CN112516334B - 一种edtmp修饰的四氧化三铁纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种edtmp修饰的四氧化三铁纳米颗粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，包括：将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O混合溶解在盐酸溶液中，得到混合液；将所述混合液和水溶液混合进行反应，得到反应液；将所述反应液和EDTMP溶液进行反应，得到EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒。本发明通过修饰的共沉淀法合成IO‑EDTMP纳米粒子，不仅具有良好的胶体稳定性的和生物相容性，而且具有很好的T1和T2弛豫效应，作为造影剂在临床MRI成像诊断领域具有潜在的应用价值。本发明还提供了一种EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒及其应用。

Description

一种EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于成像材料技术领域，尤其涉及一种EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
在生物医学成像技术中，核磁共振成像(Magnetic resonance imaging，MRI)因具有无辐射损伤、非侵入性、可提供良好的深部组织造影和较高的空间分辨率等优点，常用来对生物内脏器官和软组织进行快速检测，已经成为诊断软组织病变尤其是检测肿瘤的最为有效的临床诊断方法之一。MRI是利用人体组织中氢原子核在磁场中受到射频脉冲刺激发生核磁共振现象，产生磁共振信号，并重建出人体处于不同生理状态的组织图像。而且，MRI还可以通过应用合适的造影增强剂，有效地改变病变组织中质子的自旋弛豫时间，从而达到增强病变组织与正常组织图像之间的信号对比度，以更好地显示成像部位的解剖学特征、提高病变组织的清晰度和软组织图像的分辨率。MRI造影剂通常分为纵向弛豫造影剂(T1制剂)和横向弛豫造影剂(T2制剂)。T1制剂是通过水分子中的氢核和顺磁性金属离子直接作用来缩短T1，从而增强信号，图像为亮显影。T1制剂主要是Gd基配合物，其具有良好的增强效果。但由于其可通过尿液快速排泄，循环时间较短，限制其在需要长扫描时间的高分辨率成像中的应用，且其临床注射剂量较大，可能导致肾功能受损患者的肾源性全身纤维化。T2制剂是通过对外部局部磁性环境的不均匀性进行干扰，使邻近氢质子在弛豫中很快产生相来缩短T2，从而减弱信号，图像为暗显影。T2制剂主要是超顺磁四氧化三铁为代表的金属铁氧化物纳米粒子，其具有独特的磁性能、良好的生物相容性、使用剂量低及信号强等优点。然而，其固有的暗信号可能与钙化、金属沉积和出血引起的信号混淆，从而误导临床诊断。在临床诊断治疗时，多种成像方式的组合可以产生互补的诊断信息，并提供优于单一方式的协同优势。其中，MRI的T1-T2双模成像技术可通过高组织分辨率的T1成像和对病灶检测具有高可行性的T2成像的有效对比作用，提供高精度的诊断信息。因此，制备具有高灵敏度的双重显影剂以克服单一显影剂的缺点是非常可取且有必要的。
为了改进小分子钆螯合物或磁性铁氧化物作为MRI造影剂的局限，研究人员把铁氧化物为核、钆基配合物为壳制备具核壳结构的双重造影剂；或是在制备四氧化三铁时，用部分Gd元素代替Fe元素合成Gd掺杂的四氧化三铁(GdIO)，使其同时具备T1和T2成像的功能。然而，这些体系仍然存在一定的局限性，例如，对于核壳结构的显影剂，由于T2材料的强磁耦合和高磁化率效应，超顺磁纳米颗粒产生的磁场干扰了氧化铁纳米颗粒外顺磁物质的弛豫过程，导致T1信号下降。而GdIO多是由热分解方法合成，反应温度较高，为提高其亲水性后续还需配体交换，过程繁琐。因此，开发一种合成简单，且具有高性能(高弛豫值)的核磁共振成像造影剂具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒及其制备方法和应用，本发明提供的EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒作为高效显影剂具有较好的性能。
本发明提供了一种EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，包括：
将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O混合溶解在盐酸溶液中，得到混合液；
将所述混合液和水溶液混合进行反应，得到反应液；
将所述反应液和EDTMP溶液进行反应，得到EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒。
优选的，所述FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的用量比例使Fe3+与Fe2+的摩尔比为1：(0.4～0.8)；
所述反应液和EDTMP溶液的用量比例使Fe3+和EDTMP的摩尔比为1：(0.1～0.5)。
优选的，所述盐酸溶液的浓度为0.5～1.5mol/L。
优选的，所述水溶液的制备方法包括：
向水中充入氮气，然后进行加热；
所述充入氮气的时间为20～40min，所述加热的温度为70～100℃。
优选的，所述混合液和水溶液反应的时间为30～60min。
优选的，所述EDTMP溶液的制备方法包括：
将EDTMP溶于氨水溶液中，得到EDTMP溶液；
所述氨水溶液的质量浓度为3～5％。
优选的，所述混合液和水溶液进行反应的pH值为8～11；
所述反应液和EDTMP溶液进行反应的pH值为5～9。
本发明提供了一种上述技术方案所述的方法制备得到的EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒。
本发明提供了一种高效显影剂，包括上述技术方案所述的EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒。
本发明提供了一种上述技术方案所述的EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒在磁共振成像领域中的应用。
本发明采用简便的一锅法合成乙二胺四亚甲基磷酸(EDTMP)修饰的四氧化三铁纳米粒子(IO-EDTMP)，使其同时具备T1、T2成像的功能。EDTMP是一种氨基多膦酸螯合剂，具有很强的螯合金属离子、无毒、化学稳定性好、易于修饰等多种优势，以其作为纳米粒子的表面配体不仅能使四氧化三铁粒子表面带上较低的负电荷，提高粒子的水溶液分散性以增加水在磁核周围的分布，赋予其T1、T2成像的能力，而且其表面磷酸可使纳米粒子具有良好的生物相容性和生物活性，可为进一步的医学成像应用提供保障。
本发明通过修饰的共沉淀法合成的IO-EDTMP纳米粒子，不仅具有良好的胶体稳定性的和生物相容性，而且具有很好的T1和T2弛豫效应，作为造影剂在临床MRI成像诊断领域具有潜在的应用价值。
本发明提供了一种EDTMP修饰四氧化三铁双模态造影剂的制备方法，该方法工艺简单，反应条件温和，粒径分布均匀，易于实施，制备的IO-EDTMP纳米颗粒不仅具有良好的生物相容性，而且具有很好的T1和T2弛豫增强效果，在MRI成像诊断领域具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为本发明比较例1制备的产品形貌检测结果；
图2为本发明实施例1制备的产品形貌检测结果；
图3为本发明比较例1制备的产品粒径分布检测结果；
图4为本发明实施例1制备的产品粒径分布检测结果；
图5为本发明实施例1和比较例1制备的产品稳定性检测结果；
图6为本发明实施例1和比较例1制备的产品T1加权成像和T2加权成像；
图7为本发明实施例1制备的产品纵向弛豫速率1/T1曲线；
图8为本发明实施例1和比较例1制备的产品的横向弛豫速率1/T2曲线；
图9为本发明实施例1和比较例1制备的产品生物相容性检测结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员经改进或润饰的所有其它实例，都属于本发明保护的范围。应理解，本发明实施例仅用于说明本发明的技术效果，而非用于限制本发明的保护范围。实施例中，所用方法如无特别说明，均为常规方法。
本发明提供了一种EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，包括：
将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O混合溶解在盐酸溶液中，得到混合液；
将所述混合液和水溶液混合进行反应，得到反应液；
将所述反应液和EDTMP溶液进行反应，得到EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒。
在本发明中，所述FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的用量比例优选使Fe3+与Fe2+的摩尔比为1：(0.4～0.8)，更优选为1：(0.5～0.7)，最优选为1:0.6。
在本发明中，所述盐酸溶液优选为盐酸水溶液，所述盐酸溶液的浓度优选为0.5～1.5mol/L，更优选为1mol/L。本发明对所述盐酸溶液的用量没有特殊的限制，本领域技术人员可根据实际情况选择合适用量的盐酸溶液，优选为1～3mL，更优选为2mL。
在本发明中，所述水溶液的制备方法优选包括：
向水中充入氮气以去除水中的氧气，然后进行加热。
在本发明中，所述充入氮气的时间优选为20～40min，更优选为25～35min，最优选为30min；所述加热的温度优选为70～100℃，更优选为80～90℃。
在本发明中，所述混合液和水溶液混合优选在氮气的保护下进行混合，优选在机械搅拌的条件下进行混合，所述混合的方法优选包括：
将所述混合液注入到水溶液中。
在本发明中，所述混合液和水溶液进行反应的pH值优选为8～11，更优选为9～10，优选向所述混合液和水溶液的反应体系中加入氨水溶液调节反应的pH值，所述氨水溶液优选氨水的水溶液，所述氨水溶液的质量浓度优选为20～30％，更优选为25％，所述混合液和水溶液反应的时间优选为30～60min，更优选为35～55min，最优选为40～50min。
在本发明中，所述混合液和水溶液的质量比优选为1：(20～30)，更优选为1：(23～27)，最优选为1:25。
在本发明中，所述EDTMP溶液的制备方法优选包括：
将EDTMP溶于氨水溶液中，得到EDTMP溶液，所述氨水溶液优选为氨水的水溶液，所述氨水溶液的质量浓度优选为3～5％，更优选为4％。
在本发明中，所述EDTMP为乙二胺四亚甲基磷酸。
在本发明中，所述反应液和EDTMP溶液进行反应的pH值优选为5～9，更优选为6～8，最优选为7，优选用盐酸调节反应液和EDTMP进行反应的pH值。
在本发明中，所述反应液和EDTMP溶液的用量优选使Fe3+和EDTMP的摩尔比为1：(0.1～0.5)，更优选为1：(0.2～0.4)，最优选为1:0.3。
在本发明中，所述反应液和EDTMP溶液反应完成后优选将得到的反应产物冷却后进行水洗、磁铁分离和干燥，得到EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒。
在本发明中，所述冷却优选为自然冷却至室温，所述水洗的次数优选为5次～7次，更优选为6次，所述干燥优选为真空冷冻干燥。
本发明提供了一种上述技术方案所述的方法制备得到的EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒。
本发明提供了一种上述技术方案所述的EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒在磁共振成像领域中的应用，如可作为高效显影剂。
本发明提供了一种高效显影剂，包括上述技术方案所述的EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒。
本发明通过修饰的共沉淀法合成EDTMP修饰的四氧化三铁纳米粒子，其表面修饰层EDTMP提高了其胶体稳定性和生物相容性，使其具备了可同时T1和T2 MRI双模态成像的功能。
本发明采用一锅共沉淀法制备可同时T1和T2 MRI双模态成像的具有胶体稳定性的超小四氧化三铁纳米粒子，其合成方法新颖简单高效，反应条件温和，成本较低，易于推广和应用。IO-EDTMP粒子不仅具有良好的水溶液分散性和生物相容性，还具有弛豫率高、体外磁共振显影增强效果显著的特点，是制备双模式成像的理想纳米诊疗剂。
本发明以下实施例所用原料均为市售商品。
实施例1
首先，在三口烧瓶内加入50mL一次水，充氮气30min以除去水中的氧气，且将水溶液加热至80℃。
将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O按摩尔比(Fe3+：Fe2+＝1：0.52)溶解在适量盐酸(1mol/L，2mL)中；然后，在氮气保护和机械搅拌下，将得到的混合液快速注入到上述水溶液中，然后滴加浓氨水溶液(质量浓度25％，15mL)调pH为9～10，反应40min，得到反应液。
用盐酸调反应液PH为7，适量的EDTMP(Fe3+：EDTMP摩尔比为1：0.3)溶于稀氨水(质量浓度4％，2.5mL)中，加入上述反应液继续反应30min。
反应结束后，自然冷却至室温，然后将反应产物水洗六次，磁铁分离，真空冷冻干燥，得到EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒。
比较例1
首先，在三口烧瓶内加入50mL一次水，充氮气30min以除去水中的氧气，且将水溶液加热至80℃。
将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O按摩尔比(Fe3+：Fe2+＝1:0.52)溶解在适量盐酸(1mol/L，2mL)中；然后，在氮气保护和机械搅拌下，将混合液快速注入到上述水溶液中，然后滴加浓氨水溶液(质量浓度25％,15mL)调pH为9～10，反应40min。
反应结束后，自然冷却至室温，然后将反应产物水洗六次，磁铁分离，真空冷冻干燥，得到表面无配体修饰四氧化三铁材料(IO)。
性能检测
将本发明实施例1制备的IO-EDTMP纳米颗粒和比较例1制备的IO分散在一次水中进行超声，取适量悬浮液滴在碳涂层双联铜网上并室温干燥，然后采用透射电子显微镜(TEM)对样品的形貌和尺寸进行检测，并用NIH Image J软件随机测量100个纳米颗粒的直径对其粒径分布进行评估。检测结果如图1～图4所示，从图1和图2中可看出，利用修饰的共沉淀法制备的IO-EDTMP纳米颗粒与比较例1制备的IO纳米颗粒均为类球形，且样品粒径均为9.6nm左右(图3和图4所示)，说明EDTMP对四氧化三铁的修饰并没有影响纳米粒子的形貌和尺寸。
以一次水检测四氧化三铁纳米颗粒的分散性，将本发明实施例1制备的IO-EDTMP纳米颗粒和比较例1制备的IO按30mg/mL加入一次水中，超声处理30min以使两种纳米粒子充分分散于一次水中。于超声结束后0second，1hour，2days和12months，通过照相对比不同样品在典型的水相中的分散性和稳定性，检测结果如图5所示，图5为超声处理后不同时间点两样品在水相中的分散状态照片，超声处理结束后，即0second时间点时，可见两种纳米颗粒在超声处理下均可以分散；但随着静置时间的延长，两组间出现显著的差异，1hour后，比较例1制备的IO已有明显的沉淀现象发生，这是由于磁颗粒间产生磁相互作用力进而发生磁团聚；经2days后，比较例1制备的IO已经几乎完全沉淀，12months后沉淀情况近似2days。可见本发明实施例1制备的IO-EDTMP纳米颗粒在分散稳定性实验进行至12months时，IO-EDTMP纳米颗粒在水相中仍然保持着良好的分散稳定性，这是因为四氧化三铁表面的EDTMP提高了粒子的亲水性并削弱了磁粒子的团聚作用。分散稳定性试验结果表明，通过EDTMP的改性可以有效的改善IO的表面性质，使其在水相中长期均一稳定分散，为其作为核磁共振显影剂提供了保证。
将本发明实施例1制备的IO-EDTMP复合材料和比较例1制备的IO材料通过电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测试溶液中Fe元素的含量，再在EP管中用一次水配置Fe浓度依次为0,0.0125,0.025,0.05,0.1和0.2mmol/L的水溶液0.5mL，通过T1和T2磁共振成像测定材料在不同Fe浓度下的T1和T2弛豫效应：弛豫测量在1.2T MRI扫描仪上进行(HT-MRSI50-50KY，中国上海)，采用自旋回波序列获取T1加权图像，参数如下:重复时间＝100ms,回波时间＝8.59ms，视场＝35mm×35mm，矩阵＝256×128，层数＝32，层厚＝1mm，翻转角＝90°，激励次数＝3.0；同时采用自旋回波序列获取T2加权图像，参数如下:重复时间＝2000ms,回波时间＝9.02ms，视场＝35mm×35mm，矩阵＝256×128，层数＝32，层厚＝1mm，翻转角＝90°，激励次数＝3.0。
检测结果如图6所示，图6为比较例1和实施例1制备的产品随Fe浓度变化的灰白图和相应的mapping图，从图中的T1加权成像可以看出，随着Fe浓度的增加，IO纳米颗粒(比较例1制备的产品)的信号没有明显变化，而IO-EDTMP纳米颗粒(实施例1制备的产品)的信号逐渐增强，表明EDTMP修饰后的四氧化三铁具备了T1加权成像的功能；从图中的T2加权成像可以看出，随着Fe浓度的增加，IO和IO-EDTMP纳米颗粒的信号均为依次减弱，但相同Fe浓度下，IO-EDTMP纳米颗粒的信号明显弱于IO纳米颗粒，体现了更优的T2加权成像效果。因此，本发明制备的IO-EDTMP纳米颗粒可作为MRI分子影像学诊断中的优良T1信号增强造影剂和T2信号衰减造影剂，而对照材料IO纳米颗粒仅可作为MRI分子影像学诊断中的T2信号衰减造影剂。
取上述制备的不同Fe浓度的水溶液通过1.2T MRI扫描仪测定材料的弛豫时间，采用自旋回波序列测量T1弛豫时间，参数如下:重复时间＝500ms,回波时间＝8.59ms，视场＝35mm×35mm，矩阵＝256×128，层数＝32，层厚＝1mm，翻转角＝90°；同时采用自旋回波序列测量T2弛豫时间，参数如下:重复时间＝400ms,回波时间＝9.02ms，视场＝35mm×35mm，矩阵＝256×128，层数＝32，层厚＝1mm，翻转角＝90°。
检测结果如图7和图8所示，图7、图8均为纳米颗粒随Fe浓度变化的线性拟合图，图7弛豫率测试结果表明IO-EDTMP纳米颗粒(实施例1制备的产品)的T1弛豫时间倒数在Fe浓度范围为0.0125～0.2mmol/L范围内随着铁浓度的增加具有很好的线性关系，并且通过计算可知其r1弛豫率为11.61mM-1s-1；图8弛豫率测试结果表明IO(比较例1制备的产品)和IO-EDTMP纳米颗粒(实施例1制备的产品)的T2弛豫时间倒数随着铁浓度的增加(在0.0125～0.2mmol/L浓度范围内)均具有很好的线性关系，并且通过计算可知IO(比较例1制备的产品)的r2弛豫率为71.78mM-1s-1，而EDTMP修饰后的四氧化三铁(实施例1制备的产品)的r2弛豫率可高达452.38mM-1s-1，是IO弛豫率的6.3倍。因此，本发明制备的IO-EDTMP纳米颗粒可作为优良的双模态造影剂，有望应用于MRI双模态影像诊断。
以小鼠前成骨细胞MC3T3-E1为模型细胞，通过CCK-8法测定细胞的存活率以检测实施例1制备的IO-EDTMP纳米颗粒和比较例1制备的IO纳米颗粒的细胞毒性。将MC3T3-E1细胞接种到96孔板中，接种密度为每孔1×104个细胞。在37℃的CO2培养箱中培养24h后，加入不同粒子浓度的IO-EDTMP和IO的新鲜培养基(浓度分别取25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL)。继续培养24h后，弃去培养上清液，用PBS洗3次，然后加入含10％CCK-8(v/v)的新鲜培养基并继续孵育两个小时，在酶标仪上测定波长450nm处的吸光度值，检测结果如图9所示。从图9可以看出，以未加入纳米颗粒的细胞为对照组，细胞活力为100％。与对照组相比，实施例1制备的IO-EDTMP纳米颗粒从25μg/mL到400μg/mL实验浓度范围内对MC3T3-E1细胞的细胞量没有显著性影响，其细胞活力均在100％左右范围小幅度波动，说明没有明显的细胞毒性。比较例1制备的IO纳米颗粒在25μg/mL到100μg/mL实验浓度范围内对MC3T3-E1细胞的细胞量没有影响，其细胞活力均在100％左右范围小幅度波动。但当IO纳米颗粒浓度升至200μg/mL和400μg/mL时，MC3T3-E1细胞的细胞量明显下降，细胞活力低于100％，IO纳米颗粒在高浓度时体现了低毒性。实验测试结果表明，本发明制备的IO-EDTMP纳米颗粒在高浓度范围内仍具有良好的生物相容性，可为进一步的医学成像应用提供安全保障。
本发明采用简便的一锅法合成乙二胺四亚甲基磷酸(EDTMP)修饰的四氧化三铁纳米粒子，使其同时具备T1、T2成像的功能。EDTMP是一种氨基多膦酸螯合剂，具有很强的螯合金属离子、无毒、化学稳定性好、易于修饰等多种优势，以其作为纳米粒子的表面配体不仅能使四氧化三铁粒子表面带上较低的负电荷，提高粒子的水溶液分散性以增加水在磁核周围的分布，赋予其T1、T2成像的能力，而且其表面磷酸可使纳米粒子具有良好的生物相容性和生物活性，可为进一步的医学成像应用提供保障。
本发明通过修饰的共沉淀法合成的IO-EDTMP纳米粒子，不仅具有良好的胶体稳定性的和生物相容性，而且具有很好的T1和T2弛豫效应，作为造影剂在临床MRI成像诊断领域具有潜在的应用价值。
本发明提供了一种EDTMP修饰四氧化三铁双模态造影剂的制备方法，该方法工艺简单，反应条件温和，粒径分布均匀，易于实施，制备的IO-EDTMP纳米颗粒不仅具有良好的生物相容性，而且具有很好的T1和T2弛豫增强效果，在MRI成像诊断领域具有潜在的应用价值。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒的制备方法，包括：
将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O混合溶解在盐酸溶液中，得到混合液；
将所述混合液和水溶液混合进行反应，得到反应液；
将所述反应液和EDTMP溶液进行反应，得到EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒；
所述水溶液的制备方法包括：
向水中充入氮气，然后进行加热；
所述充入氮气的时间为20~40min，所述加热的温度为70~100℃；
所述EDTMP溶液的制备方法包括：
将EDTMP溶于氨水溶液中，得到EDTMP溶液；
所述氨水溶液的质量浓度为3~5%；
所述混合液和水溶液进行反应的pH值为8~11；
所述反应液和EDTMP溶液进行反应的pH值为5~9；
所述FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的用量比例使Fe3+与Fe2+的摩尔比为1：（0.4~0.8）；
所述反应液和EDTMP溶液的用量比例使Fe3+和EDTMP 的摩尔比为 1：（0.1~0.5）。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述盐酸溶液的浓度为0.5~1.5mol/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合液和水溶液反应的时间为30~60min。
4.一种权利要求1所述的方法制备得到的EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒。
5.一种显影剂，包括权利要求4所述的EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒。
6.一种权利要求4所述的EDTMP修饰的四氧化三铁纳米颗粒在制备磁共振成像试剂中的应用。
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