CN109364270B - 一种具有寡聚体特异性的核磁造影剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种具有寡聚体特异性的核磁造影剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种具有寡聚体特异性的核磁造影剂及其制备方法与应用，所述具有寡聚体特异性的核磁造影剂包括四氧化三铁磁纳米颗粒与单链抗体，所述四氧化三铁磁纳米颗粒被包覆于聚乙二醇二羧酸内，所述单链抗体连接于聚乙二醇二羧酸外表面上，通过本发明制备方法制备得到的具有寡聚体特异性的核磁造影剂，可以穿透血脑屏障，识别并可与多种脑部寡聚体结合，特异性好，稳定性高，生物相容性好，并且具有良好的弛豫性能，减少寡聚体毒性，在制备或诊断淀粉样蛋白疾病的制剂中具有良好的应用前景与较高的应用价值。

Description

一种具有寡聚体特异性的核磁造影剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物材料领域，涉及一种核磁造影剂及其制备方法与应用，尤其涉及一种具有寡聚体特异性的核磁造影剂及其制备方法与应用。
背景技术
淀粉样蛋白疾病(Amyloidoses)是指一类由淀粉样蛋白聚集所引起的疾病。目前，该类疾病大概有40多种，其中主要包括阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s Disease,AD)、帕金森氏病(Parkinson’s Disease,PD)、亨廷顿病(Huntington’s disease,HD)、肌萎缩性侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis/Lou Gehrig’s disease,ALS)和Prion蛋白相关疾病等神经退行性疾病以及2型糖尿病、溶菌酶和轻链沉积引起的有关疾病，这些疾病已严重危害人类的身体健康和生活质量。随着社会逐渐步入老龄化，由淀粉样蛋白引起的神经退行性疾病的发病率不断攀升，已给社会和家庭带来极大负担，而这类疾病早期诊断困难，也无有效的治疗措施。淀粉样蛋白可聚集成寡聚体、前纤维和成熟的纤维。大量的研究表明，由淀粉样蛋白聚集形成的寡聚体是淀粉样蛋白疾病发生发展的主要因素。因而，寡聚体可作为该类疾病诊断的检测靶点。
淀粉样蛋白质单体本身无毒性或毒性很小，但它们可聚集成有毒性的寡聚物而引起一系列神经退行性疾病。阿尔茨海默病中的β淀粉样蛋白(Aβ)，帕金森病中的突触核蛋白(α-synuclein)和亨廷顿舞蹈症中的多聚谷氨酰胺(polyQ) 等引起淀粉样蛋白疾病的这些淀粉样蛋白虽然氨基酸一级序列不同，但他们聚集后却可形成某些相似的空间立体结构。
目前，临床上对于神经退行性淀粉样蛋白疾病的诊断主要依赖认知能力和运动机能等神经症状的检测以及正电子发射断层(PET)和核磁共振(MRI)技术对脑组织进行成像。虽然对体液如脑脊液、血液、唾液等的检测已有大量报道，但由于检测结果受影响的因素多，误差大，尚未成为这类疾病临床诊断的标准。MRI是随着电脑技术和超导体技术的发展而迅速发展起来的一种生物磁学核自旋成像技术，也称为磁共振成像。相比较于其他的成像手段，MRI具有明显的优势，MRI对软组织有极好的分辨力；成像可选参数多，多个成像参数为诊断提供丰富的信息；MRI对人体没有电离辐射损伤；MRI检测方便，价格低。随着人们对于MRI医学成像技术分辨率的要求越来越高，这时造影剂的选择就变得异常重要了。FDA批准用于CNS磁共振成像的7个GBCA如下： Magnevist(1988年)、Prohance(1992年)、OmniScan(1993年)、Optimark(1999 年)、Multihance(2004年)和Gadavist(2011年)，Dotarem(多它灵，gadoterate meglumine，钆特酸葡胺，2013年)。第一代磁性造影剂主要是为Gd元素为主的多元配合物，但结果表明，Gd造影剂具有严重的肾脏毒性和副作用，所有的GBCA都会附带肾源性系统性纤维化(NSF)风险增高的黑框警告，这是一种罕见且严重的肾脏疾病，该疾病可引起疼痛和皮肤增厚，并导致内脏器官的纤维化。目前最有前景的MRI造影剂就是超顺磁性氧化铁纳米颗粒 (Superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)。作为核磁共振成像的常用造影剂，SPIONs具有较高的磁弛豫性，可以明显缩短T2弛豫时间，使T2权重像效果明显，使其呈灰暗的低信号，易与其它组织的信号区分开，近年来被广泛用于磁共振成像。磁性四氧化三铁纳米粒子具有饱和磁化强度高，粒径分布小，比表面积大，良好的生物相容性等特点，引起了人们极大关注。
四氧化三铁通过功能化修饰后，表面带有PEG-COOH，然后与淀粉样蛋白寡聚体特异性抗体W20偶联，制备成W20-SPIONs。将W20-SPIONs静脉注射后到小鼠后，通过核磁成像仪来追踪多种淀粉样蛋白疾病中可被W20识别的淀粉样蛋白寡聚体，磁性Fe纳米粒子在正常和异常组织中的浓度不同，能显著增加对比成像效果，从而通过病理位置的不同来区分不同的疾病因。W20-SPIONs 制剂在神经退行性疾病的早期诊断方面具有重要意义和实用价值。
CN102430130A公开了一种医药用改性葡聚糖包覆磁性纳米颗粒复合材料及其制备方法，其利用溶剂热条件反应得到四氧化三铁纳米颗粒，但是其诊断效果不好，诊断特异性不高，不具备良好的弛豫性能。
因此，开发出一种高效诊断由多种淀粉样蛋白引起的神经退行性疾病、具有良好弛豫性能的纳米颗粒，具有重要意义与实用价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有寡聚体特异性的核磁造影剂及其制备方法与应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种具有寡聚体特异性的核磁造影剂，所述具有寡聚体特异性的核磁造影剂包括四氧化三铁磁纳米颗粒与单链抗体，所述四氧化三铁磁纳米颗粒被包覆于聚乙二醇二羧酸内，所述单链抗体连接于聚乙二醇二羧酸外表面上。
在本发明中，具有寡聚体特异性的核磁造影剂可以穿透血脑屏障，与脑内相应病理部位的寡聚体特异性结合，一次核磁检查，即可同时排除其它几种相关疾病，同时也确定为某种疾病；该具有寡聚体特异性的核磁造影剂颗粒分布均匀，特异性好，稳定性高，生物相容性好，并且具有良好的弛豫性能，寡聚体毒性低，副作用小，在制备或诊断淀粉样蛋白疾病的制剂中具有良好的应用前景与较高的应用价值。
在本发明中，四氧化三铁磁纳米颗粒属于超顺磁性氧化铁纳米颗粒(Superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)的一种，可以明显缩短 T2弛豫时间，使T2权重像效果明显，使其呈灰暗的低信号，易与其它组织的信号区分开，并且具有饱和磁化强度高，粒径分布小，比表面积大，生物相容性好的诸多优点。
优选地，所述单链抗体为特异性识别淀粉样蛋白寡聚体的单链可变区抗体(single chain antibody fragment，scFv)。
在本发明中，单链抗体为特异性识别淀粉样蛋白寡聚体的单链可变区抗体 W20。
单链抗体是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成。scFv能够较好地保留完整抗体对抗原的亲和活性，并具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。
另一方面，本发明提供一种具有寡聚体特异性的核磁造影剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将聚乙二醇二羧酸包覆的四氧化三铁磁纳米颗粒置于缓冲液中，第一次离心，而后加入偶联剂进行反应，第二次离心后得到纳米颗粒混合溶液；
(2)将单链抗体加入到步骤(1)中的磁纳米颗粒混合溶液中，进行反应，经离心得到所述具有寡聚体特异性的核磁造影剂。
优选地，步骤(1)中所述缓冲液为PBS缓冲液。
优选地，所述缓冲液的pH为7.0～7.6，例如可以是7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、 7.5或7.6。
优选地，在步骤(1)中，相对于1mg的四氧化三铁纳米颗粒，加入所述 PBS缓冲液的体积为1～2mL，例如可以是1mL、1.1mL、1.2mL、1.3mL、1.5 mL、1.7mL、1.8mL或2mL。
优选地，步骤(1)中所述第一次离心的转速为8000～12000rpm，例如可以是8000rpm、9000rpm、10000rpm、11000rpm或12000rpm。
优选地，步骤(1)中所述第一次离心的时间为8～12min，例如可以是8min、 9min、10min、11min或12min。
优选地，步骤(1)中所述偶联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和氮-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)。
优选地，相对于1mg的四氧化三铁纳米颗粒，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔量为1.5～2.5mol，例如可以是1.5mol、1.7mol、1.9 mol、2.1mol、2.4mol、2.5mol。
优选地，相对于1mol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，加入氮-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔量为2～3mol，例如可以是2mol、2.2mol、2.4mol、 2.7mol、2.8mol或3mol。
优选地，步骤(1)中所述反应的时间为15～20min，例如可以是15min、 17min、18min、19min或20min。
优选地，步骤(1)中所述第二次离心的转速为8000～12000rpm，例如可以是8000rpm、9000rpm、10000rpm、11000rpm或12000rpm。
优选地，步骤(1)中所述第二次离心的时间为8～12min，例如可以是8min、 9min、10min、11min或12min。
优选地，步骤(2)中相对于1mg单链抗体，加入到所述磁纳米颗粒混合溶液为1.5～2mL，例如可以是1.5mL、1.7mL、1.8mL、1.9mL或2.0mL。
优选地，步骤(2)中所述反应的时间为12～18小时，例如可以是12小时、 13小时、14小时、15小时、16小时、17小时或18小时。
优选地，步骤(2)中所述反应的温度为2～6℃，例如可以是2℃、3℃、4℃、 5℃或6℃。
优选地，步骤(2)中所述离心的转速为22000rpm～26000rpm，例如可以是22000rpm、23000rpm、24000rpm、25000rpm或26000rpm。
优选地，步骤(2)中所述离心的次数为3～5次，例如可以是3次、4次或 5次。
优选地，步骤(2)中所述离心的时间为每次1小时。
本发明提供一种如上所述的具有寡聚体特异性的核磁造影剂在制备治疗或诊断淀粉样蛋白疾病的制剂中的应用。
在本发明中，淀粉样蛋白疾病为阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、Prion蛋白相关的神经退行性疾病、2型糖尿病、溶菌酶引起的有关疾病或轻链沉积引起的有关淀粉样蛋白疾病中的任意一种。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
具有寡聚体特异性的核磁造影剂可以穿透血脑屏障，与脑内相应病理部位的寡聚体特异性结合，一次核磁检查，即可同时排除其它几种相关疾病，同时也可确定具体为哪一种疾病；该具有寡聚体特异性的核磁造影剂颗粒分布均匀，特异性好，稳定性高，生物相容性好，并且具有良好的弛豫性能，寡聚体毒性低，副作用小，在制备或诊断淀粉样蛋白疾病的制剂中具有良好的应用前景与较高的应用价值。
附图说明
图1是本发明实施例1-3制备具有寡聚体特异性的核磁造影剂的过程与制备得到的W20-SPION的示意图。
图2A是本发明实施例4透射电子显微镜观察的SPION电镜图(标尺50 μm)。
图2B是本发明实施例4透射电子显微镜观察的W20-SPION电镜图(标尺 50μm)。
图3A是本发明实施例4中的SPION粒径分布统计图。
图3B是本发明实施例4中的W20-SPION粒径分布统计图。
图4A是本发明实施例4中的SPION水合直径曲线图。
图4B是本发明实施例4中的W20-SPION水合直径曲线图。
图5A是本发明实施例5中W20-SPION在10mM PBS放置6个月的效果图。
图5B是本发明实施例5中W20-SPION在10mM PBS放置6个月的透射电镜图。
图5C是本发明实施例5中W20-SPION在10mM PBS放置6个月的粒径分布图。
图5D是本发明实施例5中W20-SPION在10mM PBS放置6个月的水合直径图。
图5E是本发明实施例5中以ELISA检测W20-SPION颗粒中抗体活性及 SPION颗粒活性曲线图。
图6A是本发明实施例6中W20-SPION与SPION通过小核磁共振仪检测弛豫时间图。
图6B是本发明实施例6中W20-SPION与SPION通过7T核磁共振成像图。
图6C是本发明实施例6中W20-SPION与SPION细胞共孵育MRI成像图。
图7是本发明实施例7中Dot-blot检测W20-SPION中W20抗体的显影曝光图。
图8A是发明实施例8中Dot-blot检测3F-SPION中W20抗体与寡聚体结合显影曝光图。
图8B是发明实施例8中组织免疫化学检测W20-SPION中抗体与小鼠脑内寡聚体结合的免疫荧光图。
图9是本发明实施例9中W20-SPION与SPION穿透血脑屏障的分布情况检测荧光显微图(标尺20μm)。
图10A是本发明实施例10中PBS对照组SH-SY5Y细胞电镜图(标尺2μm)。
图10B是本发明实施例10中W20-SPION在SH-SY5Y细胞中分布电镜图 (标尺2μm)。
图11A是本发明实施例11中W20-SPION与Aβ寡聚体共孵育后在BV2细胞中的共定位的免疫荧光染色。
图11B是本发明实施例11中W20-SPION与α-synuclein寡聚体共孵育后在 BV2细胞中的共定位的免疫荧光染色。
图12是本发明实施例12中W20-SPION降低寡聚体细胞毒性测试图。
图13A是本发明实施例13中W20-SPION与SPION在小鼠体内成像分布图。
图13B是本发明实施例13中W20-SPION与SPION在小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑中成像图。
图14A是本发明实施例14中AD小鼠尾静脉注射W20-SPION脑部核磁成像图。
图14B是本发明实施例14中C57小鼠尾静脉注射W20-SPION脑部核磁成像图。
图15是本发明实施例14中W20-SPION、SPION及野生型与AD鼠海马区的淀粉样蛋白寡聚体结合脑部核磁成像图。
图16是本发明实施例14中W20-SPION、SPION及野生型与HD鼠纹状体区的mHTT蛋白寡聚体结合脑部核磁成像图。
图17是本发明实施例14中W20-SPION、SPION及野生型与PD鼠脑干区的α-synuclein蛋白寡聚体结合脑部核磁成像图。
图18A是本发明实施例15中SH-SY5Y细胞在W20-SPION与SPION溶液中细胞存活率测定图。
图18B是本发明实施例15中BV2细胞在W20-SPION与SPION溶液中细胞存活率测定图。
图18C是本发明实施例15中b.End3细胞在W20-SPION与SPION溶液中细胞存活率测定图。
图19是本发明实施例15中W20-SPION与SPION体内毒性检测图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的PBS缓冲液PH值为7.4的缓冲液(配方为：9g NaCl，5.73 gNa2HPO4·12H2O，0.62g NaH2PO4·2H20，用水配成1升，调pH为7.4)。
2×TY培养基：将8g Typtone，5g Yeast Extract，2g氯化钠溶于500mL 水中，然后高温高压灭菌，冷至室温备用。
5×SDS-电泳缓冲液：称取15.1g Tris，94.0g甘氨酸(Glycine)，5.0g SDS，用800mL蒸馏水或去离子水溶解，充分搅拌溶解，定容至1000mL，室温保存；
转膜缓冲液:甘氨酸2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，适量去离子水溶解后，甲醇200mL，加去离子水至1000mL。
下述实施例中的所有实验数据表示为平均值±标准偏差。数据的统计分析采用Prism软件或/和t-test进行，以P<0.05为差异具有统计学意义。
实施例1
本实施例通过以下步骤制备具有寡聚体特异性的核磁造影剂，命名为 W20-SPION：
(1)取聚乙二醇二羧酸包覆的Fe3O4铁磁纳米颗粒1.5mg，置换于1.5mL、 10mM PBS溶液中，10000rpm第一次离心10min；而后加入2.5μmol EDC， 6.25μmol sulfo-NHS，室温放置15min后，10000rpm第二次离心10min。
(2)取特异性识别淀粉样蛋白寡聚体的单链可变区抗体(W20抗体)，9.5 mg/mL，取0.5mg加入至950μL磁纳米颗粒溶液中。置于4度，放置反应12 小时，次日下午，取反应溶液超离，25000rpm，离心3次，每次1小时，去除多余的W20抗体，得到具有寡聚体特异性的核磁造影剂，Fe3O4最终浓度为1 mg/mL。
制备过程示意图及制备得到的具有寡聚体特异性的核磁造影剂W20-SPION 结构图如图1所示。
实施例2
本实施例通过以下步骤制备具有寡聚体特异性的核磁造影剂，命名为 W20-SPION：
(1)取聚乙二醇二羧酸包覆的Fe3O4铁磁纳米颗粒1.5mg，置换于3mL、 10mM PBS溶液中，8000rpm第一次离心12min；而后加入2.25μmol EDC， 4.5μmol sulfo-NHS，室温放置15min后，8000rpm第二次离心12min。
(2)取特异性识别淀粉样蛋白寡聚体的单链可变区抗体(W20抗体)，9.5 mg/mL，取0.5mg加入至750μL磁纳米颗粒溶液中。置于6度，放置反应18 小时，次日下午，取反应溶液超离，22000rpm，离心4次，每次1小时，去除多余的W20抗体，得到具有寡聚体特异性的核磁造影剂，Fe3O4最终浓度为1 mg/mL。
制备过程示意图及制备得到的具有寡聚体特异性的核磁造影剂W20-SPION 结构图如图1所示。
实施例3
本实施例通过以下步骤制备具有寡聚体特异性的核磁造影剂，命名为 W20-SPION：
(1)取聚乙二醇二羧酸包覆的Fe3O4铁磁纳米颗粒1.5mg，置换于1.5mL、 10mM PBS溶液中，12000rpm第一次离心8min；而后加入3.75μmol EDC，11.25 μmol sulfo-NHS，室温放置20min后，12000rpm第二次离心8min。
(2)取特异性识别淀粉样蛋白寡聚体的单链可变区抗体(W20抗体)，9.5 mg/mL，取0.5mg加入至1000μL磁纳米颗粒溶液中。置于2度，放置反应12 小时，次日下午，取反应溶液超离，26000rpm，离心5次，每次1小时，去除多余的W20抗体，得到具有寡聚体特异性的核磁造影剂，Fe3O4最终浓度为1 mg/mL。
制备过程示意图及制备得到的具有寡聚体特异性的核磁造影剂W20-SPION 结构图如图1所示。其中，铁颗粒对照组，命名为SPION：Fe3O4用10mM PBS 稀释至1mg/mL。
实施例4
W20-SPION与SPION的粒径与形态表征
实验方法：将0.01mg/mL W20-SPION与SPION分别溶于10mM PBS溶液中。取2μL滴在铜网上，10min后吸去多余溶液，风干过夜。消磁后用透射电子显微镜(TEM)进行观察。取1mL该两者的溶液分别置于比色皿中，通过粒度仪分析其水合直径分布。
透射电镜观察到的电镜图(图2A、图2B所示)、粒径分布统计图(图3A、图3B所示)与水合直径图(图4A、图4B所示)综合分析得出，SPION直径约为10.8±2.5nm，W20-SPION直径约为11.8±2.8nm。
实施例5
W20-SPION稳定性分析
实验方法：W20-SPION在10mM PBS放置6个月，TEM检测，DLS分析水合直径。将W20-SPION置于10％FBS中，37℃放置，12，24，36，48，60， 72h取样，以ELISA检测颗粒中抗体活性及SPION颗粒活性。
W20-SPION放置6个月的形态图如图5A所示，TEM观察到的电镜图如图 5B所示，利用DLS分析水合直径的分析图如图5C、图5D所示，由以上实验得出的结论为W20-SPION直径约为11.8±3.1nm。
观察颗粒活性图，如图5E所示，W20-SPION在0，12，24，36，48，60， 72h抗体活性为100％，100％，100％，99％，98％，95％，94％。SPION在0， 12，24，36，48，60，72h抗体活性为100％，99％，98％，92％，87％，85％， 84％。
可以得出的结论是，W20-SPION的稳定性更高。
实施例6
W20-SPION与SPION弛豫性能表征
实验方法：不同浓度W20-SPION与SPION通过小核磁共振仪检测弛豫时间，得到的弛豫时间如如图6A所示；不同浓度W20-SPION与SPION通过7T 核磁共振成像，得到的7T核磁共振成像图如图6B所示；SPION与W20-SPION 与SH-SY5Y细胞共孵育4h，MRI成像，MRI成像图如图6C所示。
得出的结论为SPION弛豫率r2约为142.89mM-1S-1，W20-SPION弛豫率r2为128.78mM- 1S-1。
实施例7
W20-SPION中W20抗体成分的确定
实验方法：将2μL浓度为1mg/mL W20-SPION与SPION分别滴在NC膜上，室温晾干，5％牛奶室温封闭1h；HRP-c-myc(9E10)抗体室温孵育1h，1:1000 稀释；0.1％PBST洗膜3次，每次5min。将NC膜、曝光盒、化学发光液带入暗室，然后将NC膜放置在封口膜上，盖上，擦干水分，加上化学发光液，发光反应90s，后盖上上层封口膜，擦干多余的发光液。放入X胶片，曝光。曝光结束后放入显影液中显影3-5min，再放于定影液中定影3-5min。定影结束后用自来水冲洗胶片并烘干。
结果如图7所示，证明W20-SPION中有W20抗体的存在。
实施例8
W20-SPION中抗体的淀粉样蛋白寡聚体特异性检测
实验方法：将淀粉样蛋白单体、寡聚体、纤维滴在NC膜上，晾干，5％牛奶室温封闭1h；用W20-SPIONs室温孵育1h；0.1％PBST洗膜3次，每次5min； HRP-c-myc(9E10)抗体室温孵育1h，1:1000稀释；以0.1％PBST洗膜3次，每次5min。
检测结果如图8A所示，W20-SPION颗粒中的W20抗体可以特异性识别淀粉样蛋白寡聚体，而与单体和纤维不结合。
取AD，PD，HD小鼠脑切片，用含有3％H2O2，0.2％Triton X-10-PBS固定穿透20min，10％NSG封闭45min，用W20-SPION 37℃孵育1h；PBS洗3 次；biotin-c-myc抗体和各自淀粉样蛋白抗体(4G8/SYN-1/EM48/Th S)孵育1h； PBS洗三次；cy3-strep和Alex488-山羊抗鼠孵育1h；PBS洗3次；Hoechst室温染核5min,PBS洗3次。
共聚焦显微镜进行观察，结果如图8B所示，结果表明W20-SPION中的 W20抗体可与体外孵育制备和体内形成的寡聚体特异性结合。
实施例9
W20-SPION与SPION穿透血脑屏障以及在胞内和体内的分布情况检测
实验方法：将b.End3细胞(血脑屏障模型细胞)铺在24孔板中，每孔105个。过夜贴壁后，分别加药W20/W20-SPION/SPION，共孵育2h。将细胞用PBS 洗两遍，4％多聚甲醛固定10min，0.1％Triton X穿透20min。用荧光标记的c-myc 抗体孵育1h；Hoechst染色20min。PBS洗3次，显微镜观察。
实验结果如图9所示，b.End3中有W20-SPION结合的荧光存在存在。表明 W20-SPION与SPION可穿透b.End3细胞。
实施例10
超薄细胞切片观察具有寡聚体特异性的核磁造影剂在SH-SY5Y细胞中的分布
实验方法：取神经细胞系SH-SY5Y细胞以1×105个/mL的密度铺板，在细胞培养皿中过夜贴壁培养，分别加入W20-SPION或PBS在37℃培养箱中共培养4h，收集细胞，用PBS离心洗三次，2.5％戊二醛固定15min，脱水浸透包埋，在显微镜下找到要观察的区域用解剖针在样品块的树脂面上画一个“口”字，使得要观察的区域在正中央，剪去多余的树脂，修块后用细胞超薄切片机制备出厚度为50nm的样品，置于铜网上，在透射电子显微镜下观察。
实验结果如图10A、图10B所示W20-SPION/SPION可以进入SH-SY5Y细胞，并且在胞质内分布，白色箭头为颗粒分布。
实施例11
W20-SPION与寡聚体，BV2细胞共定位
实验方法：取小胶质细胞过夜培养贴壁，分别加入4μM Aβ，4μMα-synuclein，以及SPION与W20-SPION，37℃，CO2培养箱孵育2h。弃上清，PBS洗三次，加入594-anti-c-myc(1:1000)以及淀粉样蛋白抗体(4G8/Syn-1)，37℃孵育1h，加荧光二抗。PBS洗三次，加入Hoechst室温染核15min。PBS洗三次，共聚焦显微镜观察。
实验结果如图11A、图11B所示。表明W20-SPION可与Aβ寡聚体结合，并被小胶质细胞吞噬清除。
实施例12
W20-SPION降低寡聚体细胞毒性测试
实验方法：取SH-SY5Y细胞过夜培养贴壁，分别加入4μM Aβ，以及不同浓度的SPION与W20-SPIOPN，设6个复孔，37℃，CO2培养箱孵育48h。每孔加入10μL MTT用铝箔纸包裹培养板，37℃，CO2培养箱孵育3h。每孔加入 100μL三联缓冲液，继续用铝箔纸包裹培养板，37℃培养箱孵育6h，使结晶物充分溶解。选择570nm波长，在多功能酶标仪上测定各孔光吸收值，减去空白培养基本底后即为最终结果。
实验结果如图12所示。加入4μM Aβ时细胞活性为40％。当同时加入 W20-SPION时，Aβ细胞毒性显著降低，细胞存活性为60％。
实施例13
证明W20-SPION可穿过血脑屏障的体内实验
实验方法：取0.375g甘露醇，加入到2.5mL cy3标记的铁颗粒中，配成15％甘露醇的溶液，于裸鼠尾静脉注射400μL。以小动物活体成像仪在0.25、0.5、1、 2、4、8、12、24h观察小鼠脑内的W20-SPION分布情况。对照组注射等量的四氧化三铁颗粒溶液。对照组为裸鼠尾静脉注射cy3-SPION后不同时间的脑部核磁成像；实验组为裸鼠尾静脉注射cy3-W20-SPION后不同时间的脑部核磁成像；24h后将老鼠处死，取心、肝、脾、肺、肾、脑进行成像。
实验结果，观察小鼠脑内的W20-SPION分布情况图如图13A所示、心、肝、脾、肺、肾、脑成像图如图13B所示，表明铁磁纳米颗粒可以通过血脑屏障。
实施例14
W20-SPION作为诊断多种淀粉样蛋白疾病的试剂的应用实验
实验动物：将10月龄大的雄性AD小鼠(华阜康生物公司，中国)、PD小鼠、HD小鼠随机分为实验组和对照组。同时以8只年龄相同的雄性C57BL/6 小鼠作为对照组(华阜康生物公司，中国)。
将上述小鼠进行如下处理：
取0.375g甘露醇，加入2.5mL铁颗粒中，配成15％甘露醇的溶液，尾静脉注射400μL,12h后进行核磁诊断(MRI)。测试参数如下：重复时间(TR, repetition time)＝80ms，回波时间(TE,echo time)＝12.3ms，BW＝75kHz；FA＝20°。 AD、PD、HD对照组和C57对照组注射等量的四氧化三铁颗粒溶液。
开展如下实验测定：
(1)W20-SPION可以穿透血脑屏障的测定
尾静脉注射400μL含有2.5mg/mL W20-SPION和15％甘露醇的制剂，分别于0.25，2，4，12，24h时间点进行脑部核磁成像检测。
实验组为AD小鼠尾静脉注射W20-SPION后不同时间的脑部核磁成像，脑部核磁成像图如图14A所示；对照组C57小鼠尾静脉注射W20-SPION后的不同时间脑部核磁成像，脑部核磁成像图如图14B所示。
(2)W20-SPION可以与AD鼠海马区的淀粉样蛋白寡聚体结合测定
实验组：取10月龄的AD鼠，通过尾静脉注射400μL含有2.5mg/mL W20-SPION和15％甘露醇的制剂，12小时后进行脑部核磁成像。
对照组：取野生型(WT)鼠，通过尾静脉注射400μL含有2.5mg/mL W20-SPION和15％甘露醇的制剂，12小时后进行脑部核磁成像。
实验结果如图15所示。结果表明偶联寡聚体特异性抗体的铁磁纳米颗粒 W20-SPION，可与AD鼠脑部海马区的淀粉样蛋白寡聚体特异性结合，而野生型对照组和注射SPION对照组的相应部位未见显影，从而达到诊断区分的效果。
(3)W20-SPION可以与HD鼠纹状体区的mHTT蛋白寡聚体结合的测定
实验组：取10周龄的HD小鼠，通过尾静脉注射400μL含有2.5mg/mL W20-SPION和15％甘露醇的制剂，12小时后进行脑部核磁成像。
对照组：取WT鼠，通过尾静脉注射400μL含有2.5mg/mL W20-SPION和 15％甘露醇的制剂，12小时后进行脑部核磁成像。
实验结果如图16所示。结果表明偶联寡聚体特异性抗体的铁磁纳米颗粒 W20-SPION，可与HD鼠脑部纹状体中淀粉样蛋白寡聚体特异性结合，而野生型对照组和注射SPION对照组的相应部位未见显影，从而达到诊断区分的效果。
(4)W20-SPION可以与PD鼠脑干区的α-synuclein蛋白寡聚体结合测定
实验组：取10月龄的PD鼠，通过尾静脉注射400μL含有2.5mg/mL W20-SPION粒和15％甘露醇的制剂，12小时后进行脑部核磁成像。
对照组：取WT鼠，通过尾静脉注射400μL含有2.5mg/mL W20-SPION和 15％甘露醇的制剂，12小时后进行脑部核磁成像。
实验结果如图17所示。结果表明偶联寡聚体特异性抗体的铁磁纳米颗粒 W20-SPION，可与PD小鼠脑干部位的淀粉样蛋白寡聚体特异性结合，而野生型对照组和注射SPION对照组的相应部位未见显影，从而达到诊断区分的效果。
实施例15
W20-SPION与SPION细胞毒性以及体内毒性测定
(1)应用MTT方法对W20-SPION与SPION进行细胞毒性检测。
实验方法：将SH-SY5Y/BV2/b.End3细胞在96孔板中过夜培养贴壁，分别加入不同浓度的SPION与W20-SPIOPN，设6个复孔，于37℃，CO2培养箱孵育48h。每孔加入10μL MTT，用铝箔纸包裹培养板，于37℃，CO2培养箱孵育3h。每孔加入100μL三联缓冲液，继续用铝箔纸包裹培养板，于37℃培养箱孵育6h，使结晶物充分溶解。选择570nm波长，在多功能酶标仪上测定各孔光吸收值，减去空白培养基本底后即为最终结果。
结果显示，在1，10，100，1000，2000μM的W20-SPION与SPION溶液中，SH-SY5Y/BV2细胞存活率均大于等于85％，存活率图如图18A、图18B所示；b.End3细胞存活率均大于等于70％，存活率图如图18C所示。表明 W20-SPION的细胞毒性较小，安全性较高。
(2)W20-SPION与SPION体内毒性检测
实验方法：对C57BL/6小鼠进行尾静脉注射400μL含有2.5mg/mL靶向性铁磁纳米颗粒和15％甘露醇的制剂，取0.375g甘露醇。7天后，处死小鼠，取心，肝，脾，肺，肾，脑，固定包埋切片，然后进行H&E染色。具体方法如下，将切片依次浸没于下列溶液中，100％的二甲苯溶液中15min，100％乙醇中5 min，95％的乙醇中5min，70％的乙醇中5min，用超纯水清洗三次，苏木精染色10min，超纯水清洗1min，0.5％伊红液染色1-3min，蒸馏水稍洗30s，70％的乙醇中5min，95％乙醇中5min，100％乙醇I中5min，100％乙醇II中5min，二甲苯I中15min，二甲苯II中15min，中性树胶固封。显微镜观察。
实验结果如图19所示。动物组织和器官心，肝，脾，肺，肾，脑，未见异常，表明W20-SPION与SPION体内毒性较小，安全性较好。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的具有寡聚体特异性的核磁造影剂及其制备方法与应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (21)

1.一种具有寡聚体特异性的核磁造影剂，其特征在于，所述具有寡聚体特异性的核磁造影剂包括四氧化三铁磁纳米颗粒与单链抗体，所述四氧化三铁磁纳米颗粒被包覆于聚乙二醇二羧酸内，所述单链抗体连接于聚乙二醇二羧酸外表面上；
所述单链抗体为特异性识别淀粉样蛋白寡聚体的单链可变区抗体W20。
2.一种如权利要求1所述的具有寡聚体特异性的核磁造影剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将聚乙二醇二羧酸包覆的四氧化三铁磁纳米颗粒置于缓冲液中，加入EDC/NHS活化，第一次离心，而后加入偶联剂进行反应，第二次离心后得到纳米颗粒混合溶液；
(2)将单链抗体加入到步骤(1)中的磁纳米颗粒混合溶液中，进行反应，经离心得到所述具有寡聚体特异性的核磁造影剂。
3.根据权利要求2所述的具有寡聚体特异性的核磁造影剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述缓冲液为PBS缓冲液。
4.根据权利要求2所述的具有寡聚体特异性的核磁造影剂的制备方法，其特征在于，所述缓冲液的pH为7.0～7.6。
5.根据权利要求3所述的具有寡聚体特异性的核磁造影剂的制备方法，其特征在于，相对于1mg的四氧化三铁纳米颗粒，加入所述PBS缓冲液的体积为1～2mL。
6.根据权利要求2所述的具有寡聚体特异性的核磁造影剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述第一次离心的转速为8000～12000rpm。
7.根据权利要求2所述的具有寡聚体特异性的核磁造影剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述第一次离心的时间为8～12min。
8.根据权利要求2所述的具有寡聚体特异性的核磁造影剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述偶联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和氮-羟基硫代琥珀酰亚胺。
9.根据权利要求8所述的具有寡聚体特异性的核磁造影剂的制备方法，其特征在于，相对于1mg的四氧化三铁纳米颗粒，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔量为1.5～2.5mol。
10.根据权利要求8所述的具有寡聚体特异性的核磁造影剂的制备方法，其特征在于，相对于1mol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，加入氮-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔量为2～3mol。
11.根据权利要求2所述的具有寡聚体特异性的核磁造影剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述反应的时间为15～20min。
12.根据权利要求2所述的具有寡聚体特异性的核磁造影剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述第二次离心的转速为8000～12000rpm。
13.根据权利要求2所述的具有寡聚体特异性的核磁造影剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述第二次离心的时间为8～12min。
14.根据权利要求2所述的具有寡聚体特异性的核磁造影剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中相对于1mg单链抗体，加入到所述磁纳米颗粒混合溶液体积为1.5～2mL。
15.根据权利要求2所述的具有寡聚体特异性的核磁造影剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述反应的时间为12～18小时。
16.根据权利要求2所述的具有寡聚体特异性的核磁造影剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述反应的温度为2～6℃。
17.根据权利要求2所述的具有寡聚体特异性的核磁造影剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述离心的转速为22000rpm～26000rpm。
18.根据权利要求2所述的具有寡聚体特异性的核磁造影剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述离心的次数为3～5次。
19.根据权利要求2所述的具有寡聚体特异性的核磁造影剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述离心的时间为每次1小时。
20.如权利要求1所述的具有寡聚体特异性的核磁造影剂在制备治疗或诊断淀粉样蛋白疾病的制剂中的应用。
21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述淀粉样蛋白疾病为阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、Prion蛋白相关的神经退行性疾病、2型糖尿病、溶菌酶引起的有关疾病或轻链沉积引起的有关淀粉样蛋白疾病中的任意一种。
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