KR102129179B1 - 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질을 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질을 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질을 기반으로 재조합된 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질로서, 서열번호1의 아미노산 서열로 이루어져 알츠하이머병의 발병을 지연시키거나 질환의 진행 속도를 늦출 수 있으며, 더 나아가 기억능력, 사고능력 및 행동능력의 퇴행과 관련된 증상을 정상 수준으로 회복시킬 수 있는 효과를 제공할 수 있다.
아울러, 본 발명은 서열번호1의 아미노산 서열로 이루도록 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질을 기반으로 재조합된 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이기도 하다.
아울러, 본 발명은 서열번호1의 아미노산 서열로 이루도록 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질을 기반으로 재조합된 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이기도 하다.
Description
본 발명은 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
치매의 가장 흔한 원인으로 75%에 가까운 치매 환자가 알츠하이머병(Alzheimer's disease)을 앓고 있다. 이와 같은 알츠하이머병은 기억력, 사고력 및 행동상의 문제가 발생하는 신경퇴행성 뇌질환으로, 정상적 노화에 비해 기억능력, 사고능력 및 행동능력의 가속화된 퇴행을 유발한다.
미국의 경우, 약 5백만 명 이상이 알츠하이머병 환자로 미국 내 사망원인 중 여섯 번째 많은 비중을 차지한다. 한국의 경우에도 농촌 지역 60세 이상의 인구에서 약 21%가 치매 양상을 보이고, 이 중 63%가 알츠하이머병으로 인한 치매인 것으로 보고되고 있다.
또한, 2006년에는 전 세계 26.6만 명이 알츠하이머병을 앓고 있고, 2050년에 이르면 85명 중 1명 꼴로 알츠하이머병이 발병될 것으로 예측되고 있어 심각하고 위험한 뇌질환이라 할 수 있다.
이에 따라, 현재 알츠하이머병 예방 또는 치료를 위해 많은 연구가 활발히 이루어지고 있고, 실제 알츠하이머병의 인지능력 퇴행 증상을 치료하기 위해 미국 식약청(FDA)의 승인을 거친 아리셉트(Aricept), 엑셀론(Exelon), 라자다인(Razadyne) 등의 콜린에스테라아제 억제제(Cholinesterase inhibitor, ChEI)와 나멘다(Namenda) 등의 메만틴 제제(Memantine)와 같은 치료 약물이 개발되어 있다.
아울러, 알츠하이머병 예방 또는 치료를 목적으로 한 약학 조성물과 관련된 종래기술에 대한 선행문헌에는 대한민국 공개특허공보 제10-2015-0065680호의"알츠하이머병의 치료방법 및 이의 약학적 조성물"(이하, '종래기술'이라고 함)이 있다.
하지만, 이러한 종래기술을 비롯한 기존의 알츠하이머병의 치료를 위해 마련된 약학 조성물의 경우, 알츠하이머병의 일부 증상을 완화시킬 뿐 질환 진행 과정 자체에 변화를 주지 못하는 실정이다.
또한, 종래기술을 비롯한 기존의 알츠하이머병의 치료를 위해 마련된 약학 조성물의 경우, 화학 성분에 기초한 조성의 생체 친화성이 낮고, 부작용 발생률이 높았으며, 생산성을 고려한 대량 생산 및 품질 관리에서 어려움을 겪고 있다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해 창작된 것으로써, 본 발명의 목적은 알츠하이머병의 발병을 지연시키거나 질환의 진행 속도를 늦출 수 있으며, 더 나아가 기억능력, 사고능력 및 행동능력의 퇴행과 관련된 증상을 정상 수준으로 회복시킬 수 있는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따른 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질은, Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 재조합 단백질로서, 서열번호1의 아미노산 서열로 이루어진다.
여기서, Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 재조합되어 서열번호1의 아미노산 서열로 이루는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질은 예방 또는 치료 대상 뇌의 대뇌피질(Cerebrum Cortex) 및 해마(Hippocampus)에서의 아밀로이드(Amyloid) 표지인자인 Thioflavin-S 및 6E10(Anti-amyloid beta) 중 적어도 하나 이상의 발현을 현저히 감소시킬 수 있다.
또한, Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 재조합되어 서열번호1의 아미노산 서열로 이루는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질은 예방 또는 치료 대상 뇌의 대뇌피질(Cerebrum Cortex) 및 해마(Hippocampus)에서의 미세아교세포(Microglia) 표지인자인 IBA-1(Ionized Calcium-Binding Adaptor Molecule-1) 및 성상교세포(Astrocyte) 표지인자인 GFAP(Glial Fibrillary Acidic Protein) 중 적어도 하나 이상의 발현을 현저히 감소시킬 수 있다.
또한, Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 재조합되어 서열번호1의 아미노산 서열로 이루는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질은 병변내 투여, 혈관내 투여, 피하 투여, 비강내 투여, 복강내 투여, 뇌실질내 투여 또는 뇌실내 투여용으로 제형화될 수 있다.
한편, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따른 알츠하이머병 예방 또는 치료용 조성물은, Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 재조합되어 서열번호1의 아미노산 서열로 이루는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질을 유효성분으로 포함한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 재조합되어 서열번호1의 아미노산 서열로 이루는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 또 다른 하나의 양태로서 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 재조합되어 서열번호1의 아미노산 서열로 이루는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 또 다른 하나의 양태로서 제공한다.
본 발명에 의하면 다음과 같은 효과가 있다.
첫째, 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질을 통해 알츠하이머병에 의해 퇴행되었던 치료대상의 신경학적 행동 및 인지기억 능력을 정상 수준으로 회복시킬 수 있다.
둘째, 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질을 통해 알츠하이머병 발병에 영향을 주는 신경세포의 퇴화 유발과 관련된 베타 아밀로이드(β-Amyloid)의 뇌 조직 내 축적을 해소할 수 있다.
셋째, 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질을 통해 뇌 조직 내 염증반응 발생에 매개체로 작용하는 미세아교세포(Microglia)의 발현을 현저히 감소시켜 뇌 조직 내 항염증 반응을 제공할 수 있다.
넷째, 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질을 통해 알츠하이머병 발병의 원인이 되는 성상교세포(Astrocyte)의 발현을 현저히 감소시킬 수 있다.
다섯째, 생체 친화적이고, 부작용이 적은 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 조성물을 제공할 수 있다.
여섯째, 대량 생산 및 품질관리가 용이한 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 조성물을 제공할 수 있다.
도1은 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)을 코딩하는 유전자가 삽입된 Backbone Vector의 구조를 도시하고 있다.
도2는 도1에 도시된 Backbone Vector의 구조 내 삽입될 수 있으며, 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)을 코딩하는 유전자의 DNA 염기서열을 도시하고 있다.
도3은 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 아미노산 서열을 도시하고 있다.
도4는 알츠하이머병 동물모델인 5XFAD 생쥐와 정상의 야생형(Wild Type) 생쥐를 이용한 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증 시험의 설계를 나타낸 모식도이다.
도5는 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델들의 3.5개월 차 Y자형 미로실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도6은 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델들의 6.5개월 차 Y자형 미로실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도7은 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델들의 3.5개월 차 수동 회피반응 시험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도8은 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델들의 6.5개월 차 수동 회피반응 시험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도9는 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델들의 뇌 조직 내 Thioflavin S 염색 결과 및 양성 세포 수 혹은 면적을 측정한 결과를 도시하고 있다.
도10은 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델들의 뇌 조직 내 6E10 관련 염색 결과 및 양성 세포 수 혹은 면적을 측정한 결과를 도시하고 있다.
도11은 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델들의 뇌 조직 내 IBA-1 관련 염색 결과 및 양성 세포 수 혹은 면적을 측정한 결과를 도시하고 있다.
도12는 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델들의 뇌 조직 내 GFAP 관련 염색 결과 및 양성 세포 수 혹은 면적을 측정한 결과를 도시하고 있다.
도2는 도1에 도시된 Backbone Vector의 구조 내 삽입될 수 있으며, 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)을 코딩하는 유전자의 DNA 염기서열을 도시하고 있다.
도3은 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 아미노산 서열을 도시하고 있다.
도4는 알츠하이머병 동물모델인 5XFAD 생쥐와 정상의 야생형(Wild Type) 생쥐를 이용한 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증 시험의 설계를 나타낸 모식도이다.
도5는 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델들의 3.5개월 차 Y자형 미로실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도6은 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델들의 6.5개월 차 Y자형 미로실험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도7은 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델들의 3.5개월 차 수동 회피반응 시험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도8은 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델들의 6.5개월 차 수동 회피반응 시험의 결과를 나타낸 그래프이다.
도9는 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델들의 뇌 조직 내 Thioflavin S 염색 결과 및 양성 세포 수 혹은 면적을 측정한 결과를 도시하고 있다.
도10은 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델들의 뇌 조직 내 6E10 관련 염색 결과 및 양성 세포 수 혹은 면적을 측정한 결과를 도시하고 있다.
도11은 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델들의 뇌 조직 내 IBA-1 관련 염색 결과 및 양성 세포 수 혹은 면적을 측정한 결과를 도시하고 있다.
도12는 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위해 설계된 동물실험 모델들의 뇌 조직 내 GFAP 관련 염색 결과 및 양성 세포 수 혹은 면적을 측정한 결과를 도시하고 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 첨부된 도면을 참조하여 더 구체적으로 설명하되, 이미 주지된 기술적 부분에 대해서는 설명의 간결함을 위해 생략하거나 압축하기로 한다.
1. 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)에 관한 설명
본 발명에 따른 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 수득이 이루어지는 과정 및 수득된 단백질의 구조적 특징에 대해 이하에서 도1 내지 도3을 참조하여 상세하게 설명한다.
(1) 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 수득
먼저 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 발현 과정을 설명하면, Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 구조 개량을 위해 Origene사의 MFG-E8(NM_005928) Human cDNA Clone (Cat. No. RG217163)을 구입하여, 이를 주형(Template)으로 사용하고 PCR을 진행하여 도2에 도시된 바와 같은 DNA 단편(fragments)을 획득(서열번호4 참고)한다.
그 후, 도1에 도시된 바와 같은 구조의 Mammalian expression Vector인 pLFCF Vector의 HindⅢ 및 SalⅠ 제한효소 부위(도1의 A부위)에 PCR 증폭을 통해 수득한 도2의 DNA 단편(서열번호4 참고)을 삽입하는 클로닝을 진행한다.
이 후, plasmid DNA를 추출하여 HEK293 세포로 형질도입(Transfection)하여 2일 후 배양액을 모아 FLAG resin으로 면역침강반응(IP, Immunoprecipitation)하여 웨스턴 블로팅(Western Blotting)으로 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)에 해당하는 재조합 단백질의 발현을 확인한다.
다음으로 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 대량 생산 과정을 설명하면, 발현의 확인을 거친 plasmid DNA를 Maxi prep을 통해 다량 확보한 후, HEK293 세포를 준비하여 대량의 plasmid DNA를 HEK293 세포에 형질도입하여 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)에 해당하는 재조합 단백질의 대량 생산을 수행할 수 있다.
다음으로 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 품질 관리를 위한 정제 과정을 설명하면, Corning사의 CellSTACK Cell Culture Chamer 10개를 준비하여 HEK293 세포를 도포한 뒤, 1600μg의 plasmid DNA와 3200μl의 Transfection Reagents를 상온에서 15분간 혼합한 후, 형질도입을 수행한다.
형질 도입 수행 4시간 뒤, 배양액을 교체해주고 6일간 추가 배양을 진행하였으며, 배양액은 2일마다 총 3번 수거하여 수거된 배양액에서 Affinity식 단백질 정제를 진행한다.
이와 같은 정제 과정은 각각의 단백질의 C-terminal에 FLAG 유전자가 발현(서열번호8 참고)되어 있으므로 FLAG affinity resin을 이용해 표적 단백질만 결합시킨 뒤, 세척 완충액(Washing Buffer)으로 세척하여 표적 단백질을 제외한 단백질들을 제거할 수 있다.
이 후, 용출 완충액(Elution Buffer)을 이용해 순수한 표적 단백질만을 추출한 뒤, 최종적으로 획득한 단백질 확인을 위해 SDS-PAGE를 진행하여 Coomassie Blue 염색 및 Anti-FLAG 항체를 이용한 웨스턴 블로팅(Western Blotting)을 통해 표적단백질의 생산 및 순도를 확인할 수 있다.
이와 같은 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질에 기반을 두고 재조합되어 마련되는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 발현을 위한 클로닝, 대량생산 및 정제 등을 위해 앞 서 설명된 일련의 구체적 과정은 이에 한정되는 것이 아니라, 아래 설명되어질 재조합 단백질의 구체적인 아미노산 서열 구조(서열번호1 및 도3 참고)의 구축을 위해 당업계의 기술자들에게 공지되고 자명한 수준의 기술을 이용한 다양한 방식으로 구현 가능하다.
예를 들어, Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질에 기반을 두고 재조합되어 마련되는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 클로닝에 이용되는 발현 벡터의 구조, 형질전환 수행 대상, 생산 조건 및 형태, 정제 조건 및 형태 등의 기술은 다양하게 실시 가능하다.
아울러, Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질에 기반을 두고 재조합되어 마련되는 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 발현과 관련하여 발현 벡터에 클로닝되는 DNA 단편(fragments)의 구조 역시 도2의 구조를 기본으로 하되, 실시에 따라 특정 Signal Peptide를 코딩하는 특정 DNA 염기서열이 추가로 DNA 단편(fragments)에 연결되는 형태로 실시 될 수도 있다.
(2) 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 구조
앞 서 설명한, 재조합 단백질의 클로닝, 분리, 생산, 정제 등의 과정을 거쳐 최종적으로 마련되는 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)은 하기 서열목록 내 서열번호1 또는 도3에 도시된 바와 같은 아미노산 서열 구조를 갖춘다.
특징적으로, Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)은 MFG-E8 단백질의 구조적 구성인 EGF-like Domain, C1 Domain 및 C2 Domain 중 EGF-like Domain(서열번호2 참고) 및 C1 Domain(서열번호3 참고)을 포함하는 구조로 재조합된다.
다시 말해, 본 발명의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)은"EGF-like Domain+C1 Domain"의 아미노산 서열을 이루는 것을 기본 구조로 삼고 있고, C2 Domain이 구조 상 배제되어짐을 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)은 알츠하이머병 예방 또는 치료용으로 이용되는 약학적 조성물의 주요 유효성분으로 이용될 수 있다.
아울러, 본 발명의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011) 및 이를 주요 유효성분으로 하는 약학적 조성물은 병변내 투여, 혈관(동맥, 정맥 등)내 투여, 피하 투여, 비강내 투여, 복강내 투여, 특정 조직(뇌조직)내 투여, 뇌실질내 투여 또는 뇌실내 투여용으로 제형화할 수 있다.
한편, 본 발명의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)은 앞 서 설명한 재조합 단백질의 발현과 관련하여 발현 벡터에 클로닝되는 DNA 단편(fragments)의 구조적 실시 형태의 범위와 대응되어 실시에 따라 특정 Signal Peptide 구조의 추가 연결이 이루어질 수도 있다.
예를 들어, 특정 Signal Peptide 구조는"MPRPRLLAALCGALLCAPSLLVA"와 같은 아미노산 서열(서열번호5 참고)을 갖추어 EGF-like Domain 선단에 연결되는 형태로 실시 가능하나 이에 한정되지는 아니한다.
2. 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증 시험 결과에 관한 설명
본 발명의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)과 관련하여 해당 재조합 단백질에 기인한 알츠하이머병 예방 또는 치료의 효과 수준 검증 및 MFG-E8 단백질과의 효과 비교를 시험을 통해 확인하였으며, 해당 시험은 당업계의 기술자들에게 자명한 수단에 의한 성질 등을 정의하기 위한 목적으로 하기 실험 방법들을 이용하였다.
(1) 알츠하이머병 동물모델의 제작 및 실험설계
우선, 알츠하이머병 동물모델인 5XFAD 생쥐는 한국뇌연구원에서 제공받아 교배 후 실험에 사용하였다.
가족성 치매 유전자를 지닌 5XFAD 생쥐(Tg6799; B.6SJL-Tg [APPSweFlLon, PSEN*M146L*L286V] 6799 Vas/J, stock no. 006554)는 세 개의 인간 APP 695 돌연변이 (Swedish, Florida 그리고, London)와 신경세포에만 과발현하는 Thy-1 promoter의 전사 조절하에 2개의 PS1 돌연변이(M146L, L286V)가 과발현되어 있다.
이러한 5XFAD 생쥐의 생후 3주째에 산자들로부터 꼬리 조직을 채취해 GeneAll사의 GenEx Tissue kit로 조직을 분쇄하고, 이소프로판올(Isopropanol)을 처리해 Genomic DNA를 분리하였다.
산자들의 유전형 확인은 하기 표1의 프라이머(서열번호6 및 서열번호7 참고)들을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR, Polymerase chain reaction)을 수행하였으며, PCR 수행 후 야생형(Wild Type) 생쥐의 유전형은 324 b.p에서, 5XFAD 생쥐는 377 b.p에서 DNA크기를 확인하였다.
| TYPE | 정방향(5'→3') |
| Transgene | AGGACTGACCACTCGACC AGCGGGGGTCTAGTTCTGCAT |
| Wild Type | CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC |
실험군으로는 알츠하이머병 동물모델인 3개월령의 5XFAD 생쥐(n=4-5)와 정상의 야생형(Wild Type) 한배 새끼 생쥐(n=5)를 사용하였으며, 이들을 이용한 치료효과 검증 실험 방범의 진행 모식도는 도4에 도시된 바와 같다.
구체적으로, Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)은 1일 기준 160μg/kg의 용량으로 알츠하이머병 동물모델인 3개월령의 5XFAD 생쥐의 꼬리 정맥 내로 하루에 한 번씩 총 15일간 15회에 걸쳐 투여했고, 대조물질인 생리식염수(PBS)도 동량을 동일 방법으로 투여했다.
이에 따른 동물 모델의 행동 분석 및 기업 시험의 실험 설계는 도4에 도시된바와 같이 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011) 혹은 생리식염수(PBS)의 투여 직후인 3.5개월의 제1실험군과 재조합 단백질(NP-011) 혹은 생리식염수(PBS)의 투여 후 투여를 3개월간 중단한 6.5개월의 제2실험군으로 구분하여 시험을 진행하도록 이루어졌다.
또한, 동물 모델의 뇌 조직 적출을 통한 조직 검사 시험의 실험 설계는 도4에 도시된 바와 같이 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011) 혹은 생리식염수(PBS)의 투여 후 투여를 3개월간 중단한 6.5개월의 제2실험군을 대상으로 시험을 진행하였다.
(2) 알츠하이머병 동물모델(5XFAD 생쥐)의 행동 분석-Y자형 미로 실험
본 발명의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과를 확인하기 위하여, 알츠하이머병 생쥐의 기억능력을 평가하는 Y자형 미로실험(Y-maze test)을 수행하였다.
구체적으로, Y 자형 미로 장치는 세 갈래의 가지가 120°로 동일하게 배치된 백색의 아크릴판 (35cm×6cm×15cm)으로 구성되어 있으며, 각 가지를 A, B, C로 정한 후 한 쪽 가지에 실험동물을 조심스럽게 놓고 8분간 자유롭게 탐색하도록 하고 그 움직임을 비디오 카메라로 녹화하였다.
또한, 네 발이 모두 한 쪽 가지에 완전히 들어가야 1회 출입으로 인정하고, 세 개의 서로 다른 가지에 차례로 진입한 경우를 실제 변경(actual alternation)으로 규정하였다.
즉, ABC, ACB, BAC, BCA, CAB, CBA를 각각 1점으로 인정한다. 자발적 변경율(spontaneous alteration)은 다음의 수식으로 계산하였으며, 높은 자발적 변경율은 기억 능력이 향상된 것으로 간주할 수 있다.
- 자발적 변경율 계산식 : Alternation (%)= 실제 변경/(총 변경-2)×100
이에 따른 앞 설명한 도4의 모식도에 따른 제1실험군과 제2실험군의 재조합 단백질(NP-011)의 투여가 이루어진 알츠하이머병 동물모델인 5XFAD 생쥐, 생리식염수(PBS)의 투여가 이루어진 알츠하이머병 동물모델인 5XFAD 생쥐 및 정상의 야생형(Wild Type) 생쥐 각각의 Y자형 미로실험(Y-maze test) 결과는 도5 및 도6(도면참고- *P<0.05, **P<0.01)에 도시된 바와 같다.
우선, 3개월의 알츠하이머병 동물모델 5XFAD 생쥐의 경우, 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 15일 간 투여 직후(3.5개월)에는 자발적 변경율이 도5에 도시된바와 같이 정상의 야생형(Wild Type) 생쥐의 수준으로 회복되지 않았다.
하지만, 3개월의 알츠하이머병 동물모델 5XFAD 생쥐에 15일 간 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)를 투여한 후 3개월 간 투여를 중단하여 방치한 뒤에는 자발적 변경율이 도6에 도시된 바와 같이 정상의 야생형(Wild Type) 생쥐의 수준에 가깝게 회복되어 신경학적 행동 수준 및 기억 능력의 회복이 상당 부분 진행됨을 확인할 수 있었다.
(3) 알츠하이머병 동물모델(5XFAD 생쥐)의 행동 분석-수동 회피반응 실험
본 발명의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과를 확인하기 위하여, 앞 서 설명한 Y 자형 미로 실험을 수행한 동물모델들을 대상으로 혐오자극에 대한 기억력을 평가하는 수동 회피반응 실험(Passive avoidance test)을 하였다.
구체적으로, 수동 회피반응 실험은 바닥에 전기충격장치가 있는 두 개의 공간으로 구성된 상자 (avoidance system; sitechkorea)를 이용하였으며, 두 개의 공간 사이에는 길로틴 도어(guillotine door)가 장착되어 있어 두 공간의 왕래가 가능하다. 훈련 시도일에 동물을 한 공간 (A chamber)에 넣고, 15초간 탐색하게 한다.
이 후, 15초가 경과된 시점에서 생쥐가 있는 공간에 불이 켜지고, 길로틴 도어가 열리면, 반대편 어두운 공간( B chamber)으로 생쥐가 이동하게 된다. 동물의 네 발이 모두 어두운 공간으로 진입하면 길로틴 도어가 닫히면서 전기 충격(0.3mA, 3초)이 주어진다.
훈련 시도 후 24시간째에 기억유지검사(retention test)를 시행하였으며, 훈련시도에서와 같이 동물모델이 된 생쥐들을 한 공간에 넣어, 불을 켜고 길로틴 도어를 열어 반대쪽의 어두운 상자로 이동하는데 걸리는 시간(response latency)을 기록하였다.
이에 따른 앞 설명한 도4의 모식도에 따른 제2실험군의 재조합 단백질(NP-011)의 투여 후 3개월간의 정체가 이루어진 알츠하이머병 동물모델인 5XFAD 생쥐, 생리식염수(PBS)의 투여 후 3개월간의 정체가 이루어진 알츠하이머병 동물모델인 5XFAD 생쥐 및 6.5개월이 경과된 정상의 야생형(Wild Type) 생쥐 각각의 Y수동 회피반응 실험 결과는 도7 및 도8에 도시된 바와 같다.
우선, 3개월의 알츠하이머병 동물모델 5XFAD 생쥐의 경우, 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 15일 간 투여 직후(3.5개월)에는 훈련 후 기억력 회복의 효과가 도7에 도시된바와 같이 거의 보이지 않았다.
하지만, 3개월의 알츠하이머병 동물모델 5XFAD 생쥐에 15일 간 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)를 투여한 후 3개월 간 투여를 중단하여 방치한 뒤에는 훈련 후 기억력 회복의 효과가 도8에 도시된 바와 같이 기억력의 회복이 상당 부분 진행됨을 확인할 수 있었다.
(4) 알츠하이머병 동물모델(5XFAD 생쥐)의 뇌 조직 분석
본 발명의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과를 확인하기 위하여, 앞 서 설명한 Y 자형 미로 실험 및 수동 회피반응 실험을 수행한 동물모델들의 실제 뇌 조직 내 특정 성분들의 변화를 알아보기 위해 조직화학적 분석을 수행했다.
우선, 제2실험군의 각 동물들(재조합 단백질(NP-011)의 투여 후 3개월간의 정체가 이루어진 알츠하이머병 동물모델인 5XFAD 생쥐, 생리식염수(PBS)의 투여 후 3개월간의 정체가 이루어진 알츠하이머병 동물모델인 5XFAD 생쥐 및 6.5개월이 경과된 정상의 야생형(Wild Type) 생쥐)은 마취 후 심장관류를 통해 4% 파라포름알데히드로 고정하여 뇌 조직을 적출하였다.
여기서, 적출된 뇌 조직들은 30% sucrose 용액에서 4일간 냉장보관하였다. 이후, 동결 포매제(OCT compound)로 포매한 뇌조직은 냉동절편기(CM3050S, Leica)를 사용하여 20㎛의 두께로 잘라 슬라이드 (silane coated slide)에 부착시켰다.
다음으로, 뇌 조직의 해마와 피질부위에서 아밀로이드 플라크의 침착을 평가하기 위해 Thioflavin S염색을 수행하였다.
구체적으로, 뇌조직 절편은 자일렌에서 지방질이 제거되고, 연속적으로 알코올 용액(100%, 95%, 80% 및 70%)을 거쳐 수화되었으며, 증류수로 세척된 슬라이드를 1% Thioflavin S 용액에서 15분간 염색하여, 탈수과정을 거쳐 커버슬립으로 봉입하였다.
또한, 뇌 조직에서의 염증반응과 아밀로이드 베타 단백질의 발현양상을 평가하기 위해서는 면역조직화학적 분석을 수행하였다.
먼저, 뇌 조직 절편을 염소혈청완충액 (10% horse serum, 0.3% Triton X-100 in PBS)으로 반응시켜 비특이적 항체 결합을 차단한 후, 각 일차항체를 4ㅀC에서 면역 반응시켰다.
여기서, 일차항체는 6E10(1:400; biolegend), IBA-1(1:200; Wako), GFAP(Glial fibrillary acidic protein / 1:200; Dako)이 해당된다.
또한. 완충용액으로 세척한 뇌 조직 절편은 이어서 Alexa 488 또는 Alexa594 형광 접합된 이차항체와 반응시켰고, 마운팅 용액을 사용해 커버슬립으로 봉입하였다. 염색을 마친 조직 슬라이드는 형광현미경 (BX61; Olympus)하에서 이미지를 얻어 양성세포 수와 면적을 측정하였다.
이를 통한 뇌 조직의 조직화학적 분석 결과는 도9 내지 도12에 도시된 바와 같으며, 우선 도9는 제2실험군의 각 동물들 뇌 조직 내 Thioflavin S 염색 결과 및 양성 세포 수 혹은 면적을 측정한 결과를 도시하고 있다.
구체적으로, 알츠하이머병 동물모델 5XFAD 생쥐에 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)를 투여할 경우, 도9에 도시된 바와 같이 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)을 투여한 알츠하이머병 동물모델 5XFAD 생쥐의 뇌 조직 중 대뇌피질(Cerebrum Cortex) 및 해마(Hippocampus) 내 아밀로이드(Amyloid) 표지인자인 Thioflavin-S의 축적이 생리식염수(PBS)를 투여한 알츠하이머병 동물모델 5XFAD 생쥐와 비교해 감소하고 있음을 확인할 수 있다.
또한, 도10(도면참고- Scale Bar=100μm, ***P<0.001)은 제2실험군의 각 동물들 뇌 조직 내 6E10 관련 염색 결과 및 양성 세포 수 혹은 면적을 측정한 결과를 도시하고 있다.
구체적으로, 알츠하이머병 동물모델 5XFAD 생쥐에 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)를 투여할 경우, 도10에 도시된 바와 같이 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)을 투여한 알츠하이머병 동물모델 5XFAD 생쥐의 뇌 조직 중 대뇌피질(Cerebrum Cortex) 및 해마(Hippocampus) 내 아밀로이드(Amyloid) 표지인자인 6E10의 축적이 생리식염수(PBS)를 투여한 알츠하이머병 동물모델 5XFAD 생쥐와 비교해 현저히 감소하고 있음을 확인할 수 있다.
여기서, Thioflavin-S 및 6E10의 표지 대상이 되는 대뇌피질(Cerebrum Cortex) 및 해마(Hippocampus) 내 아밀로이드(Amyloid)는 알츠하이머병 발병에 영향을 준다.
따라서 뇌 조직 내에 베타 아밀로이드(β-Amyloid)가 축척되면 뇌 조직 내 신경세포의 퇴화가 유발되고 이는 곧 알츠하이머병의 발병을 이어지게 되므로, 대뇌피질(Cerebrum Cortex) 및 해마(Hippocampus) 내 아밀로이드(Amyloid) 표지인자인 Thioflavin-S 및 6E10(Anti-amyloid beta)의 발현 감소가 확인됨은 알츠하이머병에 의한 신경학적 퇴행을 회복시키고 병을 치료하고 있음을 의미한다.
다음으로, 도11(도면참고- Scale Bar=20μm, ***P<0.001)은 제2실험군의 각 동물들 뇌 조직 내 IBA-1 관련 염색 결과 및 양성 세포 수 혹은 면적을 측정한 결과를 도시하고 있다.
구체적으로, 알츠하이머병 동물모델 5XFAD 생쥐에 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)를 투여할 경우, 도11에 도시된 바와 같이 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)을 투여한 알츠하이머병 동물모델 5XFAD 생쥐의 뇌 조직 중 대뇌피질(Cerebrum Cortex) 및 해마(Hippocampus) 내 미세아교세포(Microglia) 표지인자인 IBA-1의 축적이 생리식염수(PBS)를 투여한 알츠하이머병 동물모델 5XFAD 생쥐와 비교해 현저히 감소하여 정상 수준에 가까워지고 있음을 확인할 수 있다.
여기서, IBA-1의 표지 대상이 되는 대뇌피질(Cerebrum Cortex) 및 해마(Hippocampus) 내 미세아교세포(Microglia)는 뇌 조직의 염증반응을 매개하는 염증세포이다.
따라서 대뇌피질(Cerebrum Cortex) 및 해마(Hippocampus) 내 미세아교세포(Microglia)의 표지인자인 IBA-1의 발현 감소가 확인됨은 알츠하이머병에 의한 뇌 조직의 염증반응을 일으키는 미세아교세포(Microglia)의 양이 감소하며 항염 효과가 이루어져 병증 악화가 방지 혹은 감소하고 있음을 의미한다.
마지막으로, 도12(도면참고- Scale Bar=50μm, **P<0.01)는 제2실험군의 각 동물들 뇌 조직 내 GFAP(Glial fibrillary acidic protein) 관련 염색 결과 및 양성 세포 수 혹은 면적을 측정한 결과를 도시하고 있다.
구체적으로, 알츠하이머병 동물모델 5XFAD 생쥐에 본 발명의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)를 투여할 경우, 도12에 도시된 바와 같이 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)을 투여한 알츠하이머병 동물모델 5XFAD 생쥐의 뇌 조직 중 대뇌피질(Cerebrum Cortex) 및 해마(Hippocampus) 내 성상교세포(Astrocyte) 표지인자인 GFAP의 축적이 생리식염수(PBS)를 투여한 알츠하이머병 동물모델 5XFAD 생쥐와 비교해 현저히 감소하여 정상 수준에 가까워지고 있음을 확인할 수 있다.
여기서, GFAP의 표지 대상이 되는 대뇌피질(Cerebrum Cortex) 및 해마(Hippocampus) 내 성상교세포(Astrocyte)는 알츠하이머병의 병인 발생(Pathogenesis)에 관여하는 세포이다.
따라서 대뇌피질(Cerebrum Cortex) 및 해마(Hippocampus) 내 성상교세포(Astrocyte)의 표지인자인 GFAP의 발현 감소가 확인됨은 알츠하이머병을 발병시킬 수 있는 성상교세포(Astrocyte)의 양이 감소하여 알츠하이머병의 발병 가능성이 낮아져 발병이 예방될 수 있음을 의미한다.
즉, 본 발명의 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)의 효과 검증을 위한 뇌 조직의 조직화학적 분석을 수행한 결과, Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 알츠하이머병 예방 또는 치료용 재조합 단백질(NP-011)를 투여하면 신경세포의 퇴화 유발과 관련된 베타 아밀로이드(β-Amyloid), 뇌 조직 내 염증반응 발생에 매개체로 작용하는 미세아교세포(Microglia) 및 알츠하이머병 발병의 원인이 되는 성상교세포(Astrocyte)의 뇌 조직 내 발현 및 축적이 감소하여 궁극적인 알츠하이머병 예방 또는 치료가 가능해진다.
본 발명에 개시된 실시예는 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의해서 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 보호범위는 아래 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> NEXEL CO.,LTD.
<120> RECOMBINANT PROTEIN FOR ALZHEIMER'S DISEASE TREATMENT OR
PREVENTION AND COMPOSITION FOR ALZHEIMER'S DISEASE TREATMENT OR
PREVENTION CONTAINING THEREOF
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<160> 8
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 202
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RECOMBINANT PROTEIN(NP-011) FOR ALZHEIMER'S DISEASE TREATMENT OR
PREVENTION
<400> 1
Leu Asp Ile Cys Ser Lys Asn Pro Cys His Asn Gly Gly Leu Cys Glu
1 5 10 15
Glu Ile Ser Gln Glu Val Arg Gly Asp Val Phe Pro Ser Tyr Thr Cys
20 25 30
Thr Cys Leu Lys Gly Tyr Ala Gly Asn His Cys Glu Thr Lys Cys Val
35 40 45
Glu Pro Leu Gly Met Glu Asn Gly Asn Ile Ala Asn Ser Gln Ile Ala
50 55 60
Ala Ser Ser Val Arg Val Thr Phe Leu Gly Leu Gln His Trp Val Pro
65 70 75 80
Glu Leu Ala Arg Leu Asn Arg Ala Gly Met Val Asn Ala Trp Thr Pro
85 90 95
Ser Ser Asn Asp Asp Asn Pro Trp Ile Gln Val Asn Leu Leu Arg Arg
100 105 110
Met Trp Val Thr Gly Val Val Thr Gln Gly Ala Ser Arg Leu Ala Ser
115 120 125
His Glu Tyr Leu Lys Ala Phe Lys Val Ala Tyr Ser Leu Asn Gly His
130 135 140
Glu Phe Asp Phe Ile His Asp Val Asn Lys Lys His Lys Glu Phe Val
145 150 155 160
Gly Asn Trp Asn Lys Asn Ala Val His Val Asn Leu Phe Glu Thr Pro
165 170 175
Val Glu Ala Gln Tyr Val Arg Leu Tyr Pro Thr Ser Cys His Thr Ala
180 185 190
Cys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Leu Gly Cys
195 200
<210> 2
<211> 44
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGF-like domain part in Recombinant Protein(NP-011)
<400> 2
Leu Asp Ile Cys Ser Lys Asn Pro Cys His Asn Gly Gly Leu Cys Glu
1 5 10 15
Glu Ile Ser Gln Glu Val Arg Gly Asp Val Phe Pro Ser Tyr Thr Cys
20 25 30
Thr Cys Leu Lys Gly Tyr Ala Gly Asn His Cys Glu
35 40
<210> 3
<211> 158
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C1 domain part in Recombinant Protein(NP-011)
<400> 3
Thr Lys Cys Val Glu Pro Leu Gly Met Glu Asn Gly Asn Ile Ala Asn
1 5 10 15
Ser Gln Ile Ala Ala Ser Ser Val Arg Val Thr Phe Leu Gly Leu Gln
20 25 30
His Trp Val Pro Glu Leu Ala Arg Leu Asn Arg Ala Gly Met Val Asn
35 40 45
Ala Trp Thr Pro Ser Ser Asn Asp Asp Asn Pro Trp Ile Gln Val Asn
50 55 60
Leu Leu Arg Arg Met Trp Val Thr Gly Val Val Thr Gln Gly Ala Ser
65 70 75 80
Arg Leu Ala Ser His Glu Tyr Leu Lys Ala Phe Lys Val Ala Tyr Ser
85 90 95
Leu Asn Gly His Glu Phe Asp Phe Ile His Asp Val Asn Lys Lys His
100 105 110
Lys Glu Phe Val Gly Asn Trp Asn Lys Asn Ala Val His Val Asn Leu
115 120 125
Phe Glu Thr Pro Val Glu Ala Gln Tyr Val Arg Leu Tyr Pro Thr Ser
130 135 140
Cys His Thr Ala Cys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Leu Gly Cys
145 150 155
<210> 4
<211> 609
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA fragment encoding Recombinant Protein(NP-011)
<400> 4
ctggatatct gcagcaaaaa cccgtgccac aacggtggcc tgtgcgagga aattagccaa 60
gaggtgcgtg gtgacgtttt cccgagctac acctgcacct gcctgaaggg ctatgcgggt 120
aaccactgcg agaccaaatg cgtggaaccg ctgggcatgg agaacggtaa catcgcgaac 180
agccagattg cggcgagcag cgtgcgtgtt acctttctgg gcctgcaaca ctgggttccg 240
gaactggcgc gtctgaaccg tgcgggtatg gttaacgcgt ggaccccgag cagcaacgac 300
gataacccgt ggatccaggt gaacctgctg cgtcgtatgt gggttaccgg cgtggttacc 360
cagggtgcga gccgtctggc gagccacgag tacctgaagg cgttcaaagt tgcgtatagc 420
ctgaacggcc acgaattcga ctttattcac gatgtgaaca agaaacacaa ggagttcgtt 480
ggtaactgga acaaaaacgc ggtgcacgtt aacctgtttg agaccccggt ggaagcgcag 540
tacgttcgtc tgtatccgac cagctgccac accgcgtgca ccctgcgttt tgaactgctg 600
ggttgctaa 609
<210> 5
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Signal peptide Example for NP-011
<400> 5
Met Pro Arg Pro Arg Leu Leu Ala Ala Leu Cys Gly Ala Leu Leu Cys
1 5 10 15
Ala Pro Ser Leu Leu Val Ala
20
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense primers for Transgene Type used for PCR
<400> 6
aggactgacc actcgaccag cgggggtcta gttctgcat 39
<210> 7
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense primers for Wild Type used for PCR
<400> 7
ctaggccaca gaattgaaag atctgtaggt ggaaattcta gcatcatcc 49
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FLAG tag in pLFCF Vector
<400> 8
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
Claims (7)
- 서열번호1의 아미노산 서열로 이루어진 Milk fat globule-EGF factor 8(MFG-E8) 단백질 기반의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는
알츠하이머병 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 재조합 단백질은 예방 또는 치료 대상 뇌의 대뇌피질(Cerebrum Cortex) 및 해마(Hippocampus) 내 아밀로이드(Amyloid) 표지인자인 Thioflavin-S 및 6E10(Anti-amyloid beta) 중 적어도 하나 이상의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는
알츠하이머병 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 재조합 단백질은 예방 또는 치료 대상 뇌의 대뇌피질(Cerebrum Cortex) 및 해마(Hippocampus) 내 미세아교세포(Microglia) 표지인자인 IBA-1(Ionized Calcium-Binding Adaptor Molecule-1) 및 성상교세포(Astrocyte) 표지인자인 GFAP(Glial Fibrillary Acidic Protein) 중 적어도 하나 이상의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는
알츠하이머병 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 알츠하이머병 예방 또는 치료용 조성물은 병변내 투여, 혈관내 투여, 피하 투여, 비강내 투여, 복강내 투여, 뇌실질내 투여 또는 뇌실내 투여용으로 제형화되는 것을 특징으로 하는
알츠하이머병 예방 또는 치료용 조성물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
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2018
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| Genebank, AAP36434.1, Homo sapiens milk fat globule-EGF factor 8 protein, partial [synthetic construct], (2016.07.25.) |
| Genebank, XP_016877695.1, lactadherin isoform X2 [Homo sapiens], (2018.05.26.) |
| Li et al., Journal of Neuroinflammation 2012, 9:148 (2012) |
| Monowar Aziz and Ping Wang, "Role of MFG-E8 in the Brain",MFG-E8 and Infl ammation, Springer Science, pp.173-187 (2014) |
Also Published As
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| KR20200046689A (ko) | 2020-05-07 |
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