CN108244031B - 一种提高免疫低下模型小鼠非特异性免疫力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及模型动物领域，具体是一种提高免疫低下模型小鼠非特异性免疫力的方法，包括以下步骤：a)制作南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)：将南极磷虾肉糜采用碱性蛋白酶酶解至酶解液的水解度为32‑36％，干燥后制成所述的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)；b)给免疫低下模型小鼠灌胃步骤a的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)，灌胃量为20‑60g/kg，灌胃周期为14‑28天。本发明优点在于：提供了一种能有效提高改善免疫低下动物的非特异性免疫力，且解决其免疫低下引发的后续健康问题的方法。
Description
技术领域
本发明涉及模型动物领域，具体地说，是一种免疫低下模型小鼠免疫力提高的方法。
背景技术
免疫系统(immune system)最大的功能在于维护机体健康，由免疫器官、免疫组织、免疫细胞和免疫分子组成，能及时发现并清除异物、阻止外来病原微生物等入侵。因此，免疫功能的高低直接影响到生物体的抗病能力。免疫功能低下或亢进都会对自身器官或组织产生伤害。根据发病原因，免疫功能低下可分为原发性和继发性两类，而压力过大、营养不良、疲劳过度或者病原生物感染等都可能会引起继发性免疫力低下。目前常用的免疫增强剂有蜂胶、胸腺素、中药提取物等。但目前利用生物活性肽作为提高免疫低下动物免疫力的研究不多。
生物活性肽是源于蛋白质的多功能化合物。近年来的研究表明，具有生物活性的肽多由25个氨基酸通过肽键以不同组成和排列方式构成。生物活性肽易消化吸收，可促生长，提高动物机体特异性和非特异性免疫能力，提高成活率，还有抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，食用安全性极高，是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。水产动物的生长环境与陆生动物不同，在长期的生物进化过程中，具有与陆生动物不同的基因结构，经过生物酶解处理后的产物蕴含大量具有不同生物学功能的肽段。南极磷虾隶属节肢动物门、甲壳纲、磷虾目，我们通常所说的南极磷虾一般指南极大磷虾(Euphausia superba Dana)，广泛分布于环南极水域，其营养价值丰富，资源蕴藏量巨大，最新估计的现存量在5亿吨左右，是可供人类利用的海洋动物资源中蕴藏量最为丰富的一种，也是地球上资源蕴藏量最大的海洋渔业种类，被视为人类潜在的、重要的后备蛋白库。目前，磷虾资源处于未充分开发状态，尚有巨大的开发利用潜力。研究表明，南极磷虾蛋白质酶解液将富含多种必需氨基酸，尤其是赖氨酸和谷氨酸，还富含生物活性肽。关于磷虾肽，目前多见作为水产动物，如真鲷、三文鱼、淡水虹鳟鱼饵料的研究。以南极磷虾为原料，以南极磷虾蛋白为原料，开发制备具有提高免疫力的功能性保健食品原料或者特殊营养强化剂，不仅可满足人们对食品的营养要求更能满足人们对食品的保健方面的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能有效提高改善免疫低下动物的非特异性免疫力，且解决其免疫低下引发的后续健康问题的方法。
本发明解决上述问题的技术方案如下：通过给免疫功能低下动物膳食中补充南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)的方式来提高免疫低下模型小鼠免疫力，具体通过给免疫低下模型小鼠进行灌胃一定量的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)的方式来实现。
本发明的第一方面，提供一种提高免疫低下模型小鼠非特异性免疫力的方法，包括以下步骤：
a)制作南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)：将南极磷虾肉糜采用碱性蛋白酶酶解至酶解液的水解度为32-36％，干燥后制成所述的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)；
b)给免疫低下模型小鼠灌胃步骤a的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)，灌胃量为20-60g/kg，灌胃周期为14-28天。
本发明选择上述酶解液的水解度是以体外抗氧化活性的结果为参考依据的。水解度越高，表示蛋白质大分子被酶解成小片段的程度越高，根据文献报告，有生物学功能的多肽分子量范围大多在2-10KDa，如果水解程度过高，有生物学功能的多肽会被进一步水解成游离氨基酸，反而使其生物学功能降低。发明人做过不同水解度的肽液的体外抗氧化活性的实验结果也证实了这一点。
优选的，所述的步骤a制作南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)的步骤为：将冰冻南极磷虾解冻绞成磷虾肉糜，按照原料与水1：1-1：3的比例加入超纯水搅拌混匀，调至合适pH(9.5±0.5)，加入600-1000U/g碱性蛋白酶，50-55℃水浴中进行酶解(2-4h)，沸水浴灭酶10min，冷却至室温，300目筛绢过滤除渣，滤液冷冻冻干或者喷雾干燥，制得所述的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的步骤a制作南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)的步骤为：将冰冻南极磷虾解冻绞成磷虾肉糜，按照原料与水1：1的比例加入超纯水搅拌混匀，调至合适pH(9.5±0.5)，加入600U/g碱性蛋白酶，52℃水浴中进行酶解4h，沸水浴灭酶10min，冷却至室温，300目筛绢过滤除渣，滤液冷冻冻干或者喷雾干燥，制得所述的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)。其中酶解液的水解度为32.4％。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述的步骤a制作南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)的步骤为：将冰冻南极磷虾解冻绞成磷虾肉糜，按照原料与水1：3的比例加入超纯水搅拌混匀，调至合适pH(9.5±0.5)，加入1000U/g碱性蛋白酶，55℃水浴中进行酶解2h，沸水浴灭酶10min，冷却至室温，300目筛绢过滤除渣，滤液冷冻冻干或者喷雾干燥，制得所述的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)。其中酶解液的水解度为35.6％。
优选的，所述的步骤b用环丙酰胺对小鼠进行免疫缺陷造模，注射环丙酰胺一周后的小鼠经检测符合免疫低下模型动物标准。
本发明的第二方面，提供南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)在制备提高免疫低下模型小鼠非特异性免疫力的食品或药物中的应用，所述的南极磷虾蛋白肽混合物是将南极磷虾肉糜采用碱性蛋白酶酶解至酶解液的水解度为32-36％，干燥后制成。
优选的，所述的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)的制备方法为：将冰冻南极磷虾解冻绞成磷虾肉糜，按照原料与水1：1-1：3的比例加入超纯水搅拌混匀，调至合适pH(9.5±0.5)，加入600-1000U/g碱性蛋白酶，50-55℃水浴中进行酶解(2-4h)，沸水浴灭酶10min，冷却至室温，300目筛绢过滤除渣，滤液冷冻冻干或者喷雾干燥，制得所述的南极磷虾蛋白肽混合物。
本发明的第三方面，提供一种提高免疫低下模型小鼠非特异性免疫力的食品或药物，所述的食品或药物中包括南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)，所述的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)是将南极磷虾肉糜采用碱性蛋白酶酶解至酶解液水解度为32-36％，干燥后制成。
优选的，所述的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)的制备方法为：将冰冻南极磷虾解冻绞成磷虾肉糜，按照原料与水1：1-1：3的比例加入超纯水搅拌混匀，调至合适pH(9.5±0.5)，加入600-1000U/g碱性蛋白酶，50-55℃水浴中酶解2-4h，沸水浴灭酶10min，冷却至室温，300目筛绢过滤除渣，滤液冷冻冻干或者喷雾干燥，制得所述的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)。
本发明优点在于：
1、本发明提供了一种能有效提高改善免疫低下动物的非特异性免疫力，且解决其免疫低下引发的后续健康问题的方法；
2、本发明从单核-巨噬细胞功能方面研究免疫低下模型小鼠免疫力提高的方法，研究南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)是否具有提高免疫低下模型小鼠的非特异性免疫力，从而实现开发南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)为人类功能性保健食品原料或者特殊营养强化剂可能。开发南极磷虾蛋白肽制品不仅可满足人们对食品的营养要求，更能满足人们对食品的保健方面的要求。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
一种提高免疫力低下小鼠非特异性免疫力的方法
(1)南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)的制备
冰冻南极磷虾——解冻——绞成磷虾肉糜——按照原料与水1：1的比例加入超纯水搅拌混匀——调至合适pH(9.5±0.5)——加入600U/g碱性蛋白酶——52℃水浴中进行酶解4h——沸水浴灭酶10min——冷却至室温——300目筛绢过滤除渣——滤液冷冻冻干或者喷雾干燥——南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)；其中酶解液的水解度为32.4％。
(2)利用环磷酰胺(80mg·kg-1，ip)制造免疫低下昆明种小鼠模型，经检测符合免疫低下模型动物标准。免疫低下模型小鼠分两组，一组小鼠每天灌胃步骤1中制备的南极磷虾多肽粉(KPPs)(20g/kg)1次(免疫低下处理实验组)，另一组灌胃等量生理盐水(免疫低下处理对照组)，同时以正常免疫状态的小鼠每天灌胃等量生理盐水作为正对照(免疫正常组)。所有实验小鼠按照实验动物管理条例中的规定进行饲喂和管理。
(3)对各实验组小鼠每天的摄食及状态做好观察和记录，灌胃14天时采样。灌胃南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)的免疫低下处理的实验组小鼠(免疫低下处理实验组)的非特异性免疫力(单核－巨噬细胞功能)恢复，其碳廓清吞噬指数α略高于正常免疫状态的正常组小鼠(免疫正常组)，差异不显著，灌胃南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)的免疫低下处理的实验组小鼠(免疫低下处理实验组)的碳廓清吞噬指数α显著高于免疫低下处理对照组小鼠(免疫低下处理对照组)的碳廓清吞噬指数α。具体数据见表1。
表1灌胃14天后昆明种小鼠单核－巨噬细胞功能检测
注：同一列数字上标字母不同表示差异显著，字母相同表示无统计学差异。
实施例2
一种提高免疫力低下小鼠非特异性免疫力的方法
(1)南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)的制备
冰冻南极磷虾——解冻——绞成磷虾肉糜——按照原料与水1：3的比例加入超纯水搅拌混匀——调至合适pH(9.5±0.5)——加入1000U/g碱性蛋白酶——55℃水浴中进行酶解2h——沸水浴灭酶10min——冷却至室温——300目筛绢过滤除渣——滤液喷雾干燥——南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)；其中酶解液的水解度为35.6％。
(2)利用环磷酰胺(80mg·kg-1，ip)制造免疫低下ICR小鼠模型，经检测符合免疫低下模型动物标准。免疫低下模型小鼠分两组，一组小鼠每天灌胃步骤1中制备的南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)(60g/kg)1次(免疫低下处理实验组)，另一组灌胃等量生理盐水(免疫低下处理对照组)，同时以正常免疫状态的小鼠每天灌胃等量生理盐水作为正对照(免疫正常组)。所有实验小鼠按照实验动物管理条例中的规定进行饲喂和管理。记录每天各组小鼠的摄食量，观察其摄食行为。
(3)灌胃周期为28天。灌胃南极磷虾蛋白肽混合物(KPPs)的免疫低下处理的实验组小鼠(免疫低下处理实验组)的非特异性免疫力(单核－巨噬细胞功能)恢复，其碳廓清吞噬指数α显著高于正常免疫状态的正常组小鼠(免疫正常组)和灌胃生理盐水的免疫低下处理对照组小鼠(免疫低下处理对照组)的碳廓清吞噬指数α，而灌胃生理盐水的免疫低下处理的对照组小鼠的碳廓清吞噬指数α最低。具体数据见表2。
表2灌胃28天后ICR雄性小鼠单核－巨噬细胞功能检测
注：同一列数字上标字母不同表示差异显著，字母相同表示无统计学差异。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (4)
1.一种提高免疫低下模型小鼠非特异性免疫力的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)制作南极磷虾蛋白肽混合物：将南极磷虾肉糜采用碱性蛋白酶酶解至酶解液的水解度为32-36％，干燥后制成所述的南极磷虾蛋白肽混合物；所述的制作南极磷虾蛋白肽混合物的步骤为：将冰冻南极磷虾解冻绞成磷虾肉糜，按照原料与水1：1-1：3的比例加入超纯水搅拌混匀，调至pH 9.5±0.5，加入600-1000U/g碱性蛋白酶，50-55℃水浴中酶解2-4h，沸水浴灭酶10min，冷却至室温，300目筛绢过滤除渣，滤液冷冻冻干或者喷雾干燥，制得所述的南极磷虾蛋白肽混合物；
b)给免疫低下模型小鼠灌胃步骤a的南极磷虾蛋白肽混合物，灌胃量为20-60g/kg，灌胃周期为14-28天。
2.根据权利要求1所述的提高免疫低下模型小鼠非特异性免疫力的方法，其特征在于，所述的步骤b用环磷酰胺对小鼠进行免疫缺陷造模，注射环磷酰胺一周后的小鼠经检测符合免疫低下模型动物标准。
3.南极磷虾蛋白肽混合物在制备提高免疫低下模型小鼠非特异性免疫力的食品或药物中的应用，其特征在于，所述的南极磷虾蛋白肽混合物是将南极磷虾肉糜采用碱性蛋白酶酶解至酶解液的水解度为32-36％，干燥后制成；所述的南极磷虾蛋白肽混合物的制备方法为：将冰冻南极磷虾解冻绞成磷虾肉糜，按照原料与水1：1-1：3的比例加入超纯水搅拌混匀，调至pH 9.5±0.5，加入600-1000U/g碱性蛋白酶，50-55℃水浴中酶解2-4h，沸水浴灭酶10min，冷却至室温，300目筛绢过滤除渣，滤液冷冻冻干或者喷雾干燥，制得所述的南极磷虾蛋白肽混合物。
4.一种提高免疫低下模型小鼠非特异性免疫力的食品或药物，其特征在于，所述的食品或药物中包括南极磷虾蛋白肽混合物，所述的南极磷虾蛋白肽混合物是将南极磷虾肉糜采用碱性蛋白酶酶解至酶解液的水解度为32-36％，干燥后制成；所述的南极磷虾蛋白肽混合物的制备方法为：将冰冻南极磷虾解冻绞成磷虾肉糜，按照原料与水1：1-1：3的比例加入超纯水搅拌混匀，调至pH 9.5±0.5，加入600-1000U/g碱性蛋白酶，50-55℃水浴中酶解2-4h，沸水浴灭酶10min，冷却至室温，300目筛绢过滤除渣，滤液冷冻冻干或者喷雾干燥，制得所述的南极磷虾蛋白肽混合物。
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