CN117186173B - 抑制Aβ42聚集并降低其细胞毒作用的三肽化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抑制Aβ42聚集并降低其细胞毒作用的三肽化合物，三肽化合物包括ERW或WRR。本发明利用Python语言构建了三肽数据库，通过分子对接筛选出与Aβ42结合的5种三肽，并利用分子动力学方法分析5种三肽(ERW、QRW、RRR、RRW和WRR)与Aβ42蛋白的相互作用，通过拉式图结构合理性分析及伞式采样结合能分析显示复合物Aβ42‑WRR和Aβ42‑ERW对接构象是有效的，并且WRR和ERW对Aβ42聚集起到有效的抑制作用。我们设计实施药理学实验，并验证WRR和ERW及其复方混合物对Aβ42聚集有很好的抑制作用，减轻了分泌表达的Aβ42对SH‑SY5Y神经细胞株的细胞毒作用。
Description
技术领域
本发明涉及药物技术领域，特别涉及抑制Aβ42聚集并降低其细胞毒作用的三肽化合物。
背景技术
阿尔兹海默病是一种神经退行性疾病，主要病理特征为β-淀粉样蛋白(Aβ)聚集成淀粉样斑块、Tau蛋白过度磷酸化。Aβ聚集后过度激活免疫细胞引起大脑炎症；破坏神经突触和神经元；引起神经元坏死，使染色质等细胞内容物扩散到四周脑组织(未发表数据)。含有42个氨基酸的Aβ(Aβ42)是形成淀粉样斑块的主要品种，而不是Aβ40。阿尔茨海默病是发达国家十大致死性因素之一，它不但是一种智力致残性疾病，也是残酷的死亡过程。全世界阿尔茨海默病患者的总人数已超过5000万，目前临床上针对阿尔兹海默症的病理标志Aβ蛋白的药物只有美国FDA在2021年通过加急审查途径批准上市的抗淀粉样蛋白Aβ42单克隆抗体，然而过去的多项临床试验表明，Aβ42单克隆抗体可以引发脑炎，多家药厂的抗体新药研发终止于临床阶段。阿尔茨海默病的病理复杂性，给研发阿尔茨海默病治疗特效药任务带来极大挑战。我们前期基础研究表明，Aβ42单体为球状蛋白，随着聚合度增加，形成S形管状结构，该结构的系统自由能最低。在本专利中，我们提出抑制Aβ42聚集并降低其细胞毒作用的三肽化合物及其复方。
发明内容
本发明的目的在于提供抑制Aβ42聚集并降低其细胞毒作用的三肽化合物及其复方，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：三肽化合物，所述三肽化合物包括ERW或WRR。
优选的，所述ERW为谷氨酸-精氨酸-色氨酸，所述WRR为色氨酸-精氨酸-精氨酸。
优选的，所述三肽化合物用于抑制Aβ42聚集。
优选的，所述三肽化合物用于降低Aβ42细胞毒作用。
优选的，三肽化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：利用Python语言编写ChemScript脚本，创建由20种L-α氨基酸组成的所有三肽的结构数据库；
步骤二：从蛋白质数据库中筛选得到五元寡聚体Aβ42的蛋白质分子结构为靶蛋白构象；
步骤三：以五元寡聚体Aβ42为靶蛋白，利用分子对接软件和构建好的三肽结构数据库进行分子对接筛选出具备最佳对接状态的三肽；
步骤四：利用GROMACS分子动力学软件，分析对接筛选出的5种三肽与五元聚合态Aβ42的结合自由能；
步骤五：药理学实验分析5种三肽混合物抑制Aβ42聚集，并降低Aβ42引起的细胞毒作用。
优选的，三肽化合物在预防和治疗阿尔茨海默病的药物和食品中的应用。
优选的，三肽化合物在药物和食品中的应用。
本发明的技术效果和优点：
本发明利用Python语言构建了三肽数据库，通过分子对接筛选出可以与Aβ42结合的5种三肽，并利用分子动力学方法分析5种三肽(ERW、QRW、RRR、RRW和WRR)与Aβ42蛋白的相互作用，通过拉式图结构合理性分析及伞式采样结合能分析显示复合物Aβ42-WRR和Aβ42-ERW对接构象是有效的，在此基础上，设计实施药理学实验，并验证WRR和ERW及其复方混合物对Aβ42聚集有很好的抑制作用，减轻了分泌表达的Aβ42对SH-SY5Y神经细胞株的细胞毒作用，阿兹海默病的主要病理特征是患者脑内的Aβ42聚集形成斑块，依据该发病机理，由WRR和ERW构成的复方混合物用于药物或食品，可以减缓Aβ42聚集及其引起的细胞毒作用等病理过程。
附图说明
图1为本发明分子对接得到的三肽与Aβ42五元聚合核心结合示意图。
图2为本发明三肽配体与Aβ42二聚体复合物的拉式图。
图3为本发明分子动力学分析5中三肽类化合物与Aβ42五元聚集核心的结合自由能示意图。
图4为ThT法检测两种三肽及其复方抑制Aβ42聚集的作用示意图。
图5为电镜观察本发明两种三肽对Aβ42聚集形貌的影响示意图。
图6为显微镜观察WRR和ERW对分泌Aβ42的SH-SY5Y细胞存活的影响示意图。
图7为流式细胞术检测两种三肽对分泌Aβ42的SH-SY5Y细胞凋亡的影响示意图。
图8为流式细胞术检测两种三肽对分泌Aβ42的SH-SY5Y细胞产生活性氧(ROS)的影响示意图。
图9为MTT(噻唑蓝)法检测两种三肽及其复方降低Aβ42的细胞毒性的作用示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了如图1-9所示的三肽化合物，三肽化合物包括谷氨酸-精氨酸-色氨酸(ERW)或色氨酸-精氨酸-精氨酸(WRR)，用于抑制Aβ42聚集以及降低Aβ42细胞毒作用的三肽化合物的复方混合物，三肽化合物或其复方混合物用于防治与Aβ42聚集及其细胞毒性相关的疾病，或用于影响与Aβ42聚集及其细胞毒性有关的疾病病理过程，组成中包含谷氨酸-精氨酸-色氨酸(ERW)或色氨酸-精氨酸-精氨酸(WRR)。
优先的，三肽化合物或其复方混合物的研究方法，包括以下步骤：
步骤一：利用Python语言编写ChemScript脚本，创建由20种L-α氨基酸组成的所有三肽的结构数据库；
步骤二：从蛋白质数据库(PDB)中筛选得到五元寡聚体Aβ42(编号5oqv)的蛋白质分子结构为靶蛋白构象；
步骤三：以五元寡聚体Aβ42为靶蛋白，利用分子对接软件和我们构建好的三肽结构数据库进行分子对接筛选出具备最佳对接状态的三肽；
步骤四：利用GROMACS分子动力学软件，分析对接筛选出的5种三肽与五元聚合态Aβ42(5oqv)的结合自由能；
步骤五：药理学实验分析两种三肽(WRR和EWR)抑制Aβ42聚集，并降低Aβ42引起的细胞毒作用。
其中，步骤三筛选出的5种三肽，包括ERW、QRW、RRR、RRW和WRR，这五种三肽是与Aβ42结合最好的三肽。
进一步的，步骤四和步骤五中得到的分析结果显示复合物Aβ42-WRR和Aβ42-ERW对接构象是有效的，并且WRR和ERW对Aβ42聚集起到有效的抑制作用，其通过拉式图结构合理性分析及伞式采样结合能分析，拉式图结构合理性分析原理是通过蛋白中非键合原子间最小接触距离来评价两个相邻肽单位骨架构象的合理性，并以此表示蛋白中允许和不允许的构象，位于不允许区的氨基酸数应小于氨基酸总数的5％。三肽与Aβ42的结合自由能通过分析将三肽从结合复合物中拉开的过程中系统自由能的变化来获悉；系统自由能变化越大则表明三肽与Aβ42的结合自由能越高。
进一步的，步骤五药理学实验得到的分析结果，验证了WRR和ERW及其复方混合物对Aβ42聚集有抑制作用，并可用于减轻分泌表达的Aβ42对SH SY5Y神经细胞株的细胞毒作用，药理学实验包括ELISA实验、细胞凋亡实验和细胞ROS检测。
更进一步的，三肽化合物及其复方混合物在药物和食品中的应用，药物和食品可以用于减缓Aβ42聚集及其引起的细胞毒作用病理过程，其中复方混合物指的是WRR与ERW构成的复方。由于Aβ42聚集的主要动力是由疏水相互作用(三种相互作用的综合体现)降低的自由能，本发明中的三肽及其复方与Aβ42结合，抑制其过度聚集及其细胞毒作用。
本发明利用Python语言构建了三肽数据库，通过分子对接筛选出可以与Aβ42结合的5种三肽，并利用分子动力学方法分析5种三肽(ERW、QRW、RRR、RRW和WRR)与Aβ42蛋白的相互作用，通过拉式图结构合理性分析及伞式采样结合能分析显示复合物Aβ42-WRR和Aβ42-ERW对接构象是有效的并且WRR和ERW对Aβ42聚集起到有效的抑制作用，在此基础上，设计实施药理学实验，并验证WRR和ERW及其复方混合物对Aβ42聚集有很好的抑制作用，减轻了分泌表达的Aβ42对SH-SY5Y神经细胞株的细胞毒作用，阿尔茨海默病的主要病理特征是患者脑内的Aβ42聚集形成斑块，依据该发病机理，由WRR和ERW构成的复方混合物用于药物或食品，可以减缓Aβ42聚集及其引起的细胞毒作用等病理过程。
具体实施方式一：采用信息科学技术分析三肽类化合物与五元聚合态Aβ42的相互作用的方法；
(1)三肽类化合物结构数据库的构建，用Python语言编写ChemScript脚本，建立由20种L-α-氨基酸随机组合构成的全部三肽化合物分子结构的sdf(Structure Data File)格式的结构数据库；
(2)检索美国结构生物信息学研究合作组织(RCSB)的蛋白结构数据库(PDB)，下载Aβ42聚集核心的三维结构数据(编号5oqv)。下载下来的结构文件中，重新命名为5oqvPentamer.pdb并保存，作为分子对接用的靶蛋白结构文件；
(3)利用分子对接软件，以5oqvPentamer为对接受体，用上述构建的三肽类化合物结构数据库进行分子对接，对接结果依据经过优化的结合能进行排序，选取对接状态最佳的5种三肽类化合物，用于后续的分子动力学和药理学分析，分子对接筛选出的5种三肽类化合物，分别为ERW、QRW、RRR、RRW和WRR；
(4)分子动力学分析5种三肽类化合物与Aβ42结合的稳定性与相互作用能。GROMACS分子动力学分析软件(2020.03版)安装于Ubuntu(18.04版)Linux操作系统上，采用CUDA(Compute Unified Device Architecture)支持的GPU混合并行运算模式，利用针对蛋白质结构从头计算加以优化的AMBER99SB力场和TIP3P明确水分子模型，分析5种三肽类化合物与Aβ42结合的稳定性与结合自由能。自由能的变化是一个非常重要的物理量，它决定了反应的方向。自由能作为热力学第二定律中判断一个过程是否能自发进行的依据。吉布斯自由能(ΔG)反映结合能的高低，本研究通过GROMACS(2020.03)软件使用伞形采样(Umbrellasampling)和加权直方图法(WHAM)计算将配体沿反应轴(ξ)从靶蛋白拉开时的吉布斯自由能(ΔG)变化，来探究三肽和五肽化合物底物与Aβ42单体结合的稳定性。首先，将分子对接筛选的蛋白质-配体复合物结构的配体进行能量最小化和对复合物结构校正后，通过pdb2gmx指令生成GROMACS拓扑文件。选用GROMOS96 53a6力场和SPC216水分子模型溶剂。修正topol_Protein_chain_H.itp文件内容。定义体系分析单元盒尺寸大小为6.0x 7.0x15.0nm的矩形盒，与三肽和五肽结合的Aβ42蛋白复合体中心位置为3.0，3.5，12.5(x，y，z)。并将蛋白质-配体复合物结构放入长方体单元盒的一侧。单元盒内充满水分子，并向体系中添加0.1M的氯化钠平衡体系电荷。参比原子设为Aβ42第29位甘氨酸的羰基碳原子和三肽第2个氨基酸的Cα或五肽第3个氨基酸的Cα。在拉取和伞状取样阶段之前，采用上面所示的压力平衡。系统能量最小化和压力平衡后，通过在250,000个时间步长的过程中以0.01nm/ps的恒定速度施加谐振力沿反应轴(ξ)将配体底物从蛋白质复合物中拉开并生成系列构型数据，选择中心距离不超过0.2nm的系统构型作为分析窗口进行伞式采样分析，每个为5,000,000时间步长，然后利用加权直方图分析法得到蛋白质-配体复合物体系中吉布斯自由能变化曲线。
具体实施方式二：利用ThT检测三肽化合物及其复方混合物抑制Aβ42聚集的作用，Aβ42采用β-片层构象相互聚集，产生三个疏水区，将疏水性氨基酸埋藏在蛋白质复合物的内侧，从而使系统自由能降低。ThT是一种常用来聚集状态Aβ42的苯并噻唑荧光染料，它可以专一性地结合到Aβ42的β-片层结构，结合后ThT的荧光增强，体系中Aβ42的聚合态β片层结构越多，则体系的荧光强度就越强，ThT结合在Aβ42聚合态纤维外侧，不干扰Aβ42聚集，因此，ThT常用于分析判断Aβ42聚合态纤维的形成；
(1)Aβ42以及三肽样品处理，Aβ42粉末用1.0％NH4OH溶解为1mM储备液，二肽化合物固体粉末使用10mM的磷酸盐缓冲液(pH7.4)(PBS)溶解为1mM储备液，在后续实验中，所有储备液均在临用前用10mM PBS稀释为不同浓度的工作液；
(2)利用硫磺素T(ThT)，荧光检测三肽化合物及其复方混合物对Aβ42聚集的抑制作用，将0.0128mg ThT粉末溶解于PBS，充分搅拌使其溶解，定容到10mL，制得4mM ThT储备液，在黑壁透明底的96孔板中，依次添加终浓度为10μM的Aβ42、10μM的三肽化合物或三肽复方混合物(两种三肽各5μM)以及16μM的ThT，反应总体积为125μL，每组设置5个重复，样品混合均匀后，37℃温育24小时，温育结束后，放入Synergy H1酶标仪，设置激发波长450nm，在波长485nm检测荧光强度。
具体实施方式三：使用透射电子显微镜(TEM)观察Aβ42的聚集形貌，实验组Aβ42是分别加入四倍于Aβ42浓度的三肽WRR和ERW共同孵育，对照组为仅含有Aβ42；
(1)将在37℃恒温摇床孵育48h的样品取出10μl，滴加到碳支持膜去离子铜网上，之后使用2％的磷钨酸溶液滴10μl进行负染，干燥处理后利用透射电子显微镜系统进行观察，加速电压200kv，比例尺为200nm，Aβ42终浓度为10μM，三肽WRR和ERW终浓度为40μM。
(2)单独Aβ42孵育48小时中显示原纤维紧密成斑块并相互交叉，加入三肽WRR和ERW后共同孵育48小时的Aβ42呈现较小的无定形聚集体颗粒，透射电子显微镜结果表明三肽化合物的加入，一定程度上阻止了Aβ42原纤维聚集体的形成，仅产生少量低聚物。
具体实施方式四：溴化乙锭法(EB)探究三肽对Aβ42细胞毒性的影响；
(1)SH-SY5Y细胞复苏后，将处于对数生长期且状态良好的细胞接种于12孔细胞培养板过夜培养，当生长丰度达到75-80％时转染pcDNA3.1-Aβ42质粒到细胞中，使得SH-SY5Y细胞能够胞外分泌表达Aβ42。
(2)转染结束后每个给药组设置三个重复，加入终浓度为10μM和50μM的ERW、WRR两种短肽进行处理24小时。每组细胞加入终浓度为1mg/ml的溴化乙碇，移至二氧化碳培养箱中孵育10mins。
(3)使用全自动倒置荧光显微镜(Axio Observer 7),设置545nm激发波长，并测定在590nm的发射波长，观察细胞。死细胞显示红色荧光。使用Image J对死细胞进行计数，结果显示：转染pcDNA3.1-Aβ42质粒的SH-SY5Y细胞在三肽预处理的情况下与无寡肽处理组相比，死细胞数量显著降低，并且呈剂量依赖性。
具体实施方式五：流式细胞术检测三肽对Aβ42诱导的细胞凋亡的影响
选择对数生长期的SH-SY5Y细胞用胰酶消化并接种于12孔细胞板中培养24小时，Lipofectamine 2000试剂转染pcDNA3.1-Aβ42质粒到SH-SY5Y细胞中，使细胞能够胞外分泌表达Aβ42，转染结束后每个给药组设置三个重复，加入终浓度为10μM和50μM的ERW、WRR两种短肽进行处理24小时，使用上海百赛生物的调亡试剂盒标记凋亡的细胞和坏死细胞，通过流式细胞仪检测SH-SY5Y细胞的凋亡水平。
具体实施方式六：流式细胞术检测探究三肽对Aβ42刺激细胞产生活性氧水平的影响；
(1)将经过胰酶消化的SH-SY5Y细胞接种于24孔细胞板中，每个细胞板接种约106个细胞，移至二氧化碳培养箱中培养24小时后用PEI 40K转染试剂盒转染pcDNA3.1-Aβ42质粒到SH-SY5Y细胞中，使得SH-SY5Y细胞能够胞外分泌表达Aβ42，实验组加入终浓度为10μM和50μM的WRR和ERW于37℃处理24小时，其中每个三肽处理组设置三个重复；
(2)倒置显微镜下观察细胞状态并拍照；
(3)使用活性氧检测试剂处理细胞，选择流式细胞仪的FL1通道，设置488nm激发波长，并测定在530nm的发射波长。显微镜观察表明，三肽本身对SH-SY5Y细胞无神经毒性作用，WRR和ERW能够很好的抑制SH-SY5Y细胞分泌的Aβ42的聚集，消除了Aβ42聚集对细胞的毒害作用，流式结果显示：转染pcDNA3.1-Aβ42质粒的SH-SY5Y细胞在三肽预处理的情况下与无寡肽处理组相比，诱导的ROS的水平显著降低，并且呈剂量依赖性地减少了Aβ42诱导的SH-SY5Y细胞中ROS的形成。
具体实施方式七：MTT(噻唑蓝)法检测三肽及其复方对Aβ42细胞毒作用的影响；
当SH-SY5Y细胞处于对数生长期时，胰酶消化，细胞计数将细胞均匀地接种到96孔板中，每孔的细胞数量为5x 103个，培养24小时后进行转染，在分泌表达Aβ42蛋白质的SH-SY5Y细胞中加入不同浓度的WRR(10μM)、EWR(10μM)或WRR/EWR(各(5μM)混合溶液，设置空白孔为细胞培养液，对照孔为正常未转染的细胞，调零孔为加磷酸盐缓冲液的转染后的细胞，设置4个重复，边缘孔加入DPBS缓冲液，防止实验组的样品孔中的溶液挥发，在5％ CO2，37℃细胞培养箱中培养48h，弃96孔板中的溶液，每孔中加入90μL的无血清培养基和10μL MTT溶液(5mg/mL)，处理4小时后，将孔中的溶液吸出，向每孔中加入100μL的DMSO，设置转速为1500rpm，将板在37℃摇床上，摇晃10min。酶标仪检测实验孔在OD 570nm处吸光值，计算细胞活性。细胞活性为加药孔和对照孔分别减去调零孔的OD，然后计算加药孔OD值占对照孔的百分数。
在图1中，条带样结构代表五元聚合态Aβ42的空间构象，其中A为谷氨酸-精氨酸-色氨酸(ERW)；B为谷氨酰胺-精氨酸-色氨酸(QRW)；C为精氨酸-精氨酸-精氨酸(RRR)；D为精氨酸-精氨酸-色氨酸(RRW)；E为色氨酸-精氨酸-精氨酸(WRR)。
图2中，A为Aβ42-Aβ42二聚体；B为ERW与Aβ42结合；C为QRW与Aβ42结合；D为RRR与Aβ42结合；E为RRW与Aβ42结合；F为WRR与Aβ42结合。
图4，**P<0.01，与Aβ42比较；$$P<0.01，与Aβ42-WRR比较；##P<0.01，与Aβ42-EWR比较；单因素方差分析(ANOVA)，采用Modified-Tukey test作组间多重比较，n＝5,并重复三次。
图5中，A为单独孵育48小时的10μM Aβ42透射电镜图像；B为10μM Aβ42和40μM WRR共同孵育48小时的透射电镜图像；C为10μM Aβ42和40μM ERW共同孵育48小时的透射电镜图像。
图6中，图中溴化乙锭(EB)染色的死细胞显示红色荧光。A为空白对照；B为转染Aβ；C为非转染+50μM的WRR；D为转染+10μM的WRR；E为转染+50μM的WRR；F为非转染+50μM的ERW；G为转染+10μM的ERW；H为转染+50μM的ERW；I为以上观察结果的定量分析图(使用Image J工具计数)。*P<0.05，**P<0.01，与Aβ42组(Aβ)比较，单因素方差分析(ANOVA)，采用Modified-Tukey test作组间多重比较，n＝6。
图7中，A为空白对照；B为转染Aβ；C为非转染+50μM的WRR；D为转染+10μM的WRR；E为转染+50μM的WRR；F为非转染+50μM的ERW；G为转染+10μM的ERW；H为转染+50μM的ERW；I为以上观察结果的定量分析图。*P<0.05，**P<0.01，与Aβ42组(Aβ)比较，单因素方差分析(ANOVA)，采用Modified-Tukey test作组间多重比较，n＝3。
图8中，为流式细胞术检测两种三肽对分泌Aβ42的SH-SY5Y细胞产生活性氧(ROS)的影响A和H为空白对照；B为非转染+50μM的WRR；C为转染Aβ；D为转染+10μM的WRR；E为转染+50μM的WRR；F为A-E的重叠；I为非转染+50μM的ERW；J为转染Aβ；K为转染+10μM的ERW；L为转染+50μM的ERW；M为H-L的重叠；G和N为WRR组和ERW组实验结果的定量分析图。结果用平均值±SEM表示。**p<0.01，采用单因素方差分析(ANOVA)，多重比较采用Modified-Tukey test，n＝3。
图9中，**P<0.01，与Aβ42比较；$P<0.05，与Aβ42-WRR比较；#P<0.05，与Aβ42-EWR比较；单因素方差分析(ANOVA)，采用Modified-Tukey test作组间多重比较，n＝5,并重复三次。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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1.氨基酸序列为 ERW 的三肽化合物在制备预防和治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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