CH259254A - Verfahren zur Herstellung von Thrombin aus Blut. - Google Patents

Description

  Verfahren zur Herstellung von Thrombin aus Blut.    Die     Erfindung    betrifft ein Verfahren zur  Herstellung von Thrombin aus Blut. Da das  Thrombin bekanntlich blutgerinnende Wir  kung hat, so kann es in der Therapie viel  fach, z. B. bei chirurgischen Operationen ver  wendet werden, wobei man beinahe blutlos  arbeiten und dadurch chirurgische Eingriffe  in grossem Masse fördern kann.  



  Das erfindungsgemässe Verfahren ist da  durch gekennzeichnet, dass man Blut. in eine  das Gerinnen verhindernde Lösung einführt,  dann diese Mischung mit     kalziumarmem          Wasser    mindestens auf das 5fache Volumen  verdünnt, sodann durch Zugabe einer organi  schen Säure eine Ausfällung bewirkt, wobei  man den PH-Wert der Lösung auf Grund  vorangehender Proben auf einen Wert ein  stellt, bei welchem ein maximaler Nieder  schlag entsteht, dass man sodann den abgeson  derten, das     Prothrombin    des Blutes     enthalten-          den    Niederschlag in einer kalziumfreien Salz  lösung mit einem pH von mindestens 7,

  2     auf-          Ivst    und zwecks Umwandlung des     Prothrom-          bins    in Thrombin mit einer Kalziumsalz  lösung und einem Thrombokinasepräparat zu  sammenbringt, wobei man ausserdem noch  mindestens einen Stoff zugibt, welcher der  Abnahme der Menge des entstandenen     Throm-          bins    entgegenwirkt, worauf man schliesslich  das gebildete T hrombin mit Hilfe eines die  Wirksamkeit desselben     höchstens    wenig be  einträchtigenden Fällungsmittels ausfällt,    von der Flüssigkeit abtrennt, wäscht und  trocknet.  



  Als Ausgangsstoff wird zweckmässig tie  risches Blut, z. B. Rinder-, Sehweine- oder  Pferdeblut verwendet.  



  Das Verfahren kann beispielsweise wie  folgt ausgeführt werden:  Frisch gewonnenes Blut wird sofort in  eine das Gerinnen     des    Blutes hindernde Lö  sung, z. B. in eine 2 %ige     Natriumoxalat-          lösung,    eingeführt, deren Menge'/10 der Blut  menge ausmacht. Die Formelemente des Blu  tes     hauptsächlich        Blutkörperchen,    können  z. B. durch Zentrifugieren abgesondert und  nur das     Plasma    weiter verarbeitet werden;  diese     Absonderung    kann aber auch unter  bleiben, so dass man mit vollem Blut     weiter     arbeitet.

   Da die Anwesenheit von     Ca-Jonen     den Erfolg des     Verfahrens    beeinträchtigt,  wird die erhaltene Flüssigkeit mit     kalzium-          armem    Wasser,     also    z. B. mit     Oxalat    keinen  Niederschlag gebendem     Wasser,    zweckmässig  mit     Regenwasser    oder     Schneewasser    oder de  stilliertem Wasser, auf mindestens auf das  5fache Volumen, z. B. auf das 10     bis    15fache,  verdünnt.

   Dann folgt eine Ausfällung durch  Zugabe einer     organischen    Säure, am zweck  mässigsten Essigsäure, wobei die     Lösung     durch vorangehende Proben auf einen opti  malen     pH-Wert        eingestellt    wird, welcher vom       verwendeten    Blut die     grösste:    Menge Nieder  schlag     liefert.    In diesem Niederschlag ist nur      der Vorstoff des blutgerinnenden Stoffes,  das sogenannte Prothrombin anwesend. Be  züglich der Produktion des Niederschlages  hängt der optimale pH-Wert in grossem Masse  von der Herkunft des     anzuwendenden    Blutes,  vom Alter und der Rasse des Tieres usw. ab.  Es wurden z.

   B. durch Anwendung von orga  nischen Säuren, z. B. Essigsäure, vom pH 4,8  bis 5,8 gute Resultate erzielt. Der erhaltene  Niederschlag     wird    z. B. durch Zentrifugieren  abgesondert, dann in einer kalziumfreien,  schwachbasischen Salzlösung vom PH minde  stens 7,2, z. B. in kalziumfreier Ringerscher  Lösung, aufgelöst. Sodann wird unter Zu  gabe einer Kalziumsalzlösung und irgend  eines Thrombokinasepräparates das in er  Lösung anwesende Prothrombin in Thrombin  überführt.

   Das Ende der Umwandlung wird  von Zeit zu Zeit durch     Entnahme    von Pro  ben     festgestellt.    Während der Versuche  wurde beobachtet, dass sich die Menge des  entstandenen Thrombins ohne Anwendung  von besonderen Vorsichtsmassregeln Stark  vermindert, namentlich teilweise durch Ad  sorption und teilweise durch die Einwirkung  eines das Thrombin inaktivierenden Fermen  tes. Diese Nachteile werden dadurch vermie  den, dass zur Verhinderung der Adsorption  des Thrombins der Lösung vor Zugabe des  Kalziumsalzes irgendein die Lipoide lösen  des Mittel, zweckmässig Chloroform, hinzu  gegeben wird und zur Eliminierung der  fermentativen Inaktivierung in Anwesen  heit solcher Stoffe gearbeitet wird, wel  che zur Bindung von     Metallionen,    z. B.  Eisenionen befähigt sind, also z.

   B. mit     den-          selben        undislsoziierte        komplexe     bilden, da zur Wirksamkeit des inaktivieren  den Fermentes nach unseren     Feststellungen     die Anwesenheit von Metallionen unentbehr  lich ist. Als, solcher Stoff hat sich das a, a'  Dipyridil als sehr vorteilhaft erwiesen, das  schon in Spuren die fermentative Spaltung  des Thrombins verhindert.  



  Das Gerinnsel des     etwa    gebildeten Fi  brins wird nach Beendigung der     Thrombin-          bildung    entfernt und dann das Thrombin mit  einem die     Wirksamkeit    desselben nicht oder    höchstens wenig beeinträchtigenden Fäl  lungsmittel, z. B. einem Keton, aus der Lö  sung gefällt. Es hat sich die Fällung mit  Aceton, z. B. mit zweifacher Menge, in der  Umgebung von 0  C als zweckmässig er  wiesen.  



  Das erhaltene Thrombin liegt nach dem  üblichen Trennen von der Flüssigkeit, Wa  schen und Trocknen als ein verwendungs  fertiges trockenes Pulver vor. Arbeitet man  unter den angegebenen optimalen Bedingun  gen, so ist eine Ausbeute von 75-80  Thrombin leicht zu erreichen. Die Wirksam  keit des Präparates kanngesteigert werden,  wenn das erhaltene, Pulver in destilliertem  Wasser gelöst, der unlösliche Teil entfernt  und die Fällung mit Hilfe eines Fällungs  mittels, z. B. mit kaltem Aceton, sowie die  Waschung und Trocknung, wie beschrieben,       wiederholt    wird.  



  Aus dem trockenen Pulver können Lösun  gen in destilliertem Wasser oder Emulsionen  hergestellt und dieselben, in Ampullen     ein-          geschmolzen,    in     Verkehr    gebracht werden.  Ein solches Präparat kann, wenn es unter  den     angegebenen    Bedingungen hergestellt  wurde, gut aufbewahrt werden. Zur Konser  vierung der ampullierten Substanz ist die  Anwesenheit eines Lipoidlösungsmittels,  zweckmässig Chloroform, und ferner eines die  Zersetzung des Thrombins verhindernden  Stoffes, insbesondere von a, a'-Dipyridil, not  wendig.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Herstellung von Thrombin aus Blut, dadlurch gekennzeichnet, dass man Blut in eine das Gerinnen verhindernde Lö sung einführt, dann diese Mischu ng mit kal ziumarmem Wasser mindestens auf das 5fache Volumen verdünnt,sodann durchZugabeeiner onganisehen Säure eine Ausfällung bewirkt, wobei man den pH-Wert edier Lösung auf Grund; vorangehender Proben auf :

   einen Wert einstellt, bei wdchem ein maximaler Nieder schlag entsteht, dass, man sod)a:

   nn !den abgeson derten, das Prothrombin des Blutes enthal tenden Niederschlag in, einer kalziumfreien, schwachbasischen Salzlösung mit einem p$ von mindestens 7,2 auflöst und zwecks Um wandlung des Prothrombins in Thrombin mit einer Kalziumsalzlösung und einem Throm- bokinasepräparat zusammenbringt,

   wobei man ausserdem noch mindestens einen Stoff zugibt, welcher der Abnahme der Menge des Throm- bins entgegenwirkt, worauf man schliesslich das gebildete Thrombin mit Hilfeeines die Wirksamkeit desselben höchstens wenig be- einträehtigenden Fällungsmittels ausfällt, von der Flüssigkeit abtrennt, wäseht und trocknet. UNTERANSPRÜCHE: 1. Verfahren nach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet,dass man aus dem Blut die Formelemente absondert und dann das Blutplasma, weiter behandelt. 2.

   Verfahren mach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, dass man, um der Ab nahme der Menge des Thrombins entgegen zuwirken, vor Zugabe der Kalziu@msalzlösung ein Lipoidlösungsmittel zusetzt, welches die Bindung des Thrombins durch Adsorption verhindert. 3. Verfahren nach Unteranspruch 2, da durch gekennzeichnet, dass man als Lipoid lösungsmittel Chloroform verwendet. 4. Verfahren nach Patentanspruch und den Unteransprüchen 2 und 3, dadurch ge- kennzeiehnet, dass man, um der Abnahme der Menge des Thrombins entgegenzuwirken, ausserdem einen Stoff zusetzt, welcher die fermentative Zerstörung des Thrombins ver hindert. 5. Verfahren, nach Patentanspruch und den Unteransprüchen 2-4, dadurch gekenn zeichnet, dass man a, a'-Dipyridil verwendet. 6.

   Verfahren nach Patentanspruoh und den Unteransprüchen 2-5, dadurch gekenn zeichnet, dass man das getrocknete, pulverför mige TIro,-nbin in destilliertem Wasser löst und nach Abtrennen des unlöslichen Rück standes das: Thrombin erneut durch Zugabe von F'ällungsmitteIn ausfällt, die Flüssigkeit abtrennt, wäscht und trocknet.