CN110694080A - 一种微血管重建(治疗性血管新生)靶向的磁共振造影剂制备方法及其应用 - Google Patents

一种微血管重建(治疗性血管新生)靶向的磁共振造影剂制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微血管重建(治疗性血管新生)靶向的磁共振造影剂的制备方法与应用，属于纳米材料科学与生物医学工程的交叉领域。本发明所述的微血管重建(治疗性血管新生)靶向的磁共振造影剂为超小超顺磁性氧化铁‑聚乳酸‑聚乙二醇‑马来酰亚胺‑RGD环形五肽(cRGDfC)纳米粒，其表达式为：cRGDfC‑Maleimide‑PEG‑PLA‑USPIO。本发明所合成的磁共振造影剂为T2加权对比剂，其颗粒分布均匀，针对新生血管靶向性(特异性)高，稳定性高，并有良好的驰豫性能，副作用小，在微血管功能障碍相关疾病的微血管稳态重建(治疗性血管新生)的评估中的具有良好的应用前景和潜在运用价值。

Description

一种微血管重建(治疗性血管新生)靶向的磁共振造影剂制备 方法及其应用
发明领域
本发明属于纳米材料科学与生物医学工程的交叉领域，涉及一种磁共振造影剂，具体涉及一种靶向评估微血管重建(治疗性血管新生)的磁共振造影剂的制备方法及其应用。
背景技术
微血管功能障碍相关疾病(Microvascular dysfunction related disease，MRD),如：缺血性心脏病(ischemic heart disease，IHD)、心肌病、心房颤动、心力衰竭、缺血性脑血管病以及外周血管病等，已成为威胁人类健康的重大疾病。尽管目前MRD有众多治疗方案(如：常规药物治疗、血运重建等)已经取得了重大成就，然而相当一部分患者药物治疗难以见效或根本无效，也不适于常规血运再通术处理，使得MRD患病率、致残率及致死率仍保持较高水平。随着对MRD发病机制研究的不断深入，MRD是一种多因素共同作用的综合征，是多种血管和/或非血管性机制共同参与的结果，而微血管稳态失衡在 MRD的发生发展中起着至关重要的作用。以缺血组织保护为核心，以恢复微血管稳态平衡为目标，以微血管重建为手段的治疗新策略——治疗性血管新生应被视为MRD沿着正确的方向前进，为MRD治疗带来新的希望和契机，也许意味着一个新时代的开始。
然而，迄今为止，就微血管重建(治疗性血管新生)的评价仍缺乏客观的评估手段。促血管新生治疗的临床研究大都因缺乏足量的患者而无法采用诸如死亡率或患肢保全率等指标去衡量疗效，需寻找其他指标和替代终点来评估促血管新生的生物活性以及临床情况的改善。如：在一项随机、对照、开放临床试验中，患者接受经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)6个月后运动持续时间的改善大约是96秒，然而，重症心绞痛患者在接受安慰剂或激光心肌血管重建术治疗6个月后运动持续时间的改善平均是93秒。从中可以看出：心绞痛发作前运动的时间等主观测量终点随患者的不同而具有高度的变异性，从而使治疗性血管新生疗效难于评价。同时，许多安慰剂对照研究提供了患者症状减轻的证据，但是并无单光子发射计算机断层成像术(SPECT)和臂-踝指数(ABI)等客观证据的支持。这表明：选用评估大血管的指标用来评估微血管重建(治疗性血管新生)的指标是不适合的。
磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)是目前临床上常用的一种影像学成像方法，具有良好的空间分辨率和时间分辨率，多序列序列成像、反映组织的多个理化指标、确定多个测量参数、可对小动物成像、进行分子标记物分析等优点，但是其敏感性相对较低，通常需要加入磁性物质来增强其敏感性。目前，将MRI对比剂可分为T1和T2对比剂两大类，它们的理化性质以及应用中存在的问题： (1)T1对比剂：顺磁性物质，如：二乙三胺五乙酸钆(gadoinium diethyl triamine-pentaacetic acid，Gd-DTPA)，为临床所常用。但是 Gd-DTPA体内分布没有特异性，使MRI图象对比不能明显改善。 (2)T2对比剂：超小超顺磁性氧化铁(Fe3O4)纳米颗粒(USPIO)，是当前研究的热点。与钆类造影剂相比，氧化铁具有①粒径小，穿透力强，能提供最强的单位金属所致的信号变化(负性增强)；②是由生物可降解的铁构成，具有生物相容性；③表面修饰后可以偶联功能基团或配体等特点。然而，未经表面处理的纳米氧化铁粒子极不稳定，需要对其表面进行包备来增加其稳定性。与常用的柠檬酸、聚乙二醇(polyethyleneglyeol，PEG)、淀粉、右旋糖醉等包备材料相比，聚乳酸(polylactic acid，PLA)由于较小的粒径在MRI方面将具有更大的优势。
更进一步的，磁共振分子成像是近年来兴起的一门无创性分子影像技术，因其不仅具有较高的空间分辨率，而且同时对软组织提供了更好的成像对比，故在新生血管的成像具有良好的运用前景。新生血管磁共振分子成像的关键是寻找“靶向目标”，并成功构建出与“靶向目标”具有高效、特异结合能力的磁共振靶向对比剂。血管新生过程中，整合素αvβ3(integrinαvβ3)在促血管新生因子刺激下活化的内皮细胞表面特异地高表达，而在静息血管内皮细胞表面几乎不表达。因此，整合素αvβ3是新生血管磁共振分子成像的理想的成像靶点。含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(Arg-Gly-Asp，RGD)的多肽能特异性地与整合素αvβ3结合。RGD根据其分子的空间结构，可分为RGD线形肽 (linear RGD)和RGD环形肽(cyclic RGD)两大类。大量有关RGD的构效关系研究表明：RGD环形肽的稳定性是RGD线形肽的30倍，故与RGD线形肽对整合素αvβ3结合能力相比，RGD环形肽对整合素αvβ3具有更高的结合力。RGD环形五肽[cyclic(Arg1-Gly2-Asp3-X4-X5)] 是RGD环形衍生肽，进一步对其构效研究结果显示：①当其空间结构上第4位上的氨基酸残基为D-芳香族氨基酸残基时(如，D-Phe)，D-Phe作为整个RGD环形五肽[cyclic(Arg1-Gly2-Asp3-D-Phe4-X5)]空间结构上的侧翼，能增加其本身空间结构上的稳定性，同时亦增强其对整合素αvβ3结合的特异性；②其空间结构上第5位上的氨基酸残基的属性，无论是亲水性还是疏水性，对其与整合素αvβ3结合力无明显影响。实验进一步证实：RGD环形五肽[cyclic (Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)，cRGDfV]比RGD线性五肽[linear (Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)，RGDfV]对整合素αvβ3的结合力至少增加了100倍。但是，如果第5位上的氨基酸残基为含硫氨基酸时(如， Cys)，因RGD环形五肽[cyclic(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)，cRGDfC] 分子中的巯基能与马来酰亚胺(maleimide)通过共价硫醚键方式连接，进一步增强其对整合素αvβ3结合的特异性以及结合力。因此，cRGDfC 可作为理想的分子探针，用于构建与整合素αvβ3具有高效、特异结合能力的磁共振靶向对比剂，以期客观准确的评价治疗性血管新生。
综上所述，围绕目前仍缺乏微循环稳态重建(治疗性血管新生)的客观评价指标这一瓶颈，以新生血管上特异地高表达的整合素αvβ3为靶点，以能与整合素αvβ3特异结合的cRGDfC为“分子伴娘”，以超小超顺磁性氧化铁(Fe3O4)纳米颗粒(USPIO)为基核，开发T2加权对比剂——超小超顺磁性氧化铁-聚乳酸-聚乙二醇-马来酰亚胺-cRGDfC 纳米粒(cRGDfC-Maleimide-PEG-PLA-USPIO)是目前的磁共振靶向分子成像造影剂的研究热点，并带来潜在的临床应用价值。
发明内容
本发明的目的是为了克服目前仍缺乏微循环重建(治疗性血管新生)的客观评价指标这一瓶颈，从而提供了一种微血管重建(治疗性血管新生)靶向的磁共振造影剂制备方法及其应用。
该微血管重建(治疗性血管新生)靶向的磁共振造影剂，名为超小超顺磁性氧化铁-聚乳酸-聚乙二醇-马来酰亚胺-RGD环形五肽 (cRGDfC)纳米粒，其表达式为：
cRGDfC-Maleimide-PEG-PLA-USPIO，以下简称T2加权对比剂。
所述的T2加权对比剂的制备方法，其特征在于该方法包括下列反应步骤：
(I)D,1-Lactic+PEG-Maleimide→PLA-PEG-Maleimide
(II)2Fe3++Fe2++8OH-+PLA-PEG-Maleimide→ Maleimide-PEG-PLA-Fe3O4(USPIO)+4H2O
(III)cRGDfC+Maleimide-PEG-PLA-USPIO→ cRGDfC-Maleimide-PEG-PLA-USPIO
所述的T2加权对比剂的制备方法反应步骤(I)中，为 PLA-PEG-Maleimide的合成：分别将PEG2000-Maleimide、 PEG3400-Maleimide、PEG5000-Maleimide分别与D,l-丙交酯(D,l-Lactic)反应，采用开环聚合法(Lee,Li et al.2006,Yu,Lu et al. 2010)，分别合成PLA-PEG2000-Maleimide、PLA-PEG3400-Maleimide 和PLA-PEG5000-Maleimide。
所述的T2加权对比剂的制备方法反应步骤(II)中，为Maleimide-PEG-PLA-USPIO的合成：采用共沉淀法制备， Fe3O4(USPIO)晶体形成分为两个阶段：第一阶段为Fe3O4晶核生成，第二阶段为晶体长大过程。根据韦曼的晶体生长理论，只要有效的控制反映条件(如pH等)，就能生成形状相同，尺寸分布窄的均分散体系。具体方法如下：首先将0.20gFeCl2·4H2O和0.54g FeCl3·6H2O溶解于5毫升去离子水中。将PLA-PEG3400-Maleimide溶解于5ml 40％乙醇水溶液中，振荡至完全溶解后与上述溶液混合均匀后以超声波水浴，并用5mol/L NaOH溶液滴定，使混合溶液的pH＝11.0并持续超声30分钟。通过控制加入NaOH和铁盐物质的量的比，可以调整生成纳米粒子的粒径而得到一系列的粒子。为促进晶体进一步成熟，将以上混合溶液在80℃水浴2小时。将所得沉淀以去离子水洗涤5次后，重新分散在去离子水中分装4℃保存备用。
所述的T2加权对比剂的制备方法反应步骤(III)中，为 cRGDfC-Maleimide-PEG-PLA-USPIO的合成：cRGDfC中半胱氨酸上的巯基与Maleimide-PEG-PLA-USPIO中maleimide通过共价硫醚键方式连接，从而合成cRGDfC-Maleimide-PEG-PLA-USPIO，即T2 加权对比剂。
所述的T2加权对比剂在透射电镜下呈类圆形，大小均匀，表面平滑完整(图1A，×10000)，粒子之间无粘连，可见明显的壳－核结构，可见USPIO被白色纳米粒包裹(图1B，×15000)。电镜下测得T2 加权对比剂粒径约为160nm(见图1)。
所述的T2加权对比剂采用邻二氮菲法测定T2加权对比剂溶液中的铁含量为2.25mg/ml。
所述的T2加权对比剂采用Malvern-3000HS激光粒度分析仪测定的T2加权对比剂测定平均粒径177nm(见图2)；
所述的T2加权对比剂多分散系数(Poly.index)为0.221。
所述的T2加权对比剂红外光谱学分析可得出样品中含有 cRGDfC的吸收峰1750.8cm-1及cRGDfC与Maleimide-PEG- PLA-USPIO通过共价硫醚键方式连接的吸收峰1060.7cm-1，证明 RGDfC与Maleimide-PEG-PLA-USPIO形成纳米壳相连。
所述的T2加权对比剂采用X射线衍射分析，其纳米微粒的衍射图由特征峰值30°(220)、35.4°(311)、43.1°(400)、53.4°(422)、 56.9°(511)、62.5°(440)所对应的面间距(d值)与粉末衍射标准联合会(JCPDS)编制的标准粉末衍射(PDF)卡片中19-0629卡片的d值基本一致,说明该产物为面心立方尖晶石结构的Fe3O4，衍射图中可观察到尖锐的衍射峰，说明Fe3O4粒子的结晶状态很好(图3A：纯Fe3O4；图3B：纯cRGDfC；图3C：USPIO-PEG-PLA-Maleimide；图3D： cRGDfC-Maleimide-PEG-PLA-USPIO)。
所述的T2加权对比剂的用途，其特征在于该类造影剂可以用作磁共振对比剂进行体内成像。
所述的T2加权对比剂的用途，其特征在于该类造影剂可以用作新生血管的成像。与对照组(图4B：正常下肢+生理盐水+普通磁共振造影剂；图4D：缺血下肢+三突变型HIF-1α重组腺病毒载体+普通磁共振造影剂)相比，T2加权对比剂能更优地显示新生血管(见图4A：正常下肢+生理盐水+T2加权对比剂；图4C：缺血下肢+三突变型HIF-1α重组腺病毒载体+T2加权对比剂)。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：该T2加权对比剂颗粒分布均匀，针对新生血管靶向性(特异性)高，稳定性高，并有良好的驰豫性能，副作用小，在微血管功能障碍相关疾病的治疗性血管新生的评估中的具有良好的应用前景和潜在运用价值。
附图说明
图1 T2加权对比剂透射电镜分析
图2 T2加权对比剂的粒径分布
图3 T2加权对比剂X射线衍射分析
图4 T2加权对比剂靶向显像新生血管
具体实施例
实施例1微血管重建(治疗性血管新生)靶向的磁共振造影剂制备方法
提供了一种微血管重建(治疗性血管新生)靶向的磁共振造影剂(超小超顺磁性氧化铁-聚乳酸-聚乙二醇-马来酰亚胺-cRGDfC纳米粒/ cRGDfC-Maleimide-PEG-PLA-USPIO)的制备方法，其反应原理如下：
(I)D,1-Lactic+PEG-Maleimide→PLA-PEG-Maleimide
(II)2Fe3++Fe2++8OH-+PLA-PEG-Maleimide→ Maleimide-PEG-PLA-Fe3O4(USPIO)+4H2O
(III)cRGDfC+Maleimide-PEG-PLA-USPIO→ cRGDfC-Maleimide-PEG-PLA-USPIO
步骤一、PLA-PEG-Maleimide的合成：按方程(I)，采用开环聚合法(Lee,Li etal.2006,Yu,Lu et al.2010)：分别将 PEG2000-Maleimide、PEG3400-Maleimide、PEG5000-Maleimide分别与D,l-丙交酯(D,l-Lactic)反应合成PLA-PEG2000-Maleimide、 PLA-PEG3400-Maleimide和PLA-PEG5000-Maleimide。
步骤二、用共沉淀法制备Maleimide-PEG-PLA-USPIO：按方程 (II)，Fe3O4(USPIO)晶体形成分为两个阶段：第一阶段为Fe3O4晶核生成，第二阶段为晶体长大过程。根据韦曼的晶体生长理论，只要有效的控制反映条件(如pH等)，就能生成形状相同，尺寸分布窄的均分散体系。具体方法如下：首先将0.20g FeCl2·4H2O和0.54g FeCl3· 6H2O溶解于5毫升去离子水中。将PLA-PEG3400-Maleimide溶解于5ml 40％乙醇水溶液中，振荡至完全溶解后与上述溶液混合均匀后以超声波水浴，并用5mol/L NaOH溶液滴定，使混合溶液的 pH＝11.0并持续超声30分钟。通过控制加入NaOH和铁盐物质的量的比，可以调整生成纳米粒子的粒径而得到一系列的粒子。为促进晶体进一步成熟，将以上混合溶液在80℃水浴2小时。将所得沉淀以去离子水洗涤5次后，重新分散在去离子水中分装4℃保存备用。
步骤三、正交设计对Maleimide-PEG-PLA-USPIO制备工艺进行优化：首先单因素考察USPIO与不同分子量的Maleimide-PEG-PLA 对纳米粒粒径的影响，确定最佳的Maleimide-PEG-PLA分子量。其次，以纳米粒的粒径作为因变量，将上部实验筛选出来的最佳分子量的Maleimide-PEG-PLA以不同浓度(A)、超声时间(B)及超声细胞粉碎仪的功率(C)作为自变量，采用正交设计进行处方优化和工艺筛选。
步骤四、cRGDfC-Maleimide-PEG-PLA-USPIO的合成：按方程 (III)，cRGDfC中半胱氨酸上的巯基与Maleimide-PEG-PLA-USPIO 中maleimide通过共价硫醚键方式连接，从而合成 cRGDfC-Maleimide-PEG-PLA-USPIO。
步骤五、对cRGDfC-Maleimide-PEG-PLA-USPIO行表征鉴定：
①用透射电镜(日立H-600)观察T2加权对比剂的大体形态。具体操作方法为：1:4蒸馏水稀释T2加权对比剂溶液，取1滴放在镀膜铜网上，滤纸吸去多余液体，加入2％磷钨酸染30s，干燥后透射电镜下观察。结果发现：T2加权对比剂呈类圆形，大小均匀，表面平滑完整(图1A，×10000)，粒子之间无粘连，可见明显的壳－核结构，可见USPIO被白色纳米粒包裹(图1B，×15000)。电镜下测得T2加权对比剂粒径约为160nm(见图1)。
②采用邻二氮菲法测定T2加权对比剂溶液中的铁含量为 2.25mg/ml；
③取T2加权对比剂放置于透析袋内，用5％葡萄糖溶液透析 48h，每隔8h换透析液，除去游离的cRGDfC、Maleimide-PEG、 Maleimide-PEG-PLA、Maleimide-PEG-PLA-USPIO等物质。取透析过的T2加权对比剂溶液用Malvern-3000HS激光粒度分析仪测定粒径及其分布：吸取1ml制备的相应样品，用去离子水稀释至量杯中。所选激光光源波长为633.0nm，测试温度为25.00±0.05℃。用 Malvern-3000HS激光粒度分析仪测定的T2加权对比剂测定平均粒径177nm(见图2)；多分散系数(Poly.index)为0.221；
④将一定量的样品冷冻干燥后，在红外光谱学仪上检测样品的红外吸收峰谱。红外光谱学分析可得出样品中含有cRGDfC的吸收峰 1750.8cm-1及cRGDfC与Maleimide-PEG-PLA-USPIO通过共价硫醚键方式连接的吸收峰1060.7cm-1，证明RGDfC与 Maleimide-PEG-PLA-USPIO形成纳米壳相连；
⑤取真空干燥的T2加权对比剂进行研细，置D/Max-IIIAX-射线粉末(多晶)衍射仪中，采用镍过滤的CūKα放射线，X线球管电压40KV，管电流30mA，扫描范围10～90°(2θ)，开始角为10 °，结束角为90°，阶宽0.04°(2θ)，扫描速度4°/min。将所得的图谱与国际粉末衍射标准联合会出版的PDF卡片比较，以此来确定样品所具备的晶体结构。X射线衍射分析纳米微粒的衍射图由特征峰值30°(220)、35.4°(311)、43.1°(400)、53.4°(422)、56.9° (511)、62.5°(440)所对应的面间距(d值)与粉末衍射标准联合会 (JCPDS)编制的标准粉末衍射(PDF)卡片中19-0629卡片的d值基本一致,说明该产物为面心立方尖晶石结构的Fe3O4，衍射图中可观察到尖锐的衍射峰，说明Fe3O4粒子的结晶状态很好(图3A：纯Fe3O4；图3B：纯cRGDfC；图3C：USPIO-PEG-PLA-Maleimide；图3D： cRGDfC-Maleimide-PEG-PLA-USPIO)。
实施例2微血管重建(治疗性血管新生)靶向的磁共振造影剂的应用步骤一、构建糖尿病兔慢性后肢缺血模型
首先，参照Wang等(Breen,Mc Redmond et al.2008,Jablecka, Czaplicka etal.2009,Wang,Wan et al.2010)的方法，在高脂饮食诱发胰岛素抵抗的基础上使用小剂量(50mg/kg)四氧嘧啶(alloxan，ALX)注射诱导糖尿病。结果显示：与空白组相比，糖尿病组兔注射ALX后出现三多一少、脱毛、活动减少等症状；其中1只兔在ALX注射后12h 死于低血糖，1只兔在实验结束前死于感染。部份动物在注射ALX 1个月后血糖逐渐下降，可能与胰岛细胞修复有关。全程给予5-10％葡萄糖水(浓度依个体血糖而定)自由饮用有利于保持模型稳定，2 只兔在实验结束时血糖低于16.7mmol/L。实验期间动物低血糖死亡率为8.3％(1/12)，糖尿病模型建模成功率为91.7％(11/12)。糖尿病成模后的死亡率为9％(1/11)，总的糖尿病兔慢性后肢缺血模型建模成功率为75％(9/12)。
其次，通过手术完全切除糖尿病兔右侧股动脉全长及其分支造成该侧肢体急性缺血模型，利用近、远侧动脉残端之间侧枝循环的逐渐形成来模拟临床上糖尿病患者慢性肢体缺血性疾病进程。术后对兔模型行双后肢动脉血管超声确认手术效果，并按慢性动物实验要求饲养。步骤二、构建三突变型HIF-1α基因的促血管新生模型
以前述慢性后肢缺血糖尿病兔为实验对象；共设置2个实验组，分别为：生理盐水、三突变型HIF-1α重组腺病毒载体(Ad-HIF-1α-Trip) 组。兔缺血后肢局部通过肌肉注射方式按进行病毒转染或给予生理盐水，于第3月采用实施例1中的T2加权对比剂行MRI检测评估三突变型HIF-1α基因的促血管新生效应。结果表明：与对照组相比，T2 加权对比剂能更优地显示新生血管(P<0.05；图4C中白色箭头指向区域)(图4A：正常下肢+生理盐水+T2加权对比剂；图4B：正常下肢+ 生理盐水+普通磁共振造影剂；图4C：缺血下肢+三突变型HIF-1α重组腺病毒载体+T2加权对比剂；图4D：缺血下肢+三突变型HIF-1α重组腺病毒载体+普通磁共振造影剂)。

Claims (6)

1.一种微血管重建(治疗性血管新生)靶向的磁共振造影剂，其特征在于，其包括超小超顺磁氧化铁(Fe3O4)纳米粒(USPIO)、亲水性的高分子化合物(Maleimide-PEG-PLA)以及RGD环形五肽，其内核为超小超顺磁氧化铁纳米粒，所述内核表面包被有亲水性的高分子化合物。所述亲水性的高分子化合物是含有多个羧基或氨基的高分子化合物，优选聚乙二醇(PLG)、聚乳酸(PLA)。
2.权利要求1的所述微血管重建(治疗性血管新生)靶向的磁共振造影剂，其特征在于，所述RGD环形五肽能特异识别新生血管活化内皮细胞表面特异高表达的整合素αvβ3分子。优选地，RGD环形五肽的结构为cyclic(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)(cRGDfC)。
3.权利要求1、2的所述微血管重建(治疗性血管新生)靶向的磁共振造影剂，其特征在于，所述RGD环形五肽(cRGDfC)以共价硫醚键方式连接亲水性的高分子化合物的外表面。优选地，cRGDfC中半胱氨酸上的巯基与马来酰亚胺(maleimide)通过共价硫醚键方式连接。
4.权利要求1-3的所述微血管重建(治疗性血管新生)靶向的磁共振造影剂制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下反应步骤：
(I)PLA-PEG-Maleimide的合成：将PEG3400-Maleimide与D,l-丙交酯(D,l-Lactic)反应，采用开环聚合法，合成PLA-PEG3400-Maleimide。优选地，PEG3400-Maleimide与D,l-丙交酯的摩尔比例为1:10-4:10。
(II)Maleimide-PEG-PLA-USPIO的合成：采用共沉淀法制备USPIO。优选地，将0.20gFeCl2(4H2O)和0.54g FeCl3(6H2O)溶解于5毫升去离子水中。将PLA-PEG3400-Maleimide溶解于5ml 40％乙醇水溶液中，振荡至完全溶解后与上述溶液混合均匀后以超声波水浴，并用5mol/L NaOH溶液滴定，使混合溶液的pH＝11.0并持续超声30分钟。优选地，将以上混合溶液在80℃水浴2小时。将所得沉淀以去离子水洗涤5次后，重新分散在去离子水中分装4℃保存备用。
(III)cRGDfC-Maleimide-PEG-PLA-USPIO的合成：cRGDfC中半胱氨酸上的巯基与Maleimide-PEG-PLA-USPIO中maleimide通过共价硫醚键方式连接，从而合成cRGDfC-Maleimide-PEG-PLA-USPIO。优选地，cRGDfC与Maleimide-PEG-PLA-USPIO的摩尔比例为10:1-15:1。
5.权利要求1-3的所述微血管重建(治疗性血管新生)靶向的磁共振造影剂在微血管功能障碍相关疾病中微血管重建(治疗性血管新生)效果评价中应用。
6.权利要求5的所述微血管功能障碍相关疾病，其特征在于存在微血管功能障碍或微血管稳态失衡，所述微血管功能障碍相关的疾病为缺血性心脏病、心肌病、心房颤动、心力衰竭、缺血性脑血管病以及外周血管病中的任意一种。
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