CN110016086A - 一种灵芝多糖的精制工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种灵芝多糖的精制工艺，该工艺以干燥灵芝为原料，经粉碎过筛、超声提取多糖、胰蛋白酶酶解蛋白杂质、阳离子交换树脂脱酶、正向渗透膜处理、喷雾干燥等工艺步骤，制备获得精制灵芝多糖。本发明采用单一胰蛋白酶水解灵芝多糖提取液中蛋白杂质，胰蛋白酶等电点高于其最适反应pH，酶解结束后直接用阳离子交换树脂脱酶，无需再次调节pH值，工艺简单；脱酶后的多糖提取液经填充100倍吸水接枝淀粉、截留分子量5000Da的正向渗透膜处理，在浓缩同时去除蛋白酶解肽段，分离效率高，能耗低；将胰蛋白酶酶解、阳离子交换树脂脱酶和正向渗透膜处理进行工艺串联，不仅蛋白杂质去除彻底，多糖纯度高，而且脱蛋白条件温和，多糖活性结构稳定。

Description

一种灵芝多糖的精制工艺

技术领域

本发明属于灵芝功能成分提取分离纯化技术领域，具体涉及一种灵芝多糖的精制工艺。

技术背景

灵芝，是我国中医药宝库中的珍品，素有仙草之誉，《神农本草经》和《本草纲目》都对灵芝的功能有详细的记载，服用灵芝能够健脾、养胃、增元气、排毒养颜、抗癌止瘤、强身健体、调理血压，适用于多种人群。灵芝作为药材被历版《中华人民共和国药典》所收载，多糖是其主要活性成分之一。研究表明，灵芝多糖具有抗氧化、降血脂、降血糖、抗肿瘤、抗病毒和调节免疫力等功效，随着灵芝多糖在药品、保健品、化妆品和食品等领域的广泛使用，灵芝多糖的市场需求越来越大，对灵芝多糖的质量要求也越来越高。

灵芝多糖可从灵芝子实体、灵芝孢子和灵芝发酵菌丝体等原料中分离提取获得。灵芝多糖的传统提取工艺是利用多糖能溶于水、不溶于有机溶剂的原理，用水提醇沉的方法从原料中提取，传统提取工艺简单，目前广泛应用于灵芝多糖的制备。随着多糖提取技术的不断发展，酶提取法、超临界流体辅助提取法、超滤提取法、微波辅助提取法、超声波提取法等新型提取方法也逐渐被应用到灵芝多糖提取中。无论是传统提取方法还是上述新型提取方法，制备的灵芝多糖都不同程度的含有蛋白质杂质。

对灵芝多糖功能的深入研究发现，灵芝多糖的纯度对于其生物功能的发挥尤为重要。灵芝多糖提取液中多糖与蛋白质共存，蛋白质不仅影响灵芝多糖的生物活性，而且是潜在的过敏原。较为常用的灵芝多糖脱蛋白方法有Sevag法、三氯乙酸法和酶解法。Sevag法和三氯乙酸法是多糖提取液脱蛋白的传统方法，但这两种方法需要反复处理，工作量大，有机试剂污染环境，而且会造成多糖结构破坏，多糖损失率高。酶解法常用混合蛋白酶水解灵芝多糖提取液中的杂质蛋白，然后离心分离以去除杂质蛋白，酶解法具有操作流程简单、条件温和、不破坏多糖分子结构等优点，但是现有的酶解脱蛋白方法在酶解提取液中内源蛋白杂质的同时，又引入了新的外源杂质蛋白，即水解酶，而且水解酶属于水溶性蛋白，很难从灵芝多糖提取液中分离出去，多糖中杂质蛋白脱除不彻底。

灵芝多糖提取液的浓缩干燥是制备灵芝多糖的一个重要步骤，灵芝多糖提取液浓缩常用的方法是高温蒸发和逆向膜浓缩，其中高温蒸发需要加热耗能，逆向膜浓缩包括微滤、超滤、纳滤和反渗透，其过程都是以外界压力作用形成的膜内外压差实现浓缩目的，在浓缩过程中存在高能耗问题。正向渗透膜浓缩技术作为一种新型的浓缩技术，其原理是以填充物的高吸水性为驱动力实现浓缩目的，相对于传统压力驱动的膜浓缩过程，正向渗透膜浓缩不需要外加压力，具有能耗低的优点。选择合适的正向渗透膜孔径，可以在浓缩的同时去除提取液中胰蛋白酶酶解后的小分子肽段，分离效果好，操作方便，设备简单，正向渗透膜浓缩技术在灵芝多糖提取中具有很好的应用前景。

随着灵芝深加工产业现代化进程的不断深入，传统灵芝多糖提取分离纯化工艺已经不能完全适应发展的需要，开发新的工艺方法成为灵芝多糖提取分离纯化技术现代化的重要环节，针对灵芝多糖现有提取分离纯化工艺能耗大、有效成分损失率高、蛋白杂质残留多、多糖纯度不高、有机污染等问题，需要开发新工艺和新技术。灵芝多糖提取液中蛋白杂质的去除和提取液浓缩是灵芝多糖精制工艺中的两个关键步骤，为了解决现有的灵芝多糖提取分离纯化工艺中蛋白杂质去除不彻底，提取液浓缩过程能耗大、多糖损失率高的问题，本发明设计了一种灵芝多糖的精制工艺。

本发明采用单一胰蛋白酶水解灵芝多糖提取液中蛋白杂质，胰蛋白酶等电点高于其最适反应pH，酶解结束后直接用阳离子交换树脂脱酶，无需再次调节pH值，工艺简单；脱酶后的多糖提取液经填充100倍吸水接枝淀粉、截留分子量5000Da的正向渗透膜处理，在浓缩同时去除酶解肽段，分离效率高，能耗低；胰蛋白酶酶解、阳离子交换树脂脱酶和正向渗透膜处理工艺串联用于灵芝多糖精制，不仅蛋白杂质去除彻底，多糖纯度高，而且脱蛋白条件温和，多糖活性结构稳定。

发明内容

本发明以干燥灵芝为原料，经粉碎过筛、超声提取多糖、胰蛋白酶酶解蛋白杂质、阳离子交换树脂脱酶、正向渗透膜处理、喷雾干燥等工艺步骤，制备获得精制灵芝多糖。

一种灵芝多糖的精制工艺具体操作步骤如下：

(1)干燥灵芝原料经粉碎后过100目筛网，得灵芝粉末；

(2)将灵芝粉末加入50～100倍质量的水中，进行超声提取，离心取上清液，得灵芝多糖粗提液；

(3)调节灵芝多糖粗提液pH为7.8～8.5，加入胰蛋白酶，在35～40℃条件下酶解提取液中蛋白杂质，离心取上清液，得灵芝多糖酶解液；

(4)在灵芝多糖酶解液中加入阳离子交换树脂，搅拌，去除残留的胰蛋白酶，过滤取滤液，得灵芝多糖精提液；

(5)灵芝多糖精提液经正向渗透膜处理，得灵芝多糖精提浓缩液；

(6)灵芝多糖精提浓缩液经喷雾干燥，得精制灵芝多糖干粉。

步骤(1)中的灵芝原料包括灵芝子实体、破壁灵芝孢子和灵芝发酵菌丝体。

步骤(2)中超声提取条件为超声功率500～2000W、提取温度60～90℃，提取时间30～150min。

步骤(3)中胰蛋白酶的添加量为灵芝多糖粗提液质量的0.05～0.5％，酶活为120U/mg，酶解时间为10～20h。

步骤(4)中阳离子交换树脂为带有磺酸基的大孔结构树脂，阳离子交换树脂添加量为5～30g/L，脱酶处理时间为0.5～1.5h，搅拌速度50～100r/min。

步骤(5)中正向渗透膜的截留分子量为5000Da，填充物为100倍吸水率接枝淀粉，填充量为灵芝多糖精提液质量的10～30％，吸水接枝淀粉经离心脱水可重复使用4～5次。

步骤(6)喷雾干燥的条件为进风温度180～200℃，出风温度60～80℃，流速10～20mL/min。

本发明的有益技术效果体现在以下几个方面：

(1)本发明采用单一酶胰蛋白酶作为灵芝多糖提取液蛋白杂质水解酶，酶胰蛋白酶具有多个水解切割位点，能够水解灵芝多糖提取液中的几乎全部杂质蛋白。胰蛋白酶等电点高于其最适反应pH，水解结束后可以直接使用阳离子交换树脂进行脱酶，无需再次调节体系pH值，脱酶条件温和，多糖结构稳定。

(2)本发明使用正向渗透膜浓缩技术对提取液进行浓缩，正向渗透膜截留分子量为5000Da，填充剂为100倍吸水接枝淀粉，在实现浓缩的同时可以去除提取液中胰蛋白酶酶解产生的小分子肽段，浓缩分离效率高，操作简单。正向渗透膜处理过程无需外加压力，有利于降低能耗，而且接枝淀粉经离心脱水后可重复使用，节约成本。

(3)本发明将胰蛋白酶酶解、阳离子交换树脂脱酶和正向渗透膜浓缩去除酶解肽段工艺串联用于灵芝多糖的精制，蛋白杂质去除彻底，制备的多糖纯度高。脱蛋白过程条件温和，不使用有机试剂，多糖结构稳定、损失率低，工艺环境友好。

本发明中使用的干燥灵芝原料来源于安徽省金寨县；胰蛋白酶购于生工生物工程(上海)股份有限公司；阳离子交换树脂购于北京索莱宝科技有限公司；接枝淀粉购于通达变性淀粉有限公司；恒温超声提取机购于北京弘祥隆生物技术开发有限公司；pH计购于上海博取仪器有限公司；离心机购于上海天美生化仪器设备工程有限公司；小型喷雾干燥机购于上海欧蒙实业有限公司；精制灵芝多糖紫外光谱分析和红外光谱分析参考《现代仪器分析》，付敏、程弘夏主编，化学工业出版社出版。

附图说明

图1多糖精制工艺流程图；

图2精制多糖紫外扫描图；

图3精制多糖红外图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例，对本发明做进一步说明。本发明的特点和优点将随着描述而更清楚，但示例性的实施例仅仅用来说明本发明，并不对本发明的范围构成任何限制。

实施例1

(1)干燥灵芝子实体经粉碎后过100目筛网，得灵芝子实体粉末；

(2)取100g灵芝子实体粉末加入50倍质量的水中，进行超声提取，离心取上清液，得多糖粗提液4756g；

(3)调节多糖粗提液pH为7.8，加入胰蛋白酶，在38℃条件下酶解提取液中蛋白杂质，离心取上清液，得多糖酶解液4741g；

(4)在多糖酶解液中加入阳离子交换树脂，搅拌，去除残留的胰蛋白酶，过滤取滤液，得多糖精提液4690g；

(5)多糖精提液经正向渗透膜处理，得多糖精提浓缩液1000g；

(6)多糖精提浓缩液经喷雾干燥，得精制多糖干粉1.98g，从附图2可知多糖干粉没有蛋白质，多糖干粉的红外光谱图见附图3。

其中，步骤(2)中超声提取条件为超声功率1000W、提取温度80℃，提取时间60min。

其中，步骤(3)中胰蛋白酶的添加量为多糖粗提液质量的0.1％，酶活为120U/mg，酶解时间为15h。

其中，步骤(4)中阳离子交换树脂为带有磺酸基的大孔结构树脂，阳离子交换树脂添加量为20g/L，脱酶处理时间为1.0h，搅拌速度50r/min。

其中，步骤(5)中正向渗透膜的截留分子量为5000Da，填充物为100倍吸水率接枝淀粉，填充量为灵芝多糖精提液质量的15％，吸水接枝淀粉经离心脱水可重复使用4次。

其中，步骤(6)喷雾干燥的条件为进风温度180℃，出风温度60℃，流速10mL/min。

通过以上步骤精制的灵芝子实体多糖蛋白质去除彻底，纯度高。

实施例2

(1)干燥破壁灵芝孢子经粉碎后过100目筛网，得灵芝孢子粉末；

(2)取100g灵芝孢子粉末加入80倍质量的水中，进行超声提取，离心取上清液，得多糖粗提液7732g；

(3)调节多糖粗提液pH为7.8，加入胰蛋白酶，在38℃条件下酶解提取液中蛋白杂质，离心取上清液，得多糖酶解液7713g；

(4)在多糖酶解液中加入阳离子交换树脂，搅拌，去除残留的胰蛋白酶，过滤取滤液，得多糖精提液7656g；

(5)多糖精提液经正向渗透膜处理，得多糖精提浓缩液1000g；

(6)多糖精提浓缩液经喷雾干燥，得精制多糖干粉2.33g。

其中，步骤(2)中超声提取条件为超声功率1500W、提取温度80℃，提取时间150min。

其中，步骤(3)中胰蛋白酶的添加量为灵芝多糖粗提液质量的0.15％，酶活为120U/mg，酶解时间为15h。

其中，步骤(4)中阳离子交换树脂为带有磺酸基的大孔结构树脂，阳离子交换树脂添加量为20g/L，脱酶处理时间为1.0h，搅拌速度60r/min。

其中，步骤(5)中正向渗透膜的截留分子量为5000Da，填充物为100倍吸水率接枝淀粉，填充量为灵芝多糖精提液质量的25％，吸水接枝淀粉经离心脱水可重复使用4次。

其中，步骤(6)喷雾干燥的条件为进风温度180℃，出风温度80℃，流速10mL/min。

通过以上步骤精制的灵芝孢子多糖蛋白质去除彻底，纯度高。

实施例3

(1)干燥灵芝发酵菌丝体经粉碎后过100目筛网，得灵芝菌丝体粉末；

(2)取100g灵芝菌丝体粉末加入60倍质量的水中，进行超声提取，离心取上清液，得多糖粗提液5741g；

(3)调节多糖粗提液pH为7.8，加入胰蛋白酶，在38℃条件下酶解提取液中蛋白杂质，离心取上清液，得多糖酶解液5726g；

(4)在多糖酶解液中加入阳离子交换树脂，搅拌，去除残留的胰蛋白酶，过滤取滤液，得多糖精提液5669g；

(5)多糖精提液经正向渗透膜处理，得多糖精提浓缩液1000g；

(6)多糖精提浓缩液经喷雾干燥，得精制多糖干粉1.86g。

其中，步骤(2)中超声提取条件为超声功率1500W、提取温度70℃，提取时间45min。

其中，步骤(3)中胰蛋白酶的添加量为灵芝多糖粗提液质量的1.5％，酶活为120U/mg，酶解时间为15h。

其中，步骤(4)中阳离子交换树脂为带有磺酸基的大孔结构树脂，阳离子交换树脂添加量为20g/L，脱酶处理时间为1.0h，搅拌速度50r/min。

其中，步骤(5)中正向渗透膜的截留分子量为5000Da，填充物为100倍吸水率接枝淀粉，填充量为灵芝多糖精提液质量的25％，吸水接枝淀粉经离心脱水可重复使用4次。

其中，步骤(6)喷雾干燥的条件为进风温度200℃，出风温度80℃，流速10mL/min。

通过以上步骤精制的灵芝发酵菌丝体多糖蛋白质去除彻底，纯度高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，本发明的工艺同样适用于其他植物、动物、微生物来源多糖的精制，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种灵芝多糖的精制工艺，其特征在于包括以下步骤：

(1)干燥灵芝原料经粉碎后过100目筛网，得灵芝粉末；

(2)将灵芝粉末加入50～100倍质量的水中，进行超声提取，离心取上清液，得灵芝多糖粗提液；

(3)调节灵芝多糖粗提液pH至7.8～8.5，加入胰蛋白酶，在35～40℃条件下酶解提取液中蛋白杂质，离心取上清液，得灵芝多糖酶解液；

(4)在灵芝多糖酶解液中加入阳离子交换树脂，搅拌，去除残留的胰蛋白酶，过滤取滤液，得灵芝多糖精提液；

(5)灵芝多糖精提液经正向渗透膜处理，得灵芝多糖精提浓缩液；

(6)灵芝多糖精提浓缩液经喷雾干燥，得精制灵芝多糖干粉。

2.根据权利要求1所述的一种灵芝多糖的精制工艺，其特征在于：步骤(1)中的灵芝原料包括灵芝子实体、破壁灵芝孢子和灵芝发酵菌丝体。

3.根据权利要求1所述的一种灵芝多糖的精制工艺，其特征在于：步骤(2)中超声提取条件为超声功率500～2000W、超声提取温度60～90℃，超声提取时间30～150min。

4.根据权利要求1所述的一种灵芝多糖的精制工艺，其特征在于：步骤(3)中胰蛋白酶的添加量为灵芝多糖粗提液质量的0.05～0.5％，酶活为120U/mg，酶解时间为10～20h。

5.根据权利要求1所述的一种灵芝多糖的精制工艺，其特征在于：步骤(4)中阳离子交换树脂为带有磺酸基的大孔结构树脂，阳离子交换树脂添加量为5～30g/L，脱酶处理时间为0.5～1.5h，搅拌速度50～100r/min。

6.根据权利要求1所述的一种灵芝多糖的精制工艺，其特征在于：步骤(5)中正向渗透膜的截留分子量为5000Da，填充物为100倍吸水率接枝淀粉，填充量为灵芝多糖精提液质量的10～30％，吸水接枝淀粉经离心脱水可重复使用4～5次。

7.根据权利要求1所述的一种灵芝多糖的精制工艺，其特征在于：步骤(6)喷雾干燥的条件为进风温度180～200℃，出风温度60～80℃，流速10～20mL/min。