CN101225404B - 一种用于微生物发酵的复合有机氮源 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可以用于发酵生产的新型复合有机氮源，该复合有机氮源由多种不同的天然氮源复配而成。本发明的复合有机氮源在提供含氮量的同时控制了氮源中对发酵有重要影响的矿物质和维生素的含量，可以有效的保证发酵水平，提高目标组分的含量，而且适用性强。同时也解决了由于工业生产中氮源的产地、生产条件、生产批次的不同而成分会有很大变换所导致的发酵水平波动的问题；此外，由于该复合氮源是由多种不同价格的氮源通过不同比较复配而成，有利于降低成本，所以对于大规模工业化生产是十分有益的。
Description
发明领域
本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种用于微生物发酵的复合有机氮源。
背景技术
有机氮源是发酵培养基中的重要原料，其作用不仅仅是提供氮元素，更重要的是提供微生物生长发育以及产物分泌所需的矿物质和维生素并将其所需的矿物质和维生素维持在合适的范围内，如果矿物质和维生素控制不好，会造成发酵生产的大起大落，因而有机氮源是发酵培养基中对生产影响最重要的成分。
而目前发酵培养基中氮源的设计，一般通过大量的实验选择合适的有机氮源种类、并通过控制其浓度来取得较好的发酵结果，研究工作常常也就停留于此了。但针对有机氮源中控制微生物反应的矿物质和维生素的研究未见报道。这种研究的低水平，客观上造成了无法对有机氮源的供给提出有针对性的品控要求，进而导致由于原材料产地、加工方法等因素的变化，造成对发酵结果的影响。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种用于微生物发酵的复合有机氮源，以利于提高发酵水平以及降低氮源的成本。
本发明的另一个目的在于，提供一种提高微生物发酵水平的方法。
本发明提供的用于微生物发酵的复合有机氮源由多种不同的天然氮源复配而成。
根据本发明，所述天然氮源选自：黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆干粉、生物氮素、花生饼粉、酵母粉、蛋白胨、鱼粉、大豆生物营养素、鸡毛粉。
根据本发明，所述天然氮源的复配是基于天然氮源中矿物质和维生素的含量。其中：
所述矿物质包括：K+，Co2+，Na+，Zn2+，Cu2+，Mg2+，Fe2+，Mn2+，其浓度分别如下：
| K<sup>+</sup> | Co<sup>2+</sup> | Na<sup>+</sup> | Zn<sup>2+</sup> | Cu<sup>2+</sup> | Mg<sup>2+</sup> | Fe<sup>2+</sup> | Mn<sup>2+</sup> |
| 0.43-23.05mg/g | ＜0.196mg/g | ＜22.93mg/g | ＜0.34mg/g | ＜235mg/g | ＜54.53mg/g | ＜10.82mg/g | ＜0.464mg/g |
所述维生素包括：维生素B1、B2、B6、B12，烟酸，叶酸，泛酸，生物素，脂溶性维生素A、D、E、K，维生素C，其浓度分别如下：
| B族维生素 | 烟酸 | 叶酸 | 泛酸 | 生物素 | 维生素A、D、E、K | Vc |
| 0.02-4.75mg/g | ＜4.34mg/g | ＜1.41mg/g | ＜1.72mg/g | ＜1.68mg/g | ＜3.98mg/g | ＜5.91mg/g |
本发明的提高微生物发酵水平的方法是采用由多种不同的天然氮源复配而成的复合有机氮源作为发酵培养基中的氮源。
在本发明的实施例中，所述复合有机氮源用于多种微生物菌株的发酵，包括克雷伯肺炎杆菌、黑曲霉、以及红霉素链霉菌，结果显示，这些菌株的发酵水平和发酵液中目标产物的含量均有了显著的提高，从而证明了本发明的复合有机氮源的适用性。
本发明的复合有机氮源，由于在提供含氮量的同时控制了氮源中对微生物发酵有重要影响的矿物质和维生素的含量，从而可以有效的保证发酵水平，提高目标产物的含量，而且具有很好的适用性；同时也解决了由于工业生产中由于氮源的产地、生产条件、生产批次的不同引起的成分的变化而导致的发酵水平波动的问题，可用于对有机氮源的供给有针对性的进行品质控制；此外，该复合氮源是由多种不同氮源通过复配而成，有利于降低氮源的成本，所以对于大规模工业化生产是十分有益的。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
以下实施例中，用于配制复合有机氮源的各种单一氮源的来源如下：
生物氮素：蚌埠安加生物科技有限公司；
棉籽饼粉：北京中棉紫光生物科技公司；
玉米浆干粉：上海西王淀粉糖有限公司；
黄豆饼粉：河南驻马店天方制药有限公司；
鸡毛粉：临沂市河东区金鹏饲料厂；
酵母粉(进口)：上海化学试剂采购供应站中心化工厂；
酵母粉(国产)：江苏如东绿奇生物工程有限公司；
蛋白胨(进口)：上海化学试剂采购供应站中心化工厂；
蛋白胨(国产)：上海化学试剂采购供应站中心化工厂。
以下实施例中，所使用的检测方法如下：
矿物质含量测定：精确称取0.5g样品于250ml凯氏烧瓶，加10ml硝酸，0.5ml高氯酸，过夜，低温消化，至近干，冷却，加2.5ml硝酸和少量水溶解固体，定容50ml。然后通过原子吸收进行测定。
维生素含量测定：采用HPLC测定，具体条件为：色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18柱(5um，200×4.6mm)；流动相：甲醇∶水(含己烷磺酸钠PIC-B6为5mmol/L，冰醋酸1％，并且用三乙胺调pH3.2)＝30∶70；流速：1ml/min，紫外检测波长：275nm、0.04AUFS，拄温：40℃，进样量：10μl，内标物：苯甲酸。
红霉素效价的测定：将发酵液离心，8000rpm，离心10min后，取上清液0.25ml，加入4.75ml水，取稀释后的溶液0.4ml，加入10M H3PO4 4.6ml。在沸水浴中水浴3min，然后在冷水浴中冷却10min。测OD 485的吸光值，对照标准曲线，计算红霉素效价。
红霉素A组分的测定：采用高效液相色谱(HPLC)测定，色谱条件为：C18反相柱，柱温为35℃；检测器为UV 238nm；流动相：将真空抽滤过0.22um的微孔膜的0.05mol/LKH2PO4溶液按68∶32的体积比与乙睛(色谱纯)混合，超声脱气后即为流动相，其流速为1.0ml/min；进样体积为10μL。
克雷伯肺炎杆菌的菌液浓度测定：以去离子水为空白对照，620nm测光吸收值。
甘油浓度测定：用高碘酸钠氧化法滴定。
克雷伯肺炎杆菌As 1.1526发酵产物(1，3-丙二醇)测定步骤如下：参考厂商提供的使用手册，采用GC112A型气相色谱测定，色谱柱采用毛细管柱AT SE-54 30m×0.53mm×1.0μm，FID检测器，用N2作为载气，流速为15ml/min，柱温120℃，检测器温度250℃，进样量0.15μL。
黑曲霉As 3.86发酵产物β-葡萄糖苷酶的酶活测定步骤如下：移取0.25ml醋酸水杨苷溶液(0.5％水杨苷，0.1M醋酸)、0.02ml过滤后的酶液和0.73ml蒸馏水至1ml的小离心管中；把小离心管放入水浴锅中，60℃水浴10min，取出后立即用生物传感分析仪测定葡萄糖量；取0.25ml醋酸水杨苷加0.75ml水作为空白对照，酶活计算公式：酶活＝X(生物传感分析仪显示的数字)×16.67。
实施例1、复合有机氮源的制备
1.1、用于红霉素链霉菌As 4.1245发酵的复合有机氮源的制备
按表1.1所示的配方(重量百分比％，下同)，分别取不同的氮源，粉碎并混合均匀，制得用于红霉素链霉菌As 4.1245发酵的复合有机氮源，分别命名为复合有机氮源1-1～1-3。
表1.1、复合有机氮源配方
| 复合氮源 | 氮源及含量 | 氮源及含量 | 氮源及含量 | 氮源及含量 |
| 1-1 | 棉籽饼粉15.16％ | 玉米浆干粉2.87％ | 黄豆饼粉16.39％ | 生物氮素65.58％ |
| 1-2 | 酵母粉(进口)15.95％ | 玉米浆干粉7.33％ | 鸡毛粉8.62％ | 蛋白胨(进口)68.1％ |
| 1-3 | 酵母粉(国产)2.3％ | 蛋白胨(国产)2.3％ | 棉籽饼粉6.9％ | 生物氮素88.5％ |
对上述获得的复合有机氮源1-1～1-3中的K+、Co2+、Fe2+、Na+、VB 6、烟酸、叶酸以及泛酸的量进行检测，结果如表1.2所示。
表1.2、复合氮源中矿物质及维生素的含量(mg/g复合氮源，下同)
| 氮源 | K<sup>+</sup> | Co<sup>2+</sup> | Fe<sup>2+</sup> | Na<sup>+</sup> | VB 6 | 烟酸 | 叶酸 | 泛酸 |
| 1-1 | 16.763mg/g | 0.032mg/g | 0.024mg/g | 0.187mg/g | 1.592mg/g | 0.025mg/g | 0.595mg/g | 0.444mg/g |
| 1-2 | 0.433mg/g | 0.196mg/g | 10.822mg/g | 22.934mg/g | 0.025mg/g | 1.493mg/g | 0.039mg/g | 1.718mg/g |
| 1-3 | 10.693mg/g | 0.057mg/g | 7.054mg/g | 10.463mg/g | 0.624mg/g | 0.684mg/g | 1.414mg/g | 0.045mg/g |
1.2、用于红霉素链霉菌IAA-177发酵的复合有机氮源的制备
按表2.1所示的比例，分别取不同的氮源，粉碎并混合均匀，制得用于红霉素链霉菌IAA-177发酵的复合有机氮源，分别命名为复合有机氮源2-1～2-3。
表2.1、复合有机氮源配方
| 复合氮源 | 氮源及含量 | 氮源及含量 | 氮源及含量 | 氮源及含量 |
| 2-1 | 酵母粉(国产)5.4％ | 玉米浆干粉2.7％ | 棉籽饼粉8.11％ | 鸡毛粉83.79％ |
| 2-2 | 棉籽饼粉2.08％ | 蛋白胨(国产)7.08％ | 黄豆饼粉15.83％ | 生物氮素75.01％ |
| 2-3 | 棉籽饼粉17.84％ | 玉米浆干粉16.43％ | 鸡毛粉39.91％ | 生物氮素25.82％ |
对上述获得的有机氮源2-1～2-3中的Cu2+、K+、Co2+、Mn2+、烟酸、VB1、VB2、生物素的量进行检测，结果如表2.2所示。
表2.2、复合氮源中矿物质及维生素的含量
| 氮源 | Cu<sup>2+</sup> | K<sup>+</sup> | Co<sup>2+</sup> | Mn<sup>2+</sup> | 烟酸 | VB1 | VB2 | 生物素 |
| 2-1 | 0.139mg/g | 5.35mg/g | 0.024mg/g | 0.464mg/g | 0.848mg/g | 0.562mg/g | 1.12mg/g | 0.582mg/g |
| 2-2 | 0.015mg/g | 13.45mg/g | 0.004mg/g | 0.258mg/g | 0.025mg/g | 0.025mg/g | 0.02mg/g | 0.029mg/g |
| 2-3 | 0.058mg/g | 6.38mg/g | 0.018mg/g | 0.157mg/g | 1.733mg/g | 1.678mg/g | 1.71mg/g | 1.675mg/g |
1.3、用于克雷伯肺炎杆菌As 1.1526发酵的复合有机氮源的制备
按表3.1所示的比例，分别取不同的氮源，粉碎并混合均匀，制得用于克雷伯肺炎杆菌As 1.1526发酵的复合有机氮源，分别命名为复合有机氮源3-1～3-3。
表3.1、复合有机氮源配方
| 复合氮源 | 氮源及含量 | 氮源及含量 | 氮源及含量 | 氮源及含量 |
| 3-1 | 棉籽饼粉24.65％ | 玉米浆干粉6.34％ | 黄豆饼粉16.2％ | 生物氮素52.81％ |
| 3-2 | 鱼粉38.92％ | 大豆生物营养素19.17％ | 黄豆饼粉2.99％ | 鸡毛粉38.92％ |
| 3-3 | 蛋白胨(国产)21.4％ | 鸡毛粉41.4％ | 玉米浆干粉11.63％ | 棉籽饼粉25.57％ |
对上述获得的有机氮源3-1～3-3中的Cu2+、K+、Zn2+、VB12、维生素A、D、E、K的量进行检测，结果如表3.2所示。
表3.2、复合氮源中矿物质及维生素的含量
| 氮源 | Cu<sup>2+</sup> | K<sup>+</sup> | Zn<sup>2+</sup> | VB12 | 维生素A | 维生素D | 维生素E | 维生素K |
| 3-1 | 0.235mg/g | 7.39mg/g | 0.03mg/g | 0.03mg/g | 0.06mg/g | 0.06mg/g | 0.17mg/g | 0.25mg/g |
| 3-2 | 0.027mg/g | 23.05mg/g | 0.34mg/g | 0.41mg/g | 3.63mg/g | 3.98mg/g | 3.75mg/g | 3.53mg/g |
| 3-3 | 0.056mg/g | 7.07mg/g | 0.11mg/g | 1.44mg/g | 1.09mg/g | 0.97mg/g | 1.46mg/g | 0.88mg/g |
1.4、用于黑曲霉As 3.86发酵的复合有机氮源的制备
按表4.1所示的比例，分别取不同的氮源，粉碎并混合均匀，制得用于黑曲霉As 3.86发酵的复合有机氮源，分别命名为复合有机氮源4-1～4-3。
表4.1、复合有机氮源配方
| 复合氮源 | 氮源及含量 | 氮源及含量 | 氮源及含量 | 氮源及含量 |
| 4-1 | 鸡毛粉39.13％ | 玉米浆干粉9.57％ | 蛋白胨(国产)29.57％ | 生物氮素21.73％ |
| 4-2 | 大豆生物营养素37.5％ | 鱼粉14.06％ | 黄豆饼粉18.75％ | 鸡毛粉29.69％ |
| 4-3 | 蛋白胨(进口)5.05％ | 鸡毛粉35.35％ | 玉米浆干粉34.34％ | 黄豆饼粉25.26％ |
对上述获得的有机氮源4-1～4-3中的Cu2+，K+，Zn2+，Mg2+，VB 6，VB12，烟酸，维生素C的量进行检测，结果如表4.2所示。
表4.2、复合氮源中矿物质及维生素的含量
| 氮源 | Cu<sup>2+</sup> | K<sup>+</sup> | Zn<sup>2+</sup> | Mg<sup>2+</sup> | VB 6 | Vb12 | 烟酸 | 维生素C |
| 4-1 | 0.09mg/g | 13.2mg/g | 0.063mg/g | 0.48mg/g | 1.43mg/g | 1.88mg/g | 2.65mg/1g | 0.18mg/g |
| 4-2 | 0.21mg/g | 18.4mg/g | 0.245mg/g | 54.53mg/g | 3.55mg/g | 4.75mg/g | 4.34mg/g | 5.91mg/g |
| 4-3 | 0.14mg/g | 8.7mg/g | 0.125mg/g | 25.86mg/g | 0.89mg/g | 0.32mg/g | 0.48mg/g | 3.69mg/g |
实施例2、复合有机氮源用于菌种发酵
2.1、复合有机氮源1-1～1-3用于红霉素链霉菌As 4.1245的发酵
2.1.1、培养基制备
种子培养基：3.5g淀粉，3.5g糊精，3.0g黄豆饼粉，0.5g葡萄糖，0.6g硫酸铵，0.5g碳酸钙，豆油0.2ml，定容至100ml。
对照发酵培养基：4.5g淀粉，0.8g硫酸铵，0.9g碳酸钙，豆油0.8ml，4.0g黄豆饼粉，定容至100ml。
复配发酵培养基1-1～1-3：4.5g淀粉，0.8g硫酸铵，0.9g碳酸钙，0.8ml豆油，3.8g复合有机氮源1-1、1-2或1-3，定容至100ml。
经计算，按上述配方配制成的复配发酵培养基中K+、Co2+、Fe2+、Na+、VB6、烟酸、叶酸、泛酸的量分别如表1.3所示，1L对照发酵培养基中的有机氮源的成本和复配发酵培养基1.1-1.3中的有机氮源的成本分别为0.144元和0.068元、0.107元、0.109元。
表1.3、培养基中矿物质和维生素含量
| K<sup>+</sup> | Co<sup>2+</sup> | Fe<sup>2+</sup> | Na<sup>+</sup> | VB 6 | 烟酸 | 叶酸 | 泛酸 | |
| 发酵培养基1.1 | 40.9mg/100ml | 0.005mg/l | 0.2mg/100ml | 0.5mg/100ml | 3.88mg/100ml | 0.05mg/100ml | 1.45mg/100ml | 1.08mg/100ml |
| 发酵培养基1.2 | 1.0mg/100ml | 0.455mg/l | 25.1mg/100ml | 53.2mg/100ml | 0.06mg/100ml | 3.46mg/100ml | 0.09mg/100ml | 3.96mg/100ml |
| 发酵培养基1.3 | 23.2mg/100ml | 0.124mg/l | 15.3mg/100ml | 22.7mg/100ml | 1.35mg/100ml | 1.48mg/100ml | 3.06mg/100ml | 0.09mg/100ml |
2.1.2、发酵培养及检测
取红霉素链霉菌As 4.1245菌种加入种子培养基中，220rpm，32℃培养48h，制得种子液。
分别取25ml对照和复配发酵培养基，分别装于250ml的三角瓶中，并各自加入1.25ml种子液，然后在220rpm，32℃下，发酵培养144h，分别获得红霉素的对照和复配发酵液。
分别取获得的发酵液，进行效价测定和组分测定(8000rpm，离心10min，0.45um滤膜过滤后进行测定)，测定结果显示对照实验的效价为4500U/ml，A组分含量为84％，复配实验的效价分别为4800U/ml、4650U/ml、4930U/ml，A组分含量为90％、85％、87％，根据该结果，采用复配培养基培养获得的发酵液中红霉素A的效价和组分含量均有增加，并且其中的有机氮源成本与对照培养基中的有机氮源的成本相比分别降低了53％、36％、34％。
2.2、复合有机氮源2-1～2-3用于红霉素链霉菌IAA-177的发酵
2.2.1、培养基制备
种子培养基：2.5g淀粉，2.5g糊精，1.8g黄豆饼粉，1.3g玉米浆，0.12g硫酸铵，0.6g碳酸钙，0.12g硫酸铵，0.3g氯化钠，0.12g硝酸铵，0.2ml豆油，定容至100ml。
对照发酵培养基：3g淀粉，4g糊精，0.2g硫酸铵，0.6g碳酸钙，3.0g黄豆饼粉，0.8ml豆油，定容至100ml。
复配发酵培养基：3g淀粉，4g糊精，0.2g硫酸铵，0.6g碳酸钙，3.6g复合有机氮源2-1、2-2或2-3，0.8ml豆油，定容至100ml。
经计算，按上述配方配制成的复配发酵培养基中Cu2+、K+、Co2+、Mn2+、烟酸、VB1、VB2、生物素的量分别如表2.3所示，1L对照发酵培养基中的有机氮源的成本和复配发酵培养基2-1～2-3中的有机氮源的成本分别为0.144元和0.072元、0.11元、0.0798元。
表2.3、培养基中矿物质和维生素含量
| Cu<sup>2+</sup> | K<sup>+</sup> | Co<sup>2+</sup> | Mn<sup>2+</sup> | 烟酸 | VB1 | VB2 | 生物素 | |
| 发酵培养基2.1 | 2.58mg/l | 9.9mg/100ml | 0.44mg/l | 8.58mg/l | 1.56mg/100ml | 0.96mg/100ml | 2.08mg/100ml | 1.05mg/100ml |
| 发酵培养基2.2 | 0.35mg/l | 32.2mg/100ml | 0.02mg/l | 0.06mg/l | 0.06mg/100ml | 0.06mg/100ml | 0.05mg/100ml | 0.07mg/100ml |
| 发酵培养基2.3 | 1.24mg/l | 13.6mg/100ml | 0.01mg/l | 3.35mg/l | 3.68mg/100ml | 3.55mg/100ml | 3.66mg/100ml | 3.55mg/100ml |
2.2.2、发酵培养及检测
取红霉素链霉菌IA A-177菌种加入种子培养基中，220rpm，32℃培养48h，制得种子液。
分别取25ml对照和复配发酵培养基，分别装于250ml的三角瓶中，并各自加入1.25ml种子液，然后在220rpm，32℃下，发酵培养120h，加入50％的正丙醇0.5ml，分别获得红霉素的对照和复配发酵液。
分别取获得的2种发酵液，进行效价测定和组分测定，测定结果显示对照实验的效价为4520U/ml，A组分含量为81.5％，复配实验的效价为5150U/ml、4950U/ml、5300U/ml，A组分含量为91.5％、79.3％、83.2％，根据该结果，采用复配培养基培养获得的发酵液中红霉素A的效价和组分含量均明显增加，并且有机氮源的成本与对照培养基中的有机氮源的成本相比降低了50.2％、23.3％、44.6％。
2.3、复合有机氮源3-1～3-3用于克雷伯肺炎杆菌As 1.1526的发酵
2.3.1、培养基制备
种子培养基(g/L)：K2HPO4·3H2O 7.0，(NH4)2SO4 1.0，KH2PO4 2.0，MgCl2·6H2O0.1，酵母膏7.0，pH7.0。
对照实验发酵培养基(g/L)：KCl 0.75，NaH2PO4·2H2O 1.3，(NH4)2SO4 5.35，Na2SO40.28，MgSO4·7H2O 0.26，柠檬酸0.42，酵母膏2.0，pH7.0。
复配实验发酵培养基(g/L)：KCl 0.75，NaH2PO4·2H2O 1.3，(NH4)2SO4 5.35，Na2SO40.28，MgSO4·7H2O 0.26，复合有机氮源3-1、3-2或3-3，柠檬酸0.42，pH7.0。
经计算，按上述配方配制成的复配发酵培养基中Cu2+、K+、Zn2+、VB12、维生素A、D、E、K的含量分别如表3.3所示，1L对照发酵培养基中的有机氮源的成本和复配发酵培养基中的有机氮源的成本分别为0.036元和0.0198元、0.022元、0.0212元。
表3.3、培养基中矿物质和维生素含量
| Cu<sup>2+</sup> | K<sup>+</sup> | Zn<sup>2+</sup> | VB12 | 维生素A | 维生素D | 维生素E | 维生素K | |
| 发酵培养基3.1 | 3.34mg/l | 85.5mg/100ml | 0.45mg/l | 0.45mg/100ml | 0.09mg/100ml | 0.08mg/100ml | 0.24mg/100ml | 0.35mg/100ml |
| 发酵培养基3.2 | 0.45mg/l | 113.5mg/100ml | 5.76mg/l | 0.68mg/100ml | 6.06mg/100ml | 6.65mg/100ml | 6.26mg/100ml | 5.89mg/100ml |
| 发酵培养基3.3 | 1.09mg/l | 90.2mg/100ml | 2.36mg/l | 3.09mg/100ml | 2.35mg/100ml | 2.08mg/100ml | 3.02mg/100ml | 1.89mg/100ml |
2.3.2、发酵培养及检测
取克雷伯肺炎杆菌As 1.1526菌种加入种子培养基中，37℃，200rpm厌氧培养24h，制得种子液。
向5L全自动发酵罐(购自上海国强生化装备有限公司)中分别加入2L对照和复配实验发酵培养基进行发酵培养，接种量2.5％，初始甘油浓度控制在40g/L，发酵温度为37℃，pH控制在7.0，过程流加甘油控制发酵液中残留的甘油浓度，发酵时间30h，分别获得克雷伯肺炎杆菌KG1的对照和复配发酵液。
取2种克雷伯肺炎杆菌As 1.1526发酵液，分别测定1，3-丙二醇，检测结果显示，对照实验获得的发酵液中1，3-丙二醇浓度为52g/l，复配实验获得的发酵液中的1，3-丙二醇浓度为58g/l、56g/l、61g/l，根据该结果，复配实验获得的发酵液中的1，3-丙二醇浓度提高约11.5％，并且其中的有机氮源的成本与对照培养基中的有机氮源的成本相比降低了大约45％、39％、41％。
2.4、复合有机氮源4-1～4-3用于黑曲霉As 3.86的发酵
2.4.1、培养基制备
种子培养基配方：20g可溶性淀粉，10g葡萄糖，1g KH2PO4，1g MgSO4，2g NaNO3，5g酵母膏，pH4，定容至1L。
对照发酵培养基配方：2g KH2PO4，0.2g MgSO4·7H2O，1.6g(NH4)2SO4，麸皮为装液量的3％，pH6，定容至1L。
复配发酵培养基配方：2g KH2PO4，0.2g MgSO4·7H2O，1.6g(NH4)2SO4，4.35g复合有机氮源4-1，4-2或者4-3，pH6，定容至1L。
经计算，按上述配方配制成的复配发酵培养基中Cu2+、K+、Zn2+、Mg2+、VB6、VB12、烟酸、维生素C的含量分别如表4.3所示，1L对照发酵培养基中的有机氮源的成本和复配发酵培养基中的有机氮源的成本分别为0.0042元和0.0038元、0.0045元、0.0037元。
表4.3、培养基中矿物质和维生素含量
| Cu<sup>2+</sup> | K<sup>+</sup> | Zn<sup>2+</sup> | Mg<sup>2+</sup> | VB6 | VB12 | 烟酸 | 维生素C | |
| 发酵培养基4.1 | 1.05mg/l | 215.2mg/100ml | 0.72mg/l | 20.6mg/100ml | 1.65mg/100ml | 2.16mg/100ml | 3.05mg/100ml | 0.12mg/100ml |
| 发酵培养基4.2 | 2.65mg/l | 223.5mg/100ml | 3.12mg/l | 89.8mg/100ml | 4.55mg/100ml | 6.08mg/100ml | 5.55mg/100ml | 7.56mg/100ml |
| 发酵培养基4.3 | 1.35mg/l | 208.6mg/100ml | 1.24mg/l | 45.6mg/100ml | 0.88mg/100ml | 0.32mg/100ml | 0.48mg/100ml | 3.66mg/100ml |
2.4.2、发酵培养及检测
取黑曲霉As 3.86菌种加入种子培养基中，接种量约为孢子数2.0×108，30℃，200rpm培养44h，制得种子液。
分别取15ml对照和复配发酵培养基，分别装于250ml的三角瓶中，并各自加入750μl种子液，然后在200rpm，30℃下，发酵培养72h，分别获得黑曲霉As 3.86的对照和复配发酵液。
分别取黑曲霉As 3.86的对照和复配发酵液，测定发酵液中的酶活，测定结果显示，对照实验获得的发酵液中的酶活为185U/ml，复配实验获得的发酵液中的酶活为210U/ml、19gU/ml、205U/ml，根据该结果，复配实验获得的发酵液中的酶活分别提高了约36.6％、25.5％、30.2％，并且成本与对照培养基的成本大致相同。
综上所述，同现在通常使用的有机氮源相比，本发明提供的复合有机氮源，由于在提供含氮量的同时控制了氮源中对发酵有重要影响的矿物质和维生素的含量，因而可以有效的保证发酵水平，提高目标产物的含量，而且对于不同的微生物均具有较好的适用性；同时也解决了由于工业生产中氮源的产地、生产条件、生产批次的不同而成分会有很大变换所导致的发酵水平波动的问题；此外，本发明的复合氮源由多种不同价格的氮源通过不同比较复配而成，相比使用单一的氮源有利于降低氮源的成本，所以对于大规模工业化生产是十分有益的。
Claims (4)
1.一种用于微生物发酵的复合有机氮源，其特征在于，该复合有机氮源是基于天然氮源中矿物质和维生素的含量复配而成，按重量百分比计由24.65％棉籽饼粉、6.34％玉米浆干粉、16.2％黄豆饼粉、52.81％生物氮素组成，对其中的Cu2+，K+，Zn2+，VB12，维生素A、D、E、K的量进行检测，其含量分别为0.235mg/g、7.39mg/g、0.03mg/g、0.03mg/g、0.06mg/g、0.06mg/g、0.17mg/g、0.25mg/g。
2.一种提高微生物发酵水平的方法，其特征在于，微生物发酵培养基中的氮源采用如权利要求1所述的复合有机氮源，所述微生物为克雷伯肺炎杆菌As1.1526。
3.一种用于微生物发酵的复合有机氮源，其特征在于，该复合有机氮源是基于天然氮源中矿物质和维生素的含量复配而成，按重量百分比计由39.13％鸡毛粉、9.57％玉米浆干粉、29.57％蛋白胨、21.73％生物氮素组成，对其中的Cu2+，K+，Zn2+，Mg2+，VB6，VB12，烟酸，维生素C的量进行检测，其含量分别为0.09mg/g、13.2mg/g、0.063mg/g、0.48mg/g、1.43mg/g、1.88mg/g、2.65mg/g、0.18mg/g。
4.一种提高微生物发酵水平的方法，其特征在于，微生物发酵培养基中的氮源采用如权利要求3所述的复合有机氮源，所述微生物为黑曲霉As3.86。
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