CN102060911B - 同时结合多种淀粉样蛋白单体的多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于含肽的医药配制品领域，具体涉及一种同时结合淀粉样蛋白单体的多肽及其应用；本发明可应用于识别多种淀粉样蛋白过渡态单体的抗体制备，淀粉样蛋白疾病的诊断、治疗和实验研究。本发明提供一种同时结合淀粉样蛋白单体的多肽（简称PEMX），其氨基酸序列为Cys-Trp-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Cys，或由上述的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸。本发明可以有效刺激机体产生与多种淀粉样淀蛋白过渡态单体结合的特异性抗体，并且该抗体可以抑制淀粉样蛋白的聚集和细胞毒性。
Description
技术领域
本发明属于含肽的医药配制品领域，具体涉及一种同时结合淀粉样蛋白单体的多肽及其应用；本发明可应用于识别多种淀粉样蛋白过渡态单体的抗体制备，淀粉样蛋白疾病的诊断、治疗和实验研究。
背景技术
多年来，淀粉样蛋白或多肽自身的聚集导致的多种疾病对人类的健康造成了越来越大的危害。某些蛋白质单体本身无毒性或毒性很小，但它们可聚集成具有毒性作用的寡聚物（oligomer）或纤维状物（fibril）而引起一系列疾病，如由Beta-amyloid (A-Beta)引起的阿兹海默病（俗称老年性痴呆） （Alzheimer’ disease, AD），由alpha-synuclein 引起的帕金森病(Parkinson’ disease, PD)，由朊病毒蛋白（Prion protein (PrP)）引起的包括疯牛病在内的人和动物的至少十余种脑病，由含有多聚谷氨酰胺(PolyQ)的多肽引起的包括亨廷顿病（Huntington’s disease）在内的至少9种遗传性神经退行性疾病，由胰岛淀粉样多肽（islet amyloid polypeptide，IAPP,amylin）引起的II型糖尿病等及由长时间透析导致的溶菌酶（lysozyme）聚集沉积导致的疾病等。其中，对人类健康危害最大的为AD和PD及II型糖尿病。医学统计表明，我国和欧美国家中65岁以上老年人中5～6％患有AD，并且发病率逐年上升。该病已被列为导致死亡的第四大疾病，仅次于心脏病、癌症和中风。另有约1%的65岁以上老年人患有PD。而患有II型糖尿病的人数可达总人口的5%以上。这些疾病对人类的健康造成了越来越大的危害，其发病的根本原因(或部分原因)在于某些蛋白质自身的聚集。
研究表明，不同蛋白质的聚集最先始于错误折叠或变性的蛋白质单体，单体多肽链间氢键的形成导致了蛋白分子的聚合。首先形成由电子或原子力显微镜可观察到的大小约为3-10 nm的可溶性球形寡聚物，某些寡聚物进一步可聚集成弯曲柔韧的丝状物（protofibril），进而形成直径为6-10 nm的表面光滑或呈螺旋状的纤维。非同源性的蛋白质最终可形成具有相似结构的蛋白聚合物。由A-Beta、alpha-synuclein、PrP和IAPP等各种各样的蛋白聚集形成的纤维都含有“cross-Beta-sheet”结构，其中Beta片层构成的骨架与纤维纵轴垂直，而骨架中的氢键网与纵轴平行。多肽在Beta片层中排列为平行的Beta链，在Beta片层中，氨基酸都有精确的位置。不同来源的寡聚物也具有相似的结构特征，寡聚物特异性识别抗体可以与由不同来源的蛋白质单体形成的寡聚物结合，而不与它们的单体和纤维结合。这表明淀粉样蛋白多肽骨架可形成独立于其氨基酸一级序列之外的共同的寡聚物特有的抗原表位。Glabe实验室应用连接有A-Beta 40的金胶颗粒模拟A-Beta 40寡聚物制备出了不仅可与A-Beta 40和A-Beta 42寡聚物结合并且还可与alpha-synuclein、IAPP、PolyQ、PrP、Insulin、Lysozyme等形成的寡聚物结合的多克隆抗体（A11），该抗体还能够有效地抑制所有这些寡聚物的细胞毒性。
过去人们一直认为淀粉样蛋白疾病的发生是由蛋白质聚集成的不溶性的纤维状物引起的。近年来大量的研究表明，引起致病的关键因素是体积较小的水溶性的寡聚物。由蛋白寡聚物引起的退行性疾病存在着相似的机理，即细胞膜损伤、氧化应激、线粒体功能失调、细胞死亡、信号传递异常等。寡聚物形成的机理及怎样才能有效地抑制其细胞毒性等都是人们亟待探讨和解决的问题。应用主动和被动的免疫技术治疗AD从而抑制A-Beta的聚集，并加快A-Beta的清除是AD研究领域的热点之一。
2000年前后美国科研人员应用A-Beta制成的疫苗进行了动物试验和一期临床试验。实验结果十分令人鼓舞，实验动物和病人的临床症状减轻，记忆力恢复，病理变化也显著减退。同时，应用抗A-Beta抗体对实验动物的被动免疫治疗也收到了很好的疗效。然而，不幸的是在二期临床试验中，虽然大多数的病人仍表现出良好效果，却有6%的病人表现出了脑膜炎的症状和病理变化，有的病人甚至发生死亡。因此，对A-Beta疫苗和抗体的实验研究立即终止。尽管如此，从上述的研究我们可以看出A-Beta疫苗对AD的治疗效果是应该肯定的。研究表明由A-Beta疫苗导致的副作用可能是由该疫苗诱导机体产生的T淋巴细胞介导的自身免疫反应，并且该副作用的产生是由Th1而不是Th2型免疫反应造成的。为了克服A-Beta疫苗的副作用，在疫苗设计时应加强诱发B细胞反应和Th2型免疫反应的发生，并且避开诱发T细胞免疫反应和Th1型免疫反应的发生。所以，在科研和临床中需要一种与体内正常淀粉样蛋白单体之间不产生副作用，并且还不会影响蛋白的正常生理功能的结合淀粉样蛋白单体的多肽。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时结合淀粉样蛋白单体的多肽（简称PEMX），其氨基酸序列为：Cys-Trp-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Cys，或由上述的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸，且具有抑制淀粉样蛋白寡聚体形成作用的多肽。本发明可以有效刺激机体产生与多种淀粉样淀蛋白过渡态单体结合的特异性抗体，并且该抗体可以抑制淀粉样蛋白的聚集和细胞毒性。
在本发明的具体实施例中，将本发明所述多肽的N端应用PEG2000修饰（简称为PEG-PEMX）（序列为:
PEG-Cys-Trp-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Cys）、天冬氨酸置换成丙氨酸（简称为PEMX-D/A）（序列为：Cys-Trp-His-Thr-Ala-Thr-Arg-Ser-Cys）、删除色氨酸（简称为：PEMX-∆W）（序列为：Cys-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Cys）或插入甘氨酸（简称为：PEMX-G）（序列为：
Cys-Trp-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Gly-Ser-Cys），经检测表明PEMX多肽经过某些修饰、某个氨基酸经置换、缺失或在多肽中增加氨基酸后仍能保留有与Aβ42结合的能力。
体外试验表明，本发明所述的多肽可与多种淀粉样蛋白单体结合，并且自身可以聚集；所述的多肽为一有效的免疫原，可有效刺激机体产生抗体；所述的多肽既是多种淀粉样蛋白过渡态上的抗原表位，同时也是聚集时的结合位点；所述的多肽抗体可以明显抑制淀粉样蛋白Ab42、amylin、a-synuclein、lysozyme聚集；所述的多肽抗体能够明显抑制Ab42、PrP、amylin、a-synuclein、lysozyme的细胞毒性。
本发明还提供所述多肽应用于淀粉样蛋白过渡态单体抑制剂。
本发明还提供所述多肽应用于制备特异结合淀粉样蛋白过渡态单体的抗体。
本发明还提供所述多肽应用于制备治疗淀粉样蛋白疾病疫苗。
本发明相比现有技术具有如下有益效果：
1.本发明可以有效刺激机体产生与多种淀粉样淀蛋白过渡态单体结合的特异性抗体，并且该抗体可以抑制淀粉样蛋白的聚集和细胞毒性。
2.基于本发明的疫苗能够避开过敏反应的发生，还不会诱导机体形成抗A-Beta等淀粉样蛋白正常单体的抗体。这一特性可消除疫苗与体内正常淀粉样蛋白单体之间产生副作用的可能，并且还不会影响蛋白的正常生理功能。
3.本发明可用于治疗淀粉样蛋白疾病疫苗的研制。PEMX具有较好的免疫原性，可有效刺激机体产生抗体，因而在淀粉样蛋白疾病的治疗或预防用疫苗的研制方面，PEMX可作为良好的免疫原。
4．本发明可直接用于治疗淀粉样蛋白疾病。由于PEMX能够直接抑制淀粉样蛋白的聚集和细胞毒性，因而对该类疾病的直接治疗也可能具有潜在的作用。
附图说明：
图1. PEMX与多种淀粉样蛋白单体结合的ELISA测定；
图2. 经置换、缺失或插入了氨基酸的PEMX与Ab42单体结合的ELISA测定；
图3. PEMX自身凝聚成多聚体的Western-blot测定；
图4. PEMX与多种淀粉样蛋白单体结合的Western-blot测定；
图5. 经PEMX抗体免疫后小鼠血清中抗体与Ab42的结合；
图6. PEMX抗体与多种淀粉样蛋白的单体结合；
图7. ThT荧光染色测定PEMX抗体抑制淀粉样蛋白的聚集；
图8. PEMX抗体抑制淀粉样蛋白的细胞毒性。
具体实施方式：
实施例1：
一种同时结合淀粉样蛋白单体的多肽（简称PEMX），其氨基酸序列为：Cys-Trp-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Cys，或由上述的氨基酸序列经过取代、缺失、或添加一个或几个氨基酸，且具有抑制淀粉样蛋白寡聚体形成作用的多肽。本发明可以有效刺激机体产生与多种淀粉样淀蛋白过渡态单体结合的特异性抗体，并且该抗体可以抑制淀粉样蛋白的聚集和细胞毒性。
在本发明的具体实施例中，将本发明所述多肽的N端应用PEG2000修饰（简称为PEG-PEMX）（序列为:
PEG-Cys-Trp-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Cys）、天冬氨酸置换成丙氨酸（简称为PEMX-D/A）（序列为：Cys-Trp-His-Thr-Ala-Thr-Arg-Ser-Cys）、删除色氨酸（简称为：PEMX-∆W）（序列为：Cys-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Cys）或插入甘氨酸（简称为：PEMX-G）（序列为：
Cys-Trp-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Gly-Ser-Cys），经检测表明PEMX多肽经过某些修饰、某个氨基酸经置换、缺失或在多肽中增加氨基酸后仍能保留有与Aβ42结合的能力。
体外试验表明，本发明所述的多肽可与多种淀粉样蛋白单体结合，并且自身可以聚集；所述的多肽为一有效的免疫原，可有效刺激机体产生抗体；所述的多肽既是多种淀粉样蛋白过渡态上的抗原表位，同时也是聚集时的结合位点；所述的多肽抗体可以明显抑制淀粉样蛋白Ab42、amylin、a-synuclein、lysozyme聚集；所述的多肽抗体能够明显抑制Ab42、PrP、amylin、a-synuclein、lysozyme的细胞毒性。
所述多肽应用于淀粉样蛋白过渡态单体抑制剂；所述多肽也可以应用于制备特异结合淀粉样蛋白过渡态单体抗体；所述多肽也可以应用于制备治疗淀粉样蛋白疾病疫苗。
所述多肽可以有效刺激机体产生与多种淀粉样淀蛋白过渡态单体的特异性抗体，并且该抗体可以抑制淀粉样蛋白的聚集和细胞毒性。基于所述多肽的疫苗能够避开过敏反应的发生，还不会诱导机体形成抗A-Beta等淀粉样蛋白正常单体的抗体。这一特性可彻底消除疫苗与体内正常淀粉样蛋白单体之间产生副作用的可能，并且还不会影响蛋白的正常生理功能。
在近期的研究中，Frieden等推测淀粉样蛋白单体聚集时应经过无规则变性结构的形成、无规则结构的有序变化及有序结构的形成几个过渡型阶段（Frieden C. Protein
aggregation processes: In search of the mechanism. Protein Sci., 2007,）。应用噬菌体显示技术筛选与Ab42单体结合的多肽时获得了一条可与各种淀粉样蛋白的单体结合的多肽PEMX。由于各淀粉样蛋白的一级序列无同源性，因而推测PEMX是与各淀粉样蛋白单体的过渡态所含有的共同的结合位点结合。进一步的研究表明，PEMX可作为免疫原刺激机体产生抗体，并且该抗体可以与多种淀粉样蛋白单体结合，提示PEMX为多种过渡态单体上共有的抗原表位。同时，PEMX自身可发生聚集。所有这些结果使我们推测出PEMX为淀粉样蛋白过渡态单体相互聚集时的结合位点，也是一个具有较好免疫原性的抗原表位。PEMX多肽抗体可以抑制多种淀粉样蛋白的聚集及细胞毒性，表明应用该多肽的主动和被动免疫对淀粉样蛋白疾病的治疗具有潜在的应用价值。同时，PEMX抗体还可能用于实验室研究及临床诊断检测。以这种肽设计的疫苗可能会避开过敏反应的发生，还不会诱导机体形成抗A-Beta等淀粉样蛋白正常单体的抗体。这一特性可消除疫苗与体内正常淀粉样蛋白单体之间产生副作用的可能，并且还不会影响蛋白的正常生理功能。因此，基于该类抗原表位研制的肽疫苗对AD及其它淀粉样蛋白疾病的治疗具有重要的应用价值。
PEMX的合成制备的方法为：
PEMX为一环形七肽，由上海吉尔生化有限公司按常规方法合成制备（制备方法参见Weng C C, Peter D W. Fmoc
Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. Oxford: University Press,
2000. 1~8；Atherton E, Sheppard R C.
Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. Oxford: IRL Press, 1989）；PEMX纯度为大于或等于95%；PEMX保存于-20 °C，避免反复冻融。
PEMX用于特异抗各种淀粉样蛋白过渡态单体抗体的制备方法为：
将展示PEMX多肽的M13噬菌体免疫新西兰大白兔。每2周免疫一次，每次免疫用抗原为1012个噬菌粒/兔。共免疫4次。于最后一次免疫15天后，采集兔血清。以连接有PEMX多肽的琼脂糖凝胶对兔血清进行亲和层析纯化抗PEOZ的抗体。该抗体可特异结合淀粉样蛋白过渡态单体，可用于淀粉样蛋白疾病的实验研究、治疗和临床诊断等。
PEMX的所有的实验数据都是通过至少3次独立的实验获得的，实验数据表示为平均数加减标准差。数据的统计分析是应用One-way ANOVA软件进行。
以下结合实施例2-8，进一步阐述PEMX的性质。
实施例2： PEMX可与多种淀粉样蛋白的单体结合
将100 μl Ab42、PrP、amylin、a-synuclein（American Peptide Conpany,
USA）、insulin、lysozyme（Sigma-Aldrich, USA）单体（1 g/孔）分别包被96孔酶联免疫微孔板，BSA为阴性对照，置37°C 2 h，以3% BSA 37°C封闭2 h，200 μL/孔。以PBS洗板3次，加入带有组氨酸标签的PEMX 溶液100 μl，室温孵育1 h后，用含有0.1% Tween-20的PBS洗涤三次。每孔加入100 μl连接有HRP的识别组氨酸标签的抗体（9E10）（1：3000），室温孵育1 h后，用含有0.1% Tween-20的PBS洗涤3次。每孔加入底物溶液TMB 100 μL，放置37°C 20 min，然后每孔加入50 μl 1 mmol/L硫酸终止反应，于酶联免疫检测仪上测定OD值（波长450 nm）（图1）。图1表明PEMX可与Ab42、PrP、amylin、a-synuclein、lysozyme等多种淀粉样蛋白的单体结合。由于这些淀粉样蛋白氨基酸一级序列无任何同源性，因而，能够同时结合PEMX多肽的各淀粉样蛋白应是具有相似结构特征的单体聚集成寡聚体前的过渡态。
实施例3：经置换、缺失或插入了氨基酸的PEMX仍与Aβ42结合
将所述多肽PEMX的N端应用PEG2000修饰（简称为PEG-PEMX）（序列为:
PEG-Cys-Trp-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Cys）、天冬氨酸置换成丙氨酸（简称为PEMX-D/A）（序列为：Cys-Trp-His-Thr-Ala-Thr-Arg-Ser-Cys）、删除色氨酸（简称为：PEMX-∆W）（序列为：Cys-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Cys）或插入甘氨酸（简称为：PEMX-G）（序列为：
Cys-Trp-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Gly-Ser-Cys）。为了能够检测改造后的多肽与Aβ42的结合情况，将这些多肽与带有标签的未改造的PEMX竞争地与Aβ42结合，然后以ELISA检测后者与Aβ42的结合情况。将1 mg未改造的带有标签的PEMX与10 mg改造后的PEMX的混合物100 ml加入到包被有Aβ42单体的96孔ELISA板中，然后用ELISA检测带有标签的PEMX与Aβ42的结合，测定OD值，结果见图2。表明PEMX多肽经过某些修饰、某个氨基酸经置换、缺失或在多肽中增加氨基酸后仍能与未修饰改造的PEMX有效竞争结合Aβ42，致使带有标签的PEMX与Aβ42的结合明显降低（与单独的PEMX阳性对照相比，P<0.01）。
实施例4： Western-blot证明PEMX可与多种淀粉样蛋白的单体结合，并且自身可以聚集
将333 μM 带有组氨酸标签的PEMX分别与333 μM Ab42、383 μM amylin、79 μM a-synuclein、105 μM lysozyme（333μM 带有组氨酸标签的PEMX自身作为对照）孵育12 h后取10 μL，加入等量的样品缓冲液。混匀后煮沸1分钟。加入到Tricine凝胶样品孔中，浓缩胶60 V，分离胶80 V电泳使溴酚蓝至玻璃板下边缘1 cm处。将含有样品的凝胶切下，将样品以80 V湿法转移27 min 至0.45 μm NC膜(Millipore, Billerica, MA
USA)。转移结束后将NC膜稍微冲洗，用8％ milk 37°C封闭2 h；PBST洗膜1遍，加入抗组氨酸标签的抗体 （1:3000） (Santa Cruz, CA, USA)，37°C 孵育2 h；0.1% PBST洗膜3遍，每遍5min，加入二抗HRP-羊抗鼠(1:5000) (Santa Cruz, CA,
USA)，37°C 孵育1 h；0.1% PBST洗膜3遍，每遍10 min。然后用ECL发光试剂盒（Pierce, IL, USA）检测发光条带。曝光3 min，显影30 s。PEMX多肽单体分子量为1003 Da，带有6个组氨酸标签的多肽分子量为1934 Da。图3中可见PEMX自身形成分子量分别约为10和20 kDa的两条带，表明PEMX可聚集形成5聚体和10聚体。
图4显示除了PEMX自身聚集形成的两条带之外，PEMX（带标签分子量为1.9 kDa）可与Ab42（单体分子量为4.5 kDa）结合形成分子量约为6 kDa和8kDa的两条带，表明一个Ab42单体分子可结合一个或两个PEMX多肽分子。PEMX可与amylin（单体分子量为3.9 kDa）结合形成分子量约为6 kDa和8kDa的两条带，表明一个amylin单体分子也可结合一个或两个PEMX多肽分子。PEMX可分别与a-synuclein（单体分子量为14.5 kDa）和lysozyme（单体分子量为14.3 kDa）结合形成分子量都约为16 kDa的蛋白带，表明PEMX也可与a-synuclein和lysozym单体结合。由于PrP106-126分子量太小，在SDS电泳中不易形成集中的蛋白带，因而以Western-blot方法不易检测出来（本试验未加入PrP）。淀粉样蛋白Ab42、amylin、a-synuclein、lysozyme一级序列无任何同源性，而PEMX仍然可与它们明显结合（图1和4），表明各淀粉样蛋白单体之间存在有共同的结合位点，该位点只能存在于单体形成寡聚体之前的过渡态单体上。因而，PEMX是与淀粉样蛋白聚集时的过渡态单体结合。
实施例5：PEMX可诱发机体产生抗体
应用展示PEMX多肽的M13噬菌体及未有多肽展示的噬菌体（作为对照）免疫小鼠（5只/组），每只每次免疫噬菌体1010个。每2周免疫一次，共免疫4次。第4次免疫后15天采血，分离血清。应用ELISA检测血清中抗PEMX抗体的含量。将100 μl Ab（1 mg/孔）包被96孔酶联免疫微孔板，置37°C 2 h，以3% BSA 37°C封闭2 h，200 μL/孔。以PBS洗板3次，加入2000倍稀释的血清，室温孵育1 h后，用含有0.1% Tween-20的PBS洗涤三次。每孔加入100 μl稀释后的羊抗鼠酶标二抗（1：3000），室温孵育1 h后，用含有0.1% Tween-20的PBS洗涤3次。每孔加入底物溶液TMB 100μL，放置37 °C 20 min，然后每孔加入50 μl 1 mmol/L硫酸终止反应，于酶联免疫检测仪上测定OD值（波长450 nm）。图5表明PEMX为一有效的免疫原，可有效刺激机体产生抗体。
实施例6：PEMX的免疫抗体的制备及其与各淀粉样蛋白单体的结合
将展示PEMX多肽的M13噬菌体免疫新西兰大白兔。每2周免疫一次，每次免疫用抗原为1012个噬菌粒/兔。共免疫4次。于最后一次免疫15天后，采集兔血清。以连接有PEMX多肽的琼脂糖凝胶对兔血清进行亲和层析纯化抗PEOZ的抗体。
将100 μl Ab42、PrP、amylin、a-synuclein、lysozyme单体（1 mg/孔）分别包被96孔酶联免疫微孔板，BSA为阴性对照。以PEMX抗体作为一抗，以HRP标记的羊抗兔LgG作为二抗，并按上述ELISA方法进行实验操作。结果显示，PEMX抗体可与Ab、PrP、amylin、a-synuclein的单体结合，表明PEMX是多种淀粉样蛋白单体上所共有的抗原表位（图6）。由于各淀粉样蛋白的单体之间无明显的同源性，该共同的抗原表位应该位于淀粉样蛋白的过渡态单体上。由于PEMX可与淀粉样蛋白的过渡态单体结合，并且其本身也可聚集。因而PEMX既是各淀粉样蛋白过渡态单体上的抗原表位，同时也是聚集时的结合位点。
实施例7：PEMX抗体体外抑制淀粉样蛋白的聚集
1)将国外购买的Ab42、amylin、a-synuclein以六氟异丙醇（HFIP）溶解至1 mg/ml，室温超声波处理10 min，分装到epidorf管中，与真空中挥发HFIP，然后于-20 °C保存。用前将HFIP处理过的各蛋白在室温放置20 min，然后加入二甲基亚砜（DMSO），使各蛋白浓度为5 mg/ml，然后以0.02 M pH 7.4的PBS缓冲液进行稀释至所需浓度。PrP、lysozyme则直接用0.02 M pH 7.4 PBS制备到所需浓度。
2）将PEMX抗体溶解于0.02 M pH 7.4的PBS缓冲液中，然后加入到Ab42、PrP、amylin、a-synuclein、lysozym溶液中（lysozyme为pH 2.5的醋酸缓冲液，其余样品为pH 7.4的PBS缓冲液），使各蛋白的终浓度分别为10、200、20、40、200 μM。各蛋白与PEMX抗体的摩尔比分别如图6所示。以不加PEMX抗体的蛋白溶液作为对照。将Ab42、PrP、amylin、a-synuclein、lysozym于37 °C（lysozyme放置于65 °C环境）分别放置1天、5天、5小时、4天和6天。
3）将硫黄素(ThT)溶解在pH 6.5、50 mM的磷酸盐缓冲液使其浓度为5 mM。将孵育后的样品20 ml加入到含有180 ml ThT溶液的黑色酶标板中。混匀后在多功能酶标仪上以450 nm激发波长和482 nm的发射波长测定ThT的荧光强度。将各样品的荧光强度减去ThT本身的背景荧光。图7所示，加入PEMX抗体后的蛋白荧光强度显著低于蛋白自身的对照。由于ThT是与淀粉样蛋白聚集后的聚集物中的b-片层结合后才可激发出荧光，荧光越强，表明淀粉样蛋白聚集越多。因此，PEMX抗体可明显抑制各淀粉样蛋白的聚集（图6A、B、C、D、E分别表示Ab42、amylin、a-synuclein、lysozyme、PrP在有和无PEMX抗体时的荧光测定结果）（与单独的淀粉样蛋白对照相比，Ô，P<0.05；#，P<0.01）。
实施例8： PEMX抗体抑制淀粉样蛋白的细胞毒性
用含10％胎牛血清的培养基（MEM）将SH-SY5Y细胞配成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔体积100 μL。细胞于37 °C培养24小时，培养箱CO2浓度为5%。每孔加入样品（各淀粉样蛋白与PEMX抗体的混合物，淀粉样蛋白对照及PBS对照），Ab42、PrP、amylin、a-synuclein、lysozyme蛋白的终浓度分别为2、200、5、2、20 μM，PEMX抗体的终浓度为10、60、10、5、200 μM。细胞继续培养48小时后，每孔加MTT溶液（5 mg/mL) 10μL，37°C孵育3小时，终止培养，每孔加100 μL晶体溶解液(10%SDS和5%异丁醇溶解在0.01 M HCL中)，37°C孵育过夜，使结晶物充分溶解。在多功能酶联免疫检测仪上以570nm波长测定各孔光吸收值。以样品的吸光度除以不加样品的细胞的吸光度作为细胞的活性指标，并分析样品之间的差异显著情况（与各淀粉样蛋白对照相比，Ô，P<0.05；#，P<0.01），结果表明，PEMX抗体能够明显抑制Ab42、PrP、amylin、a-synuclein、lysozyme的细胞毒性（图8）。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1. 同时结合多种淀粉样蛋白单体的多肽，其特征在于，其氨基酸序列为：Cys-Trp-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Cys。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽N端用PEG2000修饰。
3.同时结合多种淀粉样蛋白单体的多肽，其特征在于，其氨基酸序列为：Cys-Trp-His-Thr-Ala-Thr-Arg-Ser-Cys。
4.同时结合多种淀粉样蛋白单体的多肽，其特征在于，其氨基酸序列为：Cys-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Ser-Cys。
5.同时结合多种淀粉样蛋白单体的多肽，其特征在于，其氨基酸序列为：Cys-Trp-His-Thr-Asp-Thr-Arg-Gly-Ser-Cys。
6.根据权利要求1-5任一项所述多肽应用于制备淀粉样蛋白过渡态单体抑制剂。
7、 根据权利要求1-5任一项所述多肽应用于制备特异结合淀粉样蛋白过渡态单体抗体。
8、 根据权利要求1-5任一项所述多肽应用于制备治疗淀粉样蛋白疾病疫苗。
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