Verfahren zur Herstellung von Thrombin aus Blut. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Thrombin aus Blut. Da das Thrombin bekanntlich blutgerinnende Wir kung hat, so kann es in der Therapie viel fach, z. B. bei chirurgischen Operationen ver wendet werden, wobei man beinahe blutlos arbeiten und dadurch chirurgische Eingriffe in grossem Masse fördern kann.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist da durch gekennzeichnet, dass man Blut. in eine das Gerinnen verhindernde Lösung einführt, dann diese Mischung mit kalziumarmem Wasser mindestens auf das 5fache Volumen verdünnt, sodann durch Zugabe einer organi schen Säure eine Ausfällung bewirkt, wobei man den PH-Wert der Lösung auf Grund vorangehender Proben auf einen Wert ein stellt, bei welchem ein maximaler Nieder schlag entsteht, dass man sodann den abgeson derten, das Prothrombin des Blutes enthalten- den Niederschlag in einer kalziumfreien Salz lösung mit einem pH von mindestens 7,
2 auf- Ivst und zwecks Umwandlung des Prothrom- bins in Thrombin mit einer Kalziumsalz lösung und einem Thrombokinasepräparat zu sammenbringt, wobei man ausserdem noch mindestens einen Stoff zugibt, welcher der Abnahme der Menge des entstandenen Throm- bins entgegenwirkt, worauf man schliesslich das gebildete T hrombin mit Hilfe eines die Wirksamkeit desselben höchstens wenig be einträchtigenden Fällungsmittels ausfällt, von der Flüssigkeit abtrennt, wäscht und trocknet.
Als Ausgangsstoff wird zweckmässig tie risches Blut, z. B. Rinder-, Sehweine- oder Pferdeblut verwendet.
Das Verfahren kann beispielsweise wie folgt ausgeführt werden: Frisch gewonnenes Blut wird sofort in eine das Gerinnen des Blutes hindernde Lö sung, z. B. in eine 2 %ige Natriumoxalat- lösung, eingeführt, deren Menge'/10 der Blut menge ausmacht. Die Formelemente des Blu tes hauptsächlich Blutkörperchen, können z. B. durch Zentrifugieren abgesondert und nur das Plasma weiter verarbeitet werden; diese Absonderung kann aber auch unter bleiben, so dass man mit vollem Blut weiter arbeitet.
Da die Anwesenheit von Ca-Jonen den Erfolg des Verfahrens beeinträchtigt, wird die erhaltene Flüssigkeit mit kalzium- armem Wasser, also z. B. mit Oxalat keinen Niederschlag gebendem Wasser, zweckmässig mit Regenwasser oder Schneewasser oder de stilliertem Wasser, auf mindestens auf das 5fache Volumen, z. B. auf das 10 bis 15fache, verdünnt.
Dann folgt eine Ausfällung durch Zugabe einer organischen Säure, am zweck mässigsten Essigsäure, wobei die Lösung durch vorangehende Proben auf einen opti malen pH-Wert eingestellt wird, welcher vom verwendeten Blut die grösste: Menge Nieder schlag liefert. In diesem Niederschlag ist nur der Vorstoff des blutgerinnenden Stoffes, das sogenannte Prothrombin anwesend. Be züglich der Produktion des Niederschlages hängt der optimale pH-Wert in grossem Masse von der Herkunft des anzuwendenden Blutes, vom Alter und der Rasse des Tieres usw. ab. Es wurden z.
B. durch Anwendung von orga nischen Säuren, z. B. Essigsäure, vom pH 4,8 bis 5,8 gute Resultate erzielt. Der erhaltene Niederschlag wird z. B. durch Zentrifugieren abgesondert, dann in einer kalziumfreien, schwachbasischen Salzlösung vom PH minde stens 7,2, z. B. in kalziumfreier Ringerscher Lösung, aufgelöst. Sodann wird unter Zu gabe einer Kalziumsalzlösung und irgend eines Thrombokinasepräparates das in er Lösung anwesende Prothrombin in Thrombin überführt.
Das Ende der Umwandlung wird von Zeit zu Zeit durch Entnahme von Pro ben festgestellt. Während der Versuche wurde beobachtet, dass sich die Menge des entstandenen Thrombins ohne Anwendung von besonderen Vorsichtsmassregeln Stark vermindert, namentlich teilweise durch Ad sorption und teilweise durch die Einwirkung eines das Thrombin inaktivierenden Fermen tes. Diese Nachteile werden dadurch vermie den, dass zur Verhinderung der Adsorption des Thrombins der Lösung vor Zugabe des Kalziumsalzes irgendein die Lipoide lösen des Mittel, zweckmässig Chloroform, hinzu gegeben wird und zur Eliminierung der fermentativen Inaktivierung in Anwesen heit solcher Stoffe gearbeitet wird, wel che zur Bindung von Metallionen, z. B. Eisenionen befähigt sind, also z.
B. mit den- selben undislsoziierte komplexe bilden, da zur Wirksamkeit des inaktivieren den Fermentes nach unseren Feststellungen die Anwesenheit von Metallionen unentbehr lich ist. Als, solcher Stoff hat sich das a, a' Dipyridil als sehr vorteilhaft erwiesen, das schon in Spuren die fermentative Spaltung des Thrombins verhindert.
Das Gerinnsel des etwa gebildeten Fi brins wird nach Beendigung der Thrombin- bildung entfernt und dann das Thrombin mit einem die Wirksamkeit desselben nicht oder höchstens wenig beeinträchtigenden Fäl lungsmittel, z. B. einem Keton, aus der Lö sung gefällt. Es hat sich die Fällung mit Aceton, z. B. mit zweifacher Menge, in der Umgebung von 0 C als zweckmässig er wiesen.
Das erhaltene Thrombin liegt nach dem üblichen Trennen von der Flüssigkeit, Wa schen und Trocknen als ein verwendungs fertiges trockenes Pulver vor. Arbeitet man unter den angegebenen optimalen Bedingun gen, so ist eine Ausbeute von 75-80 Thrombin leicht zu erreichen. Die Wirksam keit des Präparates kanngesteigert werden, wenn das erhaltene, Pulver in destilliertem Wasser gelöst, der unlösliche Teil entfernt und die Fällung mit Hilfe eines Fällungs mittels, z. B. mit kaltem Aceton, sowie die Waschung und Trocknung, wie beschrieben, wiederholt wird.
Aus dem trockenen Pulver können Lösun gen in destilliertem Wasser oder Emulsionen hergestellt und dieselben, in Ampullen ein- geschmolzen, in Verkehr gebracht werden. Ein solches Präparat kann, wenn es unter den angegebenen Bedingungen hergestellt wurde, gut aufbewahrt werden. Zur Konser vierung der ampullierten Substanz ist die Anwesenheit eines Lipoidlösungsmittels, zweckmässig Chloroform, und ferner eines die Zersetzung des Thrombins verhindernden Stoffes, insbesondere von a, a'-Dipyridil, not wendig.
Process for the production of thrombin from blood. The invention relates to a method for producing thrombin from blood. Since the thrombin is known to have blood coagulating effect, it can be used in therapy many times, eg. B. be used in surgical operations ver, where you work almost bloodless and thus can promote surgical interventions to a large extent.
The inventive method is characterized in that blood. in a solution that prevents coagulation, then this mixture is diluted with water low in calcium to at least five times its volume, then precipitated by adding an organic acid, whereby the pH of the solution is set to a value based on previous samples, at which a maximum precipitation occurs, that the separated precipitate containing the prothrombin of the blood is then placed in a calcium-free salt solution with a pH of at least 7,
2 and for the purpose of converting the prothrombin into thrombin, it is brought together with a calcium salt solution and a thrombokinase preparation, and at least one substance is also added which counteracts the decrease in the amount of thrombin formed, whereupon the T formed is finally added hrombin precipitates, separates from the liquid, washes and dries it with the aid of a precipitant which does not impair the effectiveness of the same at most.
As a starting material, it is useful to tie-up blood, z. B. Cattle, Sehweine or horse blood is used.
The method can be carried out, for example, as follows: Freshly obtained blood is immediately dissolved in a solution that prevents the blood from clotting, e.g. B. in a 2% sodium oxalate solution, the amount of which is 1/10 of the amount of blood. The form elements of the Blu tes mainly blood cells, z. B. separated by centrifugation and only the plasma further processed; this secretion can, however, also remain under, so that one continues to work with full blood.
Since the presence of Ca ions impairs the success of the process, the liquid obtained is mixed with low-calcium water, e.g. B. with oxalate no precipitate water, expediently with rainwater or snow water or de still water, to at least 5 times the volume, z. B. 10 to 15 times, diluted.
This is followed by precipitation by adding an organic acid, preferably acetic acid, with the solution being adjusted to an optimal pH value by means of previous samples, which gives the greatest amount of precipitation from the blood used. Only the precursor of the blood-clotting substance, the so-called prothrombin, is present in this precipitate. With regard to the production of the precipitate, the optimal pH depends to a large extent on the origin of the blood to be used, the age and breed of the animal, etc. There were z.
B. by using orga African acids such. B. acetic acid, from pH 4.8 to 5.8 gives good results. The precipitate obtained is z. B. separated by centrifugation, then in a calcium-free, weakly basic salt solution from the PH minde least 7.2, z. B. dissolved in calcium-free Ringer's solution. The prothrombin present in the solution is then converted into thrombin with the addition of a calcium salt solution and any other thrombokinase preparation.
The end of the conversion is determined from time to time by taking samples. During the experiments it was observed that the amount of thrombin formed is greatly reduced without the application of special precautionary measures, namely partly through adsorption and partly through the action of a ferment which inactivates the thrombin. These disadvantages are avoided by the fact that to prevent the adsorption of the thrombin in the solution before adding the calcium salt, any lipoids dissolving the agent, advantageously chloroform, is added and such substances are used to eliminate fermentative inactivation in the presence of such substances Binding of metal ions, e.g. B. iron ions are capable, so z.
B. form undislsociated complexes with the same, since according to our findings the presence of metal ions is indispensable for the effectiveness of the inactivating the ferment. As such a substance, the a, a 'dipyridil has proven to be very advantageous, which prevents the fermentative cleavage of the thrombin even in traces.
The clot of any fibrin formed is removed after the end of the thrombin formation and then the thrombin is treated with a precipitating agent that does not impair the effectiveness of the same or at most only slightly, eg B. a ketone, precipitated from the solution. Precipitation with acetone, e.g. B. with twice the amount, in the vicinity of 0 C as appropriate he pointed.
After the usual separation from the liquid, washing and drying, the thrombin obtained is present as a ready-to-use dry powder. If you work under the specified optimal conditions, a yield of 75-80 thrombin can easily be achieved. The effectiveness of the preparation can be increased if the powder obtained is dissolved in distilled water, the insoluble part is removed and the precipitation is carried out using a precipitating agent, e.g. B. with cold acetone, and the washing and drying, as described, is repeated.
Solutions in distilled water or emulsions can be prepared from the dry powder and these can be put into circulation, melted in ampoules. Such a preparation can be stored well if it was produced under the specified conditions. To conserve the ampouled substance, the presence of a lipoid solvent, expediently chloroform, and also a substance preventing the decomposition of the thrombin, in particular a, a'-dipyridil, is necessary.