CN102002110A - 海参多糖的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种海参多糖的制备方法,包括以下步骤:①提取:用2%氢氧化钠溶液提取新鲜海参或干海参;②酶解:向提取液中采用胰蛋白酶和胃蛋白酶两步酶解过程;③除蛋白:采用三氯乙酸来去除蛋白,再使用高浓度的乙醇重结晶海参多糖。本发明制备的海参多糖得率平均为11.27%,纯度平均为98.4%,生产周期约19小时左右,比现有的工艺制得的产品有很大的改善。

Description

海参多糖的制备方法
技术领域
本发明涉及保健品技术领域,尤其是海参多糖的制备方法。
背景技术
海参属棘皮动物门,海参纲。海参又名刺参,在南海、黄海分布极广。海参作为养生食品渊源流长,据《本草纲目拾遗》记载:海参,味甘成、补肾经、摄小便、壮阳疗萎,其性温补,足敌人参,故名曰海参。目前研究发现:海参营养丰富,蛋白质含量达52.2%,海参多糖等活性物质约占15%,主要为粘多糖和海参糖氨聚糖,具有抗癌防癌、增强免疫力、抗血栓、延缓衰老、抗病毒等功效。
目前虽有海参多糖的相关提取工艺专利及文献,但皆存在以下缺点:一、生产周期较长,如中国专利申请CN101451157A,至少需要28小时;二、产品得率及纯度较低,得率不及1%、纯度也低于80%;三、有机溶剂使用量大,大量使用氯仿,既污染环境,同时对最终产品也有影响。
发明内容
本发明针对以上不足,提出一种海参多糖的制备方法,生产周期短、目标产物得率及纯度较高,且避免了有机溶剂的大量使用,其生产工艺简单可行,符合大生产条件。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:一种海参多糖的制备方法,包括以下步骤:
①、提取:取新鲜海参或干海参绞碎,加入2~4倍重量的2%氢氧化钠溶液;室温搅拌2~4小时,过滤,调滤液的pH值至7.0~9.0;
②、酶解:向步骤①滤液中加入滤液重量1.0%~3.0%的胰蛋白酶,搅拌均匀,35℃~50℃酶解1~4h,调pH值至3.5~6.0;再加入滤液重量1.0%~3.0%的胃蛋白酶,搅拌均匀,35℃~50℃酶解1~4h,在100℃沸水中保温5~15分钟;
③、除蛋白:搅拌步骤②酶解后的溶液,同时加入10%的三氯乙酸至pH至3.0;于4℃静置4h,离心取上清液,加上清液2倍体积的95%乙醇于4℃静置4h,离心沉淀,沉淀物真空干燥。
优选的,向步骤①过滤后的滤渣中加入2~4倍滤渣重量的2%氢氧化钠溶液中,室温搅拌2~4小时,过滤,合并滤液。
优选的,步骤①中滤液的pH值调至8.0。
优选的,步骤②中胰蛋白酶或胃蛋白酶的酶解温度为40℃。
优选的,步骤②中胰蛋白酶或胃蛋白酶的酶解时间为2h。
优选的,步骤②中胰蛋白酶或胃蛋白酶的用量为2.0%。
与现有技术相比,本发明采用碱提双酶水解法提取海参多糖,避免了原料加热胶化(70~130℃)造成多糖蛋白变性,影响酶解反应的效价,同时采用2%氢氧化钠溶液提取的优点在于:(1)强碱环境抑制海参自溶酶活性,保留目标产物;(2)能更大程度的提取海参酸性粘多糖。
先采用碱液处理提取之后,海参多糖蛋白结构改变,当加入复合酶时便能对海参多糖蛋白进行彻底酶解,无需进行原料的超微粉碎及纳米粉碎,从而节约成本和有效防止产品的二次污染。酶解液于100℃钝化,主要是为了使其过量的酶失活,以免造成海参多糖含量的降低及损失。
采用三氯乙酸进行除蛋白,使用量极低(约为酶解液重量0.2%左右),且易回收再利用,去除蛋白率高反应条件易控制,避免了传统Sevage法除蛋白中高毒性有机溶剂氯仿的使用,也避免了采用双氧水除蛋白而造成的目标产物结构异构化导致海参多糖含量下降,生产相对较安全,产品纯度相应较高。
采用高浓度乙醇进行重结晶海参多糖,产品晶型较好,能使海参多糖纯度达到98%以上,无需进行反复脱色、脱蛋白,从而大大缩短生产周期,仅需要19h左右。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细描述,本部分的描述仅是示范性和解释性,不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。
实施例1
取干海参绞碎1.0kg,加入2倍重量2%氢氧化钠溶液2L,室温搅拌提取2小时,共提取2次,过滤,合并得3.82L滤液,滤液冷却至室温,采用1%盐酸溶液调pH值至8.0,加入2%的胰蛋白酶20ml(酶液浓度1mg/ml)充分搅匀,于40℃酶解2小时,后将酶解液用1%盐酸调pH值至4.0,再添加2%的胃蛋白酶20mL(酶液浓度1mg/ml),同样于40℃酶解2h后,再于100℃沸水中进行酶解钝化5min。酶解完毕后,用三氯乙酸除蛋白,将10%的三氯乙酸10ml直接加到酶解液中调pH至3.0,边加边搅即产生沉淀,然后4℃放置4h,离心取上清液3.06L,加2倍体积的95%乙醇于4℃静置4h,离心沉淀并减压回收乙醇,沉淀真空干燥即得海参多糖110.2g;约耗时18h。
实施例2
取新鲜海参绞碎1.5kg,加入4倍重量2%氢氧化钠溶液,室温搅拌提取3小时,过滤;滤渣加入3倍重量2%氢氧化钠溶液,室温搅拌提取4小时,过滤;合并两次滤液,得4.13L滤液,滤液冷却至室温,采用调节0.5%硫酸溶液调pH值至7.2,加入1%的胰蛋白酶30ml(酶液浓度1.5mg/ml)充分搅匀,于36℃酶解3小时,后将酶解液用0.5%硫酸调pH值至5.0,再添加1.5%的胃蛋白酶30mL(酶液浓度1.4mg/ml),于42℃酶解1h后,再于100℃沸水中进行酶解钝化15min。酶解完毕后,用三氯乙酸除蛋白,将10%的三氯乙酸约15ml直接加到酶解液中调pH至3.0,边加边搅即产生沉淀,然后4℃放置4h,离心取上清液3.56L,加2倍体积的95%乙醇于4℃静置4h,离心沉淀并减压回收乙醇,沉淀真空干燥即得海参多糖108.4g;约耗时20h。
实施例3
取新鲜海参绞碎2.0kg,加入3倍重量2%氢氧化钠溶液,室温搅拌提取4小时,过滤;滤渣加入4倍重量2%氢氧化钠溶液,室温搅拌提取2小时,过滤;合并两次滤液,得5.25L滤液,滤液冷却至室温,采用调节1%盐酸溶液调pH值至9.0,加入3%的胰蛋白酶20ml(酶液浓度1.5mg/ml)充分搅匀,于50℃酶解4小时,后将酶解液用1%盐酸调pH值至6.0,再添加3%的胃蛋白酶20mL(酶液浓度1.4mg/ml),于50℃酶解1h后,再于100℃沸水中进行酶解钝化10min。酶解完毕后,用三氯乙酸除蛋白,将10%的三氯乙酸约15ml直接加到酶解液中调pH至3.0,边加边搅即产生沉淀,然后4℃放置4h,离心取上清液3.56L,加2倍体积的95%乙醇于4℃静置4h,离心沉淀并减压回收乙醇,沉淀真空干燥即得海参多糖124.3g;约耗时20h。
根据以上实施例得到的三批样品,按含量测定方法依法测定海参多糖含量。结果见下表1:
表1样品中海参多糖含量测定结果
Figure BDA0000034063490000041
由表1结果可看出,本发明制备的海参多糖得率平均为11.27%,远高于现有海参多糖制备方法的得率;同时海参多糖的纯度平均为98.4%,也远高于现有产品纯度。另外本发明制备方法的生产周期约19小时左右,比现有的工艺缩短了时间。
附:海参多糖含量测定方法:
仪器设备:UV-2450紫外可见分光光度计(日本岛津(苏州)有限公司)
对照品溶液的制备:海参多糖标准溶液:精密称取海参多糖标准品以水配制成0.26mg/mL溶液。天青I试液:取天青I试剂0.5g,以水稀释至500mL,放置一周。过滤除去不溶物,得天青I储备液,冷藏保存。临用时取储备液1L加水至加20mL即得。
供试品溶液的制备:精密量取供试多糖样品1.0mL置于10mL容量瓶中以水定容,摇匀,得样品液。量取25L样品液,加入天青I试液5.0mL,混匀后10min内于515nm波长处测定吸光值,以水作为空白对照。如果样品的吸光值在量程范围内,则参照标准曲线计算多糖含量;否则将稀释样品的浓度作适当调整,以使吸光值最终落在量程范围内。即得。
标准曲线制备:精密量取海参多糖标准溶液10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μL分别加水至50L,依次加入天青I试液5.0mL,混匀后10min内于515nm波长处测定吸光值,以水为空白对照,绘制标准曲线,经整理后结果如下:
y=0.1226x+0.1658,R=0.9991
式中:y为吸光值(A);为多糖质量浓度(μg/mL)
稳定性实验:取质量浓度为0.10mg/mL的自制海参多糖样品溶液1.00mL,加入天青I试液50mL,混匀后平均分成10份,每隔1h测定1次含量,结果含量的RSD值0.25%,表明此方法的成色物质在10h内稳定。
加样回收实验:分别取海参多糖标准溶液50mL,连续测定5次,结果为:此方法精密度RSD值1.2%,回收率范围是(96.0~100.0)%。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种海参多糖的制备方法,包括以下步骤:
①、提取:取新鲜海参或干海参绞碎,加入2~4倍重量的2%氢氧化钠溶液;室温搅拌2~4小时,过滤,调滤液的pH值至7.0~9.0;
②、酶解:向步骤①滤液中加入滤液重量1.0%~3.0%的胰蛋白酶,搅拌均匀,35℃~50℃酶解1~4h,调pH值至3.5~6.0;再加入滤液重量1.0%~3.0%的胃蛋白酶,搅拌均匀,35℃~50℃酶解1~4h,在100℃沸水中保温5~15分钟;
③、除蛋白:搅拌步骤②酶解后的溶液,同时加入10%的三氯乙酸至pH至3.0;于4℃静置4h,离心取上清液,加上清液2倍体积的95%乙醇于4℃静置4h,离心沉淀,沉淀物真空干燥。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于:向步骤①过滤后的滤渣中加入2~4倍滤渣重量的2%氢氧化钠溶液中,室温搅拌2~4小时,过滤,合并滤液。
3.如权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于:步骤①中滤液的pH值调至8.0。
4.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤②中胰蛋白酶或胃蛋白酶的酶解温度为40℃。
5.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤②中胰蛋白酶或胃蛋白酶的酶解时间为2h。
6.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤②中胰蛋白酶或胃蛋白酶的用量为2.0%。
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