CN106800590B - 一种结合多种淀粉样蛋白单体和聚集体的多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种结合多种淀粉样蛋白单体和聚集体的多肽，其特征在于，所述的多肽包含(a)和/或(b)所示的氨基酸序列：(a)所述氨基酸序列的通式为：Ser‑X1‑Phe‑X2‑Asn‑Lys‑Arg，其中，X1和X2独立的为20种氨基酸中的任意一种；(b)或具有所述多肽功能的对所示的氨基酸序列的通式(a)进行一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加修饰的变体。本发明多肽分子量小，可特异性结合Aβ42、amylin、胰岛素和溶菌酶的寡聚体及Aβ42和amylin的单体和纤维，抑制Aβ42和溶菌酶的聚集，并抑制Aβ42、amylin、胰岛素和溶菌酶的细胞毒性，保护神经细胞免受Aβ42毒性的影响，且本发明多肽在AD、PD、HD和T2DM等淀粉样蛋白疾病的预防和治疗方面具有广泛的应用前景。

Description

一种结合多种淀粉样蛋白单体和聚集体的多肽及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种多肽，尤其涉及一种结合多种淀粉样蛋白单体和聚集体的多肽及其应用。
背景技术
淀粉样蛋白疾病是由淀粉样蛋白聚集引起的二十多种疾病的总称，它包括阿尔茨海默病(俗称老年性痴呆)(Alzheimer’disease,AD)、帕金森病(Parkinson’disease,PD)、舞蹈病(Huntington’s disease，HD)等。不同淀粉样蛋白疾病发生病变的部位有所不同，主要涉及神经系统、心脏、肝脏、肾脏等。某些蛋白质单体本身无毒性或毒性很小，但它们可聚集成具有毒性作用的寡聚物(oligomer)或纤维状物(fibril)而引起一系列疾病，如β-amyloid(Aβ)可引起AD，α-synuclein可引起PD，朊病毒蛋白(Prion protein PrP)可引起包括疯牛病在内的人和动物的至少十余种脑病，含有多聚谷氨酰胺(PolyQ)的多肽可引起包括HD在内的至少9种遗传性神经退行性疾病，胰岛淀粉样多肽(islet amyloidpolypeptide，IAPP,amylin)可引起II型糖尿病及长时间透析导致的溶菌酶(lysozyme)聚集沉积所引起的疾病等。其中，对人类健康危害最大的为AD、PD及II型糖尿病。医学统计表明，我国和欧美国家中65岁以上老年人中5～6％患有AD，并且发病率逐年上升。该病已被列为导致死亡的第四大疾病，仅次于心脏病、癌症和中风。另有约1％的65岁以上老年人患有PD。而患有II型糖尿病的人数可达总人口的5％以上。这些疾病对人类的健康造成了很大危害，其发病的根本原因(或部分原因)在于某些蛋白质自身的聚集。
研究表明，不同蛋白质的聚集最先始于错误折叠或变性的蛋白质单体，单体多肽链间氢键的形成导致了蛋白分子的聚合。首先形成由电子或原子力显微镜可观察到的大小约为3-10nm的可溶性球形寡聚物，某些寡聚物进一步可聚集成弯曲柔韧的丝状物(protofibril)，进而形成直径为6-10nm的表面光滑或呈螺旋状的纤维。非同源性的蛋白质最终可形成具有相似结构的蛋白聚合物。由Aβ、α-synuclein、PrP、IAPP、胰岛素和溶菌酶等各种各样的蛋白聚集形成的纤维都含有“cross-Beta”结构，其中β片层构成的骨架与纤维纵轴垂直，而骨架中的氢键网与纵轴平行。多肽在β片层中排列为平行的β链，在β片层中，氨基酸都有精确的位置。不同来源的寡聚物也具有相似的结构特征，寡聚物特异性识别抗体可以与由不同来源的蛋白质单体形成的寡聚物结合，而不与它们的单体和纤维结合。这表明淀粉样蛋白多肽骨架可形成独立于其氨基酸一级序列之外的共同的寡聚物特有的抗原表位。Glabe实验室应用连接有Aβ40的金胶颗粒模拟Aβ40寡聚物制备出了不仅可与Aβ40和Aβ42寡聚物结合，并且还可与α-synuclein、IAPP、PolyQ、PrP、胰岛素、溶菌酶等形成的寡聚物结合的多克隆抗体(A11)，该抗体还能够有效地抑制所有这些寡聚物的细胞毒性。
过去人们一直认为淀粉样蛋白疾病的发生是由蛋白质聚集成的不溶性的纤维状物引起的。近年来大量的研究表明，引起致病的关键因素是体积较小的水溶性的寡聚物。由蛋白寡聚物引起的退行性疾病存在着相似的机理，即细胞膜损伤、氧化应激、线粒体功能失调、信号传递异常、细胞死亡等。寡聚物形成的机理及怎样才能有效地抑制其细胞毒性等都是人们亟待探讨和解决的问题。对于Aβ来说，它可以形成不同的寡聚体形式，如纤维性寡聚体(FO)、前纤维性寡聚体(PFO)。前者可以进一步聚集形成纤维，而后者则不可。FO和PFO可分别被构象依赖性抗体OC和A11识别。Aβ还可以形成另外的寡聚体形式，如可被单链抗体W20识别而不被OC和A11识别的寡聚体。研究发现，这3类抗体不仅与Aβ结合，还可以与α-synuclein、amylin、胰岛素、溶菌酶等淀粉样蛋白的寡聚体结合，表明多种淀粉样蛋白寡聚体可形成独立于蛋白以及序列以外的相同结构。同样地，各淀粉样蛋白聚集形成的纤维也可形成共同的空间结构，并与同一抗体相结合。但是，各淀粉样蛋白单体、寡聚体及纤维之间是否存在有相同的与蛋白一级序列无关的结构尚未见报道。
AD是由Aβ聚集引起的老年人以记忆力渐进性丧失、脑内形成老年斑为特征的神经退行性疾病。Aβ寡聚体可以富集在神经突触，引起突触退化、胰岛素抵抗及tau蛋白的过度磷酸化。基于Aβ及其它淀粉样蛋白致病的机理，对淀粉样蛋白疾病治疗的策略一般为：抑制淀粉样蛋白的产生、聚集或细胞毒性，加快淀粉样蛋白的清除。在淀粉样蛋白导致疾病的发生发展中还与其引起的氧化应激、一氧化氮产生、炎症因子的形成有关。
因此，成功的淀粉样蛋白疾病治疗药物应该是多功能的。多肽类药物近十多年来一直受到医药界的广泛关注，它具有免疫原性低、毒性低、并可以较容易地以生物技术方法增进其特异性、稳定性和穿透性等特点。CN 104277105A公开了一种抑制β淀粉样蛋白聚集和毒性的多肽或其具有所述多肽功能的变体。本发明的多肽与Aβ蛋白存在强结合力，可以大大降低Aβ达到聚集平衡状态时β折叠结构的有效含量，改变Aβ在溶液环境中的二级结构，使得β折叠结构的含量大大降低甚至消失，并在极低的浓度下就可以明显降低Aβ对SH-SY5Y细胞的毒性并能够大大抑制Aβ诱导的活性氧的产生，从而为β淀粉样蛋白引起的阿尔兹海默症的治疗提供可行方法。该发明中的多肽只能特异性的识别和结合Aβ蛋白，结合淀粉样蛋白单体，抑制淀粉样蛋白聚集、细胞毒性和氧化应激及神经炎症等，但不能同时识别多种淀粉样蛋白单体、寡聚体和纤维。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多肽及其应用，特别是一种结合多种淀粉样蛋白单体和聚集体的多肽及其应用，该多肽不仅能与Aβ蛋白结合，还能与其他淀粉样蛋白包括amylin、胰岛素和溶菌酶等结合。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种结合多种淀粉样蛋白单体和聚集体的多肽，所述的多肽包含(a)和/或(b)所示的氨基酸序列：
(a)所述氨基酸序列的通式为：Ser-X1-Phe-X2-Asn-Lys-Arg，其中，X1和X2独立的为20种氨基酸中的任意一种；
(b)或具有所述多肽功能的对所示的氨基酸序列的通式(a)进行一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加修饰的变体。
本发明中，所述多肽分子量小，可特异性结合Aβ42、amylin、胰岛素和溶菌酶的寡聚体及Aβ42和amylin的单体和纤维，抑制Aβ42和溶菌酶的聚集，并抑制Aβ42、amylin、胰岛素和溶菌酶的细胞毒性，保护神经细胞免受Aβ42毒性的影响。
优选地，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1-2所示的氨基酸序列或具有所述多肽功能的对SEQ ID NO.1-2所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加修饰的变体。
优选地，所述变体的序列选自但不限于重点列举的SEQ ID NO.3-6。
氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.1：Ser-X1-Phe-X2-Asn-Lys-Arg；
SEQ ID NO.2：Ser-Phe-Phe-Asn-Asn-Lys-Arg；(ZR多肽)
SEQ ID NO.3：Ser-Phe-Phe-Asn-Lys-Arg；
SEQ ID NO.4：Ser-Ala-Phe-Gln-Asn-Lys-Arg；
SEQ ID NO.5：Ser-Phe-Phe-Asn-Asn-Asn-Lys-Arg；
SEQ ID NO.6：Ser-Phe-Phe-Asn-Asn-Lys-Arg-Lys。
第二方面，本发明提供一种DNA片段，其包含编码第一方面所述多肽的核苷酸序列。
第三方面，本发明提供一种重组载体，所述重组载体包含至少一个拷贝的如第二方面所述的DNA片段。
第四方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞包含第三方面所述的重组载体。
第五方面，本发明提供一种淀粉样蛋白细胞毒性抑制剂，所述抑制剂包含如第一方面所述的多肽、第二方面所述的DNA片段、第三方面所述的重组载体或第四方面所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述抑制剂在抑制Aβ、amylin、胰岛素和溶菌酶的细胞毒性上的应用。
优选地，所述细胞为SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞。
第六方面，本发明提供一种淀粉样蛋白聚集抑制剂，所述促进剂包含如第一方面所述的多肽、第二方面所述的DNA片段、第三方面所述的重组载体或第四方面所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述抑制剂在抑制Aβ和溶菌酶的聚集上的应用。
第七方面，本发明提供一种细胞清除Aβ促进剂，所述促进剂包含如第一方面所述的多肽、第二方面所述的DNA片段、第三方面所述的重组载体或第四方面所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述细胞为小胶质细胞，优选为BV-2细胞。
优选地，所述Aβ为Aβ42。
本发明中，所述Aβ促进剂能增加小胶质细胞对Aβ的吞噬作用。
第八方面，本发明提供一种药物组合物，包含如第一方面所述的多肽、第二方面所述的DNA片段、第三方面所述的重组载体或第四方面所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述药物组合物还包含药学上接受的辅料。
优选地，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述药物组合物在制备检测、诊断和/或治疗与淀粉样蛋白相关的疾病的药物中的应用。
优选地，所述疾病包括阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿舞蹈病(HD)或II型糖尿病(T2DM)中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所述多肽能提高AD转基因小鼠的空间记忆能力、减少小鼠脑内老年斑的数量和/或降低小鼠脑内Aβ40和Aβ42的水平和脑内的炎症反应；所述多肽能改善PD转基因小鼠的行为协调能力，降低PD转基因小鼠脑内的α-synuclein蛋白水平；所述多肽还能改善HD转基因小鼠的行为协调能力，降低HD转基因小鼠脑内的HTT蛋白水平。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明多肽分子量小，可特异性结合Aβ42、amylin、胰岛素和溶菌酶的寡聚体及Aβ42和amylin的单体和纤维，抑制Aβ42和溶菌酶的聚集，并抑制Aβ42、amylin、胰岛素和溶菌酶的细胞毒性，保护神经细胞免受Aβ42毒性的影响；
(2)本发明多肽在AD、PD、HD和T2DM等淀粉样蛋白疾病的预防和治疗方面具有广泛的应用前景，为AD、PD、HD和T2DM等淀粉样蛋白疾病的治疗诊断奠定了基础。
附图说明
图1为本发明ELISA检测ZR多肽与多种淀粉样蛋白结合图；
图2为本发明Dot-blot检测ZR多肽与多种淀粉样蛋白结合图，其中，图2(A)ZR多肽与各时间点的Aβ42结合图，图2(B)ZR多肽与各时间点的Aβ42结合的形态图，图2(C)ZR多肽与各时间点的amylin结合图，图2(D)ZR多肽与各时间点的amylin结合的形态图，图2(E)ZR多肽与各时间点的溶菌酶结合图，图2(F)ZR多肽与各时间点的溶菌酶结合图的形态图，图2(G)ZR多肽与各时间点的胰岛素结合图，图2(H)ZR多肽与各时间点的胰岛素结合的形态图；
图3为本发明ELISA检测ZR多肽衍生物与Aβ42寡聚体的结合，其中，图3(A)为序列1-8与Aβ42寡聚体结合的检测结果，图3(B)为序列1、9-12与Aβ42寡聚体结合的检测结果；
图4(A)为本发明ZR多肽抑制Aβ42的聚集的荧光密度图，图4(B)为本发明ZR多肽抑制amylin的聚集的荧光密度图，图4(C)为本发明ZR多肽抑制溶菌酶的聚集的荧光密度图，图4(D)为本发明ZR多肽抑制胰岛素的聚集的荧光密度图，图4(E)为本发明ZR多肽抑制Aβ42的聚集的扫描电镜形态图，图4(F)为本发明ZR多肽抑制amylin的聚集的扫描电镜形态图，图4(G)为本发明ZR多肽抑制溶菌酶的聚集的扫描电镜形态图，图4(H)为本发明ZR多肽抑制胰岛素的聚集的扫描电镜形态图；
图5(A)多肽ZR体外抑制Aβ42的细胞毒性，图5(B)多肽ZR体外抑制amylin的细胞毒性，图5(C)多肽ZR体外抑制溶菌酶的细胞毒性，图5(D)多肽ZR体外抑制胰岛素的细胞毒性；
图6为本发明多肽改善AD转基因小鼠的记忆能力，其中，图6(A)AD转基因小鼠到达平台的潜伏期，图6(B)探索实验中AD转基因小鼠到达平台的潜伏期，图6(C)AD转基因小鼠穿过平台的次数，图5(D)AD转基因小鼠在目标象限中所停留的时间；
图7为本发明多肽降低AD转基因小鼠脑内老年斑的数量，其中，图7(A)小鼠老年斑ThS染色情况，图7(B)小鼠老年斑所占切片面积比例，图7(C)小鼠老年斑所占切片面积数量，图7(D)小鼠老年斑6E10染色情况，图7(E)小鼠海马内老年斑面积，图7(F)小鼠皮层内老年斑面积，图7(G)小鼠海马内老年斑数量，图7(H)小鼠皮层内老年斑数量；
图8为本发明多肽降低AD转基因小鼠脑内Aβ40和Aβ42水平，其中，图8(A)AD转基因小鼠脑中不溶性Aβ40水平，图8(B)AD转基因小鼠脑中不溶性Aβ42水平，图8(C)AD转基因小鼠脑中可溶性Aβ40水平，图8(D)AD转基因小鼠脑中可溶性Aβ42水平；
图9为本发明多肽降低AD转基因小鼠脑内炎症反应，其中，图9(A)AD小鼠脑内的小胶质细胞染色情况，图9(B)AD小鼠脑内的星形细胞染色情况，图9(C)AD小鼠脑内的小胶质细胞占脑切片面积，图9(D)AD小鼠脑内的星形细胞占脑切片面积；
图10为本发明多肽促进小胶质细胞对Aβ的吞噬；
图11为本发明多肽改善PD转基因小鼠的行为协调能力，其中，图11(A)PD小鼠转头时间，图11(B)PD小鼠爬至笼内时间，图11(C)PD小鼠后肢紧抱程度；
图12为本发明多肽降低PD转基因小鼠脑内α-synuclein水平；
图13为本发明多肽改善HD转基因小鼠的行为协调能力，其中，图13(A)HD小鼠在转棒上的持续时间，图13(B)9次试验中HD小鼠在转棒上的持续时间的平均值；
图14为本发明多肽降低HD转基因小鼠脑内HTT水平。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的PBS缓冲液PH值为7.2的缓冲液，配方为：5.84g NaCl，4.72gNa2HPO4，2.64g NaH2PO4.2H20，用水配成1升，调pH为7.2。
下述实施例中的多肽及其衍生物由上海吉尔生化有限公司合成制备，用以实验的多肽SEQ ID NO.2(ZR多肽)及其衍生物纯度为大于或等于95％，ZR多肽及其衍生物保存于-20℃，避免反复冻融。
下述实施例中的所有实验数据除了水迷宫记忆实验外都是通过3次独立的实验获得的，实验数据表示为平均数加减标准差，数据的统计分析是应用One-way ANOVA软件进行，对于多组重复记忆力测定数据的比较分析则应用重复数据的Two-way ANOVA。
下述实施例中小鼠分为注射多肽ZR(AD+ZR)组、注射PBS组(AD con)、野生型(WT)组。
实施例1 ZR多肽及其衍生物的制备
根据淀粉样蛋白疾病的发病原理，治疗该类疾病的根本方法应是减少淀粉样蛋白的产生、抑制其聚集和细胞毒性或加快淀粉样蛋白的清除。应用噬菌体显示技术，以amylin寡聚体为筛选底物，将1×108种七肽进行了四轮淘选，应用噬菌体ELISA从中筛选出了多条可与amylin寡聚体明显结合的多肽，通过比对多条肽链与amylin、Aβ42、PrP、胰岛素、溶菌酶的结合特性以及对淀粉样蛋白聚集和细胞毒性的影响，最终筛选出多肽ZR。
ZR多肽(SEQ ID NO.2)的序列为：Ser-Phe-Phe-Asn-Asn-Lys-Arg。
ZR的衍生物为将ZR的氨基酸经置换、缺失或插入其它氨基酸得到的多肽，序列2-8为将序列1中的氨基酸依次置换为丙氨酸进行的丙氨酸扫描；序列9-12为将ZR的氨基酸置换、缺失或插入其它氨基酸得到的多肽具体如下：
序列1：Ser-Phe-Phe-Asn-Asn-Lys-Arg；
序列2：Ala-Phe-Phe-Asn-Asn-Lys-Arg；(对照组1)
序列3：Ser-Ala-Phe-Asn-Asn-Lys-Arg；
序列4：Ser-Phe-Ala-Asn-Asn-Lys-Arg；(对照组2)
序列5：Ser-Phe-Phe-Ala-Asn-Lys-Arg；
序列6：Ser-Phe-Phe-Asn-Ala-Lys-Arg；(对照组3)
序列7：Ser-Phe-Phe-Asn-Asn-Ala-Arg；(对照组4)
序列8：Ser-Phe-Phe-Asn-Asn-Lys-Ala；(对照组5)
序列9(ZR4-△N)：Ser-Phe-Phe-Asn-Lys-Arg；
序列10(ZR4-FN/AQ)：Ser-Ala-Phe-Gln-Asn-Lys-Arg；
序列11(ZR+N)：Ser-Phe-Phe-Asn-Asn-Asn-Lys-Arg；
序列12(ZR+K)：Ser-Phe-Phe-Asn-Asn-Lys-Arg-Lys。
实验例2ZR与多种淀粉样蛋白的特异性结合
将100μL Aβ42、PrP、amylin、胰岛素、溶菌酶单体、寡聚体和纤维分别包被96孔酶联免疫微孔板1μg/孔，BSA为阴性对照，置37℃2h，以3％BSA 37℃封闭2h，200μL/孔。以PBS洗板3次，加入带有组氨酸标签的ZR多肽溶液100μL，室温孵育1h后，用含有0.1％Tween-20的PBS洗涤三次。每孔加入100μL连接有HRP的识别组氨酸标签的抗体9E10，室温孵育1h后，用含有0.1％Tween-20的PBS洗涤3次。每孔加入底物溶液TMB 100μL，放置37℃20min，然后每孔加入50μL 1mmol/L硫酸终止反应，于酶联免疫检测仪上测定OD450值。在相同的条件下重复三次，结果见图1。
ZR与阴性对照BSA结合的OD450为0.06；ZR与Aβ42单体、寡聚体和纤维结合后的OD450分别为0.34、0.38、0.35；ZR与amylin单体、寡聚体和纤维结合后的OD450分别为0.41、0.50、0.18；ZR与溶菌酶单体、寡聚体和纤维结合后的OD450分别为0.11、0.18、0.08；ZR与胰岛素单体、寡聚体和纤维结合后的OD450分别为0.07、0.14、0.06；
图1表明ZR多肽可与Aβ42、amylin、胰岛素、溶菌酶等多种淀粉样蛋白的寡聚体结合，也可以与Aβ42和amylin的单体和纤维结合，但与胰岛素和溶菌酶的单体和纤维结合不明显。由于这些淀粉样蛋白氨基酸一级序列无任何同源性，因而，能够同时结合ZR多肽的各种形态的淀粉样蛋白应具有相似的结构特征。
为了进一步验证ZR多肽与各淀粉样蛋白结合的情况，将Aβ42、amylin、胰岛素、溶菌酶孵育一定时间后分别点到醋酸纤维膜1.8μg/点。室温干燥后，以8％milk 37℃封闭2h；加入带有组氨酸标签的ZR多肽溶液，室温孵育1h后，用含有0.1％Tween-20的PBS洗涤三次。加入鼠源抗组氨酸标签的抗体1:3000，37℃孵育2h；0.1％PBST洗膜3遍，每遍5min，加入联接HRP的羊抗鼠二抗1:5000，37℃孵育1h；0.1％PBST洗膜3遍，每遍10min。然后用ECL发光试剂盒检测膜上发光斑点，曝光3min，显影30s。以可与各淀粉样蛋白多种形态结合的抗体及只与淀粉样蛋白寡聚体结合的抗体W20为对照，以透射扫描电镜检测各时间点时淀粉样蛋白的形态结果如图2(A)-(H)所示。
图2(A)和图2(B)中可见ZR多肽可与各时间点的Aβ42结合，即与Aβ42单体、寡聚体和纤维结合。同样地，图2(C)和图2(D)中ZR多肽可与各时间点的amylin结合，即与amylin单体、寡聚体和纤维结合。但是，图2(E)和图2(F)中ZR只与24和36小时孵育形成的溶菌酶寡聚体结合，而不与其单体和纤维结合。相似地，图2(G)和图2(H)ZR只与9小时孵育形成的胰岛素寡聚体结合，而不与其单体和纤维结合。
实验例3 ZR的衍生物与Aβ42寡聚体的结合
分别将实施例1得到的序列1-12连接组氨酸标签，然后按实施例2中的ELISA实验方法检测与Aβ42寡聚体的结合特性，各多肽每孔加入1μg/孔，用ELISA方法测定OD450值，结果如图3(A)-(B)所示。
图3(A)看出ZR多肽序列中第2位的苯丙氨酸和第4位的天冬氨酸置换为丙氨酸后分别成为多肽序列3和5，此2种多肽与Aβ42寡聚体的结合相似于ZR与Aβ42寡聚体的结合，丙氨酸的置换对其结合特性影响不明显，OD450分别为0.48和0.57，表明第2位的苯丙氨酸和第4位的天冬氨酸对ZR多肽的结合活性起着较小的作用。当ZR中其它位置的氨基酸置换为丙氨酸后，其与Aβ42寡聚体的结合活性明显丧失。第1、3、5、6和7位氨基酸分别置换为丙氨酸后他们的OD450分别为0.22、0.15、0.18、0.14、0.14和0.13，表明ZR中的第1位的丝氨酸、第3位的苯丙氨酸、第5位的天冬酰胺、第6位的赖氨酸及第7位的精氨酸多ZR的结合活性起着重要的作用，Ser-X-Phe-X-Asn-Lys-Arg结构是ZR保持活性必须的基本框架结构。
图3(B)为ZR的衍生物序列ZR4-△N、ZR4-FN/AQ、ZR+N和ZR+K与Aβ42寡聚体结合的检测结果，它们与Aβ42寡聚体结合后的OD450分别为0.49、0.47、0.54和0.56。表明ZR某个氨基酸经置换、缺失或在多肽中增加氨基酸后仍保留与Aβ42结合的能力。
实验例4 ZR多肽体外抑制Aβ42和溶菌酶的聚集
1)将Aβ42、amylin以六氟异丙醇(HFIP)溶解至1mg/mL，室温超声波处理10min，分装到eppendorf管中，与真空中挥发HFIP，然后于-20℃保存。用前将HFIP处理过的各蛋白在室温放置20min，然后加入DMSO，使各蛋白浓度为5mg/mL，然后以0.02M pH 7.4的PBS缓冲液进行稀释至所需浓度。PrP、溶菌酶则直接用0.02M pH 7.4PBS制备到所需浓度。
2)将ZR多肽溶解于0.02M pH 7.4的PBS缓冲液中，然后加入到Aβ42、amylin、胰岛素、溶菌酶溶液中(溶菌酶为pH2.5的醋酸缓冲液，其余为pH7.4的PBS缓冲液)，使各蛋白的终浓度分别为10、20、100、1000μM。各蛋白与ZR多肽的摩尔比分别为1:1和1:10。将Aβ42、amylin、胰岛素于37℃，溶菌酶于65℃环境分别放置1天、5天、5小时和6天。
3)将硫黄素(ThT)溶解在pH 6.5、50mM的磷酸盐缓冲液使其浓度为5μM。将孵育后的样品20μL加入到含有180μL ThT溶液的黑色酶标板中。混匀后在多功能酶标仪上以450nm激发波长和482nm的发射波长测定ThT的荧光强度。将各样品的荧光强度减去ThT本身的背景荧光。
图4(A)-(D)所示，未加入ZR多肽的Aβ42及加入ZR多肽后Aβ42与ZR的摩尔比分别为1:1和1:10时，其荧光值分别为：26500、22000、17000；未加入ZR多肽的溶菌酶及加入ZR多肽后溶菌酶与ZR的摩尔比分别为1:1和1:10时，其荧光值分别为：310000、220000、170000；未加入ZR多肽的amylin及加入ZR多肽后amylin与ZR的摩尔比分别为1:1和1:10时，其荧光值分别为：38000、41000、43000；未加入ZR多肽的胰岛素及加入ZR多肽后胰岛素与ZR的摩尔比分别为1:1和1:10时，其荧光值分别为：305000、305000、310000。
结果表明加入ZR后Aβ42和溶菌酶荧光强度显著低于其蛋白自身的对照。由于ThT是与淀粉样蛋白聚集后的聚集物中的β-片层结合后才可激发出荧光，荧光越强，表明淀粉样蛋白聚集越多。因此，ZR可明显抑制Aβ42和溶菌酶的聚集，但ZR对amylin和胰岛素的聚集无显著影响。为了进一步验证上述结果，如图4(E)-(H)应用扫描透射电镜检测了ThT试验终点时的各淀粉样蛋白的形态特征。结果表明加入ZR多肽后的Aβ42和溶菌酶聚集形成的纤维明显减少，而ZR的加入对amylin和胰岛素的聚集没有明显影响。
实验例5 ZR多肽体外抑制淀粉样蛋白的细胞毒性
用含10％胎牛血清的培养基(DMEM)将SH-SY5Y细胞配成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔体积100μL。细胞于37℃培养24小时，培养箱CO2浓度为5％。
每孔加入如下样品：
Aβ42：Aβ42蛋白的终浓度是4μM；Aβ42与ZR的混合物(Aβ：ZR＝1:0.5)：Aβ42蛋白的终浓度是4μM，ZR的终浓度是2μM；Aβ42与ZR的混合物(Aβ：ZR＝1:1)：Aβ42蛋白的终浓度是4μM，ZR的终浓度是4μM；
Amylin：amylin蛋白的终浓度是4μM；Amylin与ZR的混合物(Amylin：ZR＝1:1)：Amylin蛋白的终浓度是4μM，ZR的终浓度是4μM；Amylin与ZR的混合物(Amylin：ZR＝1:10)：Amylin蛋白的终浓度是4μM，ZR的终浓度是40μM；
溶菌酶：溶菌酶蛋白的终浓度是20μM；溶菌酶与ZR的混合物(溶菌酶：ZR＝1:1)：溶菌酶蛋白的终浓度是20μM，ZR的终浓度是20μM；溶菌酶与ZR的混合物(溶菌酶：ZR＝1:10)：溶菌酶蛋白的终浓度是20μM，ZR的终浓度是200μM；
胰岛素：胰岛素蛋白的终浓度是60μM；胰岛素与ZR的混合物(胰岛素：ZR＝1:1)：胰岛素蛋白的终浓度是60μM，ZR的终浓度是60μM；胰岛素与ZR的混合物(胰岛素：ZR＝1:5)：胰岛素蛋白的终浓度是60μM，ZR的终浓度是300μM；以PBS为对照；
细胞继续培养48小时后，每孔加MTT溶液10μL，37℃孵育3小时，终止培养，每孔加100μL晶体溶解液(10％SDS和5％异丁醇溶解在0.01M HCL中)，37℃孵育过夜，使结晶物充分溶解。在多功能酶联免疫检测仪上以570nm波长测定各孔光吸收值。减去本底后，以样品的吸光度除以不加样品的细胞的吸光度作为细胞的活性指标，并分析样品之间的差异显著情况，结果如图5(A)-(D)。
Aβ42组的细胞活性为71％；Aβ：ZR＝1:0.5组细胞活性为：80％；Aβ：ZR＝1:1组细胞活性为：82％；Amylin组细胞活性为：61％；Amylin：ZR＝1:1组细胞活性为：70％；Amylin：ZR＝1:10组细胞活性为：75％；溶菌酶组的细胞活性：55％；溶菌酶：ZR＝1:1组的细胞活性：85％；溶菌酶：ZR＝1:10组的细胞活性：93％；胰岛素组的细胞活性：77％；胰岛素：ZR＝1:1组的细胞活性：92％；胰岛素：ZR＝1:5组的细胞活性：102％。
结果表明，各淀粉样蛋白在一定浓度下对SH-SY5Y细胞都具有细胞毒性。ZR的加入可以显著降低各淀粉样蛋白的细胞毒性，并呈现数量依赖性。当ZR与Aβ42、amylin、溶菌酶、胰岛素的摩尔比分别为1:1、1:10、1:10、1:5时，可分别抑制Aβ42、amylin、溶菌酶、胰岛素所致细胞毒性的37.8％、45.4％、117.6％和89.8％。因此，无论ZR多肽对各淀粉样蛋白聚集时的影响有何不同，ZR都能够显著抑制Aβ42、amylin、溶菌酶、胰岛素的细胞毒性。
实验例6 ZR多肽改善AD转基因小鼠的记忆能力
1)脑侧室注射：将8月龄大的转APP和PS1基因的AD雌性小鼠随机分为注射多肽ZR(AD+ZR)和PBS组(AD con)，每组8只。同时以8只年龄相同的同窝野生型小鼠做为对照组(WT)，将上述三组小鼠进行如下处理：
脑内注射前12h对小鼠禁食不禁水。首先将小鼠麻醉，麻醉剂量为：25g小鼠腹腔注射0.1mL浓度为10％的水合氯醛。将小鼠固定在立体定位仪上，参照标准图谱进行脑立体定位侧室注射给药。小鼠脑室注射定位参数为：前囱后1.8mm，中线旁开±1.8mm，硬膜下2.5mm。用无菌水溶解ZR至1mg/ml，注射速度0.2μl/min，注射剂量为5μL。注射完留针5min。每隔7天注射一次，共注射4次。于最后一次注射后5天，对小鼠进行水迷宫记忆能力检测。
2)记忆力训练：小鼠水迷宫训练之前放在室温25℃，湿度46％的环境适应3天。所有行为学检测试验中均采用随机双盲的方式。训练前，除去平台，在水槽中央轻轻放入，让其自由游动60s。测定每组小鼠游泳象限偏好，选择对面水槽的壁，作为该小鼠初始释放位置。第一次训练前让小鼠站在平台(平台直径10厘米)上15s，让它记忆一下池(直径1.1米)中台的空间位置。平台放在第二象限中部，并且平台的上表面距水面1.5厘米。池水中加入奶粉，以增加动物的视觉反差，利于图像记录。将小鼠面朝池壁，轻轻放入水中，让其在水槽中游泳。小鼠在台上站立2s就停止计时，认为上台，训练时间每次最长为60s。期间应用软件记录其轨迹以及从入水到爬上平台的时间，即潜伏期。如果小鼠在60s内找到平台则让其在平台上停留10s。如果小鼠在60s内找不到平台，则在60s后由实验人员引导其上平台，并让其在平台上停留10s。连续训练5天，每天训练2次，两次之间的间隔为3-4h。然后间隔24h，撤掉平台，让小鼠在水中寻找平台60s。以录像和软件系统记录5天训练和探索试验的结果，并以重复量数二因子变异数分析，处理试验结果。
试验结果如图6(A)-(D)所示，随着训练时间的增长，各组小鼠找到平台的潜伏期逐渐缩短；具体如下：
注射ZR的AD小鼠找到平台的潜伏期在训练到第3、4、5天时，与注射PBS对照的AD小鼠相比具有显著差异，图6(A)注射ZR后的AD小鼠空间记忆能力明显好于注射PBS的对照组；图6(B)撤掉台后注射ZR的AD小鼠找到平台的潜伏期也明显小于AD对照组，野生型(WT)小鼠、AD对照鼠和ZR治疗的AD鼠潜伏期分别为16s、24s和17s；图6(C)注射ZR的AD小鼠穿过平台所在位置的次数显著高于AD对照组，野生型(WT)小鼠、AD对照鼠和ZR治疗的AD鼠穿台次数分别为4.2、1.8和3.7；图6(D)注射ZR后的AD小鼠在目标象限中所在的时间显著高于AD对照小鼠，野生型(WT)小鼠、AD对照鼠和ZR治疗的AD鼠在目标象限中所在的时间分别为20s、11s和19s。这些结果表明注射ZR后的AD小鼠空间记忆能力明显好于未注射ZR的AD对照组。
实验例7 ZR多肽降低AD转基因小鼠脑内老年斑的数量
1)将上述的注射多肽ZR(AD+ZR)组、注射PBS组(AD con)、野生型(WT)组小鼠心脏灌流，取脑组织，应用组织冷冻液及液氮进行冷冻处理。并保存于-80℃。用时以冷冻切片机进行切片，切片厚度16μm，每隔9个切片取一个进行染色观察。
2)应用1mg/mL ThS浸染切片10min，然后以70％乙醇冲洗3次。
3)应用荧光显微镜采集图像激发波长488nm，4×物镜观察，结果如图7(A)-(C)。
图7(A)为野生型小鼠、注射多肽ZR(AD+ZR)组(n＝8)、注射PBS组(AD con)(n＝8)的脑切片(每只动物每个部位检测10-12张切片)中老年斑面积。注射ZR后AD小鼠脑内的老年斑数量明显减少。图7(B)和(C)表明注射多肽ZR(AD+ZR)组的脑切片老年斑面积所占切片面积比例和老年斑数量分别为0.3％和4个/mm2，而注射PBS组(AD con)脑切片中老年斑面积所占切片面积比例和数量分别为1.7％和17个/mm2。统计学分析表明，注射ZR后AD小鼠脑内的老年斑数量和所占面积都有显著下降。
将上述冷冻切片置于0.3％的过氧化氢中，然后应用10％的羊血清对切片进行封闭。加入1:3000稀释的Aβ抗体6E10 37℃作用1h，加入生物素化的羊抗鼠二抗37℃作用1h，最后加入联接HRP的链霉亲和素，以二氨基联苯胺(DAB)为底物显色，应用显微镜采集图像。
图7(D)可以看出，注射PBS的AD小鼠脑海马和皮层中的老年斑数量明显多于注射多肽ZR的AD小鼠中老年斑数量。应用系统visiopharm测定注射多肽ZR(AD+ZR)组(n＝8)、注射PBS组(AD+con或control)(n＝8)的脑切片(每只动物每个部位检测10-12张切片)中老年斑面积，结果为图7(E)-(H)：
注射多肽ZR的小鼠海马中老年斑面积为0.7％，注射PBS的小鼠海马中老年斑面积为2.4％；注射多肽ZR的小鼠皮层中老年斑面积为1.3％，注射PBS的小鼠皮层中老年斑面积为2.9％；注射多肽ZR的小鼠海马中老年斑数量为7个/mm2，注射PBS的小鼠海马老年斑数量为18个/mm2；注射多肽ZR的小鼠皮层中老年斑数量为9个/mm2，注射PBS的小鼠皮层老年斑数量为30个/mm2；统计学分析表明，注射ZR后AD小鼠脑海马和皮层中的老年斑数量和所占面积都有显著下降。
实验例8ZR多肽降低AD转基因小鼠脑内Aβ40和Aβ42水平
上述注射多肽ZR(AD+ZR)组、注射PBS组(AD对照)试验小鼠的脑组织在含有蛋白酶抑制剂的pH7.2PBS中匀浆。然后以15000rpm离心30min，收集上清。沉淀加入5M的盐酸胍(以tris-HCl缓冲液配制，pH8.0)，然后离心处理，收集上清，可溶性和不溶性Aβ40和Aβ42水平由试剂盒以ELISA方法测定OD值和Aβ标准曲线，结果见图8(A)-(D)。
图8(A)注射ZR多肽的脑内Aβ40水平为17pg/μg，注射PBS的脑内Aβ40水平为56pg/μg；图8(B)注射ZR多肽的脑内Aβ42水平为23pg/μg，注射PBS的脑内Aβ42水平为97pg/μg；图8(C)注射ZR多肽的脑内Aβ40水平为4pg/μg，注射PBS的脑内Aβ40水平为7.4pg/μg；图8(D)注射ZR多肽的脑内Aβ42水平为2.4pg/μg，注射PBS的脑内Aβ42水平为5.1pg/μg。
统计分析结果表明，AD小鼠注射ZR后脑内可溶性Aβ40和Aβ42水平及不溶性Aβ40和Aβ42水平都明显低于注射PBS的小鼠。
实验例9 ZR多肽降低AD转基因小鼠脑内炎症水平
将冷冻的脑切片置于0.3％的过氧化氢中处理，然后应用10％的羊血清对切片进行封闭。分别加入1:200稀释的抗Iba-1抗体和1:100稀释的抗GFAP抗体37℃作用1h，加入生物素化的羊抗鼠二抗37℃作用1h，最后加入联接HRP的链霉亲和素，以二氨基联苯胺(DAB)为底物显色，应用显微镜采集图像。应用系统visiopharm测定注射多肽ZR(AD+ZR)组(n＝8)、注射PBS组(AD con)(n＝8)的脑切片(每只动物每个部位检测10-12张切片)中小胶质细胞和星形细胞面积。
图9(A)和(B)分别显示注射ZR后AD小鼠脑内的小胶质细胞和星形胶质细胞的数量显著减少。图9(C)和(D)显示注射ZR多肽的AD小鼠脑内小胶质细胞所占脑切片面积1.2％，注射PBS的AD小鼠脑内小胶质细胞所占脑切片面积5.7％；注射ZR多肽的脑内星形胶质细胞所占脑切片面积1.8％，注射PBS的脑内星形胶质细胞所占脑切片面积4.9％。
统计学分析结果表明，注射ZR后的AD小鼠脑内的小胶质细胞和星形胶质细胞的数量均显著减少。
实验例10 ZR多肽促进细胞对Aβ的吞噬
用含10％胎牛血清的DMEM培养基将BV-2细胞配成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔体积100μL。细胞于37℃培养24小时，培养箱CO2浓度为5％，然后分别加入如下物质：
Aβ42：Aβ42蛋白的终浓度是0.1μM；Aβ42：ZR摩尔比＝1:50：Aβ42蛋白的终浓度是0.1μM；ZR的终浓度为5μM；Aβ42：ZR摩尔比＝1:100：Aβ42蛋白的终浓度是0.1μM；ZR的终浓度为10μM；Aβ42：ZR摩尔比＝1:200：Aβ42蛋白的终浓度是0.1μM；ZR的终浓度为20μM。
细胞继续培养4小时后，收集细胞。用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液处理细胞，收集细胞提取液。应用Aβ检测盒测定细胞内的Aβ42水平，结果如图10：
Aβ42：ZR摩尔比＝1:0：Aβ42蛋白的浓度是26ng/g；Aβ42：ZR摩尔比＝1:50：Aβ42蛋白的浓度是28ng/g；Aβ42：ZR摩尔比＝1:100：Aβ42蛋白的浓度是33ng/g；Aβ42：ZR摩尔比＝1:200：Aβ42蛋白的浓度是38ng/g。
随着加入的ZR浓度升高，BV-2细胞内的Aβ42水平逐步升高，表明ZR具有促进小胶质细胞吞噬Aβ的作用。
实验例11 ZR多肽改善PD转基因小鼠的行为协调能力
1)脑侧室注射：将9月龄大的PD转基因小鼠随机分为注射多肽ZR(PD+ZR)和PBS组(PD control)，每组8只。同时以8只年龄相同的同窝野生型小鼠做为对照组(WT)，将上述三组小鼠进行如下处理：
脑内注射前12h对小鼠禁食不禁水。小鼠的注射方式同实施例6，对小鼠进行爬杆试验和后肢紧抱程度试验的检测。
2)爬杆试验：所用杆是一个表面粗糙、带有基座的木质杆直径1厘米，长度50厘米。将木杆平稳放在小鼠笼内，小鼠头部朝上放在木杆顶部，使其自动转头然后头部向下顺杆爬至笼内。分别记录小鼠转头以及爬至笼内所用时间。如果小鼠跌落、滑落，或不能完成任务，则转头时间记为30秒，爬回笼内记为60秒。每天连续进行5次，前两天为训练期，第三天为测试期。统计分析各组小鼠测试期的转头以及爬至笼内所用时间，结果如图11(A)-(B)所示：
野生型(WT)小鼠、PD对照鼠和ZR治疗的PD鼠转头时间分别为1.38秒，21.87秒和13.9秒，爬至笼内所用时间分别为6.02秒，45.48秒和19.74秒。统计学分析表明，注射ZR的PD小鼠转头以及爬至笼内所用时间明显低于PD对照组小鼠。
3)后肢紧抱程度试验：将小鼠头部向下悬至空中，观察15秒以判断小鼠的后肢紧抱程度分级。分级标准如下：0级＝两后肢外张，远离腹部；1级＝至少半数观察期内，有一条后肢向腹部内收；2级＝至少半数观察期内，两条后肢不完全向腹部内收；3级＝至少半数观察期内，两条后肢完全向腹部内收。适当情况可采用0.5分分级。连续观察3天，后肢紧抱程度评分为3次实验等级评分的总和，结果如图11(C)所示：
野生型(WT)小鼠、PD对照鼠和ZR治疗的PD鼠后肢紧抱程度等级分数分别为0，1.78和1.08.统计学分析表明，注射ZR的PD小鼠后肢紧抱程度等级分数明显低于PD对照组小鼠。
实验例12 ZR多肽降低PD转基因小鼠脑内α-synuclein水平
将注射多肽ZR(PD+ZR)组、注射PBS组(PD control)、野生型(WT)组小鼠进行心脏灌流，取脑干和小脑，称重。将脑组织按1:5(V/W)的比例加入含有1×蛋白水解酶抑制剂和0.5％NP40的TNE缓冲液(10mM Tris HCl pH 7.4；150mM NaCl；5mM EDTA)，放置冰上研磨5min，静置20min后于4℃以100,000g离心力离心5min，收集上清。
将总体系为10μL的LDS缓冲液、还原剂及一定量的可溶性组分充分混匀，于70℃金属浴10min，然后以12000rpm室温离心5min即得样品。使用4-12％Bis-Tris NuPAGE胶，每孔上样10μL，150V电泳80min。然后以300mA湿法转膜2小时。按目的蛋白分子量大小剪下包含目的蛋白的NC膜。含5％脱脂牛奶的PBS室温封闭2h；加入抗α-synuclein抗体1:1000，室温孵育2h；0.1％PBST洗膜3遍，每遍5min，加入IR染色的羊抗鼠/兔二抗1:15000，室温避光孵育1h；0.1％PBST洗膜3遍，每遍10min。然后用红外激光成像系统检测膜上发光条带光密度值，结果如图12所示：
可见，WT小鼠脑中可溶性α-synuclein/α-tubulin比值为0.19；注射多肽ZR的PD转基因小鼠脑中可溶性α-synuclein/α-tubulin比值为1.44；注射PBS的PD转基因小鼠脑中可溶性α-synuclein/α-tubulin比值为1.84；统计分析结果表明，PD转基因小鼠注射ZR后脑内可溶性α-synuclein水平明显低于PD对照组小鼠。
实验例13 ZR多肽改善HD转基因小鼠的行为协调能力
脑侧室注射：将12月龄大的HD转基因小鼠随机分为注射多肽ZR(HD+ZR)和PBS组，每组8只，同时以8只年龄相同的同窝野生型小鼠做为对照组。
将上述三组小鼠进行如下处理：
脑内注射前12h对小鼠禁食不禁水，小鼠的注射方式同实施例6，对小鼠进行转棒试验检测。
转棒试验：转棒试验连续进行3天，每天由两个阶段组成：训练阶段和测试阶段。训练阶段：转棒转速为4转/分，小鼠在转棒上训练5分钟后放回笼内，1小时之后进入测试阶段。测试阶段：转棒转速为5分钟内由静止匀加速至40转/分，记录小鼠在转棒上的持续时间，不跌落记为300秒。每天测试3次，每次间隔30分钟。统计分析每组小鼠3天内总计9次测试，每次在转棒仪上的持续时间。结果如图13(A)-(B)所示：野生型(WT)小鼠、HD对照鼠和ZR治疗的HD鼠在转棒上的持续时间分别为295秒，176.72秒和233.64秒。
统计学分析表明，注射ZR的HD小鼠在转棒上的持续时间明显高于HD对照组小鼠。
实验例14 ZR多肽降低HD转基因小鼠脑内HTT水平
应用western方法检测ZR对HD转基因小鼠脑内HTT的影响。
将上述注射多肽ZR(HD+ZR)组、注射PBS组、野生型(WT)组小鼠的心脏灌流，取大脑并称重。将脑组织按1:5(V/W)的比例加入含有1×蛋白水解酶抑制剂的RIPA裂解液中，放置冰上研磨5min，静置20min后于4℃以12000rpm离心5min，收集上清。
将总体系为10μL的LDS缓冲液、还原剂及一定量的可溶性组分充分混匀，于70℃金属浴10min，然后以12000rpm室温离心5min即得样品。使用3-8％Tris-acetate NuPAGE胶，每孔上样10μL，150V电泳80min。然后以300mA，湿法转膜2小时。按目的蛋白分子量大小剪下包含目的蛋白的NC膜。含5％脱脂牛奶的PBS室温封闭2h；加入抗HTT抗体2166(1:1000)，或α-tubulin抗体(1:1000)，室温孵育2h；0.1％PBST洗膜3遍，每遍5min，加入IR染色的羊抗鼠/兔二抗1:15000，室温避光孵育1小时；0.1％PBST洗膜3遍，每遍10min。然后用红外激光成像系统检测膜上发光条带光密度值，结果如图14所示。
图14表明WT小鼠脑中可溶性HTT/α-tubulin比值为0.955；注射多肽ZR的HD转基因小鼠脑中可溶性HTT/α-tubulin比值为2.17；注射PBS的HD转基因小鼠脑中可溶性HTT/α-tubulin比值为2.79；统计分析结果表明，HD转基因小鼠注射ZR后脑内可溶性HTT水平明显低于对照小鼠。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Figure IDA0000857595990000011
Figure IDA0000857595990000021

Claims (20)

1.一种结合多种淀粉样蛋白单体和聚集体的多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列的通式为：Ser-X1-Phe-X2-Asn-Lys-Arg，其中，X1和X2独立的为20种氨基酸中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
3.一种结合Aβ蛋白寡聚体的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
4.一种DNA片段，其特征在于，其包含编码权利要求1-3任一项所述多肽的核苷酸序列。
5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含至少一个拷贝的如权利要求4所述的DNA片段。
6.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含权利要求5所述的重组载体。
7.一种淀粉样蛋白细胞毒性抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包含如权利要求1-3任一项所述的多肽、权利要求4所述的DNA片段、权利要求5所述的重组载体或权利要求6所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合。
8.如权利要求7所述的抑制剂在制备Aβ、amylin、胰岛素和溶菌酶的细胞毒性抑制药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述细胞毒性抑制剂的细胞为SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞。
10.一种淀粉样蛋白聚集抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包含如权利要求1-3任一项所述的多肽、权利要求4所述的DNA片段、权利要求5所述的重组载体或权利要求6所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合。
11.如权利要求10所述的抑制剂在制备Aβ和溶菌酶的聚集抑制药物中的应用。
12.一种细胞清除Aβ促进剂，其特征在于，所述促进剂包含如权利要求1-3任一项所述的多肽、权利要求4所述的DNA片段、权利要求5所述的重组载体或权利要求6所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合。
13.根据权利要求12所述的促进剂，其特征在于，所述细胞清除Aβ促进剂的细胞为小胶质细胞。
14.根据权利要求13所述的促进剂，其特征在于，所述细胞清除Aβ促进剂的细胞为BV-2细胞。
15.根据权利要求12所述的促进剂，其特征在于，所述Aβ为Aβ42。
16.一种药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1-3任一项所述的多肽、权利要求4所述的DNA片段、权利要求5所述的重组载体或权利要求6所述的重组细胞中的任意一种或至少两种的组合。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上接受的辅料。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其特征在于，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。
19.如权利要求16-18任一项所述的药物组合物在制备检测、诊断和/或治疗与淀粉样蛋白相关的疾病的药物中的应用。
20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所述疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病或II型糖尿病中的任意一种或至少两种的组合。
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