CN102690346B - 一种治疗糖尿病的多肽及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种治疗糖尿病的多肽及其制备方法，所述的多肽化合物具有长效的降血糖和促胰岛素分泌的作用。本发明的治疗糖尿病的多肽具有如下化学结构。

Description

一种治疗糖尿病的多肽及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种多肽化合物及其制备方法和在治疗糖尿病中的用途。
背景技术
糖尿病是由于胰岛素不足或胰岛素的细胞代谢作用缺陷所引起的葡萄糖、蛋白质及脂质代谢紊乱的一种综合症。近年来，糖尿病患者的人数逐渐增多，分为I型糖尿病和II型糖尿病。其中II型糖尿病患者的人数占糖尿病总人数的85-90％，严重威胁着病人的健康和生命。如果糖尿病得不到良好的控制，可能引起很多并发症，例如：糖尿病肾病、视网膜病变、高血压等。
目前，大多数患者通过口服降糖药物来帮助控制体内血糖，但是却无法阻止胰岛素分泌的减少，很多患者最终仍然要使用胰岛素治疗。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是在小肠L-细胞中合成并释放的，人GLP-1(7-36)的结构为：H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg。当血糖水平升高时，GLP-1能够刺激胰腺β细胞释放胰岛素。除了促胰岛素作用外，GLP-1还抑制胰高血糖素的分泌，延迟胃排空。GLP-1的促胰岛素分泌作用依赖于血糖的浓度，当血糖浓度高于6mmol/L时，GLP-1显著促进胰岛素分泌，而一旦血糖恢复到正常值则不再继续作用。因此，用GLP-1治疗糖尿病是很好的选择，目前已证实，外源给予GLP-1能够降低II型糖尿病患者的血糖水平。GLP-1是近年来糖尿病预防和治疗研究的热门领域。另外，GLP-1对老年痴呆和肥胖有治疗作用。
但是，GLP在体内很容易被二肽酰基肽酶IV(dipeptidylpeptidaseIV，DPPIV)降解，脱去N-端二肽，迅速分解成无活性的物质。静脉注射GLP-1在体内的半衰期仅有2-5min，很大程度限制了GLP-1的临床应用。因此，有必要提供一种保留GLP-1活性，但是能够相对延长半衰期的化合物。近年来很多研究都围绕着抑制二肽酰基肽酶降解，延长GLP-1的半衰期而展开。
例如，CN1904150公开了N端以Cys、Ala、Gly、His、Ser、Thr中任何一个氨基酸取代，获得GLP-1(7-36)的类似物，半衰期得以延长。
WO9808871公开了一类GLP-1的类似物，通过在GLP-1序列上增加脂肪酸支链，来延长GLP-1的半衰期的。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有长效的多肽化合物，具有类似于GLP-1的促胰岛素分泌效果和降血糖功效，其化学结构式如下：
其中每个R1、R2、R3、R4独立的选自H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基或杂环基烷基；R1、R2、R3、R4优选烷基，更优选甲基或庚烯基；
R5和R6独立的选自烷基、烯基、炔基、[R1′-K-R1′]n；
所述的R1′选自烷基、炔基(烯基)或炔基；
所述的K是O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR2′、或
所述的R2′是H或烷基；
n是2-7的整数。
R5和R6优选烯基，更优选庚烯基。
本发明治疗糖尿病的多肽优选具有下列结构的化合物：
其中每个R1、R2、R3、R4独立的选自H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基或杂环基烷基；优选烷基，更优选甲基或庚烯基；
n是2-7的整数。
本发明治疗糖尿病的多肽化合物更优选具有下列结构的化合物：
本发明的多肽化合物在天然GLP-1的基础上，将其结构中四个位点的氨基酸用上述基团进行取代，并环合连接，形成本发明的多肽化合物，因此，本发明的多肽化合物具有天然的多肽二级结构，α螺旋被稳定化，使其更接近于内源性GLP-1的结构特点，更容易与靶位相结合，并提高了多肽类似物对二肽酰基肽酶IV的耐受，降低了在体内被降解的速度。与天然GLP-1序列相比，本发明的多肽化合物在体内的血清半衰期得以延长。而且本发明的多肽化合物保留了天然GLP-1的药理活性。
本发明多肽化合物的氨基酸尤其优选以具有光学活性的(S)-2-氨基-2-甲基-6-庚酸取代，所述的取代基通过化学催化的方式彼此环合后获得的多肽化合物，使得血清半衰期明显延长。
本发明的另一方面提供了制备上述多肽化合物的方法。可以采用本领域技术人员熟知的方法，选择顺序的或次序不同的合成步骤产生具有如下化学结构的物质：
所述的合成方法包括：例如液相合成或固相合成(SPPS)进行制备，优选SPPS。所述的固相合成可以选择常规聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇类树脂等，例如：王氏树脂(WangResin)，Fmoc-Pro-CTC，RinkAmideLinkerMBHA树脂等，优选RinkAmideLinkerMBHA树脂。本发明化合物的环状结构是通过催化环合的方式制备的，所述的催化剂可以是：钌催化剂，优选的催化剂是苯基亚甲基双(三环己基磷)二氯化钌(Grubbs1st)，或Grubbs2st。
本发明另一方面提供了包括上述多肽化合物的药物组合物。所述的药物组合物包含有效量的具有上述结构的多肽化合物和药学可接受的载体，所述的组合物可以根据本领域的公知技术进行制备，例如与常规的药用辅料进行混合，制备成注射剂、注射液，或局部给药的制剂类型例如乳剂、膏剂、霜剂或经鼻给药的剂型等，或具有缓释效果的制剂，例如微球、脂质体等。
本发明所述的“药学可接受的载体”包括任何一种药用辅料，例如填充剂、稀释剂、赋形剂等。例如包括但不限于：乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、纤维素类(如羧甲基纤维素、羟丙甲基纤维素等)、乙二醇、豆油、芝麻油、乙醇、无菌生理盐水、无菌水、乙醇等。通常，药学上可接受的载体是水溶性的pH缓冲液，例如柠檬酸盐、磷酸盐等；还可以含有抗氧化剂，稳定剂(如氨基酸)、抑菌剂等。
本发明另一方面提供了上述多肽化合物在制备与GLP-1相关的疾病中的应用，尤其是在制备降低血糖的药物中的用途，更优选是预防、治疗糖尿病和/或糖尿病并发症药物中的用途。所述的糖尿病包括I型糖尿病和II型糖尿病；所述的糖尿病并发症包括但不限于：糖尿病肾病、糖尿病高血压、糖尿病眼疾、糖尿病神经性病变等。
附图说明
图1是本发明优选化合物的制备流程
以下的实施例用于进一步的阐明本发明的技术方案。本发明说明书及实施例中所带保护基的氨基酸单体以及其他化学试剂等，均可从相关公司购买获得，未注明具体条件的试验方法，可按常规条件进行，或按商品供货商所建议的条件进行。
实施例1、
按照固相合成的常规方法，例如图1所示的制备流程，将带保护基的氨基酸逐一接在树脂上，然后用催化剂催化环合，接着脱去保护基并将多肽从树脂上切下，制备如下式的多肽化合物：
1、固相合成
选择0.295gRinkAmideLinkerMBHA树脂(1)(取代度：0.51mmol/g)制备，在室温条件下用DMF浸泡树脂60min，将带有Fmoc保护的氨基酸按照图1所示的顺序排列在合成仪中进行活化连接，获得结构式为：
的化合物(2)。
2、催化环合
将上述步骤所得的化合物依次用DCM(20ml)和DCE(20ml)各冲洗两次，然后用DCE(8ml)浸泡30min，接着将Grubbs1st(25mgx2，20mg/0.1mmol)加入反应混合物中，室温振摇3小时。用MS检测环化情况，如果环化不完全，重复该步骤，通常重复2次，获得目标多肽化合物(3)(0.773g)。
3、切除树脂
将步骤3获得的反应混合物放在E溶液(5ml)中，氮气保护下室温搅拌2.5小时。过滤，去除滤液，滤饼用TFA(2ml)冲洗，接着放置在冷的乙醚(50ml)中沉淀，离心；得到的滤饼用冷的乙醚(50ml)冲洗两次，真空干燥，获得本发明的多肽化合物329mg，产率52％，M+H＝4200.3，理论MW＝4199.67
4、纯化
将上述粗品用HPLC进行纯化，获得纯度95％以上的纯品。
实施例2、实施例1多肽化合物的降血糖作用
取健康雄性昆明小鼠(体重18-22g)，禁食过夜，随机分为3组，每组5只：葡萄糖对照组(按照小鼠体重每千克腹腔注射15mmol的葡萄糖溶液(浓度20％)；GLP-1对照组(按照小鼠体重每千克腹腔注射15mmol的葡萄糖溶液和20nmol的GLP-1)；实施例化合物组(按照小鼠体重每千克腹腔注射15mmol的葡萄糖溶液和20nmol的实施例1化合物)。在0、10、30、60、90、120、150分钟鼠尾静脉取血，取血后立即注射葡萄糖溶液，用血糖仪测定血糖值。
如表1所示，与葡萄糖组小鼠相比，实施例1的化合物具有降糖作用；与GLP-1组小鼠相比，在150min内，实施例1的化合物仍然能降低血糖，而GLP-1在大约30min内能够有效降低血糖。实施例1的化合物有效的延长了药效时间。
表1实施例1化合物的降血糖作用
实施例3实施例1的多肽化合物的促胰岛素分泌作用
将NOD小鼠分为三组。用刻度毛细管眼窦取血50ul，三组小鼠分别腹腔注射10ug是实施例1多肽化合物、10ugGLP-1、200ul生理盐水，分别于0、5、10、20、30、45分钟眼窦取血。取血后的血样加入含50ul生理盐水的离心管中混匀，离心去除红血球，用放射性免疫试剂盒测定血清胰岛素浓度，检测实施例1化合物的促胰岛素分泌作用。
如表2所示，结果显示，腹腔注射实施例1的化合物和GLP-1均能显著促进胰岛素的分泌。
本发明实施例1的化合物长时间刺激产生胰岛素的能力超过GLP-1，说明本发明的多肽化合物能够有效延长GLP-1的体内药效时间。
表2实施例1化合物的促胰岛素分泌作用
给药后时间 0min 5min 10min 20min 30min 45min
空白对照组 2.16×10-6 2.11×10-6 2.02×10-6 2.01×10-6 1.95×10-6 1.85×10-6
GLP-1组 2.84×10-6 8.51×10-6 10.23×10-6 10.75×10-6 6.98×10-6 5.12×10-6
实施例1组 2.95×10-6 8.23×10-6 10.65×10-6 11.03×10-6 10.58×10-6 11.24×10-6

Claims (10)

1.一种多肽化合物，其化学结构式如下：
2.一种制备权利要求1所述多肽化合物的方法，其特征在于：
(1)制备具有下述结构的物质：
(2)通过催化剂处理步骤(1)的化合物，使其环合。
3.如权利要求2的方法，其特征在于，步骤(1)通过固相合成技术制备。
4.如权利要求3的方法，其特征在于，步骤(1)采用Fmoc保护的固相合成技术。
5.如权利要求2的方法，其特征在于，步骤(2)的催化剂是钌催化剂。
6.如权利要求5的方法，其特征在于，所述的钌催化剂是Grubbs1st。
7.如权利要求1所述的多肽化合物在制备预防、治疗与GLP-1相关疾病的药物中的应用。
8.如权利要求7的用途，所述的GLP-1相关疾病包括：高血糖、糖尿病及糖尿病并发症。
9.如权利要求8的用途，所述的糖尿病并发症是糖尿病肾病、糖尿病高血压、糖尿病眼疾、糖尿病神经性病变。
10.一种药物组合物，包括有效量的权利要求1所述的多肽化合物和药学可接受的载体。
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Exendin-4模拟肽结构、活性及稳定性研究;陈洁;《吉林大学博士学位论文》;20071231;内容提要，第6-12页 *
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