CN104130334A - 一种海参多糖的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海参多糖的提取方法，特点是包括以下步骤：原料海参浸泡清洗，用粉碎机进行粉碎处理后与4~8倍体积的去离子水混合均匀放入离心机，在8000~12000转/分钟的转速下离心30~40分钟，去除上清液，沉淀物与3~6倍的去离子水混合均匀后放入生物酶解罐，调节温度为45~65℃、pH值为6.5~8.0，加入添加量为原料重量的0.3~3%的复合酶进行酶解处理2~6小时，得到的酶解产物用截留分子量为6~10KD的超滤膜进行一次浓缩过滤后，滤液与1~2倍的去离子水混合后用6~10KD的超滤膜进行二次浓缩过滤，得到的滤渣冷冻干燥后即得海参多糖；优点是提取过程水资源用量少，且海参多糖的提取率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种多糖的提取方法，尤其是涉及一种海参多糖的提取方法。
背景技术
海参作为一种传统海产珍品，营养价值高，生理活性物质含量丰富。海参有刺参类和光参类两大类，主要有海地瓜、白乳参、黑海参、仿刺参、花刺参、黑乳参、海棒槌等品种。海参体壁中含有海参多糖、海参皂苷及海参胶原蛋白等多种具有抗癌、免疫调节功能的活性物质。海参多糖是海参体壁的重要组成成分，海参多糖包括海参粗多糖、海参硫酸软骨素(SC—CHS)及海参岩藻聚糖硫酸酯(SC—FUC)，其中海参粗多糖由海参硫酸软骨素及海参岩藻聚糖硫酸酯2种组分构成。海参硫酸软骨素是一种带岩藻糖支链的酸性粘多糖，主要由葡萄糖醛酸、氨基半乳糖及岩藻糖组成，且摩尔比约为1:1:1。海参岩藻聚糖硫酸酯是由岩藻糖所构成的直链多糖。二者的糖基组成不同，糖链上都有部分羟基发生硫酸酯化。海参硫酸软骨素及海参岩藻聚糖硫酸酯具有不同的结构及活性，现已被证实具有抗凝血、抗肿瘤、增强免疫力、降血脂等多种生物活性，在功能性食品及新药开发方面具有良好的应用前景。
现有的海参多糖的传统提取工艺可分为五类，即酸法、碱法、酶法、盐法以及热水浸提法等，其基本原理都是根据海产品的特性，改变蛋白质的外界环境，从而把多糖分离出来。酸法和碱法是将多糖在酸性和碱性环境下提取出来，盐法是将原料在一定浓度的盐溶液中提取出来，主要使用的盐有氯化钠、氯化钾和乙酸钠。以上三种方法虽然工艺简单，但是由于提取过程中会使用大量的淡水和酸碱盐，属于高能耗产业，排放的酸碱盐对周围环境产生一定的生态影响，不符合绿色可持续性经济发展模式。此外，热水浸提法也需要使用大量的淡水和能源，不符合国家及世界经济发展的主流。现有的酶法提取工艺主要利用酶反应的温和高效性在一定环境条件下将多糖从不同的原料中提取出来，然而酶法提取工艺虽然克服了上述其他提取工艺的缺陷，能够减少淡水资源的消耗，然而提取率却不高，一般仅有1.65％～2.68％。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种结合生物酶解技术和膜技术来提取海参多糖的方法，既能有效减少原料及淡水的消耗量，又有利于提高海参多糖的提取率。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种海参多糖的提取方法，包括以下步骤：①将原料海参进行浸泡清洗；②使用粉碎机对浸泡清洗后的海参进行粉碎处理；③将粉碎处理后的海参与4～8倍体积的去离子水混合均匀后放入离心机，在8000～12000转/分钟的转速下连续离心分离30～40分钟；④离心分离结束后去除上清液，剩余的沉淀物与3～6倍体积的去离子水混合均匀后放入生物酶解罐，在温度为45～65℃、pH值为6.5～8.0的条件下，加入复合酶进行酶解处理2～6小时，复合酶的添加量为原料海参重量的0.3～3％；⑤将经过生物酶解罐酶解处理的酶解产物用截留分子量为6～10KD的超滤膜进行第一次浓缩过滤；⑥将经过第一次浓缩过滤得到的滤液与1～2倍的去离子水混合后再次通过截留分子量为6～10KD的超滤膜进行第二次浓缩过滤；⑦将经过第二次浓缩过滤得到的滤渣冷冻干燥，即得到海参多糖。
步骤④中所述的复合酶是由胃蛋白酶、胰蛋白酶和胶原蛋白酶复配而成，所述的胃蛋白酶、所述的胰蛋白酶和所述的胶原蛋白酶的重量配比为1～3：1～3：2～5。胃蛋白酶是一种酸性蛋白酶，能分解蛋白质中由芳香族氨基酸或酸性氨基酸所形成的肽键，胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键，两者酶解效果好，酶解条件也温和，然而由于原料为海参，海参中含有部分会对胰蛋白酶的作用造成抑制的物质，胶原蛋白酶的添加则正好弥补了这一缺陷，因此，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胶原蛋白酶按1～3：1～3：2～5的比例复配而成的复合酶进行酶解，能够充分发挥酶解作用，有利于提高酶解效果。
步骤④中所述的复合酶是由胃蛋白酶、胰蛋白酶和胶原蛋白酶复配而成，所述的胃蛋白酶、所述的胰蛋白酶和所述的胶原蛋白酶的重量配比为2～3：1～2：3～4。
步骤⑤和步骤⑥中所述的超滤膜为中空纤维膜、管式膜或者平板膜。
与现有技术相比，本发明的优点在于：与传统的酸法、碱法、酶法、盐法以及热水浸提法提取海参多糖相比，本发明中原料海参经过粉碎、离心、酶解以及两次超滤膜浓缩过滤等步骤，将生物酶解处理和超滤膜的浓缩过滤处理相结合用于提取海参多糖，最大限度地利用了原料海参和酶的价值，降低了原料消耗，且整个提取过程中反应环境温和，可保证海参多糖的活性和纯度，提高海参多糖的提取率，其提取率可达8.32％；此外，在整个提取过程中废水、废液排放量低，有利于降低能耗，符合绿色可持续经济发展的要求。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例一：采用海地瓜作为原料海参，进行海参多糖的提取，提取方法包括以下步骤：①将海地瓜进行浸泡清洗；②使用粉碎机对浸泡清洗后的海地瓜进行粉碎处理，使得海地瓜呈流体浆物状；③将粉碎处理后的海地瓜与8倍体积的去离子水混合均匀后放入离心机，在12000转/分钟的转速下连续离心分离40分钟，从而去除其中的非多糖的水溶性物质；④离心分离结束后去除上清液，得到含多糖的沉淀物，将该含多糖的沉淀物与3倍体积的去离子水混合均匀后放入生物酶解罐，在温度为45℃、pH值为8.0的条件下，加入复合酶进行酶解处理6小时，在此，复合酶由胃蛋白酶、胰蛋白酶和胶原蛋白酶的重量按比例1:1:2复配而成，添加量为原料海地瓜重量的0.3％；⑤采用现有的超滤设备，将经过生物酶解罐酶解处理的酶解产物用截留分子量为6KD的中空纤维膜进行第一次浓缩过滤，在此分子量大于截留分子量为6KD的分子被截留；⑥将经过第一次浓缩过滤的滤液与2倍体积的去离子水混合后再次通过截留分子量为6KD的中空纤维膜进行第二次浓缩过滤；⑦将经过第二次浓缩过滤得到的滤渣冷冻干燥，即得到海参多糖，经测算得，海参多糖的提取率为8.32％。
实施例二：采用白乳参作为原料海参，进行海参多糖的提取，提取方法包括以下步骤：①将白乳参进行浸泡清洗；②使用粉碎机对浸泡清洗后的白乳参进行粉碎处理，使得白乳参呈流体浆物状；③将粉碎处理后的白乳参与4倍体积的去离子水混合均匀后放入离心机，在8000转/分钟的转速下连续离心分离30分钟，从而去除其中的非多糖的水溶性物质；④离心分离结束后去除上清液，得到含多糖的沉淀物，将该含多糖的沉淀物与6倍体积的去离子水混合均匀后放入生物酶解罐，在温度为65℃、pH值为6.5的条件下，加入复合酶进行酶解处理2小时，复合酶由胃蛋白酶、胰蛋白酶和胶原蛋白酶的重量按比例1:3:5复配而成，添加量为原料白乳参重量的3％；⑤采用现有的超滤设备，将经过生物酶解罐酶解处理的酶解产物用截留分子量为10KD的中空纤维膜进行第一次浓缩过滤，在此分子量大于截留分子量为10KD的分子被截留；⑥将经过第一次浓缩过滤的滤液与1倍体积的去离子水混合后再次通过截留分子量为10KD的中空纤维膜进行第二次浓缩过滤；⑦将经过第二次浓缩过滤得到的滤渣冷冻干燥，即得到海参多糖，经测算得，海参多糖的提取率为5.35％。
实施例三：采用黑海参作为原料海参，进行海参多糖的提取，提取方法包括以下步骤：①将黑海参进行浸泡清洗；②使用粉碎机对浸泡清洗后的黑海参进行粉碎处理，使得黑海参呈流体浆物状；③将粉碎处理后的黑海参与6倍体积的去离子水混合均匀后放入离心机，在10000转/分钟的转速下连续离心分离35分钟，从而去除其中的非多糖的水溶性物质；④离心分离结束后去除上清液，得到含多糖的沉淀物，将该含多糖的沉淀物与5倍体积的去离子水混合均匀后放入生物酶解罐，在温度为60℃、pH值为7.0的条件下，加入复合酶进行酶解处理4小时，复合酶由胃蛋白酶、胰蛋白酶和胶原蛋白酶的重量按比例3:1:5复配而成，添加量为原料黑海参重量的1.5％；⑤采用现有的超滤设备，将经过生物酶解罐酶解处理的酶解产物用截留分子量为8KD的中空纤维膜进行第一次浓缩过滤，在此分子量大于截留分子量为8KD的分子被截留；⑥将经过第一次浓缩过滤的滤液与1.5倍体积的去离子水混合后再次通过截留分子量为8KD的中空纤维膜进行第二次浓缩过滤；⑦将经过第二次浓缩过滤得到的滤渣冷冻干燥，即得到海参多糖，经测算得，海参多糖的提取率为5.72％。
除上述实施例一至三之外，在其他实际海参多糖的提取过程中，用于第一次浓缩过滤和第二次浓缩过滤的超滤膜还可以采用管式膜或者平板膜。
分别从实施例一、二、三中取1.0g提取得到的海参多糖，再将这三组海参多糖分别溶于30mL的25mmol/L的NaH2PO4-Na2HPO4的缓冲液中，以Q-Sepharose FastFlow(QFF)阴离子交换柱(2.6cm×40cm)分离纯化，其中分离采用0～3mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，流速为5mL/min，收集馏分得到海参硫酸软骨素(SC—CHS)和海参岩藻聚糖硫酸酯(SC—FUC)。再分别测定各实施例中得到的海参多糖中的海参硫酸软骨素(SC—CHS)和海参岩藻聚糖硫酸酯(SC—FUC)的相对分子质量、蛋白质含量及硫酸根含量，结果如表1。
其中，蛋白质含量采用Folin-酚法测定，以牛血清白蛋白为标准品。相对分子质量通过高效凝胶排阻色谱法测定，根据GPC软件绘制标准曲线，计算对应的相对分子质量色谱条件如下，色谱柱：TSK-gelG4000PWxl(30.0cm×7.8mm)；检测器：示差检测器(RID)；流动相：0.2mol/L NaCl；流速：0.5mL/min；柱温：40℃。硫酸根含量通过离子色谱法测定，色谱条件如下，色谱柱：Ionpac AS11-HC(4mm×250mm)；保护柱：DionexIonpac AG11-HC(4mm×50mm)；淋洗液：20mmol KOH；流速：1.2mL/min；柱温：30℃；进样体积：25μL；抑制器：ASRS ULTRA II阴离子抑制器；抑制电流：90mA。
表1 实施例一至三中各海参多糖中各组分的蛋白质含量、相对分子质量及硫酸根含量
已知海参多糖主要由海参硫酸软骨素和海参岩藻聚糖硫酸酯组成，但是不同的原料海参的海参多糖提取物中，其海参硫酸软骨素和海参岩藻聚糖硫酸酯的种类有所区别。将上述实施例一至实施例三中提取得到的1.0g的海参多糖分别进行QFF分离纯化后，得到的不同的海参硫酸软骨素和海参岩藻聚糖硫酸酯的蛋白质含量、相对分子质量及硫酸根含量的数据见表1，从表1可见，采用本发明方法提取海参多糖，在获得高的海参多糖的提取率的同时，提取得到的海参多糖的纯度也有保证。
Claims (4)
1.一种海参多糖的提取方法，其特征在于包括以下步骤：①将原料海参进行浸泡清洗；②使用粉碎机对浸泡清洗后的海参进行粉碎处理；③将粉碎处理后的海参与4~8倍体积的去离子水混合均匀后放入离心机，在8000~12000转/分钟的转速下连续离心分离30~40分钟；④离心分离结束后去除上清液，剩余的沉淀物与3~6倍体积的去离子水混合均匀后放入生物酶解罐，在温度为45~65℃、pH值为6.5~8.0的条件下，加入复合酶进行酶解处理2~6小时，复合酶的添加量为原料海参重量的0.3~3%；⑤将经过生物酶解罐酶解处理的酶解产物用截留分子量为6~10KD的超滤膜进行第一次浓缩过滤；⑥将经过第一次浓缩过滤得到的滤液与1~2倍体积的去离子水混合后再次通过截留分子量为6~10KD的超滤膜进行第二次浓缩过滤；⑦将经过第二次浓缩过滤得到的滤渣冷冻干燥，即得到海参多糖。
2.根据权利要求1所述的一种海参多糖的提取方法，其特征在于步骤④中所述的的复合酶是由胃蛋白酶、胰蛋白酶和胶原蛋白酶复配而成，所述的胃蛋白酶、所述的胰蛋白酶和所述的胶原蛋白酶的重量配比为1~3：1~3：2~5。
3.根据权利要求1所述的一种海参多糖的提取方法，其特征在于步骤④中所述的的复合酶是由胃蛋白酶、胰蛋白酶和胶原蛋白酶复配而成，所述的胃蛋白酶、所述的胰蛋白酶和所述的胶原蛋白酶的重量配比为2~3：1~2：3~4。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种海参多糖的提取方法，其特征在于步骤⑤和步骤⑥中所述的超滤膜为中空纤维膜、管式膜或者平板膜。
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