CN105431491B - 来源于京尼平或含京尼平材料的着色剂复合物 - Google Patents
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Abstract
本公开内容提供了着色剂复合物和分离来源于京尼平与胺的反应的着色剂复合物的方法。着色剂组合物包含通过用色谱对反应所得物质进行多次分级得到的经纯化的化合物(例如，经纯化的聚合物或经纯化的二聚物)。所述经纯化的聚合物或二聚物可以单独或与另一种着色剂组合用作着色剂以赋予食物、药物、化妆品、医疗装置和纺织品颜色。
Description
发明背景
1.技术领域
本公开内容涉及着色剂复合物、包含其的组合物以及制造和使用其的方法，所述着色剂复合物是从美洲格尼帕树(Genipa americana)汁，京尼平或京尼平类似物与胺的反应中分离的。
2.背景技术
消费者对使用合成着色剂的怀疑(主要由于其毒性)导致了天然着色剂化合物的研究和开发。这些化合物已被使用了多个世纪，但是最近的技术进展使得这些着色剂能够在工业上和商业上可行，并且能够与合成着色剂竞争。参见联合国贸易和发展会议(2005)提出的“Market Brief in the European Union for selected natural ingredientsderived from native species；Genipa americana”。国际上，天然着色剂(例如，美洲格尼帕树的蓝色和黑色着色剂)在食物、化妆品和纺织工业中均有使用。
制备蓝色着色剂的方法已报道过。例如Echeverri等(美国专利No.7,927,637，其内容通过引用整体并入本文中)描述了制备pH稳定的蓝色着色剂的方法，所述蓝色着色剂来源于从美洲格尼帕树果肉获得的未加工原汁与甘氨酸的混合物。制备蓝色着色剂的另一些实例包括H.Okuyama等的日本专利公开No.52053932A2和52053934A2，其描述了由伯胺与京尼平的自发反应制备的蓝紫色着色剂；以及Wu等(WO2009/120579)，其描述了将美洲格尼帕树汁与其他果汁(例如西瓜)和氨基酸混合。这些现有方法一般使用不经进一步纯化得到的粗混合物，其原因可能是本领域公认的纯化这些混合物的难度。参见Touyama R等，Studies on the Blue Pigments Produced from genipin andmethylamine.I.Structures of the Brownish-Red Pigments,Intermediates Leadingto the Blue Pigments,Chem Pharm.Bull 42,66,1994(来源于京尼平或结构类似物与氨基酸的反应的蓝色颜料“基于其色谱行为、不可分析的13C-NMR谱图并通过分子量测量被发现是难以处理的高分子聚合物的混合物”)。关于蓝色颜料材料分子结构的描述有限，这是因为这种材料由于其非常高的极性而几乎只溶于水，从而导致TLC监测困难。已报道了分子量为9000的聚合物(参见H.Jnouye,Y等，26th Symposium on the Chemistry of NaturalProduct,Kyoto,摘要.第577至584页,1983)。最近，Wu和Horn(美国公开No.2013/0115252)描述了从美洲格尼帕树中富集京尼平的方法以及所富集的京尼平材料的用途。然而，“富含京尼平的提取物”被公开为30％至97％(重量/重量)京尼平，并且组合物的剩余部分包含水分、脂肪、少量的酸和含氮化合物，余量为碳水化合物(参见美国公开No.2013/0115252，第3页，左栏)。
发明内容
本发明的贡献为克服关于来源于京尼平与氨基酸的反应的蓝色颜料材料的分子结构的知识缺乏。本文提供了包含基本上经纯化的着色剂复合物(例如，聚合物)的着色剂组合物，和分离着色剂复合物的方法以及使用经分离的着色剂复合物的方法。
某些实施方案涉及基本上经纯化的式1A或式1B的化合物、其几何异构体、其互变异构体、其盐或其组合；
某些实施方案涉及基本上经纯化的式2、3A或3B的化合物、其几何异构体、其互变异构体、其盐或其组合。
某些实施方案涉及着色剂组合物，所述着色剂组合物包含式4的聚合物：
其几何异构体、其互变异构体或其盐，
其中n为2至200的整数；
其中A各自独立地选自式5A、式5B、式5C、其几何异构体、其互变异构体、其盐及其组合：
其中：
R1为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基；
R2和R′2独立地为氢或C1-10烷基；
R3是氢或COOH；
并且其中T1为氢或甲基；且T2为氢或A-T1，其中A和T1如上所限定；
其中所述着色剂组合物基本上不含选自式6、式7、式8、其几何异构体、其互变异构体及其盐的第一附加化合物：
在一些实施方案中，着色剂组合物包含式4的聚合物：
其几何异构体、其互变异构体或其盐，
其中n为2至20的整数；
其中A各自独立地选自式5′A、式5′B、式5′C、其几何异构体、其互变异构体、其盐及其组合：
其中：
R1为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基；
并且其中T1为氢或甲基；且T2为氢或A-T1，其中A和T1如上所限定；
其中所述着色剂组合物基本上不含选自式2′、式3′A、式3′B、其几何异构体、其互变异构体及其盐的第一附加化合物：
在一些实施方案中，R1是甲基。在一些实施方案中，按聚合物的重量计第一附加化合物的总重量小于1％。
某些实施方案涉及基本上经纯化的式3′A(Me)或式3′B(Me)的化合物、其几何异构体、其互变异构体、其盐或其组合：
某些实施方案涉及基本上经纯化的式4的聚合物：
其几何异构体、其互变异构体或其盐，
其中n为2至20的整数；
其中A各自为式5′A(Me)、其几何异构体、其互变异构体或其盐：
其中T1是氢或甲基；且T2是氢或A-T1，其中A和T1如上所限定。
某些实施方案涉及经纯化的着色剂复合物以及来源于京尼平与甘氨酸的反应的着色剂复合物的分离方法。在一些实施方案中，着色剂复合物来源于经纯化的京尼平(例如，按重量计大于80％、85％、90％、95％或99％)与甘氨酸的反应。在一些实施方案中，着色剂复合物来源于甘氨酸与包含京尼平的汁的反应。在一些实施方案中，着色剂复合物来源于甘氨酸与来自美洲格尼帕树的果汁的反应。在一些实施方案中，着色剂复合物来源于经纯化的甘氨酸与京尼平的反应，其中所述京尼平是经纯化的京尼平(例如，按重量计大于80％、85％、90％、95％或99％)或包含京尼平的汁。在一些实施方案中，着色剂复合物来源于包含甘氨酸的混合物(例如，包含甘氨酸的汁或包含甘氨酸的干混合物如包含甘氨酸的汁浓缩物)与京尼平的反应，其中所述京尼平是经纯化的京尼平(例如，按重量计大于80％、85％、90％、95％或99％)或包含京尼平的汁。在一些实施方案中，着色剂复合物来源于包含甘氨酸的汁(例如果汁，如来自以下的汁：西瓜、白葡萄、菠萝、荔枝、哈密瓜、香蕉、桔子、苹果、梨、柠檬、西番莲果、红葡萄、蓝莓、罗望子、桃、木瓜、巴西莓、李子、番石榴、柑橘、博罗霍果、古布阿苏果、枸杞或猕猴桃)与包含京尼平的汁(例如果汁，如来自美洲格尼帕树的汁)的反应。在一些实施方案中，着色剂复合物来源于来自西瓜的汁与来自美洲格尼帕树的汁的反应。
某些实施方案涉及分离着色剂复合物的方法，所述方法包括：用醇溶剂提取来源于京尼平与甘氨酸的反应的蓝色混合物，以产生醇溶性部分和醇不溶性部分；纯化醇溶性部分或醇不溶性部分。在一些实施方案中，蓝色混合物为来源于京尼平与甘氨酸的反应的干粉(例如，冻干粉)。
某些实施方案涉及基本上经纯化的着色剂复合物，所述着色剂复合物包含经纯化的式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐。在一些实施方案中，基本上经纯化的着色剂复合物包括式2、式3′A(Me)或式3′B(Me)的二聚物。在一些实施方案中，基本上经纯化的着色剂复合物，例如聚合物(例如，式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐)，不含碳水化合物，例如糖。在一些实施方案中，基本上经纯化的着色剂复合物包含至少80％、85％、90％、95％、99％或100％不含碳水化合物并且至少80％、85％、90％、95％、99％或100％不含其他杂质(例如，单体、二聚物、脂肪酸、脂肪、蛋白质和/或有机酸)的聚合物(例如，式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐)。
在一些实施方案中，赋予基质蓝色的方法包括使所述基质与本文所述的着色剂组合物相接触。在一些实施方案中，所述基质是食物、药物或营养品、化妆品或医疗装置。在一些实施方案中，着色剂组合物包含经纯化的式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐。在一些实施方案中，着色剂组合物包含基本上纯的式2、式3′A(Me)或式3′B(Me)的二聚物。
附图说明
图1A-B示出1号化合物的两种异构体形式的化学式。
图2A-B示出1号化合物的两种异构体形式的化学式的另一种表示。
图3A-B示出3号化合物的两种异构体形式的化学式。
图4A-B示出3号化合物的两种异构体形式的化学式的另一种表示。
图5示出了从京尼平与甘氨酸的反应中分离的化合物1的核磁共振(NMR)波谱学谱图。
图6示出了从京尼平与甘氨酸的反应中分离的化合物3的NMR波谱学谱图。
图7示出从京尼平与甘氨酸的反应中分离的S31、S32、S33和S34级(来源于S3级分)的NMR谱图。
图8是具有式4的聚合物结构的示意图。
图9示出了从京尼平与甘氨酸的反应中分离的不溶性部分的NMR谱图。
图10示出了从京尼平与甘氨酸的反应中分离的聚合物的1H-13C固态NMR谱图。
图11示出了通过选择性分子量过滤从京尼平与甘氨酸的反应中分离的聚合物得到的质谱图。
图12示出了从京尼平与甘氨酸的反应中分离的聚合物的红外图谱。
图13A-D示出了四个样品(A、B、C和D)的高效液相色谱(HPLC)迹线，所述样品包含来自美洲格尼帕树汁与甘氨酸的反应的蓝色聚合物。A)粉线240nm，吸光度较低的蓝线590nm；B)在240nm和590nm处的吸光度几乎相等；C)在590nm处的吸光度较大；以及D)具有载体的生料(raw batch)。
图14A-F分别示出了蓝色聚合物参考标准溶液的校正曲线1至6。
图15示出了样品PF、FC和PC(参见实施例10中关于PF、FC和PC的定义)的HPLC谱图和UV吸收。
图16示出了样品PF、FC和PC的颜色参数。
图17示出了从XAD-7树脂中洗脱的聚合物部分和水性部分的HPLC谱图。
图18示出了美洲格尼帕树汁与不同氨基酸的反应产物的紫外可见吸收光谱。
图19A-C示出了美洲格尼帕树汁与不同氨基酸的反应产物的HPLC分析(根据氨基酸来分类)。图19A-C示出了对于每种氨基酸，(19A)甘氨酸、赖氨酸和缬氨酸；(19B)甲硫氨酸和脯氨酸；以及(19C)酪氨酸和色氨酸的以下内容：使用实施例6的方法，美洲格尼帕树汁与氨基酸的反应产物的HPLC谱图；鉴别出聚合物的HPLC区域的放大图；以及所选择信号的紫外可见光谱。
图20示出了在254nm处的UV照射下在pH为3.0的缓冲溶液中不同氨基酸与美洲格尼帕树汁的反应产物的稳定性(以半衰期表示)。
图21A示出了新鲜美洲格尼帕树果实的中果皮的水性提取物的HPLC图谱，所述HPLC图谱具有保留时间为19分钟至20分钟的峰，接近京尼平的保留时间(22分钟至23分钟)，并且最大吸收波长在240nm处。
图21B示出了美洲格尼帕树果实的中果皮(果皮)的水性提取物的HPLC图谱，所述美洲格尼帕树果实的年龄与图21A中的相同，但在提取前于室温下放置三天。所述图谱具有保留时间为19分钟至20分钟和22分钟至23分钟的峰。
图22示出了从美洲格尼帕树果实的中果皮(果皮)的水性提取物与甘氨酸中得到的紫色产物的1H NMR。
图23示出了从使美洲格尼帕树果实的中果皮(果皮)的经预热水性提取物与甘氨酸反应的方法中得到的蓝色产物的1H NMR。
图24示出了囊果皮(外果皮)、内果皮(果肉)和中果皮(果皮)被标记的美洲格尼帕树(哈瓜)的未熟果实。
图25A-B示出了京尼平(25A)和在中果皮中发现的前驱体(25B)在CD3OD(水抑制)中的1H NMR图谱。
图26A-B示出了中果皮水提取物(26A)和水提取物的乙酸乙酯溶剂区(26B)的HPLC图谱(240nm)。
图27示出了中果皮水提取物的HPLC图谱(240nm)，所述中果皮来自在收获后的数天期间保持在室温条件下的哈瓜果实。
图28示出了中果皮的水提取物的1H NMR实验，场区被放大以示出预计醛峰所在的区域。
图29示出了在哈瓜中果皮中发现的京尼平前驱体的13C NMR谱图。
图30示出了京尼平(1)和京尼平苷(2)的化学结构。
图31示出了通过以下得到的色谱图：Me-Gly：美洲格尼帕树汁与甘氨酸和甲硫氨酸同时反应；1+2：甲硫氨酸与美洲格尼帕树汁反应后与甘氨酸反应；以及RN：美洲格尼帕树汁与单独的甘氨酸反应。
发明详述
定义
如本文所使用的术语“聚合物”意指通过聚合形成并且基本上由重复的结构单元组成的化学化合物或所述化合物的混合物。
本文中经纯化的聚合物可以理解为具有特定分子结构和固定数目的重复结构单元的经纯化的单一化学化合物。经纯化的聚合物也可以理解为在聚合反应中形成的具有多个聚合度(即，重复结构单元的数目可以不同)的聚合化合物的混合物。
方案1示出了反应物1(例如京尼平，R1＝Me)和反应物2(例如甘氨酸，R3＝COOH，R2和R′2为H)的示例性聚合反应。来自方案1中所述反应的经纯化的聚合物于是可以是单个聚合物分子(式4的单个聚合物分子意指式中的T1、T2、A和n是固定的)的某一纯度(例如，包含按重量计大于75％、80％、85％、90％或95％的聚合物)的经分离聚合物组合物。来自方案1中所述反应的经纯化的聚合物也可以是聚合化合物的混合物的某一纯度(例如，包含按重量计大于75％、80％、85％、90％或95％的聚合物)的经分离聚合物组合物，所述聚合化合物在反应混合物中形成，其具有相同的重复结构单元但是具有不同的聚合度(例如，在式4中，聚合化合物具有相同的A值，但具有不同的n值)。
方案1
在某些实施方案中，本文中的聚合物通过分子式(例如，式4、其几何异构体、其互变异构体或其盐)来表征。如本文所使用的的术语“式4的聚合物”是指具有根据式4或其几何异构体、其互变异构体或其盐的结构的一种或更多种聚合物。在某些实施方案中，本文中的聚合物通过物理数据(例如，谱图数据、分子量分布)来表征。用于表征聚合物的方法是本领域已知的。例如，聚合物可以通过谱学方法(例如IR、紫外/可见、NMR、MS等)表征；并且可以分析聚合物的分子量以获得数均分子量(Mn)和/或重均分子量(Mw)。
如本文所使用的术语几何异构体意指除了在双键处具有不同构型(即，E异构体或Z异构体，或顺式/反式异构体)之外结构相同的异构体。为了说明，方案2示出了一对的两个几何异构体的实例，其中两个异构体之间的唯一区别在于双键处的构型。
方案2
如本文所使用的术语互变异构体(tautomer)或互变异构体(tautomeric isomer)意指可以通过互变异构化互相转化的化合物。互变异构化是本领域已知的，并且通常是指如方案3A中所示的反应。在大多数情况下，反应中的G基团为氢。
方案3A
互变异构体的另一个实例示于方案3B。方案3B不应被理解为示出了所有可能互变异构体结构。
方案3B
方案2、3A和3B中使用的的箭头是用于说明的目的，而不应被理解为异构体或互变异构体之间的真实平衡。
除非另有说明，否则如本文所使用的术语“盐”应理解为包括内盐或外盐二者。外盐的实例包括具有阳离子作为平衡离子的盐，所述阳离子为例如碱金属离子(例如，Na+、K+等)；碱土金属离子(例如，Mg2+、Ca2+等)；铵离子(例如，NH4 +或有机铵离子)等。外盐的实例还包括具有阴离子作为平衡离子的盐，所述阴离子为例如无机阴离子(例如，Cl-、SO4 2-、Br-、HSO4 -等)或有机阴离子(例如，羧酸阴离子，例如甲酸根、乙酸根等)。
如本文所使用的1号化合物、2号化合物和3号化合物是指如实施例部分中所述的从京尼平和甘氨酸的反应中分离的化合物。
如本文所使用的二聚物或二聚化合物意指基本上由两种单体组成的化合物。二聚物的实例包括1号化合物、2号化合物和3号化合物，以及式1A、1B、2、3A、3B、2′、3′A、3′B、3′A(Me)、3′B(Me)、6、7和8的化合物。
如本文所使用的“基本上不含”化合物(例如，第一附加化合物、第二附加化合物或其组合)意指所述化合物的总重量小于参照物(例如，式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐)的5重量％。在一些实施方案中，“基本上不含”化合物意指所述化合物的总重量小于参照物(例如，式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐)的4.5重量％、小于4重量％、小于3重量％、小于2重量％、小于1重量％、小于0.5重量％、小于0.1重量％或小于0.01重量％。在一些实施方案中，“基本上不含”化合物的组合物(例如，着色剂组合物)意指所述组合物不含所述化合物。在一些实施方案中，“基本上不含”化合物意指所述化合物的总重量为参照物(例如式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐)的0.01重量％至5重量％、0.01重量％至4.5重量％、0.01重量％至4重量％、0.01重量％至3重量％、0.01重量％至2重量％、0.01重量％至1重量％、0.01重量％至0.5％或0.01重量％至0.1重量％。
如本文所使用的术语“基本上经纯化的”或基本上纯的化合物(例如，基本上经纯化的聚合物、基本上经纯化的二聚物)是指纯度大于80％(例如，按重量计(例如干重，即不计算挥发性组分如溶剂(例如，水、CH3CN、MeOH、EtOH等))大于80％、85％、90％、95％或99％)的化合物。在一些实施方案中，基本上纯的式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐包含按干重计大于80％、85％、90％、95％或99％的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐。
本文所使用的术语经纯化的京尼平是指包含按重量计大于80％、85％、90％、95％或99％的京尼平的物质。同样地，本文所使用的术语经纯化的甘氨酸是指包含按重量计大于80％、85％、90％、95％或99％甘氨酸的物质。
本公开内容的着色剂的纯度可以通过已知的分析方法(例如，高效液相色谱(HPLC)分析)来测量。因此，样品中化合物(例如，二聚物、聚合物)的量化可以通过使用HPLC方法(例如与实施例部分中所述的方法类似)来实现。
包含二聚物的着色剂组合物
本发明提供了着色剂复合物及其分子结构式，以及来源于美洲格尼帕树京尼平与甘氨酸的反应的着色剂复合物的分离方法。在一些实施方案中，化合物是通过用色谱对反应所得材料进行多重分级得到的。在一些实施方案中，分子结构式由1H核磁共振谱(1HNMR)、J-调制(JMOD)、H-H相关谱(COSY 1H-1H)实验及其他分子结构工具分析而确定。
在一些实施方案中，式3A的着色剂复合物(在本申请中，式3A是呈优选同分异构形式的3号化合物)：
式3A
在另一个实施方案中，着色剂复合物具有式3B的同分异构形式(在本申请中，式3B是呈同分异构形式的3号化合物)：
式3B
某些实施方案涉及分离式3A的着色剂复合物的方法：
式3A
其中所述方法包括：
A.从美洲格尼帕树汁中分离京尼平；
B.使甘氨酸与所述京尼平反应以获得可溶于甲醇的材料；
C.通过色谱法将可溶于甲醇的材料分离成S1、S2、S3和S4级分；
D.再通过色谱法将S3级分分离成S31、S32、S33和S34级分。通过反相色谱法从S33级分中分离式I的化合物。
一个不太优选的实施方案涉及分离具有式3B的同分异构形式的化合物的方法：
式3B
所述方法包括：
A.从美洲格尼帕树汁中分离京尼平；
B.使甘氨酸与所述京尼平反应以获得可溶于甲醇的材料；
C.通过色谱法将可溶于甲醇的材料分离成S1、S2、S3和S4级分；
D.再通过色谱法将S3级分分离成S31、S32、S33和S34级分；
E.通过反相色谱法从S33级分中分离式I的化合物。
图3A和4A示出了3号化合物的优选同分异构形式的化学式的示意图。3号化合物是极深蓝色的着色剂物质。图3B和4B示出了3号化合物的不太优选的同分异构形式。图6示出了3号化合物的核磁共振(NMR)波谱图。3号化合物的NMR波谱图分析显示：
1H NMR(400MHz,D2O).δ8.6,8.0,7.9,6.7,3.90,1.8ppm。
13C NMR(100MHz).δ172.2,166.3,138.8,135.6,135.1,133.3,131.4,127.1,120.46,118.9,61.0,53.3,11.2ppm。
m/z 505[M+H]
3号化合物的进一步分析显示：
在质谱法中化合物3的质谱图显示m/z＝505[M+H]+，由此示出前述化合物的异构体。然而，1H和13CNM谱与其有很大不同。在质子谱中，检测到以下单峰：δ8.0、δ7.9和δ6.7(各自为2H)，以及在δ8.6处的一个额外的单峰(积分为1H)。其他信号为δ4.7(N-CH2)处的单峰以及δ3.9(OCH3)和δ1.8(CH3乙烯基)处的两个甲基。根据JMOD实验，还观察到以下碳原子：δ172.2处的羧基；δ166.3处的甲酯；(COOH)；δ138.8、δ135.1、δ127.1、δ120.4、δ118.9处的五个季碳原子；δ135.6、δ133.3、δ131.4、δ131.4处的四个次甲基；δ61.0(N-CH2)处的一个亚甲基；以及δ53.3(OCH3)和δ11.2(CH3乙烯基)处的两个甲基。根据HMBC实验确定了每个单体单元的结构的归属：δ7.9和δ8.0处的信号归属于吡啶基的质子，因为在δ61.0处检测到与N-亚甲基的长程相关性；另外，最后一个质子显示出与δ172.2处的甲酯羰基的3J耦合。此外，在甲基质子与δ131.4(C-7)处的单峰之间显示出其他重要的耦合。少量的芳香族质子和乙烯基质子表明存在对称的二聚分子，例如如图3A-3B所示。根据甲酯基的相对取向(图3A-3B)，可以将两种结构归属于该分子，但是再一次，由于空间位阻，结构B的可能性较低。
在另一个实施方案中，分离3号着色剂复合物的方法包括：
A.从美洲格尼帕树汁中分离京尼平；
B.使甘氨酸与所述京尼平反应以获得可溶于甲醇的材料；
C.通过色谱法将可溶于甲醇的材料分离成S1、S2、S3和S4级分；
D.再通过色谱法将S3级分分离成S31、S32、S33和S34级分(图7)。通过反相色谱法从S33级分中分离式I的化合物。
在本申请中，术语S1、S2、S3、S4和S31、S32、S33和S34是定义来源于该方法所述步骤的级分的方式。然而，这些术语(S1、S2、S3、S4和S31、S32、S33和S34)涵盖了通过相似的色谱步骤得到并且可以来源于京尼平与甘氨酸的反应的任何级分，所述反应中产生了S3类似级分和来自S3的级分(具有如图7所示的类似的NMR谱图)。图7示出了来自S3级分的S31、S32、S33和S34级分的NMR谱图。
在一些实施方案中，着色剂组合物包含从京尼平与甘氨酸的反应中分离的基本上纯的式1A、1B、2、3′A(Me)和3′B(Me)的化合物。
在一些实施方案中，分离3号着色剂复合物的方法包括：
A.从美洲格尼帕树汁中分离京尼平；
B.使甘氨酸与所述京尼平反应以获得可溶于甲醇的材料；
C.通过色谱法将可溶于甲醇的材料分离成S1、S2、S3和S4级分。
D.再通过色谱法将S3级分分离成S31、S32、S33和S34级分(图7)。通过反相色谱法从S33级分中分离化合物3。
为了本申请的目的，术语S1、S2、S3、S4和S31、S32、S33、S34，及M2S1R、M2S2R、M2S3R、M2S4R，以及i1和i2中是定义来源于该方法所述步骤的级分的方式。然而，这些术语(S1、S2、S3、S4和S31、S32、S33和S34)涵盖了通过相似的色谱步骤得到并且可以来源于京尼平与甘氨酸的反应的任何级分，所述反应中产生了S3类似级分和来自S3的级分(具有如图7所示的类似的NMR谱图)。图7示出了来自S3级分的S31、S32、S33和S34级分的NMR谱图。
某些实施方案涉及基本上经纯化的式3′A(Me)或式3′B(Me)的化合物、其几何异构体、其互变异构体、其盐或其组合：
某些实施方案涉及基本上经纯化的式1A或式1B的化合物、其几何异构体、其互变异构体、其盐或其组合：
包含聚合物的组合物
在某些实施方案中，本公开内容的经纯化的聚合物(例如，式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐)可以单独或者与另一种着色剂组合(例如，式1A、1B、2、3A、3B、2′、3′A、3′B、3′A(Me)、3′B(Me)的二聚物或其任意组合)用作单一着色剂或主要着色剂。在一些实施方案中，本公开内容的经纯化的聚合物(例如，式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐)可以通过将所述聚合物与稀释剂(例如，水)混合来稀释。在一些实施方案中，本公开内容的经纯化的聚合物(例如，式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐)可以通过从包含所述聚合物和稀释剂的组合物中除去稀释剂(例如溶剂，如甲醇、水等)来浓缩。
在一些实施方案中，着色剂组合物包含式4的聚合物：
其几何异构体、其互变异构体或其盐，
其中n为2至200的整数；
其中A各自独立地选自式5A、式5B、式5C、其几何异构体、其互变异构体、其盐和其组合：
其中：
R1是氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基；
R2和R′2独立地为氢或C1-10烷基；
R3为氢或COOH；
并且其中T1是氢或甲基；且T2是氢或A-T1，其中A和T1如上所限定；
其中所述着色剂组合物基本上不含选自式6、式7、式8、其几何异构体、其互变异构体和其盐的第一附加化合物：
在一些实施方案中，R3为H。在一些实施方案中，R3为COOH。
在一些实施方案中，R2和R′2中的一个为氢。在一些实施方案中，R2和R′2均为氢。在一些实施方案中，R2和R′2中的一个为氢，而R2和R′2中的另一个为未取代的C1-10直烷基链(例如，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等)或者被1至3个甲基取代的C1-10直烷基链，例如异丙基、异丁基、异戊基等。
在一些实施方案中，代表氨基酸残基(R3为COOH且R2和/或R′2代表侧链)。在一些实施方案中，氨基酸残基为以下的残基：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、牛磺酸、肉毒碱、鸟氨酸、瓜氨酸或谷氨酰胺。在一些实施方案中，氨基酸残基为甘氨酸的残基。
在一些实施方案中，R1可以是氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基，例如，R1可以是氢、甲基或乙基；或者R1可以是甲基。
在一些实施方案中，T1可以是氢或甲基。
在一些实施方案中、n为2至200、2至150、2至100、2至50、2至25、2至20、2至15、2至10或2至5。
在一些实施方案中，着色剂组合物包含式4的聚合物：
其几何异构体、其互变异构体或其盐，
其中n是2至20的整数；
其中A各自独立地选自式5′A、式5′B、式5′C、其几何异构体、其互变异构体、其盐和其组合：
其中：
R1是氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基；
并且其中T1是氢或甲基；且T2是氢或A-T1，其中A和T1如上所限定；
其中所述着色剂组合物基本上不含选自式2′、式3′A、式3′B、其几何异构体、其互变异构体和其盐的第一附加化合物：
在一些实施方案中，R1是甲基。
在一些实施方案中，合适的式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐具有多种重复单元(即，式4中不同的“A”)、多种末端基团(例如，不同的T1、T2，或两者均不同)和/或多种链长。在另一个实施方案中，合适的式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐包括具有特征性紫外可见吸收光谱(例如，最大吸收波长(λmax))、NMR谱图、IR谱图、平均分子量(例如数均分子量(Mn)或其组合的那些。在另一个实施方案中，合适的式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐包括具有一定水平的纯度的那些。
聚合物结构
在一些实施方案中，式4的聚合物的A各自独立地为式5′A、式5′B、式5′C、其几何异构体、其互变异构体或其盐。在一些实施方案中，式4的聚合物中的A各自为式5′A、其几何异构体、其互变异构体或其盐。在一些实施方案中，式4的聚合物中的A各自为式5′B、其几何异构体、其互变异构体或其盐。在一些实施方案中，式4的聚合物中的A各自为式5'C、其几何异构体、其互变异构体或其盐。在另一些实施方案中，式4的聚合物可以包括包含式5′A和式5′B二者、式5′A和式5′C二者、式5′B和式5′C二者、或者式5′A、式5′B和式5′C的重复单元。
具有多个R1基团(例如，氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基)的式4的聚合物可用作蓝色着色剂复合物。在一些实施方案中，R1可以是氢、甲基或乙基。在一些实施方案中，式4的聚合物中的A各自是式5′A、其几何异构体、其互变异构体或其盐，并且式5′A中的R1是氢。在一些实施方案中，式4的聚合物中的A各自是式5′A、其几何异构体、其互变异构体或其盐，并且式5′A中的R1是甲基。在一些实施方案中，式4的聚合物中的A各自是式5′A、其几何异构体、其互变异构体或其盐，并且式5′A中的R1是乙基。在一些实施方案中，式4的聚合物中的A各自是式5′B、其几何异构体、其互变异构体或其盐，并且式5′B中的R1是氢。在一些实施方案中，式4的聚合物中的A各自是式5′B、其几何异构体、其互变异构体或其盐，并且式5′B中的R1是甲基。在一些实施方案中，式4的聚合物中的A各自是式5′B、其几何异构体、其互变异构体或其盐，并且式5′B中的R1是乙基。在一些实施方案中，式4的聚合物中的每个A各自是式5′C、其几何异构体、其互变异构体或其盐，并且式5′C中的R1是氢。在一些实施方案中，式4的聚合物中的A各自是式5′C、其几何异构体、其互变异构体或其盐，并且式5′C中的R1是甲基。在一些实施方案中，式4的聚合物中的A各自是式5′C、其几何异构体、其互变异构体或其盐，并且式5′C中的R1是乙基。
本公开内容还提供了具有不同末端基团的式4的聚合物。在一些实施方案中，合适的末端基团是按照方案1中所示反应形成的那些的任意一种。在一些实施方案中，T1是氢或甲基；且T2是氢或A-T1，其中A和T1在本文中进行了描述。
在一些实施方案中，具有不同聚合度的经纯化的式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐适用于本公开内容中所公开的各种用途。在一些实施方案中，式4中的n是以下范围内的整数：2至20、2至18、2至16、2至14、2至12、2至10、2至8、2至6、2至4、4至20、4至18、4至16、4至14、4至12、4至10、4至8、4至6、6至20、6至18、6至16、6至14、6至12、6至10、6至8、8至20、8至18、8至16、8至14、8至12、8至10、10至20、10至18、10至16、10至14或10至12。在一些实施方案中，其中经纯化的聚合物是经纯化的通式4的单一化学化合物，式4中的n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
聚合物的特征
在某些实施方案中，具有某些特征的聚合物(例如，式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐)适用于着色剂组合物。
在一些实施方案中，聚合物在紫外可见光谱中的最大吸收波长(λmax)在约580nm至约610nm的范围内。在一些实施方案中，聚合物的最大吸收波长(λmax)为约580nm、约585nm、约590nm、约595nm、约600nm、约605nm或约610nm。在一些实施方案中，聚合物的最大吸收波长(λmax)小于约580nm(例如，约570nm、约560nm等)。在一些实施方案中，聚合物的最大吸收波长(λmax)大于约610nm(例如约620nm、约630nm等)。
在一些实施方案中，聚合物的特征在于，例如当通过实施例6中描述的方法进行分析时具有约10.3分钟的HPLC保留时间。在一些实施方案中，聚合物的特征在于，与240nm处的吸收相比在590nm处具有更强的吸收。在一些实施方案中，聚合物的特征在于，具有与图13C的谱图基本上相同的HPLC迹线。
在某些实施方案中，具有不同平均分子量的式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐适用于着色剂组合物。在一些实施方案中，聚合物的平均分子量为约1,000至约20,000。在一些实施方案中，聚合物的平均分子量为约3,000至约15,000或约3,000至约10,000。在一些实施方案中，聚合物的平均分子量为约4,500至约7,500。在一些实施方案中，聚合物的平均分子量为约5000、约5500、约6000、约6500或约7000。在一些实施方案中，聚合物的平均分子量为约6000。在一些实施方案中，平均分子量是数均分子量(Mn)。在一些实施方案中，平均分子量为重均分子量(Mw)。在一些实施方案中，平均分子量是本领域中已知的任何平均分子量，例如粘均分子量(Mv)、Z均分子量(Mz)等。用于测量和/或计算平均分子量(例如，Mn、Mw、Mv或Mz)的方法是本领域已知的。
在某些实施方案中，具有指定IR吸收的聚合物适用于着色剂组合物。在一些实施方案中，聚合物的特征在于IR光谱具有以下峰(±5cm-1)：3393cm-1、2949cm-1、1726cm-1、1630cm-1和1540cm-1。在一些实施方案中，聚合物的特征在于具有与图12所示光谱基本上相同的IR光谱。在一些实施方案中，聚合物的特征在于IR光谱具有以下峰(±5cm-1)：3393cm-1、2949cm-1、1726cm-1、1630cm-1和1540cm-1，或者具有与图12所示光谱基本上相同的IR光谱。
1H NMR是用于表征聚合物的另一种谱学方法。在一些实施方案中，聚合物具有如图9所示的1H NMR。在一些实施方案中，着色剂组合物包含聚合物，其中所述聚合物的1H NMR与图9中的谱图基本上相同。在一些实施方案中，聚合物具有与图9中的谱图基本上相同的1H NMR，和/或与图12所示光谱基本上相同的IR光谱。
质谱法是用于表征聚合物的另一种方法。在一些实施方案中，具有m/e为701和/或475的MS片段的聚合物用于蓝色着色剂组合物。在一些实施方案中，着色剂组合物包含特征在于具有701或475(m/e)的MS片段的聚合物。在一些实施方案中，聚合物的特征在于具有701和405(m/e)的MS片段。在一些实施方案中，MS片段(m/e)701和405分别对应于式9的左边和右边。
在一些实施方案中，聚合物的特征在于具有701和405(m/e)的MS片段，所述聚合物还具有与图9中的谱图相比基本上相同的1H NMR。在一些实施方案中，聚合物的特征还在于红外光谱与图12中的光谱基本上相同。在一些实施方案中，聚合物的特征在于具有与图11中所示的质谱图基本上相同的质谱图。在一些实施方案中，着色剂组合物基本上不含式6、7或8的第一附加化合物。
聚合物的纯度
在某些实施方案中，适合的聚合物包括例如本文所述的具有一定纯度水平的那些。在一些实施方案中，着色剂组合物包含式4的聚合物，其中所述着色剂组合物基本上不含选自式6、式7、式8、其几何异构体、其互变异构体及其盐的第一附加化合物。在一些实施方案中，着色剂组合物基本上不含选自式2′、式3′A、式3′B、其几何异构体、其互变异构体及其盐的第一附加化合物。在一些实施方案中，着色剂组合物基本上不含选自式2、式3′A(Me)、式3′B(Me)、其几何异构体、其互变异构体及其盐的第一附加化合物。
在一些实施方案中，第一附加化合物的总重量按聚合物的重量计小于4.5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.1％或小于0.01％。在一些实施方案中，第一附加化合物的总重量按聚合物的重量计小于1％。在一些实施方案中，第一附加化合物的总重量按聚合物的重量计小于0.1％。在另一些实施方案中，第一附加化合物的总重量按聚合物的重量计小于0.01％。在一些实施方案中，着色剂组合物不含第一附加化合物。在一些实施方案中，第一附加化合物的总重量为按聚合物的重量计0.01％至5％、0.01％至4.5％、0.01％至4％、0.01％至3％、0.01％至2％、0.01％至1％、0.01％至0.5％或0.01％至0.1％。
在一些实施方案中，着色剂组合物包含式4的聚合物，其中所述着色剂组合物基本上不含选自式1A、式1B、其几何异构体、其互变异构体及其盐的第二附加化合物：
在一些实施方案中，第二附加化合物的总重量按聚合物的重量计小于1％。在一些实施方案中，第二附加化合物的总重量按聚合物的重量计小于0.1％。在另一些实施方案中，第二附加化合物的总重量按聚合物的重量计小于0.01％。在一些实施方案中，着色剂组合物不含第二附加化合物。在一些实施方案中，第二附加化合物的总重量为按聚合物的重量计0.01％至5％、0.01％至4.5％、0.01％至4％、0.01％至3％、0.01％至2％、0.01％至1％、0.01％至0.5％或0.01％至0.1％。
在一些实施方案中，基本上不含第一附加化合物的着色剂组合物还基本上不含第二附加化合物。本文中描述了第一附加化合物或第二附加化合物与聚合物的合适的重量百分比。在一些实施方案中，第一附加化合物和第二附加化合物的组合重量按聚合物的重量计小于5％(例如，小于4.5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.1％、小于0.01％)。在一些实施方案中，着色剂组合物不含第一附加化合物和第二附加化合物。在一些实施方案中，第一附加化合物和第二附加化合物的总重量为按聚合物的重量计0.01％至5％、0.01％至4.5％、0.01％至4％、0.01％至3％、0.01％至2％、0.01％至1％、0.01％至0.5％或0.01％至0.1％。
在一些实施方案中，着色剂组合物包含式4的聚合物，除所述聚合物以外基本上不含最大吸收波长(λmax)在580nm至610nm的范围内的化合物。在一些实施方案中，除所述聚合物以外最大吸收波长(λmax)在580nm至610nm范围内的化合物的总重量按聚合物的重量计小于5％(例如小于4.5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.1％、小于0.01％)。在一些实施方案中，着色剂组合物除所述聚合物以外不含最大吸收波长(λmax)在580nm至610nm范围内的化合物。在一些实施方案中，除所述聚合物以外最大吸收波长(λmax)在580nm至610nm范围内的化合物的总重量为按聚合物的重量计0.01％至5％、0.01％至4.5％、0.01％至4％、0.01％至3％、0.01％至2％、0.01％至1％、0.01％至0.5％、0.01％至0.1％。
某些实施方案涉及基本上经纯化的式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐。
在一些实施方案中，基本上经纯化的聚合物包括：
其几何异构体、其互变异构体或其盐，
其中n是2至20的整数；
其中A各自是式5′A、其几何异构体、其互变异构体或其盐：
其中T1是氢或甲基；且T2是氢或A-T1，其中A和T1如上所限定。在一些实施方案中，基本上经纯化的聚合物的特征在于具有本文中所描述的平均分子量(例如，具有约6,000的数均分子量(Mn))。在一些实施方案中，基本上经纯化的聚合物的特征在于具有本文中所描述的IR光谱(例如，具有以下峰(±5cm-1)的IR光谱：3393cm-1、2949cm-1、1726cm-1、1630cm-1和1540cm-1)。在一些实施方案中，着色剂组合物包含式4的聚合物，其中所述着色剂组合物不含或基本上不含碳水化合物，例如糖。在一些实施方案中，着色剂组合物不含碳水化合物并且至少80％、85％、90％、95％、99％或100％不含其他杂质，例如单体、二聚物、脂肪酸、脂肪、蛋白质或有机酸。
制备经纯化的聚合物的方法
在某些实施方案中，本公开内容的聚合物如方案1中所公开地通过使京尼平衍生物(例如，京尼平)与胺(例如，甘氨酸)反应来制备。在一些实施方案中，经纯化的聚合物通过纯化如方案1中所公开的来自京尼平衍生物(例如，京尼平)和胺(例如，甘氨酸)的反应混合物而获得。
在一些实施方案中，聚合物通过使京尼平与胺反应来制备。在一些实施方案中，聚合物通过使京尼平与伯烷基胺(例如，甲胺、乙胺、丙胺或其他C1-10伯胺)反应来制备。在一些实施方案中，聚合物通过使京尼平与仲烷基胺(例如异丙基胺或其他C1-10仲胺)反应来制备。在一些实施方案中，聚合物通过使京尼平与氨基酸(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸等)反应来制备。在一些实施方案中，聚合物通过使京尼平与甘氨酸反应来制备。
在一些实施方案中，京尼平是经纯化的京尼平或包含京尼平的汁。在一些实施方案中，本公开内容的聚合物是通过经纯化的京尼平(例如，按重量计大于80％、85％、90％、95％或99％)与甘氨酸反应形成的产物。在一些实施方案中，本公开内容的聚合物是由甘氨酸和包含京尼平的汁反应获得的经纯化产物。在一些实施方案中，包含京尼平的汁是果汁。在一些实施方案中，所述果汁来源于美洲格尼帕树。
在一些实施方案中，甘氨酸是经纯化的甘氨酸。在一些实施方案中，甘氨酸是包含甘氨酸的混合物(例如，包含甘氨酸的汁或包含甘氨酸的干混合物，如含甘氨酸的汁浓缩物)。在一些实施方案中，甘氨酸是包含甘氨酸的汁(例如果汁，如来源于以下的汁：西瓜、白葡萄、菠萝、荔枝、哈密瓜、香蕉、桔子、苹果、梨、柠檬、西番莲果、红葡萄、蓝莓、罗望子、桃、木瓜、巴西莓、李子、番石榴、柑橘、博罗霍果、古布阿苏果、枸杞或猕猴桃)。在一些实施方案中，甘氨酸是包含甘氨酸的汁，其中所述汁来源于西瓜。在一些实施方案中，甘氨酸是包含甘氨酸的汁，其中所述汁来源于新鲜西瓜。
在一些实施方案中，聚合物来源于京尼平与来自西瓜的汁的反应。在一些实施方案中，聚合物来源于来自西瓜的汁与来自美洲格尼帕树的汁的反应。在一些实施方案中，聚合物来源于经纯化的京尼平(例如，按重量计大于80％、85％、90％、95％或99％)与来自西瓜的汁的反应。
某些实施方案涉及从京尼平与胺的反应混合物中分离聚合物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)用溶剂(例如，甲醇)提取来源于京尼平与胺的反应的蓝色混合物以产生可溶性部分和不溶性部分；以及(b)纯化所述不溶性部分。在一些实施方案中，纯化步骤(b)包括使不溶性部分经历HPLC纯化。
某些实施方案涉及从京尼平与甘氨酸的反应混合物中分离聚合物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)用甲醇提取来源于京尼平与甘氨酸的反应的蓝色混合物以产生甲醇可溶性部分和甲醇不溶性部分；以及(b)纯化所述甲醇不溶性部分。在一些实施例中，所述蓝色混合物来源于经纯化的京尼平(例如，按重量计大于80％、85％、90％、95％或99％)与甘氨酸的反应。在一些实施方案中，所述蓝色混合物来源于甘氨酸与来自美洲格尼帕树的汁的反应。在一些实施方案中，所述蓝色混合物为来源于京尼平与甘氨酸的反应的干粉(例如冻干粉)。在一些实施方案中，纯化步骤包括使不溶性部分经历HPLC纯化。在一些实施方案中，所述HPLC纯化为反相HPLC纯化。在一些实施方案中，纯化步骤(b)与实施例部分中公开的纯化步骤类似。在一些实施方案中，纯化方法提供了如本文所述的经纯化的聚合物。
在一些实施方案中，着色剂产物通过本文所述方法产生。在一些实施方案中，着色剂产物通过以下步骤产生：(a)用甲醇提取来源于京尼平与甘氨酸的反应的蓝色混合物以产生甲醇可溶性部分和甲醇不溶性部分；以及(b)纯化所述甲醇不溶性部分以获得着色剂产物。在一些实施方案中，所述蓝色混合物为来源于京尼平与甘氨酸的反应的干粉(例如，冻干粉)。在一些实施方案中，着色剂产物基本上不含本文所公开的式6、7或8的任何化合物。在一些实施方案中，着色剂产物的特征可以在于具有(a)与如图9中所示基本上相同的NMR谱图；(b)具有以下峰(±5cm-1)的IR光谱：3393cm-1、2949cm-1、1726cm-1、1630cm-1和1540cm-1；(c)约6,000的平均分子量(例如，数均分子量(Mn))；(d)显示701和/或475的MS片段的MS谱图；或者(e)为(a)至(d)的任意组合。
基本上不含碳水化合物的着色剂组合物
某些实施方案涉及包含经纯化的聚合物(例如，式4的聚合物)的着色剂组合物，其中所述着色剂组合物基本上不含碳水化合物(例如，单糖、二糖、寡糖或多糖)。在一些实施方案中，碳水化合物是糖(例如，单糖和二糖)。在一些实施方案中，基本上不含碳水化合物的着色剂组合物也基本上不含其他杂质(例如，式1A、1B、2、3A或3B的二聚物)。在一些实施方案中，着色剂组合物基本上不含碳水化合物，例如，着色剂组合物不包含可以检测到(例如，通过实施例7中描述的方法)的碳水化合物。除非另有区分，否则术语“碳水化合物”和“糖”在本文中可互换使用。
在一些实施方案中，不含或基本上不含碳水化合物的着色剂组合物包括除经纯化的聚合物以外还具有另外的材料(例如，单体、二聚物、脂肪酸、脂肪、蛋白质或有机酸)的组合物。在一些实施方案中，不含或基本上不含碳水化合物的着色剂组合物还包含另外的化合物(例如，式1A、1B、2、3A或3B的二聚物，另外的着色剂(例如，经FDA批准的颜色添加剂))。在一些实施方案中，不含或基本上不含碳水化合物的着色剂组合物也不含或基本上不含例如单体、二聚物(例如，式1A、1B、2、3A或3B的二聚物)；另外的着色剂(例如，经FDA批准的颜色添加剂)、脂肪酸、脂肪、蛋白质或有机酸。在一些实施方案中，不含或基本上不含碳水化合物的着色剂组合物通过如下方法来制备，所述方法包括将基本上不含碳水化合物的经纯化的聚合物与基本上不含碳水化合物的另外的化合物(例如式1A、1B、2、3A或3B的二聚物，另外的着色剂(例如，经FDA批准的颜色添加剂))混合。
在一些实施方案中，经纯化的聚合物来源于京尼平与甘氨酸的反应。在一些实施方案中，经纯化的聚合物来源于经纯化的京尼平(例如，按重量计大于80％、85％、90％、95％或99％)与甘氨酸的反应。在一些实施方案中，经纯化的京尼平来自美洲格尼帕树。在一些实施方案中，经纯化的聚合物来源于包含京尼平的汁与甘氨酸的反应。在一些实施方案中，经纯化的聚合物来源于果汁(例如，来自美洲格尼帕树的汁、来自美洲格尼帕树的富含京尼平的汁)与甘氨酸的反应。在一些实施方案中，经纯化的聚合物来源于京尼平与包含甘氨酸的汁(例如果汁，如西瓜汁和本文所述的其他果汁)的反应。
在一些实施方案中，经纯化的聚合物的特征在于当例如通过实施例6中描述的方法进行分析时具有约10.3分钟的HPLC保留时间。在一些实施方案中，经纯化的聚合物的特征在于与240nm处的吸收相比在590nm处具有更强的吸收。在一些实施方案中，经纯化的聚合物的特征在于具有与图13C的谱图基本上相同的HPLC迹线。
某些实施方案涉及制备基本上不含碳水化合物的着色剂组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括用柱色谱法(例如，尺寸排阻柱色谱法，反相HPLC等)纯化粗着色剂组合物；分析级分中存在的碳水化合物(例如，通过薄层色谱法)；以及收集基本上不含碳水化合物的级分。在一些实施方案中，粗着色剂组合物来源于京尼平(例如，经纯化的京尼平、来自美洲格尼帕树的汁、富含京尼平的汁、来自美洲格尼帕树的富含京尼平的汁)与甘氨酸的反应。在一些实施方案中，所述方法产生具有与图13A、13B或13C的谱图基本上相同的HPLC迹线的着色剂组合物。在一些实施方案中，所述方法产生具有与图13C的谱图基本上相同的HPLC迹线的着色剂组合物。
某些实施方案涉及制备不含糖的着色剂组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)将美洲格尼帕树汁与氨基酸混合，所述氨基酸选自甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸及其任意组合；(b)从(a)的混合物中除去糖；以及(c)从(b)的不含糖产物中分离着色剂组合物，其中通过所述方法得到的着色剂组合物的强度大于在不除去糖的情况下从步骤(a)的混合物得到的着色剂组合物的强度，例如为至少两倍。在一些实施方案中，着色剂组合物的强度通过在一定波长处(例如，在着色剂组合物的λmax处、在580nm至610nm范围内的波长处、在590nm的波长处等)的紫外可见吸光度来测量。在一些实施方案中，聚合物的含量为百分比％(g/100g样品)并通过HPLC测量来测定，并且颜色强度使用分光光度计来测定(例如0.6吸光度值)。在一些实施方案中，所述方法包括通过以下方法除去糖(例如，从美洲格尼帕树汁与氨基酸(例如甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸或其任意组合)的反应混合物中除去糖)：发酵；柱色谱法(例如，尺寸排阻色谱法、HPLC)；反渗透过滤；超滤；微滤；透析(例如，使用渗透梯度的透析方法)；树脂介导的分离(例如，XAD4、XAD7或XAD8树脂介导的分离)或者其任意组合。在某些实施方案中，发酵产物的微生物稳定性通过消除糖含量而提高，所述糖含量例如可以容易地产生嗜温微生物剂，例如真菌和酵母。
在一些实施方案中，所述方法包括通过发酵除去糖。在一些实施方案中，采用酵母(例如，天然酵母、基因改造酵母(例如在糖降解中效率提高的那些))或细菌(包括在糖降解中效率提高的基因改造细菌)进行发酵。在一些实施方案中，所述酵母或细菌是被固定的(例如，附着于固体载体；用微胶囊包封)。
在一些实施方案中，制备着色剂组合物的方法包括：(a)将美洲格尼帕树汁与氨基酸混合，所述氨基酸选自甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸及其任意组合；(b)对步骤(a)的混合物进行灭菌；(c)用酵母或细菌接种步骤(b)的经灭菌混合物；(d)在发酵条件下孵育步骤(c)的经接种混合物以产生发酵产物；以及(e)从步骤(d)的发酵产物中分离着色剂组合物，其中通过所述方法得到的着色剂组合物的强度大于在不发酵的情况下从步骤(a)的混合物得到的着色剂组合物的强度例如至少两倍。
在一些实施方案中，步骤(d)的孵育进行至少6小时(例如6至24、6至18、6至12、6至9、9至24、9至18、9至12、12至24、12至18或多于24小时)。在一些实施方案中，步骤(d)的孵育少于6个小时(例如，6、5、4、3、2、1、0.5小时)。某些实施方案涉及对样品中的聚合物进行量化的方法，所述方法包括使用以纯形式的聚合物作为外部参照的HPLC法。在一些实施方案中，聚合物是来源于京尼平与甘氨酸的反应的蓝色聚合物。在一些实施方案中，作为外部参照的纯形式的聚合物基本上不含碳水化合物。在一些实施方案中，作为外部参照的纯形式的聚合物的特征在于具有与图13C的谱图基本上相同的HPLC迹线。
制备着色剂组合物的方法
某些实施方案涉及制备着色剂组合物的方法。在一些实施方案中，制备着色剂组合物的方法包括：(a)从美洲格尼帕树果实中分离汁；(b)将该汁与第一氨基酸和第二氨基酸混合，所述第一氨基酸选自甘氨酸(GLY)、缬氨酸(VAL)、赖氨酸(LYS)、脯氨酸(PRO)、甲硫氨酸(MET)、酪氨酸(TYR)和色氨酸(TRP)，所述第二氨基酸选自甘氨酸(GLY)、缬氨酸(VAL)、赖氨酸(LYS)、脯氨酸(PRO)、甲硫氨酸(MET)、酪氨酸(TYR)和色氨酸(TRP)；(c)在(b)之后分离着色剂组合物。某些实施方案涉及包含通过使来自美洲格尼帕树果实的汁与氨基酸组合(例如，甘氨酸和甲硫氨酸)反应形成的产物的着色剂组合物。在某些实施方案中，新鲜果实在收获的一天或两天内(例如，在约0至6、0至12、0至18、0至24、0至36或0至48小时内)使用。在另一些实施方案中，果实在冷藏条件下存储之后的1.5周内(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天内)或2周内(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天内)使用。在另一个实施方案中，果实是未熟的，例如，与软且具有不规则表皮的成熟果实相比较硬且具有均匀表皮的果实。在一些实施方案中，着色剂组合物为蓝色、蓝绿色、绿色、紫色、红色或黑色。
在一些实施方案中，制备着色剂组合物的方法包括：(a)将京尼平或京尼平衍生物与第一氨基酸和第二氨基酸混合，所述第一氨基酸选自甘氨酸(GLY)、缬氨酸(VAL)、赖氨酸(LYS)、脯氨酸(PRO)、甲硫氨酸(MET)、酪氨酸(TYR)或色氨酸(TRP)，所述第二氨基酸选自甘氨酸(GLY)、缬氨酸(VAL)、赖氨酸(LYS)、脯氨酸(PRO)、甲硫氨酸(MET)、酪氨酸(TYR)或色氨酸(TRP)；以及分离由此形成的着色剂组合物。某些实施方案涉及包含通过使京尼平或京尼平衍生物与氨基酸组合(例如，甘氨酸和甲硫氨酸)反应形成的产物的着色剂组合物。在一些实施方案中，着色剂组合物为蓝色、蓝绿色、绿色、紫色、红色或黑色。紫色着色剂组合物
美洲格尼帕树的未熟果实是京尼平(与胺反应产生蓝色产物的环烯醚萜代谢物)的来源。在美洲格尼帕树果实(哈瓜)中，京尼平存在于内果皮(果肉)中，将果实的其余部分弃去。哈瓜的中果皮(果皮)材料由于其低的京尼平含量而弃去。
某些实施方案涉及制备紫色着色剂组合物的方法。在一些实施方案中，制备紫色着色剂组合物的方法包括：(a)从美洲格尼帕树果实中分离中果皮；(b)由中果皮制备汁提取物；(c)将汁提取物与甘氨酸混合；(d)在(c)之后加热汁和甘氨酸的混合物；以及(e)在(d)之后分离紫色着色剂组合物。在一些实施方案中，步骤(d)中的加热进行至少90分钟(例如，90分钟至约3、4、5或6小时，或大于6小时)。如本文所使用的“中果皮”是指果实(例如，美洲格尼帕树果实)的果皮。在某些实施方案中，新鲜果实在收获的一天或两天内(例如，约0至6、0至12、0至18、0至24、0至36或0至48小时内)使用。在另一些实施方案中，果实在冷藏条件下存储之后的1.5周内(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12天内)或2周内(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天内)使用。在另一个实施方案中，果实是未熟的，例如与软且具有不规则表皮的成熟果实相比硬且具有均匀表皮的果实。
某些实施方案涉及包含通过使包含京尼平衍生物的水性提取物与胺(例如氨基酸，如甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、赖氨酸、色氨酸、酪氨酸或甲硫氨酸)反应而形成的产物的着色剂组合物。在一些实施方案中，包含京尼平衍生物的水性提取物通过包括如下步骤的方法来制备：(a)从美洲格尼帕树果实中分离中果皮；以及(b)用水提取中果皮。在一些实施方案中，着色剂组合物是紫色着色剂组合物，所述紫色着色剂组合物包含由来自美洲格尼帕树果实的中果皮的水性提取物与甘氨酸形成的产物。在一些实施方案中，按AUC(HPLC谱图中的曲线下面积)计，水提取物具有小于20％、15％、10％、5％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的京尼平。在一些实施方案中，氨基酸是甘氨酸。在一些实施方案中，所述产物通过如下过程形成：将来自美洲格尼帕树果实的中果皮的水性提取物与甘氨酸混合，然后加热混合物，其中所述水性提取物没有进行预热。在一些实施方案中，着色剂组合物包含京尼平前驱体，所述前驱体包括(+)-京尼平苷或京尼平的环烯醚萜B-糖苷前驱体，其来源于来自美洲格尼帕树果实的中果皮(果皮)。
京尼平苷是京尼平的糖苷。京尼平苷具有与京尼平不同的动力学和化学特性。葡萄糖是京尼平苷结构的一部分。
葡萄糖作为游离葡萄糖存在于美洲格尼帕树汁的果肉(内果皮)中。然而，京尼平存在于内果皮中，其当与甘氨酸反应时产生蓝色着色剂。甘氨酸与来自中果皮的京尼平苷反应产生紫色着色剂。
某些实施方案涉及制备着色剂组合物的方法，所述方法包括：(a)从美洲格尼帕树果实中分离中果皮；(b)从中果皮中分离京尼平苷；(c)将京尼平苷与氨基酸混合，所述氨基酸选自甘氨酸(GLY)、缬氨酸(VAL)、赖氨酸(LYS)、脯氨酸(PRO)、甲硫氨酸(MET)、酪氨酸(TYR)、色氨酸(TRP)或其任意组合；以及(d)在(c)之后分离着色剂组合物。在一些实施方案中，京尼平苷通过冷冻干燥或快速冷冻来稳定。在一些实施方案中，着色剂组合物是紫色的。
绿色和黑色着色剂组合物
某些实施方案涉及制备绿色或黑色着色剂组合物的方法。美洲格尼帕树汁与不同的氨基酸反应产生不同颜色的产物，例如蓝色(GLY和LYS)；蓝绿色(VAL、MET和TYR)；绿色(TRP)和黑色(PRO)。一些实施方案涉及制备黑色着色剂组合物的方法，所述方法包括：(a)由美洲格尼帕树果实制备汁提取物；(c)将所述汁提取物与脯氨酸混合；以及(e)从(c)中分离黑色着色剂组合物。一些实施方案涉及制备绿色着色剂组合物的方法，所述方法包括：(a)由美洲格尼帕树果实制备汁提取物；(c)将所述汁提取物与色氨酸混合；以及(e)从(c)中分离绿色着色剂组合物。
包含聚合物和/或二聚物的着色剂组合物的用途
某些实施方案涉及经纯化的聚合物(例如，式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐，或者基本上不含碳水化合物的聚合物(例如，来源于京尼平与甘氨酸的反应的聚合物))或经纯化的二聚物(例如，基本上纯的1号化合物、2号化合物、3号化合物或者基本上纯的式1A、1B、2、3′A(Me)、3′B(Me)的化合物或其组合)以赋予基质(例如，食物、化妆品、药物或营养品、纺织品或装置如医疗装置)蓝色。
在一些实施方案中，赋予基质(例如，食物、化妆品、药物或营养品、纺织品或装置如医疗装置)蓝色的方法包括：使基质与包含经纯化的聚合物(例如，式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐，或者基本上不含碳水化合物的聚合物(例如，来源于京尼平与甘氨酸的反应的聚合物))或经纯化的二聚物(例如基本上纯的1号化合物、2号化合物、3号化合物或基本上纯的式1A、1B、2、3′A(Me)、3′B(Me)的化合物)的着色剂组合物、本文所述的着色剂组合物或其任意组合相接触。在一些实施方案中，着色剂组合物包含式4的聚合物、其几何异构体、其互变异构体或其盐。在一些实施方案中，着色剂组合物包含二聚物。在一些实施方案中，二聚物是基本上经纯化的式1A、1B、2、3′A(Me)或3′B(Me)的化合物。在一些实施方案中，着色剂组合物通过将式1A、1B、2、3′A(Me)或3′B(Me)的化合物与本文所公开的任何聚合物混合的方法来制备。在一些实施方案中，着色剂组合物是通过将本文所公开的聚合物或二聚物与颜色添加剂(例如，经FDA批准的颜色添加剂)混合来制备。在一些实施方案中，基质是食物。在一些实施方案中，基质是医疗装置。在一些实施方案中，基质是药品。在一些实施方案中，基质是营养品。在一些实施方案中，基质是化妆品。
某些实施方案涉及包含食物和本文所公开的着色剂组合物(例如，包含本文所公开的经纯化聚合物的着色剂组合物，或者包含本文所公开的经纯化二聚物的着色剂组合物)的食品。所述食物可以是固体食物或液体食物。在一些实施方案中，所述食物是乳制品、焙烤制品、软饮料、甜食(例如，糖果或谷物棒等)或饮料。在一些实施方案中，所述食物是饮料。在一些实施方案中，所述食物是碳酸饮料。在一些实施方案中，所述食物用于人类消耗。在一些实施方案中，所述食物是兽医食物如宠物食物(例如，猫食、狗食等)或农场动物食物(例如，牛食)。在一些实施方案中，所述食物是植物食物，例如肥料。在一些实施方案中，所述食物是单位剂型食物，例如单位剂型酸奶、布丁、汤等。
某些实施方案涉及包含药物(例如，经FDA批准的药物)和本文所公开的着色剂组合物(例如，包含本文所公开的经纯化聚合物的着色剂组合物，或者包含本文所公开的经纯化二聚物的着色剂组合物)的药品。在一些实施方案中，所述药物为液体剂型。在一些实施方案中，所述药物为固体剂型。在一些实施方案中，所述药物是选自以下的剂型：片剂、胶丸、珠剂、球剂、丸剂、糖衣丸、锭剂、软膏剂、胶囊剂、粉剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂和悬浮剂。在一些实施方案中，所述药物呈糖浆的形式。
某些实施方案涉及包含营养物和本文所公开的着色剂组合物(例如，包含本文所公开的经纯化聚合物的着色剂组合物，或者包含本文所公开的经纯化二聚物的着色剂组合物)的营养品(例如，维生素、维生素补充剂，或饮食混剂和饮食组剂)。在一些实施方案中，所述营养物为液体剂型。在一些实施方案中，所述营养物为固体剂型。在一些实施方案中，所述营养物是选自以下的剂型：片剂、胶丸、珠剂、球剂、丸剂、糖衣丸、锭剂、软膏剂、胶囊剂、粉剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂和悬浮剂。在一些实施方案中，所述营养物是片剂或胶丸的形式。
某些实施方案涉及包含化妆剂和本文所公开的着色剂组合物(例如，包含本文所公开的经纯化聚合物的着色剂组合物，或者包含本文所公开的经纯化二聚物的着色剂组合物)的化妆品。在一些实施方案中，所述化妆品为沐浴用品，例如淋浴露、沐浴露或肥皂。在一些实施方案中，所述化妆品可以是用于眼和面部化妆的产品、指甲油、口红或纹身。在一些实施方案中，所述化妆品可以是用于口腔护理的产品(例如漱口水、牙胶或牙膏)。在一些实施方案中，所述化妆品可以是用于皮肤护理的产品(例如皮肤调理剂、胶露(例如护手露)、润肤霜和面霜或面膜)。在一些实施方案中，所述化妆品可以是用于剃须的产品(例如剃须膏)。在一些实施方案中，所述化妆品可以是用于头发护理的产品(例如染发产品)。
某些实施方案涉及通过本文所公开的着色剂组合物(例如，包含本文所公开的经纯化聚合物的着色剂组合物，或者包含本文所公开的经纯化二聚物的着色剂组合物)着色的医疗装置。在一些实施方案中，所述医疗装置是外科装置(例如，外科缝线、剪刀、手套等)。
某些实施方案涉及通过本文所公开的着色剂组合物着色的纺织品。
在某些实施方案中，并入到食品、化妆品、药品、医疗装置或纺织品中的着色剂组合物的量取决于要实现的最终颜色。在一些实施方案中，食品、化妆品、药品、医疗装置或纺织品包含有效量的本文所公开的着色剂组合物，所述着色剂组合物单独或者与另一种着色剂一起赋予食品、化妆品、药品或医疗装置选自以下的颜色：淡蓝色、空军蓝、空优蓝、爱丽丝蓝、湛蓝色、婴儿蓝、法国蓝(Bley de France)、蓝色、蓝灰色、邦迪蓝、布兰迪斯蓝、剑桥蓝、卡罗莱纳蓝、天蓝色、蔚蓝色、钴蓝色、哥伦比亚蓝、矢车菊蓝、蓝绿色、深蓝色、深天蓝色、牛仔蓝、道奇蓝、公爵蓝、埃及蓝、铁蓝色、伊顿蓝、浅灰蓝、荧光靛蓝、靛蓝、国际克莱因蓝、鸢尾蓝、淡蓝色、马若雷勒蓝、玛雅蓝、中蓝色、午夜蓝、海军蓝、写意蓝、牛津蓝、巴拉丁蓝、长春花色、波斯蓝、酞菁蓝、粉末蓝、普鲁士蓝、皇室蓝、宝蓝色、钢蓝色、青色、蒂芙尼蓝、纯蓝色、塔夫茨蓝、绿松石色、UCLA蓝、群青色、紫蓝色、耶鲁蓝和钴氧蓝。着色剂组合物的有效性可以通过将待实现的颜色(例如浅蓝)与用一定量着色剂组合物着色的产品或装置进行比较(例如，通过目视比较)来确定。
尽管说明书呈现了本发明的优选实施方案，但是可对部分的形式和配置作出另外的改变而不偏离由权利要求所涵盖的构思和基本原则。
实施例
实施例1.从美洲格尼帕树汁中分离京尼平
用二氯甲烷对从10L美洲格尼帕树绿色汁中冻干的固体(冷冻干燥)(900g)进行索氏提取；使所产生的溶剂在减压下蒸发，产生棕色残余物(240g)；使用己烷/甲醇/二氯甲烷(2:2:1)的混合物作为流动相通过尺寸排阻色谱分离1g的等分部分，由此得到四个级分；使用薄层色谱并通过与之前已知的京尼平图式进行比较，在所述级分之一中鉴定出了京尼平。用色谱硅胶柱和己烷/乙酸乙酯流动相将包含京尼平的级分纯化多次，直至根据NMR图谱得到纯产物(200mg京尼平)。
实施例2.京尼平与甘氨酸的反应
将溶于水(200mL)中的甘氨酸(2g)在70℃下加热。然后加入甲醇(10mL)中的京尼平(5g)，并将混合物搅拌4小时。将反应混合物冻干(冷冻干燥)，并用乙酸乙酯提取蓝色粉末以除去过量的京尼平和其他低极性组分。
实施例3.组分的分级
用甲醇(5×100mL)提取蓝色粉末(5.7g)，所产生的溶剂在减压下蒸发，得到蓝色树脂(2.2g)。在LH20(甲醇流动相)中对溶于90％甲醇中的蓝色树脂进行分离(甲醇流动相)，产生了4个级分，将其命名(为了本专利申请的目的)为S1(1.5g)、S2(0.3g)、S3(100mg)和S4(5mg)。
使用吸附树脂(Amberlite -7)，最初使用15％乙醇并以纯水结束，分离了S1级分。分离的三个级分具有相同的IR和NMR图谱。将这三个级分合并并确定为聚合物。
使用吸附树脂(Amberlite-7)，最初使用15％乙醇并以95％乙醇结束，分离了S2级分。由S2产生了四个子级分。将这些S2子级分命名(为了本专利申请的目的)为M2S1R、M2S2R、M2S3R和M2S4R。用不同的流动相(乙醇-水混合物和甲醇-水混合物)对M2S1R进行数次RP-C18分离，直至得到两种化合物，将这两种化合物之一命名为1号化合物(7mg)。1号化合物(图5)的波谱特征为：
1H NMR(400MHz,D2O).δ8.77,8.53,7.54,5.30-4.95,3.94,2.25,1.66ppm。
13C NMR(100MHz).δ170.0,164.16,157.80,157.44,148.29,146.41,139.76,137.83,124.16,63.35,62.6,56.19,53.89,17.43,14.93ppm。
对1号化合物的进一步分析显示：
在1H NMR中显示了几个信号：δ8.77和8.53处作为单峰的两个芳香质子；7.54处的乙烯基质子；4.95处的单峰(2H)；3.94处各自积分为3H的3个单峰(OCH3)，2.25(乙烯基甲基)及1.66。
JMOD实验显示下列信号：14.93、17.43和53.89处的三个甲基，62.68处的一个亚甲基(可归属为来源于甘氨酸的亚甲基)，157.44、146.41、137.83处的三个次甲基，以及最后，170.00(羧基)、164.16(甲酯羰基)、157.80、148.29、139.76、124.16和53.89处的七个季碳原子。因此，京尼平部分和甘氨酸残基得到保留，但是分子当前是具有吡啶残基的芳烃(原因是NMR谱图中质子和碳原子的位置)。然而，在结构中出现了新的甲基，并且基于JMOD、HMQC和HMBC实验可对其位置进行归属。因此，COSY 1H-1H显示出2.25处的甲基和7.54处的乙烯基质子之间的烯丙型连接；在HMBC实验中，该质子显示与这些甲基(13C NMR中157.44处)和14.93处的脂肪族甲基(1H NMR中1.66处)的3J耦合，这进而建立了53.89处的季碳原子与157.80和148.29处的芳香族碳原子的相关性。检测到的其他长程相关性为：N-CH2(62.68)与8.77和8.53处的两个芳香质子，以及N-CH2(62.68)与甲酯羰基。最后，MS显示m/z522[M++H]，表示对称的二聚物分子，如从图1A-1B和2A-2B中可以看出。单体之间的连接桥是通过C-8和C-8′碳原子推出的，原因是在HMBC实验中出现了作为单峰的甲基(其与另一个甲基相互偶合)。存在两种可能的异构体，例如具有式1A或1B(参见图1A、1B、2A和2B)。
用使用95％甲醇流动相通过色谱法分离S3级分，产生了四个S3级分，为了本专利申请的目的将其命名为S31、S32、S33和S34。使用不同的流动相(乙醇-水混合物和甲醇-水混合物)通过RP-C18反相色谱对S33级分进行多次分离，直至得到被命名为3号化合物的化合物(4mg)。3号化合物(图6)的波谱特征为：
1H NMR(400MHz,D2O).δ8.6,8.0,7.9,6.7,3.90,1.8ppm。
13C NMR(100MHz).δ172.2,166.3,138.8,135.6,135.1,133.3,131.4,127.1,120.46,118.9,61.0,53.3,11.2ppm。
m/z 505[M+H]
对3号化合物的进一步分析显示：
在质谱法中化合物3的质谱显示m/z＝505[M+H]+，因此示出先前描述的化合物的异构体。然而，1H和13CNM谱图与其有很大差异。在质子谱图中，检测到以下单峰：δ8.0、δ7.9和δ6，7(各自为2H)，以及在δ8.6处的一个额外的单峰(积分为1H)。其他信号为：δ4.7(N-CH2)处的单峰以及δ3.9(OCH3)和δ1.8(CH3乙烯基)处的两个甲基。根据JMOD实验，还观察到以下碳原子：δ172.2处的羧基；δ166.3处的甲基酯，(COOH)；δ138.8、δ135.1、δ127.1、δ120.4、δ118.9处的五个季碳原子；δ135.6、δ133.3、δ131.4、δ131.4处的四个次甲基；δ61.0处的一个亚甲基(N-CH2)；以及δ53.3(OCH3)和δ11.2(CH3乙烯基)处的两个甲基。根据HMBC实验确定了每个单体单元的结构的归属：由于检测到与δ61.0处的N-亚甲基的长程相关性，δ7.9和δ8.0处的信号归属于吡啶基的质子。另外，最后一个质子显示与δ172.2处的甲酯羰基的3J耦合。此外，其他重要的耦合显示在δ131.4处的单峰(C-7)与甲基质子之间。少量的芳香质子和乙烯基质子表示存在对称的二聚物分子，例如图3A-3B所示。根据甲酯基的相对取向(图3A-3B)，可将两种结构归属于该分子，但是由于空间位阻，结构B的可能性较低。
实施例4.甲醇不溶性级分的纯化
使用Sephadex LH-20并用MeOH-水洗脱来分离甲醇不溶性组分，并收集子级分i1(3.1g)和i2(100mg)。使用重复RP-C18柱并用MeOH/水洗脱来分离子级分i2，以得到纯的2号化合物(25mg)。化合物2显示出具有式2的结构。
使用RP-C18柱将子级分i1分离成两个主要级分。然而，这两个级分具有相同的IR和NMR图谱，并将这两个级分合并以产生经纯化的聚合物。所述经纯化的聚合物的示意性结构示于图8。
所述经纯化的聚合物的NMR、IR和质谱分析显示：
IR光谱(图12)显示出可归属于羧酸(3393cm-1)、脂肪族CH(2949)、酯(1726)和芳香吡啶盐体系(1630、1540)的谱带。
建立了蓝色小分子(具体为先前分离和鉴定的二聚物，以及京尼平)的1H和13C NMR指纹图谱。1H NMR(图9)显示下列信号：δ9.50(双键桥质子)；δ8.00-9.00(芳香吡啶衍生物或共轭双键)；δ5.0-7.0(环戊烷环中的双键)；δ5.0-4.5(与季氮连接的CH2))；δ3.8-4.1(OCH3)；δ1.5-2.3(CH3)。13C NMR显示下列信号：δ160-175(羧基和酯基)；δ150.0-120.0(芳烃和/或双键)；δ60.0-62.0(与季氮连接的CH2)；δ50.0-55.0(OCH3)；δ42.0-48.0(CH2)；以及最后的δ10,0-15.0(CH3)。
随后，得到了固态1H-13C NMR谱图(图10)，并检测到特征谱带或峰：羰基、芳基，双键、N-亚甲基、甲氧基和亚甲基。不存在甲基或环外亚甲基的信号，表示初始环外亚甲基(或羟甲基)参与聚合过程。
HPLC/MALDI分析表明经纯化的聚合物具有约6000的分子量，约12个单元的二聚物。观察到对应于m/e 701和475的MS片段，参见式9中所示的结构。
实施例5.美洲格尼帕树汁与甘氨酸的反应
将原始液汁(100mL)与甘氨酸(0.8g，甘氨酸的量可根据所述原始液汁的京尼平含量进行调整，以使甘氨酸和京尼平的摩尔比为约1:1)混合，并将反应温度在70℃下保持2小时。在此之后，将溶剂蒸发并减压，或冻干以得到深蓝色粉末混合物。
然后，将所述深蓝色粉末首先用乙酸乙酯提取，然后用甲醇更彻底地提取。使用Sephadex LH-20柱和甲醇通过柱色谱分离甲醇中的可溶性组分(800mg)。在第一级分中，在甲醇蒸发后得到了作为经纯化聚合物的大部分深蓝色产物(600mg)。从甲醇可溶性级分中还得到了少量的化合物1(1mg)、化合物2(1.5mg)和化合物3(1mg)。
还使用Sephadex LH-20柱并用醇:水(9:1)洗脱来分离甲醇不溶性级分(1.2mg)。随后，进行反相C-18分离以得到经纯化的聚合物。将来自甲醇不溶性级分的经纯化聚合物物与来自甲醇可溶性级分的经纯化聚合物合并，总共得到1.8克聚合物。通过使美洲格尼帕树汁与甘氨酸反应得到的聚合物的分析数据与通过使纯化的京尼平与甘氨酸反应得到的聚合物的分析数据相同。
实施例6.聚合物的量化
开发了HPLC/PDA方法以评估蓝色聚合物的纯度并量化其在哈瓜提取物(由美洲格尼帕树汁与甘氨酸的反应得到)中的含量。
该分析研究使用了Shimadzu Prominence UFLC，其具有在线脱气装置(DGU-20A5)、四级泵(LC 20AT)、自动采样器(SIL 20A HT)、柱温箱(CTO 20A)和由通信总线模块(CBM 20A)控制的光电二极管阵列检测器(SPD M20A)。
使用多个柱，例如反相Luna C18(Phenomenex)150×4,6mm 5μm、supelcosil(Sigma)C8,150×4,6mm 5μm和Luna PFP 150×4,6mm 5μm。
哈瓜提取物中的聚合物的高极性特性限制了正相柱的使用。
乙腈和甲醇以100％至100％水的多种比例使用。
使用1mL/分钟的流量，并且在整个展开过程中不进行改动。
使用PDA检测器，并且以最大吸收制图模式从200nm至800nm以及在590nm处监测波长以检测蓝色聚合物。
虽然对若干柱和检测器池温度进行了评估，但使用Luna PFP柱得到了最好的结果。用其他柱进行分析的结果并不令人满意，这是由于无论使用何种溶剂混合物、柱和检测器温度、流量或进样体积，都只观察到未保留的峰。
在选择柱之后对溶剂梯度进行了评估，用甲醇和水作为洗脱剂得到了最好的分离结果，但在该阶段需要改善峰形和峰宽，使用不同的柱温箱温度的若干试验使得具有良好的形状和宽度，而对保留时间没有影响。
最佳分离条件的汇总包括以下内容：
具有安全保护柱的Luna PFP 100A(Phenomenex)柱：
长度………150mm
内径........4.6mm
粒径............5μm
流动相：洗脱剂A：水以及洗脱剂B：甲醇
线性梯度：
| 线性梯度(分钟) | ％A | ％B |
| 0 | 80 | 20 |
| 5 | 80 | 20 |
| 6 | 0 | 100 |
| 10 | 0 | 100 |
| 11 | 80 | 20 |
| 20 | 80 | 20 |
流量：1mL/分钟
温度：
T样品：环境温度(20℃至24℃)
T柱：40℃
T检测器池：40℃
检测：最大吸收制图法(Maxplot)230nm至800nm(提取物图谱)；
最大吸收制图法590nm(蓝色聚合物的量化)。
样品制备：在10mL或25mL容量瓶中，称取10mg待分析的批次样品，并用去离子水定容。使用自动进样器注入10μL的该溶液。
系统表现：在标准方法中蓝色聚合物在10.3分钟时被洗脱。
实施例7.不含糖的蓝色聚合物的纯化
使用Sephadex LH-20通过柱色谱对不含糖的蓝色聚合物进行纯化。
将10g冻干的哈瓜提取物(从美洲格尼帕树汁与甘氨酸的反应得到)溶解在10mL去离子水中并过滤。随后将着色剂的溶液施加到柱的顶部。流动相组成为100％甲醇、80％甲醇、50％甲醇和100％水。共收集了14个级分，并通过薄层色谱用异丙醇:水:乙酸(2:0.5:0.5)溶液洗脱来检查糖含量。向板喷洒硫酸(5％)并在105℃下加热。将首先洗脱的和不含糖的级分混合并在真空条件下干燥，然后使用与上述相同的洗脱条件进行纯化步骤，直至通过HPLC检测到期望纯度。
在使用实施例6的方法通过HPLC进行分析之前，将级分的等分试样进行稀释，并使用尼龙膜过滤器(Acrodisc，Pall)通过0.45μm过滤。
来自哈瓜提取物的蓝色聚合物的期望纯度的选择标准使用紫外-可见标准和HPLC标准，即分别为：Sephadex柱的级分在TLC方法下不含糖，并且在590nm处检测出的主峰的吸光度等于或大于在240nm处的吸光度。
图13A-D示出了生料和具有不同纯度的三个级分的HPLC迹线(谱图)。图13C代表不含糖的纯的蓝色聚合物(用作“参考标准”)的HPLC迹线。
实施例8.哈瓜提取物样品中蓝色聚合物含量的量化
将实施例7中制备的不含糖的的参考标准蓝色聚合物用作外标用于使用实施例6中所描述的分析方法来量化哈瓜提取物样品中蓝色聚合物的含量。
校正曲线
由蓝色聚合物参考标准制备参考标准溶液。将来自参考标准的曲线下面积(AUC)各自对浓度作图，并应用线性回归以得到校正曲线方程。
将参考标准溶液的五个浓度各注射三次，并且在一些情况下注射更多次。
发现所述方法在20μg/mL至100μg/mL的范围内呈线性。
得到了六个不同的校正曲线。校正曲线1至6分别示于图14A-F。
检测限与量化限
经开发以测量哈瓜提取物中蓝色聚合物浓度的方法能够在2μg/mL的浓度下限于10.2分钟时检测到在590nm处监测的信号。根据公式2H/h，其中H是标准参考峰的高度并且h是空白色谱图(注射10μL甲醇或水)中在该保留时间处的高度。值(2×3423/2836＝2.4)是被视为检测限的下限。使用标准参考峰高和空白色谱图的平均值进行计算。
蓝色聚合物的量化限经测定为20μg/mL。
哈瓜提取物样品中蓝色聚合物的量化
使用外标法将来自哈瓜提取物的蓝色聚合物量化为百分比。
每批次称重三次以在两天内得到对10mL稀释液的三次独立测量；对于25mL稀释液仅在一天内进行三次。对于批次5312005，仅对10mL稀释液进行分析，这是因为两个体积的样品稀释液的目的是为了评估浓度是否为当分析哈瓜提取物时应考虑的参数。在表1中，显示了批次5312001至5312004的对于25mL和10mL稀释液的结果，其中可以比较平均值。
当将样品稀释至10mL时使用下面的公式来计算蓝色聚合物的浓度：
或
当将样品稀释至25mL时，y＝蓝色聚合物在590nm处的测定峰面积；b＝回归线的截距；a＝回归线的斜率；w＝样品的重量(mg)。
对产生的每个校正曲线计算样品中的百分比。将校正曲线1的数据排除在外。当从六个校准曲线方程得到所分析的每个批次的数据时，来自校正曲线1的结果与其他值不同，并且如果对它们取平均值，％RSD增加，这可能是由在稀释和样品制备或在称重步骤中的误差造成的。
表1.哈瓜提取物中蓝色聚合物的百分比
实施例9.通过发酵除去糖
将哈瓜提取物(4.5L，从美洲格尼帕树汁与甘氨酸的反应得到，批次5113003)在立式高压釜Tuttnauer 3870ELV(85L)(Tuttnauer Europe BV,Netherlands)中在121℃，15psi下灭菌20分钟。然后使经灭菌的哈瓜提取物在高压釜内冷却。将所得培养基用25g商品级(Levapan,Colombia)酵母(酿酒酵母，Saccharomyces cerevisia)接种，所述酵母先前在相同的无菌培养基中在30℃下进行了活化。发酵在具有5L工作体积的7L生物反应器中进行。
将混合物在生物反应器BioFlo110(New Brunswick Scientific,USA)中孵育24小时，使用软件Biocommand 6.1.7601批次控制变量用于监测。对四个500mL样品进行测试(孵育的最初12小时中每3小时取一次)。在此之后，工作体积为约2.5L的培养基。
发酵过程的操作条件示于表2中。系统以厌氧生长开始并且在发酵过程期间不添加外部氧。检测到的氧的百分比(DO2(％))表示在未添加外部氧的情况下存在于样品中的氧。在发酵过程中，将温度在30±2℃下保持恒定。
表2.生物反应器操作条件
| 时间(小时:分钟:秒) | 搅拌(rpm) | DO2(％) | pH | 温度(℃) |
| 0:01:06 | 149.80 | 11.55 | 5.61 | 32.59 |
| 23:19:07 | 150 | 9.13 | 5.53 | 29.99 |
23小时19分钟之后，发酵过程终止。将反应混合物冷却并在Labofuge ThermoScientific中以200rpm至4800rpm离心20分钟(Thermo Fisher Scientific，NJ，USA)。随后除去酵母。
使用数字折光仪Atago PAL-3(Atago Co.Ltd.Tokyo,Japan)分析经离心样品的可溶性固体(°Brix)，并使用MA35M Brand Sartorius(The Sartorius Group,Goettingen,德国)分析含水量。采用涂有硅胶60F 2544×5cm的铝板，用异丙醇:乙酸:水(2:0.5:0.5)的混合物进行洗脱，通过TLC法对样品的糖含量进行分析。用乙醇中的10％硫酸喷洒所述TLC板，并将所述板加热至110℃。使用纯葡萄糖、果糖和蔗糖作为标准。在3、6、9和12小时对反应混合物的分析表明6个小时的发酵足以除去所有的糖。通过上述TLC法在发酵6小时后在反应混合物中没有观察到糖。
实施例10.发酵产物和非发酵产物的特性比较
样品制备
将实施例9中制备的经发酵哈瓜提取物(离心并过滤)在旋转蒸发器中浓缩，然后在存在或不存在载剂(改性食物淀粉)的情况下用Büchi B-290(Labortechnik AG,Flawil,瑞士)进行喷雾干燥。干燥条件为：150℃的入口温度和103℃至110℃的出口温度；泵送25％(290mL/小时)，空气干燥流量400以及抽气机85％。
使未发酵的哈瓜提取物(来自用于制备经发酵产物的相同批次)在如本文所述的用于经发酵产物的相同条件下干燥。
总之，制备了三种产物：
(1)PF：经发酵产物，离心并浓缩，没有载剂；
(2)FC：经发酵产物，离心并浓缩，用载剂作为载剂(60％总固体来自产物-40％总固体来自载剂)；
(3)PC：未发酵产物，存在载剂(60％总固体来自产物-40％总固体来自载剂)。
对三种粉末产物(PF、FC和PC)的特性(水分含量、聚合物含量、颜色强度以及在pH3缓冲液中的稳定性)进行分析。还测试了产物的微生物稳定性。
聚合物含量
通过如实施例6至8中描述的HPLC方法测量PF、FC和PC的聚合物含量。HPLC结果示于表3中。HPLC色谱图示于图15中。
表3.聚合物的量化结果
颜色强度
颜色参数
用具有VISIONlite软件的GENESYS 10S UV-VIS分光计对PF、FC和PC的水性染料溶液(0.015g粉末/40mL)的CIELab参数分析三次。三个样品的颜色参数示于图16中。
CIELab参数表明经发酵产物(PF和FC)具有比未发酵产物更强烈的蓝色。与PC相比，PF和FC均具有更低的L值(更低的亮度)，更小的负a值(这可能意味着更紫的颜色)，但是b值类似。图16还表明，PF具有最强的吸光度，为PC的两倍；并且FC的吸光度为PC的1.6倍。产物在pH 3缓冲溶液中的稳定性
在以下三个存储条件下对PF、FC和PC在pH为3.0的缓冲溶液中的稳定性进行了评估：冰箱(6℃)、温度(20℃)和室(45℃)，持续19天。
对产物(PF、FC和PC)以40mL缓冲液中15mg样品的浓度各自测试三次。在同一分光光度计上从350nm至800nm(以2nm的步长进行测量)监测样品。使用VISIONlite软件版本2，通过CIELab参数以D65和10°的观察角确定颜色变化。使用参数L(亮度，白0/黑100)、a(-绿/红+)和b(-蓝/黄+)使用方程[1](以下所示)计算颜色变化。
随时间监测PF、FC和PC的颜色相关参数：A(吸光度)、L、a、b及ΔEab。
半衰期是根据一级动力学由反应速率常数(由Ln(蓝色面积)t/(蓝色面积)0对时间的曲线获得的斜率)来计算。使用Statgraphics Centurion XV试验进行统计分析。使用Fisher最小显著性差异(Fisher least significant difference，LSD)来区分平均值。
表4示出了PF、FC和PC的以天计的半衰期的结果。
表4.以天计的平均半衰期
如通过水分分析仪(Sartorius Brand MA35M)测定的，PF、FC和PC的含水量分别为4.12％、3.24％和3.15％。
发酵过程在六小时内有效地从哈瓜提取物中除去了所有的糖。所得发酵产物(PF与PC)具有更强烈的蓝色。PF的蓝色强度是未发酵产物PC的两倍。
当在不添加载剂密封剂(例如淀粉)的情况下喷雾干燥时，发酵产物PF是稳定的。
如下测试发酵产物的微生物稳定性：通过向发酵产物中添加已知量的微生物(例如，细菌、真菌或酵母)，然后(例如，7天后)测量发酵产物的微生物稳定性(例如，通过测量所添加的微生物的活性)。
实施例11.通过XAD-7从哈瓜提取物中除去糖
使粗制美洲格尼帕树汁(150mL)与甘氨酸(1.5g)在70℃下反应2小时。使反应混合物冷却至室温。然后将XAD-7树脂(100g)添加到冷却的反应混合物中。24小时后，将XAD-7树脂滤出。
将所得树脂首先用水洗脱以产生水性级分，然后用水和乙醇的混合物洗脱以产生聚合物级分。使用实施例6的方法通过HPLC分析确定聚合物级分中聚合物的种类。通过实施例9描述的TLC法测定聚合物级分的糖含量。通过TLC分析表明聚合物级分中不含糖。另一方面，水性级分中富含糖。HPLC分析还表明水性级分包含一些聚合物。图17示出了聚合物级分和水性级分的HPLC光谱。
表5示出了通过用HP XAD7树脂进行纯化得到的级分的分光光度特征。
表5.通过用HP XAD7树脂进行纯化得到的级分的分光光度特征
| 样品 | L | a | b | 吸光度590nm |
| POL | 6.3 | 6.7 | -27.2 | 9.9999 |
| H2O | 95 | -0.6 | -2.9 | 0.0768 |
| RN | 93 | -2.8 | -6.2 | 0.1267 |
RN：美洲格尼帕树汁与甘氨酸反应。
POL：聚合物级分；用乙醇洗脱，包含大部分的聚合物。
H2O：水性级分；用水洗脱，富含糖
实施例12.美洲格尼帕树汁与不同氨基酸的反应
使美洲格尼帕树汁与某些氨基酸反应以确定所得颜色的性质。在100mL锥形瓶中将美洲格尼帕树汁(50mL)(通过HPLC在与二极管阵列检测器和PDA耦合的ShimadzuProminence UFLC(日本)上测定的京尼平含量为2.42％)与等摩尔量的甘氨酸(GLY)、缬氨酸(VAL)、赖氨酸(LYS)、脯氨酸(PRO)、甲硫氨酸(MET)、酪氨酸(TYR)或色氨酸(TRP)混合。将所得的汁+氨基酸混合物在70℃下搅拌2小时。使用薄层色谱法在涂覆有硅胶的铝板F254 4×5cm上用甲醇-水4:1的混合物洗脱来监测反应。通过实施例6中描述的方法通过HPLC分析反应产物。反应产物的分光光度表征在GENESYS 10S分光光度计UV-VIS上用VISIONlite软件版本2.0进行。为了表征实验，通过将20μL反应溶液在5mL去离子水中稀释来制备样品，在与色氨酸和脯氨酸反应的情况下除外，在该情况下，分别通过将100μL和200μL反应溶液在5mL去离子水中稀释来制备样品。
在pH为3.0的缓冲溶液中，以类似于实施例10中描述的方法对所产生的反应产物的稳定性进行评估，不同之处在于，在当前实施例中，还用紫外线灯UVGL-58手持式UV(Ultra-Violet Products Ltd,Cambridge,UK)使反应产物经受254nm下的照射7.46小时。将反应产物在每10ml的pH为3.0的缓冲液中40μL反应产物的浓度下测试三次。
图18示出了美洲格尼帕树汁与不同氨基酸的反应产物的吸收光谱。这些产物的颜色参数示于表6中。
表6.美洲格尼帕树汁与不同氨基酸的反应产物的颜色参数
| 氨基酸 | L* | a* | b* | λmax | 吸光度λmax |
| GLY | 56.5 | -9.5 | -22.1 | 594 | 0.9217 |
| LYS | 67.6 | -10.4 | -9.7 | 596 | 0.5904 |
| VAL | 72.9 | -12.4 | -7.6 | 598 | 0.5205 |
| MET | 72.3 | -14.7 | -11.1 | 602 | 0.575 |
| PRO | 88.6 | -0.7 | 3.4 | 350 | 0.3902 |
| TYR | 78.4 | -12.1 | -9 | 602 | 0.4272 |
| TRP | 93.1 | -2.9 | 1.4 | 350 | 0.2582 |
| PRO 200* | 34.2 | 0.9 | 11.1 | 350 | 3.1127 |
| TRP 100* | 72.1 | -10.4 | 4.3 | 350 | 1.1678 |
*对于PRO200，使用200微升的粗制反应混合物；而在PRO中使用20微升。对于TRP100，使用100微升的粗制反应混合物；而在TRP中使用20微升。
图19A-C示出了美洲格尼帕树汁与不同氨基酸的反应产物的HPLC分析(按氨基酸分类)。图19A-C示出了对于每种氨基酸，使用实施例6中方法的美洲格尼帕树汁与氨基酸的反应产物的HPLC光谱；鉴定出聚合物的HPLC区域的放大图；以及所选信号的紫外可见光谱。
氨基酸LYS、VAL、MET和PRO与美洲格尼帕树汁的反应产物的保留时间在10.3分钟(10.3分钟±5％)的范围内。该保留时间与对于来自美洲格尼帕树汁和甘氨酸的聚合物所观察到的保留时间相似，然而，与对于美洲格尼帕树汁与甘氨酸的反应产物所观察到的信号相比，美洲格尼帕树汁与氨基酸LYS、VAL、MET和PRO的反应产物的信号更复杂(参见图19A-B)。不被理论所束缚，这些结果可以表明，使用氨基酸LYS、VAL、MET和PRO形成了更多种不同尺寸的化合物或聚合物链。
美洲格尼帕树汁与酪氨酸或色氨酸的反应不形成保留时间在10.3分钟(即，10.3分钟±5％)范围内的产物。这些产物的最大吸收波长(λmax)超过600nm(参见图19C)。
图20示出了在254nm的UV照射下不同氨基酸与美洲格尼帕树汁的反应产物在pH为3.0的缓冲溶液中的稳定性(以半衰期表示)。
美洲格尼帕树汁与不同氨基酸反应产生不同颜色的产物：蓝色(GLY和LYS)；蓝绿色(VAL、MET和TYR)；绿色(TRP)和黑色(PRO)。
当用254nm的UV照射在pH为3.0的缓冲溶液中进行测试7.46小时时，由甲硫氨酸(MET)与美洲格尼帕树汁的反应形成的产物的pH稳定性是来源于甘氨酸(GLY)与美洲格尼帕树汁的产物的两倍。
HPLC分析表明，当与来源于甘氨酸(GLY)和美洲格尼帕树汁的聚合物相比时，美洲格尼帕树汁与酪氨酸(TYR)或色氨酸(TRP)反应形成具有稍低极性的化合物(如对于与TYR和TRP的反应产物与GLY相比更高的保留时间所表明)。
实施例13.由美洲格尼帕树果实的中果皮提取物与甘氨酸反应所产生的颜色
美洲格尼帕树果实的中果皮的水性提取物
制备来自美洲格尼帕树果实的中果皮(即，果实的果皮)的水性提取物。与软且具有不规则表皮的成熟果实相比，使用了硬且具有均匀表皮的未熟果实。用300mL去离子水使新鲜(即，收获后1至2天内)美洲格尼帕树果实的中果皮(76g)溶解，过滤该汁并通过TLC和HPLC(在与二极管阵列检测器(DAD)耦合的Shimadzu Prominence UFLC上)分析，以测定京尼平和其他环烯醚萜京尼平的含量。为了比较，在如上所述用去离子水提取前，将相同年龄的完整水果在室温下放置三天(非新鲜果实)。所得汁也经TLC和HPLC分析以测定京尼平和其他环烯醚萜京尼平的含量。
图21A示出了新鲜美洲格尼帕树果实的中果皮的水性提取物的HPLC谱图，其具有保留时间为19分钟至20分钟的峰，这接近京尼平的保留时间(22分钟至23分钟)，并且在240nm处具有最大吸收波长。
图21B示出了美洲格尼帕树果实的中果皮的水性提取物的HPLC谱图，所述美洲格尼帕树果实具有与图21A中相同的年龄，但在提取前在室温下放置三天(非新鲜)。所述谱图具有保留时间为19分钟至20分钟及22分钟至23分钟的峰。
中果皮(果皮)水性提取物与甘氨酸的反应
在500mL锥形瓶中将如上所述制备的中果皮的水性提取物(经过滤的汁，300mL)与甘氨酸(450mg)混合。接着，将所得混合物在有磁力搅拌的加热板(VELP,意大利)上在75℃和4000rpm下搅拌90分钟。该方法产生了深紫色的产物。
将反应产物过滤，并用具有VISIONlite软件版本2.0的GENESYS10S牌分光光度计UV-VIS进行表征。粗反应产物通过1H NMR和质谱(MS)进行表征。图22示出了由将水性提取物与甘氨酸混合的这种方法得到的紫色产物的1H NMR。
表7示出了在紫色染料混合物中检测到的一些信号。
表7.在所分析的紫色染料混合物中检测到的信号
在表7中作出的去卷积示出了m/z 257.2处的分量信号的去卷积。
或者，如下进行所述方法：在添加甘氨酸之前将水性提取物预热至70℃，所得产物为蓝色。所述产物与从京尼平与甘氨酸的混合物所得到的是相同的蓝色。图23示出了由将经预热水性提取物与甘氨酸混合的这种方法得到的蓝色产物的1H NMR。
这些结果表明，由美洲格尼帕树果实的中果皮得到的汁与甘氨酸的反应产物取决于在添加甘氨酸之前水性提取物是否被预热。在将甘氨酸与水性提取物(不预热)混合的工序之后，所形成的产物为深紫色。在添加甘氨酸之前将水性提取物预热至70℃的工序之后，所形成的产物为蓝色。来自中果皮水性提取物的京尼平前驱体的表征
I.水提取和冷冻干燥方法
将美洲格尼帕树的新鲜未熟果实(收获后两天)切成4块，并将中果皮(果皮)与内果皮(果肉)和囊果皮(外果皮)分离。未熟美洲格尼帕树的图像示于图24中。在搅拌机中用300mL去离子水将360g中果皮压碎，并使所得汁通过棉纱真空过滤，然后立即使用LABCONCO装置使所述汁冷冻干燥过夜。
将50mg的冻干产物在超声下用1mL的CD3OD提取5分钟并过滤。在水抑制下在Bruker Fourier 300上分别在300MHz和75MHz处通过1H和13C NMR对溶液进行分析。
II.液氮冷冻法
在用液氮冷冻后将新鲜切开的中果皮压碎，并将50mg的所得粉末在超声下用1mL的CD3OD提取5分钟并过滤，在水抑制下在Bruker Fourier 300上分别在300MHz和75MHz处通过1H和13C NMR对溶液进行分析。
III.结果
经冻干和经氮冷冻的中果皮的1H NMR结果显示出分辨率非常好的谱图，其具有相似的京尼平指纹图谱(图25A-B)。
哈瓜中果皮的水提取物在19分钟时具有HPLC(240nm)峰，所述峰在加热或用乙酸乙酯提取后消失。在21分钟至22分钟检测到京尼平峰。图26A-B分别示出了中果皮水提取物和水提取物的乙酸乙酯溶剂部分的HPLC迹线(240nm)。
由哈瓜果实的中果皮中的前驱体形成京尼平是自发的，如由在图26A所示的分析之后数天内在室温下放置的果实所制备的水提取物的HPLC图谱所确定。京尼平在21分钟至22分钟时出现，且其在19分钟处的前驱体可以在240nm下检测到(图27)。
京尼平由其存在于哈瓜中果皮中的前驱体快速且自发形成表明了由氧或热引起的前驱体结构变化(即，形成半缩醛环)，导致产生京尼平或者该前驱体分子发生酶裂解以将京尼平释放到果实的内果皮。中果皮水提取物的1H NMR实验没有显示出醛质子(12ppm)，参见图28。
检测到5.1ppm和4.7ppm处的两个双峰以及100ppm和70-80ppm处的的碳信号，这些在京尼平中不存在，而是糖中的异位质子和CHO基团的特征，支持了所述前驱体是京尼平的糖苷。京尼平前驱体的1H(图29)和13C(图30)数据与分子(+)-京尼平苷和京尼平的环烯醚萜B-糖苷前驱体相匹配。
(+)-京尼平苷的波谱数据：
1H NMR:(300MHz,CD3OD):δ7,53(s,1H),δ5,81(s,1H),δ5,17(d,J＝7,6 1H),δ4.73(d,J＝7.8Hz,1H),δ4,33(d,J＝14,6Hz,1H),δ4,20(d,J＝14,3Hz,1H),δ3,83(d,J＝11,7Hz,1H),δ3,72(s,3H),δ3,66(dd,j＝12,2,5,7Hz,1H),δ3,39-3,42(m,1H),δ3,15-3,28(m,3H),δ2,83(dd,16,5,8,4Hz,1H),δ2.53(dd,J＝7.95,15.75Hz,1H),δ2,05-2,14(m,1H)
13C NMR:(75MHz,CD3OD):δ168.71,152.23,142.98,127.37,111.15,98.90,96.99,76.82,76.34,73.39,71.43,61.12,60.00,50.77,45.58,38.29,35.03。
实施例14.向美洲格尼帕树汁中添加甲硫氨酸和甘氨酸
使美洲格尼帕树汁与甲硫氨酸和甘氨酸反应以确定所得的颜色性质。将美洲格尼帕树汁(50mL)添加到100mg甲硫氨酸和100mg甘氨酸的混合物中，并将反应在70℃下维持2小时。
在第二个实验中，首先将美洲格尼帕树汁(50mL)添加到100mg甲硫氨酸中，并在反应一小时后，添加另外的100mg甘氨酸，并将反应再维持1小时。
在400至700波长范围内的GENESYS 10S分光光度计的紫外可见吸收下，由0.015g/40mL粉末染料的水溶液来测量由这些反应各自得到的颜色，以确定最大吸光度和CIELab参数。
与氨基酸的添加顺序无关，结果是形成深蓝色。薄层色谱表明形成了聚合物，并且表明无论反应物的添加顺序如何，主要化合物是相同的，且无论是单独使用甲硫氨酸或甘氨酸还是使用甲硫氨酸和甘氨酸的混合物，颜色是相同的。TLC显示出蓝色染料形成。通过分光光度法对反应产物进行分析，如表8所示。
表8.美洲格尼帕树汁与甲硫氨酸和甘氨酸的混合物之间，以及与甘氨酸之间反应的CIELab参数
| 样品 | L | a | b | 吸光度590nm |
| M+G | 87 | -3.6 | -11.2 | 0.2374 |
| 1+2 | 88.1 | -4.2 | -10.5 | 0.221 |
| RN | 93 | -2.8 | -6.2 | 0.1267 |
M+G：美洲格尼帕树汁与甘氨酸和甲硫氨酸同时反应；
1+2：甲硫氨酸与美洲格尼帕树汁反应，然后甘氨酸与其反应；
RN：美洲格尼帕树汁与甘氨酸反应。
在大多数的美洲格尼帕树汁和氨基酸的混合物中确定了聚合物HPLC色谱图中的保留时间，所述保留时间与仅通过甘氨酸与美洲格尼帕树汁反应所产生的染料的保留时间相同。最大吸收在590nm处。将甘氨酸和甲硫氨酸同时加入美洲格尼帕树汁中。通过美洲格尼帕树汁与氨基酸甘氨酸和甲硫氨酸反应以及仅与甘氨酸反应所得到的色谱图示于图31中。
Claims (17)
1.一种着色剂组合物，包含式4的聚合物：
其几何异构体、其互变异构体或其盐，
其中n为2至20的整数；
其中A各自独立地选自式5′A、式5′B、式5′C、其几何异构体、其互变异构体、其盐及其组合：
其中：
R1为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基；
其中T1为氢或甲基；T2为氢或A-T1，其中A和T1如上所限定；
其中所述着色剂组合物包含与所述式4的聚合物的重量相比小于5重量％的选自式2′、式3′A、式3′B、其几何异构体、其互变异构体及其盐的第一附加化合物：
2.根据权利要求1所述的着色剂组合物，其中所述着色剂组合物包含与所述式4的聚合物的重量相比小于5重量％的选自式1A、式1B、其几何异构体、其互变异构体及其盐的第二附加化合物：
3.一种纯度大于80％的式4的聚合物：
其几何异构体、其互变异构体或其盐，
其中n为2至20的整数；
其中A各自为式5′A(Me)、其几何异构体、其互变异构体或其盐：
其中T1为氢或甲基；T2为氢或A-T1，其中A和T1如上所限定。
4.根据权利要求3所述的聚合物，其数均分子量(Mn)为6,000。
5.根据权利要求3所述的聚合物，其特征在于IR光谱具有以下峰(±5cm-1)：3393cm-1、2949cm-1、1726cm-1、1630cm-1和1540cm-1。
6.一种赋予基质蓝色的方法，包括使所述基质与根据权利要求1或2所述的着色剂组合物或者根据权利要求3所述的聚合物相接触。
7.一种产品，包含(a)根据权利要求1或2所述的着色剂组合物或者根据权利要求3所述的聚合物以及(b)食物、药物、营养物、化妆剂或医疗装置。
8.根据权利要求7所述的产品，其中所述药物或营养物是选自以下的剂型：片剂、胶丸、珠剂、球剂、丸剂、糖衣丸、锭剂、软膏剂、胶囊剂、粉剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂和悬浮剂。
9.一种医疗装置，其通过根据权利要求1或2所述的着色剂组合物或者根据权利要求3所述的聚合物着色。
10.一种着色剂组合物，其包含式4的聚合物：
其几何异构体、其互变异构体或其盐，
其中n是2至20的整数；
其中A各自独立地选自式5A、式5B、式5C、其几何异构体、其互变异构体、其盐及其组合：
其中：
R1为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基；
R2和R′2独立地为氢或C1-10烷基；
R3是氢或COOH；
其中T1为氢或甲基；T2为氢或A-T1，其中A和T1如上所限定；
其中所述着色剂组合物包含与所述式4的聚合物的重量相比小于5重量％的选自式6、式7、式8、其几何异构体、其互变异构体及其盐的第一附加化合物：
11.一种着色剂组合物，其包含式4的聚合物：
其几何异构体、其互变异构体或其盐，
其中n是2至20的整数；
其中A各自独立地选自式5A、式5B、式5C、其几何异构体、其互变异构体、其盐及其组合：
其中：
R1为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基；
其中代表氨基酸残基，其中R3为COOH并且R2和/或R′2代表所述氨基酸的侧链，并且其中所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、牛磺酸、鸟氨酸和瓜氨酸，其中所述氨基酸能够是D构型或L构型；
并且其中T1为氢或甲基；T2为氢或A-T1，其中A和T1如上所限定；
其中所述着色剂组合物包含与所述式4的聚合物的重量相比小于5重量％的选自式6、式7、式8、其几何异构体、其互变异构体及其盐的第一附加化合物：
12.根据权利要求1、2、10和11中任一项所述的着色剂组合物，其中所述着色剂组合物包含小于5重量％的碳水化合物。
13.根据权利要求12所述的着色剂组合物，其中所述氨基酸是甘氨酸。
14.根据权利要求12所述的着色剂组合物，其中所述着色剂组合物的至少80％不含脂肪酸、脂肪和蛋白质。
15.一种着色剂组合物，包含根据权利要求3所述的聚合物，其中所述着色剂组合物的至少80％不含糖，并且在不使用淀粉的情况下经喷雾干燥。
16.一种产品，包含(a)根据权利要求11所述的着色剂组合物和(b)食物、药物、营养物、化妆剂或医疗装置。
17.一种着色剂组合物，包含经纯化的式4的聚合物，
其几何异构体、其互变异构体或其盐，
其中所述式4的聚合物纯度大于80％，并且由以下的反应形成
其中n是2至20的整数；
其中A各自独立地选自式5A、式5B、式5C、其几何异构体、其互变异构体、其盐及其组合：
其中R1为甲基，以及
代表伯烷基胺或代表氨基酸残基，其中R3为COOH并且R2和/或R′2代表所述氨基酸的侧链，并且其中所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、牛磺酸、鸟氨酸和瓜氨酸，其中所述氨基酸能够是D构型或L构型；
以及其中T1为氢或甲基；以及T2为氢或A-T1，其中A和T1如上所限定。
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