CN101104745B - 一种天然蓝色素的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种天然蓝色素的生产方法，包括β-葡萄糖苷酶催化栀子苷反应得到京尼平，以及将京尼平和氨基酸在适当条件下反应得天然栀子蓝色素，其特征在于，在β-葡萄糖苷酶催化栀子苷得到京尼平的反应中加入金属酶促进剂。本发明的天然蓝色素的生产方法，由于在反应过程中添加了金属酶促进剂，因此可以显著加快酶促反应的速度，缩短反应时间，从而节约生产成本，有利于工业化生产；同时，由于所添加的金属离子均为人体所必需的微量元素，因此，所获得的色素不仅没有人工色素潜在的危害，相反具有很好的保健功能，可以广泛应用于食品工业等各领域中。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地说，是关于一种天然蓝色素的生产方法。
背景技术
合成色素发明之前，人们一直使用天然色素。但是，由于合成色素具有色泽鲜艳，着色力强，稳定性高，价格低，生产不受季节影响等诸多优势，因此，在合成色素出现后不久，就很快占据了色素市场的大部分市场份额。
但是，随着对合成色素安全性研究的不断深入，发现很多合成色素对人体健康有害，因而天然食用色素的开发和应用又重新得到人们的重视。但是在众多的天然色素中大多为红黄两色，而蓝色素却很稀少，缺少了蓝色素就调配不出绿色，紫色，棕色等等颜色，满足不了食品上色、着色等需求，为此研究开发天然蓝色素就成为急需解决的一项新课题。
国内对该色素的研究起步较晚，且多采用在培养基中直接加入栀子果粉方法生产天然色素，所得的产品其颜色多为灰暗带紫，得率较低，难以工业化生产。
后有研究者改进生成方法，采用二步法(孙立军等，用二步法生产天然使用栀子蓝色素，南京农业大学学报，1994，17(4)：98-101)，先利用β-葡萄糖苷酶催化栀子苷反应得到中间产物京尼平；然后将京尼平和氨基酸在适当条件下反应得天然栀子蓝色素，得到的栀子蓝色素色泽理想，但其反应速率较低，影响了其工业化生产。
发明内容
本发明的目的就在于进一步改进现有的天然蓝色素的生产方法，从而提供一种新型的生产天然蓝色素的方法。
本发明的天然蓝色素的生产方法包括β-葡萄糖苷酶催化栀子苷反应得到京尼平，以及将京尼平和氨基酸在适当条件下反应得天然栀子蓝色素，其中，在β-葡萄糖苷酶催化栀子苷得到京尼平的反应中加入金属酶促进剂；所述金属酶促进剂包括：Fe3+，Zn2+，Cu2+，Co2+，Mn2+；所述金属酶促进剂的加入量为每毫升反应体系中添加金属酶促进剂的量为0.02-0.25μg；所述β-葡萄糖苷酶催化栀子苷反应得到京尼平的步骤包括：向栀子苷溶液中加入β-葡萄糖苷酶液并加入金属酶促进剂，于50-60℃反应30-120min；所述将京尼平和氨基酸在适当条件下反应得天然栀子蓝色素的步骤包括：在反应液中加入氨基酸，在65-85℃反应1-4h；所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、谷氨酸、组氨酸、精氨酸和谷氨酸钠，所述氨基酸的加入量为每毫升反应体系中添加氨基酸37-87mg。
根据本发明的方法，在反应获得栀子蓝色素后，还包括对获得的栀子蓝色素进行分离纯化的步骤，具体通过对最后的反应液进行干燥获得栀子蓝色素，优选的，所述加热方法包括加热干燥、真空干燥以及喷雾干燥。
本发明的天然蓝色素的生产方法，由于在反应过程中添加了金属酶促进剂，因此可以显著加快酶促反应的速度，缩短反应时间，从而节约生产成本，有利于工业化生产；同时，由于所添加的金属离子均为人体所必需的微量元素，因此，所获得的色素不仅没有人工色素潜在的危害，相反具有很好的保健功能，可以广泛应用于食品工业等各领域中。
附图说明
图1A是浓度为0.05％的栀子苷的HPLC出峰图，图1B为实施例3的2#样品反应后剩余栀子苷的HPLC出峰图。
图2是添加不同酶促进剂对栀子苷转化率和反应时间的影响。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
以下实施例中使用的菌种及试剂为：黑曲霉为黑曲霉IFFI2230(购自上海微生物所)，栀子苷购自毫州市亚强天然产物制品厂，氨酸钠(购自中国医药集团上海化学试剂公司)，来源于苦杏仁的β-葡萄糖苷酶购自FLUKA公司；
以下实施例中使用的分析方法如下：
栀子苷的测定：采用高效液相色谱(HPLC)测定，色谱条件为：C18反相柱；柱温为35℃；检测器为UV238nm；流动相中甲醇∶水＝60∶40，其流速为1.0mL/min；进样体积为10μL；
栀子蓝的测定：分光光度计在波长590nm下测定。
酶活测定方法：
酶活测定步骤：配制醋酸水杨苷溶液：0.5％水杨苷，0.1M醋酸；用移液抢准确移取0.25ml醋酸水杨苷溶液至1ml的小离心管中，再准确移取过滤后的酶液0.02ml，最后移取0.73ml蒸馏水；空白对照：0.25ml醋酸水杨苷加0.75ml水；把小离心管放入水浴锅中，60℃水浴10min，取出后立即用生物分析仪测定葡萄糖量。
酶活计算方法：生物传感分析仪的标准液为100mg/dl葡萄糖溶液，若生物传感分析仪数字显示为10即代表10mg/dl＝0.1mg/ml，按上述酶活测定步骤，若生物传感分析仪数字显示为10ml则说明被0.02ml酶液还原的葡萄糖0.1mg/ml×1ml＝0.1mg，那么根据酶活定义，1个小时底物在1ml酶液作用下可以产生0.1mg×6×50＝30mg葡糖糖＝166.7μmol葡糖糖，即酶活为166.7U。
酶活计算公式：X(生物传感分析仪数字显示)×16.67。
实施例1、黑曲霉发酵获得β-葡萄糖苷酶
种子培养基配方(g/L)：可溶性淀粉20g，葡萄糖10g，KH2PO41g，MgSO41g，NaNO32g，酵母膏5g，pH 4。
发酵培养基配方(g/L)：KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.2g，(NH4)2SO41.6g，麸皮为装液量的3％，pH 6。
按照种子培养基配方，种子培养在250ml的三角瓶中进行，装液量为25ml，接种量约为孢子数2.0×108，摇床转速为200rpm，培养温度为30℃，培养时间44h。
按照发酵培养基配方，发酵培养在250ml的三角瓶中进行，装液量为15ml，接种量为750μl，摇床转速为200rpm，培养温度为30℃，培养时间72h。
按照以上方法获得β-葡萄糖酶液，经上述酶活测定方法测定其酶活为175U/ml。
实施例2、黑曲霉发酵获得β-葡萄糖苷酶
种子培养基配方(g/L)：可溶性淀粉15g，葡萄糖8g，KH2PO4 0.8g，MgSO4 0.8g，NaNO3 1.8g，酵母膏4.5g，pH 4。
发酵培养基配方(g/L)：KH2PO4 1.8g，MgSO4·7H2O 0.15g，(NH4)2SO4 1.3g，麸皮为装液量的5％，pH 7.5。
按照种子培养基配方，种子培养在250ml的三角瓶中进行，装液量为25ml，接种量约为孢子数2.0×108，摇床转速为200rpm，培养温度为30℃，培养时间48h。
按照发酵培养基配方，发酵培养在250ml的三角瓶中进行，装液量为15ml，接种量为750μl，摇床转速为200rpm，培养温度为30℃，培养时间74h。
按照以上方法获得β-葡萄糖酶液，经上述酶活测定方法测定其酶活为170U/ml。
实施例3、栀子蓝色素的制备
配制重量比浓度为0.05％的栀子苷溶液，取4ml，按表1所示分别加入适量实施例1、2得到的酶液以及来源于苦杏仁的β-葡萄糖苷酶(FLUKA公司)各100μl，并选择性添加金属酶促进剂(按反应液体积计，每ml的加量为0.02-0.25μg)，于50-60℃反应30-120min，反应过程中每隔10min取样，以HPLC方法测定栀子苷的含量(其中2#样品反应前后的HPLC图谱如图1A和1B所示，其余样品基本相同，故省略)，并计算转化率(转化率＝1-测得的栀子苷含量/初始栀子苷含量)，结果见表2。
然后向反应液中加入不同的氨基酸(按反应液体积计，每ml的加量为37-87mg)，在65-85℃反应1-4h后，用分光光度计检测获得的栀子蓝的OD590值，结果见表2。
最后经干燥，包括加热干燥、真空干燥以及喷雾干燥，获得颜色鲜艳的栀子蓝，对获得的栀子蓝色素进行称量，结果见表2。
以HPLC测得的栀子苷的转化率(％)对反应时间(min)作图，结果如图2所示。
表1
| # | β-葡萄糖苷酶来源 | 酶促进剂及加量(μg/ml) | 酶促反应温度(℃) | 酶促反应时间(min) | 氨基酸及浓度(mg/ml) | 生成色素反应温度(℃) | 生成色素反应时间(h) |
| 1 | 实施例1 | - | 60 | 30 | 谷氨酸钠(84mg/ml) | 80 | 2 |
| 2 | 实施例1 | Fe3+(0.2μg/ml) | 50 | 30 | 谷氨酸(73mg/ml) | 85 | 2 |
| 3 | 实施例1 | Zn2+(0.1μg/ml) | 55 | 60 | 甘氨酸(37mg/ml) | 75 | 1 |
| 4 | 实施例1 | Cu2+(0.15μg/ml) | 58 | 60 | 丙氨酸(44mg/ml) | 70 | 3 |
| 5 | 苦杏仁 | Co2+(0.25μg/ml) | 60 | 90 | 苏氨酸(59mg/ml) | 65 | 4 |
| 6 | 苦杏仁 | Mn2+(0.02μg/ml) | 60 | 120 | 组氨酸(78mg/ml) | 80 | 1 |
| 7 | 实施例2 | Fe3+(0.05μg/ml) | 60 | 80 | 精氨酸(87mg/ml) | 75 | 2 |
表2
| # | 栀子苷转化率(％) | 栀子蓝色素的OD590 | 获得栀子蓝色素的重量(mg) |
| 1 | 38.2 | 1.42 | 87.35 |
| 2 | 85.5 | 3.32 | 75.67 |
| 3 | 86.7 | 4.94 | 40.02 |
| 4 | 88.9 | 5.24 | 46.78 |
| 5 | 88.3 | 3.68 | 61.52 |
| 6 | 92.5 | 5.59 | 80.23 |
| 7 | 84.6 | 5.33 | 89.88 |
由表1、表2和图3的结果可见，在栀子苷转化为京尼平的第一步反应中，加入金属酶促进剂可以显著提高栀子苷的转化速度，相同反应时间内栀子苷的转化率远大于不加入金属酶促进剂的反应。
实施例4、栀子蓝色素的色价测定
色价定义为：单位质量原料的提取物的吸光度(按照GB5525中2.2重铬酸钾溶液比色法执行)。
色价是单位质量原料的提取物在1％浓度、以1cm比色皿在其最大吸收峰处的吸光度。
计算方法为：色价＝Af/100m，其中A为实测试样的吸光度，f为稀释倍数，m为试样质量。
具体操作如下：
准确称取实施例3得到的2#样品色素0.1g，用去离子水稀释于100ml容量瓶中，用紫外可见分光光度计于最大波长处，用去离子水作参比液，于1cm比色皿中测定其吸光度。然后按上述计算方法计算得到样品的色价为25。可见采用本发明的方法获得的蓝色素的颜色较深。
实施例5、栀子蓝色素的稳定性检测
将实施例3制得的2#天然蓝色素放置于自然光下，在放置不同时间后，分别测其OD590值，并计算损失率(损失率＝1-测得的OD590值/初始OD590值)，其结果如表3所示。
表3、栀子蓝色素的稳定性
| 放置时间 | 损失率(％) |
| 1天 | 2.3 |
| 2天 | 3.1 |
| 3天 | 4 |
| 1周 | 4.5 |
| 1月 | 5.2 |
由表3可以看出，放置1月后，天然蓝色素损失率仅为5.2％，可见采用本发明的方法获得的蓝色素在自然光条件下相当稳定。
综上所述，本发明提供的方法，在反应过程中添加了金属离子酶促进剂，包括Fe3+，Zn2+，Cu2+，Co2+，Mn2+等，这些金属离子的添加可以加快酶促反应速度，缩短反应时间，节约生产成本，并且通过本发明获得的天然蓝色素在自然光条件下相当稳定，有利于工业化生产；同时，由于所添加的金属离子酶促进剂中的金属离子均为人体所必需的微量元素，因此，本发明提供的蓝色素不仅没有人工色素潜在的危害，相反具有很好的保健功能，可以广泛应用于食品工业等各领域中。
Claims (4)
1.一种天然蓝色素的生产方法，包括β-葡萄糖苷酶催化栀子苷反应得到京尼平，以及将京尼平和氨基酸在适当条件下反应得天然栀子蓝色素，其特征在于，在β-葡萄糖苷酶催化栀子苷得到京尼平的反应中加入金属酶促进剂；所述金属酶促进剂包括：Fe3+，Zn2+，Cu2+，Co2+，Mn2+；所述金属酶促进剂的加入量为每毫升反应体系中添加金属酶促进剂的量为0.02-0.25μg；所述β-葡萄糖苷酶催化栀子苷反应得到京尼平的步骤包括：向栀子苷溶液中加入β-葡萄糖苷酶液并加入金属酶促进剂，于50-60℃反应30-120min；所述将京尼平和氨基酸在适当条件下反应得天然栀子蓝色素的步骤包括：在反应液中加入氨基酸，在65-85℃反应1-4h；所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、谷氨酸、组氨酸、精氨酸，所述氨基酸的加入量为每毫升反应体系中添加氨基酸37-87mg。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对获得的栀子蓝色素进行分离纯化的步骤。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分离纯化包括将最后的反应液进行干燥。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述干燥的方法包括：加热干燥，真空干燥，以及喷雾干燥。
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