KR102257141B1 - 제니핀 또는 제니핀 함유 물질로부터 유래된 착색제 화합물 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은, 제니핀과 아민의 반응으로부터 유래된 착색제 화합물, 및 상기 착색제 화합물의 단리 방법을 제공한다. 착색제 조성물은, 반응 생성 물질의 크로마토그래피에 의한 다중 분획화로부터 얻어진 정제된 화합물 (예를 들어, 정제된 중합체 또는 정제된 이량체)를 포함한다. 정제된 중합체 또는 이량체는, 식품, 약물, 화장품, 의료 기기 및 직물 제품에 색을 부여하기 위해, 착색제로서 그 자체로 또는 또 다른 착색제와 조합되어 사용될 수 있다.

Description

제니핀 또는 제니핀 함유 물질로부터 유래된 착색제 화합물 {COLORANT COMPOUNDS DERIVED FROM GENIPIN OR GENIPIN CONTAINING MATERIALS}

본 개시내용은 제니파 아메리카나(Genipa americana) 즙, 제니핀 또는 제니핀 유사체와 아민의 반응으로부터 단리된 착색제 화합물, 그를 포함하는 조성물, 및 그의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

합성 착색제의 사용에 있어, 주로 이들의 독성으로 인한 소비자의 불신은, 천연 색 화합물의 연구 및 개발로 이어져 왔다. 이들 화합물은 수 세기에 걸쳐 사용되었지만, 최근의 기술 진보는 이들 착색제가 산업적 및 상업적으로 실용적이며 합성 착색제와 경쟁할 수 있게 하였다. 국제연합 무역개발회의 (2005)에서 발효된 "Market Brief in the European Union for selected natural ingredients derived from native species; Genipa americana"을 참조한다. 국제적으로, 제니파 아메리카나의 청색 및 흑색 착색제와 같은 천연색은 둘 다 식품, 화장품 및 직물 산업에 의해 사용된다.

청색 착색제를 제조하는 방법이 보고되었다. 예를 들어, 제니파 아메리카나 과육으로부터 얻어진 비가공 생즙과 글리신의 혼합물로부터 유래된 pH 안정성 청색 착색제를 제조하는 방법이 에케베리(Echeverri) 등 (미국 특허 번호 7,927,637)에 의해 기재되었고, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 청색 착색제의 제조에 대한 다른 예는, 1급 아민과 제니핀의 자발적 반응으로부터 제조된 청보라색 착색제를 기재한 에이치. 오쿠야마(H. Okuyama) 등의 일본 특허 공개 번호 52053932A2 및 52053934A2; 및 제니파 아메리카나 즙과, 다른 과즙 (예를 들어 수박) 및 아미노산을 혼합하는 것을 기재한 우(Wu) 등의 WO 2009/120579를 포함한다. 이들 기존 방법은 일반적으로, 아마도 혼합물 정제에 대한 관련 기술분야에서 인식되는 어려움으로 인해, 생성된 조 혼합물을 추가의 정제 없이 사용한다. 문헌 [Touyama R. et al., Studies on the Blue Pigments Produced from genipin and methylamine. I. Structures of the Brownish-Red Pigments, Intermediates Leading to Blue Pigments, Chem Pharm. Bull 42, 66, 1994] (제니핀 또는 구조적 유사체와 아미노산의 반응으로부터 유래된 청색 안료는 "그의 크로마토그래피 거동, 비-분석가능한 ¹³C-NMR 스펙트럼에 기초하여, 또한 분자량 측정에 의해 고분자량 중합체의 난해한 혼합물인 것"으로 밝혀짐)을 참조한다. 청색 안료 물질 분자 구조는, 이러한 물질이 그의 매우 높은 극성으로 인해 단지 물 중에서만 거의 가용성이어서 TLC 모니터링을 어렵게 하기 때문에, 그 설명이 제한되어 있다. 9000 분자량의 중합체가 보고되었다 (문헌 [H. Jnouye, Y. et al., 26th Symposium on the Chemistry of Natural Product, Kyoto, Abstr. pp 577-584, 1983] 참조). 보다 최근에, 우 및 호른(Horn)의 미국 공개 번호 2013/0115252에는, 제니파 아메리카나로부터 제니핀을 농후화하는 방법, 및 농후화된 제니핀 물질의 용도가 기재되었다. 그러나, "제니핀-풍부 추출물"은, 30 내지 97% (w/w)의 제니핀이며, 조성물의 나머지는 수분, 지방, 소량의 산 및 질소-함유 화합물을 포함하고 나머지는 탄수화물임이 개시되었다 (미국 공개 번호 2013/0115252, 페이지 3, 좌측 칼럼 참조).
접근 및 이익 공유의 성명(Statement of Access and Benefit Sharing; ABS)
생물 다양성 협약의 ABS 원칙 및 그를 보완하는 나고야 의정서의 이행에 따라, 소수 민족 공동체 및 콜롬비아의 법률에 의해 그들의 집합적인 영토를 관리하도록 권한이 부여된 기관으로부터 동의를 받아 본 유전자원에 대한 접근권을 얻었습니다. 양수인은 또한 상업 파트너와 지역의 생산과 공급 역학을 조정하는 여러 지역 사회의 신생 기업과 계약을 체결하였습니다. 이러한 지분 계약을 통해, 지역 사회 소유의 공급자들은 유전자원의 상업화에 따른 경제적 이익을 공유합니다. 윤리적 바이오무역을 위한 연합 (Union for Ethical BioTrade)의 회원이고, 지역의 생산업자들을 대상으로 태평양 온대우림에서의 지속가능한 공급을 교육하는 비영리기관인, 푼다시온 에스파베(Fundacio'n Espave')를 통해 추가적인 이익 공유가 제공됩니다.

본 발명은, 제니핀과 아미노산의 반응으로부터 유래된 청색 안료 물질의 분자 구조에 대한 지식의 부재를 극복하는데 기여한다. 본원에서는, 실질적으로 정제된 착색제 화합물 (예를 들어, 중합체)을 포함하는 착색제 조성물, 및 착색제 화합물을 단리하는 방법, 및 단리된 착색제 화합물을 사용하는 방법이 제공된다.

특정 실시양태는 실질적으로 정제된 하기 화학식 1A 또는 화학식 1B의 화합물, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체, 그의 염 또는 그의 조합물에 관한 것이다.

<화학식 1A>

<화학식 1B>

특정 실시양태는 실질적으로 정제된 하기 화학식 2, 3A 또는 3B의 화합물, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체, 그의 염 또는 그의 조합물에 관한 것이다.

특정 실시양태는 하기 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염을 포함하며, 하기 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 추가 화합물을 실질적으로 함유하지 않는 착색제 조성물에 관한 것이다.

<화학식 4>

상기 식에서,

n은 2 내지 200의 정수이고;

각각의 A는 독립적으로 하기 화학식 5A, 화학식 5B, 화학식 5C, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체, 그의 염 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

<화학식 5A>

<화학식 5B>

<화학식 5C>

R¹은 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이고;

R² 및 R'²는 독립적으로 수소 또는 C_{1 -10} 알킬이고;

R³은 수소 또는 COOH이고;

T¹은 수소 또는 메틸 기이고; T²는 수소 또는 A-T¹이고, A 및 T¹은 상기에 정의되어 있다.

<화학식 6>

<화학식 7>

<화학식 8>

일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 하기 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염을 포함하며, 하기 화학식 2', 화학식 3'A, 화학식 3'B, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 추가 화합물을 실질적으로 함유하지 않는다.

<화학식 4>

상기 식에서,

n은 2 내지 20의 정수이고;

각각의 A는 독립적으로 하기 화학식 5'A, 화학식 5'B, 화학식 5'C, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체, 그의 염 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

<화학식 5'A>

<화학식 5'B>

<화학식 5'C>

R¹은 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이고;

T¹은 수소 또는 메틸 기이고; T²는 수소 또는 A-T¹이고, A 및 T¹은 상기에 정의되어 있다.

<화학식 2'>

<화학식 3'A>

<화학식 3'B>

일부 실시양태에서, R¹은 메틸이다. 일부 실시양태에서, 제1 추가 화합물의 총 중량은 중합체의 1 중량% 미만이다.

특정 실시양태는 실질적으로 정제된 하기 화학식 3'A (Me) 또는 화학식 3'B (Me)의 화합물, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체, 그의 염 또는 그의 조합물에 관한 것이다.

<화학식 3'A (Me)>

<화학식 3'B (Me)>

특정 실시양태는 실질적으로 정제된 하기 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염에 관한 것이다.

<화학식 4>

상기 식에서,

n은 2 내지 20의 정수이고;

각각의 A는 하기 화학식 5'A (Me), 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염이고;

<화학식 5'A (Me)>

T¹은 수소 또는 메틸 기이고; T²는 수소 또는 A-T¹이고, A 및 T¹은 상기에 정의되어 있다.

특정 실시양태는 제니핀과 글리신의 반응으로부터 유래된 정제된 착색제 화합물, 및 상기 착색제 화합물의 단리 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 착색제 화합물은 정제된 제니핀 (예를 들어, 80 중량%, 85 중량%, 90 중량%, 95 중량% 또는 99 중량% 초과)과 글리신의 반응으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 착색제 화합물은 글리신과 제니핀 함유 즙의 반응으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 착색제 화합물은 글리신과 제니파 아메리카나로부터 유래된 과즙의 반응으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 착색제 화합물은 정제된 글리신과 제니핀 (여기서, 제니핀은 정제된 제니핀 (예를 들어, 80 중량%, 85 중량%, 90 중량%, 95 중량% 또는 99 중량% 초과)임) 또는 제니핀 함유 즙의 반응으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 착색제 화합물은 제니핀과 글리신 함유 혼합물 (예를 들어, 글리신 함유 즙, 또는 글리신 함유 즙 농축물과 같은 글리신 함유 건조 혼합물)의 반응으로부터 유래되고, 여기서 제니핀은 정제된 제니핀 (예를 들어, 80 중량%, 85 중량%, 90 중량%, 95 중량% 또는 99 중량% 초과) 또는 제니핀 함유 즙이다. 일부 실시양태에서, 착색제 화합물은 글리신 함유 즙 (예를 들어, 수박, 백포도, 파인애플, 리치, 칸탈루프, 바나나, 오렌지, 사과, 배, 레몬, 패션 과일, 적포도, 블루베리, 타마린드, 복숭아, 파파야, 아사이, 자두, 구아바, 탄제린, 보로호, 쿠푸아수, 고지 또는 키위로부터 유래된 즙 등의 과즙)과 제니핀 함유 즙 (예를 들어, 제니파 아메리카나로부터 유래된 즙 등의 과즙)의 반응으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 착색제 화합물은 수박으로부터 유래된 즙과 제니파 아메리카나로부터 유래된 즙의 반응으로부터 유래된다.

특정 실시양태는, 제니핀과 글리신의 반응으로부터 유래된 청색 혼합물을 알콜성 용매로 추출하여 알콜-가용성 분획 및 알콜-불용성 분획을 생성하는 단계; 및 알콜-가용성 분획 및 알콜 불용성 분획을 정제하는 단계를 포함하는, 착색제 화합물을 단리하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 청색 혼합물은 제니핀과 글리신의 반응으로부터 유래된 건조 분말 (예를 들어, 동결건조된 분말)이다.

특정 실시양태는 정제된 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염을 포함하는 실질적으로 정제된 착색제 화합물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 정제된 착색제 화합물은 화학식 2, 3'A (Me) 또는 3'B (Me)의 이량체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 정제된 착색제 화합물, 예를 들어 중합체 (예를 들어, 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염)는, 탄수화물, 예를 들어 당을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 정제된 착색제 화합물은 중합체 (예를 들어, 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염)는 탄수화물을 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%, 또한 다른 불순물, 예를 들어 단량체, 이량체, 지방산, 지방, 단백질 및/또는 유기 산을 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 함유하지 않는다.

일부 실시양태에서, 기재에 청색을 부여하는 방법은, 기재를 본원에 기재된 착색제 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 기재는 식품, 약물 또는 건강기능식 제품, 화장 제품, 또는 의료 기기이다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 정제된 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 실질적으로 순수한 화학식 2, 3'A (Me) 또는 3'B (Me)의 이량체를 포함한다.

도 1a 내지 b는 화합물 번호 1의 두 이성질체 형태에 대한 화학식을 나타낸다.
도 2a 내지 b는 화합물 번호 1의 두 이성질체 형태에 대한 화학식의 또 다른 표시를 나타낸다.
도 3a 내지 b는 화합물 번호 3의 두 이성질체 형태에 대한 화학식을 나타낸다.
도 4a 내지 b는 화합물 번호 3의 두 이성질체 형태에 대한 화학식의 또 다른 표시를 나타낸다.
도 5는 제니핀과 글리신의 반응으로부터 단리된 화합물 1의 핵 자기 공명 (NMR) 분광 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 제니핀과 글리신의 반응으로부터 단리된 화합물 3의 NMR 분광 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 제니핀과 글리신의 반응으로부터 단리된 S31, S32, S33, 및 S34 분획 (S3 분획으로부터 유래됨)에 대한 NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 화학식 4를 갖는 중합체의 개략도이다.
도 9는 제니핀과 글리신의 반응으로부터 단리된 불용성 분획에 대한 NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 10은 제니핀과 글리신의 반응으로부터의 단리된 중합체의 ¹H-¹³C 고체 NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 11은 제니핀과 글리신의 반응으로부터의 단리된 중합체의 선택적 분자량 여과에 의해 얻어진 질량 프로파일을 나타낸다.
도 12는 제니핀과 글리신의 반응으로부터의 단리된 중합체의 IR 프로파일을 나타낸다.
도 13a 내지 d는 제니파 아메리카나 즙과 글리신의 반응으로부터의 청색 중합체를 함유하는 4종의 샘플 (A, B, C, 및 D)의 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 트레이스를 나타낸다. a) 핑크색 라인 240 nm, 낮은 흡광도를 갖는 청색 라인 590 nm; b) 240 및 590 nm에서의 거의 동일한 흡광도; c) 590 nm에서의 보다 큰 흡광도; 및 d) 캐리어를 갖는 원료 배치.
도 14a 내지 f는 각각 청색 중합체 기준 표준물 용액에 대한 보정 곡선 1 내지 6을 나타낸다.
도 15는 샘플 PF, FC 및 PC (PF, FC 및 PC의 정의에 대해서는 실시예 10 참조)의 HPLC 스펙트럼 및 UV 흡수를 나타낸다.
도 16은 샘플 PF, FC 및 PC의 색 파라미터를 나타낸다.
도 17은 XAD-7 수지로부터 용출된 중합체 분획 및 수성 분획의 HPLC 스펙트럼을 나타낸다.
도 18은 다양한 아미노산과 제니파 아메리카나 즙의 반응 생성물의 UV-vis 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 19a 내지 c는 아미노산에 따라 분류된, 다양한 아미노산과 제니파 아메리카나 즙의 반응 생성물의 HPLC 분석을 나타낸다. 도 19a 내지 c는, 각각의 아미노산에 대하여, 즉 (19A) 글리신, 리신 및 발린, (19B) 메티오닌 및 프롤린, 및 (19C) 티로신 및 트립토판에 대하여, 실시예 6의 방법을 이용한 아미노산과 제니파 아메리카나 즙의 반응 생성물의 HPLC 스펙트럼; 중합체가 확인된 HPLC 영역의 확대도; 및 선택된 신호의 UV-vis 스펙트럼을 나타낸다.
도 20은 254 nm에서의 UV 조사를 이용한 pH 3.0의 완충액 중에서의 제니파 아메리카나 즙과 다양한 아미노산의 반응 생성물의 안정성 (반감기로 나타냄)을 나타낸다.
도 21a는 제니파 아메리카나 생과(fresh fruit)의 중과피의 수성 추출물의 HPLC 스펙트럼을 나타내며, 이는 240 nm에서 최대 흡수 파장을 가지며, 제니핀의 체류 시간 (22 내지 23분) 근처의 19 내지 20분의 체류 시간을 갖는 피크를 갖는다.
도 21b는 도 21a에서와 동일한 연령을 갖지만, 추출 전에 3일 동안 실온에 둔 제니파 아메리카나 과실의 중과피 (껍질)의 수성 추출물의 HPLC 스펙트럼을 나타낸다. 스펙트럼은 19 내지 20분 및 22 내지 23분의 체류 시간을 갖는 피크를 갖는다.
도 22는 글리신과 제니파 아메리카나 과실 중과피 (껍질)의 수성 추출물로부터 얻어진 자주색 생성물의 ¹H NMR을 나타낸다.
도 23은 글리신과 제니파 아메리카나 과실 중과피 (껍질)의 예열된 수성 추출물을 반응시키는 방법으로부터 얻어진 청색 생성물의 ¹H NMR을 나타낸다.
도 24는 라벨링된 외과피 (외부 껍질), 내과피 (과육) 및 중과피 (껍질)를 갖는 제니파 아메리카나 (재구아(Jagua))의 덜 익은 과실을 나타낸다.
도 25a 내지 b는 제니핀 (25a) 및 중과피에서 발견된 전구체 (25b)의 CD₃OD 중에서의 (물 억제) ¹H NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 26a 내지 b는 물 중과피 추출물 (26a) 및 물 추출물의 에틸 아세테이트 용매 분배 (26b)의 HPLC 프로파일 (240 nm)을 나타낸다.
도 27은 수확 후 수 일 동안 실온에서 유지된 재구아 과실로부터의 물 추출물 중과피의 HPLC 프로파일 (240 nm)을 나타낸다.
도 28은, 알데히드 피크가 존재하는 것으로 예상되는 영역이 나타나도록 영역을 확장시킨, 중과피의 물 추출물에 대한 ¹H NMR 실험을 나타낸다.
도 29는 재구아 중과피에서 발견된 제니핀 전구체에 대한 ¹³C NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 30은 제니핀 (1) 및 제니포시드 (2)의 화학 구조를 나타낸다.
도 31은, Me - Gly: 제니파 아메리카나 즙과 글리신 및 메티오닌의 동시 반응; 1+2: 메티오닌과 제니파 아메리카나 즙, 그 후 글리신의 반응; 및 RN: 제니파 아메리카나 즙과 글리신 단독의 반응에 의해 얻어진 크로마토그램을 나타낸다.

정의

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "중합체"는 중합에 의해 형성되고, 반복 구조 단위를 주 성분으로 하는 화학적 화합물 또는 화합물의 혼합물을 의미한다.

본원에서 정제된 중합체는 특정 분자 구조 및 고정된 수의 반복 구조 단위를 갖는 정제된 단일 화학적 화합물로서 이해될 수 있다. 정제된 중합체는 또한 다양한 중합도를 갖는 (즉, 반복 구조 단위의 수가 상이할 수 있음) 중합 반응에서 형성된 중합체 화합물의 혼합물로서 이해될 수 있다.

반응식 1은 반응물 1 (예를 들어, 제니핀, R¹ = Me) 및 반응물 2 (예를 들어, 글리신, R³ = COOH, R² 및 R'²는 H임)의 예시적 중합 반응을 나타낸다. 이어서, 반응식 1에 기재된 반응으로부터의 정제된 중합체는, 특정 순도 (예를 들어, 75 중량%, 80 중량%, 85 중량%, 90 중량% 또는 95 중량% 초과의 중합체 함유)의 단일 중합체 분자 (화학식 4의 단일 중합체 분자는 화학식에서 T¹, T², A 및 n이 고정됨을 의미함)의 단리된 중합체 조성물일 수 있다. 반응식 1에 기재된 반응으로부터의 정제된 중합체는 또한, 동일한 반복 구조 단위를 공유하지만 다양한 중합도를 갖는 (예를 들어, 화학식 4에서, 중합체 화합물은 동일한 A 값을 갖지만 상이한 n 값을 가질 수 있음) 반응 혼합물 중에 형성된 특정 순도 (예를 들어, 75 중량%, 80 중량%, 85 중량%, 90 중량% 또는 95 중량% 초과의 중합체 함유)의 중합체 화합물의 혼합물의 단리된 중합체 조성물일 수 있다.

<반응식 1>

특정 실시양태에서, 본원에서 중합체는 분자식, 예를 들어 화학식 4, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염을 특징으로 한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "화학식 4의 중합체" 또는 화학식 4의 중합체들은 화학식 4에 따른 구조를 갖는 중합체(들), 또는 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염을 의미한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 중합체는 물리적 데이터 (예를 들어, 스펙트럼 데이터, 분자량 분포)에 의해 특징규명된다. 중합체의 특징규명 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 중합체는 분광분석적 방법 (예를 들어, IR, UV/vis, NMR, MS 등)에 의해 특징규명될 수 있고; 중합체의 분자량을 분석하여 수 평균 분자량 (M_n), 및/또는 중량 평균 분자량 (M_w)을 얻을 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 기하 이성질체는, 이중 결합(들)에서의 상이한 배위를 제외하고는 동일한 구조를 갖는 이성질체 (즉, E 또는 Z 이성질체, 또는 시스/트랜스 이성질체)를 의미한다. 예시적으로, 반응식 2는 두 기하 이성질체의 쌍의 일례를 나타내고, 여기서 두 이성질체간의 유일한 차이는 이중 결합에서의 배위이다.

<반응식 2>

본원에 사용된 바와 같이 용어 호변이성질체 또는 호변 이성질체는 호변이성질현상을 통해 상호 전환가능할 수 있는 화합물을 의미한다. 호변이성질현상은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 일반적으로 반응식 3A에 나타낸 바와 같은 반응을 지칭한다. 다수의 경우에, 반응에서 G 기는 수소이다.

<반응식 3A>

호변이성질체의 추가의 예를 반응식 3B에 나타내었다. 반응식 3B는 모든 가능한 호변이성질체 구조를 나타내는 것으로 이해되어선 안된다.

<반응식 3B>

반응식 2, 3A, 및 3B에서 사용된 화살표는 예시 목적을 위한 것이며, 이성질체 또는 호변이성질체 사이의 실제 평형으로서 해석되어선 안된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "염"은, 달리 특정되지 않는 한, 내부 염 또는 외부 염 둘 다를 포함하는 것으로 이해된다. 외부 염의 예는, 반대 이온으로서의 양이온, 예컨대 알칼리 금속 이온 (예를 들어, Na⁺, K⁺ 등), 알칼리 토금속 이온 (예를 들어, Mg^{2 +}, Ca^{2 +} 등), 암모늄 이온 (예를 들어, NH₄ ⁺, 또는 유기 암모늄 이온) 등을 갖는 염을 포함한다. 외부 염의 예는 또한, 반대 이온으로서의 음이온, 예컨대 무기 음이온 (예를 들어, Cl^-, SO₄ ^{2 -}, Br^-, HSO₄ ^- 등) 또는 유기 음이온 (예를 들어, 카르복실산 음이온, 예컨대 포르메이트, 아세테이트 등)을 갖는 염을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 화합물 번호 1, 2, 및 3은 실시예 부분에 기재된 바와 같은 제니핀과 글리신의 반응으로부터 단리된 화합물을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 이량체 또는 이량체 화합물은, 2종의 단량체를 주 성분으로 하는 화합물을 의미한다. 이량체의 예는 화합물 번호 1, 번호 2, 번호 3, 및 화학식 1A, 1B, 2, 3A, 3B, 2', 3'A, 3'B, 3'A (Me), 3'B (Me), 6, 7, 및 8의 화합물을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 화합물 (예를 들어, 제1 추가 화합물, 제2 추가 화합물 또는 그의 조합)을 "실질적으로 함유하지 않는"은, 화합물의 총 중량이 기준물 (예를 들어, 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염)의 5 중량% 미만임을 의미한다. 일부 실시양태에서, 화합물을 "실질적으로 함유하지 않는"은, 화합물의 총 중량이 기준물 (예를 들어, 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염)의 4.5 중량% 미만, 4 중량% 미만, 3 중량% 미만, 2 중량% 미만, 1 중량% 미만, 0.5 중량% 미만, 0.1 중량% 미만, 또는 0.01 중량% 미만임을 의미한다. 일부 실시양태에서, 화합물을 "실질적으로 함유하지 않는" 조성물 (예를 들어, 착색제 조성물)은 조성물이 화합물을 함유하지 않음을 의미한다. 일부 실시양태에서, 화합물을 "실질적으로 함유하지 않는"은, 화합물의 총 중량이 기준물 (예를 들어, 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염)의 0.01 내지 5 중량%, 0.01 내지 4.5 중량%, 0.01 내지 4 중량%, 0.01 내지 3 중량%, 0.01 내지 2 중량%, 0.01 내지 1 중량%, 0.01 내지 0.5 중량%, 또는 0.01 내지 0.1 중량%임을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 정제된" 또는 실질적으로 순수한 화합물 (예를 들어, 실질적으로 정제된 중합체, 실질적으로 정제된 이량체)은, 80% 초과 (예를 들어, 80 중량%, 85 중량%, 90 중량%, 95 중량% 또는 99 중량% 초과 (여기서, 중량은, 예를 들어 건조 중량, 즉, 용매 (예를 들어, 물, CH₃CN, MeOH, EtOH 등)와 같은 휘발성 성분을 계산하지 않은 중량))의 순도를 갖는 화합물을 의미한다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 순수한 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염은, 건조 중량 기준으로 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 초과의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염을 포함한다.

본원에 사용된 용어 정제된 제니핀은 80 중량%, 85 중량%, 90 중량%, 95 중량% 또는 99 중량% 초과의 제니핀을 포함하는 물질을 지칭한다. 유사하게, 본원에 사용된 용어 정제된 글리신은 80 중량%, 85 중량%, 90 중량%, 95 중량% 또는 99 중량% 초과의 글리신을 포함하는 물질을 지칭한다.

본 개시내용의 착색제의 순도는 공지된 분석 방법 (예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석)에 의해 측정될 수 있다. 따라서, 샘플에서 화합물 (예를 들어, 이량체, 중합체)의 정량화는, 예를 들어 실시예 부분에 기재된 방법과 유사한 HPLC 방법을 이용하여 달성될 수 있다.

이량체를 포함하는 착색제 조성물

본 발명은 제니파 아메리카나 제니핀과 글리신의 반응으로부터 유래된 착색제 화합물 및 그의 분자 구조식, 및 상기 착색제 화합물의 단리 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 화합물은 반응 생성 물질의 크로마토그래피에 의해 다중 분획화로부터 얻어진다. 일부 실시양태에서, 분자 구조식은 ¹H 핵 자기 공명 분광분석 (¹HNMR), J-모듈레이션 (JMOD), H-H 상관 분광분석 (COSY ¹H-¹H) 실험, 및 다른 분자 구조 분석 도구에 의해 측정된다.

일부 실시양태에서, 착색제 화합물은 하기 화학식 3A를 갖는다 (본 출원에서, 화학식 3A는 바람직한 이성질체 형태의 화합물 번호 3에 대한 것임).

<화학식 3A>

또 다른 실시양태에서, 착색제 화합물은 하기 화학식 3B의 이성질체 형태를 갖는다 (본 출원에서, 화학식 3B는 이성질체 형태의 화합물 번호 3에 대한 것임).

<화학식 3B>

특정 실시양태는,

A. 제니파 아메리카나 즙으로부터 제니핀을 단리하는 단계;

B. 글리신을 상기 제니핀과 반응시켜 메탄올 중에서 가용성인 물질을 얻는 단계;

C. 메탄올 중에서 가용성인 물질을 크로마토그래피에 의해 S1, S2, S3, 및 S4 분획으로 분리하는 단계; 및

D. S3 분획을 다시 크로마토그래피에 의해 S31, S32, S33 및 S34 분획으로 분리하고, 역상 크로마토그래피에 의해 S33 분획으로부터 화학식 I의 화합물을 단리하는 단계

를 포함하는, 하기 화학식 3A의 착색제 화합물을 단리하는 방법에 관한 것이다.

<화학식 3A>

덜 바람직한 실시양태는,

A. 제니파 아메리카나 즙으로부터 제니핀을 단리하는 단계;

B. 글리신을 상기 제니핀과 반응시켜 메탄올 중에서 가용성인 물질을 얻는 단계;

C. 메탄올 중에서 가용성인 물질을 크로마토그래피에 의해 S1, S2, S3, 및 S4 분획으로 분리하는 단계;

D. S3 분획을 다시 크로마토그래피에 의해 S31, S32, S33 및 S34 분획으로 분리하는 단계; 및

E. 역상 크로마토그래피에 의해 S33 분획으로부터 화학식 I의 화합물을 단리하는 단계

를 포함하는, 하기 화학식 3B의 이성질체 형태를 갖는 화합물을 단리하는 방법에 관한 것이다.

<화학식 3B>

도 3a 및 4a는 화합물 번호 3의 바람직한 이성질체 형태에 대한 화학식의 표시를 나타낸다. 화합물 번호 3은 매우 어두운 청색 착색제 물질이다. 도 3b 및 4b는 화합물 번호 3의 덜 바람직한 이성질체 형태를 나타낸다. 도 6은 화합물 번호 3의 핵 자기 공명 (NMR) 분광분석 프로파일을 나타낸다. 화합물 번호 3의 NMR 분광분석 프로파일의 분석에서는 하기와 같이 나타난다:

화합물 번호 3의 추가의 분석에서는 하기와 같이 나타났다:

질량 분광측정법에서 화합물 3의 질량 스펙트럼은 m/z= 505 [M+H]⁺을 나타내었고, 따라서 이전에 기재된 화합물의 이성질체를 나타낸다. 그러나, ¹H 및 ¹³CNM 스펙트럼은 그것과 매우 상이하였다. 양성자 스펙트럼에서, 하기 단일선이 검출되었다: δ 8.0, δ 7.9, 및 δ 6.7 (각각 2H), 또한 1H에 대해 적분되는 δ 8.6에서의 1개의 추가의 단일선. 다른 신호는 δ 4.7 (N-CH₂)에서의 단일선 및 δ 3.9 (OCH₃)에서의 2개의 메틸 기 및 δ 1.8 (CH₃ 비닐)이었다. JMOD 실험에 따라, 하기 탄소 원자가 또한 관찰되었다: δ 172.2에서의 카르복실 기, δ 166.3에서의 메틸에스테르, (COOH), δ 138.8, δ 135.1, δ 127.1, δ 120.4, δ 118.9에서의 5개의 4급 탄소 원자, δ 135.6, δ 133.3, δ 131.4, δ 131.4에서의 4개의 메틴, δ 61.0에서의 1개의 메틸렌 (N-CH₂) 및 δ 53.3 (OCH₃) 및 δ 11.2 (CH₃ 비닐)에서의 2개의 메틸 기. 각각의 단량체 단위의 구조가 HMBC 실험에 따라 지정되었다: δ61.0에서의 N-메틸렌 기에 대한 긴 범위 상관관계가 검출되었고; 추가로 최종 양성자는 δ172.2에서 메틸 에스테르 카르보닐에 대한 ³J 커플링을 나타내었기 때문에, δ7.9 및 δ8.0에서의 신호는 피리딜 기의 양성자로 지정되었음. 또한 다른 중요한 커플링이 메틸 기의 양성자와 δ 131.4 (C-7)에서의 단일선 사이에서 나타났다. 소량의 방향족 및 비닐 양성자는, 도 3a 내지 3b에 나타낸 바와 같은 대칭적 이량체 분자의 존재를 나타내었다. 메틸에스테르 기의 상대적 배향에 따라 2개의 구조가 이 분자에 지정될 수 있으나 (도 3a 내지 3b), 구조 b는 입체 장애로 인해 낮은 확률을 갖는다.

또 다른 실시양태에서, 착색제 화합물 번호 3을 단리하는 방법은,

A. 제니파 아메리카나 즙으로부터 제니핀을 단리하는 단계;

B. 글리신을 상기 제니핀과 반응시켜 메탄올 중에서 가용성인 물질을 얻는 단계;

C. 메탄올 중에서 가용성인 물질을 크로마토그래피에 의해 S1, S2, S3, 및 S4 분획으로 분리하는 단계; 및

D. S3 분획을 다시 크로마토그래피에 의해 S31, S32, S33 및 S34 분획으로 분리하고 (도 7), 역상 크로마토그래피에 의해 S33 분획으로부터 화학식 I의 화합물을 단리하는 단계를 포함한다.

본 출원에서, 용어 S1, S2, S3, S4, 및 S31, S32, S33 및 S34는 기재된 방법 단계로부터 유래된 분획을 정의하는 방식이다. 그러나, 이들 용어 (S1, S2, S3, S4, 및 S31, S32, S33 및 S34)는 유사한 크로마토그래피 단계에 의해 얻어지고 제니핀과 글리신의 반응으로부터 유래될 수 있는 임의의 분획을 커버하며, 여기서 S3 유사 분획 및 S3 유래된 분획 (도 7에 나타낸 바와 같은 유사 NMR 분광분석의 분획)이 생성된다. 도 7은 S3 분획 유래된 S31, S32, S33 및 S34 분획의 NMR 분광분석을 나타낸다.

일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 제니핀과 글리신의 반응으로부터 단리된 실질적으로 순수한 화학식 1A, 1B, 2, 3'A (Me), 및 3'B (Me)의 화합물을 포함한다.

일부 실시양태에서, 착색제 화합물 번호 3을 단리하는 방법은,

A. 제니파 아메리카나 즙으로부터 제니핀을 단리하는 단계;

B. 글리신을 상기 제니핀과 반응시켜 메탄올 중에서 가용성인 물질을 얻는 단계;

C. 메탄올 중에서 가용성인 물질을 크로마토그래피에 의해 S1, S2, S3, 및 S4 분획으로 분리하는 단계; 및

D. S3 분획을 다시 크로마토그래피에 의해 S31, S32, S33 및 S34 분획으로 분리하고 (도 7), 역상 크로마토그래피에 의해 S33 분획으로부터 화합물 3을 단리하는 단계를 포함한다.

본 출원의 목적상, 용어 S1, S2, S3, S4, 및 S31, S32, S33, S34, 및 M2S1R, M2S2R, M2S3R, M2S4R, 및 i1 및 i2는 기재된 방법 단계로부터 유래된 분획을 정의하는 방식이다. 그러나, 이들 용어 (S1, S2, S3, S4, 및 S31, S32, S33 및 S34)는, 제니핀과 글리신의 반응으로부터 유래될 수 있는, 유사한 크로마토그래피 단계에 의해 얻어진 임의의 분획을 커버하고, 여기서는 S3 유사 분획 및 S3 유래된 분획 (도 7에 나타낸 바와 같은 유사 NMR 분광분석의 분획)이 생성된다. 도 7은 S3 분획 유래된 S31, S32, S33 및 S34 분획의 NMR 분광분석을 나타낸다.

특정 실시양태는 실질적으로 정제된 하기 화학식 3'A (Me) 또는 화학식 3'B (Me)의 화합물, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체, 그의 염 또는 그의 조합물에 관한 것이다.

<화학식 3'A (Me)>

<화학식 3'B (Me)>

특정 실시양태는 실질적으로 정제된 하기 화학식 1A 또는 화학식 1B의 화합물, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체, 그의 염 또는 그의 조합물에 관한 것이다.

<화학식 1A>

<화학식 1B>

중합체를 포함하는 조성물

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 정제된 중합체, 예를 들어 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염은 단일 또는 주요 착색제로서 그 자체로 또는 또 다른 착색제 (예를 들어, 화학식 1A, 1B, 2, 3A, 3B, 2', 3'A, 3'B, 3'A (Me), 3'B (Me) 또는 그의 임의의 조합의 이량체)와 조합되어 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 정제된 중합체, 예를 들어 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염은, 중합체를 희석제 (예를 들어, 물)와 혼합하여 희석할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 정제된 중합체, 예를 들어 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염은, 중합체 및 희석제를 포함하는 조성물로부터 희석제 (예를 들어, 용매, 예컨대 메탄올, 물 등)를 제거함으로써 농축될 수 있다.

일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 하기 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염을 포함하며, 하기 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 추가 화합물을 실질적으로 함유하지 않는다.

<화학식 4>

상기 식에서,

n은 2 내지 200의 정수이고;

각각의 A는 독립적으로 하기 화학식 5A, 화학식 5B, 화학식 5C, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체, 그의 염 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

<화학식 5A>

<화학식 5B>

<화학식 5C>

R¹은 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이고;

R² 및 R'²는 독립적으로 수소 또는 C_{1 -10} 알킬이고;

R³은 수소 또는 COOH이고;

T¹은 수소 또는 메틸 기이고; T²는 수소 또는 A-T¹이고, A 및 T¹은 상기에 정의되어 있다.

<화학식 6>

<화학식 7>

<화학식 8>

일부 실시양태에서, R³은 H이다. 일부 실시양태에서, R³은 COOH이다.

일부 실시양태에서, R² 및 R'² 중 하나는 수소이다. 일부 실시양태에서, R² 및 R'²는 둘 다 수소이다. 일부 실시양태에서, R² 및 R'² 중 하나는 수소이고; R² 및 R'² 중 다른 하나는 비치환된 C_1-10 직쇄형 알킬 쇄 (예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실 등), 또는 이소프로필, 이소부틸, 이소펜틸 등과 같은, 1 내지 3개의 메틸 기로 치환된 C_1-10 직쇄형 알킬 쇄이다.

일부 실시양태에서,

는 아미노산 잔기 (R³은 COOH이고, R² 및/또는 R'²는 측쇄(들)을 나타냄)를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 아미노산 잔기는 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 시스테인, 트레오닌, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 아스파르테이트, 글루타메이트, 아스파라긴, 타우린, 카르니틴, 오르니틴, 시트룰린 또는 글루타민의 잔기이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 잔기는 글리신 잔기이다.

일부 실시양태에서, R¹은 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸일 수 있고, 예를 들어 R¹은 수소, 메틸 또는 에틸일 수 있거나; 또는 R¹은 메틸일 수 있다.

일부 실시양태에서, T¹은 수소 또는 메틸일 수 있다.

일부 실시양태에서, n은 2 내지 200, 2 내지 150, 2 내지 100, 2 내지 50, 2 내지 25, 2 내지 20, 2 내지 15, 2 내지 10, 또는 2 내지 5이다.

일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 하기 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염을 포함하며, 하기 화학식 2', 화학식 3'A, 화학식 3'B, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 추가 화합물을 실질적으로 함유하지 않는다.

<화학식 4>

상기 식에서,

n은 2 내지 20의 정수이고;

각각의 A는 독립적으로 하기 화학식 5'A, 화학식 5'B, 화학식 5'C, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체, 그의 염 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

<화학식 5'A>

<화학식 5'B>

<화학식 5'C>

R¹은 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이고;

T¹은 수소 또는 메틸 기이고; T²는 수소 또는 A-T¹이고, A 및 T¹은 상기에 정의되어 있다.

<화학식 2'>

<화학식 3'A>

<화학식 3'B>

일부 실시양태에서, R¹은 메틸이다.

일부 실시양태에서, 적합한 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염은, 다양한 반복 단위 (즉, 화학식 4에서 상이한 "A"), 다양한 말단 기 (예를 들어, 상이한 T¹, T² 또는 이들 둘 다), 및/또는 다양한 쇄 길이를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 적합한 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염은, 특징적 UV-Vis 흡수 스펙트럼 (예를 들어, 최대 흡수 파장 (λ_max), NMR 스펙트럼, IR 스펙트럼, 평균 분자량 (예를 들어, 수 평균 분자량 (M_n)) 또는 그의 조합을 갖는 것들을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 적합한 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염은, 특정 레벨의 순도를 갖는 것들을 포함한다.

중합체 구조

일부 실시양태에서, 화학식 4의 중합체에서 각각의 A는 독립적으로 화학식 5'A, 화학식 5'B, 화학식 5'C, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염이다. 일부 실시양태에서, 화학식 4의 중합체에서 각각의 A는 화학식 5'A, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염이다. 일부 실시양태에서, 화학식 4의 중합체에서 각각의 A는 화학식 5'B, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염이다. 일부 실시양태에서, 화학식 4의 중합체에서 각각의 A는 화학식 5'C, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염이다. 다른 실시양태에서, 화학식 4의 중합체는 화학식 5'A 및 화학식 5'B 둘 다, 화학식 5'A 및 화학식 5'C 둘 다, 화학식 5'B 및 화학식 5'C 둘 다, 또는 화학식 5'A, 화학식 5'B 및 화학식 5'C를 포함하는 반복 단위를 포함할 수 있다.

다양한 R¹ 기 (예를 들어, 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸)를 갖는 화학식 4의 중합체가 청색 착색제 화합물로서 유용하다. 일부 실시양태에서, R¹은 수소, 메틸 또는 에틸일 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학식 4의 중합체에서 각각의 A는 화학식 5'A, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염이고, 화학식 5'A에서 R¹은 수소이다. 일부 실시양태에서, 화학식 4의 중합체에서 각각의 A는 화학식 5'A, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염이고, 화학식 5'A에서 R¹은 메틸이다. 일부 실시양태에서, 화학식 4의 중합체에서 각각의 A는 화학식 5'A, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염이고, 화학식 5'A에서 R¹은 에틸이다. 일부 실시양태에서, 화학식 4의 중합체에서 각각의 A는 화학식 5'B, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염이고, 화학식 5'B에서 R¹은 수소이다. 일부 실시양태에서, 화학식 4의 중합체에서 각각의 A는 화학식 5'B, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염이고, 화학식 5'B에서 R¹은 메틸이다. 일부 실시양태에서, 화학식 4의 중합체에서 각각의 A는 화학식 5'B, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염이고, 화학식 5'B에서 R¹은 에틸이다. 일부 실시양태에서, 화학식 4의 중합체에서 각각의 A는 화학식 5'C, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염이고, 화학식 5'C에서 R¹은 수소이다. 일부 실시양태에서, 화학식 4의 중합체에서 각각의 A는 화학식 5'C, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염이고, 화학식 5'C에서 R¹은 메틸이다. 일부 실시양태에서, 화학식 4의 중합체에서 각각의 A는 화학식 5'C, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염이고, 화학식 5'C에서 R¹은 에틸이다.

본 개시내용은 또한, 상이한 말단 기를 갖는 화학식 4의 중합체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 적합한 말단 기는 반응식 1에 나타낸 반응에 따라 형성되는 것들 중 임의의 것이다. 일부 실시양태에서, T¹은 수소 또는 메틸 기이고; T²는 수소 또는 A-T¹이고, 여기서 A 및 T¹은 본원에 정의되어 있다.

일부 실시양태에서는, 다양한 중합도를 갖는, 정제된 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염이 본 개시내용에 개시된 다양한 용도에 적합하다. 일부 실시양태에서, 화학식 4에서 n은 2 내지 20, 2 내지 18, 2 내지 16, 2 내지 14, 2 내지 12, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 4, 4 내지 20, 4 내지 18, 4 내지 16, 4 내지 14, 4 내지 12, 4 내지 10, 4 내지 8, 4 내지 6, 6 내지 20, 6 내지 18, 6 내지 16, 6 내지 14, 6 내지 12, 6 내지 10, 6 내지 8, 8 내지 20, 8 내지 18, 8 내지 16, 8 내지 14, 8 내지 12, 8 내지 10, 10 내지 20, 10 내지 18, 10 내지 16, 10 내지 14, 또는 10 내지 12의 정수이다. 일부 실시양태에서, 정제된 중합체가 정제된 화학식 4의 단일 화학적 화합물인 경우, 화학식 4에서 n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다.

중합체의 특징

특정 실시양태에서는, 특정 특징을 갖는 중합체, 예를 들어 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염이 착색제 조성물에서의 사용에 적합하다.

일부 실시양태에서, 중합체는 UV-Vis 스펙트럼에서 약 580 내지 약 610 nm 범위의 최대 흡수 파장 (λ_max)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 약 580, 약 585, 약 590, 약 595, 약 600, 약 605 또는 약 610 nm의 최대 흡수 파장 (λ_max)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 약 580 nm 미만 (예를 들어, 약 570, 약 560 nm 등)의 최대 흡수 파장 (λ_max)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 약 610 nm 초과 (예를 들어, 약 620, 약 630 nm 등)의 최대 흡수 파장 (λ_max)을 갖는다.

일부 실시양태에서, 중합체는, 예를 들어 실시예 6에 기재된 방법에 의해 분석시, 약 10.3분의 HPLC 체류 시간을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 240 nm에서의 흡수에 비해 590 nm에서 보다 강한 흡수를 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 도 13c의 스펙트럼과 실질적으로 동일한 HPLC 트레이스를 갖는 것을 특징으로 한다.

특정 실시양태에서는, 상이한 평균 분자량을 갖는 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염이 착색제 조성물에서의 사용에 적합하다. 일부 실시양태에서, 중합체는 약 1000 내지 약 20,000 범위의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 약 3000 내지 약 15,000, 또는 약 3000 내지 약 10,000 범위의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 약 4,500 내지 약 7,500 범위의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 약 5000, 약 5500, 약 6000, 약 6500 또는 약 7000의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 약 6000의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 평균 분자량은 수 평균 분자량 (M_n)이다. 일부 실시양태에서, 평균 분자량은 중량 평균 분자량 (M_w)이다. 일부 실시양태에서, 평균 분자량은 관련 기술분야에 공지된 임의의 평균 분자량, 예컨대 점도 평균 분자량 (M_v), Z 평균 분자량 (M_z) 등이다. 평균 분자량 (예를 들어, M_n, M_w, M_v 또는 M_z)의 측정 및/또는 계산 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.

특정 실시양태에서는, 특정된 IR 흡수를 갖는 중합체가 착색제 조성물에서의 사용에 적합하다. 일부 실시양태에서, 중합체는 하기 피크 (± 5 cm^-1): 3393, 2949, 1726, 1630 및 1540 cm^{- 1}를 갖는 IR 스펙트럼을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 도 12에 나타낸 스펙트럼과 실질적으로 동일한 IR 스펙트럼을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 하기 피크 (± 5 cm^-1): 3393, 2949, 1726, 1630 및 1540 cm^{- 1}를 갖는 IR 스펙트럼 또는 도 12에 나타낸 스펙트럼과 실질적으로 동일한 IR 스펙트럼을 갖는 것을 특징으로 한다.

¹H NMR은 중합체를 특징규명하는 또 다른 분광학적 방법이다. 일부 실시양태에서, 중합체는 도 9에 나타낸 바와 같은 ¹H NMR을 갖는다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 중합체의 ¹H NMR이 도 9에서의 스펙트럼과 실질적으로 동일한 것인 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 도 9에서의 스펙트럼과 실질적으로 동일한 ¹H NMR 및/또는 도 12에서의 스펙트럼과 실질적으로 동일한 IR 스펙트럼을 갖는다.

질량 분광측정법은 중합체를 특징규명하는 또 다른 방법이다. 일부 실시양태에서는, 701 및/또는 475의 m/e를 갖는 MS 단편을 갖는 중합체가 청색 착색제 조성물에 사용된다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 701 또는 475의 MS 단편 (m/e)을 갖는 것을 특징으로 하는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 701 및 405의 MS 단편 (m/e)을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, MS 단편 (m/e) 701 및 405는 각각 하기 화학식 9에서 좌측 및 우측에 상응한다.

<화학식 9>

일부 실시양태에서, 중합체는 701 및 405의 MS 단편 (m/e)을 가지며, 또한 도 9에서의 스펙트럼과 비교시 실질적으로 동일한 ¹H NMR을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 추가로 도 12에서의 스펙트럼과 실질적으로 동일한 IR 스펙트럼을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 도 11에 나타낸 것들과 실질적으로 동일한 질량 프로파일을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 화학식 6, 7 또는 8의 제1 추가 화합물을 실질적으로 함유하지 않는다.

중합체의 순도

특정 실시양태에서, 적합한 중합체는, 예를 들어 특정 레벨의 순도를 갖는 본원에 기재된 것들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 화학식 4의 중합체를 포함하며, 여기서 착색제 조성물은 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 추가 화합물을 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 화학식 2', 화학식 3'A, 화학식 3'B, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 추가 화합물을 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 하기 화학식 2, 화학식 3'A (Me), 화학식 3'B (Me), 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 추가 화합물을 실질적으로 함유하지 않는다.

<화학식 2>

<화학식 3'A (Me)>

<화학식 3'B (Me)>

일부 실시양태에서, 제1 추가 화합물의 총 중량은 중합체의 4.5 중량% 미만, 4 중량% 미만, 3 중량% 미만, 2 중량% 미만, 1 중량% 미만, 0.5 중량% 미만, 0.1 중량% 미만 또는 0.01 중량% 미만이다. 일부 실시양태에서, 제1 추가 화합물의 총 중량은 중합체의 1 중량% 미만이다. 일부 실시양태에서, 제1 추가 화합물의 총 중량은 중합체의 0.1 중량% 미만이다. 다른 실시양태에서, 제1 추가 화합물의 총 중량은 중합체의 0.01 중량% 미만이다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 제1 추가 화합물을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제1 추가 화합물의 총 중량은 중합체의 0.01 내지 5 중량%, 0.01 내지 4.5 중량%, 0.01 내지 4 중량%, 0.01 내지 3 중량%, 0.01 내지 2 중량%, 0.01 내지 1 중량%, 0.01 내지 0.5 중량%, 또는 0.01 내지 0.1 중량%이다.

일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 화학식 4의 중합체를 포함하며, 여기서 착색제 조성물은 하기 화학식 1A, 화학식 1B, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 추가 화합물을 실질적으로 함유하지 않는다.

<화학식 1A>

<화학식 1B>

일부 실시양태에서, 제2 추가 화합물의 총 중량은 중합체의 1 중량% 미만이다. 일부 실시양태에서, 제2 추가 화합물의 총 중량은 중합체의 0.1 중량% 미만이다. 다른 실시양태에서, 제2 추가 화합물의 총 중량은 중합체의 0.01 중량% 미만이다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 제2 추가 화합물을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제2 추가 화합물의 총 중량은 중합체의 0.01 내지 5 중량%, 0.01 내지 4.5 중량%, 0.01 내지 4 중량%, 0.01 내지 3 중량%, 0.01 내지 2 중량%, 0.01 내지 1 중량%, 0.01 내지 0.5 중량%, 또는 0.01 내지 0.1 중량%이다.

일부 실시양태에서, 제1 추가 화합물을 실질적으로 함유하지 않는 착색제 조성물은 또한 제2 추가 화합물을 실질적으로 함유하지 않는다. 중합체의 중량에 대한 제1 또는 제2 추가 화합물의 적합한 중량 백분율은 본원에 기재되었다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 추가 화합물의 합쳐진 중량은 중합체의 5 중량% 미만 (예를 들어, 4.5 중량% 미만, 4 중량% 미만, 3 중량% 미만, 2 중량% 미만, 1 중량% 미만, 0.5 중량% 미만, 0.1 중량% 미만, 0.01 중량% 미만)이다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 제1 및 제2 추가 화합물을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 추가 화합물의 총 중량은 중합체의 0.01 내지 5 중량%, 0.01 내지 4.5 중량%, 0.01 내지 4 중량%, 0.01 내지 3 중량%, 0.01 내지 2 중량%, 0.01 내지 1 중량%, 0.01 내지 0.5 중량%, 또는 0.01 내지 0.1 중량%이다.

일부 실시양태에서, 착색제 조성물은, 580 내지 610 nm 범위의 최대 흡수 파장 (λ_max)을 갖는, 중합체 이외의 화합물을 실질적으로 함유하지 않는 화학식 4의 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 580 내지 610 nm 범위의 최대 흡수 파장 (λ_max)을 갖는, 중합체 이외의 화합물의 총 중량은, 중합체의 5 중량% 미만 (예를 들어, 4.5 중량% 미만, 4 중량% 미만, 3 중량% 미만, 2 중량% 미만, 1 중량% 미만, 0.5 중량% 미만, 0.1 중량% 미만, 0.01 중량% 미만)이다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 580 내지 610 nm 범위의 최대 흡수 파장 (λ_max)을 갖는, 중합체 이외의 화합물을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 580 내지 610 nm 범위의 최대 흡수 파장 (λ_max)을 갖는, 중합체 이외의 화합물의 총 중량은, 중합체의 0.01 내지 5 중량%, 0.01 내지 4.5 중량%, 0.01 내지 4 중량%, 0.01 내지 3 중량%, 0.01 내지 2 중량%, 0.01 내지 1 중량%, 0.01 내지 0.5 중량%, 또는 0.01 내지 0.1 중량%이다.

특정 실시양태는 실질적으로 정제된 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 실질적으로 정제된 중합체는 하기 화학식 4, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염을 포함한다.

<화학식 4>

상기 식에서,

n은 2 내지 20의 정수이고;

각각의 A는 하기 화학식 5'A (Me), 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염이고;

<화학식 5'A (Me)>

T¹은 수소 또는 메틸 기이고; T²는 수소 또는 A-T¹이고, A 및 T¹은 상기에 정의되어 있다.

일부 실시양태에서, 실질적으로 정제된 중합체는 본원에 기재된 평균 분자량을 갖는 (예를 들어, 약 6,000의 수 평균 분자량 (M_n)을 갖는) 것을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 정제된 중합체는 본원에 기재된 IR 스펙트럼 (예를 들어, 하기 피크 (± 5 cm^-1): 3393, 2949, 1726, 1630 및 1540 cm^-1을 갖는 IR 스펙트럼)을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 화학식 4의 중합체를 포함하며, 여기서 착색제 조성물은 탄수화물, 예를 들어 당을 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 탄수화물을 함유하지 않으며, 다른 불순물, 예를 들어 단량체, 이량체, 지방산, 지방, 단백질 또는 유기 산을 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 함유하지 않는다.

정제된 중합체를 제조하는 방법

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 중합체는, 반응식 1에 개시된 바와 같이 제니핀 유도체 (예를 들어, 제니핀)를 아민 (예를 들어, 글리신)과 반응시킴으로써 제조된다. 일부 실시양태에서, 정제된 중합체는 반응식 1에 개시된 바와 같이 제니핀 유도체 (예를 들어, 제니핀) 및 아민 (예를 들어, 글리신)으로부터의 반응 혼합물을 정제함으로써 얻어진다.

일부 실시양태에서, 중합체는 제니핀을 아민과 반응시킴으로써 제조된다. 일부 실시양태에서, 중합체는 제니핀을 1급 알킬 아민 (예를 들어, 메틸 아민, 에틸 아민, 프로필 아민 또는 다른 C_{1 -10} 1급 아민)과 반응시킴으로써 제조된다. 일부 실시양태에서, 중합체는 제니핀을 2급 알킬 아민 (예를 들어, 이소프로필 아민 또는 다른 C_{1 -10} 2급 아민)과 반응시킴으로써 제조된다. 일부 실시양태에서, 중합체는 제니핀을 아미노산 (예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 리신, 티로신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌 등)과 반응시킴으로써 제조된다. 일부 실시양태에서, 중합체는 제니핀을 글리신과 반응시킴으로써 제조된다.

일부 실시양태에서, 제니핀은 정제된 제니핀 또는 제니핀 함유 즙이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 중합체는 정제된 제니핀 (예를 들어, 80 중량%, 85 중량%, 90 중량%, 95 중량% 또는 99 중량% 초과)과 글리신의 반응에 의해 형성된 생성물이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 중합체는 글리신과 제니핀 함유 즙의 반응으로부터 얻어진 정제된 생성물이다. 일부 실시양태에서, 제니핀 함유 즙은 과즙이다. 일부 실시양태에서, 과즙은 제니파 아메리카나로부터 유래된다.

일부 실시양태에서, 글리신은 정제된 글리신이다. 일부 실시양태에서, 글리신은 글리신 함유 혼합물 (예를 들어, 글리신 함유 즙, 또는 글리신 함유 즙 농축물과 같은 글리신 함유 건조 혼합물)이다. 일부 실시양태에서, 글리신은 글리신 함유 즙 (예를 들어, 수박, 백포도, 파인애플, 리치, 칸탈루프, 바나나, 오렌지, 사과, 배, 레몬, 패션 과일, 적포도, 블루베리, 타마린드, 복숭아, 파파야, 아사이, 자두, 구아바, 탄제린, 보로호, 쿠푸아수, 고지 또는 키위로부터 유래된 즙 등의 과즙)이다. 일부 실시양태에서, 글리신은 글리신 함유 즙이며, 여기서 즙은 수박으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 글리신은 글리신 함유 즙이며, 여기서 즙은 수박 생과로부터 유래된다.

일부 실시양태에서, 중합체는 수박으로부터 유래된 즙과 제니핀의 반응으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 중합체는 수박으로부터 유래된 즙과 제니파 아메리카나로부터 유래된 즙의 반응으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 중합체는 수박으로부터 유래된 즙과 정제된 제니핀 (예를 들어, 80 중량%, 85 중량%, 90 중량%, 95 중량% 또는 99 중량% 초과)의 반응으로부터 유래된다.

특정 실시양태는 제니핀과 아민의 반응 혼합물로부터 중합체를 단리하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 (a) 제니핀과 아민의 반응으로부터 유래된 청색 혼합물을 용매 (예를 들어, 메탄올)로 추출하여 가용성 분획 및 불용성 분획을 생성하는 단계; 및 (b) 불용성 분획을 정제하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 정제 단계 (b)는 불용성 분획을 HPLC 정제에 적용하는 것을 포함한다.

특정 실시양태는 제니핀과 글리신의 반응 혼합물로부터 중합체를 단리하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 (a) 제니핀과 글리신의 반응으로부터 유래된 청색 혼합물을 메탄올로 추출하여 메탄올-가용성 분획 및 메탄올-불용성 분획을 생성하는 단계; (b) 메탄올-불용성 분획을 정제하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 청색 혼합물은 정제된 제니핀 (예를 들어, 80 중량%, 85 중량%, 90 중량%, 95 중량% 또는 99 중량% 초과)과 글리신의 반응으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 청색 혼합물은 글리신과 제니파 아메리카나로부터 유래된 즙의 반응으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 청색 혼합물은 제니핀과 글리신의 반응으로부터 유래된 건조 분말 (예를 들어, 동결건조된 분말)이다. 일부 실시양태에서, 정제 단계는 불용성 분획을 HPLC 정제에 적용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, HPLC 정제는 역상 HPLC 정제이다. 일부 실시양태에서, 정제 단계 (b)는 실시예 부분에 개시된 정제 단계와 유사하다. 일부 실시양태에서, 정제 방법은 본원에 기재된 바와 같은 정제된 중합체를 제공한다.

일부 실시양태에서, 착색제 생성물은 본원에 기재된 방법에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 착색제 생성물은 (a) 제니핀과 글리신의 반응으로부터 유래된 청색 혼합물을 메탄올로 추출하여 메탄올-가용성 분획 및 메탄올-불용성 분획을 생성하는 단계; 및 (b) 메탄올-불용성 분획을 정제하여 착색제 생성물을 얻는 단계에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 청색 혼합물은 제니핀과 글리신의 반응으로부터 유래된 건조 분말 (예를 들어, 동결건조된 분말)이다. 일부 실시양태에서, 착색제 생성물은 본원에 개시된 임의의 화학식 6, 7 또는 8의 임의의 화합물을 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 착색제 생성물은 (a) 도 9에 나타낸 것과 실질적으로 동일한 NMR 스펙트럼; (b) 하기 피크 (± 5 cm^-1): 3393, 2949, 1726, 1630 및 1540 cm^-1을 갖는 IR 스펙트럼; (c) 약 6,000의 평균 분자량 (예를 들어, 수 평균 분자량 (M_n)); (d) 701 및/또는 475의 MS 단편을 나타내는 MS 스펙트럼; 또는 (e) (a) 내지 (d)의 임의의 조합을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

탄수화물을 실질적으로 함유하지 않는 착색제 조성물

특정 실시양태는, 탄수화물 (예를 들어, 모노사카라이드, 디사카라이드, 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드)을 실질적으로 함유하지 않는 정제된 중합체 (예를 들어, 화학식 4의 중합체)를 포함하는 착색제 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 탄수화물은 당 (예를 들어, 모노사카라이드 및 디사카라이드)이다. 일부 실시양태에서, 탄수화물을 실질적으로 함유하지 않는 착색제 조성물은 또한, 다른 불순물 (예를 들어, 화학식 1A, 1B, 2, 3A 또는 3B의 이량체)을 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 탄수화물을 함유하지 않고, 예를 들어 착색제 조성물은, 예를 들어 실시예 7에 기재된 방법에 의해, 검출될 수 있는 탄수화물을 함유하지 않는다. 용어 "탄수화물" 및 "당"은 달리 구별되지 않는 한 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.

일부 실시양태에서, 탄수화물을 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는 착색제 조성물은 정제된 중합체 이외의 추가의 물질, 예를 들어 단량체, 이량체, 지방산, 지방, 단백질 또는 유기 산을 갖는 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 탄수화물을 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는 착색제 조성물은 추가 화합물 (예를 들어, 화학식 1A, 1B, 2, 3A 또는 3B의 이량체, 추가의 착색제 (예를 들어, FDA 승인된 색 첨가제))을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 탄수화물을 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는 착색제 조성물은 또한, 예를 들어 단량체, 이량체 (예를 들어, 화학식 1A, 1B, 2, 3A 또는 3B의 이량체), 추가의 착색제 (예를 들어, FDA 승인된 색 첨가제), 지방산, 지방, 단백질 또는 유기 산을 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 탄수화물을 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는 착색제 조성물은, 탄수화물을 실질적으로 함유하지 않는 정제된 중합체와, 탄수화물을 실질적으로 함유하지 않는 추가 화합물 (예를 들어, 화학식 1A, 1B, 2, 3A 또는 3B의 이량체, 추가의 착색제 (예를 들어, FDA 승인된 색 첨가제))를 혼합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.

일부 실시양태에서, 정제된 중합체는 제니핀과 글리신의 반응으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 정제된 중합체는 정제된 제니핀 (예를 들어, 80 중량%, 85 중량%, 90 중량%, 95 중량% 또는 99 중량% 초과)과 글리신의 반응으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 정제된 제니핀은 제니파 아메리카나로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 정제된 중합체는 제니핀 함유 즙과 글리신의 반응으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 정제된 중합체는 과즙 (예를 들어, 제니파 아메리카나로부터 유래된 즙, 제니파 아메리카나로부터 유래된 제니핀 풍부 즙)과 글리신의 반응으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 정제된 중합체는 제니핀과 글리신 함유 즙 (예를 들어, 과즙, 예컨대 수박 즙 및 본원에 기재된 바와 같은 다른 것들)의 반응으로부터 유래된다.

일부 실시양태에서, 정제된 중합체는, 예를 들어 실시예 6에 기재된 방법에 의해 분석시, 약 10.3분의 HPLC 체류 시간을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 정제된 중합체는 240 nm에서의 흡수에 비해 590 nm에서 보다 강한 흡수를 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 정제된 중합체는 도 13c의 스펙트럼과 실질적으로 동일한 HPLC 트레이스를 갖는 것을 특징으로 한다.

특정 실시양태는 탄수화물을 실질적으로 함유하지 않는 착색제 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은, 조 착색제 조성물을 칼럼 크로마토그래피 (예를 들어, 크기 배제 칼럼 크로마토그래피, 역상 HPLC 등)로 정제하는 단계; 분획을 탄수화물 존재에 대하여 분석하는 단계 (예를 들어, 박층 크로마토그래피에 의해); 탄수화물을 실질적으로 함유하지 않는 분획을 수집하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조 착색제 조성물은 제니핀 (예를 들어, 정제된 제니핀, 제니파 아메리카나로부터 유래된 즙, 제니핀 풍부 즙, 제니핀 풍부 제니파 아메리카나로부터 유래된 제니핀 풍부 즙)과 글리신의 반응으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 방법은 도 13a, 13b 또는 13c의 스펙트럼과 실질적으로 동일한 HPLC 트레이스를 갖는 착색제 조성물을 생성한다. 일부 실시양태에서, 방법은 도 13c의 스펙트럼과 실질적으로 동일한 HPLC 트레이스를 갖는 착색제 조성물을 생성한다.

특정 실시양태는 당을 함유하지 않는 착색제 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 방법은 (a) 제니파 아메리카나 즙과, 글리신, 발린, 리신, 메티오닌, 프롤린, 티로신, 트립토판 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 혼합하는 단계; (b) (a)의 혼합물로부터 당을 제거하는 단계; 및 (c) (b)의 당-무함유 생성물로부터 착색제 조성물을 단리하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 방법에 의해 얻어진 착색제 조성물의 색 강도는 당을 제거하지 않고 단계 (a)의 혼합물로부터 얻어진 착색제 조성물의 색 강도보다 더 크며, 예를 들어 2배 이상이다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물의 색 강도는 특정 파장에서 (예를 들어, 착색제 조성물의 λ_max에서, 580 내지 610 nm 범위의 파장에서, 590 nm의 파장에서 등)의 UV-vis 흡광도에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 중합체 함량은 백분율 % (g/100 g 샘플)이고, 이는 HPLC 측정에 의해 측정되고, 색 강도는 분광광도계를 사용하여 측정된다 (예를 들어, 0.6 흡광도 값). 일부 실시양태에서, 방법은 당을 (예를 들어, 제니파 아메리카나 즙과 아미노산 (예를 들어, 글리신, 발린, 리신, 메티오닌, 프롤린, 티로신, 트립토판 또는 그의 임의의 조합)의 반응 혼합물로부터) 발효, 칼럼 크로마토그래피 (예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피, HPLC), 역 삼투 여과, 한외여과, 마이크로여과, 투석 (예를 들어, 삼투 구배를 이용한 투석 방법), 수지 매개 분리 (예를 들어, XAD4, XAD7 또는 XAD8 수지 매개 분리) 또는 그의 임의의 조합에 의해 제거하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 발효 생성물의 미생물학적 안정성은, 예를 들어 용이하게 중온 미생물제, 예컨대 진균 및 이스트를 생성할 수 있는 당 내용물을 제거함으로써 개선된다.

일부 실시양태에서, 방법은 발효에 의해 당을 제거하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 발효는, 이스트 (예를 들어, 천연 이스트, 유전자 변형된 이스트, 예컨대 당 분해에 있어 증가된 효율을 갖는 것들) 또는 박테리아 (당 분해에 있어 증가된 효율을 갖는 유전자 변형된 박테리아 포함)에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 이스트 또는 박테리아는 고정화되어 있다 (예를 들어, 고체 지지체에 결합됨; 마이크로 캡슐로 캡슐화됨).

일부 실시양태에서, 착색제 조성물을 제조하는 방법은 (a) 제니파 아메리카나 즙과, 글리신, 발린, 리신, 메티오닌, 프롤린, 티로신, 트립토판 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 혼합하는 단계; (b) 단계 (a)의 혼합물을 멸균시키는 단계; (c) 단계 (b)의 멸균된 혼합물을 이스트 또는 박테리아로 접종시키는 단계; (d) 단계 (c)의 접종된 혼합물을 발효 조건 하에 인큐베이션시켜 발효 생성물을 생성하는 단계; 및 (e) 단계 (d)의 발효 생성물로부터 착색제 조성물을 단리하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 방법에 의해 얻어진 착색제 조성물의 색 강도는 발효 없이 단계 (a)의 혼합물로부터 얻어진 착색제 조성물의 색 강도보다 더 크며, 예를 들어 2배 이상이다.

일부 실시양태에서, 단계 (d)의 인큐베이션은 6시간 이상 (예를 들어, 6 내지 24, 6 내지 18, 6 내지 12, 6 내지 9, 9 내지 24, 9 내지 18, 9 내지 12, 12 내지 24, 12 내지 18시간, 또는 24시간 초과)이다. 일부 실시양태에서, 단계 (d)의 인큐베이션은 6시간 미만 (예를 들어, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5시간)이다. 특정 실시양태는 외부 기준물로서 순수 형태의 중합체를 사용하여 HPLC 방법을 사용하는 것을 포함하는 샘플 중의 중합체의 정량화 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 중합체는 제니핀과 글리신의 반응으로부터 유래된 청색 중합체이다. 일부 실시양태에서, 외부 기준물로서의 순수 형태의 중합체는 탄수화물을 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 외부 기준물로서의 순수 형태의 중합체는 도 13c의 스펙트럼과 실질적으로 동일한 HPLC 트레이스를 갖는 것을 특징으로 한다.

착색제 조성물을 제조하는 방법

특정 실시양태는 착색제 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물을 제조하는 방법은 (a) 제니파 아메리카나 과실로부터 즙을 단리하는 단계; (b) 즙과, 글리신 (GLY), 발린 (VAL), 리신 (LYS), 프롤린 (PRO), 메티오닌 (MET), 티로신 (TYR), 및 트립토판 (TRP)으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 아미노산 및 글리신 (GLY), 발린 (VAL), 리신 (LYS), 프롤린 (PRO), 메티오닌 (MET), 티로신 (TYR), 및 트립토판 (TRP)으로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 아미노산을 혼합하는 단계; 및 (c) (b) 후에, 착색제 조성물을 단리하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태는 제니파 아메리카나 과실로부터 즙을 아미노산 조합, 예를 들어 글리신 및 메티오닌과 반응시킴으로써 형성된 생성물을 포함하는 착색제 조성물에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 생과는 수확 1 또는 2일 내에 (예를 들어, 약 0 내지 6, 0 내지 12, 0 내지 18, 0 내지 24, 0 내지 36, 또는 0 내지 48시간 내에) 사용된다. 다른 실시양태에서는, 과실을 냉장 조건 하에 저장 후에 사용하고, 1.5주 내에 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12일 내에) 또는 2주 내에 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일 내에) 사용한다. 또 다른 실시양태에서, 과실은 익지 않은 것이고, 예를 들어 부드럽고 불규칙한 외피를 갖는 익은 과실과 달리 딱딱하고 균일한 외피를 갖는 과실이다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 청색, 청록색, 녹색, 자주색, 적색 또는 흑색이다.

일부 실시양태에서, 착색제 조성물을 제조하는 방법은 (a) 제니핀 또는 제니핀 유도체를, 글리신 (GLY), 발린 (VAL), 리신 (LYS), 프롤린 (PRO), 메티오닌 (MET), 티로신 (TYR) 또는 트립토판 (TRP)으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 아미노산 및 글리신 (GLY), 발린 (VAL), 리신 (LYS), 프롤린 (PRO), 메티오닌 (MET), 티로신 (TYR) 또는 트립토판 (TRP)으로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 아미노산과 혼합하고, 이로부터 형성된 착색제 조성물을 단리하는 것을 포함한다. 특정 실시양태는 제니핀 또는 제니핀 유도체를 아미노산 조합, 예를 들어 글리신 및 메티오닌과 반응시킴으로써 형성된 생성물을 포함하는 착색제 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 청색, 청록색, 녹색, 자주색, 적색 또는 흑색이다.

자주색 착색제 조성물

제니파 아메리카나의 덜 익은 과실은 제니핀의 공급원이며, 이는 아민과 반응하여 청색 착색된 생성물을 생성하는 이리도이드 대사물이다. 제니파 아메리카나 과실 (재구아)에서, 제니핀은 내과피 (과육)에서 발견되며, 과실의 나머지는 폐기된다. 재구아 중과피 (껍질) 물질은 그의 낮은 제니핀 함량으로 인해 폐기된다.

특정 실시양태는 자주색 착색제 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 자주색 착색제 조성물을 제조하는 방법은 (a) 제니파 아메리카나 과실로부터 중과피를 단리하는 단계; (b) 중과피로부터 즙 추출물을 제조하는 단계; (c) 즙 추출물과 글리신을 혼합하는 단계; (d) (c) 후에, 즙과 글리신의 혼합물을 가열하는 단계; 및 (e) (d) 후에, 자주색 착색제 조성물을 단리하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (d)에서 90분 이상 (예를 들어, 90분 내지 약 3, 4, 5 또는 6시간, 또는 6시간 초과) 동안 가열한다. 본원에 사용된 바와 같이, "중과피"는 과실, 예를 들어 제니파 아메리카나 과실의 껍질을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 생과는 수확 1 또는 2일 내에 (예를 들어, 약 0 내지 6, 0 내지 12, 0 내지 18, 0 내지 24, 0 내지 36, 또는 0 내지 48시간 내에) 사용된다. 다른 실시양태에서는, 과실을 냉장 조건 하에 저장 후에 사용하고, 1.5주 내에 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12일 내에) 또는 2주 내에 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일 내에) 사용한다. 또 다른 실시양태에서, 과실은 익지 않은 것이고, 예를 들어 부드럽고 불규칙한 외피를 갖는 익은 과실과 달리 딱딱하고 균일한 외피를 갖는 과실이다.

특정 실시양태는 제니핀 유도체를 함유하는 수성 추출물을 아민 (예를 들어, 아미노산, 예컨대 글리신, 발린, 프롤린, 리신, 트립토판, 티로신 또는 메티오닌)과 반응시킴으로써 형성된 생성물을 포함하는 착색제 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 제니핀 유도체를 함유하는 수성 추출물은, (a) 제니파 아메리카나 과실로부터 중과피를 단리하는 단계; 및 (b) 중과피를 물로 추출하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 제니파 아메리카나 과실로부터의 중과피의 수성 추출에 의해 형성된 생성물 및 글리신을 포함하는 자주색 착색제 조성물이다. 일부 실시양태에서, 수성 추출물은 AUC (HPLC 스펙트럼에서 곡선 하 면적)에 의해 20%, 15%, 10%, 5%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 미만의 제니핀을 갖는다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 글리신이다. 일부 실시양태에서, 생성물은 제니파 아메리카나 과실로부터의 중과피의 수성 추출물을 글리신과 혼합하고, 이어서 혼합물을 가열함으로써 형성되고, 여기서 수성 추출물은 예열되지 않는다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 (+)-제니포시드를 포함하는 제니핀 전구체 또는 제니핀의 이로도이드 B-글리코시드 전구체 (이는 제니파 아메리카나 과실로부터의 중과피 (껍질)로부터 유래됨)를 포함한다.

제니포시드는 제니핀의 글리코시드이다. 제니포시드는 제니핀과 상이한 동력학 및 화학적 특성을 갖는다. 글루코스는 제니포시드 구조의 일부이다.

글루코스는 유리 글루코스로서 과육 (내과피) 내의 제니파 아메리카나 즙 중에 존재한다. 그러나, 제니핀은 내과피에서 발견되며, 이는 글리신과 반응시 청색 착색제를 생성한다. 글리신과 중과피로부터의 제니포시드의 반응은 자주색 착색제를 생성하였다.

특정 실시양태는 (a) 제니파 아메리카나 과실로부터 중과피를 단리하는 단계; (b) 중과피로부터 제니포시드를 단리하는 단계; (c) 제니포시드와, 글리신 (GLY), 발린 (VAL), 리신 (LYS), 프롤린 (PRO), 메티오닌 (MET), 티로신 (TYR), 트립토판 (TRP) 또는 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 혼합하는 단계; 및 (d) (c) 후에, 착색제 조성물을 단리하는 단계를 포함하는, 착색제 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 제니포시드는 냉동 건조 또는 순간 냉동에 의해 안정화된다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 자주색이다.

녹색 및 흑색 착색제 조성물

특정 실시양태는 녹색 또는 흑색 착색제 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 제니파 아메리카나 즙과 다양한 아미노산의 반응은 다양한 색의 생성물, 예를 들어 청색 (GLY 및 LYS), 청록색 (VAL, MET 및 TYR), 녹색 (TRP) 및 흑색 (PRO)을 생성하였다. 일부 실시양태는 (a) 제니파 아메리카나 과실로부터 즙 추출물을 제조하는 단계; (c) 즙 추출물과 프롤린을 혼합하는 단계; 및 (e) (c)로부터 흑색 착색제 조성물을 단리하는 단계를 포함하는, 흑색 착색제 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태는 (a) 제니파 아메리카나 과실로부터 즙 추출물을 제조하는 단계; (c) 즙 추출물과 트립토판을 혼합하는 단계; 및 (e) (c)로부터 녹색 착색제 조성물을 단리하는 단계를 포함하는, 녹색 착색제 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

중합체 및/또는 이량체를 포함하는 착색제 조성물의 용도

특정 실시양태는, 기재 (예를 들어, 식품, 화장품, 약물 또는 건강기능식 제품, 직물 제품, 또는 의료 기기 등의 기기)에 청색을 부여하기 위한, 정제된 중합체 (예를 들어, 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염, 또는 탄수화물을 실질적으로 함유하지 않는 중합체 (예를 들어, 제니핀과 글리신의 반응으로부터 유래된 중합체)) 또는 정제된 이량체 (예를 들어, 실질적으로 순수한 화합물 번호 1, 2, 3, 또는 실질적으로 순수한 화학식 1A, 1B, 2, 3'A (Me), 3'B (Me)의 화합물 또는 그의 조합)의 용도에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 기재 (예를 들어, 식품, 화장품, 약물 또는 건강기능식 제품, 직물 제품, 또는 의료 기기 등의 기기)에 청색을 부여하는 방법은, 기재를 정제된 중합체 (예를 들어, 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염, 또는 탄수화물을 실질적으로 함유하지 않는 중합체 (예를 들어, 제니핀과 글리신의 반응으로부터 유래된 중합체)) 또는 정제된 이량체 (예를 들어, 실질적으로 순수한 화합물 번호 1, 2, 3, 또는 실질적으로 순수한 화학식 1A, 1B, 2, 3'A (Me), 3'B (Me)의 화합물)를 포함하는 착색제 조성물, 본원에 기재된 착색제 조성물 또는 그의 임의의 조합과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은 이량체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이량체는 실질적으로 정제된 화학식 1A, 1B, 2, 3'A (Me), 또는 3'B (Me)의 화합물이다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은, 화학식 1A, 1B, 2, 3'A (Me), 또는 3'B (Me)의 화합물을 본원에 개시된 임의의 중합체와 혼합하는 방법에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 착색제 조성물은, 본원에 개시된 중합체 또는 이량체를 색 첨가제 (예를 들어 FDA 승인된 색 첨가제)와 혼합함으로써 제조된다. 일부 실시양태에서, 기재는 식품이다. 일부 실시양태에서, 기재는 의료 기기이다. 일부 실시양태에서, 기재는 약물 제품이다. 일부 실시양태에서, 기재는 건강기능식 제품이다. 일부 실시양태에서, 기재는 화장 제품이다.

특정 실시양태는 식품 및 본원에 개시된 착색제 조성물 (예를 들어, 본원에 개시된 정제된 중합체를 포함하는 착색제 조성물, 또는 본원에 개시된 정제된 이량체를 포함하는 착색제 조성물)을 포함하는 식제품에 관한 것이다. 식품은 고체 식품 또는 액체 식품일 수 있다. 일부 실시양태에서, 식품은 유제품, 제과 제품, 청량 음료, 과자류 (예를 들어, 캔디, 또는 시리얼 바 등), 또는 음료이다. 일부 실시양태에서, 식품은 음료이다. 일부 실시양태에서, 식품은 탄산 음료이다. 일부 실시양태에서, 식품은 인간 소비용이다. 일부 실시양태에서, 식품은 가축 사료품, 예컨대 애완 동물 사료품 (예를 들어, 고양이 사료, 개 사료 등) 또는 농경 가축 사료품 (예를 들어, 소 사료)이다. 일부 실시양태에서, 식품은 식물 영양제 품목, 예컨대 비료이다. 일부 실시양태에서, 식품은 단위 투여 식품, 예컨대 단위 투여 요구르트, 푸딩, 수프 등이다.

특정 실시양태는 약물 (예를 들어 FDA 승인된 약물) 및 본원에 개시된 착색제 조성물 (예를 들어, 본원에 개시된 정제된 중합체를 포함하는 착색제 조성물, 또는 본원에 개시된 정제된 이량체를 포함하는 착색제 조성물)을 포함하는 약물 제품에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 약물은 액체 투여 형태로 존재한다. 일부 실시양태에서, 약물은 고체 투여 형태로 존재한다. 일부 실시양태에서, 약물은 정제, 젤라틴 캡슐, 비드, 펠릿, 환제, 당의정, 로젠지, 연고, 캡슐, 분말, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 형태로 존재한다. 일부 실시양태에서, 약물은 시럽 형태로 존재한다.

특정 실시양태는 건강기능식품 및 본원에 개시된 착색제 조성물 (예를 들어, 본원에 개시된 정제된 중합체를 포함하는 착색제 조성물, 또는 본원에 개시된 정제된 이량체를 포함하는 착색제 조성물)을 포함하는 건강기능식 제품 (예를 들어 비타민, 비타민 보충제, 또는 식이요법 믹스 및 패킷)에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 건강기능식품은 액체 투여 형태로 존재한다. 일부 실시양태에서, 건강기능식품은 고체 투여 형태로 존재한다. 일부 실시양태에서, 건강기능식품은 정제, 젤라틴 캡슐, 비드, 펠릿, 환제, 당의정, 로젠지, 연고, 캡슐, 분말, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 형태로 존재한다. 일부 실시양태에서, 건강기능식품은 정제, 또는 젤라틴 캡슐 형태로 존재한다.

특정 실시양태는 화장품 및 본원에 개시된 착색제 조성물 (예를 들어, 본원에 개시된 정제된 중합체를 포함하는 착색제 조성물, 또는 본원에 개시된 정제된 이량체를 포함하는 착색제 조성물)을 포함하는 화장 제품에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 화장품은 바쓰 제품, 예컨대 샤워 겔, 바쓰 겔, 또는 비누이다. 일부 실시양태에서, 화장품은 아이 및 페이스 메이크업, 매니큐어, 립스틱, 또는 문신용 제품일 수 있다. 일부 실시양태에서, 화장품은 구강 관리용 제품 (예를 들어, 구강 청결제, 치아 겔, 또는 치약)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 화장품은 피부 관리용 제품 (예를 들어, 스킨 컨디셔너, 겔 (예를 들어, 핸드 겔), 로션 및 크림, 또는 마스크)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 화장품은 면도용 제품 (예를 들어, 면도 크림)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 화장품은 모발 관리용 제품 (예를 들어, 헤어 컬러링 제품)일 수 있다.

특정 실시양태는 본원에 개시된 착색제 조성물 (예를 들어, 본원에 개시된 정제된 중합체를 포함하는 착색제 조성물, 또는 본원에 개시된 정제된 이량체를 포함하는 착색제 조성물)에 의해 착색된 의료 기기에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 의료 기기는 외과용 기기 (예를 들어, 외과용 실, 외과용 가위, 글러브 등)이다.

특정 실시양태는 본원에 개시된 착색제 조성물에 의해 착색된 직물 제품에 관한 것이다.

특정 실시양태에서, 식제품, 화장 제품, 약물 제품, 의료 기기, 또는 직물 제품 내로 혼입되는 착색제 조성물의 양은 달성하고자 하는 최종 색에 따라 달라진다. 일부 실시양태에서, 식제품, 화장 제품, 약물 제품, 의료 기기 또는 직물 제품은, 라이트 블루 (밝은 청색), 에어 포스 블루(Air Force blue), 에어 수피어리오리티 블루(air superiority blue), 앨리스 블루(Alice blue), 아주레(azure), 베이비 블루, 블루 드 프랑스(Bley de France), 블루 (청색), 블루-그레이, 본디 블루(Bondi blue), 브랜다이스 블루(Brandeis blue), 캠브리지 블루(Cambridge blue), 캐롤라이나 블루(Carolina blue), 셀레스테(celeste), 세룰리안(cerulean), 코발트 블루(Cobalt blue), 콜롬비아 블루(Columbia blue), 콘플라워 블루, 시안(Cyan), 다크 블루, 딥 스카이 블루, 데님, 다저 블루(Dodger blue), 듀크 블루(Duke blue), 이집티안 블루(Egyptian blue), 일렉트릭 블루, 에톤 블루(Eton blue), 글라우코우스 블루(Glaucous blue), 일렉트릭 인디고, 인디고, 인터내셔널 클라인 블루(international Klein blue), 아이리스, 라이트 블루, 마조렐 블루, 마야 블루, 미디엄 블루, 미드나잇 블루, 네이비 블루, 논-포토 블루, 옥스포드 블루(Oxford blue), 팔라티네이트 블루(Palatinate blue), 페리윙클(Periwinkle), 페르시안 블루(Persian blue), 프탈로 블루(Phthalo blue), 파우더 블루(Powder blue), 프러시안 블루(Prussian blue), 로얄 블루(Royal blue), 사파이어 스카이 블루(Sapphire Sky blue), 스틸 블루(Steel blue), 틸(Teal), 티파니 블루(Tiffany Blue), 트루 블루(True Blue), 터프츠 블루(Tufts Blue), 터워이즈(Turquoise), UCLA 블루(UCLA Blue), 울트라마린(Ultramarine), 바이올렛-블루(Violet-Blue), 예일 블루(Yale Blue) 및 자프레(Zaffre)로 이루어진 군으로부터 선택된 색을 식제품, 화장 제품, 약물 제품 또는 의료 기기에 부여하기 위해, 본원에 개시된 착색제 조성물을 그 자체로 또는 또 다른 착색제와 함께 유효량으로 포함한다. 착색제 조성물의 유효성은, 달성하고자 하는 색 (예를 들어, 밝은 청색)과 일정량의 착색제 조성물로 착색된 생성물 또는 기기를 비교 (예를 들어, 시각적 비교에 의해)함으로써 정해질 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태를 기재하였지만, 청구범위에 포함된 개념 및 기본 원리에서 벗어나지 않으면서 부분들의 형태 및 배치에 있어 추가의 변화가 이루어질 수 있다.

실시예

실시예 1. 제니파 아메리카나 즙으로부터의 제니핀 단리

10 리터의 제니파 아메리카나 녹색 즙으로부터의 동결건조된 (냉동 건조된) 고체 (900 그램)를 디클로로메탄으로 속슬렛(Soxhlet) 추출하고; 생성된 용매를 감압 하에 증발시켜 갈색 잔류물 (240 g)을 얻고; 1 g의 분취량을, 이동 상으로서 헥산/메탄올/디클로로메탄 (2:2:1)의 혼합물을 사용하여 크기에 의한 배제 크로마토그래피에 의해 분리하여, 이로부터 4개의 생성 분획이 생성되었고; 미세 층 크로마토그래피를 사용하고 이전에 공지된 제니핀 패턴과 비교함으로써 분획들 중 하나에서 제니핀을 확인하였다. NMR 스펙트럼에 따라 순수 생성물 (200 mg의 제니핀)이 얻어질 때까지, 제니핀을 함유하는 분획을 크로마토그래피 실리카 겔 칼럼 및 헥산/에틸 아세테이트 이동 상으로 다수 회 정제하였다.

실시예 2. 제니핀과 글리신의 반응

물 (200 mL) 중에 용해된 글리신 (2 g)을 70°로 가열하였다. 이어서, 메탄올 (10 mL) 중의 제니핀 (5 g)을 첨가하고, 혼합물을 4시간 동안 혼합하였다. 반응 혼합물을 동결건조 (냉동 건조)시키고, 청색 분말을 에틸-아세테이트로 추출하여, 과량의 제니핀 및 다른 저 극성 성분을 제거하였다.

실시예 3. 성분들의 분획화

청색 분말 (5.7 g)을 메탄올 (5x100 mL)로 추출하고, 생성된 용매를 감압 하에 증발시키고, 청색 수지 (2.2 g)를 얻었다. 메탄올 90% 중에 용해된 청색 수지를 세파덱스(Sephadex) ® LH 20 (메탄올 이동 상)에서 분리하여 4개의 분획을 얻었고, 이를 (본 특허 출원의 목적상) S1 (1.5 g), S2 (0.3 g), S3 (100 mg) 및 S4 (5 mg)로 명명하였다.

S1 분획을, 초기 15% 에탄올 및 최종 순수 물을 사용하여 흡착 수지 (앰벌라이트(Amberlite) ® XAD-7)를 사용하여 분리하였다. 3개의 분획을 동일한 IR 및 NMR 스펙트럼으로 분리하였다. 3개의 분획을 합쳤고, 이는 중합체로 정해졌다.

S2 분획을, 초기 15% 에탄올 및 최종 95% 에탄올을 사용하여 흡착 수지 (앰벌라이트 ® XAD-7)를 사용하여 분리하였다. S2로부터 4개의 하위-분획이 생성되었다. 이들 S2 하위-분획을 (본 특허 출원의 목적상) M2S1R, M2S2R, M2S3R 및 M2S4R로 명명하였다. M2S1R을, 2종의 화합물 (이들 2종의 화합물 중 하나를 화합물 번호 1 (7 mg)로 명명함)이 얻어질 때까지, 상이한 이동 상 (에탄올-물 및 메탄올-물의 혼합물)으로 수 회 RP-C18 분리하였다. 화합물 번호 1의 분광학적 특징은 하기와 같다 (도 5):

화합물 번호 1의 추가의 분석에서는 하기와 같이 나타났다:

¹H NMR에서 몇몇 신호가 나타난다: δ 8.77 및 8.53에서 단일선으로서 2개의 방향족 양성자, 7.54에서 비닐 양성자, 4.95에서 단일선, (2H) 및 각각 3.94 (OCH₃), 2.25 (비닐 메틸 기), 및 1.66에서 3H에 대해 적분되는 3개의 단일선.

JMOD 실험에서는 하기 신호가 나타났다: 14.93, 17.43 및 53.89에서 3개의 메틸 기, 62.68에서 1개의 메틸렌 (글리신으로부터 유래된 메틸렌으로 지정가능), 157.44, 146.41, 137.83에서 3개의 메틴, 및 마지막으로, 170.00 (카르복실), 164.16 (메틸 에스테르 카르보닐), 157.80, 148.29, 139.76, 124.16 및 53.89에서 7개의 4급 탄소 원자. 따라서, 제니핀 모이어티 및 글리신 잔기는 보존되었으나, NMR 스펙트럼에서 양성자 및 탄소 원자의 위치로 인해, 분자는 이제 피리딜 잔기를 갖는 방향족이다. 그러나, 새로운 메틸 기가 구조에서 나타났고, 그의 위치는 JMOD, HMQC, 및 HMBC 실험에 기초하여 지정가능하였다. 따라서, COSY 1H-1H에서는 7.54에서의 비닐 양성자와 2.25에서의 메틸 기 사이에 알릴 연결성이 나타났고, HMBC 실험에서 이 양성자는 이들 메틸 (13C NMR에서 157.44) 및 14.93에서의 지방족 메틸 기 (¹H NMR에서 1.66)에 대한 3J 커플링을 나타내었고, 이는 결국 53.89에서의 4급 탄소 원자 및 157.80 및 148.29에서의 방향족에 대한 상관관계를 확립한다. 검출된 다른 긴 범위 연결성은, 8.77 및 8.53에서의 양쪽 방향족 양성자에 대한 N-CH2 (62.68)였고, 전자는 메틸에스테르 카르보닐에 대한 것이다. 마지막으로, MS는, 도 1a 내지 1b 및 2a 내지 2b에서 볼 수 있는 바와 같이, 대칭적 이량체 분자를 나타내는 m/z 522 [M⁺+H]를 나타내었다. 단량체간의 연결 가교는, HMBC 실험에서 다른 메틸 기에 상호 커플링된, 단일선으로서의 메틸 기의 발현 때문에, C-8 및 C-8' 탄소 원자를 통해 추론되었다. 화학식 1A 또는 1B를 갖는 이성질체와 같은 2개의 가능한 이성질체가 존재한다 (도 1a, 1b, 2a 및 2b 참조).

S3 분획을, 95% 메탄올 이동 상을 사용하여 세파덱스 ®로 크로마토그래피에 의해 분리하여 4개의 S3 분획을 생성하였고, 이는 본 특허 출원의 목적상 S31, S32, S33, 및 S34로 명명되었다. S33 분획을, 화합물 번호 3으로 명명된 화합물 (4 mg)이 얻어질 때까지 상이한 이동 상 (에탄올-물 및 메탄올-물의 혼합물)을 사용하여 RP-C18 역상 크로마토그래피에 의해 수 회 분리하였다. 화합물 번호 3의 분광학적 특징은 하기와 같다 (도 6):

화합물 번호 3의 추가의 분석에서는 하기와 같이 나타났다:

질량 분광측정법에서 화합물 3의 질량 스펙트럼은 m/z=505 [M+H]⁺를 나타내었고, 따라서 이는 이전에 기재된 화합물의 이성질체를 나타낸다. 그러나, ¹H 및 ¹³CNM 스펙트럼은 그것과 매우 상이하였다. 양성자 스펙트럼에서, 하기 단일선이 검출되었다: δ 8.0, δ 7.9, 및 δ 6,7 (각각 2H) 및 1H에 대해 적분되는 δ 8.6에서의 1개의 추가 단일선. 다른 신호는 δ 4.7 (N-CH2)에서의 단일선 및 δ 3.9 (OCH₃)에서의 2개의 메틸 기 및 δ 1.8 (CH₃ 비닐)이었다. JMOD 실험에 따라, 하기 탄소 원자가 또한 나타났다: δ 172.2에서의 카르복실 기, δ 166.3에서의 메틸 에스테르, (COOH), δ 138.8, δ 135.1, δ 127.1, δ 120.4, δ 118.9에서의 5개의 4급 탄소 원자, δ 135.6, δ 133.3, δ 131.4, δ 131.4에서의 4개의 메틴, δ 61.0에서의 1개의 메틸렌 (N-CH₂) 및 δ 53.3 (OCH₃) 및 δ 11.2 (CH₃ 비닐)에서의 2개의 메틸 기. 각각의 단량체 단위의 구조는 HMBC 실험에 따라 지정되었다: δ61.0에서의 N-메틸렌 기에 대한 긴 범위 상관관계가 검출되었고; 추가로 최종 양성자는 δ172.2에서 메틸 에스테르 카르보닐에 대한 ³J 커플링을 나타내었기 때문에, δ7.9 및 δ8.0에서의 신호는 피리딜 기의 양성자로 지정되었음. 또한 다른 중요한 커플링이 메틸 기의 양성자와 δ131.4 (C-7)에서의 단일선 사이에 나타났다. 소량의 방향족 및 비닐 양성자는, 도 3a 내지 3b에 나타낸 바와 같은 대칭적 이량체 분자의 존재를 나타내었다. 메틸에스테르 기의 상대적 배향에 따라 2개의 구조가 이 분자에 지정될 수 있으나 (도 3a 내지 3b), 구조 b는 입체 장애로 인해 낮은 확률을 갖는다.

실시예 4. 메탄올 불용성 분획의 정제

불용성 메탄올 성분을 MeOH-물로 용출시키며 세파덱스 LH-20을 사용하여 분리하고, 하위-분획 i1 (3.1 g) 및 i2 (100 mg)를 수집하였다. 하위분획 i2를 MeOH/물로 용출시키며 반복된 RP-C18 칼럼을 사용하여 분리하여, 순수 화합물 번호 2 (25 mg)를 얻었다. 화합물 2는 화학식 2의 구조를 갖는 것으로 나타났다.

하위-분획 i1을 RP-C18 칼럼을 사용하여 2개의 주요 분획으로 분리하였다. 그러나, 2개의 분획은 동일한 IR 및 NMR 스펙트럼을 갖고, 이를 합쳐 정제된 중합체를 얻었다. 정제된 중합체의 개략적 구조를 도 8에 나타내었다.

정제된 중합체의 NMR, IR 및 질량 분광 분석에서는 하기와 같이 나타났다:

IR 스펙트럼 (도 12)은 카르복실산 (3393 cm^-1), 지방족 CH (2949), 에스테르 (1726) 및 방향족 피리디늄 시스템 (1630, 1540)으로 지정가능한 밴드를 나타내었다.

작은 청색 분자, 구체적으로 이전에 단리 및 확인된 이량체, 및 제니핀의 ¹H 및 ¹³C NMR 핑거프린트를 구성하였다. ¹H NMR (도 9)에서는 하기 신호가 나타났다: δ 9.50 (이중 결합 브릿지 양성자), δ 8.00 내지 9.00 (방향족 피리딘 유도체 또는 공액 이중 결합), δ 5.0 내지 7.0 (시클로펜탄 고리 내의 이중 결합), δ 5.0 내지 4.5 (4급 질소에 결합된 CH₂), δ 3.8 내지 4.1 (OCH₃), δ 1.5 - 2.3 (CH₃). ¹³C NMR은, δ 160 내지 175 (카르복실 및 에스테르 기), δ 150.0 내지 120.0 (방향족 및/또는 이중 결합), δ 60.0 내지 62.0 (4급 질소에 결합된 CH₂), δ 50.0 내지 55.0 (OCH₃), δ 42.0 내지 48.0 (CH₂) 및 마지막으로 δ 10.0 내지 15.0 (CH₃)에서의 신호를 나타내었다.

이어서, 고체 상태 ¹H-¹³C NMR 스펙트럼 (도 10)을 얻었고, 특징적 밴드 또는 피크가 검출되었다: 카르보닐, 방향족, 이중 결합, N-메틸렌, 메톡시, 및 메틸렌 기. 메틸 기 또는 엑소시클릭 메틸렌 신호는 부재하였고, 이는 중합 과정에서 원래의 엑소사이클 메틸렌 (또는 히드로메틸 기)의 관여를 나타낸다.

HPLC/MALDI 분석에서는, 정제된 중합체가 약 6000의 분자량, 약 12개의 이량체 단위를 갖는 것으로 나타났다. 701 및 475의 m/e에 상응하는 MS 단편이 나타났다 (화학식 9에 나타낸 구조 참조).

실시예 5. 제니파 아메리카나 즙과 글리신의 반응

액체 생즙 (100 mL)을 글리신 (0.8 g, 글리신의 양은, 글리신 및 제니핀의 몰비가 약 1:1이 되도록 액체 생즙의 제니핀 함량에 따라 조정할 수 있음)과 혼합하고, 반응 온도를 70℃에서 2시간 동안 유지하였다. 그 후, 용매를 감압 하에 증발시키거나, 동결건조시켜, 암청색 분말 혼합물을 얻었다.

이어서, 암청색 분말을 먼저 에틸 아세테이트로, 또한 이어서 보다 철저하게 메탄올로 추출하였다. 메탄올, 및 세파덱스 LH-20을 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 메탄올 중의 가용성 성분 (800 mg)을 분리하였다. 제1 분획에서, 메탄올의 증발 후 정제된 중합체로서 대부분 짙은 청색 생성물 (600 mg)을 얻었다. 메탄올 가용성 분획으로부터 소량의 화합물 1 (1 mg), 화합물 2 (1.5 mg) 및 화합물 3 (1 mg)을 또한 얻었다.

또한, 메탄올:물 (9:1)로 용출시키며 세파덱스 LH-20 칼럼을 사용하여 메탄올 불용성 분획 (1.2 g)을 분리하였다. 그 후, 역상 C-18 분리를 수행하여 정제된 중합체를 수득하였다. 메탄올 불용성 분획으로부터의 정제된 중합체를 메탄올 가용성 분획으로부터의 정제된 중합체와 합쳐 총 1.8 그램의 중합체를 수득하였다. 제니파 아메리카나 즙과 글리신의 반응에 의해 얻어진 중합체의 분석 데이터는 정제된 제니핀과 글리신의 반응으로부터 얻어진 것들과 동일하다.

실시예 6. 중합체의 정량화

청색 중합체의 순도를 평가하고, 재구아 추출물 (제니파 아메리카나 즙과 글리신의 반응으로부터 얻음) 중의 그의 함량을 정량화하기 위해 HPLC/PDA 방법이 시행되었다.

온라인 탈기 장치 (DGU-20 A5), 4개 펌프 (LC 20AT), 오토 샘플러 (SIL 20A HT), 칼럼 오븐 (CTO 20A), 및 포토다이오드 어레이 검출기 (SPD M20A) (커뮤니케이션 버스 모듈 (CBM 20A)에 의해 제어됨)를 갖는 시마쯔 프로미넨스(Shimadzu Prominence) UFLC를 이 분석 연구에 사용하였다.

여러 개의 칼럼, 예컨대 역상 루나(Luna) C18 (페노메넥스(Phenomenex)) 150 x 4.6 mm 5 ㎛, 수펠코실(supelcosil) (시그마(Sigma)) C8, 150 x 4.6 mm 5 ㎛, 및 루나 PFP 150 x 4.6 mm 5 ㎛를 사용하였다.

재구아 추출물 중의 중합체의 매우 극성인 성질은 정상 칼럼의 사용을 제한하였다.

아세토니트릴 및 메탄올을 100% 내지 100% 물 범위의 다수의 비율로 사용하였다.

1 mL/min의 유량을 사용하였고, 전개 과정을 통해 변형을 수행하지 않았다.

PDA 검출기를 사용하고, 파장을 200 내지 800 nm에서 최대 플롯 모드로, 또한 590 nm에서 모니터링하여 청색 중합체를 검출하였다.

여러 칼럼 및 검출기 셀 온도를 평가하였지만, 루나 PFP 칼럼 사용시 최선의 결과가 얻어졌다. 다른 칼럼을 사용하여 수행된 분석으로부터의 결과는, 용매 혼합물, 칼럼 및 검출기 온도, 유속 또는 주입 부피 사용과 관계 없이 단지 유지되지 않은 피크만이 관찰되었기 때문에 만족스럽지 못하였다.

칼럼 선택 후, 용매 구배를 평가하였고, 용출제로서 메탄올 및 물 사용시 최선의 분리 결과가 얻어졌지만 이 단계에서 피크 형상 및 폭은 개선되어야 했고, 상이한 칼럼 오븐 온도를 이용한 여러 시도는 체류 시간에 대한 효과 없이 우수한 형상 및 폭을 가질 수 있게 하였다.

최선의 분리 조건의 요약은 하기를 포함하였다:

칼럼: 보안 가드 카트리지를 갖는 루나 PFP 100A (페노메넥스)

길이 ............... 150 mm

내경 ............... 4.6 mm

입자 크기 .......... 5 ㎛.

이동 상: 용출제 A: 물 및 용출제 B: 메탄올

선형 구배:

유량: 1 mL/min

온도:

T_샘플: 주변 온도 (20 내지 24℃)

T_칼럼: 40℃

T_{검출기 셀}: 40℃

검출: 맥스플롯(Maxplot) 230 내지 800 nm (추출물 프로파일);

맥스플롯 590 nm (청색 중합체의 정량화).

샘플 제조: 10 또는 25 mL 메스 플라스크 내에서; 분석하려는 배치 샘플 10 mg을 칭량하고, 탈이온수로 부피를 채움. 이 용액 10 ㎕를 오토 샘플러를 사용하여 주입함.

시스템 성능: 표준 방법에서, 청색 중합체는 10.3분에 용출됨.

실시예 7. 당을 함유하지 않는 청색 중합체의 정제

당을 함유하지 않는 청색 중합체를 세파덱스 LH-20을 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

10 g의 냉동-건조된 재구아 추출물 (제니파 아메리카나 즙과 글리신의 반응으로부터 얻음)을 10 mL의 탈이온수 중에 용해시키고, 여과하였다. 그 후, 착색제의 용액을 칼럼의 상단에 적용하였다. 이동 상 조성은 100% 메탄올, 80% 메탄올, 50% 메탄올 및 100% 물이었다. 총 14개의 분획을 수집하였고, 이소프로판올:물:아세트산 (2:0.5:0.5) 용액으로 용출시키며 당 함량에 대하여 박층 크로마토그래피에 의해 체크하였다. 플레이트에 황산 (5%)을 분무하고, 105℃에서 가열하였다. 최초로 용출되는 당을 함유하지 않는 분획을 혼합하고 진공 조건 하에 건조시키고, 이어서 HPLC에 의해 요망되는 순도가 검출될 때까지 상기에 기재된 것과 동일한 용출 조건을 이용하여 정제 단계에 적용하였다.

분취량의 분획을 희석하고, 나일론(Nylon) 멤브레인 필터 (아크로디스크(Acrodisc), 폴(Pall))을 사용하여 0.45 ㎛를 통해 여과한 후, 실시예 6의 방법을 이용하여 HPLC에 의해 분석하였다.

재구아 추출물로부터의 청색 중합체의 요망되는 순도에 대한 선택 기준으로는 UV-vis 및 HPLC 표준물을 사용하였고, 즉, 세파덱스 칼럼의 분획은 TLC 방법 하에 당을 함유하지 않았고, 590 nm에서 검출된 주 피크의 흡광도는 각각 240 nm에서의 흡광도 이상이었다.

도 13a 내지 d에 원료 배치 및 상이한 순도를 갖는 3개의 분획의 HPLC 트레이스 (스펙트럼)를 나타내었다. 도 13c는 당을 함유하지 않는 순수 청색 중합체 ("기준 표준물"로서 사용됨)의 HPLC 트레이스를 나타낸다.

실시예 8. 재구아 추출물 샘플 중의 청색 중합체 함량의 정량화

실시예 7에서 제조된 당을 함유하지 않는 기준 표준물 청색 중합체를, 실시예 6에 기재된 분석 방법을 이용하여 재구아 추출물 샘플 중의 청색 중합체 함량을 정량화하기 위한 외부 표준물으로서 사용하였다.

보정 곡선

청색 중합체 기준 표준물로부터 기준 표준물 용액을 제조하였다. 기준 표준물로부터의 각각의 곡선 하 면적 (AUC)을 농도에 대하여 플롯팅하고, 선형 회귀를 적용하여 보정 곡선 식을 얻었다.

기준 표준물 용액을 5개 농도에 대해 3회 반복 주입하고, 일부 경우에는 더 많은 주입을 수행하였다.

방법은 20 내지 100 ㎍/mL 범위에서 선형인 것으로 밝혀졌다.

6개의 상이한 보정 곡선을 얻었다. 보정 곡선 1 내지 6을 각각 도 14a 내지 f에 나타내었다.

검출 및 정량화의 한계

재구아 추출물 중의 청색 중합체 함량을 측정하기 위해 시행된 방법은, 2 ㎍/mL의 하한 농도에서 590 nm에서 모니터링되는 10.2 min에서의 신호를 검출할 수 있었다. 식 2H/h에 따르며, 여기서 H는 표준 기준물 피크의 높이이고, h는 블랭크 크로마토그램에서의 체류 시간에서의 높이이다 (10 ㎕의 메탄올 또는 물을 주입함). 값 (2x3423/2836 = 2.4)은 검출 한계로서 허용되는 하한이다. 표준 기준물 피크 높이 및 블랭크 크로마토그램의 평균 값을 계산에 이용하였다.

청색 중합체에 대한 정량화 한계는 20 ㎍/mL로 측정되었다.

재구아 추출물 샘플 중의 청색 중합체의 정량화

재구아 추출물로부터의 청색 중합체를 외부 표준물 방법을 이용하여 백분율로서 정량화하였다.

각각의 배치를 3회 반복 칭량하여 2일 내에 10 mL 희석에 대한 3개의 독립적 측정치를 얻었다; 25 mL 희석을 단지 1일 동안 3회 반복 수행하였다. 배치 5312005에 대하여, 2개 부피의 샘플 희석의 목적은 재구아 추출물 분석시의 농도가 고려되어야 할 파라미터인지를 평가하기 위한 것이었으므로, 단지 10 mL 희석만을 분석하였다. 표 1에, 배치 5312001 내지 5312004로부터의 결과를 25 및 10 mL 희석에 대하여 나타내었고, 여기서 평균 값을 비교할 수 있다.

하기 식을 이용하여, 샘플을 10 mL로 희석시, 청색 중합체 농도를 계산하였다.

또는

샘플을 25 mL로 희석시; y = 590 nm에서의 청색 중합체의 분석 피크 면적; b = 회귀선의 절편; a = 회귀선의 기울기; w = 샘플의 중량 (mg).

샘플 중의 백분율을 생성된 각각의 보정 곡선에 대하여 계산하였다. 보정 곡선 1로부터의 데이터를 제외시켰다. 분석된 각각의 배치에 대하여 6개의 보정 곡선 식으로부터의 데이터를 얻은 경우, 보정 곡선 1로부터의 결과는 다른 값들과 상이하였고, 이들을 평균내면, %RSD는 증가하고, 이는 아마도 희석 및 샘플 제조에서의 또는 칭량 단계에서의 오류에 의한 것이다.

<표 1>

재구아 추출물 중의 청색 중합체의 백분율.

실시예 9. 발효에 의한 당 제거

재구아 추출물 (4.5 L, 제니파 아메리카나 즙과 글리신의 반응으로부터 얻음, 배치 5113003)을 121℃, 15 psi에서 20 min 동안 수직 오토클레이브 투트나우어(Tuttnauer) 3870 ELV (85 리터) (네덜란드 소재의 투트나우어 유럽 비브이(Tuttnauer Europe BV))에서 멸균하였다. 이어서, 멸균된 재구아 추출물을 오토클레이브 내부에서 냉각시켰다. 생성된 브로쓰(broth)를, 30℃에서 동일한 멸균 브로쓰에서 미리 활성화시킨, 25 g의 이스트 (사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)) 시판 등급 (콜롬비아 소재의 레바판(Levapan))으로 접종시켰다. 7 L 생물반응기에서 5 L 작업 부피로 발효를 수행하였다.

혼합물을, 모니터링을 위해 소프트웨어 바이오커맨드(Biocommand) 6.1.7601 배치 컨트롤 변수를 이용하여, 생물반응기 바이오플로(BioFlo) 110 (미국 소재의 뉴 브룬스윅 사이언티픽(New Brunswick Scientific))에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 500 mL의 4개 샘플을 시험하였다 (인큐베이션 최초 12시간 동안 3시간마다). 그 후, 작업 부피는 약 2.5 L의 브로쓰였다.

발효 과정을 위한 작업 조건을 표 2에 나타내었다. 시스템은 혐기생활에서 시작되었고, 발효 과정 동안 외부 산소가 첨가되지 않았다. 산소의 검출 백분율 (DO₂ (%))은 외부 산소 첨가 없이 샘플 중에 존재하는 산소를 나타낸다. 발효 과정 동안, 온도를 30 ± 2℃에서 일정하게 유지하였다.

<표 2>

생물반응기 작업 조건

23시간 19분 후, 발효 과정이 종료되었다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 라보퓨즈 써모 사이언티픽(Labofuge Thermo Scientific)에서 20분 동안 200 내지 4800 rpm으로 원심분리에 적용하였다 (미국 뉴저지주 소재의 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)). 이어서 효모를 제거하였다.

원심분리된 샘플을 디지털 굴절계 아타고(Atago) PAL-3 (일본 도쿄 소재의 아타고 컴파니 리미티드(Atago Co. Ltd.))을 사용하여 가용성 고체 (°브릭스(Brix))에 대하여, 또한 MA35M 브랜드 사르토리우스(Brand Sartorius) (독일 괴팅겐 소재의 더 사르토리우스 그룹(The Sartorius Group))를 사용하여 수분 함량에 대하여 분석하였다. 샘플의 당 함량을, 이소프로판올:아세트산:물 (2:0.5:0.5)의 혼합물로 용출시키며, 실리카 겔 60 F254 4x5 cm로 코팅된 알루미늄 플레이트를 사용하여 TLC 방법에 의해 분석하였다. TLC 플레이트에 에탄올 중 10% 황산을 분무하고, 110℃로 가열하였다. 순수 글루코스, 프룩토스 및 수크로스를 표준물로서 사용하였다. 3, 6, 9, 및 12시간에서의 반응 혼합물의 분석에서는, 모든 당을 제거하기 위해 6시간의 발효이면 충분한 것으로 나타났다. 6시간의 발효 후 반응 혼합물에서는 상기에 기재된 TLC 방법에 의해 당이 나타나지 않았다.

실시예 10. 발효 생성물 및 비-발효 생성물의 특징 비교

샘플 제조

실시예 9에서 제조된 발효된 재구아 추출물 (원심분리되고 여과됨)을 회전 증발기에서 농축시키고, 이어서 캐리어 비히클 (변형된 식품 전분 (캅술(Capsul)®))의 존재 및 부재 하에 뷔히(Buechi) B-290 (스위스 플라빌 소재의 뷔히 래보르테크닉 아게(BUECHI Labortechnik AG))로 분무 건조시켰다. 건조 조건은 하기와 같았다: 150℃ 유입구 온도 및 103 내지 110℃ 유출구 온도; 펌핑 25% (290 mL/h), 공기 건조 유량 400 및 흡인기 85%.

비-발효된 재구아 추출물 (발효 생성물의 제조에 사용된 것과 동일한 배치로부터)을 발효 생성물에 대해 본원에 기재된 것과 동일한 조건 하에 건조시켰다.

요약하면, 하기 3종의 생성물을 제조하였다:

(1) PF: 발효 생성물, 원심분리 및 농축됨, 비히클 부재;

(2) FC: 발효 생성물, 원심분리 및 농축됨, 비히클 (캅술®) 존재 (생성물로부터 60% 총 고형분 - 비히클로부터 40% 총 고형분);

(3) PC: 비-발효 생성물, 비히클 (캅술®) 존재 (생성물로부터 60% 총 고형분 - 비히클로부터 40% 총 고형분).

3종의 분말 생성물 (PF, FC 및 PC)의 특징을 수분 함량, 중합체 함량, 색 강도, 및 pH 3의 완충액 중에서의 안정성에 대하여 분석하였다. 생성물의 미생물학적 안정성을 또한 시험한다.

중합체 함량

실시예 6 내지 8에 기재된 바와 같이 HPLC 방법에 의해 PF, FC 및 PC의 중합체 함량을 측정하였다. HPLC 결과를 표 3에 나타내었다. HPLC 크로마토그램을 도 15에 나타내었다.

<표 3>

중합체의 정량화 결과

색 강도

색 파라미터

PF, FC 및 PC의 수성 염료 용액 (0.015 g 분말/40 mL)을, CIELab 파라미터에 대하여 비젼라이트(VISIONlite) 소프트웨어를 사용하여 제네시스(GENESYS) 10S UV-VIS 분광광도계로 3회 반복 분석하였다. 3종의 샘플의 색 파라미터를 도 16에 나타내었다.

CIELab 파라미터는, 발효 생성물 (PF 및 FC)이 비-발효 생성물보다 더 강력한 청색을 가졌음을 보여준다. PF 및 FC 둘 다 PC에 비해 더 낮은 L 값 (낮은 휘도), 낮은 음의 a 값 (이는 보다 자주색임을 의미할 수 있음), 그러나 유사한 b 값을 가졌다. 도 16은 또한, PF는 PC의 흡광도의 2배인 가장 강한 흡광도를 갖고; FC는 PC의 흡광도에 비해 1.6배 더 강한 흡광도를 가졌음을 보여준다.

pH 3의 완충액 중에서의 생성물의 안정성

PF, FC 및 PC의 안정성을 하기 3개 저장 조건 하에 pH 3.0의 완충액 중에서 평가하였다: 19일 동안 냉장고 (6℃), 온도 (20℃) 및 챔버 (45℃).

생성물 (PF, FC 및 PC)을 40 mL의 완충액 중 15 mg의 샘플 농도에서 3회 반복 시험하였다. 샘플을 350 내지 800 nm (2 nm 단계로 측정)에서 동일한 분광광도계에서 모니터링하였다. D₆₅ 및 10°의 관찰각으로 비젼라이트 소프트웨어 버젼 2를 사용하여 CIELab 파라미터에 의해 색 변화를 측정하였다. 파라미터 L (밝기, 백색 0/흑색 100), a (-녹색/적색+), 및 b (-청색/황색+)를 이용하여 하기 등식 [1]을 이용하여 색 변화를 계산하였다.

PF, FC 및 PC의 색-관련 파라미터, A (흡광도), L, a, b 및 ΔE_ab를 시간에 따라 모니터링하였다.

반응 속도 상수 (Ln (청색 면적)_t / (청색 면적)₀ 대 시간의 플롯으로부터 얻어지는 기울기)로부터의 1차 반응속도론에 따라 반감기를 계산하였다. 스태트그래픽스 센투리온(Statgraphics Centurion) XV 시험을 이용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 피셔(Fisher) 최소 유의차 (LSD)를 이용하여 평균치를 구별하였다.

표 4에 PF, FC 및 PC에 대한 일 단위의 반감기 결과를 나타내었다.

<표 4>

일 단위의 평균 반감기

수분 분석기 (사르토리우스 브랜드 MA35M)에 의해 측정된 PF, FC 및 PC에 대한 수분 함량은 각각 4.12%, 3.24% 및 3.15%였다.

발효 과정은 6시간 내에 재구아 추출물로부터 모든 당을 효율적으로 제거하였다. 생성된 발효 생성물 (PF 및 PC)은 보다 강력한 청색을 가졌다. PF는 비-발효 생성물 PC의 경우보다 2배 강력한 청색을 가졌다.

발효 생성물 PF는 비히클 캡슐제 (예를 들어, 전분)의 첨가 없이 분무 건조시 안정하였다.

기지의 양의 미생물 (예를 들어, 박테리아, 진균, 또는 이스트)을 발효 생성물에 첨가하고, 이어서 (예를 들어, 7일 후) 발효 생성물의 미생물학적 안정성을 측정함 (예를 들어, 첨가된 미생물의 활성 측정에 의해)으로써 발효 생성물의 미생물학적 안정성을 시험한다.

실시예 11. XAD -7에 의한 재구아 추출물로부터의 당의 제거

조 제니파 아메리카나 즙 (150 mL)을 70℃에서 2시간 동안 글리신 (1.5 g)과 반응시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 이어서, 냉각된 반응 혼합물에 XAD-7 수지 (100 g)를 첨가하였다. 24시간 후, XAD-7 수지를 여과하였다.

생성된 수지를 먼저 물로 용출시켜 수성 분획을 생성하고, 이어서 물과 에탄올의 혼합물로 용출시켜 중합체 분획을 생성하였다. 중합체 분획 중의 중합체의 정체를 실시예 6의 방법을 이용하여 HPLC 분석에 의해 확인하였다. 중합체 분획의 당 함량을 실시예 9에 기재된 TLC 방법에 의해 측정하였다. TLC에 의한 분석은 중합체 분획 중의 당의 부재를 나타내었다. 한편, 수성 분획은 당이 풍부하였다. HPLC 분석은 또한, 수성 분획이 일부 중합체를 함유함을 시사하였다. 도 17에 중합체 분획 및 수성 분획의 HPLC 스펙트럼을 나타내었다.

표 5에 HP XAD7 수지를 사용한 정제에 의해 얻어진 분획의 분광광도 특징을 나타내었다.

<표 5>

HP XAD7 수지를 사용한 정제에 의해 얻어진 분획의 분광광도 특징

RN: 제니파 아메리카나 즙과 글리신의 반응.

POL: 중합체 분획; 에탄올로 용출, 대부분 중합체 함유.

H₂O: 수성 분획; 물로 용출, 당이 풍부.

실시예 12. 제니파 아메리카나 즙과 다양한 아미노산의 반응

제니파 아메리카나 즙을 특정 아미노산과 반응시켜 생성 색 프로파일을 얻었다. 100 mL 삼각 플라스크 내의 제니파 아메리카나 즙 (50 mL) (다이오드 어레이 검출기 및 PDA에 커플링된 시마쯔 프로미넨스 UFLC (일본) 상에서의 HPLC에 의해 측정된 2.42% 제니핀 함량)을 등몰량의 글리신 (GLY), 발린 (VAL), 리신 (LYS), 프롤린 (PRO), 메티오닌 (MET), 티로신 (TYR), 또는 트립토판 (TRP)과 혼합하였다. 생성된 즙 + 아미노산 혼합물을 70℃에서 2시간 동안 교반하였다. 메탄올-물 4:1의 혼합물로 용출시키며 실리카 겔 F254 4x5 cm로 코팅된 알루미늄 플레이트에서의 박층 크로마토그래피를 이용하여 반응을 모니터링하였다. 반응 생성물을 실시예 6에 기재된 방법에 의해 HPLC로 분석하였다. 비젼라이트 소프트웨어 버젼 2.0을 사용하여 제네시스 10S 분광광도계 UV-VIS 상에서 반응 생성물의 분광광도 특징규명을 수행하였다. 특징규명 실험을 위해, 각각 100 및 200 ㎕의 반응 용액을 5 mL의 탈이온수 중에 희석함으로써 샘플을 제조한 트립토판 및 프롤린과의 반응의 경우를 제외하고는, 20 ㎕의 반응 용액을 5 mL의 탈이온수 중에 희석함으로써 샘플을 제조하였다.

본 실시예에서는 반응 생성물에 또한 7.46시간 동안 254 nm에서 자외선 램프 UVGL-58 핸드헬드(Handheld) UV (영국 캠브릿지 소재의 울트라-바이올렛 프로덕츠 리미티드(Ultra-Violet Products Ltd))를 조사한 것을 제외하고는, pH 3.0의 완충액 중에서 실시예 10에 기재된 방법과 유사하게 생성된 반응 생성물의 안정성을 평가하였다. 반응 생성물을 pH 3.0의 완충액 10 mL 당 반응 생성물 40 ㎕의 농도로 3회 반복 시험하였다.

도 18에 제니파 아메리카나 즙과 다양한 아미노산의 반응 생성물의 흡수 스펙트럼을 나타내었다. 이들 생성물의 색 파라미터를 표 6에 나타내었다.

<표 6>

제니파 아메리카나 즙과 다양한 아미노산의 반응 생성물에 대한 색 파라미터

* PRO200의 경우, 200 마이크로리터의 조 반응 혼합물을 사용하였지만, PRO에서는, 20 마이크로리터를 사용하였다. TRP100의 경우, 100 마이크로리터의 조 반응 혼합물을 사용하였지만, TRP에서는, 20 마이크로리터를 사용하였다.

도 19a 내지 c에, 아미노산에 따라 분류된, 다양한 아미노산과 제니파 아메리카나 즙의 반응 생성물의 HPLC 분석을 나타내었다. 도 19a 내지 c에, 각각의 아미노산에 대하여, 실시예 6의 방법을 이용한 아미노산과 제니파 아메리카나 즙의 반응 생성물의 HPLC 스펙트럼; 중합체가 확인된 HPLC 영역의 확대도; 및 선택된 신호의 UV-vis 스펙트럼을 나타내었다.

아미노산 LYS, VAL, MET 및 PRO 및 제니파 아메리카나 즙으로부터의 반응 생성물은 10.3분 범위 내 (10.3분 ± 5%)의 체류 시간을 갖는다. 이 체류 시간은 제니파 아메리카나 즙과 글리신으로부터 유래된 중합체에서 나타난 체류 시간과 유사하지만, 제니파 아메리카나 즙과 아미노산 LYS, VAL, MET 및 PRO의 반응의 생성물에 대한 신호는 제니파 아메리카나 즙과 글리신의 반응의 생성물에서 나타난 신호에 비해 더 복잡하였다 (도 19a 내지 b 참조). 이론에 의해 한정되는 것은 아니지만, 이들 결과는, 아미노산 LYS, VAL, MET 및 PRO의 사용시 보다 많은 수의 화합물 및 상이한 크기의 중합체 쇄의 형성을 나타낼 수 있다.

제니파 아메리카나 즙과 티로신 또는 트립토판의 반응은 10.3분 범위 내 (즉, 10.3분 ± 5%)의 체류 시간을 갖는 생성물을 형성하지 않았다. 이들 생성물에 대한 최대 흡수 파장 (λ_max)은 600 nm 초과였다 (도 19c 참조).

도 20에, 254 nm에서의 UV 조사를 이용한 pH 3.0의 완충액 중에서의 제니파 아메리카나 즙과 다양한 아미노산의 반응 생성물의 안정성 (반감기로 나타냄)을 나타내었다.

제니파 아메리카나 즙과 다양한 아미노산의 반응은 상이한 색의 생성물을 생성하였다: 청색 (GLY 및 LYS), 청록색 (VAL, MET 및 TYR), 녹색 (TRP) 및 흑색 (PRO).

메티오닌 (MET)과 제니파 아메리카나 즙의 반응으로부터 형성된 생성물은, 7.46시간 동안 254 nm에서의 UV 조사 하에 pH 3.0의 완충액에서 시험시, 글리신 (GLY) 및 제니파 아메리카나 즙으로부터 유래된 생성물에 비해 2배로 pH 안정성이었다.

HPLC 분석에서는, 제니파 아메리카나 즙과 티로신 (TYR) 또는 트립토판 (TRP)의 반응은, 글리신 (GLY) 및 제니파 아메리카나 즙으로부터 유래된 중합체와 비교시, 약간 더 낮은 극성을 갖는 화합물을 형성한 것으로 나타났다 (GLY에 비해 TYR 및 TRP와의 반응으로부터의 생성물에 대해 보다 높은 체류 시간에 의해 나타남).

실시예 13. 제니파 아메리카나 과실 중과피의 추출물과 글리신의 반응으로부터 생성된 색

제니파 아메리카나 과실 중과피의 수성 추출물

제니파 아메리카나 과실 중과피 (즉, 과실의 껍질)로부터의 수성 추출물을 제조하였다. 부드럽고 불규칙한 외피를 갖는 익은 과실과 달리 딱딱하고 균일한 외피를 갖는 익지 않은 과실을 사용하였다. 제니파 아메리카나 생과 (즉, 수확 후 1 내지 2일 내의 것)의 중과피 (76 g)를 300 mL의 탈이온수로 액화시켰다. 이 즙을 여과하고, TLC 및 HPLC (다이오드 어레이 검출기 (DAD)에 커플링된 시마쯔 프로미넨스 UFLC 상에서)로 분석하여 제니핀 및 다른 이리도이드 제니핀의 함량을 측정하였다. 비교를 위해, 동일 연령의 무손상 과실을 3일 동안 실온에 두고 (비-생과), 그 후 상기에 기재된 바와 같이 탈이온수로 추출하였다. 생성된 즙을 또한 TLC 및 HPLC에 의해 분석하여 제니핀 및 다른 이리도이드 제니핀의 함량을 측정하였다.

도 21a에, 제니파 아메리카나 생과의 중과피의 수성 추출물의 HPLC 스펙트럼을 나타내었으며, 이는 240 nm에서의 최대 흡수 파장을 갖는, 제니핀의 체류 시간 (22 내지 23분) 근처인 19 내지 20분의 체류 시간을 갖는 피크를 가졌다.

도 21b에, 도 21a에서와 동일한 연령을 갖지만, 추출 전에 3일 동안 실온에 둔 제니파 아메리카나 과실 (비-생과)의 중과피의 수성 추출물의 HPLC 스펙트럼을 나타내었다. 스펙트럼은 19 내지 20분 및 22 내지 23분의 체류 시간을 갖는 피크를 가졌다.

중과피 (껍질)의 수성 추출물과 글리신의 반응

상기에 기재된 바와 같이 제조된 중과피의 수성 추출물 (여과된 즙, 300 mL)을 500 mL 삼각 플라스크 내에서 글리신 (450 mg)과 혼합하였다. 이어서, 생성된 혼합물을 자기 교반 (이탈리아 소재의 벨프(VELP)) 하에 핫 플레이트 상에서 4000 rpm 및 75℃에서 90분 동안 교반하였다. 이 방법은 짙은 자주색을 갖는 생성물을 생성하였다.

반응 생성물을 여과하고, 비젼라이트 소프트웨어 버젼 2.0을 사용하여 제네시스 10S 브랜드 분광광도계 UV-VIS로 특징규명하였다. 조 반응 생성물을 ¹H NMR 및 질량 분광측정법 (MS)에 의해 특징규명하였다. 도 22에, 수성 추출물과 글리신을 혼합하는 이 방법으로부터 얻어진 자주색 생성물의 ¹H NMR을 나타내었다.

표 7에 자주색 염료 혼합물에서 검출된 일부 신호를 나타내었다.

<표 7>

분석된 자주색 염료 혼합물에서 검출된 신호

표 7에서 이루어진 디컨볼루션은 m/z 257.2에서의 컴포넌트 신호 디컨볼루션을 나타낸다.

대안적으로, 글리신 첨가 전에 수성 추출물을 70℃로 예열하는 방법을 수행하였고, 얻어진 생성물은 청색을 가졌다. 생성물은 제니핀 및 글리신의 혼합물로부터 얻어진 것과 동일한 청색이었다. 도 23에, 예열된 수성 추출물과 글리신을 혼합하는 이 방법으로부터 얻어진 청색 생성물의 ¹H NMR을 나타내었다.

이들 결과는, 제니파 아메리카나 과실 중과피로부터 얻어진 즙과 글리신의 반응 생성물이, 글리신 첨가 전에 수성 추출물을 예열하였는지의 여부에 따라 달라짐을 보여준다. 글리신을 수성 추출물과 혼합하는 절차 (예열 없음)에 따르면, 형성된 생성물은 짙은 자주색을 가졌다. 글리신 첨가 전에 수성 추출물을 70℃로 예열한 절차에 따르면, 형성된 생성물은 청색을 가졌다.

중과피의 수성 추출물로부터의 제니핀 전구체의 특징규명

I. 물 추출 및 냉동 건조 방법

제니파 아메리카나의 덜 익은 생과 (수확으로부터 2일)를 4 조각으로 절단하고, 중과피 (껍질)를 내과피 (과육) 및 외과피 (외부 껍질)로부터 분리하였다. 익지 않은 제니파 아메리카나의 이미지를 도 24에 나타내었다. 360 g의 중과피를 블렌더에서 300 mL의 탈이온수로 분쇄하고, 생성된 즙을 면직물로 진공 여과하고, 즉시 즙을 랩콘코(LABCONCO) 장치를 이용하여 밤새 냉동 건조시켰다.

50 mg의 냉동 건조된 생성물을 5분 동안 음파파쇄 하에 1 mL의 CD₃OD로 추출하고, 여과하였다. 용액을 물 억제 하에 브루커 푸리에(Bruker Fourier) 300 상에서 각각 300 및 75 MHz에서 ¹H 및 ¹³C NMR에 의해 분석하였다.

II. 액체 질소 동결 방법

새로 절단된 중과피를 액체 질소로 동결 후에 분쇄하고, 50 mg의 생성 분말을 5분 동안 음파파쇄 하에 1 mL의 CD₃OD로 추출하고, 여과하고, 용액을 물 억제 하에 브루커 푸리에 300 상에서 각각 300 및 75 MHz에서 ¹H 및 ¹³C NMR에 의해 분석하였다.

III. 결과

냉동 건조된 및 질소 동결된 중과피에 대한 ¹H NMR 결과는, 제니핀 핑거프린트의 유사 패턴을 갖는 매우 우수한 분해 스펙트럼을 나타내었다 (도 25a 내지 b).

재구아 중과피의 물 추출물은 19분에서 HPLC (240 nm) 피크를 가졌고, 이는 가열 또는 에틸 아세테이트로의 추출 후 사라졌다. 제니핀 피크 21 내지 22분이 검출되었다. 도 26a 내지 b에, 각각, 물 중과피 추출물 및 물 추출물의 에틸 아세테이트 용매 분배의 HPLC 프로파일 (240 nm)을 나타내었다.

재구아 과실의 중과피 중의 전구체로부터의 제니핀의 형성은, 도 26a에 나타낸 분석 후 수 일 동안 실온에서 유지된 과실을 사용하여 제조된 물 추출물의 HPLC 프로파일에 의해 측정된 바와 같이 자발적이었다. 제니핀은 21 내지 22분에서 나타났고, 19분에서의 그의 전구체가 240 nm에서 검출가능하였다 (도 27).

재구아 중과피에서 발견된 제니핀의 전구체로부터의 제니핀의 빠르고 자발적인 형성은, 산소 또는 열에 의해 촉발된 전구체의 구조 변화 (즉, 헤미아세탈 고리의 형성)를 나타내었고, 이는 제니핀 또는 전구체 분자의 효소 절단으로부터 제니핀의 과실의 내과피로의 방출로 이어진다. 중과피의 물 추출물에 대한 ¹H NMR 실험은 알데히드 양성자 (12 ppm)를 나타내지 않았다 (도 28 참조).

5.1 및 4.7 ppm에서의 2개의 이중선 및 100 및 70 내지 80 ppm에서의 탄소 신호가 검출되었고, 이는 제니핀에서는 존재하지 않았고, 이는 당 내의 애노머 양성자 및 CHO 모이어티의 특징으로, 전구체가 제니핀의 글리코시드임을 지지하는 것이다. 제니핀 전구체의 ¹H (도 29) 및 ¹³C (도 30) 데이터는 분자 (+)-제니포시드 및 제니핀의 이로도이드 B-글리코시드 전구체에 일치된다.

(+)-제니포시드의 스펙트럼 데이터:

실시예 14. 제니파 아메리카나 즙에 대한 메티오닌 및 글리신의 첨가

제니파 아메리카나 즙을 메티오닌 및 글리신과 반응시켜 생성 색 프로파일을 측정하였다. 제니파 아메리카나 즙 (50 mL)을 100 mg 메티오닌 및 100 mg 글리신의 혼합물에 첨가하고, 반응을 70℃에서 2시간 동안 유지하였다.

제2 실험에서, 제니파 아메리카나 즙 (50 mL)을 초기에 100 mg 메티오닌에 첨가하고, 반응 1시간 후, 추가의 100 mg 글리신을 첨가하고, 반응을 추가의 1시간 동안 유지하였다.

이들 반응 각각으로부터 생성된 색을 0.015 g/40 mL까지의 분말 중 염료의 수용액으로부터 400 내지 700 파장 범위의 제네시스 10S 분광광도계 UV-vis 흡수에서 측정하여, 최대 흡광도 및 CIELab 파라미터를 구하였다.

아미노산 첨가 순서와 관계 없이, 결과는 짙은 청색의 형성이다. 박층 크로마토그래피에서는 중합체의 형성이 나타났고, 이는, 주요 화합물이 반응물의 첨가 순서에 관계 없이 동일하였고, 메티오닌 또는 글리신 단독을 사용하든 메티오닌 및 글리신의 혼합물을 사용하든 색이 동일하였음을 보여준다. TLC에서는 청색 염료 형성이 나타났다. 반응 생성물을 표 8에 나타낸 바와 같이 분광광도 분석하였다.

<표 8>

제니파 아메리카나 즙과 메티오닌과 글리신의 혼합물 및 글리신 사이의 반응에 대한 CIELab 파라미터

M+G: 제니파 아메리카나 즙과 글리신 및 메티오닌의 동시 반응.

1+2: 메티오닌과 제니파 아메리카나 즙, 그 후 글리신의 반응.

RN: 제니파 아메리카나 즙과 글리신의 반응.

제니파 아메리카나 즙과 아미노산의 대부분의 혼합물에서 중합체의 HPLC 크로마토그램에서의 체류 시간을 확인하였고, 이는 단지 글리신과 제니파 아메리카나 즙 사이의 반응에 의해 생성된 염료와 동일하였다. 흡수 최대는 590 nm였다. 글리신 및 메티오닌은 동시에 제니파 아메리카나 즙에 섞였다. 제니파 아메리카나 즙과, 아미노산 글리신 및 메티오닌, 뿐만 아니라 글리신 단독 사이의 반응에 의해 얻어진 크로마토그램을 도 31에 나타내었다.

Claims (113)

1. 하기 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염을 포함하며, 하기 화학식 2', 화학식 3'A, 화학식 3'B, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 추가 화합물을 실질적으로 함유하지 않는 착색제 조성물.
   <화학식 4>
   

   

   
   상기 식에서,
   n은 2 내지 20의 정수이고;
   각각의 A는 독립적으로 하기 화학식 5'A, 화학식 5'B, 화학식 5'C, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체, 그의 염 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
   <화학식 5'A>
   

   

   
   <화학식 5'B>
   

   

   
   <화학식 5'C>
   

   

   
   R¹은 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이고;
   T¹은 수소 또는 메틸 기이고; T²는 수소 또는 A-T¹이고, A 및 T¹은 상기에 정의되어 있다.
   <화학식 2'>
   

   

   
   <화학식 3'A>
   

   

   
   <화학식 3'B>
   

   
2. 제1항에 있어서, 하기 화학식 1A, 화학식 1B, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 추가 화합물을 실질적으로 함유하지 않는 착색제 조성물.
   <화학식 1A>
   

   

   
   <화학식 1B>
   

   
3. 실질적으로 정제된 하기 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염.
   <화학식 4>
   

   

   
   상기 식에서,
   n은 2 내지 20의 정수이고;
   각각의 A는 하기 화학식 5'A (Me), 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염이고;
   <화학식 5'A (Me)>
   

   

   
   T¹은 수소 또는 메틸 기이고; T²는 수소 또는 A-T¹이고, A 및 T¹은 상기에 정의되어 있다.
4. 기재를 제1항 또는 제2항의 착색제 조성물 또는 제3항의 중합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 기재에 청색을 부여하는 방법.
5. (a) 제1항 또는 제2항의 착색제 조성물 또는 제3항의 중합체 및 (b) 식품, 약물, 건강기능식품 (nutraceutical), 화장품, 또는 의료 기기를 포함하는 제품.
6. 제5항에 있어서, 상기 제품이 식제품이고, 상기 식품이 고체 식품 또는 액체 식품인 제품.
7. 제5항에 있어서, 상기 제품이 약물 또는 건강기능식 제품이고, 상기 약물 또는 건강기능식품이 정제, 젤라틴 캡슐 (gel cap), 비드, 펠릿, 환제, 당의정, 로젠지, 연고, 캡슐, 분말, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 형태로 존재하는 것인 제품.
8. 하기 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염을 포함하며, 하기 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 및 그의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 추가 화합물을 실질적으로 함유하지 않는 착색제 조성물.
   <화학식 4>
   

   

   
   상기 식에서,
   n은 2 내지 20의 정수이고;
   각각의 A는 독립적으로 하기 화학식 5A, 화학식 5B, 화학식 5C, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체, 그의 염 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
   <화학식 5A>
   

   

   
   <화학식 5B>
   

   

   
   <화학식 5C>
   

   

   
   R¹은 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, 이소부틸 또는 tert-부틸이고;
   R² 및 R'²는 독립적으로 수소 또는 치환되거나 비치환된 C_1-10 알킬이고;
   R³은 수소 또는 COOH이고;
   T¹은 수소 또는 메틸 기이고; T²는 수소 또는 A-T¹이고, A 및 T¹은 상기에 정의되어 있다.
   <화학식 6>
   

   

   
   <화학식 7>
   

   

   
   <화학식 8>
   

   
9. 제8항에 있어서,

   

   이 아미노산 잔기를 나타내고, R³이 COOH이고, R² 및/또는 R'²가 아미노산의 측쇄(들)을 나타내고, 여기서 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 시스테인, 트레오닌, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 아스파르테이트, 글루타메이트, 아스파라긴, 글루타민, 오르니틴 및 시트룰린으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 아미노산은 D 또는 L 배위로 존재할 수 있는 것인 착색제 조성물.
10. 제1항, 제2항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 탄수화물을 실질적으로 함유하지 않는 착색제 조성물.
11. (a) 제니파 아메리카나 즙과, 글리신, 발린, 리신, 메티오닌, 티로신, 트립토판 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 혼합하는 단계;
    (b) 단계 (a)의 혼합물로부터 당을 제거하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)의 당-무함유 생성물로부터 착색제 조성물을 단리하는 단계
    를 포함하는, 착색제 조성물을 제조하는 방법이며,
    여기서 상기 방법에 의해 얻어진 착색제 조성물의 색 강도는 당을 제거하지 않고 단계 (a)의 혼합물로부터 얻어진 착색제 조성물의 색 강도보다 더 큰 것인, 착색제 조성물을 제조하는 방법.
12. (a) 제니파 아메리카나 즙과, 글리신, 발린, 리신, 메티오닌, 프롤린, 티로신, 트립토판 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 혼합하는 단계;
    (b) 단계 (a)의 혼합물을 멸균시키는 단계;
    (c) 단계 (b)의 멸균된 혼합물을 이스트 또는 박테리아로 접종시키는 단계;
    (d) 단계 (c)의 접종된 혼합물을 발효 조건 하에 인큐베이션시켜 발효 생성물을 생성하는 단계; 및
    (e) 단계 (d)의 발효 생성물로부터 착색제 조성물을 단리하는 단계
    를 포함하는, 착색제 조성물을 제조하는 방법이며,
    여기서 상기 방법에 의해 얻어진 착색제 조성물의 색 강도는 발효 없이 단계 (a)의 혼합물로부터 얻어진 착색제 조성물의 색 강도보다 더 큰 것인, 착색제 조성물을 제조하는 방법.
13. (i) (a) 제니파 아메리카나 과실로부터 중과피를 단리하는 단계;
    (b) 중과피로부터 즙 추출물을 제조하는 단계;
    (c) 즙 추출물과 글리신을 혼합하는 단계;
    (d) 단계 (c) 후에, 즙과 글리신의 혼합물을 가열하는 단계; 및
    (e) 단계 (d) 후에, 자주색 착색제 조성물을 단리하는 단계
    를 포함하는 방법 단계; 또는
    (ii) (a) 제니파 아메리카나 과실로부터 중과피를 단리하는 단계;
    (b) 중과피로부터 제니포시드를 단리하는 단계;
    (c) 제니포시드와 글리신을 혼합하는 단계; 및
    (d) 단계 (c) 후에, 자주색 착색제 조성물을 단리하는 단계
    를 포함하는 방법 단계
    를 포함하는, 자주색 착색제 조성물을 제조하는 방법.
14. (a) 제니파 아메리카나 과실로부터 즙 추출물을 제조하는 단계;
    (b) 즙 추출물과 프롤린을 혼합하여 흑색 착색제를 생성하거나, 또는 즙 추출물과 트립토판을 혼합하여 녹색 착색제를 생성하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)로부터 흑색 또는 녹색 착색제 조성물을 단리하는 단계
    를 포함하는, 흑색 또는 녹색 착색제 조성물을 제조하는 방법.
15. 정제된 하기 화학식 4의 중합체, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체 또는 그의 염을 포함하는 착색제 조성물이며,
    여기서 하기 화학식 4의 중합체가

    

    및

    

    의 반응에 의해 형성된 것인 착색제 조성물.
    <화학식 4>
    

    

    
    상기 식에서,
    n은 2 내지 20의 정수이고;
    각각의 A는 독립적으로 하기 화학식 5A, 화학식 5B, 화학식 5C, 그의 기하 이성질체, 그의 호변이성질체, 그의 염 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    <화학식 5A>
    

    

    
    <화학식 5B>
    

    

    
    <화학식 5C>
    

    

    
    R¹은 메틸이고;
    

    

    은 1급 알킬 아민을 나타내거나 또는

    

    은 아미노산 잔기를 나타내고, R³은 COOH이고, R² 및/또는 R'²는 아미노산의 측쇄(들)을 나타내고, 여기서 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 시스테인, 트레오닌, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 아스파르테이트, 글루타메이트, 아스파라긴, 글루타민, 타우린, 오르니틴 및 시트룰린으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 아미노산은 D 또는 L 배위로 존재할 수 있고;
    T¹은 수소 또는 메틸 기이고; T²는 수소 또는 A-T¹이고, A 및 T¹은 상기에 정의되어 있다.
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제
29. 삭제
30. 삭제
31. 삭제
32. 삭제
33. 삭제
34. 삭제
35. 삭제
36. 삭제
37. 삭제
38. 삭제
39. 삭제
40. 삭제
41. 삭제
42. 삭제
43. 삭제
44. 삭제
45. 삭제
46. 삭제
47. 삭제
48. 삭제
49. 삭제
50. 삭제
51. 삭제
52. 삭제
53. 삭제
54. 삭제
55. 삭제
56. 삭제
57. 삭제
58. 삭제
59. 삭제
60. 삭제
61. 삭제
62. 삭제
63. 삭제
64. 삭제
65. 삭제
66. 삭제
67. 삭제
68. 삭제
69. 삭제
70. 삭제
71. 삭제
72. 삭제
73. 삭제
74. 삭제
75. 삭제
76. 삭제
77. 삭제
78. 삭제
79. 삭제
80. 삭제
81. 삭제
82. 삭제
83. 삭제
84. 삭제
85. 삭제
86. 삭제
87. 삭제
88. 삭제
89. 삭제
90. 삭제
91. 삭제
92. 삭제
93. 삭제
94. 삭제
95. 삭제
96. 삭제
97. 삭제
98. 삭제
99. 삭제
100. 삭제
101. 삭제
102. 삭제
103. 삭제
104. 삭제
105. 삭제
106. 삭제
107. 삭제
108. 삭제
109. 삭제
110. 삭제
111. 삭제
112. 삭제
113. 삭제

Images