CN108969517A - 一种银杏内酯组合物在制备用于肾组织纤维化的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了银杏内酯组合物在制备治疗肾组织纤维化药物中的应用。所述银杏内酯组合物包括银杏内酯A、B、K，其特征在于，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～40):(50～75):(0.2～5)。本发明建立的UUO动物模型，在给予银杏内酯组合物治疗后发现UUO动物的行为学有了明显改善，血清中Scr、BUN、bFGF、TNF‑а及肾脏组织中TGF‑β1、FN等指标被不同程度的改善，肾脏组织纤维化程度显著降低。这表明本发明的组合物对肾纤维化有良好的疗效。

Description

一种银杏内酯组合物在制备用于肾组织纤维化的药物中的 应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及银杏内酯组合物对于肾纤维化的治疗作用。

背景技术

慢性肾脏疾病(chronic kidney disease,CKD)包括原发性、继发性肾小球疾病，肾小管、间质及血管疾病等，目前认为肾纤维化是各种CKD发展到末端肾病(end stagerenal disease,ESRD)的共同病理途径。导致肾纤维化的因素很多，但其病理学特征主要表现为细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在组织器官内持续过度沉积及肾小球细胞的萎缩。虽然现代医学对于肾纤维化的理论机制研究已经非常深入，但目前对于肾纤维化还未有行之有效的治疗方法，患者主要通过血液透析、肾脏移植等方法维持生命，巨大的经济压力也给患者及其家属带来了极大的痛苦。而中药则依据其自身理论基础，在肾纤维化的防治上取得极大的进展，并且临床研究也显示了中医药对于肾纤维化的保护作用。

目前实验性的肾纤维化模型主要分为两种，一种是药物或毒物诱导的模型，包括氯化汞、马兜铃酸、腺嘌呤及链脲霉素等；另一种则是手术模型，包括单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)、5/6肾切除模型、缺血再灌注模型，其中UUO模型因为成模率高、模型稳定而应用广泛。

银杏内酯作为银杏叶中主要的活性成分之一，是一类罕见的天然化合物，迄今尚未发现存在于其他植物中，具有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集、抗细胞凋亡及死亡、扩张血管、保护中枢神经和缺血组织等药理作用。而目前也未见有关银杏内酯成分在抗肾纤维化的报道。

发明内容

本发明应用单侧输尿管梗阻模型来评价银杏内酯的抗肾纤维化作用，旨在提供一种多成分协同针对肾纤维化的银杏内酯组合物。

由此，本发明提出了一种银杏内酯组合物在制备用于肾组织纤维化的药物中的应用。所述用于，可以是包括预防或治疗在内的一切有益于改善患者肾纤维化的方式。其具体包括能够改善包括原发性、继发性肾小球疾病，肾小管、间质及血管疾病等肾脏慢性疾病诱发的肾纤维化。

进一步地，所述银杏内酯组合物包括银杏内酯A、B、K，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～40):(50～75):(0.2～5)。进一步地，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～35):(50～70):(0.5～4)。更进一步地，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～30):(50～65):(0.8～4)。

优选地，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为20:50:5。

优选地，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为30:75:0.2。

进一步地，所述用于肾组织纤维化的药物还包括药学上可接受的辅料。

具体地，所述用于肾组织纤维化的药物可以使用各种药学上可接受的辅料制备成口服制剂、注射给药剂型、吸入给药剂型或外用给药制剂等。且该药物可用于相关疾病的单一用药或联合用药治疗。

进一步地，银杏内酯组合物可以制备成片剂、胶囊剂、粉针剂、注射剂、栓剂、透皮制剂等等。

进一步地，当用于肾组织纤维化的药物选自注射给药时，所述注射给药剂型剂量为0.8-8mg/kg/d。具体为静脉滴注治疗。

本发明还提出了一种银杏内酯组合物在制备用于肾炎的药物中的应用，其特征在于，所述银杏内酯组合物包括银杏内酯A、B、K，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～30):(50～65):(0.8～4)。优选地，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为30:75:0.2。

本发明采用单侧输尿管梗阻造成大鼠肾纤维化模型，给予银杏内酯组合物干预后，发现造模动物肾组织中TGF-β1、FN的mRNA表达显著降低，大鼠血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肿瘤坏死因子(TNF-а)水平较模型组也有明显降低，大鼠的行为学及肾组织的病变显著改善。可见，银杏内酯组合物具有治疗肾纤维化的作用。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式的内容仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

需要注意的是，如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例或份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用与本发明。

实施例1银杏内酯组合物注射给药剂型的配制

1.银杏内酯组合物的配制

(1)原料银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯K(GK)以及银杏内酯组合物1-4由江苏康缘药业股份有限公司自制，具体如下；

表1银杏内酯组合物及剂量设计

2.组合物注射液及试剂的配制

(1)将银杏内酯按表1比例组合用生理盐水配成0.131、0.262、0.524mg/ml。

(2)将盐酸贝那普利用生理盐水配成0.5mg/ml。

实施例2银杏内酯组合物口服给药剂型的配制

1.组合物片剂的制备

将银杏内酯组合物按表1比例称量后，加入淀粉、乳糖、20％的明胶溶液、干淀粉和蒸馏水，混合干燥后加入润滑剂，压片，包衣，即得银杏内酯组合物的片剂。

2.组合物颗粒剂的制备

将银杏内酯组合物按表1比例称量后，加入淀粉、5％的明胶溶液和蒸馏水，压成薄片，粉碎成小颗粒，即得药物组合物的颗粒剂。

实施例3银杏内酯组合物吸入给药剂型的配制

组合物喷雾剂的制备：按表1银杏内酯组合物比例，称取组合物4g，加入10mL的乙醇中搅拌至溶解，再加入50mL聚乙二醇，搅匀备用，配制含有0.01％苯扎溴铵的水溶液，将前期配制的银杏内酯组合物溶液缓慢加入到水溶液中，边加边搅拌，得到一外观澄明的溶液，灌装于适当的容器中，即得。

实施例4银杏内酯组合物注射给药对单侧输尿管梗阻肾纤维化大鼠的保护作用

1.动物

SPF级SD雄性大鼠，购于上海毕凯医药科技有限公司。

2.实验药品及试剂

盐酸盐酸贝那普利(Sigma，批号：X2608，规格：250mg)；尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肿瘤坏死因子(TNF-а)测定试剂盒(南京翼飞雪生物科技有限公司，批号：20180217、2018031520180124、20180312)。Trizol(life technologies,批号97214)，反转录试剂盒(Transgen，批号K10235)，定量PCR试剂盒(Transgen，批号K45254)，氯仿(上海凌峰化学试剂有限公司，批号20180741)，乙醇(南京化学试剂有限公司，分析纯，批号1745987611632)，异丙醇(南京化学试剂有限公司，批号14385710823)。银杏内酯组合物，按照实施例1方法配制。

3.仪器

Unique-s15型超纯水系统，FA1104电子天平(HANGPING)，Mastercycle gradient梯度PCR仪(eppendrof)，eppendrofBio PhotometerPlus核酸蛋白测定仪(eppendrof)，Bioprep-24生物样品均质器，Allegrax-22R多功能离心机(BECKMAN COULTER)，TG16-WS台式高速离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)，ABI7500实时荧光定量PCR仪。

4.实验方法

4.1动物分组及模型建立

雄性SD大鼠，手术前一天禁食，实验设备高温消毒，10％水合氯醛对大鼠进行麻醉，将大鼠右侧卧位固定于手术台上，去毛后常规备皮消毒，由大鼠左腹部依次剪开外皮、内皮、肌肉至腹膜后，暴露并分离左侧输尿管，在输尿管上1/3处和中1/3处分别用丝线结扎输尿管，并在中间剪断，最后逐层缝合肌肉及皮肤。假手术组仅打开腹腔和剥离输尿管后即缝合腹腔。

4.2给药

取造模成功的大鼠入组，随机分组，每组10只：模型组、盐酸贝那普利组(5mg/kg，生理盐水溶解，根据成人临床用量换算而得)及银杏内酯组合物1、2、3、4低、中、高(1.31mg·kg^-1、2.62mg·kg^-1、5.24mg·kg^-1)三个剂量组，均按照10ml/kg腹腔注射给药，空白组和假手术组大鼠腹腔注射等体积的生理盐水，每天给药1次，连续给药4周。

4.3标本采集

每组大鼠于造模后第28天眼眶取血，血液静置20min，3000r/min离心10min，取上清液，待测。采用腹腔注射10％水合氯醛(360mg·kg-1)进行麻醉，打开腹腔，寻找并取出左肾组织，部分保存于4％多聚甲醛液中固定24h，行石蜡包埋后，用于HE染色；另一部分肾组织用液氮快速冷却后保存于-80℃冰箱以提取mRNA。

4.4组织病理学分析

将蜡块制成4μm厚的切片，行苏木精-伊红(HE)染色，并按照Banff分级进行评分：0表示正常，无肾小管扩张、萎缩、坏死等病理变化；1表示轻度损伤，间质水肿与纤维化、炎性细胞浸润、肾小管萎缩与扩张伴管型形成<25％所测区域；2表示中度损伤，损伤面积在25～50％所测区域；3表示严重损伤，损伤面积>50％所测区域。

4.5血清中肾功能指标及纤维化因子检测

采用ELISA检测血清中肾功能指标Scr、BUN及碱性成纤维细胞生长因子(BasicFibroblast GrowthFactor，bFGF)、肿瘤坏死因子-а(TumorNecrosis Factor，TNF-а)等促纤维化细胞因子。

4.6RT-PCR法检测肾脏组织中TGF-β1、FN mRNA表达水平

称取冻存的肾脏组织30mg，加入1mL Trizol，并于生物样品均质器中将组织均质化，取出后静置5min。在每份样品中加入200mL的氯仿溶液并剧烈震摇15s，然后室温静置5min。在4℃，12000rpm条件下离心15min后，取出样品并小心的吸取上清至无酶的1.5mL EP管中。每份样品中加入500μL的异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min，使RNA沉淀。在4℃，12000rpm条件下离心10min后，吸取上清并弃去，加入75％DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯处理水)配置的乙醇溶液洗涤，4℃，7500rpm离心5min后，弃去上清，放置5-10min使RNA沉淀干燥，最终加入50μLDEPC水溶解RNA。采用核酸蛋白测定仪，测定各样品的含量及纯度，在保证纯度的基础上(吸光度A260nm/280nm在1.8-2.0之间)，将各样品调整到同一浓度。采用反转录试剂盒，按照说明将各样品逆转录为cDNA。以β-actin为内参照，根据引物并由上海生工生物工程股份有限公司合成，用PCR法扩增TGF-β1、FN，引物设计如表2，反应条件一致：20μL的反应体系，94℃预变性30s，94℃变性5s，60℃退火34s，40个循环，收集荧光信号，计算CT值，以β-actin为内参，以空白为1，采用ΔΔCT法比较各组的TGF-β1、FN的mRNA相对表达量。

表2PCR引物设计表

4.7数据处理

实验结果以Mean±SD表示，所有数据用SPSS 17.0软件进行分析。采用方差分析统计，符合正态分布采用完全随机设计资料的两均数比较，其中方差齐性者采用LSD法检验，方差不齐者Dunnet’s法检验。不符合正态分布数据则采用非正态性的两均数比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

5.实验结果

5.1各组大鼠行为学变化的比较

大鼠行为学变化能够最直观的反应出大鼠的生存状态，肺纤维化会导致大鼠活动减少、反应迟钝，对外界刺激反应减弱，敲打鼠笼能够反应大鼠的反应敏感度。实验过程中，发现正常组及假手术组大鼠精神、饮食正常，体毛顺滑有光泽，粪便呈麦粒状，尿量正常，对于敲打笼壁能够迅速做出反应；而模型组大鼠则表现出体毛干枯、精神状况差、活动减少、反应迟钝等现象，敲打笼壁后仅睁眼或抬头，并且饮水量减少、尿量亦明显减少；盐酸贝那普利组大鼠与模型组相比，情况有所好转，对于敲打笼壁能够转向敲击方向，且活动增多；银杏内酯组合物组表现介于盐酸贝那普利组与模型组之间。

5.2组织病理学评分

大鼠肾组织苏木精－伊红(Hematoxylin－eosin，HE)染色和Masson三色复染法统计结果如表3，HE染色结果显示，与假手术组比较，模型组(model)中可见肾小体内细胞增生，系膜基质增生，肾小管结构遭到破坏，部分萎缩消失，小管中可见较多蛋白和细胞管型，间质纤维组织增生及巨噬细胞、淋巴细胞浸润；使用盐酸贝那普利治疗后，可见炎性细胞浸润减少，肾小管扩张减轻，肾小管上皮细胞空泡变性减少，小管中蛋白及系膜基质增生减少，损伤程度明显减轻(P＜0.01)；四种不同类型的银杏内酯组合物对于大鼠肾组织纤维化均有一定的改善作用，尤以组合物1、组合物2的高剂量组效果显著，与盐酸贝那普利组相比无统计学意义(P＞0.05)。Masson染色结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠肾组织的胶原分布面积显著增大(P＜0.01)与模型组比较，部分银杏内酯组合物及盐酸贝那普利组大鼠肾组织病理评分显著降低(P＜0.01)，其中银杏内酯组合物1的高剂量组改善作用优于盐酸贝拉普利组(P＜0.05)。

表3各组肾组织纤维化结果统计

注：与假手术组比，^*p＜0.05，^**p＜0.01；与模型组比；^#p＜0.05，^##p＜0.01；与盐酸贝那普利组比，^Δp＜0.05

5.3血清中肾功能指标及纤维化因子检测

Scr和BUN表达水平反应的是肾功能的正常与否，实验研究发现，与假手术组比，模型组Scr、BUN表达水平显著升高(P＜0.01)，大鼠肾功能遭到明显损伤，盐酸贝那普利治疗后，能够显著降低Scr、BUN的表达，改善肾功能；银杏内酯组合物均能够以剂量依赖的方式降低Scr、BUN的表达，其中尤以组合物1、2的高剂量组改善作用最为明显，与盐酸贝那普利组比，组合物1高剂量组的改善效果更好，并具有显著性差异(Δp＜0.05)。bFGF、TNF-а过度表达会加重间质的炎性反应，促使肾小管上皮细胞增生与肥大，最终导致肾小管上皮细胞转化成成纤维细胞，实验结果显示，模型组中bFGF、TNF-а与假手术比显著升高，盐酸贝那普利治疗后其数值得到改善，银杏内酯组合物亦能够以剂量依赖的方式降低大鼠血清中bFGF、TNF-а的表达量，且组合物1的高剂量组比盐酸贝那普利组的治疗效果更佳(Δp＜0.05)。

表4各组大鼠血清中Scr、BUN、bFGF、TNF-а水平比较

注：与假手术组比，^*p＜0.05，^**p＜0.01；与模型组比；^#p＜0.05，^##p＜0.01；与盐酸贝那普利组比，^Δp＜0.05

5.4肾脏组织中TGF-β1、FN mRNA表达水平统计

TGF-β1是最重要的促纤维化因子，其既可通过影响层黏连蛋白和FN发挥作用，又可通过促进肾小管上皮细胞转分化为肌纤维母细胞，推进肾脏纤维化发生发展。FN是一种非胶原性a2糖蛋白，介导细胞与细胞或细胞与基质之间的私连，维持细胞正常形态。它能够与纤维蛋白、纤维蛋白原和胶原结合，是胶原沉积于肾小管和肾间质的前提。通过实验可以发现，与假手术组比，模型组中大鼠肾脏组织中TGF-β1、FN mRNA水平显著提高(P＜0.01)，盐酸贝那普利治疗后能够降低造模大鼠肾脏组织中TGF-β1、FN mRNA的表达量，减轻肾纤维化；银杏内酯组合物均能够以剂量依赖的方式降低TGF-β1、FN mRNA的表达，其中尤以组合物1高剂量组改善作用最为明显，并优于盐酸贝那普利组(P＜0.05)。

表5各组大鼠肾脏中肾脏组织中TGF-β1、FN mRNA表达水平比较

注：与假手术组比，^*p＜0.05，^**p＜0.01；与模型组比；^#p＜0.05，^##p＜0.01；与盐酸贝那普利组比，^Δp＜0.05

本发明的上述实施例仅仅是为了能够清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种银杏内酯组合物在制备用于肾组织纤维化的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，所述银杏内酯组合物包括银杏内酯A、B、K，其特征在于，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～40):(50～75):(0.2～5)。

3.根据权利要求1所述的应用，所述银杏内酯组合物包括银杏内酯A、B、K，其特征在于，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～35):(50～70):(0.5～4)。

4.根据权利要求1所述的应用，所述银杏内酯组合物包括银杏内酯A、B、K，其特征在于，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～30):(50～65):(0.8～4)。

5.根据权利要求1所述的应用，所述银杏内酯组合物包括银杏内酯A、B、K，其特征在于，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为20:50:5。

6.根据权利要求1所述的应用，所述银杏内酯组合物包括银杏内酯A、B、K，其特征在于，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为30:75:0.2。

7.根据权利要求1-6任一所述的应用，其特征在于，所述用于肾组织纤维化的药物还包括药学上可接受的辅料。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述用于肾组织纤维化的药物选自口服给药剂型、注射给药剂型、吸入给药剂型。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述注射给药剂型剂量为0.8-8mg/kg/d。

10.一种银杏内酯组合物在制备用于肾炎的药物中的应用。