CN105543334B - 一种产β-葡萄糖苷酶微生物的鉴别方法 - Google Patents

一种产β-葡萄糖苷酶微生物的鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产β‑葡萄糖苷酶微生物的鉴别方法。首先将待鉴定微生物接种于含有栀子苷和氨基酸的LB培养基中，培养5～48h，然后观察培养基，若菌落及菌落边缘培养基变为蓝色，则该微生物产生细胞外β‑葡萄糖苷酶；若菌落内侧变为蓝色，则该微生物产生细胞内β‑葡萄糖苷酶；若无显色反应，则该微生物不产生β‑葡萄糖苷酶。本发明方法得到的鉴定结果与经过吸光度测定β‑葡萄糖苷酶的酶活后得到的结果完全相同，并且耗时短，操作简洁，能够通过直观的现象确定微生物是否产生β‑葡萄糖苷酶，并确定胞内或者胞外β‑葡萄糖苷酶，实用性强。

Description

一种产β-葡萄糖苷酶微生物的鉴别方法
技术领域
本发明涉及一种产β-葡萄糖苷酶微生物的鉴别方法，特别涉及一种鉴别微生物产生细胞内或细胞外β-葡萄糖苷酶的方法，属于微生物技术领域。
背景技术
京尼平是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物，作为一种优良的天然生物交联剂，可与蛋白质、胶原、明胶和壳聚糖等交联制作生物材料。京尼平分子内隐含一个戊二醛的结构，能与氨基自发反应生成具有荧光效应的深蓝色产物。
β-葡萄糖苷酶属于纤维素酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分，能够水解β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷酶按其底物特异性可分为三类：第一类是能水解烃基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的酶，可水解纤维二糖、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等；第二类是只能水解烃基-β-葡萄糖苷的酶，可水解纤维二糖等；第三类是只能水解芳香基-β-D葡萄糖苷的酶，可水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等类似物。栀子苷能被β-葡萄糖苷酶水解，产生京尼平。
β-葡萄糖苷酶的鉴定方法主要有电化法、荧光法、分光光度法，目前只能用于鉴定β-葡萄糖苷酶的存在或测定其活性。鉴定微生物中β-葡萄糖苷酶的产酶位点的常用方法是将培养后的菌液离心后取上清测定β-葡萄糖苷酶的酶活，再取菌液离心后的沉淀进行细胞破碎取上清测定酶活，从而确定该微生物产生细胞内或细胞外的β-葡萄糖苷酶，该方法操作过程繁琐。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单快速的产β-葡萄糖苷酶微生物的鉴别方法，以栀子苷为底物，鉴别微生物是否产生β-葡萄糖苷酶及产酶位点位于细胞内或细胞外。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种产β-葡萄糖苷酶微生物的鉴别方法，首先将待鉴定微生物接种于pH值为5.5～8.5、含有1mg/L-10mg/L栀子苷和1mg/L～10mg/L氨基酸的LB培养基中，10～55℃下培养5～48h，然后观察培养基，若菌落及菌落边缘培养基变为蓝色，则该微生物产生细胞外β-葡萄糖苷酶；若菌落内侧变为蓝色，则该微生物产生细胞内β-葡萄糖苷酶；若无显色反应，则该微生物不产生β-葡萄糖苷酶。
优选地，所述的LB培养基的组分为：3g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，5g/L NaCl，15g/L琼脂。
与现有技术相比，本发明能够快速准确地鉴定产β-葡萄糖苷酶微生物及微生物产β-葡萄糖苷酶的位置，本发明操作简洁，能够通过直观的现象确定微生物是否产生β-葡萄糖苷酶，并确定胞内或者胞外β-葡萄糖苷酶。
附图说明
图1为实施例1中的待鉴定微生物的鉴定结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
实施例1
反应体系：首先配制培养基，将酵母粉0.9g、蛋白胨3g、NaCl 1.5g、水300mL混合，并加入栀子苷0.3g和谷氨酸0.3g，调至pH＝8.5，再加入琼脂粉4.5g，在121℃高温灭菌锅中灭菌15min。然后将培养基倒入无菌培养皿中制成平板，冷却。之后在无菌操作环境中将待鉴定微生物接种至培养皿中，在10℃下进行培养22h后，出现菌落及菌落外培养基变为蓝色的菌株、只有菌落变为蓝色和未见显色反应的三种菌株。
将出现菌落及菌落外培养基变为蓝色的菌株接种在LB培养基中进行摇瓶培养。24h后进行离心，待测液为取离心后的100μL上层清液于试管中，加入pNPG100μL，无菌水1mL，在37℃下反应30min，加入0.1M的Na2CO31.5mL。取参比为100μL上层清液于试管中，加入无菌水1.1mL，在37℃下反应30min，加入0.1M的Na2CO31.5mL，在410nm下进行比色测定，测得参比吸光度为0.100，待测液吸光度为0.124。可以断定该上清液中有β-葡萄糖苷酶存在，即出现菌落及菌落外培养基变为蓝色的菌株产生β-葡萄糖苷酶。取离心后的下层沉淀，加入10mL无菌水，进行超声细胞破碎五分钟，离心，取离心后的100μL上层清液于试管中，加入pNPG100μL，无菌水1mL，在37℃下反应30min，加入0.1M的Na2CO31.5mL。取参比为100μL上层清液于试管中，加入无菌水1.1mL，在37℃下反应30min，加入0.1M的Na2CO31.5mL，在410nm下进行比色测定，测参比吸光度为0.625，待测液吸光度为0.620，可以确定该微生物未产生细胞内β-葡萄糖苷酶，即菌落及菌落外围培养基变为蓝色的菌株只在在胞外产生β-葡萄糖苷酶。
同样对只有菌落变为蓝色，未见显色反应的两种微生物进行同样如上培养、测量，测得只有菌落变蓝的微生物胞外待测液透光度为0.205，参比透光度为0.209，可以确定该微生物未产生细胞外β-葡萄糖苷酶，胞内待测液吸光度为0.506，参比吸光度0.590，能确定该微生物产生细胞内β-葡萄糖苷酶，即该微生物只产生细胞内β-葡萄糖苷酶。
测得未见变色反应的微生物胞外待测液透光度为0.152，待测液透光度为0.154，胞内待测液透光度为0.523，参比透光度为0.515，即该微生物不产生β-葡萄糖苷酶。
鉴定结果如图1所示，A图出现的菌落颜色深，菌落周围无颜色，菌落边界明显的菌落产生细胞内β-葡萄糖苷酶；B图中出现的深颜色菌落，菌落周围培养基变色，菌落界限不明显的菌落产生细胞外β-葡萄糖苷酶；A、B图中都出现的浅颜色、菌落及菌落周围培养基都未变色的菌株不产生β-葡萄糖苷酶。
实施例2
反应体系：首先配制培养基，将酵母粉0.9g、蛋白胨3g、NaCl 1.5g、水300mL混合，并加入栀子苷3g和酪氨酸3g，调至pH＝8.5。再加入琼脂粉4.5g，在121℃高温灭菌锅中灭菌15min。然后将培养基倒入无菌培养皿中制成平板，冷却。之后在无菌操作环境中将待鉴定微生物接种至培养皿中，在55℃下进行培养12h后，出现菌落及菌落外围培养基变为蓝色的菌株，只有菌落变为蓝色，未见显色反应的三种菌株。
将菌落及菌落外围培养基变为蓝色的菌株接种在LB培养基中进行摇瓶培养。24h后进行离心，待测液为取离心后的100μL上层清液于试管中，加入pNPG100μL，无菌水1mL，在37℃下反应30min，加入0.1M的Na2CO31.5mL。取参比为100μL上层清液于试管中，加入无菌水1.1mL，在37℃下反应30min，加入0.1M的Na2CO31.5mL，在410nm下进行比色测定，测得参比吸光度为0.201，待测液吸光度为0.150。可以断定该上清液中有β-葡萄糖苷酶存在，即菌落及菌落外围培养基变为蓝色的菌株在胞外产生β-葡萄糖苷酶。取离心后的下层沉淀，加入10mL无菌水，进行超声细胞破碎五分钟，离心，取离心后的100μL上层清液于试管中，加入pNPG100μL，无菌水1mL，在37℃下反应30min，加入0.1M的Na2CO31.5mL。取参比为100μL上层清液于试管中，加入无菌水1.1mL，在37℃下反应30min，加入0.1M的Na2CO31.5mL，在410nm下进行比色测定，测参比吸光度为0.729，待测液吸光度为0.720，可以确定该微生物胞内未产生β-葡萄糖苷酶，即菌落及菌落外围培养基变为蓝色的菌株只产生细胞外β-葡萄糖苷酶。
同样对菌落内侧变为蓝色，未见显色反应的两种微生物进行同样如上培养，测得菌落内侧变蓝的微生物胞外待测液透光度为0.152，参比透光度为0.160，可以确定该微生物不产生细胞内β-葡萄糖苷酶，胞内待测液吸光度为0.434，参比吸光度0.325，能确定该微生物产生细胞内β-葡萄糖苷酶，即该微生物只产生细胞内β-葡萄糖苷酶。
测得未见变色反应的微生物胞外待测液透光度为0.106，待测液透光度为0.099，胞内待测液透光度为0.565，参比透光度为0.551，即该微生物不产生β-葡萄糖苷酶。
实施例3
反应体系：首先配制培养基，将酵母粉0.9g、蛋白胨3g、NaCl 1.5g、水300mL混合，并加入栀子苷1.5g和谷氨酸1.5g，调至PH＝7.0，再加入琼脂粉4.5g，在121℃高温灭菌锅中灭菌15min。然后将培养基倒入无菌培养皿中制成平板，冷却。之后在无菌操作环境中将待鉴定微生物接种至培养皿中，在37℃下进行培养13h后，出现菌落及菌落外围培养基变为蓝色，只菌落变为蓝色，未见显色反应的三种菌株。
将菌落及菌落外围培养基变为蓝色的菌株接种在LB培养基中进行摇瓶培养。24h后进行离心，待测液为取离心后的100μL上层清液于试管中，加入pNPG100μL，无菌水1mL，在37℃下反应30min，加入0.1M的Na2CO31.5mL。取参比为100μL上层清液于试管中，加入无菌水1.1mL，在37℃下反应30min，加入0.1M的Na2CO31.5mL，在410nm下进行比色测定，测得参比吸光度为0.121，待测液吸光度为0.089。可以断定该上清液中有β-葡萄糖苷酶存在，即菌落及菌落外围培养基变为蓝色的菌株在胞外产生β-葡萄糖苷酶。取离心后的下层沉淀，加入10mL无菌水，进行超声细胞破碎五分钟，离心，取离心后的100μL上层清液于试管中，加入pNPG100μL，无菌水1mL，在37℃下反应30min，加入0.1M的Na2CO31.5mL。取参比为100μL上层清液于试管中，加入无菌水1.1mL，在37℃下反应30min，加入0.1M的Na2CO31.5mL，在410nm下进行比色测定，测参比吸光度为0.590，待测液吸光度为0.601，可以确定该微生物未产生细胞内β-葡萄糖苷酶，即及菌落外围培养基变为蓝色的菌株只产生细胞外β-葡萄糖苷酶。
同样对菌落内侧变为蓝色，未见显色反应的两种微生物进行同样如上培养，测得菌落内侧变蓝的微生物胞外待测液透光度为0.211，参比透光度为0.199，可以确定该微生物胞外无β-葡萄糖苷酶，胞内待测液吸光度为0.506，参比吸光度0.602，能确定该微生物细胞内存在β-葡萄糖苷酶，即该微生物只产生细胞内β-葡萄糖苷酶。
测得未见变色反应的微生物胞外待测液透光度为0.127，待测液透光度为0.140，胞内待测液透光度为0.492，参比透光度为0.481，即该微生物不产生β-葡萄糖苷酶。
实施例4
反应体系：首先配制培养基，将酵母粉0.9g、蛋白胨3g、NaCl 1.5g、水300mL混合，并加入栀子苷1.5g和谷氨酸1.5g，调至PH＝5.5，再加入琼脂粉4.5g，在121℃高温灭菌锅中灭菌15min。然后将培养基倒入无菌培养皿中制成平板，冷却。之后在无菌操作环境中将待鉴定微生物接种至培养皿中，在37℃下进行培养16h后，出现菌落及菌落外围培养基变为蓝色变为蓝色，只菌落变为蓝色，未见显色反应的三种菌株。
将菌落及菌落外围培养基变为蓝色的菌株接种在LB培养基中进行摇瓶培养。24h后进行离心，待测液为取离心后的100μL上层清液于试管中，加入pNPG100μL，无菌水1mL，在37℃下反应30min，加入0.1M的Na2CO31.5mL。取参比为100μL上层清液于试管中，加入无菌水1.1mL，在37℃下反应30min，加入0.1M的Na2CO31.5mL，在410nm下进行比色测定，测得参比吸光度为0.109，待测液吸光度为0.055。可以断定该上清液中有β-葡萄糖苷酶存在，即菌落及菌落外围培养基变为蓝色的菌株产生细胞外β-葡萄糖苷酶。取离心后的下层沉淀，加入10mL无菌水，进行超声细胞破碎五分钟，离心，取离心后的100μL上层清液于试管中，加入pNPG100μL，无菌水1mL，在37℃下反应30min，加入0.1M的Na2CO31.5mL。取参比为100μL上层清液于试管中，加入无菌水1.1mL，在37℃下反应30min，加入0.1M的Na2CO31.5mL，在410nm下进行比色测定，测参比吸光度为0.436，待测液吸光度为0.451，可以确定该微生物未产生细胞内β-葡萄糖苷酶，即菌落及菌落外围培养基变为蓝色的菌株只在产生细胞外β-葡萄糖苷酶。
同样对菌落内侧变为蓝色，未见显色反应的两种微生物进行同样如上培养，测得菌落内变蓝的微生物胞外待测液透光度为0.189，参比透光度为0.161，可以确定该微生物未产生胞外β-葡萄糖苷酶，胞内待测液吸光度为0.481，参比吸光度0.599,能确定该微生物产生细胞内β-葡萄糖苷酶，即该微生物只产生细胞内β-葡萄糖苷酶。
测得未见变色反应的微生物胞外待测液透光度为0.099，待测液透光度为0.108，胞内待测液透光度为0.512，参比透光度为0.505，即该微生物不产生β-葡萄糖苷酶。

Claims (2)

1.一种产β-葡萄糖苷酶微生物的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：首先将待鉴定微生物接种于pH值为5.5～8.5、含有1mg/L-10mg/L栀子苷和1mg/L～10mg/L氨基酸的LB培养基中，10～55℃下培养5～48h，然后观察培养基，若菌落及菌落边缘培养基变为蓝色，则该微生物产生细胞外β-葡萄糖苷酶；若菌落内侧变为蓝色，则该微生物产生细胞内β-葡萄糖苷酶；若无显色反应，则该微生物不产生β-葡萄糖苷酶。
2.根据权利要求1所述的产β-葡萄糖苷酶微生物的鉴别方法，其特征在于，所述的LB培养基的组分为：3g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，5g/L NaCl，15g/L琼脂。
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