发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服了现有技术中桃胶加工工艺落后,在加工过程中易造成桃胶多糖分解,导致桃胶提取物品质下降,且由该工艺制得的桃胶提取物含有大量杂质,应用领域窄,难以产业化生产等缺陷,提供了一种桃胶多糖及其提取物,以及其制备方法和应用。本发明的桃胶多糖提取物的制备方法能获得高收率的提取物,且不会破坏提取物中桃胶多糖的产品性能,进一步提纯后的桃胶多糖中不含有核酸、蛋白、鞣质、糊精和淀粉等杂质,各方面理化性能皆优于现有技术中,并且能够完全符合食品、药品和化妆品领域的应用要求,使用范围广,能够产业化生产,具有广泛的使用前景。
本发明的目的之一是提供一种桃胶多糖,其主要由70~98wt%,较佳的为90~98wt%的中性总糖组成;且不含核酸、蛋白、鞣质、糊精和淀粉等杂质;其中,该中性总糖中含有的葡萄糖醛酸为桃胶多糖重量的5~30%,较佳的为10~20%;该桃胶多糖的平均分子量为3000道尔顿以上,较佳的为3000~200,000道尔顿,更佳的为8000~150,000;浓度为10wt%的该桃胶多糖水溶液的动力粘度为0.5~4.0帕·秒(Pa.S),较佳的为1.4~3.4帕·秒,该粘度为于25℃由NDJ-1动力粘度计测得;浓度为10wt%的桃胶多糖水溶液的pH值为4.0~6.5;浓度为1wt%的该桃胶多糖水溶液的比旋度为
其中,该中性总糖主要包括下列含量的糖基:阿拉伯糖30~60%,较佳的为50~55%;葡萄糖0.1~35%,较佳的为30~35%;木糖5~30%,较佳的为5~10%;鼠李糖1~5%,较佳的为1~2%;半乳糖0.1~5%,较佳的为1~2%;以及甘露糖0.1~5%,较佳的为0.5~1.5%;上述含量为相对于所述桃胶多糖的重量百分比,所述的葡萄糖醛酸包含在所述葡萄糖中。
本发明的桃胶多糖为浅白色粉末状物体,具有良好的水溶液稳定性,高分子量和高粘度的特点。
本发明目的之二是提供了一种桃胶多糖提取物,其主要由下述重量百分比的组分组成:所述桃胶多糖80~99.8%,较佳的为87~99%;氮元素0.01~0.2%;以及灰分0.2~3%,较佳的为0.3~2%;该桃胶多糖提取物中不含鞣质、糊精和淀粉;其中,所述桃胶多糖中葡萄糖醛酸的含量为桃胶多糖提取物重量的5~28%,较佳的为10~20%;浓度为10wt%的该桃胶多糖提取物水溶液的动力粘度为0.5~4.0帕·秒(Pa.S),较佳的为1.4~3.4帕·秒,该粘度为于25℃由NDJ-1动力粘度计测得;该桃胶多糖提取物的平均分子量为3000道尔顿以上,较佳的为3000~200,000道尔顿,更佳的为8000~150,000;浓度为10wt%的该桃胶多糖提取物水溶液的pH值为4.0~6.5。
其中,所述的灰分为桃胶经高温(500~600℃)灼烧后的残留物。灰分是标示食品中无机成分总量的一项指标。
其中,所述鞣质、糊精和淀粉均存在于天然桃胶中,这类物质的存在可能会造成桃胶多糖及其提取物品质的下降,因此,必须将其尽可能从产品中去除,或降低至可接受的程度。
其中,所述的氮元素指桃胶多糖提取物中含有的蛋白质的氮元素。本发明中的氮元素采用凯式定氮法进行氮元素的测定,可根据该氮含量计算提取物中蛋白质的含量。
本发明的目的之三是提供所述桃胶多糖提取物的制备方法,其包括如下步骤:
(1)粉碎或研磨:将天然原桃胶干燥后粉碎成桃胶粗粉,并将其溶散于纯水中得桃胶混悬液;或将天然原湿桃胶用纯水溶胀后研磨得桃胶混悬液;
(2)生物酶解:将该桃胶混悬液加热至40℃~60℃,在生物酶的作用下,在保温和搅拌条件下进行酶解,得料液1;所述生物酶在该桃胶混悬液中的浓度为0.005~0.05g/ml;
(3)低温水解:于40℃~60℃,将该料液1与氢氧化钠混合,在保温和搅拌条件下进行水解,得料液2;该氢氧化钠在该料液1中的浓度为0.03~0.6g/ml。
(4)调节pH:在40℃~60℃下,在保温和搅拌条件下,将该料液2与纯水混合形成透明溶液,用pH调节剂将pH值调节至6.0~6.5,过滤,得精滤液;
(5)纯化:利用离子交换树脂法和大孔树脂吸附法对该精滤液进行除杂和分离,得到纯化液,用活性炭或活性白土进行脱色处理,得料液3;
(6)浓缩:减压浓缩该料液3,至其固含量≥5.0wt%,得浓缩液;
(7)干燥:将该浓缩液进行喷雾干燥,收集喷雾干粉即得所述桃胶多糖提取物。
步骤(1)中,所述的天然原桃胶指水分含量在15wt%以下的桃胶;所述的天然原湿桃胶指新鲜桃胶。所述的桃胶粗粉的粒径较佳的为20~40目。所述纯水的用量较佳的为5~60ml/g桃胶粗粉或湿桃胶。所述的研磨较佳的用胶体磨进行。所述溶胀的温度较佳的为40℃~60℃,溶胀时间以使湿桃胶充分溶胀即可。
步骤(2)中,所述的生物酶较佳的为所有能够酶解糖蛋白,并使其分解成能够用本发明纯化方法去除的小分子化合物的糖蛋白酶,更佳的为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶和胰酶中的一种或多种。现有技术中的所有市售碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶和胰酶都能适用于本发明。其中,所述的酶解时间以使酶解完成为止,较佳的为1~5小时。
步骤(3)中,所述的氢氧化钠可以纯固体的形式或水溶液的形式与料液1混合,无论以何种形式混合,氢氧化钠在料液1中的浓度较佳的为0.1~0.4g/ml。其中,当以水溶液形式混合时,氢氧化钠水溶液的重量浓度较佳的为5%~50%。其中,所述的水解时间以使水解完成为止,较佳的为1~5小时。
步骤(4)中,所述纯水的用量为使料液2能够完全溶解于纯水中形成透明溶液即可,较佳的为20~120ml/g桃胶粗粉或湿桃胶。所述的溶解时间以使料液2能够完全溶解于纯水中形成透明溶液即可,较佳的为0.5~2小时,考虑到成本与效率问题,更佳的为0.5~1小时。其中,所述的pH调节剂可选用本领域常规的各种弱酸性pH调节剂,较佳的为醋酸和/或稀盐酸。
步骤(5)中,所述的离子交换树脂法可采用本领域此类方法的常规操作进行,以除去精滤液中的无机盐和重金属(如砷、铅、铬)等。其中,所述的离子交换树脂为阳离子和阴离子交换树脂。所述的阳离子交换树脂可使用本领域常规的各种阳离子交换树脂,较佳的为氢型或钠型阳离子交换树脂。所述的阴离子交换树脂可选用本领域常规的各种阴离子交换树脂,较佳的为弱碱性阴离子交换树脂。所述的大孔树脂吸附法可采用本领域此类方法的常规操作进行,以除去精滤液中的色素等非极性的杂质及小分子化合物。所述的大孔树脂吸附法中使用的大孔吸附树脂可选用本领域常规的各种弱极性或非极性大孔吸附树脂,较佳的为D 101、AB-8、NK-109、H-103、NKA-9或ADS-17。所述活性炭或活性白土的用量为使该纯化液脱色完全为止,较佳的为纯化液体积的0.5%~3%。所述离子交换树脂法和大孔树脂吸附法的具体操作为:将所述精滤液上阳离子交换树脂分离柱,纯水洗脱,收集洗脱液,采用菲林试剂法检测洗脱液至无多糖反应时停止收集,得洗脱液1;将洗脱液1上阴离子交换树脂分离柱,纯水洗脱,收集洗脱液,采用菲林试剂法检测洗脱液至无多糖反应时停止收集,得洗脱液2;将洗脱液2再用大孔吸附树脂进行分离,纯水洗脱,收集洗脱液,采用菲林试剂法检测洗脱液至无多糖反应时停止收集,得纯化液。
步骤(6)中,所述的减压浓缩的浓缩条件可根据本领域常识进行选择,减压温度较佳的为50℃~80℃,压力较佳的为-0.085Mpa~-0.050Mpa。所述的减压浓缩较佳地在旋转蒸发仪中进行。
本发明的目的之四是提供所述桃胶多糖的制备方法,其包括如下步骤:
(1)根据上述桃胶多糖提取物的制备方法得到桃胶多糖提取物;
(2)纯化除去桃胶多糖提取物中的核酸、蛋白等杂质。
其中,步骤(2)中的纯化可选用本领域中用于去除所述杂质常用的各种多糖纯化方法,如三氯乙酸法、凝胶色谱法等,各种纯化的具体操作步骤可根据本领域常识进行选择。本发明优选采用Sevag法及透析法来实现纯化,该纯化的具体步骤可根据本领域常识进行选择,较佳地按下述步骤进行:
①将桃胶多糖提取物与纯水混合,得桃胶多糖提取物水溶液;其中,所述纯水的用量较佳的400ml/g~600ml/g桃胶多糖提取物;
②加入所述水溶液体积1/3~1/5的三氯甲烷,再加入所述三氯甲烷体积1/3~1/5的正丁醇,剧烈振摇15~30分钟,离心,分去水相和有机相交界处的变性蛋白质;
③重复步骤②,直至水相在280nm处的吸光度值不再下降为止;其中,重复步骤②时,再次加入的三氯甲烷和正丁醇加入步骤②的水相中;
④将所述水相减压浓缩至半流质状浓缩液(即流浸膏状浓缩液),将该浓缩液与95%乙醇充分混合,离心得沉淀物1;将该沉淀物1与纯水混合,离心,去除不溶物,得清液1;将清液1于透析袋内进行透析,用纯水冲洗12~16小时,收集透析袋中透析后的清液2(即收集分子量为3000道尔顿以上的物质);将该清液2与无水乙醇混合,再次离心得沉淀物2;用无水乙醇对该沉淀物2进行脱水后于60℃~80℃真空干燥,即得桃胶多糖;其中,95%乙醇的用量较佳的为该半流质状浓缩液体积的3倍~5倍;该沉淀物1与纯水的混合比例较佳的为质量比1∶100~1∶500,更佳的为1∶100~1∶200;该透析袋为能够透过分子量小于3000道尔顿的物质的透析袋;该清液2与无水乙醇的混合比例较佳的为体积比1∶3~1∶5。
本发明的目的之五是提供上述桃胶多糖以及桃胶多糖提取物作为稳定剂的应用。其中,所述的稳定剂较佳的为药品、食品、化妆品、轻化工领域中使用的稳定剂,更佳的为蛋白稳定剂,最佳的为液体乳制品稳定剂。所述的液体乳制品较佳的为牛奶、酸奶或含乳饮料;所述的含乳饮料包括配置型含乳饮料、发酵型含乳饮料和乳酸菌饮料,较佳的为果乳饮料或调味奶。
进一步的研究发现,本发明桃胶多糖及桃胶多糖提取物具有稳定剂功能主要与其结构有关:
(1)桃胶多糖中含有葡萄糖醛酸,而且百分含量较高(5%~30%),葡萄糖醛酸可以起到稳定蛋白的作用,因此,桃胶多糖可以作为一种蛋白稳定剂应用在果乳饮料及乳饮料中。
(2)桃胶多糖及其提取物中蛋白质含量极低,赋予样品良好的溶解性和稳定性,使桃胶多糖和桃胶多糖提取物的具有广泛的应用领域,且性能可靠。
本发明中的使用的原料、试剂和设备皆市售可得。
本发明中,上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明的积极进步效果在于:
一、本发明桃胶多糖及其提取物的制备方法不同于传统的工艺,克服了常规桃胶加工工艺需进行高温、强碱水解的不足之处,是一种新的桃胶多糖及其提取物的制备工艺,采用生物酶法技术、低温水解技术、树脂吸附分离控制技术和脱色技术等生产工艺,能够确保得到的桃胶多糖以及桃胶多糖提取物的各项物化性质满足食品、药品、化妆品以及轻化工领域的使用要求。
二、本发明的制备方法反应条件温和,能够避免桃胶多糖在反应过程中发生分解,保持了桃胶多糖的天然状态,不影响桃胶多糖的产品性能,并且去除了与桃胶多糖结合的糖蛋白,以及残留农药等杂质,从而确保产品的安全性、稳定性、有效性和可控性。由此使得桃胶多糖及其提取物的分子量、粘度、外观颜色等使用性能和市场价值完全符合市场要求,具有广泛的产业化前景和使用前景。
三、本发明的桃胶多糖和桃胶多糖提取物可作为稳定剂,具有优异的应用特性,可以广泛作为药品、食品、化妆品和轻化工领域中的稳定剂,尤其能够作为乳制品的稳定剂。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明,但本发明并不受其限制。
实施例中的碱性蛋白酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶购于南宁庞博生物工程有限公司。
实施例4中的透析袋的型号为R-25--3.5K,购于济南浩博生物技术有限公司。
下述实施例中所涉及的测试方法有:
一、桃胶多糖提取物中桃胶多糖含量的测定方法为:
以木糖为标准品,采用苯酚-硫酸法(张惟杰.糖复合物生化研究技术[M].浙江大学出版社.2003)测定桃胶多糖提取物中桃胶多糖含量。
(1)绘制木糖标准曲线:
以木糖为标准品,分别配制标准溶液。取木糖标准溶液,加入6%苯酚溶液,加入浓硫酸,静置10min,摇匀,进行显色反应至溶液呈橙红色。在波长480nm处测定吸光度值,用经同样显色操作后的水为空白对照。以吸光度值为纵坐标,木糖量为横坐标,绘制标准曲线(y=ax+b)。
(2)桃胶多糖相当于木糖的换算因子的确定:
准确称取桃胶多糖,纯水溶解,作为待测液1。取适量待测液1,按与标准曲线显色方法相同的操作进行显色反应后,测定其在480nm处的吸光度值,按下式计算桃胶多糖相当于木糖的换算因子:
f=W1/CD 式1
式1中:f-桃胶多糖相当于木糖的换算因子
W1-反应体系中桃胶多糖的质量(g)
C-根据标准曲线计算所得反应体系中样品相当于木糖的质量(g,C=(y-b)/a)
D-待测液1稀释倍数
(3)桃胶多糖含量的测定
准确称取桃胶多糖提取物,纯水溶解,作为待测液2。取适量待测液2,按标准曲线检测方法操作,测定其在480nm处的吸光度值,根据以下公式计算桃胶多糖含量:,
X=CDf/W2 式2
式2中:X-桃胶多糖提取物中桃胶多糖含量(wt%)
W2-反应体系中桃胶多糖提取物的质量(g)
C-根据标准曲线计算所得反应体系中样品相当于木糖的质量(g,C=(y-b)/a)
D-待测液2的稀释倍数
f-换算因子
该桃胶多糖含量的测试方法由于采用的是自身对照的方法,因此测试结果存在本领域普遍能够接受的误差。
二、桃胶多糖的组成确定方法:
采用硅胶薄层层析法,用标准单糖:阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、甘露糖、葡萄糖、鼠李糖和岩藻糖作为对照,对桃胶多糖提取物和桃胶多糖进行薄层层析。
薄层层析条件:
展开剂为正丁醇∶乙酸乙酯∶异丙醇∶乙酸∶水∶吡啶=7∶20∶12∶7∶6∶6。(体积比)
显色剂:茴香胺1.23g、邻苯二甲酸1.66g,溶于100ml 85%wt乙醇溶液,摇匀,临用时配制。
三、中性总糖成分含量分析方法:
采用气相色谱法,用标准单糖阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、鼠李糖作为对照,采用三氟乙酸法对桃胶多糖进行水解,并制备成糖醇乙酸酯后进行气相-质谱分析。
检测方法:
检测仪器:Agilent GC7890/MS D5973N气质连用仪。
色谱条件:色谱柱DB-5MS(30m*0.25nm*0.25μm)。采用程序升温法,150℃升到220℃,保持5min,再升到250℃,保持5min。
质谱条件:离子化方式EI,70eV。
四、桃胶多糖及桃胶多糖提取物中葡萄糖醛酸含量的测定方法:
方法:咔唑硫酸法,以葡萄糖醛酸内酯为标准。
五、桃胶多糖及桃胶多糖提取物中鞣质的检测:取待测样品的水溶液1ml,加三氯化铁试液1~2滴,若溶液呈现绿色、蓝黑色或暗紫色即说明反应呈阳性,样品中含鞣质,反之则说明不含鞣质。
六、桃胶多糖及桃胶多糖提取物中淀粉和糊精的检测:将待测样品的水溶液煮沸冷却后,加碘2~3滴,若溶液呈蓝色、绿色即说明反应呈阳性,样品中含淀粉;若溶液呈红色,即反应也呈阳性,说明样品中含有糊精,反之则说明样品中不含淀粉和糊精,反应呈阴性。
实施例1桃胶多糖提取物
桃胶多糖提取物的制备方法为:
(1)粉碎:将天然原桃胶进行粉碎,全部通过20目标准筛,得到天然原桃胶粗粉,备用。称上述天然原桃胶粗粉25g,倾入2000ml三口烧瓶中,向其中加入纯水125ml(5ml/g桃胶粗粉),形成桃胶混悬液;
(2)生物酶解:将桃胶混悬液加热至40℃,向其中加入碱性蛋白酶0.63g(0.005g/ml桃胶混悬液),保温并搅拌1h,进行生物酶解,得料液1;
(3)低温水解:将料液1升温至40℃,向其中加入固体氢氧化钠12.5g(0.1g/ml料液1),保温并搅拌1h,进行低温水解,得料液2;
(4)调节pH:向料液2中加入纯水500ml(20ml/g桃胶粗粉),在40℃条件下,保温并搅拌0.5h,桃胶全部溶解成透明溶液;用稀盐酸(浓盐酸∶水为体积比1∶4)调节料液pH=6.5,过滤,得精滤液;
(5)纯化:上述精滤液上氢型阳离子交换树脂分离柱(型号:924,吸附量2.4g/ml树脂),纯水洗脱,收集洗脱液,采用菲林试剂法检测洗脱液至无多糖反应时停止收集,得洗脱液1;将洗脱液1上弱碱性阴离子交换树脂分离柱(型号:900,吸附量为2.4g/ml树脂),纯水洗脱,收集洗脱液,采用菲林试剂法检测洗脱液至无多糖反应时停止收集,得洗脱液2;洗脱液2再用大孔吸附树脂(型号:AB-8,对多糖的吸附量为0.34mg/ml湿树脂)进行分离,纯水洗脱,收集洗脱液,采用菲林试剂法检测洗脱液至无多糖反应时停止收集,得纯化液,对并用纯化液体积3%的活性白土对纯化液进行脱色处理,得料液3;
(6)浓缩:利用旋转蒸发器对料液3进行减压浓缩,浓缩条件:在60℃、-0.085Mpa的条件下进行减压浓缩。浓缩至料液3中固含量达6.0%时,停止浓缩,得浓缩液;
(7)干燥:将浓缩液进行喷雾干燥,收集喷雾干粉,得桃胶多糖提取物15.1g,收率为60.4%,平均分子量为150,000道尔顿。
该桃胶多糖提取物中含有桃胶多糖87.3wt%,氮元素0.056wt%,鞣质未检出,糊精未检出,淀粉未检出,灰分1.9wt%;该桃胶多糖中的葡萄糖醛酸占桃胶多糖提取物重量的14.2%。
该桃胶多糖提取物水溶液(浓度为10wt%)的特性粘度为3.36Pa.S;25℃下,由NDJ-1动力粘度计测得。该桃胶多糖提取物水溶液(浓度为10wt%)的pH值为6.02。
薄层层析法显示:桃胶多糖提取物中含有阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖醛酸。
实施例2桃胶多糖提取物
桃胶多糖提取物的制备方法为:
(1)研磨:将树干中采摘的湿桃胶30.0g剪切、粉碎,向其中加入纯水700ml(23.3ml/g湿桃胶),置于50℃纯水中溶胀24h,研磨,得桃胶混悬液备用。
(2)生物酶解:将上述桃胶混悬液倾入2000ml三口烧瓶中,加热至50℃,向其中加入中性蛋白酶22.5g(0.032g/ml桃胶混悬液),保温并搅拌3h,进行生物酶解,得料液1;
(3)低温水解:将料液1升温至50℃,向其中加入固体氢氧化钠140g(0.2g/ml料液1),保温并搅拌3h,进行低温水解,得料液2;
(4)调节pH:向料液2中加入纯水1500ml(50ml/g湿桃胶),在50℃条件下,保温并搅拌0.5h,桃胶全部溶解成透明溶液;用稀盐酸(浓盐酸∶水为体积比1∶4)调节料液pH=6.5,过滤,得精滤液;
(5)纯化:将上述精滤液上钠型阳离子交换树脂分离柱(型号:D001,吸附量为2.8g/ml树脂),纯水洗脱,收集洗脱液,采用菲林试剂法检测洗脱液至无多糖反应时停止收集,得洗脱液1;将洗脱液1上弱碱性阴离子交换树脂分离柱(型号:D301-F,吸附量为2.8g/ml树脂),纯水洗脱,收集洗脱液,采用菲林试剂法检测洗脱液至无多糖反应时停止收集,得洗脱液2;将洗脱液2再用大孔吸附树脂(型号:NKA-9,对多糖的吸附量为0.30mg/ml树脂)进行分离,纯水洗脱,收集洗脱液,采用菲林试剂法检测洗脱液至无多糖反应时停止收集,得纯化液,对并用纯化液体积0.5%的活性炭对纯化液进行脱色处理,得料液3;
(6)浓缩:利用旋转蒸发器对料液3进行减压浓缩,浓缩条件:在70℃、-0.085Mpa的条件下进行减压浓缩。浓缩至料液3中固含量达8.0%时,停止浓缩,得浓缩液;
(7)干燥:将浓缩液进行喷雾干燥,收集喷雾干粉,得桃胶多糖提取物13.5g,收率为45.0%,平均分子量为70,000道尔顿。
该桃胶多糖提取物中含有桃胶多糖98.5wt%,氮元素0.073wt%,鞣质未检出,糊精未检出,淀粉未检出,灰分1.6wt%;该桃胶多糖中的葡萄糖醛酸占桃胶多糖提取物重量的20.0%。
该桃胶多糖提取物水溶液(浓度为10wt%)的特性粘度为2.59Pa.S;25℃下,由NDJ-1动力粘度计测得。该桃胶多糖提取物水溶液(浓度为10wt%)的pH值为5.06。
薄层层析法显示:桃胶多糖提取物中含有阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖醛酸。
实施例3桃胶多糖提取物
桃胶多糖提取物的制备方法为:
(1)粉碎:将天然原桃胶进行粉碎,全部通过20目标准筛,得到天然原桃胶粗粉,备用。称上述天然原桃胶粗粉25g,倾入5000ml三口烧瓶中,向其中加入纯水1500ml(60ml/g桃胶粗粉),形成桃胶混悬液;
(2)生物酶解:将桃胶混悬液加热至60℃,向其中加入复合蛋白酶75.0g(0.05g/ml桃胶混悬液),保温并搅拌5h,进行生物酶解,得料液1;
(3)低温水解:将料液1升温至60℃,向其中加入固体氢氧化钠600g(0.4g/ml料液1),保温并搅拌5h,进行低温水解,得料液2;
(4)调节pH:向料液2中加入纯水3000ml(120ml/g桃胶粗粉),在60℃条件下,保温并搅拌0.5h,桃胶全部溶解成透明溶液;用稀盐酸(浓盐酸∶水为体积比1∶4)调节料液pH=6.5,过滤,得精滤液;
(5)纯化:将上述精滤液上钠型阳离子交换树脂分离柱(型号:D001,吸附量为2.8g/ml树脂),纯水洗脱,收集洗脱液,采用菲林试剂法检测洗脱液至无多糖反应时停止收集,得洗脱液1;将洗脱液1上弱碱性阴离子交换树脂分离柱(型号:900,吸附量为2.4g/ml树脂),纯水洗脱,收集洗脱液,采用菲林试剂法检测洗脱液至无多糖反应时停止收集,得洗脱液2;将洗脱液2再用大孔吸附树脂(型号:D 101,对多糖的吸附量为0.26mg/ml树脂)进行分离,纯水洗脱,收集洗脱液,采用菲林试剂法检测洗脱液至无多糖反应时停止收集,得纯化液,对并用纯化液体积0.5%的活性炭对纯化液进行脱色处理,得料液3;
(6)浓缩:利用旋转蒸发器对料液3进行减压浓缩,浓缩条件:在80℃、-0.085Mpa的条件下进行减压浓缩。浓缩至料液3中固含量达5.0%时,停止浓缩,得浓缩液;
(7)干燥:将浓缩液进行喷雾干燥,收集喷雾干粉,得桃胶多糖提取物10.8g,收率为43.2%,平均分子量为8,000道尔顿。
该桃胶多糖提取物中含有桃胶多糖101.6wt%,氮元素0.067wt%,鞣质未检出,糊精未检出,淀粉未检出,灰分0.5wt%;该桃胶多糖中的葡萄糖醛酸占桃胶多糖提取物重量的10.6%。由于测试方法的限制,桃胶多糖含量高于100%是由实验误差导致的。
该桃胶多糖提取物水溶液(浓度为10wt%)的特性粘度为1.42Pa.S;25℃下,由NDJ-1动力粘度计测得。该桃胶多糖提取物水溶液(浓度为10wt%)的pH值为4.31。
薄层层析法显示:桃胶多糖提取物中含有阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖醛酸。
实施例4桃胶多糖
一、桃胶多糖的制备
将上述实施例1~3所得的桃胶多糖提取物分别用Sevag法和透析法进行纯化,得到3个桃胶多糖:
①用纯水溶解桃胶多糖提取物(纯水用量为600ml/g桃胶多糖提取物)得水溶液;
②加入水溶液体积1/5的三氯甲烷,再加入三氯甲烷体积1/5的正丁醇,剧烈振摇20min,离心,分去水相和有机相交界处的变性蛋白质;
③重复步骤②至水相在280nm处的吸光度值不再下降为止;其中三氯甲烷和正丁醇加入步骤②中的水相中。
④将所述水相减压浓缩至半流质状浓缩液,向该浓缩液中加入浓缩液体积量3倍的95%乙醇,充分混合,离心,得沉淀物1。将该沉淀物1用其重量100倍的去离子水溶解,离心,去不溶物,得清夜1。将该清液1装入透析袋内进行透析,用去离子水冲洗12h,收集透析袋中透析后的清液2。将该清液2与其3倍体积量的无水乙醇充分混合,再次离心,得沉淀物2。用无水乙醇对该沉淀物2脱水后,于60℃真空干燥,得到本发明的桃胶多糖1~3,分别对应实施例1~3中的桃胶多糖提取物。
二、桃胶多糖的性质
1、桃胶多糖红外光谱分析:
红外光谱条件:溴化钾压片;样品扫描次数:32次;背景扫描次数:32次;分辨率:4.000;样品得率:1.0;镜速度:0.6329;孔径:100.00;检测器:DTGS KBr;光源:IR。
结论:本发明的桃胶多糖1~3在4000~650cm-1具有多糖类物质的一般特征,表现为:在3600~3300cm-1区有强峰、宽峰(3417cm-1),对应于缔合羟基的O-H键伸缩振动,说明是多聚糖;2929cm-1有一弱峰,为C-H吸收峰;1616.1cm-1的吸收峰是羧酸离子的C=O非对称伸缩振动,说明桃胶多糖中含有羧基,以此推断其中含有葡萄糖醛酸;1400~1200cm-1的一些峰为C-H的变角振动;1260~1000cm-1区间有C-O键的伸缩振动;840.8cm-1为α-吡喃糖苷键的特征峰,894.8cm-1为β-吡喃糖苷键的特征峰,表明桃胶多糖的结构中同时有α-吡喃糖苷键和β-吡喃糖苷键。
2、桃胶多糖紫外光谱分析
桃胶多糖1~3经紫外分光光度仪在200~400nm进行波长扫描,结果显示在260nm和280nm处均无紫外吸收峰,表明该桃胶多糖样品中不含核酸和蛋白质,多糖纯度很高,桃胶多糖1的紫外光谱图见图2,桃胶多糖2和3同图2。
3、经检测,桃胶多糖1~3均不含鞣质、淀粉和糊精。
4、薄层层析法显示:桃胶多糖1~3中皆含有阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖醛酸。
5、成分和性能数据:
桃胶多糖1:桃胶多糖的收率为97.3%,平均分子量为150,000。
经GC-MS检测,桃胶多糖1中,中性总糖包括下列含量的糖基:51.71%阿拉伯糖、33.29%的葡萄糖、9.24%的木糖、1.28%的鼠李糖、1.29%的半乳糖和0.63%的甘露糖;含量为相对于桃胶多糖1重量的百分比。
经咔唑硫酸法检测,桃胶多糖1中含有葡萄糖醛酸14.9%;含量为相对于桃胶多糖1重量的百分比。
该桃胶多糖水溶液(浓度为10wt%)的特性粘度为3.36Pa.S;25℃下,由NDJ-1动力粘度计测得。该桃胶多糖水溶液(浓度为10wt%)的pH值为6.02,桃胶多糖水溶液(浓度为10wt%)比旋度为
桃胶多糖2:桃胶多糖的收率为98.6%,平均分子量为70,000。
经GC-MS检测,桃胶多糖2中,中性总糖包括下列含量的糖基:50.61%阿拉伯糖、32.29%的葡萄糖、10.24%的木糖、1.98%的鼠李糖、1.69%的半乳糖和1.03%的甘露糖;含量为相对于桃胶多糖1重量的百分比。
经咔唑硫酸法检测,桃胶多糖2中含有葡萄糖醛酸20.1%;含量为相对于桃胶多糖2重量的百分比。
该桃胶多糖水溶液(浓度为10wt%)的特性粘度为2.59Pa.S;25℃下,由NDJ-1动力粘度计测得。该桃胶多糖水溶液(浓度为10wt%)的pH值为5.06,桃胶多糖水溶液(浓度为1wt%)的比旋度为
桃胶多糖3:桃胶多糖的收率为98.3%,平均分子量为8,000。
经GC-MS检测,桃胶多糖3中,中性总糖包括下列含量的糖基:52.03%阿拉伯糖、32.23%的葡萄糖、8.73%的木糖、1.05%的鼠李糖、1.46%的半乳糖和0.57%的甘露糖;含量为相对于桃胶多糖1重量的百分比。
经咔唑硫酸法检测,桃胶多糖3中含有葡萄糖醛酸10.8%;含量为相对于桃胶多糖3重量的百分比。
该桃胶多糖水溶液(浓度为10wt%)的特性粘度为1.42Pa.S;25℃下,由NDJ-1动力粘度计测得。该桃胶多糖水溶液(浓度为10wt%)的pH值为4.32,该桃胶多糖水溶液(浓度为1wt%)的比旋度为
效果实施例1桃胶多糖和桃胶多糖提取物的溶解性和稳定性
1、溶解性:
分别称取一定量的实施例4中的桃胶多糖1~3和实施例1~3中的桃胶多糖提取物(简称提取物1~3),溶于一定量的各种溶剂中,高速均匀搅拌,待桃胶多糖和桃胶多糖提取物溶解或均匀分散后,将溶液离心后观察其状态,具体方法和结果见表1。表1中乳化液的制备方法为:桃胶多糖或其提取物配制成5%的水溶液,用柠檬酸调节其pH为4.0,加入体积总量2%(v/v)的芳香姜油,16,000r/min进行剪切乳化,乳化条件:20℃,20min;制成初乳,然后经高压均质机在40-70mpa压力下进行乳化,即得乳化液。
表1
由表1可见:
(1)本发明桃胶多糖和桃胶多糖提取物均可以溶解于水、含可溶性蛋白的水溶液以及低浓度的有机溶剂(乙醇、丙二醇、丁二醇、甘油等)中,同时桃胶多糖和桃胶多糖提取物均可以溶解或分散于乳化液(软磷脂、油脂等)中。
(2)添加了桃胶多糖和桃胶多糖提取物的各类混合液的体系均十分稳定,无分层和/或沉淀现象发生,说明桃胶多糖和桃胶多糖提取物对稳定溶液体系具有明显的作用。
2、稳定性
(1)分别配制pH=4.0、6.0、8.0、10.0的溶液中,将桃胶多糖1~3和桃胶多糖提取物1~3溶解于上述pH值溶液中,分别配制成5.0wt%和10.0wt%两种浓度。以纯水溶解桃胶多糖和桃胶多糖提取物作为基础对照数据。在室温保存条件下,分别于0h、1天、2天、5天、15天、30天测定其粘度、透光率和pH值变化。
试验结果表明:桃胶多糖1~3和桃胶多糖提取物1~3经上述测试,粘度、透光率和pH均无明显变化,外观透明、无分层和沉淀现象,证明其有良好的稳定性。
(2)桃胶多糖和桃胶多糖提取物别配制成浓度为5.0wt%和10.0wt%的水溶液,将上述样品溶液分别置于-18℃(冰柜冷冻)、室温、40℃、60℃、80℃条件下,放置0、5、10、15、20、30天,取样,测定粘度、透光率和pH值变化。
试验结果表明:桃胶多糖和桃胶多糖提取物经上述测试,粘度、透光率和pH均无明显变化,外观透明、无分层和沉淀现象,证明其有良好的稳定性。
(3)桃胶多糖和桃胶多糖提取物别配制成5.0wt%h和10.0wt的溶液,述样品溶液分别置于自然光照条件下,放置0、5、10、15、20、30天,取样,测定粘度、透光率和pH值变化。
试验结果表明:桃胶多糖和桃胶多糖提取物经上述测试,粘度、透光率和pH均无明显变化,外观透明、无分层和沉淀现象,证明其有良好的稳定性。
(4)分别取桃胶多糖和桃胶多糖提取物粉末,用PE袋塑封包装,外套一只PE袋用扎口绳扎口。将该包装好的样品置于-18℃(冰柜冷冻)、25℃、40℃和60℃保存,分别于第1、2、3、6个月取样,重点考察以下项目:外观、pH值、粘度、分子量、透光率、葡萄糖醛酸含量和桃胶多糖含量。
试验结果表明:桃胶多糖和桃胶多糖提取物经上述测试,样品粉末色泽均物变化,无结块现象发生;样品溶解后测定其pH、粘度、分子量和透光率均无明显变化,外观透明、无分层和沉淀现象;桃胶多糖提取物中萄糖醛酸含量和桃胶多糖含量均无明显变化。
效果实施例2桃胶多糖提取物在乳饮料中的应用
采用实施1的桃胶多糖提取物,葡萄糖醛酸含量为14.2%。
1.乳液样品的制备方法:
(1)溶液一的配制(2%全脂奶粉水混悬溶液):称6.0g全脂奶粉溶解于300ml纯水中,快速搅拌至全部溶解,备用;
(2)溶液二的配制(2%桃胶多糖提取物溶液):称4.0g桃胶多糖提取物溶解于200ml 0.1%的尼泊金乙酯水溶液中,快速搅拌至全部溶解,备用;
(3)将120ml溶液二在快速搅拌状态下加入溶液一中,搅拌均匀测乳液pH=7.04。向其中加入5%柠檬酸水溶液11.5ml调节乳液pH=3.90,测乳液温度为:28.5℃。
(4)利用高剪切乳化分散机对上述乳液进行乳化,乳化条件:16000r/min;乳化时间:20分钟。乳化结束,测乳液温度为:39.0℃。
(5)将上述乳液加热至80℃,保温30分钟灭菌。灭菌结束后,静置30分钟,乳液无沉淀、絮凝产生,体系呈乳白色稳定体系,降温至室温(30℃),得乳液样品。
(6)空白对照实验:向溶液一中加入5%柠檬酸水溶液11.5ml调节乳液pH=3.90,测乳液温度为:28.9℃;利用高剪切乳化分散机对上述乳液进行乳化,乳化条件:16000r/min;乳化时间:20分钟。乳化结束,测乳液温度为:38.3℃;将上述乳液加热至80℃,保温30分钟灭菌。得空白对照乳液,灭菌结束后,静置30分钟,降温至室温(30℃),空白对照乳液体系即产生明显的分层,有沉淀、絮凝现象产生,乳液不稳定,将乳液置于100倍光学显微镜下观察,具体结果见图3。
2.稳定性测试结果:
(1)离心沉淀法:在离心管中加入适量上述乳液样品,利用低速离心机在4000r/min的转速下离心30min,弃去离心管中的乳液,离心管倒置在滤纸上30min,称量底部沉淀物重量,按式3计算沉淀率,沉淀率越小,说明乳液样品越稳定。
将乳液样品分别置于冷冻(-18℃)、冷藏(8℃)、恒温恒湿箱(40℃)、室温(30℃)中放置5天,用离心沉淀法考察在不同温度下放置5天前后,乳液样品的稳定性,具体数据如表2所示:
表2离心沉淀率
|
初始样品离心沉淀率(%) |
5天后样品离心沉淀率(%) |
-18℃ |
0.99 |
1.76 |
8℃ |
0.99 |
1.44 |
室温(30℃) |
0.99 |
1.05 |
40℃ |
0.99 |
0.96 |
(2)体系稳定常数法:
本法是研究乳液稳定性的定量方法,乳液离心前后光密度变化百分率称为稳定常数,用Ke表示,其表达式如式4所示:
Ke=(Ao-A)/A×100% 式4
式4中,Ke——稳定常数
Ao——未离心乳液的吸光度
A——离心后乳液的吸光度
测定方法:
取适量乳液样品于离心管中,用低速离心机在4000r/min的转速下离心30min,用紫外分光光度计在波长780nm处测定其吸光度A,再与离心前样品吸光度A0比较,带入公式计算Ke。Ke值愈小乳剂愈稳定。同时,直接以H=A/A0×100%的比值也可作为乳液体系稳定性的判断指标。H值为:98%~100%说明体系稳定。若低于此值则表明乳液的稳定性差。
将乳液样品在不同温度下放置5天,用体系稳定法考察样品稳定性,具体数据如表3所示:
表3体系稳定常数
|
Ke值(%) |
H值(%) |
-18℃ |
1.50 |
98.51 |
8℃ |
0.95 |
99.06 |
室温(30℃) |
0.69 |
99.31 |
40℃ |
0.33 |
99.66 |
(3)显微快速判断法:将上述乳液样品置于100倍光学显微镜下观察,如果样品乳糜颗粒大小均匀,分散性好,无聚结现象,说明体系稳定。
乳液样品在不同温度条件:-18℃、8℃、40℃和30℃中放置5天,显微快速判断法考察体系稳定性,具体结果见图4~7。乳液样品(试验样品)放置5天后与5天前相比几乎没有变化。空白对照样品静置30分钟后即发生絮凝等现象。
3.结论
从上述稳定性试验来看,桃胶多糖提取物具有稳定牛奶蛋白的作用;常温、冷冻、冷藏或40℃储藏,均具有较好的稳定性,因此桃胶多糖提取物作为牛奶体系中的稳定剂具有较好的应用前景。