CN114601898B - 一种黄精酶解糖化的炮制工艺 - Google Patents

一种黄精酶解糖化的炮制工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黄精酶解糖化的炮制工艺，包括原料预处理、液氮粉碎、高温糊化、淀粉酶解、糖化酶解、灭酶活、过滤，涉及中草药炮制技术领域。相比传统方法，本发明炮制后功能成分含量更高而5‑羟甲基糠醛含量更低，按照本发明方法制得的糖化黄精液，相比于传统九蒸九制的黄精，避免了长时间的蒸制和晒干过程，方法工艺简单，便于操作，成本降低，具有广阔的市场前景。

Description

一种黄精酶解糖化的炮制工艺
技术领域
本发明涉及中草药炮制技术领域，具体为一种黄精酶解糖化的炮制工艺。
背景技术
黄精是百合科黄精属植物，其化学成分主要有糖类、皂苷、黄酮类、生物碱等。药用部位为其干燥根茎，是我国名贵的滋补中药，有着补气养阴，健脾益肾，润肺的功效。
常规的黄精炮制以九蒸九制为主，炮制的热加工过程不仅繁琐，而且加工过程中的焦糖化或美拉德反应会生成危害人体健康的化合物，如5-羟甲基糠醛等。5-羟甲基糠醛被人体摄入或皮肤吸收后，会对上呼吸道、黏膜、眼睛和皮肤等产生刺激，同时还能与人体内蛋白结合而引发蓄积中毒。本发明使用淀粉酶与糖化酶结合酶解黄精，步骤简便，代替了传统黄精九蒸九制繁杂过程从而减少5-羟甲基糠醛等有害物质的产生。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种步骤简便的黄精酶解糖化炮制工艺代替传统的九蒸九制炮制方法，且相比传统方法，本发明炮制后功能成分含量更高而5-羟甲基糠醛含量更低。
一种黄精酶解糖化的炮制工艺，包括以下步骤：
S1、原料预处理：取新鲜黄精，除去杂质、根须、削皮，洗净；
S2、液氮粉碎：采用低温液氮粉碎法进行粉碎，粉碎后过筛，得到黄精粉；
S3、高温糊化：黄精粉与水混合，在60-75℃下糊化1-3h，得到黄精糊化液；
S4、淀粉酶解：将黄精糊化液取出冷却至60℃左右，加入无水氯化钙和α-淀粉酶，于pH5.0-7.0，温度为60-75℃下，酶解；
S5、糖化酶解：加入糖化酶，于pH3.8-5.2，温度为50-65℃下，酶解；
S6、灭酶活：于95-100℃下，灭酶10-15min；
S7、过滤：将灭酶后的固液混合物过滤，即得糖化后的滤液。
优选的，步骤S2中，低温液氮粉碎通氮量为200-300mL/100g，粉碎后过80目筛。
优选的，步骤S3中，黄精粉与水按1:2-1:6的料液比混合。
优选的，步骤S4中，加入0.05-0.25％无水氯化钙和1.5-2.5％α-淀粉酶，酶解1.5-3.5h。
优选的，步骤S5中，加入1-2％糖化酶，酶解1-3h。
本发明的有益效果：
1、按照本发明方法制得的糖化黄精液，相比于传统九蒸九制的黄精，避免了长时间的蒸制和晒干过程。
2、相较传统方法而言，功能成分含量更高，5-羟甲基糠醛含量更低。
3、本发明所述方法工艺简单，便于操作，成本降低，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为本发明实施例1、例2和对比例1的多糖含量图；
图2为本发明实施例1、例2和对比例1的总皂苷含量图；
图3为本发明实施例2和对比例1的5-羟甲基糠醛含量图；
图4为本发明实施例2和对比例1的DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和Fe2+螯合能力对比图；
图5为本发明实施例2和对比例1的线虫行为能力对比图；
图6为本发明实施例2和对比例1的感官评价对比图。
注：
图1中：*，P＜0.01；
图2中：**，P＜0.01；
图3中：***，P＜0.001；
图4中：*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001；
图5中：**，P＜0.01。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
实施例1
一种黄精的酶解炮制工艺，包括如下步骤：
S1、原料预处理：取新鲜黄精，除去杂质、根须、削皮，洗净；
S2、液氮粉碎：采用低温液氮粉碎法进行粉碎，通氮量为200mL/100g，粉碎后过80目筛，得到新鲜黄精粉。
S3、高温糊化：黄精粉碎后，将其取出，按1:4的料液比，在65℃下，糊化1h，得到黄精糊化液。
S4、淀粉酶解：将黄精糊化液取出冷却至60℃左右，2％α-淀粉酶，于pH5.0，温度为65℃下，酶解1.5h；
S5、糖化酶解：加入2％糖化酶，于pH5.0，温度为60℃下，酶解2h。
S6、灭酶活：于100℃下，灭酶10min。
S7、过滤：将灭酶后的固液混合物过滤，即得糖化后的滤液。
实施例2
一种黄精的酶解炮制工艺，包括如下步骤：
S1、原料预处理：取新鲜黄精，除去杂质、根须、削皮，洗净；
S2、液氮粉碎：采用低温液氮粉碎法进行粉碎，通氮量为200mL/100g，粉碎后过80目筛，得到黄精粉。
S3、高温糊化：黄精粉碎后，将其取出，按1:4的料液比，在65℃下，糊化1h，得到黄精糊化液。
S4、淀粉酶解：将黄精糊化液取出冷却至60℃左右，加入0.1％无水氯化钙和2％α-淀粉酶，于pH5.0，温度为65℃下，酶解1.5h；
S5、糖化酶解：加入2％糖化酶，于pH5，温度为60℃下，酶解2h。
S6、灭酶活：于100℃下，灭酶10min。
S7、过滤：将灭酶后的固液混合物过滤，即得糖化后的滤液。
对比例1
利用黄精传统的九蒸九制技术进行，步骤如下：
S1、原料预处理：取新鲜黄精，除去杂质、根须、削皮，洗净、切片；
S2、高温蒸制：将切好的新鲜黄精，隔水蒸制6h，60℃烘干8h，如此反复蒸制9次，得九蒸九制黄精；
S3、加水炮制：将九蒸九制黄精取出，按1:4的料液比，在65℃下，炮制4.5h；
S4、过滤：将炮制后的固液混合物过滤，即得九蒸九制后的滤液。
对上述实施案例方法所制得的黄精液的多糖、总皂苷和5-羟甲基糠醛含量进行测定。
试验例1
多糖含量的测定
参考2020版中国药典的测定方法，取1mL黄精炮制液进行测定，置圆底烧瓶中，加80％乙醇150mL，置水浴中加热回流1h，趁热滤过，残渣用80％热乙醇洗涤3次，每次10mL，将残渣及滤纸置烧瓶中，定容至150mL，置沸水浴中加热回流1h，趁热滤过，残渣及烧瓶用热水洗涤4次，每次10mL，合并滤液与洗液，放冷，转移至250mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取lmL，置10ml具塞干燥试管中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加水至2.0mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含无水葡萄糖的重量(mg)，计算，即得。
试验例2
总皂苷含量的测定
加入1mL黄精炮制液于内径为1.5cm的玻璃层析柱内装3cm已活化且洗脱好的的大孔树脂中，用25mL水洗脱，弃去洗脱液，再用25mL 70％乙醇以不超过3mL/min的速度洗脱黄精皂苷至洗脱液无色，收集洗脱液于蒸发皿中，置于60℃水浴挥干，残渣用少量甲醇溶解并转移至10mL具塞比色管中于560nm波长处测定吸光度。
由图1、图2可知，实施例1和实施例2中黄精炮制液的多糖和总皂苷含量均显著高于(P＜0.01)对比例1，且多糖含量达到了2020版中国药典要求(不少于7.0％)，表明本发明工艺比九蒸九制方法能够提供功能成分含量更高的黄精炮制液。无水氯化钙能使α-淀粉酶耐高温并在酶解过程中保持活力，添加了无水氯化钙的实施例2中多糖和总皂苷的含量略高于实施例1，因此本发明在炮制工艺为实施例2时效果最优。
试验例3
5-羟甲基糠醛的测定
称取10g试样，精确至0.01g，置于100mL烧杯中，加入10mL甲醇，用玻璃棒轻轻搅拌均匀，使试样完全溶解。转移至100mL容量瓶中，用水释稀至刻度，充分混匀。用0.45μm的滤膜过滤，滤液用于液相色谱仪紫外检测器测定。
HPLC条件：Diamonsil C18 5μm，250mm×4.6mm色谱柱，流动相为甲醇-水(90:10)，流速为1.0mL/min，检测波长为285nm，柱温30℃，进样量为10μL。
由图3可知，本发明方法所得的液体有害物质5-羟甲基糠醛的含量为5.74mg/L远远低于(P＜0.001)传统九蒸九制炮制方法的3740mg/L。这充分说明本发明工艺安全可靠，产生的危害成分远低于传统九蒸九制的炮制方法。
综上所述，本发明所提供的一种黄精糖化炮制工艺相比传统方法，能有效减少炮制步骤和降低炮制时间的特点且具有活性成分含量更高，有害成分含量更低的优势。
试验例4
单糖成分分析
用1.5mL甲醇分解试剂(含有0.5mL HCl的甲醇)处理多糖溶液部分，以便将中性和酸性单糖水解成它们相应的甲基糖苷。反应在80℃的氮气中进行，然后氮吹除去过量的试剂。通过向干燥的材料中加入0.5mL吡啶：六甲基二硅氮烷：三甲基氯硅烷(10:2:1v/v/v)的混合物，来进行甲基糖苷向3-甲基甲硅烷基(TMS)衍生物的转化。反应在80℃下进行30min，然后用氮气除去试剂。然后加入25μL的衍生化肌醇溶液作为内标，用1mL正己烷提取衍生化残留物。用1μL的这些溶液进行GC-MS和GC-FID，样品分两次进样。不同的标准碳水化合物也被转换成相应的TMS衍生物，并用GC-MS和GC-FID进行分析，以获得用于鉴定的模式和标准校准曲线。
GC-MS条件：色谱柱为Tenowkroma熔融石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，流动相为5％苯基-95％甲基聚硅氧烷。起始温度为120℃，以1℃/min升温至145℃，然后以0.9℃/min升温至180℃，最后以4℃/min升温至230℃。GC进样器内径3.4mm，温度250℃，分流比1:20。载气为氦气(99.996％)，流速为1mL/min。电离以电子碰撞(EI)方式进行，电压为70eV。MS Quad的温度为150℃，MS源的温度为230℃，传输线使用的温度为250℃。
表1多糖的单糖组成摩尔百分比
葡萄糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖等单糖对多糖抗氧化生物活性影响较大。由表2可知，实施例2的葡萄糖醛酸、半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖的单糖组成均在一定程度上高于对比例1，也为后续抗氧化活性的研究提供了参考依据。
试验例5
抗氧化能力测试
DPPH自由基清除能力研究：取2mL不同的样品溶液于试管中，加入2mL0.2mmol/L的DPPH溶液(19.7mg溶于250mL容量瓶)，充分摇匀，4000rpm离心6min,静置30min,以无水乙醇为参比组调零，在517nm处测定吸光度。按照公式计算清除能力。
羟自由基清除能力：取2mL不同的样品溶液于试管中，依次加入6mmol/L的FeSO4溶液(41.7mg溶于25mL容量瓶)和H2O2溶液各2mL，摇匀后静置10min，再加入6mmol/L的水杨酸2mL(20.7mg溶于25mL容量瓶)，摇匀后室温避光静置30min，在510nm测其吸光度(As)，用蒸馏水替代样品测吸光度(A0)，用蒸馏水替代水杨酸测其吸光度(Ac)，按照公式计算清除能力。
Fe2+螯合能力研究：取1mL不同的样品溶液于试管中，依次加入蒸馏水3.7mL、2mmol/L(2.5mg溶于10mL水)的FeCl2溶液0.1mL和5mmol/L(24.6mg溶于10mL水)的菲啰嗪溶液0.2mL，振荡摇匀，室温避光静置10min后，5000rpm离心10min，取上清液在562nm处测定吸光度(As)，用蒸馏水替代样品作为空白对照测其吸光度(A0)，用蒸馏水替代反应体系中的FeCl2测其吸光度(Ac)，按照公式计算清除能力。
DPPH自由基清除率/羟自由基清除率/Fe2+螯合能力＝[1-(AS-AC)/A0]×100％
注：As为实验组吸光度；Ac为用无水乙醇替代DPPH溶液的对照组吸光度；A0为用无水乙醇替代样品溶液的空白组吸光度。
自由基是影响衰老的主要因子，因此线虫寿命是评价抗氧化能力较为直接的指标；运动行为能力可用作衡量神经系统基本功能的指标，因此也可以用来反应抗氧化剂对线虫的抗氧化保护作用，进而判断多糖的抗氧化能力。
寿命的测定：将L4期的线虫分为对照组和实验组(多糖浓度1.2mg/mL)，每板30条，在20℃下恒温培养。每天都观察并记录线虫的死亡数、存活数和丢失数，直至最后一条线虫死亡即实验结束。培养基中全部线虫均死亡的时间平均值为平均寿命，当培养基中线虫存活数量为原总数10％时的平均寿命为最高寿命。
线虫运动行为能力测定：线虫培养方法同寿命培养方法。从空白组和实验组中分别挑取至少15条、培养时间为3d的线虫放置于原始的线虫生长培养基(nematode growthmedium，NGM)培养基，在线虫恢复运动两分钟后，记录一分钟时间内头部摆动的总次数；用相同方法记录20s时间内躯体弯曲的总次数(20s内线虫躯体完成波长轨迹的次数)。
由图4所示，实施例2的DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和Fe2+螯合能力分别为69.07％、72.38％和48.3％均显著高于对比例1的55.20％、66.13％和31.51％。
表2不同工艺的多糖对线虫寿命的影响
注：与空白组线虫平均寿命相比，*P<0.05，**P<0.01；与空白组线虫最长寿命相比，#P<0.05，##P<0.01。
由表3所示，实施例2和对比例1的平均寿命分别为15.52和13.28d，与对照组相比提高了34.48％(P＜0.01)和14.81％(P＜0.05)。结果表明本发明工艺与传统九蒸九制的多糖液均有一定的延长寿命效果，但本发明工艺所得多糖效果更优。
如图5所示，实施例2和对比例1所得的多糖均能提升线虫的头部摆动频率和身体弯曲频率，且实施例2均显著高于对比例1。
综上所述，本发明工艺所得多糖具有较强的抗氧化能力，且强于传统的九蒸九制方法。
试验例6
对糖尿病小鼠的降血糖作用
取80只健康小鼠，雌雄各半，适应性饲养3d。采用尾部静脉注射四氧嘧啶，注射剂量70mg/kg。3d后测定空腹血糖。血糖值15.0-24.0的小鼠为成功造模小鼠，总计60只。将60只小鼠随机分成3组，每组20只，雌雄各半，分别为空白组，实施例2组，对比例1组，按一定剂量给药，1次/d，分别给药后第6d，第9d采用尾静脉取血，血糖仪测定空腹血糖值。
表3不同工艺的黄精多糖对四氧嘧啶致糖尿病小鼠血糖的影响
从表3的结果可知，实施例2组的多糖降血糖效果略优于对比例1。
试验例7
感官评价
由10名以上受过专业培训的感官评价人员进行评分，满分为100分，评价指标包括色泽(20分)、香气(30分)、口感(30分)、组织形态(20分)，感官评分标准如表4所示。
表4黄精炮制液感官评价标准
由图6可知，实施例2的香气评价略低于对比例1，但组织状态、色泽和口感均优于对比例1。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (2)

1.一种黄精酶解糖化的炮制工艺，其特征在于，包括以下步骤：
S1、原料预处理：取新鲜黄精，除去杂质、根须、削皮，洗净；
S2、液氮粉碎：采用低温液氮粉碎法进行粉碎，粉碎后过筛，得到黄精粉；
S3、高温糊化：黄精粉与水按1:2-1:6的料液比混合，在65℃下糊化1h，得到黄精糊化液；
S4、淀粉酶解：将黄精糊化液取出冷却至60℃，加入0.1％无水氯化钙和2％α-淀粉酶，于pH5.0，温度为65℃下，酶解1.5h；
S5、糖化酶解：加入2％糖化酶，于pH5，温度为60℃下，酶解2h；
S6、灭酶活：于95-100℃下，灭酶10-15min；
S7、过滤：将灭酶后的固液混合物过滤，即得糖化后的滤液。
2.根据权利要求1所述的黄精酶解糖化的炮制工艺，其特征在于，步骤S2中，低温液氮粉碎通氮量为200-300mL/100g，粉碎后过80目筛。
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