CN105061617B - 一种桃胶多糖的提取工艺及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桃胶多糖的提取工艺及其应用。本发明采用水提醇沉、Sevage试剂去蛋白、透析、以DEAE纤维素为填料过柱等步骤制备得到了更加精细的多糖PGPSD。该多糖PGPSD在常温下能溶于水，由阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖通过糖苷键连接。本发明制备的桃胶多糖PGPSD能增强胰岛素相关转录因子和葡萄糖降解关键酶的表达，对小鼠无毒害作用，能显著降低糖尿病小鼠的血糖。

Description

一种桃胶多糖的提取工艺及其应用

技术领域

本发明属于植物多糖领域和生物医药领域，更具体地，涉及一种桃胶多糖的提取工艺及其应用。

背景技术

桃胶是桃树(Prunus persica(L)Batsch)或山桃(Prunus davidiana)感染流胶病后从主干，主枝，侧枝和果实等部位分泌出来的树脂。桃流胶病在我国南方发生普遍，严重影响了果园产量和果实品质。桃胶90％以上成分都是多糖，该多糖由阿拉伯糖，木糖，甘露糖，半乳糖和糖醛酸以糖苷键连接。桃胶多糖在医药，印染，贮藏保鲜等行业的作用被逐渐挖掘并应用，拥有巨大的生产价值。

但至今，桃胶多糖的提取比较粗放，没有一个公认的可以应用产业化生产的工艺。例如，徐燕等只是经高温溶解，Sevage法去除蛋白质，乙醇沉淀，浓缩等化学处理来提取桃胶多糖，骆峰等用生物酶酶解去除蛋白质，低温溶解来制备桃胶多糖，李风月课题组使用微波助溶来提取多糖成分。然而现有技术中多糖得取率较低，得到的大多是粗多糖，混有小分子或其他物质，只能用于化工印染等领域，不能应用于食品，保健品和医药领域。因此有必要对桃胶多糖的提取工艺进行改良和细化。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种桃胶多糖的提取工艺及其应用，其目的在于通过细化桃胶多糖的提取步骤，得到了一种高收率且纯度高的桃胶多糖PGPSD，由此解决以往桃胶提取物桃胶多糖含有大量杂质、应用领域窄、难以产业化生产以及无法满足药品应用要求的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种桃胶多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)将天然桃胶去杂质，并将其与水溶胀后得混悬液，将混悬液加热溶解，过滤、离心后得上清液；

(2)将所得上清液浓缩，醇沉得沉淀；将沉淀用水溶解，纯化，褪色，浓缩后干燥得到桃胶粗多糖；

(3)将桃胶粗多糖配置成质量体积比为5％-12％溶液，过DEAE-52纤维素柱，用0.3mol/L-0.7mol/L的无机盐离子水溶液或磷酸盐缓冲液洗脱，收集多糖溶液；将收集到的多糖溶液用水透析后，真空冷冻干燥，即得所述桃胶多糖。

优选地，步骤(1)中的溶胀按0.5-1.5:100的料液比来实现。

优选地，步骤(2)将所得沉淀用水溶解，至溶液均一透明；随后的纯化采用Sevage法来实现，具体步骤为：向粗多糖水溶液中加入同体积的Sevage试剂，除去蛋白质，重复上述步骤，直至中间层澄清。

优选地，步骤(2)中的醇沉的步骤为：将浓缩的多糖溶液倒入3-4倍体积的无水乙醇中。

优选地，步骤(3)中的桃胶粗多糖溶液的质量体积比优选为10％；无机盐离子水溶液优选为氯化钠溶液或氯化钾溶液。

优选地，步骤(3)中透析2d-5d，透析袋截留分子量为10000-20000。

优选地，步骤(3)中DEAE纤维素柱中填料上柱前需使用氢氧化钠和盐酸的反复浸泡洗涤。

本发明的另一个方面提供了一种由所述的制备方法得到的桃胶多糖，该桃胶多糖PGPSD由阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖通过糖苷键连接。

优选地，该桃胶多糖常温下能溶于水。

本发明的再一个方面提供了一种上述桃胶多糖在制备降血糖药物中的应用。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

(1)本发明在以往水提醇沉多糖的基础上，加之以DEAE纤维素为填料过柱、透析等生产工艺，能够确保得到高纯度的桃胶多糖PGPSD，本发明的桃胶多糖PGPSD由阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖通过糖苷键连接。本发明的桃胶多糖制备方法较之其他已有的方法更为精细，制备得到的多糖纯度更高，且能完全溶解于水中。

(2)本发明的制备方法中各个步骤相扣，通过对制备方法中各个步骤和各个参数的进一步优化，使得本发明的桃胶多糖的损失更小，产率更高，纯度更高。

(3)相比于桃胶原液和市场药物二甲双胍，本发明的桃胶多糖能更好地增强胰岛素相关转录因子和葡萄糖降解关键酶的表达，无毒害作用，且能帮助受损器官有效地恢复，缓解病情，能显著降低血糖，将其作为药物或保健品进行开发，有很大的潜在价值，也能在一定程度上减少由流胶病引起的经济损失。

附图说明

图1是本发明制备得到的桃胶多糖PGPSD的红外光谱图。

图2(a)是本发明制备得到的桃胶多糖PGPSD的气相图谱。

图2(b)为标准样品图，其中Rha：鼠李糖；Ara：阿拉伯糖；Xyl：木糖；Tre：海藻糖；Man：甘露糖；Glu：葡萄糖；Gal：半乳糖。

图3(a)是本发明制备得到的桃胶多糖PGPSD，桃胶原液及药物二甲双胍及对糖尿病小鼠血糖的影响。

图3(b)是本发明制备得到的桃胶多糖PGPSD，桃胶原液及药物二甲双胍及对糖尿病小鼠体重的影响。

图3(c)是本发明制备得到的桃胶多糖PGPSD，桃胶原液及药物二甲双胍及对糖尿病小鼠饮水量的影响。

图4(a)是本发明制备得到的桃胶多糖PGPSD，桃胶原液及药物二甲双胍对小鼠胰岛Insulin表达的影响。

图4(b)是本发明制备得到的桃胶多糖PGPSD，桃胶原液及药物二甲双胍对小鼠胰岛PDX-1表达的影响。

图4(c)是本发明制备得到的桃胶多糖PGPSD，桃胶原液及药物二甲双胍对小鼠胰岛己糖激酶(HK)表达的影响。

图5(a)是本发明制备得到的桃胶多糖PGPSD，桃胶原液及药物二甲双胍对糖尿病小鼠胰岛的影响。

图5(b)是本发明制备得到的桃胶多糖PGPSD，桃胶原液及药物二甲双胍对糖尿病小鼠胰岛肾脏的影响。

图5(c)是本发明制备得到的桃胶多糖PGPSD，桃胶原液及药物二甲双胍对糖尿病小鼠胰岛肝脏的影响。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

按照本发明的一个方面，提供了一种桃胶多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将天然桃胶去杂质，并将其与水按料液比0.5-1.5:100溶胀后得混悬液，将混悬液加热溶解，过滤、离心后得上清液；温度优选为90-100℃；

(2)将上清液浓缩，乙醇醇沉得沉淀，将所述沉淀用水溶解，纯化，取上清液，褪色，浓缩后干燥得到桃胶粗多糖；

(3)将桃胶粗多糖配置成质量体积比为5％-12％水溶液，过DEAE纤维素柱，用0.3mol/L-0.7mol/L的水溶剂洗脱液洗脱，上柱后10-16小时内收集多糖溶液；

(4)将收集到的多糖溶液用水透析2d-5d后，真空冷冻干燥，即得所述桃胶多糖。

其中，步骤(1)中，采桃胶时，一般选择新流出的表面比较干净的胶体，避免选择表面杂质较多已经干燥的胶体，将所采胶体用手术刀切成小块或片状进行过夜溶胀。过夜溶胀后溶解效率更高。

其中，步骤(1)中，过滤用纱布过滤；由于桃胶溶液黏度很高且有未完全溶解的胶体，用纱布过滤时，每隔一段时间需要将纱布上的杂质去掉，清洗纱布，再继续过滤。离心速率为2000rpm/min-5000rpm/min，优选为3000rpm/min。

其中，步骤(2)中的纯化采用Sevage法来实现，该纯化的具体步骤为：向粗多糖水溶液中按体积比1:1加入Sevage试剂(氯仿正丁醇混合液)，剧烈震荡，离心，分去水相和有机相交界处中间层中的变性蛋白质，重复上述步骤，直至中间层澄清。其中，氯仿和正丁醇体积比优选4:1。

其中，步骤(2)中的醇沉的步骤为：将浓缩的多糖溶液倒入3-4倍体积的无水乙醇中；步骤(2)中用30％H₂O₂褪色。

其中，步骤(3)中的桃胶粗多糖溶液的浓度优选为10％；洗脱液优选为无机盐离子水溶液或磷酸盐缓冲液，其中，无机盐离子水溶液优选为氯化钠溶液或氯化钾溶液；洗脱液的浓度更优选0.5mol/L。

其中，步骤(3)中利用填料DEAE纤维素过柱分离桃胶多糖，该填料为二乙氨乙基纤维素，是弱酸型阴离子交换剂，本发明实施例中选用的填料柱为DEAE-52纤维素，所选层析柱子为上海厦美生物科技发展有限公司生产，(1.5cm×70cm)，洗脱液优选为0.5mmol/LNaCl溶液，每8min-12min收集一管，上柱后10-16小时内收集多糖。硫酸蒽酮法检测每管的糖含量，确定是否分离到多糖。

DEAE纤维素柱中填料上柱前需使用氢氧化钠和盐酸的反复浸泡洗涤。预处理的具体步骤：现将其干粉浸泡于蒸馏水中，去除杂质；抽滤干燥后将其浸0.5M NaOH 2-3h，用超纯水洗至中性，抽滤至干；将其浸泡于0.5M的HCl中浸泡2-3h,用超纯水洗至中性，抽滤至干；将其浸于0.5M NaOH 2-3h，再次洗至中性，抽滤至干，用洗脱液溶解，搅拌，超声波处理，使气泡完全逸出。装柱时打开下出口，先用1/2柱体积的超纯水洗柱子，待水至1/4柱体积时开始装入填料，边装入边用橡胶吸耳球敲打，以使填料均匀沉淀，减少空隙，装至柱子2/3体积时停止装柱，连入洗脱液，利用恒流泵使柱内体积和压力保持平衡。柱子平衡过夜，待体系稳定后，开始上样。跟据所测糖含量，将一个峰附近的多糖溶液收集起来。

其中，步骤(4)中透析3d，透析袋截留分子量为10000-20000，优选为14000。

本发明的一个方面，提供了一种桃胶多糖PGPSD，其特征在于，该桃胶多糖PGPSD由阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖通过糖苷键连接，其中，阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖的摩尔比为5.98：1：3.55。

所述桃胶多糖常温下能溶于水。

本发明的再一方面，提供了所述的桃胶多糖在制备降血糖药物中的应用。本发明得到的桃胶多糖纯度较高，而大量研究表明，植物多糖具有降低血糖，提高免疫力的功效，如宁夏枸杞多糖通过刺激胰岛细胞增生，增加胰岛素分泌，增强葡萄糖分解代谢途径的关键酶活性等降低了糖尿病小鼠的血糖。通过大量实验证明，本发明所得的桃胶多糖PGPSD能降低糖尿病小鼠的血糖，并且该多糖对小鼠无毒害作用，可将其用于无副作用且价格低廉的降低血糖的药物的制备中。桃胶潜在药用价值的挖掘，不仅可以解决我国桃胶一直以来弃之不用的资源浪费现象，还可以促进我国桃产业及医药保健品开发等产业的可持续发展。

以下为实施例

一、桃胶多糖的制备

实施例1

(1)将原桃胶去杂质，按1：100的料液比溶胀，之后于100℃溶解25-30h。将所得桃胶溶液用四层纱布过滤，第一次去除未溶解的桃胶及树皮等杂质；将所得上清液3000rpm/min离心,第二次去除灰尘等杂质。

(2)将收集的上清液利用真空旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/4左右，用乙醇进行醇沉，过夜，所得沉淀即为粗多糖。将粗多糖用水再次溶解，Sevage法去除蛋白质，此过程重复3-4次，至中间层澄清。混合所得去蛋白多糖溶液再浓缩，用30％H₂O₂褪色，搅拌均匀，放置数小时待颜色稳定后，褪色结束。浓缩至原体积的1/5,利用真空冷冻干燥仪将浓缩的桃胶溶液干燥成粉末，至此得桃胶粗多糖。其中，Sevage法的步骤：将溶解的桃胶溶液分装于50mL离心管中，按1:1比例加入氯仿正丁醇混合液(体积比为4:1)剧烈震荡后，去除中间变性蛋白质，重复此步骤，至中间层澄清透明，无变性蛋白质。

(3)将所得粗多糖粉末配置成质量体积比10％溶液，过DEAE-52纤维素柱，0.5mol/L NaCl溶液洗脱，每8min收集一管。硫酸蒽酮法检测每管是否分离到多糖。

(4)透析，干燥：按照糖含量合并所得多糖溶液，蒸馏水透析3d后，真空冷冻干燥，即得目标桃胶多糖PGPSD。该多糖能完全溶解于水中。

实施例2

(1)将原桃胶去杂质，按0.5：100的料液比溶胀，之后于90℃溶解25-30h。将所得桃胶溶液用四层纱布过滤，第一次去除未溶解的桃胶及树皮等杂质；将所得上清液2000rpm/min离心,第二次去除灰尘等杂质。

(2)将收集的上清液利用真空旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/4左右，用乙醇进行醇沉，过夜，所得沉淀即为粗多糖。将粗多糖用水再次溶解，Sevage法去除蛋白质，此过程重复3-4次，至中间层澄清。混合所得去蛋白多糖溶液再浓缩，用30％H₂O₂褪色，搅拌均匀，放置数小时待颜色稳定后，褪色结束。浓缩至原体积的1/5,利用真空冷冻干燥仪将浓缩的桃胶溶液干燥成粉末，至此得桃胶粗多糖。其中，Sevage法的步骤：将溶解的桃胶溶液分装于50mL离心管中，按1:1比例加入氯仿正丁醇混合液(体积比为4:1)剧烈震荡后，去除中间变性蛋白质，重复此步骤，至中间层澄清透明，无变性蛋白质。

(3)将所得粗多糖粉末配置成质量体积比5％溶液，过DEAE-52纤维素柱，0.3mol/LKCl溶液洗脱，每10min收集一管。硫酸蒽酮法检测每管是否分离到多糖。

(4)透析，干燥：按照糖含量合并所得多糖溶液，蒸馏水透析4d后，真空冷冻干燥，即得目标桃胶多糖PGPSD。该多糖能完全溶解于水中。

实施例3

(1)将原桃胶去杂质，按1.5：100的料液比溶胀，之后于100℃溶解25-30h。将所得桃胶溶液用四层纱布过滤，第一次去除未溶解的桃胶及树皮等杂质；将所得上清液5000rpm/min离心,第二次去除灰尘等杂质。

(2)将收集的上清液利用真空旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/4左右，用乙醇进行醇沉，过夜，所得沉淀即为粗多糖。将粗多糖用水再次溶解，Sevage法去除蛋白质，此过程重复3-4次，至中间层澄清。混合所得去蛋白多糖溶液再浓缩，用30％H₂O₂褪色，搅拌均匀，放置数小时待颜色稳定后，褪色结束。浓缩至原体积的1/5,利用真空冷冻干燥仪将浓缩的桃胶溶液干燥成粉末，至此得桃胶粗多糖。其中，Sevage法的步骤：将溶解的桃胶溶液分装于50mL离心管中，按1:1比例加入氯仿正丁醇混合液(体积比为4:1)剧烈震荡后，去除中间变性蛋白质，重复此步骤，至中间层澄清透明，无变性蛋白质。

(3)将所得粗多糖粉末配置成质量体积比12％溶液，过DEAE-52纤维素柱，0.7mol/L磷酸盐溶液洗脱，每10min收集一管。硫酸蒽酮法检测每管是否分离到多糖。

(4)透析，干燥：按照糖含量合并所得多糖溶液，蒸馏水透析5d后，真空冷冻干燥，即得目标桃胶多糖PGPSD。该多糖能完全溶解于水中。

二、桃胶多糖的性质

1、桃胶多糖红外光谱分析：

(1)将多糖粉末，KBr及玛瑙碾磨置于红外灯下，干燥过夜。次日，与KBr混合均匀碾成粉末，越细越好，利用模具将其制成透明薄片。

(2)红外光谱条件：扫描次数，32次；背景扫描次数，32次；光源，IR，扫描波长范围为4000cm^-1-400cm^-1。

步骤(1)中，所有要用到的药品和用具都要提前在红外灯下干燥数小时，粉末小于2um。将研好的粉末均匀撒入模具内，取片时要小心，尽量避免中间有裂痕，制好的片子透明最好。

步骤(2)中，使用的仪器为傅立叶红外转换光谱仪(FT-IR)，使用前需预热30min,之后打开OMNIC软件，进行条件设定和扫描。导出数据，用Origin软件作图。

图1为上述实施例中得到的桃胶多糖PGPSD的红外光谱图。图1结果显示，桃胶多糖PGPSD为典型的多糖。波长3401.87cm^-1处的强吸收峰表明有多糖的羟基伸缩振动，1650cm^-1-1400cm^-1波段的中强度吸收峰是多糖C-C之间的特征吸收峰。而1419.38cm^-1和1043.32cm^-1处有吸收峰表明有羧基的存在。950cm^-1和1160cm^-1处的强吸收峰显示有吡喃糖苯环的存在。2923.60cm^-1处的吸收峰显示有CH₂基团的非对称伸缩。综上，PGPSD是为目标多糖。

2、气相-质谱联用仪(GC-MS)鉴定其单糖组成

(1)称取5mg多糖，少量浓硫酸降解，加入内标肌醇和水后，100℃反应6h。

(2)BaCO₃中和硫酸，去除沉淀取上清液。

(3)用50％氨水调节pH至中性，加NaBH₄少量，过夜。

(4)利用真空浓缩仪将所得溶液蒸干，洗涤两次之后，加入吡啶和乙酸酐进行乙酰化，100℃条件下反应1h。

(5)用水和无水乙醇洗涤两次后，干燥。

(6)将所得干样溶于1mL甲醇中，完全溶解后，上机检测。

(7)GC-MS设定条件:柱子，DB-5；程序升温，120℃保持2min,以10℃/min速度升至195℃，再以3℃/min速度升至240℃；进样量，1uL；每个样品跑25min。

步骤(1)中，浓硫酸可以使多糖的糖苷键打开，故用硫酸降解多糖时要不断搅拌，待无明显颗粒时降解完毕，加入2g/L的内标肌醇溶液和3mL蒸馏水，在圆底烧瓶里进行后面的反应。该过程配合冷凝设备一起进行。本发明中样品为目标多糖PGPSD，所选标准单糖为：D-半乳糖，D-葡萄糖，木糖，阿拉伯糖，鼠李糖，海藻糖。每个样品重复3次。

步骤(2)中根据所加硫酸的量，加入适量BaCO₃，去除溶液中的SO₄离子，反应完后，离心，取上清。

步骤(3)中pH调至7-8后，加NaBH₄，因反应比较剧烈，步骤(2)所得上清液需转移至较大离心管中。

步骤(4)中重复洗涤干燥的步骤，去除残留离子，进行乙酰化的样品需足够干燥。

步骤(6)中用色谱级甲醇溶解，上样最好需离心，取上清，以免上机进样时堵针。

步骤(7)中样品跑完之后，导出数据，用Origin软件作图。结合标准样品的峰值，比对质谱库，确定样品的单糖组成。

图2是PSPDG的气相-质谱联用图，a为样品图，b为标准样品图，其中Rha：鼠李糖；Ara：阿拉伯糖；Xyl：木糖；Tre：海藻糖；Man：甘露糖；Glu：葡萄糖；Gal：半乳糖。

图2可知，桃胶多糖PGPSD由阿拉伯糖,甘露糖和半乳糖以5.98:1:3.55的分子摩尔比由糖苷键链接而成。

3、本发明的桃胶多糖PGPSD具有降低糖尿病小鼠血糖，缓解病情，改善病变器官等药用功效

(1)建立小鼠糖尿病模型：选用C57小鼠，体重约为20g左右时，开始造模。按照70mg/Kg剂量腹腔注射链脲佐菌素，7d后断尾取血，测小鼠血糖。凡血糖值大于17.6mmol/L者视为糖尿病模型小鼠。正常饮食一周后再测血糖，血糖稳定后视为造模成功。

(2)将糖尿病小鼠随机分为6组，每天给小鼠腹腔灌胃不同浓度的PGPSD多糖溶液，灌胃40天。每天记录小鼠的饮食饮水量及体重。40天后，测量小鼠的血糖。

(3)处死小鼠后，取其肝脏，肾脏，胰岛，对胰岛素及葡萄糖代谢相关因子的表达进行分析，同时对重要器官(肝肾胰)的组织切片进行观察。

步骤(1)中，STZ用过滤灭菌的柠檬酸缓冲液(0.1M,pH＝4.5)溶解，第一次腹腔注射，小鼠需空腹。

步骤(2)中，以无菌水和市场药物盐酸二甲双胍分别为阴性和阳性对照。各组分别为：正常对照组(NC),模型对照组(MOD)，药物对照组(MET),原桃胶溶液组(GUM),不同浓度(低，中，高)PGPSD多糖溶液组(PSD-L,PSD-M,PSD-L)。每组7只小鼠。测量血糖所用为罗康全活力型血糖仪及配套血糖试纸。

步骤(3)中，选取胰岛素相关的两个因子Insulin和PDX-1，及葡萄糖代谢关键酶己糖激酶(HK)，采用免疫组化(S-P法染色)的方法对其表达情况进行研究，该染色法反应速度更快，敏感性强且背景低。一抗分别购自Sigma公司(批号I2018)和Abcam公司，(批号ab47267)。二抗和三抗分别为生物素标记的羊抗鼠/兔IgG和过氧化酶标记的链霉素抗生物素蛋白。所选试剂盒为迈新生物所产即用型免疫组化超敏S-P试剂盒(鼠/兔)。利用常规HE染色进行组织切片观察。

图3是桃胶多糖PSPDG，桃胶原液，药物二甲双胍及对糖尿病小鼠血糖(a)，体重(b)和饮水量(c)的影响。在图4中，原桃胶溶液降低了糖尿小鼠的血糖，PGPSD降血糖效果更佳，且优于药物二甲双胍。此外，桃胶多糖还有效控制了小鼠体重，缓解了其多饮的临床症状。以高浓度PGPSD治疗效果最佳。

图4是桃胶多糖PSPDG，桃胶原液及药物二甲双胍对小鼠胰岛胰岛素相关因子Insulin(a)，PDX-1(b)和己糖激酶(HK)(c)表达的影响。图4中纵坐标表示的是各因子免疫组化阳性率。由图4可知，PGPSD发挥降血糖的药效有一定的剂量效应，高浓度显著加强了胰岛素相关因子的表达，促进了糖尿病小鼠胰岛素的分泌，同时也增强了葡萄糖糖酵解关键酶的表达。

图5是桃胶多糖PSPDG，桃胶原液，药物二甲双胍对糖尿病小鼠胰岛(a)，肾脏(b)和肝脏(c)的影响。如图所示，PGPSD对糖尿病小鼠肝脏，肾脏均有一定程度的恢复，对胰岛的恢复作用更明显。高浓度PGPSG治疗组的胰岛面积和形态已接近正常对照组。

本发明采用水提醇沉、Sevage法、透析、过柱(以DEAE纤维素为填料)等步骤制备得到了更加精细的多糖组分PGPSD，且该多糖粉末能溶于水，成均一透明状胶体。该多糖由阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖通过糖苷键连接。相对桃胶原液和市场药物二甲双胍，本发明所得桃胶多糖PGPSD能更好地增强胰岛素相关转录因子和葡萄糖降解关键酶的表达，对小鼠无毒害作用，且能帮助受损器官有效地恢复，达到能显著降低血糖。本发明的提取较之其他已有方法更为精细，所得多糖纯度更高，加之其降血糖效果显著，因此将其药物或保健品进行开发，有很大的潜在价值，也能在一定程度上减少由流胶病引起的经济损失。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种桃胶多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将天然桃胶去杂质，并将其与水按1：100的料液比溶胀，之后于100℃溶解25-30h；接着，将所得桃胶溶液用四层纱布过滤，第一次去除未溶解的桃胶及树皮杂质；将所得上清液3000rpm/min离心，第二次去除灰尘杂质；

(2)将收集的上清液利用真空旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/4左右，用乙醇进行醇沉，过夜，所得沉淀即为粗多糖；接着，将粗多糖用水再次溶解，Sevage法去除蛋白质，此过程重复3-4次，至中间层澄清；然后，混合所得去蛋白多糖溶液再浓缩，用30％H₂O₂褪色，搅拌均匀，放置数小时待颜色稳定后，褪色结束；接着，浓缩至原体积的1/5,利用真空冷冻干燥仪将浓缩的桃胶溶液干燥成粉末，至此得桃胶粗多糖；

其中，Sevage法的步骤具体是：将溶解的桃胶溶液分装于50mL离心管中，按1:1比例加入氯仿正丁醇混合液，剧烈震荡后，去除中间变性蛋白质，重复此步骤，至中间层澄清透明，无变性蛋白质；此外，所述氯仿正丁醇混合液是按氯仿与正丁醇体积比为4:1混合得到的；

(3)将所得粗多糖粉末配置成质量体积比10％溶液，过DEAE-52纤维素柱，0.5mol/LNaCl溶液洗脱，每8min收集一管；然后，硫酸蒽酮法检测每管是否分离到多糖；

(4)透析，干燥：按照糖含量合并所得多糖溶液，蒸馏水透析3d后，真空冷冻干燥，即得目标桃胶多糖PGPSD；该桃胶多糖PGPSD能完全溶解于水中。

2.一种桃胶多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将天然桃胶去杂质，并将其与水按0.5：100的料液比溶胀，之后于90℃溶解25-30h；接着，将所得桃胶溶液用四层纱布过滤，第一次去除未溶解的桃胶及树皮杂质；将所得上清液2000rpm/min离心,第二次去除灰尘杂质；

(2)将收集的上清液利用真空旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/4左右，用乙醇进行醇沉，过夜，所得沉淀即为粗多糖；接着，将粗多糖用水再次溶解，Sevage法去除蛋白质，此过程重复3-4次，至中间层澄清；然后，混合所得去蛋白多糖溶液再浓缩，用30％H₂O₂褪色，搅拌均匀，放置数小时待颜色稳定后，褪色结束；接着，浓缩至原体积的1/5,利用真空冷冻干燥仪将浓缩的桃胶溶液干燥成粉末，至此得桃胶粗多糖；

其中，Sevage法的步骤具体是：将溶解的桃胶溶液分装于50mL离心管中，按1:1比例加入氯仿正丁醇混合液剧烈震荡后，去除中间变性蛋白质，重复此步骤，至中间层澄清透明，无变性蛋白质；此外，所述氯仿正丁醇混合液是按氯仿与正丁醇体积比为4:1混合得到的；

(3)将所得粗多糖粉末配置成质量体积比5％溶液，过DEAE-52纤维素柱，0.3mol/L KCl溶液洗脱，每10min收集一管；然后，硫酸蒽酮法检测每管是否分离到多糖；

(4)透析，干燥：按照糖含量合并所得多糖溶液，蒸馏水透析4d后，真空冷冻干燥，即得目标桃胶多糖PGPSD；该桃胶多糖PGPSD能完全溶解于水中。

3.一种桃胶多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将天然桃胶去杂质，并将其与水按1.5：100的料液比溶胀，之后于100℃溶解25-30h；接着，将所得桃胶溶液用四层纱布过滤，第一次去除未溶解的桃胶及树皮杂质；将所得上清液5000rpm/min离心,第二次去除灰尘杂质；

(2)将收集的上清液利用真空旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/4左右，用乙醇进行醇沉，过夜，所得沉淀即为粗多糖；接着，将粗多糖用水再次溶解，Sevage法去除蛋白质，此过程重复3-4次，至中间层澄清；然后，混合所得去蛋白多糖溶液再浓缩，用30％H₂O₂褪色，搅拌均匀，放置数小时待颜色稳定后，褪色结束；接着，浓缩至原体积的1/5,利用真空冷冻干燥仪将浓缩的桃胶溶液干燥成粉末，至此得桃胶粗多糖；

其中，Sevage法的步骤具体是：将溶解的桃胶溶液分装于50mL离心管中，按1:1比例加入氯仿正丁醇混合液剧烈震荡后，去除中间变性蛋白质，重复此步骤，至中间层澄清透明，无变性蛋白质；此外，所述氯仿正丁醇混合液是按氯仿与正丁醇体积比为4:1混合得到的；

(3)将所得粗多糖粉末配置成质量体积比12％溶液，过DEAE-52纤维素柱，0.7mol/L磷酸盐溶液洗脱，每10min收集一管；然后，硫酸蒽酮法检测每管是否分离到多糖；

(4)透析，干燥：按照糖含量合并所得多糖溶液，蒸馏水透析5d后，真空冷冻干燥，即得目标桃胶多糖PGPSD；该桃胶多糖PGPSD能完全溶解于水中。