CN102283870A - 一种高纯度银杏叶组合物，含其制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高纯度银杏叶组合物，含其制剂及其制备方法，该组合物中由重量比为3-9∶1银杏总黄酮精制物和银杏总内酯精制物组成，且该组合物中总银杏酸含量不超过百万分之三。总黄酮和内酯的纯度高，杂质少，由其制备的注射剂颜色浅，有效成分比例适宜，质量稳定，安全有效。

Description

一种高纯度银杏叶组合物,含其制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及中药提取物的制备方法，具体涉及一种银杏叶组合物及其制备方法。

背景技术

银杏，为银杏科银杏属多年生落叶乔木银杏，在地球上存在约2亿多年，素有“天然活化石”之称。

银杏又名公孙树、白果树等，其种子白果仁作为止咳平喘、缩小便、止带浊的中药在我国已有很久历史。其叶子银杏叶又称白果叶，味苦、甘涩、性平、小毒。银杏叶的化学成分很复杂，迄今已发现170多种化合物，主要为黄酮类、萜类、醇类、生物碱类、聚异戊二烯类、多糖等具有药理作用的活性成分，有毒成分为银杏酸。

银杏叶药用最早载于《神农本草经》，早在宋朝我国民间就使用银杏叶治疗哮喘和支气管炎。我国药典中记载银杏叶有润肺、平喘、止痛之功效，用于肺虚咳嗽、冠心病心绞痛等。

现代研究证实，银杏叶提取物具有以下方面的应用：

1、治疗冠心病心绞痛：60年代我国利用银杏叶提取物“6911”治疗冠心病，银杏叶提取物对治疗冠心病心绞痛有明显的作用，可改善冠脉血流量、减少冠脉阻力、减少心肌耗氧量，可明显改善冠心病患者的临床症状，如对头晕、胸闷、心悸、气短、乏力等均有较好的改善作用；

2、治疗高脂血症，银杏叶提取物对高脂血症有治疗作用，可明显降低血脂水平，降低中老年人冠心病的发病率；

3、治疗脑血管疾病：通过对银杏叶提取物制剂的临床研究，发现他能够改善细胞血液循环、活化细胞代谢，因此对老年痴呆症、脑损伤后遗症、脑血栓等疾病的疗效显著；

4、抗癌作用：银杏叶提取物还能抑制亚硝胺等物质的致癌作用。

目前国内报道的银杏叶提取方法的文献有很多，如中国专利申请97116798.2公开了一种超临界二氧化碳从银杏叶中萃取分离黄酮和萜内酯的方法，将银杏叶装入萃取釜内，升温到50-60℃，开动二氧化碳泵，升压到25-35兆帕，开动改性剂泵送出改性剂，使二氧化碳和改性剂在预热器内预热并送入萃取釜，动态萃取3-5小时，停泵、降压，从萃取泵放出含有银杏黄酮类萃取物，和从分离器内放出银杏萜内酯类萃取物。但超临界萃取法存在设备复杂，产品稳定性差的缺点，不利于大规模生产。

中国专利申请00120352.5公开了一种微波提取银杏黄酮和银杏内酯类物质的方法，采用频率为2450MHz或915MHz、功率为500-15000瓦的微波对银杏叶在选自水、C₁-C₄的醇、乙醚、丙酮或其混合物的溶剂中进行处理，从银杏叶提取银杏黄酮和萜内酯类物质的方法。但目前微波萃取基本上还停留在实验室小样品的提取及分析，使用设备简陋，有的还使用家用微波炉。工业化微波提取器尚未见报道。

中国专利申请200810162070.1公开了一种银杏叶提取物的制备方法及其应用，包括如下步骤：a)将银杏叶洗净、烘干；b)粉碎、过筛；c)乙醇浸泡(所用酒精浓度为70-80％)；d)超声波细胞粉碎机振荡；e)提取、过滤；f)真空浓缩、干燥。其采用超声波辅助提取的方法，加速药物有效成分进入溶剂，同时免去高温对提出成分的影响，提取物的得率有较大的提高。提取物中黄酮类物质含量高达36％，银杏萜内酯类含量也高达8％以上，而有害物酚酸少于3ppm。但受超声波衰减因素的制约，超声有效作用区域为一环形，导致提取罐不能太大，否则中央就会形成超声空白区，影响提取效果。而且，功率也难以和罐容积相匹配，超声设备制造难度大，成本高，不适宜大生产。

目前大生产常规用法还是化学溶剂浸提法，并结合萃取法、树脂吸附法分离、精制银杏叶提取物。如中国专利申请200610072435.2公开了一种银杏叶提取物及该提取物高纯度有效成分的分离生产工艺，公开了一种提取并分离高纯度银杏内酯和银杏黄酮的方法。采用大孔吸附树脂色谱分离技术，将银杏药材用水提取，水提液直接上大孔吸附树脂柱，再依次用蒸馏水，5-25％乙醇，0.01-10％碱水，蒸馏水和30-95％乙醇洗脱大孔吸附树脂柱，分别收集碱水洗脱液和30-95％乙醇洗脱液，再分别浓缩、纯化可得到高纯度的银杏内酯或银杏黄酮。但该方法采用多步进行洗脱，有效成分损失较大。

为了除去银杏叶中的毒性成分银杏酸，也有报道在提取过程中增加萃取步骤进行脱除。如中国专利申请03131915.7公开了一种萃取法从银杏叶提取物中脱除银杏酸的方法，一种通过有机溶剂萃取从银杏叶提取物中脱除银杏酸的方法。其主要含精制、萃取、干燥几道工序，其中精制工序是将粉碎后的银杏叶提取物加入甲醇或乙醇搅拌溶解放置、过滤、减压浓缩干燥；萃取工序是取精制后的银杏叶提取物用乙醇或丙酮搅拌溶解后加入到萃取器中，加入烷烃类物质，混和均匀后静置分层，去除上层，下层重复操作数次，将下层物质放置在干燥设备中进行干燥。能够获得银杏酸小于5ppm的银杏叶提取物。

中国专利申请02129905.6公开了银杏叶提取物中由银杏叶总黄酮苷提取物A和银杏叶总内酯提取物B混合而成，提取物A中含总黄酮苷的量为65％以上，提取物B含总内酯75％以上，提取物A和提取物B的混合比例为4.20-5.0∶1.05-1.80(折算后总黄酮苷与总内酯的比为2.73-3.25∶0.79-1.35)，混合后提取物含总黄酮苷和总内酯65％以上，银杏酸含量小于5ppm。其中上述提取物A的制备方法为：取含银杏叶黄酮苷大于24％和银杏内酯大于6％的银杏叶初提取物，加水超声提取，取上清液，上聚酰胺柱，其中初提取物与聚酰胺的比例为1∶8-15，用水清洗，弃去保留体积的水，收集所有内酯馏分，供提取银杏叶总内酯用，继用60％乙醇洗脱，初提取物与洗脱剂60％乙醇的比例为1∶80-120，洗脱液减压浓缩、喷雾干燥，得黄棕色粉末，该粉末加丙酮超声提取2次，提取液过滤、减压浓缩至干，干固物加醋酸乙酯搅拌处理、过滤、滤渣真空干燥、研细得淡黄色粉末即为提取物A；提取物B的制备：取总黄酮苷提取物制备过程中的聚酰胺用水洗脱的内酯馏分，减压浓缩，醋酸乙酯提取，醋酸乙酯提取液真空浓缩、干燥、研细得提取物B；或聚酰胺用水洗脱的内酯馏分经浓缩、冷却、结晶、过滤，得白色内酯结晶物，内酯结晶物经真空干燥，研细备用，母液在用醋酸乙酯提取，取醋酸乙酯提取液，浓缩、真空干燥、研细得浅黄白色的粉末，加入上述内酯结晶物，混合均匀即为提取物B。

上述方法中在制备银杏叶总黄酮苷提取物A时使用了传统的聚酰胺树脂，该树脂带有酰胺基，对醇羟基具有良好的吸附效果，而对内酯则基本没有吸附能力，但是其除杂效果并不理想；第二，在聚酰胺树脂洗脱时，先用水洗脱，再用60％乙醇洗脱，先用水洗脱不能很好的去除杂质，需要增加后续步骤除杂，而用60％乙醇洗脱，对总黄酮的洗脱能力较差，获得的总黄酮含量较低；第三，因为上述步骤导致最后得到的总黄酮纯度不高，因此增加了用丙酮、乙酸乙酯处理的步骤，增加了带入新杂质的风险。

为了克服现有技术中杂质含量高，总黄酮、内酯含量少的缺点，发明人经过大量的实验研究证实，最后提出了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种银杏叶组合物及其制备方法。

本发明提供的一种银杏叶组合物，由重量比为3-9∶1银杏总内酯精制物和银杏总黄酮精制物组成，且该组合物中总银杏酸含量不超过百万分之三。

优选地，本发明提供的银杏叶组合物，由重量比为4-8∶1银杏总内酯精制物和银杏总黄酮精制物组成，且该组合物中总银杏酸含量不超过百万分之二。

优选地，本发明提供的银杏叶组合物，由重量比为5-7∶1银杏总内酯精制物和银杏总黄酮精制物组成，且该组合物中总银杏酸含量不超过百万分之一。

上述所述银杏总内酯精制物中含有75％以上的银杏内酯A、B和C的混合物；所述银杏总黄酮精制物中含有72％以上的银杏总黄酮醇苷。

说明：银杏总黄酮精制物和银杏总内酯精制物是个混合物，其控制指标是总黄酮醇苷和银杏内酯A、B、C，表明其纯度。

本发明还提供了一种制备银杏叶组合物的方法，包括以下步骤：

1)银杏叶粗粉用85-95％乙醇提取3次，每次1-3小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味并浓缩至每1ml药液中的生药量不少于1g，加水稀释，冷藏静置6-24小时，过滤，滑石粉助滤，过ADS-17树脂柱，先用水冲洗，后用70％乙醇洗脱，待有效成分流出时开始收集洗脱液，浓缩，得银杏粗提物；将银杏粗提物用乙醇溶解，冷藏，过滤，上ADS-F8树脂柱，分别用10％和70％乙醇进行洗脱，分别收集洗脱液，得到银杏总黄酮和银杏总内酯；

2)将银杏总黄酮经冷热处理后，干燥，得银杏总黄酮精制物；

3)将银杏总内酯经乙酸乙酯萃取，得银杏总内酯精制物；

4)将银杏总黄酮精制物和银杏总内酯精制物混合，即得。

本发明还提供了一种含银杏叶组合物的制剂，该制剂由上述银杏叶组合物和药学上可接受的载体或稀释剂组成。

所述制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液、悬浮液或注射剂，所述注射剂为注射液、注射用无菌粉末、注射用冻干粉和注射用浓溶液。

优选地，所述制剂为注射液，其中活性成分的含量为：总黄酮醇苷的含量不少于0.70mg/ml，银杏内酯A的含量不少于0.07mg/ml，银杏内酯B的含量不少于0.03mg/ml，银杏内酯C的含量不少于0.04mg/ml。

所述药学上可接受的载体或稀释剂选自填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、增溶剂、抗氧剂、pH调节剂、等渗调节剂、络合剂、非水溶剂、乳化剂中的一种或几种。

所述填充剂选自淀粉、甘露醇、山梨醇、乳糖、蔗糖或微晶纤维素；

所述崩解剂选自交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、交联聚维酮或羧甲基淀粉钠；

所述粘合剂选自淀粉、交联聚维酮或糊精；

所述润滑剂选自硬脂酸镁、硬脂酸、二氧化硅或滑石粉。

所述增溶剂选自泊洛沙姆124、188、237、338、407或吐温-80。

所述抗氧剂选自没食子酸丙酯或谷胱甘肽。

所述pH调节剂选自氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠或盐酸。

所述等渗调节剂选自氯化钠或葡萄糖。

所述络合剂选自依地酸钙钠。

所述非水溶剂选自乙醇、丙二醇或植物油。

所述乳化剂选自卵磷脂、豆磷脂、胆固醇、甘油单油酸脂或泊洛沙姆68。

上述制剂可采用本领域常规的工艺制备。

本发明还提供了银杏叶组合物及其制剂在制备防治冠心病、心绞痛；脑梗塞、痴呆；视网膜静脉阻塞；消化性溃疡、酒精肝、脂肪肝；肾小球肾炎、肾病综合症、肾功能衰竭；肺心病；精神分裂症、抑郁症；突发性耳聋、噪声性耳聋的药物中的应用。

本发明提供的银杏叶提取物的关键点是：

1、采用高浓度乙醇进行热回流提取

目前采用化学溶剂提取银杏叶的报道中，所用溶剂有水、乙醇和丙酮，其中银杏叶中有效成分更易溶于乙醇，水提取不但有效成分的提取率低，而且一并提出的杂质较多，不利于后续的处理步骤；丙酮对人体的危害较大，一般不宜使用。而采用稀乙醇提取是目前的主流工艺，主要采用浓度为50-60％的稀乙醇，但稀乙醇提取也存在一定问题，在提取的过程中提出较多水溶性杂质，加重了后续处理的难度，一旦处理不到位，将导致产品颜色深，质量稳定性差等问题。

本发明采用高浓度乙醇进行热回流提取，避免了稀乙醇提取带来的不良影响，最大限度的降低了水溶性杂质的带入，缓解了后续处理的难度，而且，提出的不同类别的有效成分含量均很高。

2、低温水沉

常规方法为在常温情况下水沉静置，通常去除杂质的效果不显著，往往导致上树脂吸附前的药液不澄清，不但污染树脂，而且增加后续处理步骤的难度。本发明采用低温冷沉，除杂效果显著，药液澄明，对树脂污染小。

3、采用针对性强的树脂进行分离

现有银杏黄酮和银杏内酯的树脂分离方法效果差，本发明通过选择高选择性树脂分离有效成分，避免了常规选择D101、HPD450等树脂进行分离提取，选择性差，有效成分含量低，内酯、黄酮比例不协调等缺点。

本发明提供的银杏叶组合物的优点：

1、与现有技术相比，尤其是中国专利申请02129905.6(简称02年专利)相比，本发明的区别在于：

1)02年专利在制备银杏叶总黄酮苷提取物A时采用了传统的聚酰胺树脂，该树脂带有酰胺基，对醇羟基具有良好的吸附效果，而对内酯则基本没有吸附能力，因此可以将内酯、黄酮分开，同时去除鞣质，但现在普遍的观点是聚酰胺树脂除杂效果并不理想。本发明使用的ADS-F8是酰胺型树脂，是一种极性凝胶型氢键选择吸附性树脂，对黄酮类化合物具有极高的选择性，兼顾了聚酰胺树脂对鞣质的吸附和凝胶树脂的除杂效果，与聚酰胺树脂比较来说，对色素的去除效果更好。

2)洗脱液及浓度不同：02年专利先用水洗脱，再用60％乙醇洗脱，而本发明是先用10％乙醇洗脱，再用70％乙醇洗脱：10％乙醇较水而言，能更好的去除杂质，避免后续为除杂而增加处理步骤，进而更大的损失有效成分；70％乙醇较60％乙醇而言，对总黄酮的洗脱能力更佳，获得的总黄酮含量高。

3)总黄酮部分的纯化不同：由于前面的步骤不同，导致02年专利为了得到纯度高的总黄酮，不得不用丙酮、乙酸乙酯进行处理，增加了带入新杂质的风险。而本发明前面的处理较好，后续不需再特意除杂，仅进行冷热处理即可，简单、方便，不会带入新杂质。

2、本发明提供的组合物中银杏总黄酮和银杏总内酯的纯度高，采用冷藏、专用树脂分离等步骤对药液进行处理，有效去除杂质，最终产品中杂质少，由其制备的注射剂颜色浅，有效成分比例适宜，质量稳定，安全有效。

3、本发明提供的组合物可以治疗急性脑梗死、心绞痛、痴呆，效果优于上市剂型及02129905.6专利产品。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

BV是指柱体积，1BV指1个柱体积。

实施例1：银杏叶组合物

1、提取方法：

1)银杏叶粗粉用乙醇提取3次，第一次加5倍量95％乙醇浸泡0.5小时后再回流提取3小时，第二次加3倍量90％乙醇提取2小时，第三次加2倍量90％乙醇提取2小时，滤过，减压回收乙醇至无醇味，并浓缩至含生药1g/ml，加4倍量水稀释，冷却，10℃以下静置12小时，过滤，滑石粉助滤，以1BV/h的流速过ADS-17树脂柱，先用树脂2倍量纯化水以1BV/h的流速冲洗，后用树脂2倍量70％乙醇以1BV/h的流速洗脱，待有效成分流出时开始收集洗脱液，回收乙醇至无醇味，得银杏粗提物。将银杏粗提物用20倍量的60％乙醇溶解，10℃以下静置12小时，过滤至澄清，加乙醇并使含醇量达到10％，以0.7BV/h的流速过ADS-F8树脂柱，先用1BV的10％乙醇以0.7BV/h的流速冲洗，收集流出液和冲洗液，回收乙醇至无醇味，得到银杏总内酯；然后用树脂3倍量70％乙醇以0.7BV/h的流速洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至无醇味，得到银杏总黄酮；

2)将银杏总黄酮用乙醇溶解至含生药0.7g/ml，煮沸15分钟，5℃以下放置40小时，过滤至澄清，浓缩，干燥，粉碎得银杏总黄酮精制物(收率0.74％)；

3)将银杏总内酯用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯的用量均为总内酯的0.5倍，合并3次萃取的乙酸乙酯溶液，依次加入0.3倍量的3％的乙酸钠溶液和1倍量纯化水进行洗涤，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯至近干，减压干燥，得银杏总内酯精制物(收率0.66％)；

4)将银杏总黄酮精制物和银杏总内酯精制物按6∶1比例混合，即得。

2、含量测定方法及结果：

1)总黄酮醇苷照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50∶50)为流动相；检测波长为368nm。理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500；分离度按山奈素与异鼠李素峰计算，应大于1.5。

对照品溶液的制备：分别精密称取槲皮素对照品、山奈素对照品、异鼠李素对照品，加甲醇制成每1ml分别含30μg、30μg、20μg的混合溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：取本品(实施例1制备的银杏叶组合物)约35mg，精密称定，加甲醇-25％盐酸溶液(4∶1)的混合溶液25ml，置水浴中加热回流30分钟，迅速冷却至室温，转移至50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，分别计算槲皮素、山奈素与异鼠李素的含量，按下式换算成总黄酮醇苷的含量：

总黄酮醇苷含量＝(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)×2.51

2)银杏内酯 照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-四氢呋喃-水(20∶10∶75)为流动相；用蒸发光散射检测器检测。理论板数按银杏内酯A峰计算应不低于5000。

对照品溶液的制备：精密称取银杏内酯A对照品、银杏内酯B对照品和银杏内酯C对照品适量，加丙酮制成每1ml各含1.5mg、0.25mg、0.5mg的混合溶液，即得。

供试品溶液的制备：精密量取本品(实施例1制备的银杏叶组合物)52.5mg，加水4ml溶解，加稀盐酸2滴，调节pH值至2，用乙酸乙酯提取4次(20ml、10ml、10ml、10ml)，合并乙酸乙酯液，用5％醋酸钠溶液20ml洗涤，分取乙酸乙酯液，醋酸钠溶液再以乙酸乙酯10ml洗涤，合并乙酸乙酯液及洗液，用水洗涤2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加丙酮适量使溶解，并转移至2ml量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液3μl与10μl，供试品溶液5μl-10μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C的含量，即得。

3)总银杏酸：照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-1％冰醋酸溶液(90∶10)为流动相；检测波长为310nm。理论板数按白果新酸峰计算应不低于4000。

对照品溶液的制备：精密称取白果新酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含5μg的溶液，作为对照品溶液。另取总银杏酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含100μg的溶液，作为定位用对照溶液。

供试品溶液的制备：取本品粉末(实施例1制备的银杏叶组合物)约10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入石油醚(60-90℃)50ml，称定重量，回流提取2小时，放冷，在称定重量，用石油醚(60-90℃)补足减失的重量，振摇，滤过。精密量取续滤液25ml，减压回收溶剂至干，精密加入甲醇2ml，密塞，摇匀，即得。

测定法：分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液及定位用对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，计算供试品溶液中与总银杏酸对照品相应色谱峰的总峰面积，以白果新酸对照品外标法计算总银杏酸含量，即得。

本实施例中，总黄酮精制物中总黄酮的纯度为74％，总内酯精制物中总内酯的纯度为95％，未检出总银杏酸。

实施例2：银杏叶组合物

1、提取方法：

1)银杏叶粗粉用乙醇提取3次，第一次加6倍量90％乙醇浸泡0.5小时后再回流提取3小时，第二次加4倍量85％乙醇提取2小时，第三次加3倍量85％乙醇提取1小时，滤过，减压回收乙醇至无醇味，并浓缩至含生药1.5g/ml，加6倍量水稀释，冷却至10℃以下静置8小时，过滤，滑石粉助滤，以1.2BV/h的流速过ADS-17树脂柱，先用树脂3倍量纯化水以1.2BV/h的流速冲洗，后用树脂2倍量70％乙醇以1.2BV/h的流速洗脱，待有效成分流出时开始收集洗脱液，回收乙醇至无醇味，得银杏粗提物。将银杏粗提物用18倍量60％乙醇溶解，10℃以下静置12小时，过滤至澄清，加乙醇并使醇量达到10％，以0.6BV/h的流速过ADS-F8树脂柱，先用2BV的10％乙醇以0.6BV/h的流速冲洗，收集流出液和冲洗液，回收乙醇至无醇味，得到银杏总内酯；然后用树脂4倍量70％乙醇以0.6BV/h的流速洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至无醇味，得到银杏总黄酮；

2)将银杏总黄酮用乙醇溶解至含生药0.6g/ml，煮沸15分钟，5℃以下放置38小时，过滤至澄清，浓缩，干燥，粉碎得银杏总黄酮精制物(收率0.59％)；

3)将银杏总内酯用乙酸乙酯萃取4次，乙酸乙酯的用量均为总内酯的0.5倍，合并4次萃取的乙酸乙酯溶液，依次加入0.5倍量3％的乙酸钠溶液和2倍量的纯化水进行洗涤，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯至近干，减压干燥，得银杏总内酯精制物(收率0.49％)；

4)将银杏总黄酮精制物和银杏总内酯精制物按3∶1比例混合，即得。

2、含量检测方法及结果：检测方法同实施例1，本实施例中，总黄酮精制物中总黄酮的纯度为98％，总内酯精制物中总内酯的纯度为75％，未检出总银杏酸。

实施例3：银杏叶组合物

1、提取方法：

1)银杏叶粗粉用乙醇提取3次，第一次加4倍量94％乙醇浸泡0.5小时后再回流提取3小时，第二次加3倍量88％乙醇提取2小时，第三次加2倍量85％乙醇提取1小时，滤过，减压回收乙醇至无醇味，并浓缩至含生药1.2g/ml，加4.8倍量水稀释，冷却至10℃以下静置24小时，过滤，滑石粉助滤，以1BV/h的流速过ADS-17树脂柱，先用树脂2.5倍量纯化水以1BV/h的流速冲洗，后用树脂1.5倍量70％乙醇以1BV/h的流速洗脱，待有效成分流出时开始收集洗脱液，回收乙醇至无醇味，得银杏粗提物。将银杏粗提物用16倍量60％乙醇溶解，10℃以下静置18小时，过滤至澄清，加乙醇并使含醇量达到10％，以0.7BV/h的流速过ADS-F8树脂柱，先用3BV的10％乙醇以0.7BV/h的流速冲洗，收集流出液和冲洗液，回收乙醇至无醇味，得到银杏总内酯；然后用树脂3倍量70％乙醇以0.7BV/h的流速洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至无醇味，得到银杏总黄酮；

2)将银杏总黄酮用乙醇溶解至含生药0.8g/ml，煮沸15分钟，5℃以下放置30小时，过滤至澄清，浓缩，干燥，粉碎得银杏总黄酮精制物(收率0.67％)；

3)将银杏总内酯用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯的用量分别为总内酯的0.65倍、0.5倍和0.35倍，合并3次萃取的乙酸乙酯溶液，依次加入0.4倍量3％的乙酸钠溶液和1.5倍量纯化水进行洗涤，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯至近干，减压干燥，得银杏总内酯精制物(收率0.52％)；

4)将银杏总黄酮精制物和银杏总内酯精制物按9∶1比例混合，即得。

2、含量检测方法及结果：检测方法同实施例1，本实施例中，总黄酮精制物中总黄酮的纯度为72％，总内酯精制物中总内酯的纯度为98％，未检出总银杏酸。

实施例4：银杏叶组合物

1、提取方法：

1)银杏叶粗粉用乙醇提取3次，第一次加5倍量88％乙醇浸泡0.5小时后再回流提取3小时，第二次加4倍量88％乙醇提取2小时，第三次加3倍量85％乙醇提取2小时，滤过，减压回收乙醇至无醇味，并浓缩至含生药2g/ml，加8倍量水稀释，冷却至10℃以下静置6小时，过滤，滑石粉助滤，以1.5BV/h的流速过ADS-17树脂柱，先用树脂2倍量纯化水以1.5BV/h的流速冲洗，后用树脂2倍量70％乙醇以1.5BV/h的流速洗脱，待有效成分流出时开始收集洗脱液，回收乙醇至无醇味，得银杏粗提物。将银杏粗提物用20倍量60％乙醇溶解10℃以下静置16小时，过滤至澄清，加乙醇并使含醇量达到10％，以0.7BV/h的流速过ADS-F8树脂柱，先用2.5BV的10％乙醇以0.7BV/h的流速冲洗，收集流出液和冲洗液，回收乙醇至无醇味，得到银杏总内酯；然后用树脂2.5倍量70％乙醇以0.7BV/h的流速洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至无醇味，得到银杏总黄酮；

2)将银杏总黄酮用乙醇溶解至含生药0.7g/ml，煮沸15分钟，5℃以下放置35小时，过滤至澄清，浓缩，干燥，粉碎得银杏总黄酮精制物(收率0.70％)；

3)将银杏总内酯用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯的用量均为总内酯的0.5倍，合并3次萃取的乙酸乙酯溶液，依次加入0.5倍量3％的乙酸钠溶液和1倍量纯化水进行洗涤，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯至近干，减压干燥，得银杏总内酯精制物(收率0.57％)；

4)将银杏总黄酮精制物和银杏总内酯精制物按8∶1比例混合，即得。

2、含量检测方法及结果：检测方法同实施例1，本实施例中，总黄酮精制物中总黄酮的纯度为75％，总内酯精制物中总内酯的纯度为96％，未检出总银杏酸。

实施例5：银杏叶组合物

1、提取方法：

1)银杏叶粗粉用乙醇提取3次，第一次加5倍量92％乙醇浸泡0.5小时后再回流提取2.5小时，第二次加4倍量87％乙醇提取2小时，第三次加3倍量85％乙醇提取1.5小时，滤过，减压回收乙醇至无醇味，并浓缩至含生药1.5g/ml，加6倍量水稀释，冷却至10℃以下静置16小时，过滤，滑石粉助滤，以1.2BV/h的流速过ADS-17树脂柱，先用树脂3倍量纯化水以1.2BV/h的流速冲洗，后用树脂2倍量70％乙醇以1.2BV/h的流速洗脱，待有效成分流出时开始收集洗脱液，回收乙醇至无醇味，得银杏粗提物。将银杏粗提物用19倍量60％乙醇溶解，10℃以下静置18小时，过滤至澄清，加乙醇并使含醇量达到10％，以0.5BV/h的流速过ADS-F8树脂柱，先用1BV的10％乙醇以0.5BV/h的流速冲洗，收集流出液和冲洗液，回收乙醇至无醇味，得到银杏总内酯；然后用树脂2倍量70％乙醇以0.5BV/h的流速洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至无醇味，得到银杏总黄酮；

2)将银杏总黄酮用乙醇溶解至含生药0.8g/ml，煮沸15分钟，5℃以下放置40小时，过滤至澄清，浓缩，干燥，粉碎得银杏总黄酮精制物(收率0.78％)；

3)将银杏总内酯用乙酸乙酯萃取4次，乙酸乙酯的用量分别为总内酯的0.65倍、0.5倍、0.5倍和0.35倍，合并4次萃取的乙酸乙酯溶液，依次加入0.4倍量3％的乙酸钠溶液和2倍量纯化水进行洗涤，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯至近干，减压干燥，得银杏总内酯精制物(收率0.70％)；

4)将银杏总黄酮精制物和银杏总内酯精制物按4∶1比例混合，即得。

2、含量检测方法及结果：

检测方法同实施例1，本实施例中，总黄酮精制物中总黄酮的纯度为85％，总内酯精制物中总内酯的纯度为84％，未检出总银杏酸。

实施例6：银杏叶组合物注射液

1、制备方法：

1)取实施例1的银杏叶组合物，用注射用水溶解，200目绢布、0.22μm滤膜过滤，再经过超滤器超滤，使含总黄酮醇苷1.0mg/ml，搅拌10分钟；

2)用浓度为10％的NaOH调pH值至5.1，加热至80℃，加入配制总量0.3％的活性炭脱色，搅拌均匀，煮沸15分钟，冷却至60℃以下调pH值至5.0，定容，过滤，药液降温至30℃以下经0.22μm滤器精滤，灌装，115℃30分钟灭菌，包装，即得。

2、含量检测方法及结果：

1)总黄酮醇苷照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50∶50)为流动相；检测波长为368nm。理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500；分离度按山奈素与异鼠李素峰计算，应大于1.5；

对照品溶液的制备：取经五氧化二磷干燥至恒重的槲皮素对照品、山奈素对照品、异鼠李素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含30μg、30μg、20μg的混合溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备：精密量取本品(实施例6制备的注射液)10ml，加甲醇16ml，18％盐酸溶液6ml，置水浴中加热回流1.5小时，迅速冷却至室温，转移至50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，分别计算槲皮素、山奈素与异鼠李素的含量，按下式换算成总黄酮醇苷的含量：

总黄酮醇苷含量＝(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)×2.51。

2)银杏内酯 照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-四氢呋喃-水(20∶10∶75)为流动相；用蒸发光散射检测器检测。理论板数按银杏内酯A峰计算应不低于5000；

对照品溶液的制备 精密称取银杏内酯A对照品、银杏内酯B对照品和银杏内酯C对照品适量，加丙酮制成每1ml各含1.5mg、0.25mg、0.5mg的混合溶液，即得。

供试品溶液的制备 精密量取本品(实施例6制备的注射液)15ml，加稀盐酸2滴，调节pH值至2，用乙酸乙酯提取4次(20ml、10ml、10ml、10ml)，合并乙酸乙酯液，用5％醋酸钠溶液20ml洗涤，分取乙酸乙酯液，醋酸钠溶液再以乙酸乙酯10ml洗涤，合并乙酸乙酯液及洗液，用水洗涤2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加丙酮适量使溶解，并转移至2ml量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液3μl与10μl，供试品溶液5μl-10μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C的含量，即得。

3)总银杏酸：照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸溶液(85∶10)为流动相；检测波长为300nm。理论板数按白果新酸峰计算应不低于4000；

对照品溶液的制备：取白果新酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.8μg的溶液，作为对照品溶液。另取总银杏酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含60μg的溶液，作为定位用对照溶液。

供试品溶液的制备：精密量取本品(实施例6制备的注射液)50ml，加氯化钠使饱和，用石油醚(60-90℃)振摇提取4次，每次30ml，合并石油醚液，通过铺有少量无水硫酸钠的漏斗，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，并转移至2ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液及定位用对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，计算供试品溶液中与总银杏酸对照品相应色谱峰的总峰面积，以白果新酸为对照品，外标法计算总银杏酸含量，即得。

本实施例中，总黄酮醇苷的含量为0.92mg/ml，银杏内酯A的含量为0.10mg/ml，银杏内酯B的含量为0.04mg/ml，银杏内酯C的含量为0.06mg/ml，未检出总银杏酸。

实施例7：银杏叶组合物注射液

1、制备方法：

取实施例2的银杏叶组合物，按实施例6的制备方法制成注射液。

2、含量检测方法及结果：检测方法同实施例6，本实施例中，该组合物中总黄酮醇苷的含量为0.84mg/ml，银杏内酯A的含量为0.09mg/ml，银杏内酯B的含量为0.05mg/ml，银杏内酯C的含量为0.07mg/ml，未检出总银杏酸。

实施例8：银杏叶组合物注射液

1、制备方法：

取实施例3的银杏叶组合物，按实施例6的制备方法制成注射液。

2、含量检测方法及结果：检测方法同实施例6，本实施例中，该组合物中总黄酮醇苷的含量为0.92mg/ml，银杏内酯A的含量为0.07mg/ml，银杏内酯B的含量为0.03mg/ml，银杏内酯C的含量为0.04mg/ml，未检出总银杏酸。

实施例9：银杏叶组合物注射液

1、制备方法：

取实施例4的银杏叶组合物，按实施例6的制备方法制成注射液。

2、含量检测方法及结果：检测方法同实施例6，本实施例中，该组合物中总黄酮醇苷的含量为0.89mg/ml，银杏内酯A的含量为0.07mg/ml，银杏内酯B的含量为0.03mg/ml，银杏内酯C的含量为0.04mg/ml，未检出总银杏酸。

实施例10：银杏叶组合物注射液

1、制备方法：

取实施例5的银杏叶组合物，按实施例6的制备方法制成注射液。

2、含量检测方法及结果：检测方法同实施例6，本实施例中，该组合物中总黄酮醇苷的含量为0.90mg/ml，银杏内酯A的含量为0.11mg/ml，银杏内酯B的含量为0.05mg/ml，银杏内酯C的含量为0.06mg/ml，未检出总银杏酸。

对比例1：采用02129905.6的方法

1、提取物A的制备：取含银杏叶黄酮苷大于24％和银杏内酯大于6％的银杏叶初提取物，加水超声提取，取上清液，上聚酰胺柱，弃去保留体积的水，收集所有内酯馏分，供提取银杏叶总内酯用，再用60％乙醇洗脱，初提取物与洗脱剂60％乙醇的比例为1∶80-120，洗脱液减压浓缩、喷雾干燥，得黄棕色粉末，该粉末加丙酮超声提取2次，提取液过滤、减压浓缩至干，干固物加醋酸乙酯搅拌处理、过滤、滤渣真空干燥、研细得淡黄色粉末即为提取物A(收率0.47％)；

2、提取物B的制备：取聚酰胺用水洗脱的内酯馏分经浓缩、冷却、结晶、过滤，得白色内酯结晶物，内酯结晶物经真空干燥，研细备用，母液再用醋酸乙酯提取，取醋酸乙酯提取液，浓缩、真空干燥、研细得浅黄白色的粉末，加入上述内酯结晶物，混合均匀即为提取物B(收率0.38％)；

3、将提取物A和提取物B按照(4.20-5.0)∶(1.05-1.80)混合均匀，得到高活性的银杏叶提取物。

4、含量：按实施例1中方法检测，提取物A中总黄酮醇苷的含量为70.6％，提取物B中总内酯含量为77.2％，总银杏酸含量为4ppm。

5、按实施例6的制备方法制成注射液。

6、含量检测：按实施例6的检测方法检验，该注射液总黄酮醇苷的含量为0.82mg/ml，银杏内酯的含量为0.21mg/ml。

对比例2：上市注射液

1、提取物制备方法：

取银杏叶粉碎，加入稀乙醇回流提取两次，第一次2h，第二次1.5h。合并乙醇提取液，40℃以下时用NaOH测调pH值7.5，静置12小时；上清液过滤，滤液负压回收乙醇至无醇味，加纯化水适量，通过大孔吸附树脂柱，依次用纯化水、20％乙醇冲洗树脂柱。再用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇至无醇味，并浓缩成稠膏，干燥，粉碎，得提取物。

2、注射液制备方法：按实施例6制备方法制成注射液。

3、含量检测：按实施例6检测方法检测，该注射液总黄酮醇苷的含量为0.80mg/ml，银杏内酯的含量为0.21mg/ml。

实验例1：组合物、注射液含量及杂质的检测

1、组合物含量检测：对实施例1-5和对比例1组合物、对比例2制备的提取物含量进行检测，含量检测方法为实施例1中的检测方法，得到结果见表1：

表1：组合物含量测定

	总黄酮醇苷(％)	银杏内酯(％)	总银杏酸
				实施例1	63.4	13.6	未检出
实施例2	73.5	18.4	未检出
				实施例3	64.8	9.8	未检出
实施例4	66.7	8.3	未检出
				实施例5	68.0	16.8	未检出
对比例1	57.5	14.8	百万分之4
				对比例2	50.1	13.2	百万分之2.7

从表1可以看出：本发明组合物中银杏总黄酮精制物与银杏总内酯精制物的重量比例在3-9∶1之间，其中总黄酮醇苷含量与银杏内酯含量的比例在4.0-8.0∶1之间，而对比例1总黄酮醇苷含量与银杏内酯含量的比为3.9∶1，上市注射液总黄酮醇苷含量与银杏内酯含量的比为3.8∶1。本发明总黄酮醇苷含量明显高于对比例1及上市注射液，且未检测出总银杏酸。

2、注射液含量检测

对实施例6-10和对比例1制备的注射液、对比例2制备的注射液含量进行检测，含量检测方法为实施例6中的检测方法，得到结果见表2：

表2：注射液含量测定

	总黄酮醇苷(mg/ml)	银杏内酯(mg/ml)	总银杏酸(ng/ml)
				实施例6	0.92	0.20	未检出
实施例7	0.84	0.21	未检出
				实施例8	0.92	0.14	未检出
实施例9	0.89	0.14	未检出
				实施例10	0.90	0.22	未检出
对比例1	0.82	0.21	16
				对比例2	0.80mg/ml	0.21mg/ml	10

从表2可以看出：本发明注射液中总黄酮醇苷含量与银杏内酯含量的比例在4.0-6.6∶1之间，而对比例1总黄酮醇苷含量与银杏内酯含量的比为3.9∶1，上市注射液总黄酮醇苷含量与银杏内酯含量的比为3.8∶1。本发明总黄酮醇苷含量明显高于对比例1及上市注射液，且未检测出总银杏酸。

3、组合物杂质的检测：

3.1检测方法

3.1.1蛋白质：取组合物加水制成每1ml含总黄酮醇苷1.5mg的溶液，依法(中国药典2010年版一部附录IX S)检查，应不得出现混浊。

3.1.2鞣质：取组合物加水制成每1ml含总黄酮醇苷1.5mg的溶液，依法(中国药典2010年版一部附录IX S)检查，应不得出现混浊或沉淀。

3.1.3树脂：取组合物加水制成每1ml含总黄酮醇苷1.5mg的溶液，依法(中国药典2010年版一部附录IX S)检查，应无絮状析出。

3.1.4草酸盐：取组合物加水制成每1ml含总黄酮醇苷1.5mg的溶液，依法(中国药典2010年版一部附录IX S)检查，不得出现混浊或沉淀。

3.1.5钾离子：取组合物加水制成每1ml含总黄酮醇苷1.5mg的溶液，依法(中国药典2010年版一部附录IX S)检查，应符合规定。

3.1.6炽灼残渣：取组合物加水制成每1ml含总黄酮醇苷1.5mg的溶液，依法(中国药典2010年版一部附录IX J)检查，残渣每1ml不得过0.5mg。

3.1.7重金属：取组合物加水制成每1ml含总黄酮醇苷1.5mg的溶液，依中国药典2010年版一部附录IX E检查，不得过百万分之十。

3.2结果：见表3。

表3：组合物杂质检查

	蛋白质	鞣质	树脂	草酸盐	炽灼残渣(％)
						实施例1	未见浑浊	未见浑浊	未见浑浊	未见浑浊	0.2
实施例2	未见浑浊	未见浑浊	未见浑浊	未见浑浊	0.3
						实施例3	未见浑浊	未见浑浊	未见浑浊	未见浑浊	0.3
实施例4	未见浑浊	未见浑浊	未见浑浊	未见浑浊	0.2
						实施例5	未见浑浊	未见浑浊	未见浑浊	未见浑浊	0.2
对比例1	未见浑浊	轻微浑浊	轻微浑浊	未见浑浊	0.6
						对比例2	未见浑浊	轻微浑浊	轻微浑浊	未见浑浊	0.5

结果显示：本发明组合物制备工艺除杂效果显著，所得组合物杂质少，尤其对鞣质、树脂去除效果优于对比例1和对比例2。

实验例2：注射液稳定性的考察

1、考察项目

考察总黄酮醇苷含量、银杏内酯含量、总银杏酸含量，按实施例6中检测方法进行检测；考察蛋白质、鞣质、树脂、草酸盐和炽灼残渣，按实验例2中的检查方法进行检查。

2、结果：见表4。

表4：注射液稳定性考察结果

结果显示：本发明组合物制备的注射液稳定性好，总黄酮醇苷的含量在36个月内仅下降了0.02mg/ml，而对比例1和对比例2分别下降了0.05mg/ml和0.04mg/ml，是本发明的2.5倍和2倍。银杏内酯的含量在36个月内下降了0-0.02mg/ml，而对比例1和对比例2均下降了0.05mg/ml，是本发明的2.5倍以上。而且随着时间的延长，本发明组合物制备的注射液有关物质无明显变化，而对比例1和对比例2的鞣质、树脂均出现浑浊，甚至沉淀，其稳定性明显差于本发明注射液。

实验例3：对急性脑梗死的影响

1、病例：

住院急性脑梗死患者180例，均符合第4届全国脑血管病学术会议制定的诊断标准，均经脑CT确诊，并已排除合并呼吸衰竭、严重肝肾功能障碍、脑疝、上消化道出血。180例患者随机分为三个治疗组：

治疗1组男、女各30例，年龄35-86岁，发病至就诊时间为2.0-72.0小时，梗死灶体积为0.04-57.8cm²，神经功能缺损评分为16.0-30.2分；

治疗2组男28例、女32例，年龄33-85岁，发病至就诊时间为2.5-74.0小时，梗死灶体积为0.04-56.7cm²，神经功能缺损评分为16.4-30.6分；

治疗3组男26例、女34例，年龄35-88岁，发病至就诊时间为2.0-75.0小时，梗死灶体积为0.04-57.2cm²，神经功能缺损评分为16.1-30.2分。

三组患者的性别、年龄、发病至就诊时间、梗死灶的体积、神经功能缺损评分均具可比性(P均＞0.05)。

2、治疗方法：

三组均于住院当日开始治疗：

治疗1组给予5％葡萄糖注射液250ml+实施例10 20ml，静脉滴注，1次/天，连用15天；

治疗2组给予5％葡萄糖注射液250ml+对比例1制备的注射液20ml，静脉滴注，1次/天，连用15天；

治疗3组给予5％葡萄糖注射液250ml+对比例2制备的注射液20ml，静脉滴注，1次/天，连用15天。

三组患者若有颅内压增高及纳差、进食困难而引起脱水者，给予甘露醇、速尿降低颅内压及补足相应的液体量，血糖升高者进行降血糖治疗。

3、观察指标：记录治疗前后脑CT、血液流变学、血糖、肝肾功能、心电图等检查数据。神经功能缺损评分根据第4届全国脑血管病学术会议通过的卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准，从功能正常至丧失依次评为0-6分。根据住院当日和治疗后15天评分的减少并结合患者的生活能力进行疗效评定：1)痊愈，恢复正常者；2)显著进步，缺损评分减少≥4分；3)进步，缺损评分减少2-3分；4)无变化，缺损评分减少1分或无减少者。

4、统计学处理：采用秩和检验、t检验和配对t检验。

5、结果

总体来说，实验期间未见任何不良反应。

5.1临床疗效：详见表5。

表5：对脑梗死的治疗作用

组别	例数	痊愈	显著进步	进步	无变化
						治疗1组	60	32	22	5	1
治疗2组	60	21	24	10	5
						治疗3组	60	19	24	9	8

从表5可以看出：从痊愈患者来看，治疗1组明显优于治疗2、3组；从总有效率来看，治疗1组的总有效率为98.3％，治疗2组的总有效率为91.7％，治疗3组的总有效率为86.7％，治疗1组效果优于治疗2、3组。

5.2血液流变学指标变化：见表6。

表6：治疗前后血液流变学指标变化

注：与治疗前相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与治疗2组比较^#P＜0.05；与治疗3组相比^※P＜0.05。

从表6可以看出：与治疗前相比，治疗1组的血液流变学指标显著改善(P＜0.01)，治疗2、3组明显改善(P＜0.05)；与治疗2、3组相比，治疗1组的血液流变学指标明显改善(P＜0.05)。

5.3血脂及梗死灶体积：见表7。

表7：治疗前后总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、脑梗死灶的比较

注：与治疗前相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与治疗2组比较^#P＜0.05；与治疗3组相比^※P＜0.05。

从表7可以看出：

总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)：与治疗前相比，治疗1组的TC、TG显著降低(P＜0.01)，治疗2、3组的TC、TG明显降低(P＜0.05)；与治疗2、3组相比，治疗1组的TC、TG明显降低(P＜0.05)；

高密度脂蛋白(HDL-L)：与治疗前相比，治疗1组的HDL-L显著增加(P＜0.01)，治疗2、3组的HDL-L明显增加(P＜0.05)；与治疗2、3组相比，治疗1组的HDL-L明显增加(P＜0.05)；

脑梗死灶：与治疗前相比，治疗1组的脑梗死灶显著减小(P＜0.01)，治疗2、3组的脑梗死灶明显减小(P＜0.05)；与治疗2、3组相比，治疗1组的脑梗死灶明显减小(P＜0.05)。

6、实验小结：本发明提供的组合物可以治疗急性脑梗死，效果优于上市剂型及02129905.6专利产品。

实验例4：对冠心病心绞痛的作用

1、病例：180例住院患者均符合1979年WHO制定的《缺血性心脏病的命名及诊断标准》，根据卫生部1993年制定的中药新药治疗胸痹(冠心病心绞痛)的临床研究指导原则，确定中医证型和冠心病心绞痛轻重分级标准。

轻度：有较典型的心绞痛发作，但疼痛不重，有时需含硝酸甘油；

中度：每天有数次较典型的心绞痛发作，每次持续数分钟至10分钟，一般都需含服硝酸甘油；

较重度：每天有多次典型发作，影响日常生活活动，每次发作持续时间较长，需多次含服硝酸甘油；

重度：疼痛发作次数及程度均比较严重者。

随机分为3组，治疗1组60例，男32例，女28例，平均年龄(55.3±9.2)岁，平均病程(6.8±7.1)年；治疗2组60例，男26例，女34例，平均年龄(56.3±8.7)岁，平均病程(7.0±6.8)年；治疗3组60例，男33例，女27例，平均年龄(55.8±8.5)岁，平均病程(6.9±7.2)年。

2、治疗方法：

治疗1组给予5％葡萄糖注射液250ml+实施例620ml，静脉滴注，1次/天，连用15天；

治疗2组给予5％葡萄糖注射液250ml+对比例1制备的注射液20ml，静脉滴注，1次/天，连用15天；

治疗3组给予5％葡萄糖注射液250ml+对比例2制备的注射液20ml，静脉滴注，1次/天，连用15天。

3、观察指标：每天观察2次，了解临床症状、体征、舌象、脉象及有关反应，心率、血压等一般体格检查项目，并做详细记录。用药前后各查一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，三大常规化验及心、肝、肾功能检查，常规12导联心电图。

心绞痛症状疗效评定标准按轻度、中度、分别评定：

轻度：症状消失或基本消失为显效；疼痛发作次数、程度及持续时间明显减轻为有效；症状基本与治疗前相同为无效；疼痛发作次数、程度及持续时间有所加重(或达到“中度、较重度”标准)为加重。

中度：症状消失或基本消失为显效；症状减轻到“轻度”标准为有效；症状基本与治疗前相同为无效；疼痛发作次数、程度及持续时间有所加重(或达到“较重度”标准)为加重。

心电图疗效评定标准：显效：心电图恢复到“大致正常”或达到“正常心电图”；有效：ST段降低，以治疗后回升0.05mv以上，但未达到正常标准，在主要导联倒置T波变浅(达25％以上者)，或T波由平坦变为直立，房室或室内传导阻滞改善者；无效：心电图基本与治疗前相同；加重：ST段较治疗前降低0.05mv以上，在主要导联倒置T波加深(达25％以上者)或直立T波变平坦，平坦T波变倒置，以及出现异位心律、房室传导阻滞或室内传导阻滞。

4、结果

实验期间未见任何不良反应。

4.1 NO、NOS、SOD、MDA变化情况：见表8。

表8：治疗前后NO、NOS、SOD、MDA比较

注：与治疗前相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与治疗2组比较^#P＜0.05；与治疗3组相比^※P＜0.05。

从表8可以看出：

一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)：与治疗前相比，治疗1组的NO、NOS、SOD显著增加(P＜0.01)，治疗2、3组的NO、NOS、SOD明显增加(P＜0.05)；与治疗2、3组相比，治疗1组的NO、NOS、SOD明显增加(P＜0.05)；

丙二醛(MDA)：与治疗前相比，治疗1组的MDA显著减少(P＜0.01)，治疗2、3组的MDA明显减少(P＜0.05)；与治疗2、3组相比，治疗1组的MDA明显减少(P＜0.05)。

4.2心绞痛临床疗效比较：见表9。

表9：心绞痛疗效比较

组别	例数	显效	有效	无效	加重
						治疗1组	60	17	41	2	0
治疗2组	60	12	30	18	0
						治疗3组	60	11	33	16	0

从表9可以看出：从有效来说，治疗1组的心绞痛效果(41)明显优于治疗2组(30)、治疗3组(33)；从总有效率来说，治疗1组治疗心绞痛的总有效率为96.7％，治疗2组的总有效率为70％，治疗3组的总有效率为73.3％，治疗1组的总有效率优于治疗2、3组。

4.3心电图疗效比较：见表10。

表10：心电图疗效比较

组别	例数	显效	有效	无效	加重
						治疗1组	60	6	36	18	0
治疗2组	60	4	27	29	0
						治疗3组	60	5	25	30	0

从表10可以看出：从有效来说，治疗1组的心电图疗效有效和显效(36+6)明显优于治疗2组(27+4)、治疗3组(25+5)；从总有效率来说，治疗1组治疗心绞痛的总有效率为70％，治疗2组的总有效率为51.7％，治疗3组的总有效率为50％，治疗1组心电图疗效的总有效率优于治疗2、3组。

4.4动态心电图缺血性ST-T改变时间比较：见表11。

表11：动态心电图缺血性ST-T改变时间比较

注：与治疗前相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与治疗2组比较^#P＜0.05；与治疗3组相比^※P＜0.05。

从表11可以看出：与治疗前相比，治疗1-3组心电图缺血性ST-T改变时间有不同程度的减少(P＜0.05，P＜0.01)；与治疗2、3组分别相比，治疗1组心电图缺血性ST-T改变时间明显减少(P＜0.05)。

5、实验小结：本发明提供的组合物可以治疗心绞痛，效果优于上市剂型及02129905.6专利产品。

实验例5：对痴呆型小鼠学习记忆能力的影响

1、实验动物：清洁级昆明种小鼠，雌雄各半，体重18-22g。

2、实验分组：

将50只小鼠根据体重随机分为5组，每组10只：对照组、模型组、治疗1组、治疗2组和治疗3组。

除对照组按照10ml/kg腹腔注射的氯化钠注射液和灌胃10ml/kg的纯化水外，其余各组腹腔注射氯化钠注射液配制的D-半乳糖溶液，每天的剂量为60mg/kg和灌胃三氯化铝溶液(纯化水配制的)，每天的剂量为5mg/kg，1次/日，连续60天。

4、实验方法-小鼠跳台试验

3个治疗组自造模起每日上午给予D-半乳糖和三氯化铝，下午给予相应的药物，即治疗1组给予实施例8、治疗2组给予对比例1制备的注射液、治疗3组给予对比例2，每日1次，连续60天，灌胃体积为0.2ml/10g。

末次给药1小时后开始训练，将动物放入反应箱内适应环境3分钟，然后将动物放置反应箱内的铜栅上，立即通36V交流电。动物受到电击其正常反应是跳回平台上。

训练1次后，将动物放在反应箱内的平台上，记录5分钟内各鼠跳下平台的错误次数和第1次跳下平台的潜伏期，以此作为学习成绩。

24小时后进行重新测验，将小鼠放在平台上，记录各鼠第1次跳下平台的潜伏期、各鼠3分钟内电击次数和受电击的动物总数，同时计算出现错误反应的动物百分率。

停止训练5天后可以在不同的时间进行1次或多次记忆消退实验。

5、实验结果：见表12。

表12：对模型小鼠记忆的影响

注：与对照组相比，**P＜0.01；与模型组相比，^#P＜0.05；与治疗2组相比^※P＜0.05；与治疗3组相比，^☆P＜0.05。

从表12可以看出：与对照组相比，模型组的学习记忆获得性障碍、巩固记忆障碍、记忆再现障碍的潜伏期显著减少(P＜0.01)、5min错误次数显著增加(P＜0.01)；与模型组相比，治疗1组的学习记忆获得性障碍、巩固记忆障碍、记忆再现障碍的潜伏期显著增加(P＜0.01)、5min错误次数显著减少(P＜0.01)，治疗2、3组学习记忆获得性障碍、巩固记忆障碍、记忆再现障碍的潜伏期明显增加(P＜0.05)、5min错误次数明显减少(P＜0.05)；与治疗2、3组分别比较，治疗1组的学习记忆获得性障碍、巩固记忆障碍、记忆再现障碍的潜伏期明显增加(P＜0.01)、5min错误次数显著减少(P＜0.01)。

6、实验小结：本发明提供的组合物能明显提高痴呆型小鼠的学习记忆能力，效果优于上市剂型和02129905.6专利产品。

实验总结：本发明提供的组合物可以治疗急性脑梗死、心绞痛、痴呆，效果优于上市剂型及02129905.6专利产品。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种银杏叶组合物，其特征在于，该组合物由重量比为3-9∶1的银杏总黄酮精制物和银杏总内酯精制物组成，且该组合物中总银杏酸含量不超过百万分之三。

2.根据权利要求1所述的银杏叶组合物，其特征在于，该组合物中由重量比为4-8∶1的银杏总黄酮精制物和银杏总内酯精制物组成，且该组合物中总银杏酸含量不超过百万分之二。

3.根据权利要求2所述的银杏叶组合物，其特征在于，该组合物由重量比为5-7∶1的由银杏总黄酮精制物和银杏总内酯精制物组成且该组合物中总银杏酸含量不超过百万分之一。

4.根据权利要求1-3任一项所述的银杏叶组合物，其特征在于，所述银杏总内酯精制物中含有75％以上的银杏内酯A、B和C的混合物。

5.根据权利要求1-3任一项所述的银杏叶组合物，其特征在于，所述银杏总黄酮精制物中含有72％以上的银杏总黄酮醇苷。

6.一种制备权利要求1-5任一项所述的银杏叶组合物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)银杏叶粗粉用85-95％乙醇提取3次，每次1-3小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味并浓缩至每1ml药液中的生药量不少于1g，加水稀释，冷藏静置6-24小时，过滤，滑石粉助滤，过ADS-17树脂柱，先用水冲洗，后用70％乙醇洗脱，待有效成分流出时开始收集洗脱液，浓缩，得银杏粗提物；将银杏粗提物用乙醇溶解，冷藏，过滤，上ADS-F8树脂柱，分别用10％和70％乙醇进行洗脱，分别收集洗脱液，得到银杏总黄酮和银杏总内酯；

2)将银杏总黄酮经冷热处理后，干燥，得银杏总黄酮精制物；

3)将银杏总内酯经乙酸乙酯萃取，得银杏总内酯精制物；

4)将银杏总黄酮精制物和银杏总内酯精制物混合，即得。

7.含有权利要求1-5任一项所述的银杏叶组合物的制剂，其特征在于，该制剂由权利要求1-5任一项所述的银杏叶组合物和药学上可接受的载体或稀释剂组成。

8.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液、悬浮液或注射剂，所述注射剂为注射液、注射用无菌粉末、注射用冻干粉和注射用浓溶液。

9.根据权利要求8所述的制剂，其特征在于，所述制剂为注射液，其中活性成分的含量为：总黄酮醇苷的含量不少于0.70mg/ml，银杏内酯A的含量不少于0.07mg/ml，银杏内酯B的含量不少于0.03mg/ml，银杏内酯C的含量不少于0.04mg/ml。

10.权利要求1-5任一项所述的银杏叶组合物或权利要求7-9任一项所述的制剂在制备防治冠心病、心绞痛；脑梗塞、痴呆；视网膜静脉阻塞；消化性溃疡、酒精肝、脂肪肝；肾小球肾炎、肾病综合症、肾功能衰竭；肺心病；精神分裂症、抑郁症；突发性耳聋、噪声性耳聋的药物中的应用。