CN103772487B - 一种抑制人胰淀素聚集或毒性的多肽、试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抑制人胰淀素聚集或毒性的多肽试剂及其应用，所述多肽的氨基酸序列为SEQ？ID？NO:1、SEQ？ID？NO:2或SEQ？ID？NO:3所示的氨基酸序列；所述试剂包括上述本发明所述的多肽；及上述所述的多肽或上述所述的试剂在制备用于治疗人胰淀素相关疾病的药物中的应用。本发明通过试验验证设计的多肽序列片段，能够与目标淀粉样蛋白分子特异结合，实现对人胰淀素组装结构的调控，从而抑制了目标蛋白的生理毒性，对于抑制人胰淀素生理毒性的药物设计具有非常重要的意义，从而能够用于治疗II型糖尿病。
Description
技术领域
本发明涉及属于生物医学技术领域。本发明具体涉及一种多肽及其应用，尤其涉及一种抑制人胰淀素聚集或毒性的多肽、试剂及其应用。具体地说，本发明针对调控hIAPP蛋白的生理功能，发现了一系列多肽序列。该序列可以为hIAPP引起的II型糖尿病的治疗提供可行方法，可能为淀粉样蛋白相关疾病相关先导化合物的发现提供思路与参考标准。
背景技术
II型糖尿病是一种退行性疾病，主要与胰岛细胞大量死亡和胰岛素抵抗有关。在II型糖尿病患者的胰岛组织上发现有淀粉样沉淀，人胰淀素蛋白（hIAPP）为沉淀的重要组成部分[1]。人胰淀素蛋白从可溶状态向具有生理毒性的寡聚体、纤维的转变，是II型糖尿病发生发展的重要环节[2-4]。所以开发新药物，实现对胰淀素蛋白聚集过程的调控，降低胰淀素蛋白对胰岛细胞的毒性，是具有重要意义的[5]我。
在药物设计和开发研究中，发现和筛选对靶标蛋白具有特异性识别结合能力的先导化合物是极其重要的。目前，对淀粉样蛋白分子的聚集过程可以进行特异性地抑制或促进的药物分子，按种类可分为有机小分子与多肽分子两大类[6]。
有机小分子类先导化合物的设计思路是以已报道的具有调节多肽聚集动力学能力的分子（如刚果红），或对多肽分子具有强亲和性的分子（如硫磺素T）等作为母核，利用合成化学和组合化学方法对药物分子进行改造和筛选[6]。但是，由于靶标蛋白的空间结构并不清晰[7]，难以研究药物分子与多肽分子之间的相互作用机制，所以预测具有药效的有机小分子结构存在着很大的困难。
多肽类先导化合物的设计思路是筛选具有调节靶标蛋白聚集动力学过程的蛋白片段，如阻止hIAPP蛋白聚集的SNNFGA片段，并结合组合化学改造分子结构[8]。但是由于特异性识别hIAPP蛋白的多肽分子有限，大大限制了以hIAPP为靶标蛋白的多肽药物的设计、优化和筛选。因而，需要发现、发展新型的多肽类分子作为淀粉样蛋白生理毒性的抑制剂，实现从体外实验的调控淀粉样蛋白聚集动力学，调控体外毒性，到治疗hIAPP等淀粉样蛋白沉积导致疾病的最终目的。
发明内容
因此，本发明的目的是针对目前特异性识别hIAPP蛋白的多肽分子有限，大大限制了以hIAPP为靶标蛋白的多肽药物的设计、优化和筛选的不足，提供一种抑制人胰淀素聚集或毒性的多肽及其制备方法和应用，该多肽通过调控hIAPP的聚集，从而实现对hIAPP蛋白生理毒性的抑制。
除非特别指明，本发明中的“人胰淀素蛋白”均指“人胰淀素”，其序列为：KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY(C2-C7之间为二硫键)（SEQIDNO:4）。
针对上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一方面，本发明提供一种抑制人胰淀素聚集或毒性的多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。
优选地，所述人胰淀素的氨基酸序列为SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供一种上述本发明所述的抑制人胰淀素聚集或毒性的多肽的制备方法，该方法包括采用固相多肽合成法合成所述多肽。
还一方面，本发明提供一种抑制人胰淀素聚集或毒性的试剂，所述试剂包括上述本发明所述的多肽和辅料。
优选地，所述辅料体可选自六氟异丙醇、二甲基亚砜（DMSO）、硫磺素T（ThT）、磷酸盐缓冲液（PBS,pH值为7.4）、乙腈、磷钨酸、RPMI-1640培养基和噻唑蓝(MTT)中的一种或多种。
再一方面，本发明提供一种上述本发明所述的多肽在制备用于抑制人胰淀素聚集或毒性的药物中的应用。
又一方面，本发明提供一种上述本发明所述的试剂在制备用于抑制人胰淀素聚集或毒性的药物中的应用。
还一方面，本发明提供一种上述本发明所述的多肽在制备用于治疗人胰淀素相关疾病的药物中的应用。
优选地，所述人胰淀素相关疾病为II型糖尿病。
优选地，所述药物中所述多肽的有效浓度为0.01μg/ml~100μg/ml。
优选地，所述药物中所述多肽的有效浓度为1μg/ml。
另一方面，本发明提供一种上述本发明所述的试剂在制备用于治疗人胰淀素相关疾病的药物中的应用。
优选地，所述人胰淀素相关疾病为II型糖尿病。
优选地，所述药物中所述多肽的有效浓度为0.01μg/ml~100μg/ml。
优选地，所述药物中所述多肽的有效浓度为1μg/ml。
本发明还提供一种抑制抑制人胰淀素聚集或毒性的方法，所述方法包括以下步骤：
1）设计具有调节功能的多肽：HI37-1(VLFESS)，HI37-2(QTAEAL)和HI37-3(EALNVLFE)。
2）通过硫磺素T（ThT）荧光光谱观测溶液环境下HI37-1，HI37-2和HI37-3多肽序列对hIAPP向β折叠结构转变动力学过程的影响。HI37-1，HI37-2和HI37-3多肽序列均可以大大降低hIAPP向β折叠结构进行转变的速度，并大大降低聚集平衡状态时的β折叠结构的有效含量。
3）通过静态光散射观测溶液环境下HI37-1，HI37-2和HI37-3多肽序列对hIAPP聚集过程的影响。HI37-1，HI37-2和HI37-3多肽序列均可以加快hIAPP聚集的动力学过程。
4）通过圆二色谱观测溶液环境下HI37-1，HI37-2和HI37-3多肽序列对hIAPP二级结构的影响。hIAPP在溶液中以β折叠结构和无规卷曲结构为主，HI37-1，HI37-2，HI37-3多肽序列均可以改变hIAPP溶液环境中的二级结构，使得β折叠结构的含量大大降低，甚至消失。
5）以原子力显微技术观测HI37-1，HI37-2和HI37-3多肽对hIAPP聚集体形貌的影响。
6）以透射电子显微技术观测HI37-1，HI37-2和HI37-3多肽对hIAPP聚集状态的影响。
7）以胰岛细胞系INS-1评价HI37-1，HI37-2和HI37-3多肽对hIAPP细胞毒性的抑制。发现HI37-1，HI37-2和HI37-3均可以大大降低hIAPPINS-1细胞的毒性。
综上所述，本发明的目的在于发现与目标蛋白人胰淀素结合的多肽序列，对于抑制人胰淀素生理毒性的药物设计具有非常重要的意义。本发明的一个实施方案是测定设计多肽与靶标人胰淀素之间的识别作用，以及对人胰淀素聚集状态的调控，以及设计多肽对人胰淀素生理毒性的抑制作用。包括如下步骤：
1）通过ThT荧光光谱观测溶液环境下HI37-1、HI37-2和HI37-3多肽序列对hIAPP向β折叠结构转变动力学的影响。
2）通过静态光散射观测溶液环境下HI37-1、HI37-2和HI37-3多肽序列对hIAPP聚集过程的影响。
3）通过圆二色谱观测溶液环境下HI37-1、HI37-2和HI37-3多肽序列对hIAPP二级结构的影响。
4）以原子力显微技术观测HI37-1、HI37-2和HI37-3多肽对hIAPP聚集体形貌的影响。
5）以透射电子显微技术观测HI37-1、HI37-2和HI37-3多肽对hIAPP聚集状态的影响。
6）以胰岛细胞系INS-1评价HI37-1、HI37-2和HI37-3多肽对hIAPP细胞毒性的抑制。
本发明通过大量的试验，根据人胰淀素的反平行β发卡结构特征，具体地，其1-7氨基酸为无规卷曲结构，8-19构成β发卡结构的第一个核心区域，可能的转角位置在第20位丝氨酸处，试图通过干扰第一个核心区域及转角，影响人胰淀素的整体结构和功能，特此，设计了三个多肽序列，并通过试验验证，惊奇地发现他们能够与目标淀粉样蛋白分子特异结合，实现对人胰淀素组装结构的调控，从而抑制了目标蛋白的生理毒性，对于抑制人胰淀素生理毒性的药物设计具有非常重要的意义，从而能够用于治疗II型糖尿病。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1表明本发明所述的多肽通过结合人胰淀素（hIAPP），抑制其聚集的示意图；
图2表明本发明所述的HI37-1多肽调节hIAPP聚集过程的ThT染色实验；
图3表明本发明所述的HI37-1多肽调节hIAPP聚集过程的静态光散射实验；
图4表明CD的β折叠结构标准曲线，图中，(○)表示α-螺旋；(●)表示β-折叠；(Δ)表示β-转角；表示P2(0.1mol/L醋酸溶液中的聚-L-脯氨酸)；
图5表明本发明所述的HI37-1多肽调节hIAPP二级结构的圆二色谱；
图6表明本发明所述的HI37-1对hIAPP形貌的调节作用，其中，（a）为hIAPP纤维的原子力显微镜成像；（b）为HI37-1的原子力显微镜成像；（c）为HI37-1与hIAPP混合体系的原子力显微镜成像；（d）为hIAPP纤维的透射电子显微镜成像；（e）为HI37-1的透射电子显微镜成像；（f）为HI37-1与hIAPP混合体系的透射电子显微镜成像；
图7表明HI37-1对hIAPP细胞毒性的抑制作用，其中，图7a为hIAPP对Ins-1细胞活力的影响；图7b为HI37-1对Ins-1细胞活力的影响；图7c为HI37-1对32μM的hIAPP细胞毒性的抑制作用；
图8表明HI37-2多肽调节hIAPP聚集过程的ThT染色实验；
图9表明HI37-2多肽调节hIAPP聚集过程的静态光散射实验；
图10表明HI37-2多肽调节hIAPP二级结构的圆二色谱；
图11表明HI37-2对hIAPP形貌的调节作用，其中，（a）为HI37-2的原子力显微镜成像；（b）为HI37-2与hIAPP混合体系的原子力显微镜成像；（c）为HI37-2的透射电子显微镜成像；（d）为HI37-2与hIAPP混合体系的透射电子显微镜成像；
图12表明HI37-2对hIAPP细胞毒性的抑制作用，其中，图12a为HI37-2对INS-1细胞活力的影响；图12b为HI37-2对32μM的hIAPP细胞毒性的抑制作用；
图13表明HI37-3多肽调节hIAPP聚集过程的ThT染色实验；
图14表明HI37-3多肽调节hIAPP聚集过程的静态光散射实验；
图15表明HI37-3多肽调节hIAPP二级结构的圆二色谱；
图16表明HI37-3对hIAPP形貌的调节作用，其中，（a）HI37-3的原子力显微镜成像；（b）HI37-3与hIAPP混合体系的原子力显微镜成像；（c）HI37-3的透射电子显微镜成像；（d）HI37-3与hIAPP混合体系的透射电子显微镜成像；
图17表明HI37-3对hIAPP细胞毒性的抑制作用，其中，图17a为HI37-3对Ins-1细胞活力的影响；图17b为HI37-3对32μM的hIAPP细胞毒性的抑制作用。
具体实施方式
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯试剂，且可从正规渠道商购获得。
除非特别指明，以下实施例中所用的大鼠胰岛细胞瘤细胞INS-1细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。
除非特别指明，以下实施例中所用的人胰淀素（humanIAPP）购自北京博奥森生物技术有限公司。
除非特别指明，以下实施例中所用的多肽（HI37-1，HI37-2和HI37-3）由上海科肽生物科技有限公司采用固相多肽合成，其制备纯度>98%。
除非特别指明，以下实施中所用的二次水即二次蒸馏水，水质参数1.0MΩ.cm25℃，三次水即超纯水，水质参数电阻率18.2MΩ.cm25℃。
实施例1hI37-1调节人胰淀素的作用
1、所使用物质的化学结构
人胰淀素（humanIAPP）：
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY(C2-C7之间为二硫键)。
多肽：HI37-1:NH2-VLFESS-COOH（SEQIDNO:1）。
2、测定方法
2.1ThT染色检测所述多肽对人胰淀素聚集能力的调节作用
配制1×PBS溶液：称取0.4gNaCl，0.01gKCl，182mgNa2HPO4·12H2O，12mgKH2PO4，0.01gNaN3，使用50ml二次水溶解，用0.22μm水相滤膜过滤，待用。
配制ThT储液：称取15.9mgThT，14.36gNa2HPO4·12H2O，1.36gKH2PO4，量取100ml二次水使其溶解，超声5分钟使充分溶解。
配制10μM的ThT测试液：量取2mlThT储液，718mgNa2HPO4·12H2O，68mgKH2PO4，使用二次水定溶至100ml，再用0.22μm水相滤膜过滤，待用。
人胰淀素分散方法：现将人胰淀素蛋白固体粉末1mg，在玻璃瓶中，溶于1ml六氟异丙醇中，超声5分钟，待充分溶解后，将玻璃瓶放在摇床上，120rpm摇动匀质作用下，保持12小时。再将人胰淀素蛋白的六氟异丙醇溶液按每瓶100μl浓度为1mg/ml分装在玻璃瓶中，用氮气将六氟异丙醇溶剂吹干，将含有人胰淀素蛋白的玻璃瓶置于冷冻干燥机中抽真空冻干45分钟。此时每瓶中含有0.1mg已分散的人胰淀素蛋白。
多肽处理方法：HI37-1取1mg，使用49.0μlDMSO溶解，超声5分钟使溶解完全。
人胰淀素-多肽混合溶液配制方法：向含有已分散的0.1mg人胰淀素蛋白的玻璃瓶中加入2μlDMSO，超声5分钟，使人胰淀素蛋白溶解完全。向每瓶分子中加入8.5μl多肽HI37-1的DMSO溶液。再向每瓶中各加842.5μl1×PBS溶液，然后向每瓶中各加一颗直径为400-600μm的玻璃球（SigmaAldrich）。此时，溶液中的人胰淀素蛋白和多肽HI37-1的浓度均为30μM。将玻璃瓶置于120rpm，37℃恒温的摇床中，保持24小时。将851μl1×PBS加入2μlDMSO的混合溶液作为背底。将含0.1mg人胰淀素蛋白的2μlDMSO加851μl1×PBS的混合溶液作为对照组Ⅰ，即图2中的hIAPP。将8.5μl所述经过处理的多肽，加2μlDMSO，加851μl1×PBS作为对照组Ⅱ，即图2中的HI137-1。
从样品配制完成的时刻开始计时，每隔3小时，从测试溶液中取出20μl样品溶液，与180μl浓度为10μM的ThT测试液混合，加到黑色的低吸附量96孔板（Corning）中。在连续光谱多功能酶标仪（TecaninfiniteM200）中，以450nm作为激发波长，收集482nm的发射光信号，增益值为100，并且在处理试验结果的过程中，扣除了背底。
结果如图2所示，人胰淀素蛋白在溶液中向β折叠转变，在第9小时转变完全。HI37-1多肽在溶液中不能引起ThT的荧光增强，即不会发生向β折叠结构的转变。向人胰淀素蛋白中加入HI37-1后，其ThT荧光增强强度降低，即HI37-1可以阻止人胰淀素蛋白向β折叠结构的转变。ThT染色实验反映了多肽的以β折叠结构为主的淀粉样聚集过程随时间的变化。
2.2静态光散射检测所述多肽对人胰淀素聚集能力的调节作用
配制1×PBS溶液：同2.1所述。
人胰淀素分散方法：同2.1所述。
多肽处理方法：同2.1所述。
人胰淀素-多肽混合溶液配制方法：同2.1所述。
从样品配制完成的时刻开始计时，每隔3小时，从测试溶液中取出400μl样品溶液，加到1cm×1cm的石英比色皿中。在荧光分光光度计（SL55）中，以405nm作为激发波长，收集405nm的发射光信号。狭缝宽为1.0nm，1.0nm。
静态光散射实验反映了溶液中的多肽随时间可溶颗粒的聚集尺寸的变化。如图3所示，人胰淀素蛋白在溶液中的静态光散射强度随时间会逐渐增强，在第12小时，到达聚集平衡态。HI37-1多肽在溶液中会迅速到达溶解-聚集平衡态。向人胰淀素蛋白中加入HI37-1后，可迅速完成聚集，其静态光散射强度明显强于单纯的人胰淀素溶液。故HI37-1可以改变人胰淀素蛋白聚集的动力学特征。
2.3圆二色谱检测所述多肽对人胰淀素二级结构的影响
人胰淀素分散方法：同2.1所述。
多肽处理方法：HI37-1取1mg，置于玻璃瓶中。每瓶加1ml六氟异丙醇，超声5分钟，待充分溶解后，将玻璃瓶放在摇床上，恒温为37，℃120rpm摇动匀质。用氮气将六氟异丙醇溶剂吹干，将含有所述多肽的玻璃瓶至于冷冻干燥机中抽真空冻干45分钟。使用49.0μl乙腈将多肽溶解，超声5分钟使溶解完全。
人胰淀素-多肽混合溶液配制方法：向含有已分散的0.1mg人胰淀素蛋白的玻璃瓶中加入2μl乙腈，超声5分钟，使人胰淀素蛋白溶解完全。向其中加入8.5μl多肽HI37-1的乙腈溶液。向每瓶中各加842.5μl三次水溶液。向每瓶中各加一颗直径为400-600μm的玻璃球（SigmaAldrich）。此时，溶液中的人胰淀素蛋白和多肽HI37-1的浓度均为30μM。将玻璃瓶置于摇床中，恒定温度为37，℃120rpm摇动匀质保持72小时。以含0.1mg人胰淀素的2μl乙腈加851μl三次水的混合溶液作为参考组I，即图5中的hIAPP。以8.5μl所述经过处理的多肽，加2μl乙腈，加851μl三次水作为参考组Ⅱ，作为背底。
72小时老化之后，从测试溶液中取出800μl样品溶液，加到1cm×1cm的石英比色皿中。在圆二色光谱仪（J-810）中，测量190nm-260nm的圆二色光谱，狭缝宽为1.0nm，5.0nm。
结果如图5所示，人胰淀素蛋白经72小时后，β折叠结构（217nm处负峰）和无规卷曲结构（202nm处负峰）为其主要空间构象（图5中的（b））。加入HI37-1多肽后，人胰淀素与HI37-1的混合体系变为以无规卷曲结构为主（以HI37-1自身的CD吸收为背底，已经扣除背底，图5中的（a））。即HI37-1可以抑制人胰淀素向β折叠结构的转变。
2.4原子力显微技术检测所述多肽对人胰淀素聚集形貌的影响
人胰淀素分散方法：同2.1所述。
多肽处理方法：同2.1所述。
人胰淀素-多肽混合溶液配制方法：向含有已分散的0.1mg人胰淀素蛋白的玻璃瓶中加入2μlDMSO，超声5分钟，使人胰淀素蛋白溶解完全。加入8.5μl多肽HI37-1的DMSO溶液。向每瓶中各加842.5μl三次水溶液。向每瓶中各加一颗直径为400-600μm的玻璃球（SigmaAldrich）。此时，溶液中的人胰淀素蛋白和多肽HI37-1的浓度均为30μM。将玻璃瓶置于120rpm，37℃的恒温摇床中，保持24小时。以含0.1mg人胰淀素的2μlDMSO加851μl三次水的混合溶液作为参考组Ⅰ，即图6中的hIAPP。以8.5μl所述经过处理的多肽，加2μlDMSO，加851μl三次水作为参考组Ⅱ，即图6中的HI37-2。
24小时老化之后，从测试液中取10μl样品溶液，滴在新解理的云母表面，静置10分钟，再用高纯氮气吹干。
利用扫描探针显微镜（Dimension3100，BrukerNano，美国），原子力探针轻敲模式，对测试样品在云母表面的形貌进行成像。图6中的（a）所示，人胰淀素蛋白会自组装成为纤维状结构。图6中的（b）所示，HI37-1能在云母表面中形成粗壮的纤维状结构。图6中的（c）所示，HI37-1能抑制人胰淀素蛋白的纤维状组装行为，二者的混合体系可以在云母表面形成膜状或颗粒状结构。
2.5透射电子显微技术检测所述多肽对人胰淀素聚集过程的影响
人胰淀素分散方法：同2.1所述。
多肽处理方法：同2.1所述。
人胰淀素-多肽混合溶液配制方法：同2.4所述。
24小时老化之后，从测试液中取50μl样品溶液，滴在超薄镀碳铜网表面，静置20分钟，将剩余液体吸走。在沉积样品的铜网表面滴20μl的1mg/ml磷钨酸铵水溶液，沉积10分钟，将剩余液体吸走。用三次水清洗铜网三次。在干燥器中干燥过夜。利用200kV六硼化镧透射电子显微镜（TecnaiG220S-TWIN）成像，成像时加速电压200kV。图6中的（d）所示，人胰淀素蛋白会自组装成为纤维状结构。图6中的（e）所示，HI37-1在溶液中为无规膜状结构。图6中的（f）所示，HI37-1能抑制人胰淀素蛋白的纤维化趋势，形成膜状结构。
2.6所述多肽对人胰淀素细胞毒性的影响
人胰淀素分散方法：同2.1所述。
多肽处理方法：同2.1所述。
以胰岛细胞INS-1细胞系作为研究模型。在96孔细胞培养板（Corning）中，每孔培养1万个细胞，使用RPMI-1640培养基（含10%北美小牛血清，1%青链霉素）。在种入细胞后24小时，向培养板中加入人胰淀素蛋白及所述多肽孵育。在孵育后的第24小时，向培养板中每孔加入10μl的5mg/ml噻唑蓝（MTT）生理盐水溶液。在37°C反应4小时。将培养板中的溶液吸走，每孔用100μl的DMSO溶解MTT产生的甲瓒沉淀。在连续光谱多功能酶标仪（TecaninfiniteM200）中，测定其在490nm处的吸光度值。
如图7a所示，人胰淀素蛋白对INS-1细胞系具有显著的细胞毒性。对于10000个INS-1细胞，其人胰淀素的半数致死量为32μM。如图7b所示，当HI37-1的浓度小于1μg/ml时，细胞存活率均大于90%。如图7c所示，将人胰淀素与HI37-1共孵育INS-1细胞，可以显著提高细胞的存活率。当HI37-1的浓度为0.01μg/ml至100μg/ml时（人胰淀素浓度为32μM），细胞的存活率可大于67%。当HI37-1的浓度为1μg/ml时，细胞存活率为75%。即HI37-1多肽可以有效抑制人胰淀素蛋白的细胞毒性。
实施例2HI37-2对人胰淀素的调节作用
1、所使用物质的化学结构
人胰淀素（humanIAPP）：
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY(C2-C7之间为二硫键)
多肽：HI37-2:NH2-QTAEAL-COOH（SEQIDNO:2）
2、测定方法与实施例1相同
结果表明，HI37-2可以阻止人胰淀素蛋白向β折叠结构的转变。如图8所示，人胰淀素蛋白在溶液中自发地由无规卷曲结构向β折叠转变，在第9小时转变完全。HI37-2多肽在溶液不会发生向β折叠结构的转变。向人胰淀素蛋白中加入HI37-2后，其ThT荧光增强强度降低。
结果表明，HI37-2可以改变人胰淀素蛋白聚集的动力学特征。如图9所示，人胰淀素蛋白在溶液中的静态光散射强度随时间会逐渐增强，在第12小时，达到聚集-解离平衡态。HI37-2多肽在溶液中不发生聚集，故其静态光散射强度始终较低。向人胰淀素蛋白中加入HI37-2后，可迅速达到聚集的平衡状态。
结果表明，HI37-2可以抑制人胰淀素蛋白向β折叠结构的转变。图10所示，人胰淀素蛋白经72小时后，β折叠结构（217nm处负峰）和无规卷曲结构（202nm处负峰）为其主要空间构象（图10中的（b））。加入HI37-2多肽后，202nm处和217nm处负峰峰值均发生降低（以HI37-2自身的CD吸收为背景，图10中的（a））。
经原子力显微技术成像，如图11中的（a）所示，HI37-2为无规的颗粒状或膜状结构。图11中的（b）所示，HI37-2能抑制人胰淀素蛋白的纤维状组装行为，形成较细的纤维和形状不规则的颗粒共存的聚集体。
透射电子显微技术成像也同样证明，图11中的（c）所示，HI37-2在溶液中为无规膜状结构。图11中的（d）所示，HI37-2能抑制人胰淀素蛋白的纤维化趋势，形成膜状或颗粒状结构。
结果表明，HI37-2多肽可以有效抑制人胰淀素蛋白的细胞毒性。如图12a所示，HI37-2的浓度从0.01μg/ml到100μg/ml区间，细胞存活率均大于90%。如图12b所示，将人胰淀素与HI37-2共孵育INS-1细胞，可以显著提高细胞的存活率。当HI37-2的浓度为0.01μg/ml至100μg/ml时（人胰淀素浓度为32μM），细胞的存活率可大于70%。当HI37-2的浓度为100μg/ml时，细胞存活率为79%。
实施例3HI37-3对人胰淀素的调节作用
1、所使用物质的化学结构
人胰淀素（humanIAPP）：
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY(C2-C7之间为二硫键)
多肽：HI37-3:NH2-EALNVLFE-COOH（SEQIDNO:3）。
2、测定方法与实施例1相同。
结果表明，HI37-3可以阻止人胰淀素蛋白向β折叠结构的转变。如图13所示，人胰淀素蛋白在溶液中自发地由无规卷曲结构向β折叠转变，在第9小时转变完全。HI37-3多肽在溶液不会发生向β折叠结构的转变。向人胰淀素蛋白中加入HI37-3后，其ThT荧光增强强度降低。
结果表明，HI37-3可以改变人胰淀素蛋白聚集的动力学特征。如图14所示，人胰淀素蛋白在溶液中的静态光散射强度随时间会逐渐增强，在第12小时，形成了稳定的较大尺寸的聚集颗粒。HI37-3多肽在溶液中不发生聚集，故其静态光散射强度始终较低。向人胰淀素蛋白中加入HI37-3后，可迅速形成具有较大尺寸的可溶性聚集结构。
结果表明，HI37-3可以抑制人胰淀素向β折叠结构的转变。图14所示，人胰淀素蛋白经72小时后，β折叠结构（217nm处负峰）和无规卷曲结构（202nm处负峰）为其主要空间构象（图15中的（b））。加入HI37-3多肽后，217nm处负峰消失，即混合体系以无规卷曲为主要结构（以HI37-3自身的CD吸收为背景，图15中的（a））。
经原子力显微技术成像，如图16中的（a）所示，HI37-3为无规的颗粒状或膜状结构。图16中的（b）所示，HI37-3能抑制人胰淀素蛋白的纤维化趋势，形成与人胰淀素的缠绕长纤维组装结构相比，较为粗短的棒状或者短纤维状组装结构。
透射电子显微技术成像也同样证明，图16中的（c）所示，HI37-3在溶液中为无规膜状结构。图16中的（d）所示，HI37-3能抑制人胰淀素蛋白的纤维化，形成较为粗短的棒状或者短纤维状结构。
结果表明，HI37-3多肽可以有效抑制人胰淀素蛋白的细胞毒性。如图17a所示，HI37-3的浓度从0.01μg/ml到100μg/ml区间，细胞存活率均大于90%。如图17b所示，将人胰淀素与HI37-3共孵育INS-1细胞，可以显著提高细胞的存活率。当HI37-3的浓度为0.01μg/ml至100μg/ml时（人胰淀素浓度为32μM），细胞的存活率可大于68%。当HI37-3的浓度为1μg/ml时，细胞存活率为82%。
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Claims (10)
1.一种抑制人胰淀素聚集或毒性的多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抑制人胰淀素聚集或毒性的多肽，其特征在于，所述人胰淀素的氨基酸序列为SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的抑制人胰淀素聚集或毒性的多肽的制备方法，该方法包括采用固相多肽合成法合成所述抑制人胰淀素聚集或毒性的多肽。
4.一种抑制人胰淀素聚集或毒性的试剂，所述试剂包括权利要求1或2所述的多肽和辅料。
5.据权利要求1或2所述的多肽在制备用于抑制人胰淀素聚集或毒性的药物中的应用。
6.根据权利要求4所述的试剂在制备用于抑制人胰淀素聚集或毒性的药物中的应用。
7.根据权利要求1或2所述的多肽或权利要求4所述的试剂在制备用于治疗人胰淀素相关疾病的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述人胰淀素相关疾病为II型糖尿病。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物中所述多肽的有效浓度为0.01μg/ml～100μg/ml。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物中所述多肽的有效浓度为1μg/ml。
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