CN107320737A - 阿尔茨海默病老年斑纳米靶向磁共振诊断对比剂及制备方法 - Google Patents

阿尔茨海默病老年斑纳米靶向磁共振诊断对比剂及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种阿尔茨海默病老年斑纳米靶向磁共振诊断对比剂及制备方法，属于生物诊断试剂的开发领域，该方法制得的诊断对比剂可以顺利地通过血脑屏障，与老年斑特异性地结合，且具有超顺磁性，可以实现磁共振下老年斑的特异性显像。同时还具有低毒性、低免疫原性、空间体积小、成本低的优点，可以作为阿尔茨海默病磁共振成像中的诊断对比剂来应用，达到早期诊断阿尔茨海默病的目的。

Description

阿尔茨海默病老年斑纳米靶向磁共振诊断对比剂及制备方法
技术领域
本发明涉及医学及诊断试剂领域，具体地指一种阿尔茨海默病老年斑 纳米靶向磁共振诊断对比剂及制备方法。
背景技术
长期以来，生物医学中阿尔茨海默病(Alzheimer Disease,AD)的诊断 只有依靠病理活检或尸检来确诊，但病理学活检接受度不高，而利用脑脊 液标志物来进行实验室诊断，则面临诊断准确性以及难以量化评估AD的 严重程度等问题。目前针对AD的治疗药物一直难以取得实质的进展，主 要原因在于当患者出现明显的临床症状时，疾病多数已经进入中晚期，往 往延误了患者的早期最佳治疗时机，以至于疗效均不理想。因此，只有采 用合理有效的方法早期诊断AD患者，才可以在早期进行可能有效的干预 治疗，这对于挽救千百万患者的生命和提高生活质量有着重要的社会和经 济意义。如何在AD发病的早期利用非创伤性方法来定性又定量的诊断AD， 一直是广大神经病学专家和研究者试图解决的难题，现代分子影像学的飞 速发展为早期诊断AD带来可能，利用磁性纳米颗粒特异性对老年斑进行 活体磁共振显像，是分子影像学与纳米技术交叉整合的热点和难点。本研 究组在前期研究中发现：将磁性纳米铁颗粒进行表面修饰，连接生物肽段 (Aβ40肽段)特异性能与老年斑相结合的特性达到其靶向性作用，再连接 生物肽段(HIV-1Tat肽段)使之能够通过血脑屏障，实现对APP/PS1转基 因AD小鼠脑内老年斑的活体显像。然而Aβ40肽段作为老年斑的主要成分， 但具有一定的毒性作用，同时其由40个氨基酸残基组成，其免疫原性相对 较大，同时空间结构上也会相对较大，不利于其通过血脑屏障。有研究表 明，Aβ40肽段的不同区域，其功能不同，其中Aβ25-35是Aβ40肽段的主要毒 性部分，而Aβ16-20则是Aβ40肽段的主要结合部位。
在进一步的探索中，我们创新性地选择Aβ16-20代替Aβ40肽段来与老年 斑结合，不仅避开了毒性部分，还能降低免疫原性及空间体积，且Aβ16-20分子量更小，合成费用更低。同时采用水向共沉淀法制备全新一代的超微 超顺磁性纳米颗粒(USPIO)，产物具有更好的生物相容性，且粒径分布更 窄，粒径更小。
发明内容
本发明针对现有技术存在的缺陷，提供了一种阿尔茨海默病老年斑纳 米靶向磁共振诊断对比剂及制备方法，本发明选择Aβ16-20代替Aβ40肽段来 与老年斑结合，不仅避开了毒性部分，还能降低免疫原性及空间体积，且 Aβ16-20分子量更小，合成费用更低。同时，本发明选用超微超顺磁性纳米颗 粒(USPIO)，产物具有更好的生物相容性，且粒径分布更窄，粒径更小。
为实现上述目的，本发明提供的一种阿尔茨海默病老年斑纳米靶向磁 共振诊断对比剂，所述诊断对比剂包括有效量的诊断物 Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20和生理可接受的水；所述诊断物 Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20由超顺磁性纳米氧化铁颗粒USPIO和负载在超顺磁 性纳米氧化铁颗粒上的两个短肽组成，且两个短肽分别人体免疫缺陷病毒 (HIV-1)的转录活化因子肽段(简称:HIV-1Tat肽段)和Aβ16-20肽段，其中，转 录活化因子肽段的氨基酸序列为：GRKKRRQRRRPPQ，Aβ16-20肽段的氨基 酸序列为：KLVFF。
上述方法中所述的人免疫缺陷病毒HIV-1的转录活化因子肽段(HIV-1 Tat肽段)，可来源于多肽合成，其氨基酸序列为：GRKKRRQRRRPPQ，[参 见：1.Dennison SR,Baker RD,Nicholl ID,Phoenix DA.Interactions of cell penetrating peptide Tat with modelmembranes:a biophysical study Biochem Biophys Res Commun.2007 Nov 9；363(1):178-82.Epub 2007 Sep 4(PMID: 17854767)；2.Futaki S.Membrane-permeablearginine-rich peptides and the translocation mechanisms Adv Drug DelivRev.2005 Feb 28；57(4):547-58. Epub 2004 Dec 16(PMID:15722163)]；所述的ophysRes Commun.}2007 Nov 9；363(1):178-82.Epub 2007 Sep 4(PMID:17854767)；2..Membrane-permeable arginine-rich peptides and the translocationmechanisms。2005 Feb 28；57(4):547-58.Epub 2004 Dec 16(PMID: 15722163)]；所述的Aβ16-20肽段，可来源于多肽合成，氨基酸序列为： KLVFF。
进一步地，所述超顺磁性纳米氧化铁颗粒的粒径为6～10nm。
再进一步地，所述诊断对比剂中，以铁元素含量计量该诊断对比剂中 诊断物Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20的浓度为：其铁元素含量为0.01-20摩尔/升。
再进一步地，所述诊断物Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20的粒径为50-65nm。
本发明还提供了一种阿尔茨海默病老年斑纳米靶向磁共振诊断对比剂 的制备方法，包括以下步骤：
1)利用水向共沉淀法制备葡聚糖包覆的超顺磁性纳米氧化铁颗粒：
a.将2-5重量份的葡聚糖溶解于5-10重量份的蒸馏水中，得到葡聚糖 溶液；
b.将1-3重量份的FeCl3和1-4重量份的FeCl2溶于2-4重量份蒸馏水中， 得到铁离子溶液；
c.将上述葡聚糖溶液和铁离子溶液混合均匀，并在惰性气体环境下磁力 搅拌30-60mins，得到初级混合液，在温度为4～10℃，按体积比为1：2～4 向初级混合液中以33-60滴/秒的速度滴加浓度为0.1-0.25mol/L的氨水；氨 水滴加完毕后升温至60-70℃并继续磁力搅拌90-120mins；然后往制备好的 葡聚糖覆的纳米氧化铁颗粒；
2)表面官能化的超顺磁性纳米氧化铁颗粒USPIO的制备：
a.制备好的葡聚糖包覆的纳米氧化铁颗粒中加入絮凝剂，在8000-9000 转/min条件下离心10-20min，弃去上清液，得到沉淀物；
b.将沉淀物分散于蒸馏水中，得到含有超顺磁性纳米颗粒的混合溶液；
c.取2-4体积份的含有超顺磁性纳米颗粒的混合溶液与10-15体积份的 含NaBH4的NaOH溶液在室温下混合均匀，在惰性气体环境下升温至 60-70℃，边搅拌边加入3-5体积份的表氯醇，反应约10-12小时后取下， 加入絮凝剂，离心，重新分散，洗涤三至五次后，重新分散于蒸馏水中； 得到分散液；
d.向分散液5-10体积份的乙二胺，反应10-12小时后取下，加入絮凝 剂，离心，洗涤后重新分散于pH值为7.4-8的磷酸缓冲溶液(PBS)中， 形成含有表官能化的超顺磁性纳米氧化铁颗粒USPIO的溶液；
3)交联剂溶液与磷酸盐溶液的混合液制备
按重量/体积比5～10:1～2mg/mL将3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀 酰亚胺酯(SPDP)溶于二甲基亚砜中，得交联剂溶液，再将该交联剂溶液 与浓度为0.1-0.2mol/L、pH＝7.4-8的磷酸盐缓冲溶液混合，得到交联剂溶 液与磷酸盐溶液的混合液；
4)超顺磁性纳米氧化铁颗粒USPIO的交联
向3～5体积份的含有表面官能化的超顺磁性纳米氧化铁颗粒USPIO的 溶液加入步骤3)得到的2～3体积份的混合液中，在室温下放置60～120 分钟，置于超滤管中，6000-8000转/分离心50-60分钟，过滤去除杂质和未 反应的交联剂溶液，得到经交联液处理过的表面官能化的超顺磁性纳米氧 化铁颗粒(USPIO)磷酸盐溶液；其中超顺磁性纳米氧化铁颗粒(USPIO) 磷酸盐溶液中，超顺磁性纳米氧化铁颗粒(USPIO)含量为1.0-2.5mg/mL；
5)诊断对比剂的制备
诊断对比剂分别称取1-2体积份的浓度为0.02mol/L的N-羟基琥珀酰亚 胺(NHS)溶液和1-2体积份的浓度为0.2mol/L的3-二甲胺基丙基碳二亚 胺(EDC)溶液，并加入上述3-5体积份交联溶液处理过的表面官能化的超 顺磁性纳米氧化铁颗粒(USPIO)磷酸盐溶液中，在温度为35～40℃条件下 放置30-90分钟，然后再加入3-5重量份的人体免疫缺陷病毒HIV-1的转录 活化因子肽段(HIV-1Tat肽段)和3-5重量的份Aβ16-20肽段，混合后室温 下放置10-12小时；置于超滤管中，6000-8000转/分离心40-60分钟，过滤 去除杂质和未反应的(固体)成分，管中即为水相的诊断对比剂，诊断对 比剂包括有效量的诊断物Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20和生理可接受的水。
作为优选方案，所述步骤2)的第a小步中，絮凝剂为乙醇、甲醇、丙 醇和丁醇中任意一种。
作为优选方案，其特征在于：所述步骤2)的第b小步中，NaOH浓度 为1.8-2mol/L。
作为优选方案，所述步骤2)的第c小步中，惰性气为氮气或氩气。
作为优选方案，其特征在于：所述步骤3)中，交联剂溶液与磷酸盐溶 液的体积用量比为1：1-2。
本发明的有益效果在于：
本发明采用了小分子的Aβ16-20来作为识别AD老年斑的特异性探针， 同时采用水向共沉淀法制备全新一代的超微超顺磁性纳米颗粒，与现有的 AD诊断方法相比又具有安全无创性，同时又能实脑内老年斑的活体磁共振 显像。与前期产品相比毒性低，分子量小、免疫排斥少、结合能力强、及 整体成本低廉等优点。
附图说明
图1为按照实施例1、2方法制备的USPIO的透射电子显微镜图，纳米 氧化铁粒子均匀分散于基底中，总体来看其大小在6-10nm，呈球形；
图2为按照实施例1、2方法制备的USPIO样品的水化粒径分布图：其 水化半径主要分布在10-15nm左右；
图3为连接转录活化因子肽段(Tat-PTD肽段)和Aβ16-20的诊断物 (Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20)样品的水化直径分布图：其水化直径分布在 50-65nm左右；
图4为按照实施例3、6方法制备的官能化的USPIO样品的电荷分布图， 这种官能化的USPIO样品其表面带有负电荷，电荷大小为-8.003mV；
图5为按照实施例4、9方法制备的官能化的USPIO样品在进行弛豫性 能检测时的磁共振仪屏幕截图，截图中，样品按照铁浓度(mmol/L)依次 排列，从下至上，样品中铁浓度依次递增；
图6为按照实施例4、9方法制备的官能化的USPIO样品其弛豫时间倒 数(1/T2)与样品中铁浓度(mmol/L)之间的曲线图。横坐标为样品中铁 浓度(mmol/L)，纵坐标为样品的T2弛豫时间的倒数(1/T2)。通过对该曲 线的线性拟合计算可以得到样品的R2值为140(mM-1sec-1)；
图7为按照实施例4、9方法制备诊断对比剂(诊断对比剂包括 有效量的诊断物Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20和生理可接受的水)的园二 色谱对照；
图8为按照实施例4、9方法制备USPIO样品的磁性分析。在室 温下测得了USPIO和USPIO-NH2的磁滞回线，可以看到其磁性都表 现为超顺磁性；
图9为Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20与神经干细胞孵育后铁染色验证： 细胞内可见蓝色铁颗粒(A:Perl’s染色)与棕褐色铁颗粒(B:DAB 复染)，如箭头所示，细胞胞体内存在均匀分布的 Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20，其中的铁元素使细胞染色呈蓝色(左图) 和棕褐色(右图)。
图10为Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20与神经干细胞孵育后体外磁共振 检测验证其弛豫性(A，B)，透射电镜证实细胞质内散在分布铁颗粒 (C,D)：神经干细胞与Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20孵育后1.5TMRI成像 结果(EP管1、2、3、4分别对应培养基，Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20, 与Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20共孵育后的神经干细胞，单纯的神经干细 胞)，从上述四个样品的MR图像上可以清楚看到，第3管的T2信号 强度介于第2管和第4管之间，即与Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20共孵育 过的细胞的T2信号强度介于单纯的Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20与单纯的神经干细胞之间。
图11为6月龄阳性鼠在尾静脉注射Tat PTD- USPIO-Aβ16-20-HiLyte Fluor 555(0.01-20M)后24h脑部所成的MRI 像，可见皮层及海马区有散在分布的小点状低T2信号区。
图12为图9的脑区局部放大图，箭头所示位置即为散在分布于 皮层及海马区的小点状低T2信号区的代表。
图13为上述注射过Tat PTD-USPIO-Aβ16-20-HiLyte Fluor 555的 老鼠作脑组织切片后在荧光显微镜下观察，发红色荧光的箭头所指处 为Tat PTD-USPIO-Aβ16-20-HiLyteFluor 555聚集的部位。
图14为上述注射过Tat PTD-USPIO-Aβ16-20-HiLyte Fluor 555的老 鼠作脑组织切片并进行老年斑硫磺素染色后在荧光显微镜下观察，发 绿色荧光的箭头所指处为老年斑所在部位。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明 的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1：
用水向共沉淀法制备葡聚糖包覆的纳米氧化铁颗粒，将10g分子 量为两万的葡聚糖溶解于50ml蒸馏水中，再加2.34g六水氯化铁和 0.86g四水氯化亚铁；将上面的葡聚糖溶液和铁离子溶液混合均匀并 在惰性气体环境下磁力搅拌30-60mins，接着在4-10℃下以33-60滴/ 秒的速度滴加30ml浓度为0.1-0.25mol/L的氨水；等到氨水滴加完毕 后升温至60-70℃并继续磁力搅拌90-120mins；然后向超顺磁性纳米 铁颗粒中加入无水乙醇直至有黑色絮凝出现为止，通过8000转/分的 速度离心10分钟，弃去上清液，收集下部黑色沉淀均匀溶解于60ml 的蒸馏水中。取该溶液20ml，在室温下加入10ml含0.1g NaBH4的 NaOH溶液(NaOH溶液浓度为2mol/L)，混合均匀后，再于惰性气 体环境下升温至60℃，磁力搅拌速度200转/分下，注入3ml表氯醇， 反应10小时后停止反应，加入无水乙醇直至有黑色絮凝出现为止， 通过8000转/分的速度离心，弃去上清液，收集下部黑色沉淀溶于 50ml的蒸馏水中，然后在50℃的惰性气体环境下，向其中加入5ml 乙二胺，反应10小时后停止反应，加入无水乙醇直至有黑色絮凝出 现为止，通过8000转/分的速度离心，弃去上清液，收集下部黑色沉淀(即表面官能化的USPIO)溶于PH值为7.4的磷酸缓冲液(PBS 溶液)中。
将100uL浓度为0.02mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液与100uL浓度为0.2mol/L的3-二甲胺基丙基碳二亚胺(EDC)溶液混合， 然后向其中加入0.1ml表面官能化的USPIO溶液，37℃下放置 30mins；再向其中加入0.5mg的SPDP、和0.128ml二甲基亚砜，然 后再加入0.1ml的HIV-1Tat溶液和0.1ml的Aβ16-20肽段溶液，混合 后在室温下放置反应10小时；然后置于规格为0.5ml、100k的超滤 管中，在离心机上离心，离心机的转速为6000转/分，离心时间为 50mins，过滤去除杂质和未反应的溶液，得到诊断对比剂，诊断对比 剂包括有效量的诊断物Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20和生理可接受的水， 于4℃下保存。
实施例2
向超顺磁性纳米铁颗粒中加入无水乙醇直至有黑色絮凝出现为 止，通过8000转/分的速度离心10分钟，弃去上清液，收集下部黑 色沉淀超声溶于60ml的蒸馏水中。取该溶液25ml，在室温下加入 15ml含0.1g NaBH4的NaOH溶液(NaOH溶液浓度为2mol/L)，混 合均匀后，再于惰性气体环境下升温至60℃，磁力搅拌速度300转/ 分下，注入4ml表氯醇，反应11小时后停止反应，加入无水乙醇直 至有黑色絮凝出现为止，通过8000转/分的速度离心，弃去上清液， 收集下部黑色沉淀溶于50ml的蒸馏水中，然后在50℃的惰性气体环 境下，向其中加入8ml乙二胺，反应11小时后停止反应，加入无水 乙醇直至有黑色絮凝出现为止，通过8000转/分的速度离心，弃去上 清液，收集下部黑色沉淀(即表面官能化的USPIO)溶于PH值为 7.8的磷酸缓冲液(PBS溶液)中。
将150μL浓度为0.02mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液与 150μL浓度为0.2mol/L的3-二甲胺基丙基碳二亚胺(EDC)溶液混 合，然后向其中加入0.2ml表面官能化的USPIO溶液，37℃下放置 50mins；再向其中加入1mg的SPDP、和0.128ml二甲基亚砜，然 后再加入0.2ml的HIV-1Tat溶液和0.2ml的Aβ16-20-HiLyte Fluor 555 肽段溶液，混合后在室温下放置反应11小时，然后置于规格为0.5ml、 100k的超滤管中，在离心机上离心，离心机的转速为7000转/分，离 心时间为40mins，过滤去除杂质和未反应的溶液，得到诊断对比剂， 诊断对比剂包括有效量的诊断物Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20和生理可接 受的水，于4℃下保存。
实施例3
向超顺磁性纳米铁颗粒中加入无水乙醇直至有黑色絮凝出现为 止，通过8000转/分的速度离心10分钟，弃去上清液，收集下部黑 色沉淀溶于60ml的蒸馏水中。取该溶液30ml，在室温下加入20ml含 0.1g NaBH4的NaOH溶液(NaOH溶液浓度为2mol/L)，混合均匀后， 再于惰性气体环境下升温至60℃，磁力搅拌速度400转/分下，注入 5ml表氯醇，反应12小时后停止反应，加入无水乙醇直至有黑色絮 凝出现为止，通过8000转/分的速度离心，弃去上清液，收集下部黑 色沉淀溶于50ml的蒸馏水中，然后在50℃的惰性气体环境下，向其中加入10ml乙二胺，反应12小时后停止反应，加入无水乙醇直至有 黑色絮凝出现为止，通过8000转/分的速度离心，弃去上清液，收集 下部黑色沉淀(即表面官能化的USPIO)溶于PH值为7.4的磷酸缓 冲液(PBS溶液)中。
将200μL浓度为0.02mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液与 200μL浓度为0.2mol/L的3-二甲胺基丙基碳二亚胺(EDC)溶液混 合，然后向其中加入0.3ml表面官能化的USPIO溶液，37℃下放置 60mins；再向其中加入1mg的SPDP、和0.128ml二甲基亚砜，然 后再加入0.3ml的HIV-1Tat(FITC)溶液和0.3ml的Aβ16-20肽段溶 液，混合后在室温下放置反应12小时；然后置于规格为0.5ml、100k 的超滤管中，在离心机上离心，离心机的转速为8000转/分，离心时 间为30mins，过滤去除杂质和未反应的溶液，得到诊断对比剂，诊 断对比剂包括有效量的诊断物Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20和生理可接受 的水，于4℃下保存。
实施例4
向超顺磁性纳米铁颗粒中加入无水乙醇直至有黑色絮凝出现为 止，通过8000转/分的速度离心10分钟，弃去上清液，收集下部黑 色沉淀溶于60ml的蒸馏水中。取该溶液30ml，在室温下加入10ml含 0.1g NaBH4的NaOH溶液(NaOH溶液浓度为2mol/L)，混合均匀后， 再于惰性气体环境下升温至60℃，磁力搅拌速度500转/分下，注入 5ml表氯醇，反应12小时后停止反应，加入无水乙醇直至有黑色絮 凝出现为止，通过8000转/分的速度离心，弃去上清液，收集下部黑 色沉淀溶于50ml的蒸馏水中，然后在50℃的惰性气体环境下，向其中加入10ml乙二胺，反应12小时后停止反应，加入无水乙醇直至有 黑色絮凝出现为止，通过8000转/分的速度离心，弃去上清液，收集 下部黑色沉淀(即表面官能化的USPIO)溶于PH值为7.4的磷酸缓 冲液(PBS溶液)中。
将100μL浓度为0.02mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液与 150μL浓度为0.2mol/L的3-二甲胺基丙基碳二亚胺(EDC)溶液混 合，然后向其中加入0.1ml表面官能化的USPIO溶液，37℃下放置 30mins；再向其中加入1mg的SPDP、和0.128ml二甲基亚砜，然 后再加入0.15ml的HIV-1Tat(FITC)溶液和0.15ml的Aβ16-20肽段溶液， 混合后在室温下放置反应12小时；然后置于规格为0.5ml、100k的 超滤管中，在离心机上离心，离心机的转速为6000转/分，离心时间 为60mins，过滤去除杂质和未反应的溶液，得到诊断对比剂，诊断 对比剂包括有效量的诊断物Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20和生理可接受的 水，于4℃下保存。
实施例5-14：其成分及配比见下表，其制备过程同实例1-4：
实施例15
用KLAFF替代Aβ16-20，其他制备方法同上，也可以得到相同的 结果。
实施例16
用KLVAF替代Aβ16-20，其他制备方法同上，也可以得到相同的 结果。
效果评价：Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20
检测USPIO的粒径在6-10nm，见图1,其水化半径在50nm左右， 见图2，且在水相中分散性能良好，无团聚现象；通过检测纳米颗粒 表面其带有负电荷，电荷大小为-8.003mV，见图3。
我们在1.5T磁共振仪下测量了官能化的USPIO的驰豫性能，通 过测量其T2驰豫时间，获得其驰豫速率R2值为140(mM-1sec-1)。 见图4、图5，其中图4为官能化的USPIO进行弛豫性能检测的磁共 振仪屏幕截图，图5为T2弛豫时间倒数与样品中铁浓度之间的关系 曲线，通过对曲线的拟合计算可以得到样品的R2值为140(mM-1 sec-1)。
将诊断对比剂(诊断对比剂包括有效量的诊断物 Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20和生理可接受的水，)在体外与神经细胞共孵 育后，普鲁士蓝染色显示Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20能够进入活体细胞 内，使细胞染色呈淡蓝色，均匀分布于细胞质内,见图7。透射电镜显 示Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20位于细胞质内，细胞膜内侧居多，呈直径 约数十至数百纳米的致密电子沉积颗粒，部分聚集成片状，见图8， 说明Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20能够穿透细胞膜进入细胞体内。
利用Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20与神经细胞共孵育后所测得的细胞 T2信号强度介于未孵育纯细胞与官能化的USPIO之间(图8)，说明 Tat-USPIO-Aβ40能够缩短T2弛豫时间，改变目标组织的T2信号强度， 磁共振图像上能够对目标区域起负性强化作用。
6月龄阳性鼠在尾静脉注射实施例2中制备的带有红色荧光Tat PTD-USPIO-Aβ16-20-HiLyte Fluor 555(0.01-20M)后24h可见到在皮 层及海马区有散在分布的小点状低T2信号区，见图9，脑区局部放 大见图10。制备脑组织切片后荧光显微镜下显像，见图11，之后将 脑组织切片进行特异性的老年斑硫磺素染色，见图12，可见磁共振 成像与组织学切片中Tat PTD-USPIO-Aβ16-20-HiLyte Fluor 555所在位 置以及老年斑病灶相吻合良好，说明靶向磁性纳米材料经静脉注射能 够突破血脑屏障进入脑内，进而特异性与老年斑结合，最终改变老年 斑的T2信号强度，达到活体诊断AD脑内老年斑的目的。所有阴性 小鼠在注射上述磁性纳米材料之前及之后不同的时间点后成像均没 有发现特异性的点状低信号区，所有月龄的阳性鼠在注射Tat PTD- USPIO-Aβ16-20-HiLyte Fluor 555之前扫描均没有明显的点状低信号改 变。
图9-12综合说明磁共振成像与组织学切片中本发明中的诊断试 剂所在的位置以及老年斑病灶均吻合良好。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明 做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实 施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施 例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一种阿尔茨海默病老年斑纳米靶向磁共振诊断对比剂，其特征在于：所述诊断对比剂包括有效量的诊断物Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20和生理可接受的水；所述诊断物Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20由超顺磁性纳米氧化铁颗粒USPIO和负载在超顺磁性纳米氧化铁颗粒上的两个短肽组成，且两个短肽分别人体免疫缺陷病毒HIV-1的转录活化因子肽段HIV-1Tat肽段和Aβ16-20肽段，其中，转录活化因子肽段的氨基酸序列为：GRKKRRQRRRPPQ，Aβ16-20肽段的氨基酸序列为：KLVFF。
2.根据权利要求1所述阿尔茨海默病老年斑纳米靶向磁共振诊断对比剂，其特征在于：所述超顺磁性纳米氧化铁颗粒的粒径为6～10nm。
3.根据权利要求1所述阿尔茨海默病老年斑纳米靶向磁共振诊断对比剂，其特征在于：所述诊断对比剂中，以铁元素含量计量该诊断对比剂中诊断物Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20的浓度为：其铁元素含量为0.01-20摩尔/升。
4.根据权利要求1所述阿尔茨海默病老年斑纳米靶向磁共振诊断对比剂，其特征在于：所述诊断物Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20的粒径为50-65nm。
5.一种权利要求1所述阿尔茨海默病老年斑纳米靶向磁共振诊断对比剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)利用水向共沉淀法制备葡聚糖包覆的超顺磁性纳米氧化铁颗粒：
a.将2-5重量份的葡聚糖溶解于5-10重量份的蒸馏水中，得到葡聚糖溶液；
b.将1-3重量份的FeCl3和1-4重量份的FeCl2溶于2-4重量份蒸馏水中，得到铁离子溶液；
c.将上述葡聚糖溶液和铁离子溶液混合均匀，并在惰性气体环境下磁力搅拌30-60mins，得到初级混合液，在温度为4～10℃，按体积比为1：2～4向初级混合液中以33-60滴/秒的速度滴加浓度为0.1-0.25mol/L的氨水；氨水滴加完毕后升温至60-70℃并继续磁力搅拌90-120mins；然后往制备好的葡聚糖覆的纳米氧化铁颗粒；
2)表面官能化的超顺磁性纳米氧化铁颗粒USPIO的制备：
a.制备好的葡聚糖包覆的纳米氧化铁颗粒中加入絮凝剂，在8000-9000转/min条件下离心10-20min，弃去上清液，得到沉淀物；
b.将沉淀物分散于蒸馏水中，得到含有超顺磁性纳米颗粒的混合溶液；
c.取2-4体积份的含有超顺磁性纳米颗粒的混合溶液与10-15体积份的含NaBH4的NaOH溶液在室温下混合均匀，在惰性气体环境下升温至60-70℃，边搅拌边加入3-5体积份的表氯醇，反应约10-12小时后取下，加入絮凝剂，离心，重新分散，洗涤三至五次后，重新分散于蒸馏水中；得到分散液；
d.向分散液5-10体积份的乙二胺，反应10-12小时后取下，加入絮凝剂，离心，洗涤后重新分散于pH值为7.4-8的磷酸缓冲溶液中，形成含有表官能化的超顺磁性纳米氧化铁颗粒USPIO的溶液；
3)交联剂溶液与磷酸盐溶液的混合液制备
按重量/体积比5～10:1～2mg/mL将3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯SPDP溶于二甲基亚砜中，得交联剂溶液，再将该交联剂溶液与浓度为0.1-0.2mol/L、pH＝7.4-8的磷酸盐缓冲溶液混合，得到交联剂溶液与磷酸盐溶液的混合液；
4)超顺磁性纳米氧化铁颗粒USPIO的交联
向3～5体积份的含有表面官能化的超顺磁性纳米氧化铁颗粒USPIO的溶液加入步骤3)得到的2～3体积份的混合液中，在室温下放置60～120分钟，置于超滤管中，6000-8000转/分离心50-60分钟，过滤去除杂质和未反应的交联剂溶液，得到经交联液处理过的表面官能化的超顺磁性纳米氧化铁颗粒USPIO磷酸盐溶液；其中超顺磁性纳米氧化铁颗粒USPIO磷酸盐溶液中，超顺磁性纳米氧化铁颗粒USPIO含量为1.0-2.5mg/mL；
5)诊断对比剂的制备
分别称取1-2体积份的浓度为0.02mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液和1-2体积份的浓度为0.2mol/L的3-二甲胺基丙基碳二亚胺EDC溶液，并加入上述3-5体积份交联溶液处理过的表面官能化的超顺磁性纳米氧化铁颗粒USPIO磷酸盐溶液中，在温度为35～40℃条件下放置30-90分钟，然后再加入3-5重量份的人体免疫缺陷病毒HIV-1的转录活化因子肽段HIV-1Tat肽段和3-5重量的份Aβ16-20肽段，混合后室温下放置10-12小时；置于超滤管中，6000-8000转/分离心40-60分钟，过滤去除杂质和未反应的成分，管中即为水相的诊断对比剂，诊断对比剂包括有效量的诊断物Tat-PTD-USPIO-Aβ16-20和生理可接受的水。
6.根据权利要求5所述阿尔茨海默病老年斑纳米靶向磁共振诊断对比剂的制备方法，其特征在于：所述步骤2)的第a小步中，絮凝剂为乙醇、甲醇、丙醇和丁醇中任意一种。
7.根据权利要求5所述阿尔茨海默病老年斑纳米靶向磁共振诊断对比剂的制备方法，其特征在于：所述步骤2)的第b小步中，NaOH浓度为1.8-2mol/L。
8.根据权利要求5所述阿尔茨海默病老年斑纳米靶向磁共振诊断对比剂的制备方法，其特征在于：所述步骤2)的第c小步中，惰性气为氮气或氩气。
9.根据权利要求5所述阿尔茨海默病老年斑纳米靶向磁共振诊断对比剂的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，交联剂溶液与磷酸盐溶液的体积用量比为1：1-2。
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MING MA等: ""Synthesis of amino-group functionalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles and applications as biomedical labeling probes"", 《J NANOPART RES》 *
熊永洁: ""阿尔茨海默病磁共振诊断磁对比剂及药物、细胞治疗的实验研究"", 《华中科技大学博士学位论文》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109364270A (zh) * 2018-10-25 2019-02-22 中国科学院过程工程研究所 一种具有寡聚体特异性的核磁造影剂及其制备方法与应用

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