KR101766441B1 - 헌팅틴 유전자의 뇌 시공간 특이적 발현 방법 및 이를 이용한 동물 모델 - Google Patents
헌팅틴 유전자의 뇌 시공간 특이적 발현 방법 및 이를 이용한 동물 모델 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자의 뇌 부위-특이적 발현 방법 및 뇌 부위-특이적 발현 양상을 나타내는 동물모델의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus; HSV) 벡터를 이용하여 인간을 제외한 성체 동물의 뇌 부위에 주입함으로써, 특정 뇌 부위(선조체, 해마 또는 소뇌), 특정 연령 및 특정 신경세포에만 헌팅틴 유전자가 발현되는 헌팅턴 병 질환 모델을 확립하였고, 일정 타이터(titer)의 바이러스를 정량하여 이를 특정 뇌 부위에 주입하기 때문에 획일성 있게 동일한 양의 헌팅틴 유전자의 발현을 유도할 수 있다.
Description
본 발명은 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자의 뇌 부위-특이적 발현 방법 및 뇌 부위-특이적 발현 양상을 나타내는 동물모델의 제조 방법에 관한 것이다.
헌팅턴 병은 헌팅틴(huntingtin) 단백질에 동반한 돌연변이(mutation)에 의해 야기되는 유전적 신경퇴행성 질환으로서 한쪽 부모에게서 비정상적 상염색체 우성 유전자를 받을 경우 발병한다. 돌연변이로 인해 세포가 필요로 하는 영양분의 운송이 차단되면서 정상적인 세포 활동이 제한을 받는다. 영양분이 정상적으로 공급되지 못하면 어린 세포는 제대로 발달, 성장할 수 없고 성장한 세포는 조기에 사멸 과정에 들어가는 변화를 피할 수 없다. 특히 헌팅턴 병은 운동에 관여하는 뇌의 특정 부위의 신경세포가 서서히 퇴화되어가는 진행성 질환으로, 일명 무도병(chorea)이라고도 한다. 퇴화되는 과정에서 나타나는 여러 부수적 증상으로 자가 운동조절 능력 상실(uncontrolled movement), 지적기능상실(loss of interllectual facilities), 감정 장애(emotional disturbance)가 나타나게 되는데, 뇌의 하저부에 위치한 대뇌 기저핵(basal ganglia)에 이상으로 인해 나타나게 되며, 대뇌 기저핵은 인체의 조화로운 몸의 움직임을 관할하는데 이를 담당하는 미상핵(caudate nuclei)과 담창구(pallidum)라는 하저부의 뇌의 층(striatum)에 신경세포에서 손상이 일어나면서 오게 된다. 여기에 인식(perception), 기억(memory)을 관할하는 뇌이외피질(outer surface-cortex)도 손상이 일어나게 된다 [2]. 헌팅턴 병을 유발하는 헌팅틴(huntingtin) 단백질의 존재가 알려진 지 20년 가까이 되었지만 아직 원인이 명확히 밝혀지지 않았다. 미국에서만 헌팅턴 병 환자는 3만 명으로 집계되고 있으며 전 세계적으로 1만 명당 1명에게 발생한다고 한다. 헌팅턴 병의 증상은 대부분의 다른 유전질환과는 달리 중년까지는 나타나지 않는다. 질환의 발병 후 초기에는 근육의 경련적 동작이나 발작이 나타나고 시간이 지나면서 기억력과 근육의 조절 능력을 상실하게 되며 혼란과 성격적인 문제가 동반되며 나중에는 운동, 사고, 의사소통의 기능을 잃게 된다 [3, 4]. 결국 장기간 투병 후엔 과다 근육 긴장증과 심한 경직 상태에 이르러 흡입성 폐렴과 호흡곤란, 심부전, 감염으로 쉽게 사망한다. 현재 헌팅턴 병에 대한 완전한 치료법이 아직 발견되지 않고 있다. 약물을 이용한 치료는 각각의 증상에 대한 약물을 투여하는 것에 국한되어 있다. 물리적, 심리적 치료와 대화요법도 효과가 있다고 알려져 있다.
헌팅턴 병을 일으키는데 중요하게 관여하는 단백질은 헌팅틴(huntingtin)이며 이 단백질의 돌연변이에 의해서 일어난다. 헌팅틴은 4번 염색체의 16.3(4p, 16.3)부분에 위치하고 있으며, 약 350 Kda의 가용성(soluble) 단백질이다. 헌팅틴은 신경 기능(neuronal function)에 중요한 역할을 하고 있으며, 또한 배아 발생(embryogenesis)에서도 중요한 역할을 하고 있다 [5]. 주로 고환(testis)과 뇌에서 발현되는데, 특히 뇌에서는 신피질(neocortex), 소뇌 피질(cerebellar cortex), 선조체(striatum) 및 해마(hippocampus)에서 발현된다. 세포내에서 헌팅틴은 세포질에서 발견되며, 클라스린-피막성 소포(clathrin-coated vesicles), endoplasmic compartments, 미토콘드리아 및 미세소관(microtubule)과 같은 세포 소기관(organelles)과 구조물(structure)에 결합하고 있다. 비록 주로 세포질에서 발견되지만, 핵에서도 발견된다. 헌팅틴은 세포질과 핵에서 다양한 기능을 가지고 있으며, 유전자발현, 세포내 수송(intracellular transport) 및 세포 사멸 억제(anti-apoptotic)와 관련된 단백질들과의 상호작용을 하고 있다 [6,7]. 염색체 4p16.3에 위치하는 헌팅턴 유전자에는 CAG 세 개의 염기가 반복되어 나타나는 서열이 존재하는데, 헌팅턴 병은 이 반복서열이 비정상적으로 증가되어 발생한다.
표 1에서 볼 수 있듯이, 정상인에게서는 CAG 반복 횟수가 평균 19회 정도이지만 헌팅턴 병 환자에게서는 40회 이상 나타나며, 반복 횟수는 헌팅턴 병이 발병하는 나이와 반비례한다. 세대가 거듭될수록, 특히 부계 유전 시 대물림악화(anticipation)에 의하여 CAG 반복 횟수가 증가되면서 발병연령이 낮아지고 증상이 심해질 수 있다. 동일한 이상 증상이 산발성(명확히 밝혀지지 않은) 원인에 의해서도 발생할 수 있다.
헌팅틴 단백질은 포유류의 정상적인 성장을 위해 필요한 유전자이며 모든 세포조직에 존재하지만 그 기능에 대한 연구들이 전세계적으로 활발히 이루어질 뿐 헌팅턴 병을 치유하는데 필요한 메커니즘에 대해서는 크게 알려진 결과가 많지 않다. 헌팅턴 병은 미국에서는 약 3만 명이 발병하였으며 서유럽의 경우 5만 명가량의 환자와 10만 명 이상의 인구가 부모로부터 이 병을 유전 받을 가능성을 가지고 있는 것으로 보고되고 있다. 한국의 경우도 3만 명 정도의 환자가 존재하며 10만 명 이상이 이 병에 걸릴 유전인자를 가지고 있을 것으로 추정되고 있다. 이렇듯 전세계적으로 헌팅턴 병으로 고통 받는 인구가 급증하고 있으며 수많은 환자들이 적절한 치료의 부재로 병을 완치하지 못해 오로지 증상을 호전시키거나 지연시켜주는 치료책만을 의존한 채 죽음을 맞이하고 있다. 현재까지 수많은 마우스와 초파리를 비롯한 헌팅턴 병 질환모델을 제작하여 그 발병 메커니즘과 치료책에 대해 연구되고 있으나 동물 모델들과 실제 사람 환자와의 차이점이나 여러 제약으로 인해 실제 환자에 치료제가 도입되지 못하는 사례들도 많이 있다. 이러한 측면에서 헌팅턴 병에 대한 심층적인 연구가 필요시 되며 본 발명자들의 연구 결과는 새로운 발병 메커니즘을 제시해 질환의 치료제 개발 및 치료책 연구에 기여할 것으로 생각된다.
한편, 국내외 기술개발 현황을 살펴보면 다음과 같다:
(1) 단백질 수정 효소(protein modifying enzyme)인 키나제(kinase)에 인해 헌팅턴 단백질의 핵내 이동 메커니즘 규명
최근 연구 결과, 헌팅틴에서 단백질 품질관리(quality control)에 필수적인 세포 부위로 이동하는데 필요한 작은 단백질 서열을 발견했다. 유사한 발견은 파킨슨병이나 알츠하이머병 등의 신경퇴행성 질환에서도 매우 중요한 것으로 나타났다. 또한 연구팀은 헌팅틴이 단백질 수정 효소(protein modifying enzyme)인 키나제(kinase)로 인해 핵으로 보내질 수 있다는 사실을 알아냈으며 이 서열의 3차원 모형을 규명했다. 만약 헌팅틴 돌연변이체의 핵 진입이 차단되면 뇌세포 괴사를 일으킬 수 없다. 따라서 키나제 억제 약물이 헌팅턴 병에 효과적일 수 있다. 키나제 억제제는 뇌졸증, 관절염 및 암 등의 여러 질환의 치료를 위한 성공적인 새로운 차세대 약물의 대부분을 차지한다 [8].
(2) 발병·증세 진행이 완화되는‘caspase-1’차단물질 개발
헌팅턴 병에 걸리도록 유전 조작된 쥐들은 평균 77일 만에 동작장애, 경련, 체중감소 등 헌팅턴 병 증세가 나타난 반면,‘caspase-1’차단제가 투여된 쥐들은 평균 84일 만에 증상이 나타나기 시작했다고 한다. 또한,‘caspase-1’차단제가 주사된 쥐들은 평균 121일 동안 생존한데 비해 그렇지 않은 쥐들은 평균수명이 101일로써 다른 뇌손상 질환에도 이용이 가능할 것이다 [9].
(3) 태아 세포 이식으로 완화하는 기술
태아(7-9주 사이)의 미발달 뇌조직을 채취해 헌팅턴 랫트 모델에게 이식한 후 태아세포가 리셉터 c-KIT 와 그 신호 전달 경로를 변화시켜 신경 줄기 세포(neural stem cell)와 중간엽(mesenchymal) 줄기 세포의 이동과 증식을 증가시켜 헌팅턴 병 랫트 모델의 증상을 완화시킨 결과가 보고된 바 있다 [10].
(4) 헌팅턴 병 차단 단백질 발견
헌팅턴 병을 저해하는 것으로 판명된 단백질은 천연 단백질이 아니라 실험실에서 사람의 힘으로 만들어진 것으로 헌팅턴 병 돌연변이를 갖고 있는 세포에 개발한 단백질을 발현시키는 유전자를 삽입한 후 그 유전자가 발현되면서 헌팅턴 병을 유도하는 Htt 단백질의 수치가 감소하기 시작했으며 신경 세포에서 전형적으로 관찰되는 병징 가운데 하나인 응괴(clump)의 형성도 함께 줄어들었다. 또한, 일단 발현된 단백질로 인해서 초파리의 눈에 위치한 신경 세포의 변성 과정까지 저해를 받는 것으로 확인되었다. 연구진에 따르면, 이 같은 효과가 유도되는 이유는 삽입된 유전자로부터 발현된 단백질이 Htt 단백질과 결합을 형성함으로써 Htt 단백질의 신경 손상 기능이 약화되기 때문이라고 한다. 단백질 결합을 통해 활성을 나타내는 돌연변이 단백질이 감소하고 헌팅턴 병의 진행이 저해를 받는다는 것이다.
(5) 노화된 미토콘드리아에 헌팅틴이 부착되어 전위차 조절 능력 저하, 칼슘 농도 급증으로 세포사멸 현상 발견
헌팅턴 병의 진행 과정에서 미토콘드리아가 중요한 인자로 작용할 수 있다는 가설을 세운 쥐와 인체 세포를 대상으로 가설의 검증을 시도했다. 그리고 헌팅턴 병이 발병한 쥐와 인체 세포의 미토콘드리아를 조사한 결과, 문제의 헌팅틴 단백질 글루타민 사슬이 미토콘드리아 외막에 부착되어 있다는 사실을 확인할 수 있었다. 이에 대한 후속 조사 결과, 부착된 글루타민 사슬은 이온이 미토콘드리아 외막을 경유해 자유롭게 드나들 수 있는 환경을 조성하는 것으로 밝혀졌다. 미토콘드리아가 정상적인 기능을 유지하기 위해서는 막 사이의 전위차가 적절한 수준으로 유지되어야만 한다. 그러나 헌팅틴 단백질의 글루타민 사슬이 외막에 결합한 상태에서는 이러한 전위차를 유지하는 것이 불가능해진다. 이 같은 상태는 건전지에 비유할 수 있다. 글루타민 사슬이 붙어 있는 미토콘드리아는 이미 전기력을 소진해 버린 건전지와 같은 상태로 변하는 것이다. 또한 글루타민 사슬이 결합된 미토콘드리아는 칼슘을 적절히 조절하는 기능까지 상실하는 것으로 확인됐다. 칼슘이 조절되지 못한다는 것은 이 물질이 축적될 위험이 증가한다는 것을 의미한다. 칼슘이 임계 농도 이상 축적되면 독성을 나타내면서 세포가 사멸에 이를 수도 있다.
한편, 본 발명자들은 다음과 같은 종래 헌팅턴 질환 동물 모델의 문제점을 해결하고자 하였다:
(1) 특정 뇌 영역에만 헌팅턴 유전자가 발현되는 질환 동물 모델의 부재
종래 헌팅턴 질환 모델의 경우 유전자 삽입(knock-in) 기법이나 형질전환 마우스(transgenic model) 제작 기법을 이용하여 만들어 졌기 때문에 마우스의 배아 줄기 세포(ES cell)나 수정란에 형질전환 유전자나 인간 헌팅턴 유전자를 삽입하는 방식으로 유전자 조작이 이루어지고 이를 대리모 마우스의 자궁에 착상시켜 임신과 출산 방식으로 질환 동물 모델을 탄생시켰다. 그리하여, 헌팅틴 유전자가 수정란 전체에 삽입되어 마우스의 뇌 뿐만 아니라 신체 전부에서 발현이 되어 퇴행성 뇌질환인 헌팅턴 병이 뇌의 특정 부위에 어떤 기작으로 신경세포 장애를 일으키는지 연구하는데 적합하지 않았다.
또한, 본래 헌팅틴 유전자는 뇌의 전 영역에 발현되지만 특히 선조체(striatum), 해마(hippocampus) 및 소뇌(cerebellum)에서 특이적으로 신경계 세포들의 괴사와 비정상적인 단백질을 생성하며 아미노산의 일종인 글루타민(glutamine)이 반복되어 비정상 미스폴딩(misfolding) 단백질을 형성하게 된다. 이 덩어리 단백질들은 글루타민의 사슬 길이가 길수록 발병시기가 빨라지고 뇌의 특정 영역이 파괴되게 된다. 이러한 현상을 연구하기엔 현재까지 제작된 질환 동물 모델들은 적합하지 않았다. 또한, 뇌 전반 영역에 헌팅틴을 발현하기 때문에 선조체와 소뇌에서만 일어나는 뇌 세포 파괴 현상을 연구 할 수 없는 문제점이 있었다.
(2) 특정 연령에만 헌팅턴 유전자가 발현되는 질환 동물 모델의 부재
또한, 시기적으로도 마우스 발생 과정부터 유전자 발현이 시작되기 때문에 중년 이상 노인성 질환인 헌팅턴 병을 연구하기 위해서는 노화 쥐를 사용한 면밀한 분석이 필요로 되는데 연구 기간이 오랜 시간 필요로 되며 심층적인 노인성 질환 연구와 실험에 적합하지 않는 문제점이 있었다. 종래 제작된 헌팅턴 병 질환 동물 모델들은 발생 시기부터 돌연변이 헌팅틴을 발현하기에 마우스의 생존 기간이 2년에서 2년 반 정도 되는데 최소 1년 반 이상의 시간을 기다려야 노화된 질환 동물 모델을 연구할 수 있게 된다. 따라서, 질환 동물 모델이 구축되었다고 하여도 시간적 소요가 낭비되고 노인성 질환을 연구하기에도 좋은 시스템이 아니다.
(3) 특정 신경세포에만 헌팅틴 유전자가 발현되는 질환 동물 모델의 부재
헌팅턴 병 환자들은 신체 전체에서 돌연변이 글루타민 사슬을 발현하지만 왜 유독 신경 세포에서만 세포 괴사와 뇌 파괴 현상이 일어나는지에 대한 연구가 이루어지지 않아 왔다. 왜 유독 신경계 세포만 공격 받는가에 대한 해답을 연구하기엔 현재까지 제작된 질환 동물 모델들이 탁월하지 않았다. 신경 세포는 다른 세포에 비해 오래 생존하기에 세포가 노화할수록 더욱 취약해지기 마련이다. 신경 세포는 비정상적으로 길어진 글루타민 사슬의 스트레스를 받고 세포핵으로 돌아갔다가 다시 제대로 나올 수 없어 세포핵에 오랜 기간 축적되어 뇌세포의 괴사를 일으키게 된다. 이러한 현상을 규명하기 위해서도 체세포나 상피 세포가 아닌 신경 세포 특히 뇌신경 세포에만 헌팅틴 유전자를 발현시킬 수 있는 시스템이 매우 유용한 시스템으로 평가된다.
(4) 종래 헌팅턴 병 질환 모델들은 글루타민 사슬 발현량의 일관화를 유지할 수 없는 어려움을 가지고 있음
종래 헌팅턴 병 질환 모델은 유전자 삽입(knock-in) 기법이나 형질전환 마우스(transgenic model) 제작 기법을 이용하여 만들어 졌기 때문에 마우스의 배아 줄기 세포(ES cell)나 수정란에 형질전환 유전자나 인간 헌팅턴 유전자를 삽입하는 방식으로 유전자 조작이 이루어지고 이를 대리모 마우스의 자궁에 착상시켜 임신과 출산 방식으로 질환 동물 모델을 탄생시켰다. 따라서, 수정란에 같은 농도와 같은 양의 조작 유전자를 삽입한다 해도 실제 마우스의 지노믹(genomic) DNA에 끼어 들어가는 조작된 유전자의 양은 모든 실험 동물들이 다를 수 밖에 없었다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 바이러스 벡터 기반 뇌 시공간 특이적 헌팅틴 유전자 발현 시스템을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자의 뇌 부위-특이적 발현하는 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus; HSV) 벡터를 제작하였고, 이를 이용하고 브레인 아틀라스(brain atlas)-기반 좌표를 기초하여 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자를 뇌 부위 특이적으로 발현한 정상 또는 헌팅턴 병 동물모델을 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자의 뇌 부위-특이적 발현 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자의 뇌 부위-특이적 발현 양상을 나타내는 동물모델의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 뇌 부위-특이적 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자의 발현용 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus; HSV) 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자의 뇌 부위-특이적 발현 방법을 제공한다: (ⅰ)(a) HSV IE(immediate-early)4/5 프로모터; 및 (b) 상기 프로모터에 작동적으로 결합된(operatively linked to) 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus; HSV) 벡터를 제작하는 단계; (ⅱ) 상기 제작된 HSV 벡터를 인간을 제외한 동물의 뇌 부위에 주입하는 단계; 및 (ⅲ) 상기 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자의 뇌부위-특이적 발현 양상을 확인하는 단계.
본 발명자들은 바이러스 벡터 기반 뇌 시공간 특이적 헌팅틴 유전자 발현 시스템을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자의 뇌 부위-특이적 발현하는 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus; HSV) 벡터를 제작하였고, 이를 이용하고 브레인 아틀라스(brain atlas)-기반 좌표를 기초하여 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자를 뇌 부위 특이적으로 발현한 정상 또는 헌팅턴 병 동물모델을 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (ⅰ): (a) HSV IE(immediate-early)4/5 프로모터; 및 (b) 상기 프로모터에 작동적으로 결합된(operatively linked to) 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus; HSV) 벡터를 제작
우선, 본 발명의 목적 유전자인 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자의 뇌 부위-특이적 발현 방법을 위해 뇌 부위-특이적 발현벡터를 제작한다. 본 발명에서 이용되는 벡터는 기본적으로 발현 컨스트럭트를 포함하며, 이는 “HSV IE(immediate-early)4/5 프로모터-폴리-Q 및 헌팅틴 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열-폴리아데닐화 서열”을 포함한다.
본 발명에서 이용되는 발현 벡터에서, 목적 유전자인 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결되어 있다. 본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명에 있어서, 목적 유전자에 결합된 프로모터는 HSV IE(immediate-early)4/5 프로모터이다.
본 발명에서 이용되는 폴리아데닐화 서열은 토끼 글로빈(rabbit globin) 폴리 아데닐화 서열, 소성장 호르몬 터미네이터, HSV(Herpes simplex virus) 유래 TK(Thymidine kinase) 또는 SV40(Simian virus 40) 유래 폴리 아데닐화 서열을 포함하며, 바람직하게는 SV40(Simian virus 40) 유래 폴리 아데닐화 서열이다.
본 발명의 벡터에 의해 운반되는 목적 유전자는 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열이며, 바람직하게는 상기 폴리-Q 유전자는 (Gln)2-104의 반복횟수(repeat)를 갖는 아미노산을 암호화하고, 보다 바람직하게는 상기 폴리-Q 유전자는 (CAG)2-102(CAA)0-1(CAG)0-1의 반복횟수(repeat)로 이루어진 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열 내지 제4서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 폴리-Q 유전자에 의해 발현되는 글루타민 사슬 (Gln)n에 있어 n이 40 미만이면 정상 헌팅틴 단백질을 나타내고 n이 40 이상이면 돌연변이 헌팅틴 단백질을 나타낸다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명에 이용되는 헌팅틴 유전자는 헌팅틴 단백질의 N-말단의 엑손-1의 일부 뉴클레오타이드 서열이며, 상기 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열 내지 제4서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
예를 들어, (CAG)2 및 헌팅틴(huntingtin) 단백질의 N-말단의 엑손-1을 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 1 서열 이고, (CAG)21(CAA)1(CAG)1 및 헌팅틴(huntingtin) 단백질의 N-말단의 엑손-1을 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 2 서열이며, (CAG)44(CAA)1(CAG)1 및 헌팅틴(huntingtin) 단백질의 N-말단의 엑손-1을 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 3 서열이고, (CAG)102(CAA)1(CAG)1 및 헌팅틴(huntingtin) 단백질의 N-말단의 엑손-1을 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 4 서열이다.
본 발명에 이용되는 바이러스 벡터는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995))이며, 본 발명에서 헤르페스 심플렉스 바이러스를 채택한 이유는 바이러스 시스템 기반 질환 모델에 이용되는 렌티(lenti) 또는 아데노-관련 바이러스(AAV)는 거대 크기의 지노믹(genomic) DNA를 발현할 수 없는 단점을 가지는 데 반해 헤르페스 심플렉스 바이러스는 거대 크기의 지노믹(genomic) DNA 까지도 발현할 수 있는 유일한 바이러스 벡터라는 점에서 본 발명에서 바이러스 벡터로 이용하였다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 숙주 세포를 상술한 본 발명의 재조합 HSV 벡터로 트랜스펙션 시키고 복제-불능 헬퍼 바이러스를 감염시켜 HSV 바이러스 패키징 단계를 추가적으로 포함한다.
본 발명에 따르면, 상기 HSV 바이러스 패키징 과정은 숙주 세포인 2-2 세포(IE2/ICP27 유전자 포함)를 상기 재조합 HSV 벡터로 트랜스펙션 시키고, 복제-불능 헬퍼 바이러스(5dl 1.2 결손됨)를 감염시켜 48-72 시간 동안 HSV 바이러스가 셀프 패키징 하도록 하였다.
추가적으로 정제 과정을 거친 다음 수득한 재조합(HSV-PolyQ) 바이러스의 타이터(titer)는 약 1~5 x 107 PFU/ml이다.
단계 (ⅱ): 상기 제작된 HSV 벡터를 인간을 제외한 동물의 뇌 부위에 주입
그 다음, 본 발명의 방법은 상기 제작된 HSV 벡터를 인간을 제외한 동물의 뇌 부위에 주입하는 단계를 거친다.
종래 헌팅턴 질환 모델의 경우 유전자 삽입(knock-in) 기법이나 형질전환 마우스(transgenic model) 제작 기법을 이용하여 만들어 졌기 때문에 마우스의 배아 줄기 세포(ES cell)나 수정란에 형질전환 유전자나 인간 헌팅턴 유전자를 삽입하는 방식으로 유전자 조작이 이루어지고 이를 대리모 마우스의 자궁에 착상시켜 임신과 출산 방식으로 질환 동물 모델을 탄생시켰다. 그리하여, 헌팅틴 유전자가 수정란 전체에 삽입되어 마우스의 뇌 뿐만 아니라 신체 전부에서 발현이 되어 퇴행성 뇌질환인 헌팅턴 병이 뇌의 특정 부위에 어떤 기작으로 신경세포 장애를 일으키는지 연구하는데 적합하지 않았다.
또한, 시기적으로도 마우스 발생 과정부터 유전자 발현이 시작되기 때문에 중년 이상 노인성 질환인 헌팅턴 병을 연구하기 위해서는 노화 쥐를 사용한 면밀한 분석이 필요로 되는데 연구 기간이 오랜 시간 필요로 되며 심층적인 노인성 질환 연구와 실험에 적합하지 않는 문제점이 있었다. 종래 제작된 헌팅턴 병 질환 동물 모델들은 발생 시기부터 돌연변이 헌팅틴을 발현하기에 마우스의 생존 기간이 2년에서 2년 반 정도 되는데 최소 1년 반 이상의 시간을 기다려야 노화된 질환 동물 모델을 연구할 수 있게 된다. 따라서, 질환 동물 모델이 구축되었다고 하여도 시간적 소요가 낭비되고 노인성 질환을 연구하기에도 좋은 시스템이 아니다.
이러한 문제점을 해결하는 데 있어, 본 발명의 방법은 인간을 제외한 성체 동물에 상기 제작된 HSV 벡터를 주입하여 후술하는 실시예(도 10 및 도 11)에서 명확히 확인할 수 있는 바와 같이 성체 마우스(생후 2달 또는 1년 8개월)의 선조체(striatum), 해마(hippocampus) 및 소뇌(cerebellum)에만 특이적으로 목적 유전자인 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자가 발현됨을 확인하였다.
이는 원하는 시기와 원하는 뇌 부위에 헌팅틴 유전자를 발현하는 HSV 바이러스 시스템이 잘 구축됨을 확인한 것이고, 이러한 효과는 본 발명의 가장 큰 특징 이며, 이러한 시스템은 노화된 쥐나 성별에 따라서도 시기적으로 발현이 조절 가능함을 보여준다.
한편, 본 발명의 방법은 원하는 뇌 부위에 상술한 HSV 벡터를 인간을 제외한 동물의 뇌 부위에 주입하기 위해서, 브레인 아틀라스(brain atlas)-기반 좌표를 이용하였다.
본 발명에 따르면, 상술한 본 발명의 HSV 벡터를 이용해서 특정 뇌 영역에 원하는 유전자를 전달하기 위해서 stereotaxic frame을 이용하였고, 브레인 아틀라스(brain atlas)에 기초해서 선조체(striatum), 해마(hippocampus) 및 소뇌(cerebellum)에 해당하는 3차원적인 좌표를 계산하였으며, 이 수치를 이용해서 선조체, 해마(hippocampus) 및 소뇌(cerebellum)의 위치에 정확하게 주입 피펫(injection pipette)을 위치시켜 HSV 벡터를 이용해서 특정 뇌 영역에 원하는 유전자를 전달하였다(도 7).
단계 (ⅲ): 상기 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자의 뇌부위-특이적 발현 양상을 확인
마지막으로, 본 발명의 방법은 상기 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자의 뇌부위-특이적 발현 양상을 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따르면, 정위 수술한 마우스 뇌를 분리하고, 40 um 두께의 절편으로 절단한 다음 광학현미경을 이용하여 GFP 발현을 관찰하였고, 그 결과, 도 10 및 도 11에서 볼 수 있는 바와 같이, 마우스의 선조체(striatum), 해마(hippocampus) 및 소뇌(cerebellum)에만 특이적으로 발현되는 헌팅틴 유전자를 관찰하였다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 뇌 부위는 선조체(striatum), 해마(hippocampus) 또는 소뇌(cerebellum)이고, 보다 바람직하게는 선조체(striatum)이다.
이러한 본 발명의 뇌부위-특이적인 발현 방법은, 본래 헌팅틴 유전자가 뇌의 전 영역에 발현되지만 특히 선조체(striatum), 해마(hippocampus) 및 소뇌(cerebellum)에서 특이적으로 신경계 세포들의 괴사와 비정상적인 단백질을 생성하며 아미노산의 일종인 글루타민(glutamine)이 반복되어 비정상 미스폴딩(misfolding) 단백질을 형성하게 되며, 이러한 덩어리 단백질들이 뇌의 특정 영역을 파괴하는 현상을 연구할 수 있으며, 또한 뇌 전반 영역에 헌팅틴을 발현하여 선조체와 소뇌에서만 일어나는 뇌 세포 파괴 현상을 연구 할 수 없었던 문제점을 해결하게 되었다.
한편, 본 발명의 뇌부위-특이적인 발현 방법은 이미 노화된 인간을 제외한 성체 동물의 특정 뇌 부위 및 원하는 시기에 바로 상술한 HSV 벡터를 주입함으로써 목적 유전자의 발현을 유도할 수 있으며, 뇌 수술을 마친 동물은 바로 다음 날부터 헌팅턴 병 연구를 수행할 수 있고 단기간 내에 모든 동물의 행동 검사가 가능한 장점이 있다. 또한 노화된 동물 이외에도 젊은 연령의 동물 또는 성별을 나누어 실험을 할 수 있는 장점이 있다.
그리고 뇌 신경 세포에만 특이적으로 발현을 유도할 수 있으며 오랜 기간 기다림의 시간의 필요 없이 뇌 수술 후 다음날부터 신경 세포에서 헌팅턴 유전자가 발현됨을 관찰할 수 있다.
아울러 종래 헌팅턴 병 질환 모델들은 글루타민 사슬 발현량의 일관화를 유지할 수 없었으나, 본 발명의 방법은 같은 타이터(titer)로 바이러스를 정량하여 같은 양의 바이러스 만을 특정 뇌영역에 주입하기 때문에 획일성 있게 동일한 양의 헌팅턴 유전자의 발현을 유도할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 인간을 제외한 동물은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 소, 말, 돼지, 양 또는 염소이고, 보다 바람직하게는 마우스, 래트, 햄스터 또는 토끼이며, 보다 더 바람직하게는 마우스 또는 래트이고, 가장 바람직하게는 마우스이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자의 뇌 부위-특이적 발현 양상을 나타내는 동물모델의 제조 방법을 제공한다: (ⅰ)(a) HSV IE(immediate-early)4/5 프로모터; 및 (b) 상기 프로모터에 작동적으로 결합된(operatively linked to) 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus; HSV) 벡터를 제작하는 단계; (ⅱ) 상기 제작된 HSV 벡터를 인간을 제외한 동물의 뇌 부위에 주입하는 단계; 및 (ⅲ) 상기 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자의 뇌 부위-특이적 발현 양상을 나타내는 동물모델을 수득하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 다음을 포함하는 뇌 부위-특이적 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자의 발현용 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus; HSV) 벡터를 제공한다: (a) HSV IE(immediate-early)4/5 프로모터; (b) 상기 프로모터에 작동적으로 결합된(operatively linked to) 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (c) 폴리 아데닐화 서열.
동물모델의 제조방법 및 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus; HSV) 벡터는 상술한 본 발명의 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자의 뇌 부위-특이적 발현 방법에서 이용한 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus; HSV) 벡터를 이용하거나 동일하므로, 이 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 목적 유전자인 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자의 뇌 부위-특이적 발현 방법 및 뇌 부위-특이적 발현 양상을 나타내는 동물모델의 제조 방법을 제공한다.
(b) 종래 헌팅턴 병 질환 모델의 경우 유전자 삽입(knock-in) 기법 또는 형질전환 마우스(transgenic model) 제작 기법을 이용하여, 특정 뇌 부위, 특정 연령 및 특정 신경세포에만 헌팅틴 유전자가 발현되는 질환 동물 모델이 부재하였다.
(c) 그러나, 본 발명은 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus; HSV) 벡터를 이용하여 인간을 제외한 성체 동물의 뇌 부위에 주입함으로써, 특정 뇌 부위(선조체, 해마 또는 소뇌), 특정 연령 및 특정 신경세포에만 헌팅틴 유전자가 발현되는 헌팅턴 병 질환 모델을 확립하였다.
(d) 또한, 본 발명은 일정 타이터(titer)의 바이러스를 정량하여 이를 특정 뇌 부위에 주입하기 때문에 획일성 있게 동일한 양의 헌팅틴 유전자의 발현을 유도할 수 있다.
도 1은 poly-Q(Q2, Q23, Q48, Q104) 만을 서브클로닝하여 제작한 HSV-Poly-Q 컨스트럭트를 보여준다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 제작한 HSV-poly-Q2 바이러스 벡터의 개열 지도를 보여준다.
도 3은 본 발명의 다른 실시예에 따라 제작한 HSV-poly-Q23 바이러스 벡터의 개열 지도를 보여준다.
도 4는 본 발명의 또 다른 실시예에 따라 제작한 HSV-poly-Q46 바이러스 벡터의 개열 지도를 보여준다.
도 5는 본 발명의 다른 실시예에 따라 제작한 HSV-poly-Q104 바이러스 벡터의 개열 지도를 보여준다.
도 6은 HSV-poly-Q104 바이러스 벡터 컨스트럭트를 이용하여 HSV 바이러스 패키징 과정을 보여준다.
도 7은 stereotaxic frame(왼쪽 패널) 및 브레인 아틀라스(brain atlas)에 기초한 선조체(striatum)의 3차원적인 좌표를 이용하여 정제된 HSV 앰플리콘(amplicon) 바이러스를 마우스의 뇌에 원하는 시기와 뇌 부위에 정위 수술하는 과정을 보여준다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 헌팅틴 HSV 바이러스 시스템을 선조체(striatum)에 감염시킨 후 공포 조건화(fear conditioning) 행동 실험으로 학습을 시키고 하루 또는 일정 시간 후에 기억 테스트 하는 과정을 보여준다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른 헌팅틴 HSV 바이러스 시스템 주입 전에 먼저 로타로드(rotarod) 시험을 하여 본래 운동 능력을 테스트 하고 이들을 그룹별로 나누어 HSV 바이러스(wtHtt-Q23, mHtt-Q104)를 주입 하고 다시 로타로드 시험을 하는 과정을 보여준다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른 HSV-poly-Q 바이러스 벡터를 이용하여 생후 2달된 성체 마우스의 선조체(striatum), 해마(hippocampus) 및 소뇌(cerebellum)에만 특이적으로 발현시킨 결과를 보여준다.
도 11은 본 발명의 실시예에 따른 HSV-poly-Q 바이러스 벡터를 이용하여 1년 8개월 된 마우스 뇌의 선조체(striatum), 해마(hippocampus) 및 소뇌(cerebellum)의 신경 세포에만 선택적으로 발현시킨 결과를 보여준다.
도 12는 정상 대조군(HSV-wtHtt-Q23)과 질환동물 모델(HSV-mHtt-Q104)을 학습 전에 선조체(striatum)에 발현시키고 감정 기억인 소리 공포 조건화에 미치는 효과를 조사 한 결과를 보여준다.
도 13은 HSV 바이러스(wtHtt-Q23, mHtt-Q104)를 주입 전 및 후의 로타로드 시험 결과를 보여준다.
도 14는 선조체 MSN(medium spiny neuron) 뉴런에서의 도파민 신호 전달 과정 및 DARPP-32 단백질의 역할을 보여준다.
도 15는 선조체 MSN 뉴런에서 HSV-Q23 또는 104를 발현시킨 후 DARPP-32의 발현 정도를 보여준다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 제작한 HSV-poly-Q2 바이러스 벡터의 개열 지도를 보여준다.
도 3은 본 발명의 다른 실시예에 따라 제작한 HSV-poly-Q23 바이러스 벡터의 개열 지도를 보여준다.
도 4는 본 발명의 또 다른 실시예에 따라 제작한 HSV-poly-Q46 바이러스 벡터의 개열 지도를 보여준다.
도 5는 본 발명의 다른 실시예에 따라 제작한 HSV-poly-Q104 바이러스 벡터의 개열 지도를 보여준다.
도 6은 HSV-poly-Q104 바이러스 벡터 컨스트럭트를 이용하여 HSV 바이러스 패키징 과정을 보여준다.
도 7은 stereotaxic frame(왼쪽 패널) 및 브레인 아틀라스(brain atlas)에 기초한 선조체(striatum)의 3차원적인 좌표를 이용하여 정제된 HSV 앰플리콘(amplicon) 바이러스를 마우스의 뇌에 원하는 시기와 뇌 부위에 정위 수술하는 과정을 보여준다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 헌팅틴 HSV 바이러스 시스템을 선조체(striatum)에 감염시킨 후 공포 조건화(fear conditioning) 행동 실험으로 학습을 시키고 하루 또는 일정 시간 후에 기억 테스트 하는 과정을 보여준다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른 헌팅틴 HSV 바이러스 시스템 주입 전에 먼저 로타로드(rotarod) 시험을 하여 본래 운동 능력을 테스트 하고 이들을 그룹별로 나누어 HSV 바이러스(wtHtt-Q23, mHtt-Q104)를 주입 하고 다시 로타로드 시험을 하는 과정을 보여준다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른 HSV-poly-Q 바이러스 벡터를 이용하여 생후 2달된 성체 마우스의 선조체(striatum), 해마(hippocampus) 및 소뇌(cerebellum)에만 특이적으로 발현시킨 결과를 보여준다.
도 11은 본 발명의 실시예에 따른 HSV-poly-Q 바이러스 벡터를 이용하여 1년 8개월 된 마우스 뇌의 선조체(striatum), 해마(hippocampus) 및 소뇌(cerebellum)의 신경 세포에만 선택적으로 발현시킨 결과를 보여준다.
도 12는 정상 대조군(HSV-wtHtt-Q23)과 질환동물 모델(HSV-mHtt-Q104)을 학습 전에 선조체(striatum)에 발현시키고 감정 기억인 소리 공포 조건화에 미치는 효과를 조사 한 결과를 보여준다.
도 13은 HSV 바이러스(wtHtt-Q23, mHtt-Q104)를 주입 전 및 후의 로타로드 시험 결과를 보여준다.
도 14는 선조체 MSN(medium spiny neuron) 뉴런에서의 도파민 신호 전달 과정 및 DARPP-32 단백질의 역할을 보여준다.
도 15는 선조체 MSN 뉴런에서 HSV-Q23 또는 104를 발현시킨 후 DARPP-32의 발현 정도를 보여준다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 방법
HSV 벡터
새로운 돌연변이 헌팅턴 병 질환 모델을 만들기 위해 HSV 바이러스 벡터에 4가지 종류의 poly-Q(Q2, Q23, Q48, Q104) 만을 서브클로닝하여 HSV-Poly-Q 컨스트럭트를 제작하였다(도 1).
구체적으로, (CAG)2 및 헌팅틴(huntingtin) 단백질의 N-말단의 엑손-1을 포함하는 poly-Q2(서열목록 제 1 서열), (CAG)21(CAA)1(CAG)1 및 헌팅틴(huntingtin) 단백질의 N-말단의 엑손-1을 포함하는 poly-Q23(서열목록 제 2 서열), (CAG)44(CAA)1(CAG)1 및 헌팅틴(huntingtin) 단백질의 N-말단의 엑손-1을 포함하는 poly-Q46(서열목록 제 3 서열), 또는 (CAG)102(CAA)1(CAG)1 및 헌팅틴(huntingtin) 단백질의 N-말단의 엑손-1을 포함하는 poly-Q104(서열목록 제 4 서열)를 서브클로닝(subcloning) 하여 총 4가지 바이러스 벡터를 제작하였다(도 2 내지 5).
Poly-Q의 발현은 HSV IE4/5 프로모터에 의해 조절되며, SV40 poly(A) 시그널에 의해 종결된다.
HSV 패키징
HSV(Herpes Simplex Virus)를 만들기 위하여 숙주 세포(host cell)인 2-2 세포(캐나다 토론토 대학, Sheena Josselyn 박사; Smith I. L. et al., (1992). Virology 186, 74-86.) 및 헬퍼(helper) 바이러스인 5dl1.2(MIT, Rachael Neve 박사; McCarthy A. M. et al.,(1989). J. Virol. 63, 18-27.)를 준비하고, 이로부터 HSV 패키징을 셋업 하였다. 숙주 세포인 2-2 세포는 아프리카 녹색 원숭이 신장 상피 세포주(african green monkey kidney epithelium cell line)에서 유래된 vero cell로부터 만들어졌으며, 2-2 세포는 vero cell에 바이러스 패키징(packaging)에 필수적인 ICP27이라는 유전자가 추가된 세포주이며, 헬퍼 바이러스는 바이러스 패키징에 필수적인 유전자 중에 하나가 결여되어 있기 때문에 그 자체로는 DNA 복제가 발생하지 않지만 HSV 벡터 DNA와 함께 숙주 세포에 감염되면 HSV 벡터 DNA를 포함하는 바이러스 입자를 만들 수 있었다.
HSV 바이러스 패키징(도 6)을 상세하게 설명하면, 우선 숙주 세포인 2-2 세포(IE2/ICP27 유전자 포함)를 하기의 재조합 HSV 벡터로 트랜스펙션 시키고, 복제-불능 헬퍼 바이러스(5dl 1.2 결손됨)를 감염시켜 48-72 시간 동안 HSV 바이러스가 셀프 패키징 하도록 하였다. CPE(cytopathic effect)를 보일 때 까지 2-2 세포를 배양시키고 세포와 배지를 수확하였다. 총 4회에 걸쳐 바이러스 패키징 과정을 실시하였고, 얻어진 세포와 배지를 수크로오스 농도구배를 이용하여 정제하고 초원심분리를 실시하여 순수한 HSV 바이러스 층만을 수득하였다. 최종 정제된 재조합(HSV-PolyQ) 바이러스의 타이터(titer)는 약 1~5 x 107 PFU/ml이었다.
뇌 정위 수술(stereotaxic brain surgery)
순수하게 정제된 HSV 앰플리콘(amplicon) 바이러스를 마우스의 뇌에 원하는 시기와 뇌부위에 정위 수술하였다(도 7). 구체적으로, 바이러스 벡터를 이용해서 특정 뇌 영역에 원하는 유전자를 전달하기 위해서 stereotaxic frame을 이용하였다. 브레인 아틀라스(brain atlas)에 기초해서 선조체(striatum), 해마(hippocampus) 및 소뇌(cerebellum)에 해당하는 3차원적인 좌표를 계산하였다. 이 수치를 이용해서 선조체, 해마(hippocampus) 및 소뇌(cerebellum)의 위치에 정확하게 주입 피펫(injection pipette)을 위치시켰다. 수술을 하기 전에 펜토바르비탈(pentobarbital)을 복강에 주사해서 생후 2달 또는 1년 8개월된 마우스를 마취시킨 다음, 바이러스를 주입하기 위한 방법으로 끝이 날카롭게 다듬어져 있는 유리 피펫을 이용하였다. 마우스 뇌에 주입하는 바이러스의 양은 일반적으로 1.5 ul 정도이고 주사기 펌프를 이용해서 0.1 ul/min의 속도로 천천히 주입하였다. HSV 바이러스에 의한 유전자 발현은 뇌에 주입한 후 2시간 정도부터 관찰할 수 있었고 3일 정도 후에 가장 많이 발현되었다. 바이러스에 의한 유전자 전달을 확인하기 위해서 뇌 조직을 약 40 um 정도의 두께로 잘라서 절편을 만든 후 형광 현미경을 이용해서 GFP의 발현을 관찰하거나 면역조직화학(immunohistochemistry)을 통해 발현된 단백질을 확인하였다.
동결 뇌 조직 절편화(frozen sectioning)
마우스 뇌 조직을 이용해서 특정 뇌 영역에서 면역조직화학(immunohistochemistry)을 수행하기 위해서는 일정한 두께로 잘라진 구조적으로 잘 보존된 뇌 조직 절편이 필요하므로, 이를 위해서 cryostat(Leica CM 1850)를 이용하였다.
구체적으로, 4% PFA(Paraformaldehyde)로 고정한 마우스 뇌를 cyostat platform에 동결 조직 포매제(embedding medium)를 이용해서 고정하였고, -20°C 정도에서 얼린 후 cryostat을 이용해서 일정한 두께로 잘라주었다. 잘라진 뇌 절편은 0.02% 소듐 아지드(sodium azide)가 첨가된 PBS에 넣어서 장기간 보관하거나, 슬라이드 글라스에 옮긴 후 마운팅 미디아를 이용해서 바로 뇌 절편을 관찰하거나 보관하였다.
심장내 관류(Intracardiac perfusion)
마우스 뇌 조직을 얻기 위해서 많이 이용되고 있는 실험 방법으로서, 우선 펜토바르비탈(pentobarbital)(55 mg/kg, ip)을 복강내 주사함으로써 마우스를 마취시킨 다음, 수술용 가위를 이용해서 가슴부위를 절개해서 심장이 드러나게 하였다. 주사기 바늘을 심장의 우심실에 삽입하고 펌프를 이용해서 100 ml PBS를 혈관을 따라 흘려주어 뇌 조직에 있는 혈액세포를 제거한 후 4% PFA 100 ml을 이용해서 뇌 조직을 고정하였다. 관류가 끝난 후 조심스럽게 뇌 조직을 취해서 30% 수크로오스 용액에 넣어서 4℃에 2-4일간 보관하면서 뇌 조직이 바닥에 가라앉을 때 까지 보관하였다.
공포 조건화 행동 실험(fear conditioning)
상기 준비된 헌팅틴 HSV 바이러스 시스템을 선조체(striatum)에 감염시킨 후 공포 조건화(fear conditioning) 행동 실험으로 학습을 시키고 하루 또는 일정 시간 후에 기억을 테스트 해 보았다(도 8).
현재 널리 사용되고 있는 공포 조건화는 크게 소리 공포 조건화(auditory fear conditioning)와 공간 공포 조건화(contextual fear conditioning)로 나뉘는데, 소리 공포 조건화로 마우스를 학습시킬 때 강한 전기 자극을 전달할 수 있는 그리드가 바닥에 있는 상자를 이용하였다.
구체적으로, 정상 대조군(HSV-Q23) 및 질환 동물 모델(HSV-Q104)을 학습 전에 발현시킨 마우스를 공포 조건화 상자에 넣고 2분간 자유롭게 움직이면서 주변 공간을 탐색할 수 있게 하였다. 2분 후에 30초간 2.8 kHz, 85 dB의 소리(CS, conditioned stimulus)를 들려주고 소리가 끝나기 2초전에 0.4 mA-0.7 mA의 전기 자극(US, unconditioned stimulus)을 상자 바닥에 있는 그리드에 흘려줌으로써 마우스를 자극하였다. 이와 같은 학습과정을 통해서 마우스는 특정 소리와 전기 자극에 의한 고통스러운 감각의 조건화를 학습하게 되었다.
한편, 24시간 후에 공포 조건화 기억을 테스트 할 때는 마우스를 테스트 상자에 넣은 다음, 테스트 상자는 기본적으로 학습시킬 때 사용한 상자와 다른 환경으로 만들었다. 마우스를 테스트 상자에 넣고 2 분간 자유롭게 움직이게 한 다음 이후 1분 또는 3분간 학습시킬 때 들려주었던 소리와 똑같은 소리를 들려 주었다. 이 때 마우스가 보이는 프리징(freezing) 행동을 컴퓨터 소프트웨어를 통해서 측정하였다. 얼마만큼의 시간동안 프리징 행동을 보이는가가 기억의 강도를 나타내는 지표가 되기 때문이다.
로타로드(Rotarod) 행동 실험
근육 운동 조절과 균형 감각을 테스트하기 위하여, 같은 연령과 같은 성별의 마우스들을 바이러스 주입 전에 먼저 로타로드(rotarod) 시험을 하여 본래 운동 능력을 테스트 하고 이들을 그룹별로 나누어 HSV 바이러스(wtHtt-Q23, mHtt-Q104)를 주입 하고 다시 로타로드 시험을 하였다(도 9).
구체적으로, 1년 8개월 이상된 마우스 10마리를 4일 동안 하루 2번씩(24 rpm, 60 sec) 로타로드 장비에서 훈련을 시켜서 원통(지름이 약 3 cm 되는 회전하는 실린더)을 기어가는 운동 자체를 훈련시키고 운동 수행 능력이 비슷한 수준의 쥐들을 각 실험군 별로 5마리씩 나누었다. 정상 대조군(HSV-Q23)과 질환동물 모델(HSV-Q104)로 나누어 각각의 바이러스를 선조체(striatum)와 소뇌(cerebellum)에 발현시켜 주었고 3일간의 회복 과정을 거친 다음, 고정된 24 rpm 값에서 총 5일 동안 10마리의 쥐들을 로타로드 시험을 실시하였다. 실험동물이 회전하는 실린더에서 얼마나 잘 균형을 유지하고 떨어지지 않는지 관찰하였는데, 한 실험 블락당 1분 동안 측정하였다.
세포학적 실험(공촛점 현미경을 통한 관찰 및 분석)
배양된 신경 세포에 Poly-Q나 돌연변이 헌팅틴 유전자를 신경세포에 도입시, 다양한 세포 마커(Synaptophysin-GFP, PSD95-RFP, Tau-1, MAP2)를 도입하여 신경세포의 축삭(axon) 및 수상돌기(dendrite)의 모양, 길이 또는 수를 측정하거나, 시냅스의 수나 모양을 측정하였다. 구체적으로, HSV-Q104를 발현시킨 선조체 MSN 뉴런에서도 마찬가지로 DARPP-32 단백질의 발현레벨이 감소하는지 조사하기 위해서, HSV-Q104 또는 HSV-Q23을 주입한 선조체(striatum) 뇌 조직을 이용하였고, 면역염색법(immunocytochemistry)을 수행하였다. DARPP-32 특이적인 항체를 이용해서 DARPP32의 발현정도를 확인하였다. 그리고, Image J program을 통해 이미지 분석하였다.
실험 결과
다양한 뇌부위와 원하는 나이의 마우스에서 돌연변이 헌팅틴의 발현 확인이 가능하였다.
정위 수술한 마우스 뇌를 분리하여 꺼낸 다음, 40 um 두께의 절편으로 절단한 다음 광학현미경을 이용하여 GFP 발현을 관찰하였다. 그 결과, 도 10에서 볼 수 있는 바와 같이, 생후 2달된 성체 마우스의 선조체(striatum), 해마(hippocampus) 및 소뇌(cerebellum)에만 특이적으로 헌팅틴 유전자(HSV-mHtt-Q104 -(CAG)102(CAA)1(CAG)1)의 발현을 조작할 수 있었다.
그리고, 도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, stereotaxic frame을 이용해서 1년 8개월 된 마우스 뇌의 선조체(striatum), 해마(hippocampus) 및 소뇌(cerebellum)의 신경 세포에만 선택적으로 HSV 바이러스(HSV-mHtt-Q104-(CAG)102(CAA)1(CAG)1)를 발현시켰다.
이를 통해, 원하는 시기와 원하는 뇌 영역에 헌팅틴 유전자를 발현하는 HSV 바이러스 시스템이 잘 구축됨을 확인할 수 있었다. 또한, 이러한 시스템은 노화된 쥐나 성별에 따라서도 시기적으로 발현이 조절 가능함을 보여준다.
돌연변이 헌팅틴 HSV 바이러스를 사용하여 제작된 헌팅턴 병 질환 동물 모델들의 인지행동 조사 결과
정상 대조군(HSV-wtHtt-Q23)과 질환동물 모델(HSV-mHtt-Q104)을 학습 전에 선조체(striatum)에 발현시키고 감정 기억인 소리 공포 조건화에 미치는 효과를 조사 한 결과, 도 12에서 알 수 있는 바와 같이 정상 대조군(HSV-wtHtt-Q23)에 비해서 질환동물 모델(HSV-mHtt-Q104)의 경우, 현저히 감소된 공포 기억 테스트 결과를 보여주어(HSV-wtHtt-Q23 n=21 : HSV-mHtt-Q104 n=12), 헌팅턴 질환 모델인 HSV-mHtt-Q104 마우스는 새롭게 학습된 공포 기억을 저장하고 기억을 생성하는 능력에는 큰 장애가 발생함을 확인하였다.
이는 짧은 기간 poly-Q가 선조체(striatum)에 작용할 때에는, 기저핵(basal ganglia)을 이루는 세부 구조인 미상핵(caudate nucleus)과 피각(putamen)이 공포와 두려움에 관한 기억이 저장되는 편도체(lateral amygdale)와의 시냅스 투영(synaptic projection)이 영향을 받게 되어 기억이 생성, 저장되는데 치명적인 결함을 보였던 것으로 판단된다.
돌연변이 헌팅틴 HSV 바이러스를 사용하여 제작된 헌팅턴 병 질환 동물 모델들의 운동능력 조사 결과
헌팅턴 병 환자가 보이는 주요한 행동 표현형(phenotype) 중 하나는 균형감각, 운동 조절 능력에 문제가 발생하고 몸을 떠는 행동을 보이는 것이 특징이다. 헌팅턴 병 환자의 경우 선조체가 가장 크게 파괴되지만 선조체 외에도 운동 조절에 중요하다고 알려져 있는 소뇌(cerebellum)도 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 균형 감각 및 운동 능력을 조절을 테스트하기 위해서 로타로드(rotarod) 테스트를 수행하였다.
그 결과, 도 13에서 확인할 수 있듯이, 수술 전 280-290 초 가량 운동성을 보이던 마우스들이 수술 후엔 전혀 운동성을 보이지 않거나 혹은 10초 미만가량만 운동성을 보여, 노화 헌팅턴 병 질환 모델들은 HSV-mHtt-Q104 바이러스를 발현하고 나서 운동 능력이 현저히 감소되었음을 알 수 있었다. 거의 대부분의 질환 모델들이 로타로드 시험 자체를 하기 힘들 정도로 균형감각과 사지의 운동능력이 떨어진 상태였다.
이를 통해, 헌팅턴 병 질환 모델의 경우 poly-Q 사슬들이 노화된 신경세포에 더욱 강하게 작용하여 신경세포를 취약하게 만들고 그로 인해 운동능력 저하를 일으킬 수 있음을 알 수 있었다.
헌팅턴 질환 동물의 선조체(striatum) MSN 신경 세포 기능에 미치는 영향
선조체 MSN(medium spiny neuron) 뉴런의 DARPP-32 단백질은 도파민 신호전달에 중요하다고 알려져 있다. 도파민 신호 전달 과정에서의 DARPP-32의 역할은 도 14에 나타내었다. 한편, 헌팅턴 병 환자에서 DARPP-32 단백질의 발현 레벨이 현저히 감소하는 것이 보고되어 있다. 따라서 HSV-Q104를 발현시킨 선조체 MSN 뉴런에서 마찬가지로 DARPP-32 단백질의 발현 레벨이 감소하는지 조사하였다.
DARPP-32 항체를 이용한 면역염색법(immunocytochemistry)의 실험결과, 종전의 보고와 일치하게 HSV-Q104를 발현시킨 MSN 뉴런에서만 DARPP-32 발현 레벨이 현저히 감소함을 확인하였다(도 15).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
참고문헌
1. Walker FO (2007). "Huntington's disease". Lancet 369 (9557): 220.
2. "Huntington Disease". genereviews bookshelf. University of Washington. 2007-07-19. Retrieved 2009-03-12.
3. Kremer B (2002). "Clinical neurology of Huntington's disease". In Bates G, Harper P, and Jones L. Huntington's Disease Third Edition. Oxford: Oxford University Press.
4. Wagle, A C; Wagle SA, MarkovIS, Berrios GE (2000). "Psychiatric Morbidity in Huntington's disease.". Neurology, Psychiatry and Brain Research (8): 516.
5. Cattaneo E, Zuccato C, Tartari M (2005). "Normal huntingtin function: an alternative approach to Huntington's disease". Nat. Rev. Neurosci. 6 (12): 91930.
6. Goehler H, Lalowski M, Stelzl U, et al. (2004). "A Protein Interaction Network Links GIT1, an Enhancer of Huntingtin Aggregation, to Huntington's Disease". Mol. Cell 15 (6): 85365.
7. Walker FO (2007). "Huntington's disease". Lancet 369 (9557): 221.
8. YowSien Lin1 et al (2011) AGING, June 2011, Vol. 3 No 6 Besides Huntington’s disease, does braintype creatine kinase play a role in other forms of hearing impairment resulting from a common pathological cause.
9. Ona Vo et al (1999) Nature. May20;399(6733):263-7.Inhibition of caspase-1 slows disease progression in a mouse model of Huntington's disease.
10. Mangiarini, L. et al. Exon 1 of the HD gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice. Cell 87, 493506 (1996).
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology
<120> Methods for Temporarily and Spatially Specific Expression of
Huntingtin Gene in the Brain and Animal Models
<130> PN140644
<160> 8
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 459
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence comprising poly-Q2
<400> 1
atggcgaccc tggaaaagct gatgaaggcc ttcgagtccc tcaagtcctt ccagcagccg 60
ccaccgccgc cgccgccgcc gccgcctcct cagcttcctc agccgccgcc gcaggcacag 120
ccgctgctgc ctcagccgca gccgcccccg ccgccaccac cgccgccacc cgggccggct 180
gtggctgagg agccgctgca ccgaccaaag aaagaacttt cagctaccaa gaaagaccgt 240
gtgaatcatt gtctgacaat atgtgaaaac atagtggcac agtctgtcag aaattctcca 300
gaatttcaga aacttctggg catcgctatg gaactttttc tgctgtgcag tgatgacgca 360
gagtcagatg tcaggatggt ggctgacgaa tgcctcaaca aagttatcaa agctttgatg 420
gattctaatc ttccaaggtt acagctcgag ctaggctag 459
<210> 2
<211> 522
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence comprising poly-Q23
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cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcaacag 120
ccgccaccgc cgccgccgcc gccgccgcct cctcagcttc ctcagccgcc gccgcaggca 180
cagccgctgc tgcctcagcc gcagccgccc ccgccgccac caccgccgcc acccgggccg 240
gctgtggctg aggagccgct gcaccgacca aagaaagaac tttcagctac caagaaagac 300
cgtgtgaatc attgtctgac aatatgtgaa aacatagtgg cacagtctgt cagaaattct 360
ccagaatttc agaaacttct gggcatcgct atggaacttt ttctgctgtg cagtgatgac 420
gcagagtcag atgtcaggat ggtggctgac gaatgcctca acaaagttat caaagctttg 480
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<213> Artificial Sequence
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<223> nucleotide sequence comprising poly-Q46
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cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 180
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ccgcaggcac agccgctgct gcctcagccg cagccgcccc cgccgccacc accgccgcca 300
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<212> DNA
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<223> necleotide sequence comprising poly-Q104
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> amino acid sequence comprising poly-Q2
<400> 5
Met Ala Thr Leu Glu Lys Leu Met Lys Ala Phe Glu Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
Phe Gln Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln Leu
20 25 30
Pro Gln Pro Pro Pro Gln Ala Gln Pro Leu Leu Pro Gln Pro Gln Pro
35 40 45
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Pro Ala Val Ala Glu Glu
50 55 60
Pro Leu His Arg Pro Lys Lys Glu Leu Ser Ala Thr Lys Lys Asp Arg
65 70 75 80
Val Asn His Cys Leu Thr Ile Cys Glu Asn Ile Val Ala Gln Ser Val
85 90 95
Arg Asn Ser Pro Glu Phe Gln Lys Leu Leu Gly Ile Ala Met Glu Leu
100 105 110
Phe Leu Leu Cys Ser Asp Asp Ala Glu Ser Asp Val Arg Met Val Ala
115 120 125
Asp Glu Cys Leu Asn Lys Val Ile Lys Ala Leu Met Asp Ser Asn Leu
130 135 140
Pro Arg Leu Gln Leu Glu Leu Gly
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence comprising poly-Q23
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Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
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Pro Gln Pro Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Pro
65 70 75 80
Ala Val Ala Glu Glu Pro Leu His Arg Pro Lys Lys Glu Leu Ser Ala
85 90 95
Thr Lys Lys Asp Arg Val Asn His Cys Leu Thr Ile Cys Glu Asn Ile
100 105 110
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Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro
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Pro Gln Ala Gln Pro Leu Leu Pro Gln Pro Gln Pro Pro Pro Pro Pro
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Pro Pro Pro Pro Pro Gly Pro Ala Val Ala Glu Glu Pro Leu His Arg
100 105 110
Pro Lys Lys Glu Leu Ser Ala Thr Lys Lys Asp Arg Val Asn His Cys
115 120 125
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Ser Asp Asp Ala Glu Ser Asp Val Arg Met Val Ala Asp Glu Cys Leu
165 170 175
Asn Lys Val Ile Lys Ala Leu Met Asp Ser Asn Leu Pro Arg Leu Gln
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<212> PRT
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<223> amino acid sequence comprising poly-Q104
<400> 8
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Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
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Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
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Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
100 105 110
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
115 120 125
Pro Pro Pro Pro Gln Leu Pro Gln Pro Pro Pro Gln Ala Gln Pro Leu
130 135 140
Leu Pro Gln Pro Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly
145 150 155 160
Pro Ala Val Ala Glu Glu Pro Leu His Arg Pro Lys Lys Glu Leu Ser
165 170 175
Ala Thr Lys Lys Asp Arg Val Asn His Cys Leu Thr Ile Cys Glu Asn
180 185 190
Ile Val Ala Gln Ser Val Arg Asn Ser Pro Glu Phe Gln Lys Leu Leu
195 200 205
Gly Ile Ala Met Glu Leu Phe Leu Leu Cys Ser Asp Asp Ala Glu Ser
210 215 220
Asp Val Arg Met Val Ala Asp Glu Cys Leu Asn Lys Val Ile Lys Ala
225 230 235 240
Leu Met Asp Ser Asn Leu Pro Arg Leu Gln Leu Glu Leu Gly
245 250
Claims (8)
- 다음의 단계를 포함하는 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자의 뇌 부위-특이적 발현 양상을 나타내는 헌팅턴 질환 동물 모델의 제조 방법:
(ⅰ)(a) HSV IE(immediate-early)4/5 프로모터; 및 (b) 상기 프로모터에 작동적으로 결합된(operatively linked to) 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus; HSV) 벡터를 제작하는 단계;
(ⅱ) 상기 제작된 HSV 벡터를 인간을 제외한 동물의 뇌 부위에 주입하는 단계; 및
(ⅲ) 상기 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자의 뇌부위-특이적 발현 양상을 나타내는 동물 모델을 수득하는 단계.
- 제 1 항에 있어서, 상기 뇌 부위는 선조체(striatum), 해마(hippocampus) 또는 소뇌(cerebellum)인 것을 특징을 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 폴리-Q 유전자는 (Gln)2-104의 반복횟수(repeat)를 갖는 아미노산을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 상기 폴리-Q 유전자는 (CAG)2-102(CAA)0-1(CAG)0-1의 반복횟수(repeat)로 이루어진 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것을 특징으로 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 폴리-Q 및 헌팅틴 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열 내지 제4서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 동물은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 소, 말, 돼지, 양 또는 염소인 것을 특징으로 하는 방법.
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| KR1020150020450A KR101766441B1 (ko) | 2015-02-10 | 2015-02-10 | 헌팅틴 유전자의 뇌 시공간 특이적 발현 방법 및 이를 이용한 동물 모델 |
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| KR1020150020450A KR101766441B1 (ko) | 2015-02-10 | 2015-02-10 | 헌팅틴 유전자의 뇌 시공간 특이적 발현 방법 및 이를 이용한 동물 모델 |
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-
2015
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Kegel, KB. et al., Molecular Neurodegeneration, 2010, 5:58 (2010.12.14.) |
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|---|---|
| KR20160097940A (ko) | 2016-08-18 |
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