JP2001057885A - スクリーニング - Google Patents

スクリーニング

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JP2001057885A JP2000168065A JP2000168065A JP2001057885A JP 2001057885 A JP2001057885 A JP 2001057885A JP 2000168065 A JP2000168065 A JP 2000168065A JP 2000168065 A JP2000168065 A JP 2000168065A JP 2001057885 A JP2001057885 A JP 2001057885A
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ジル・キャロライン・リチャードソン
Herman Thomas Rene Rupniak
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 アルツハイマー脳に観察されるアミロイドー
シスの動物モデルに関し、中枢神経系におけるアミロイ
ド蓄積の結果を研究する追跡システムで、これは又、ア
ルツハイマー病及び頭部損傷等の他の退行性脳疾患を治
療し得る薬剤をスクリーニングするためのシステムを表
す。更に、関連ポリヌクレオチド構築物、ベクター、及
びそのような可能性のある薬剤の試験、スクリーニング
方法の提供。 【解決手段】 変異型Ｋ６７０Ｎ及びＭ６７１Ｌのみを
含むヒトＡＰＰ６９５アイソフォームをコードするコー
ド配列と、前記コード配列に動作的にリンクした脳特異
的Ｔｈｙ−１調節配列とを含む組換えＤＮＡ構築物。こ
の構築物は、トランスジェニック非ヒト動物及び細胞を
作製するのに有用であり、該動物及び該細胞は、アルツ
ハイマー病のような神経変性疾患のための有力な治療薬
をスクリーニングするために使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アルツハイマー脳
に観察されるアミロイドーシスの動物モデルに関し、中
枢神経系（ＣＮＳ）におけるアミロイド蓄積の結果を研
究する追跡システムを表す。この動物モデルはまた、ア
ルツハイマー病および頭部損傷等の他の退行性脳疾患を
治療し得る薬剤をスクリーニングするためのシステムを
表す。本発明はまた、関連ポリヌクレオチド構築物、ベ
クター、およびそのような可能性のある薬剤を試験しス
クリーニングする方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】アルツハイマー病（ＡＤ）は、それぞれ
凝集したβ−アミロイドペプチド（βＡ４：３９〜４３
アミノ酸からなる４ｋＤペプチド）および過剰にリン酸
化されたタウから構成されるアミロイド斑および神経原
線維変化という二つの主要な病理学的特徴を有する。β
Ａ４ペプチドは、プロテアーゼ、β−およびγ−セクレ
ターゼによる、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）
のタンパク質分解切断によって生じる。ＡＰＰはα−セ
クレターゼによっても、βＡ４を構成するＡＰＰ領域内
で切断される。これにより、βＡ４の形成が妨げられ
る。
【０００３】ＡＰＰの最も豊富な三つのアイソフォーム
は、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、およびＡＰＰ７７０
である。ＡＰＰのこれらのアイソフォームは、選択的ス
プライシングの結果として生成する。ＡＰＰ７５１およ
びＡＰＰ７７０アイソフォームは、ＡＰＰ６９５の全配
列および、βＡ4ドメインの部位とは異なるＡＰＰタン
パク質の領域内にそれぞれ一つまたは二つのさらなるド
メインを含む。異なるアイソフォームのそれぞれがいか
にしてＡＤのアミロイド斑症状を導くのかは、今だ未知
である。慣例により、全ＡＰＰ型のアミノ酸の位置は、
ＡＰＰ７７０アイソフォームに対応する位置により参照
される。特に明記しない限り、ＡＰＰおよびＡＰＰ遺伝
子は、すべてそれぞれヒトＡＰＰおよびヒトＡＰＰ遺伝
子を意味する。
【０００４】ＡＰＰおよびプレセニリン変異と遺伝的に
関連した家族性ＡＤの早期発症において、この疾患の基
本的原因は、このタンパク質のアミロイド形成プロセシ
ングの上昇を生じるＡＰＰプロセシングの変化と、その
結果として起こる脳内のアミロイド症状であると推測さ
れている。ある早期発症型家族性ＡＤと同時分離する三
つの変異が、ＡＰＰ遺伝子内で同定された。これらの変
異は、アミロイド形成プロセシングの部位またはその近
傍で起こる。そのような変異二つはＫ６７０ＮとＭ６７
１Ｌであり、共にスウェーデン変異として知られてい
る。スウェーデン変異では、全βＡ４の産生が野生型Ａ
ＰＰと比較して４から５倍上昇していることが示されて
いる。
【０００５】アルツハイマー病に特徴的な病理学的徴候
は、齧歯動物では自然には起こらない。トランスジェニ
ック技術を利用して、マウスの脳でＡＤの症状を再現す
ることが試みられた（ＷＯ９５／１１９６８号、ＷＯ９
６／４０８９５号、およびＷＯ９８／０３６４号）。以
前、家族性ＡＤ変異を含むヒトＡＰＰの過剰発現は、ト
ランスジェニックマウスにおいて重要なアミロイド斑症
状を生じることが以前から立証されている。しかし、そ
のようなモデルはどれも、アミロイド負荷量の増加と認
識的欠損の発生との確証的な関係を提供するものではな
かった。さらに、神経原線維変化や顕著な神経損失等の
他のＡＤ症状を再現するモデルは、これまで成功してい
ない。
【０００６】
【発明の概要】我々は、トランスジェニックマウスにお
いて様々なＡＤモデルを作製した。特異的ニューロンの
プロモーターを、特異的変異を含む特異的ＡＰＰアイソ
フォームと共に利用することにより、アミロイド症状を
生じるばかりでなく、初めて脳内のβＡ４レベルに関連
した確証的な年齢関連性の認識欠損をも示すトランスジ
ェニックマウスが作製できることを見出した。そのよう
なマウスにより、指標として機能的情報（認識行為）を
利用し、イン・ビボでアミロイド生成の阻害因子を試験
することができる。関連する組織（すなわち脳）でこれ
らの化合物の活性を試験することに加えて、このモデル
により、アミロイド負荷量が老化ＡＤ脳で見られる認識
変化の原因であるという仮説を試験することが可能であ
る。したがって、本発明は
【０００７】−変異型Ｋ６７０ＮとＭ６７１Ｌ（スウェ
ーデン変異）のみを含むヒトＡＰＰ６９５アイソフォー
ムをコードするコード配列と、コード配列に機能するよ
うに結合された脳特異的Ｔｈｙ−１制御配列を含む組換
えＤＮＡ構築物；
【０００８】−そのゲノムが、変異型Ｋ６７０ＮとＭ６
７１Ｌのみを含むヒトＡＰＰ６９５アイソフォームをコ
ードするコード配列と、コード配列に機能するように結
合された脳特異的Ｔｈｙ−１制御配列を含むＤＮＡを組
み込み、その動物の脳細胞で発現される該変異型ヒトＡ
ＰＰ６９５アイソフォームの量がその中で発現される内
在性ＡＰＰ量よりも少なくとも５倍高い、トランスジェ
ニック非ヒト動物；
【０００９】−そのゲノムが、変異型Ｋ６７０ＮとＭ６
７１Ｌのみを含むヒトＡＰＰ６９５アイソフォームをコ
ードするコード配列と、コード配列に機能するように結
合された脳特異的Ｔｈｙ−１制御配列を含むＤＮＡを組
み込み、該細胞で発現される該変異型ヒトＡＰＰ６９５
アイソフォームの量がその中で発現される内在性ＡＰＰ
量よりも少なくとも５倍高い、トランスジェニック非ヒ
ト動物細胞：
【００１０】−（ａ）本発明にしたがって用いる構築物
を細胞または胚に導入し、（ｂ）該細胞または胚から該
動物を作製することを含む、トランスジェニック非ヒト
動物を作製する方法；
【００１１】−本発明によるトランスジェニック非ヒト
動物または細胞を利用して該薬剤をスクリーニングする
ことを含む、退行性脳疾患の治療に利用する薬剤のスク
リーニング法；
【００１２】−本発明のトランスジェニック非ヒト動物
細胞および試験薬剤が該細胞での変異型ＡＰＰ発現に関
連した細胞変化を阻害するか否かを決定する方法を含
む、退行性脳疾患の治療に利用する薬剤をスクリーニン
グするキット；
【００１３】−本発明によるスクリーニング法またはキ
ットを利用して同定される薬剤；
【００１４】−退行性脳疾患の治療に利用する本発明の
薬剤；
【００１５】−アルツハイマー病の治療用薬剤の製造に
おける本発明の薬剤の利用；
【００１６】−製薬上容認されるキャリアーまたは希釈
剤、および活性成分として本発明によるスクリーニング
法またはキットを利用して同定されたる薬剤を含む、退
行性脳疾患の治療に利用するのに適切な薬剤組成；
【００１７】−アミロイド負荷量の増加と、年齢に関連
した様式で相関性のある認識減退を示す、トランスジェ
ニック非ヒト動物を提供する。
【００１８】
【発明の詳細な記述】＜構築物＞退行性脳疾患の治療に
利用可能な薬剤をスクリーニングするための動物モデル
を作製するため、本発明は特有なＤＮＡ構築物の利用に
依存する。構築物は基本的に、スウェーデン変異（ＡＰ
Ｐ６９５ｓｗ）を含むＡＰＰ６９５をコードする配列と
脳特異的Ｔｈｙ−１制御配列からなる。脳特異的Ｔｈｙ
−１制御配列は、トランスジェニック動物モデルの脳の
ニューロンにおいて選択的にＡＰＰ６９５ｓｗの発現を
導くのに対して、動物の胸腺では発現は起こらない。
【００１９】ヒトＡＰＰ６９５ｓｗのコード配列は、ｃ
ＤＮＡまたはゲノムクローンである。上記したように、
ＡＰＰ６９５ｓｗタンパク質は、ＡＰＰ６９５ポリペプ
チド配列内に唯一の変異として二つの点変異型Ｋ６７０
ＮとＭ６７１Ｌを含む。よって、ＡＰＰ６９５ｓｗタン
パク質のアミノ酸６７０と６７１には、それぞれアスパ
ラギンとロイシン残基が存在する。
【００２０】スウェーデン変異を含むヒトＡＰＰ６９５
アイソフォームをコードする配列は、Ｔｈｙ−１遺伝子
の脳特異的制御領域に機能するように結合される。この
ように、コード配列は典型的に、制御領域を含むＴｈｙ
−１遺伝子の一部に結合される。制御領域は、胸腺細胞
等の脳細胞でない細胞において、コード配列の発現を起
こさない。
【００２１】制御部分は、一つまたはそれ以上の欠失の
あるＴｈｙ−１遺伝子を含んでもよい。そのような欠失
は、コード配列および／またはイントロン配列からな
る。好ましい実施形態では、欠失は図１に示される欠失
のようなイントロンＩＩＩを含む。イントロンＩＩＩの
欠失は、胸腺での発現を導くＴｈｙ−１遺伝子の制御領
域の能力を無効にする。典型的には、そのような欠失
は、胸腺細胞等の脳細胞でない細胞において構築物から
のコード配列の発現を減少させる。典型的にこの欠失
は、脳細胞においては、構築物からのコード配列の発現
を減少させない。
【００２２】好ましい実施形態では、制御領域は、脳細
胞内で構築物からの発現を起こすように操作されたＴｈ
ｙ−１遺伝子を含む。そのような操作された配列は、例
えばVidalら(1990)EMBO J.,9(3),833-40に記述されてい
るように、先行技術で知られている。操作された配列
は、一つまたはそれ以上の（例えば、２または３から
５、１０または２０またはそれ以上）挿入、置換、また
は欠失（例えば、上記した欠失）を含んでもよい。
【００２３】制御領域はＴｈｙ−１プロモーターからな
る、あるいはＴｈｙ−１プロモーターを含む。制御領域
は、典型的に哺乳動物である。それはヒトでもよいが、
好ましくはマウス等の齧歯動物の領域である。典型的に
その領域は、それが発現される細胞の種に固有のもので
ある。Ｔｈｙ−１プロモーターはヒトプロモーターでも
よいが、好ましくはマウスＴｈｙ−１プロモーター等の
齧歯動物Ｔｈｙ−１プロモーターである。Ｔｈｙ−１プ
ロモーターは典型的に、作製される動物のＴｈｙ−１遺
伝子の固有のプロモーターである。
【００２４】構築物は、コード配列の５’と３’、コー
ド配列の転写および／または翻訳を援助するような発現
を援助する配列を含んでもよい。構築物は典型的に、
（Ｔｈｙ−１プロモーターと同様に）エンハンサー、転
写終結点、ポリアデニル化シグナル、ポリＡ尾部、イン
トロン、翻訳開始コドン、および／または翻訳終止コド
ンを含む。
【００２５】本発明の構築物は、アンチセンスＲＮＡを
生成するのにも利用され得る。アンチセンスポリヌクレ
オチドは、Ｔｈｙ−１プロモーターにアンチセンスの向
きに結合されたＡＰＰ６９５ｓｗタンパク質をコードす
る配列を含む。そのようなポリヌクレオチドは、内在性
のＡＰＰホモログの発現を変化させるアンチセンスｍＲ
ＮＡを産生してその正常機能を調べるのに利用され、ま
たはトランスジーンの発現レベルを制御するために本発
明の非ヒトトランスジェニック動物の脳細胞にトランス
フェクトしてもよい。
【００２６】＜ベクター＞本発明の構築物は、組換え複
製可能なベクターに組み込まれる。ベクターは、例えば
細菌等の適合する宿主細胞内でポリヌクレオチドを複製
するのに利用可能な、またはルーチン技術を利用してポ
リヌクレオチドにさらなる変異を挿入するのに利用可能
なクローニングベクターである。
【００２７】或いは、本発明の構築物は、Ｔｈｙ−１制
御配列に加えて転写を増強または減少させる制御配列を
含む発現ベクターにおいて提供されてもよい。このベク
ターは、脳内のニューロンや他の細胞に効率的にトラン
スフェクトするのに利用可能なウイルスベクターであっ
てもよい。
【００２８】＜動物＞本発明は、ＡＰＰ６９５ｓｗタン
パク質のコード配列とコード配列に機能するように結合
された脳特異的Ｔｈｙ−１制御配列を含む二倍体ゲノム
を含む、非ヒトトランスジェニック動物を提供する。よ
って、動物のゲノムは本発明の構築物を含むことができ
る。トランスジェニック動物の脳のニューロンにおける
変異型ＡＰＰアイソフォームの過剰発現により、時間依
存的な様式でＡＤの症状を示すトランスジェニック動物
モデルが作製される。非ヒトトランスジェニック動物
は、脳内のβＡ４の蓄積に関連する認識欠損、特に空間
的記憶欠損を示す。
【００２９】ヒトＡＰＰ６９５ｓｗアイソフォームは典
型的に、この動物の脳細胞で、細胞で発現される内在性
ＡＰＰ量の５から１２倍高い量で発現される。過剰発現
が起こる脳細胞は、好ましくは海馬または皮質である。
過剰発現は小脳でも起こる。ＡＰＰ６９５ｓｗタンパク
質の発現は、胸腺では起こらない。
【００３０】非ヒトトランスジェニック動物は、元の構
築動物、構築動物からいずれかの世代を隔たったトラン
スジーンを発現するその後の子孫、および構築動物また
はその子孫と同種の他の動物との交配動物を含む。さら
なる非ヒトトランスジェニック動物は、このように、ス
ウェーデン変異を含むヒトＡＰＰ６９５を過剰発現する
本発明の動物と、ＡＤの他の性質またはこの疾患に関連
した遺伝子を発現する同種のトランスジェニック動物を
交配することにより作製可能である。そのようなケース
の一つは、本発明のヒトＡＰＰ６９５ｓｗトランスジェ
ニック動物を、Ｔｈｙ−１制御エレメントの制御下に家
族性変異（Ｍ１４６ＶまたはＥ２８０Ｇ）を含むヒトプ
レセニリン（ＰＳ）−１ ｃＤＮＡを発現するトランス
ジェニック動物と交配させる場合であり、これは初期齢
においてアルツハイマー様の症状を発症する。本発明に
よれば、変異型ヒトＰＳ−１、ヒトタウ、ヒトａｐｏＥ
２、ヒトａｐｏＥ３、またはヒトａｐｏＥ４を発現する
トランスジェニック非ヒト動物を提供することも可能で
ある。
【００３１】トランスジェニック動物は、一般に哺乳動
物、特に齧歯動物である。好ましくはトランスジェニッ
クマウスである。マウスでは、好ましいバックグラウン
ドの遺伝株は純系ｃ５７ｂｌ／６であり、さらに好まし
いバックグラウンドの遺伝株はｃ５７ｂｌ／６ｘｃ５７
ｂｌ／６ｘＣ３Ｈである。
【００３２】＜細胞＞本発明は、トランスジェニック非
ヒト動物から培養されるいずれの細胞を含む。細胞はイ
ン・ビトロで培養される。よって細胞のゲノムは、本発
明の構築物を含む。ヒトＡＰＰ６９５ｓｗアイソフォー
ムは典型的に、そのような細胞内で、その細胞で発現さ
れる内在性ＡＰＰ量の５から１２倍高い量で発現され
る。
【００３３】トランスジェニック動物からイン・ビトロ
で培養される細胞は、いずれかの適当な方法で調製され
る。細胞は典型的に齧歯細胞であり、好ましくはマウス
の細胞である。したがってニューロン細胞の培養が提供
され得り、例えば海馬または皮質細胞の培養である。細
胞は、既知のいずれかの方法により（ウイルス送達を含
む）、他の目的遺伝子を導入するのに利用することもで
きる。
【００３４】本発明は、本発明のポリヌクレオチドで形
質転換またはトランスフェクトされるいずれの細胞も含
む。そのような細胞はポリヌクレオチドを含むベクター
を複製するのに利用される細菌または酵母細胞、および
本発明の非ヒトトランスジェニック動物を作製するのに
利用される幹細胞または卵母細胞を含む。
【００３５】＜動物の作製＞非ヒトトランスジェニック
動物は、いずれかの適当なプロトコールを利用すること
により作製される。適当な方法は、 −本発明の適当な細胞を作製し −細胞を本発明の動物に生育させ −随意に、典型的な動物を交配することを含む。
【００３６】本発明の構築物は、マイクロインジェクシ
ョンにより動物胚に導入される。代わりに、胚幹細胞を
利用してもよい。どちらのアプローチをとるにしても、
トランスジェニック動物は作製できる。得られた構築動
物は、交配させることができる。前核マイクロインジェ
クション経路が実際に好まれ、それによると本発明の構
築物は非ヒト動物の受精卵母細胞の前核に注入される。
【００３７】トランスジェニック動物は、いずれかの適
当な方法により、トランスジーンの存在（すなわち遺伝
子型）について解析される。典型的に、ＡＰＰ６９５ｓ
ｗコード配列中のアンチセンスプライマーとコード配列
が挿入されたＴｈｙ−１遺伝子中のセンスプライマーを
利用して、動物のゲノムＤＮＡをスクリーニングする。
結果は、陽性サンプルのゲノムＤＮＡをサザンブロット
し、本発明の放射標識したｃＤＮＡ構築物（すなわち、
Ｔｈｙ−１−ＡＰＰプローブ）でプローブ検出すること
により確認される。
【００３８】アミロイド負荷量の増加と関連した年齢依
存性の空間的記憶欠損を示すトランスジェニック動物を
得るには、適当なレベルのトランスジーンの過剰発現を
示すトランスジェニック動物株を選択することが重要で
ある。変異型ＡＰＰトランスジーンを内在性ＡＰＰレベ
ルの少なくとも５倍発現する株のみを選択すべきであ
る。そのように選択された株は、次に病理学的、行動学
的、および電気生理学的解析に供される。
【００３９】内在性ＡＰＰタンパク質と比較したヒトＡ
ＰＰ６９５ｓｗタンパク質の発現レベルは、イムノブロ
ット技術（典型的にウェスタンブロット解析）を利用し
て測定することができる。そのようなレベルは一般に、
殺した動物の海馬、皮質、または小脳の細胞で測定され
る。発現の効果は、生化学、組織学、および／または免
疫組織化学によって解析することが可能である。行動学
的解析は、Ｙ迷路試験またはＭｏｒｒｉｓ水迷路試験の
ような認識試験を利用して実施可能である。
【００４０】発現レベルは、トランスジェニック動物が
得られた時、すなわち時間＝０の時点で測定してよい。
発現レベル、組織学、免疫組織化学、および行動学的解
析も、時間＝３、６、９、１２、１８、および／または
２４ヶ月の時点で測定することができる。Ｔｈｙ−１プ
ロモーターの制御下でＡＰＰ６９５ｓｗを過剰発現する
トランスジェニックマウスは、アミロイド症状を示すこ
とが見出された。さらに、空間的記憶欠損は、アミロイ
ド負荷量の増加と、典型的に時間＝６ヶ月の時点で関連
することが示された。
【００４１】＜トランスジェニック細胞および動物の使
用＞本発明の細胞および動物は、この疾患のアミロイド
形成経路における候補セクレターゼまたは他の重要な因
子を確認するため、例えば同定および試験するためにも
利用され得る。例えば、ＡＰＰを切断してβＡ４を生成
するβ−セクレターゼおよびγ−セクレターゼが同定さ
れ得る。この細胞および動物は、アルツハイマー病にお
けるＡＰＰとβＡ４の役割を研究するのにも利用でき
る。例えば、アンチセンスＲＮＡは、βＡ４関連経路の
可逆性を調べるのに利用可能である。
【００４２】本発明の細胞および動物は、例えば頭部損
傷および特にアルツハイマー病等の神経変性疾患等の、
ＡＰＰプロセシングにおける欠陥を特徴とする疾患の治
療のための可能性ある治療薬の有効性を試験するのにも
利用され得る。可能性ある治療薬は、βＡ４の生成、沈
着、または毒性を阻害するのかもしれない。よって、 −本発明の動物に、候補試験物質を投与し −候補物質が（ｉ）疾患の発症を妨げるあるいは遅らせ
るか、または（ｉｉ）疾患を治癒するかどうかを調べる
ことを含む、βＡ4蓄積を特徴とする疾患の治療用治療
薬を同定する方法が提供される。
【００４３】選択肢（ｉｉ）は、候補物質が、疾患によ
って生じる本明細書の中で述べたような細胞または生理
的変化のいずれかを減じるかどうかを測定することによ
り、試験される。また、 −候補物質を本発明の細胞に接触させ −候補物質が（ｉ）疾患に関連した細胞変化の発症を妨
げるあるいは遅らせるか、または（ｉｉ）（本明細書の
中で述べた細胞変化のいずれかのような）疾患によって
生じる細胞変化のいずれかを減じるかどうかを調べるこ
とを含む、βＡ4蓄積を特徴とする疾患の治療用治療薬
を同定する方法も提供される。
【００４４】選択肢（ｉｉ）は、例えば、候補物質が、
変異型ＡＰＰのβＡ４への開裂を阻害するか否かを測定
することにより試験される。
【００４５】上記方法で試験される適当な候補物質に
は、抗体産物（例えば、モノクローナルおよびポリクロ
ーナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、およびＣＤＲ−移
植抗体）が含まれる。さらに、ディスプレイライブラリ
ー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）のよ
うな、無作為配列ライブラリー、確定した化学的に非常
によく類似したもの、ペプチドとペプチド模倣物、オリ
ゴヌクレオチド、および天然物ライブラリーも試験でき
る。候補物質は化合物でもよい。例えば反応当たり１０
の物質というように、候補物質のバッチを最初のスクリ
ーニングに使用してもよく、次に阻害を示すバッチの物
質を個々に試験する。
【００４６】本発明のトランスジェニック動物は、例え
ばタウのリン酸化、ニューロンのアポトーシス、および
炎症等の、ＡＰＰプロセシングの下流で起こる現象を阻
害することを目的とした、可能性ある治療薬の有効性を
試験するのにも利用される。治療薬試験の一例として、
本発明の組換え細胞や脳組織と、老人および慢性アミロ
イド斑の主要な特徴であるβＡ４アミロイドを認識する
抗血清とのインキュベーションが含まれる。タウのリン
酸化ともつれ形成のレベル、ミクログリアの活性化状
態、およびニューロンの減少程度に影響を及ぼす薬剤の
試験は、本発明のＡＰＰトランスジーンに加えてプレセ
ニリン遺伝子の変異等の変異を含むトランスジェニック
動物およびそのような動物由来の細胞に特に好まれる。
【００４７】βＡ４生成を変化させるおよび／またはＡ
Ｄ様の症状を変化させる薬剤は、イン・ビボで、あるい
は細胞または組織サンプルを用いてイン・ビトロで試験
することが可能である。本発明を特徴付けるのに用いら
れるアッセイおよび試験を利用して、化合物を試験する
ことができる。例えば、いずれかの可能性ある治療薬を
投与した後、トランスジェニック動物の反応を、実施例
に記述されたように行動学的および電気生理学的試験に
より評価できる。細胞株または動物を利用した可能性あ
る治療薬をスクリーニングする方法が、確立される。Ｅ
ＬＩＳＡまたはHomogenous Time Resolved Fluorescenc
e（HTRF）方法論が利用可能である。
【００４８】本発明のスクリーニング法で同定された薬
剤は、先に議論した疾患を防止しまたは治療するのに利
用される。よって、そのような疾患を患った患者の症状
は、そのような産物を投与することにより改善され得
る。治療的に効果的で毒性のない薬剤の量が、その必要
性に応じてヒト患者に与えられる。
【００４９】疾患を防止または治療するのに利用する産
物の剤形は、同定された薬剤と防止または治療する疾患
の性質等の因子に依存する。典型的に、薬剤は製薬上容
認されるキャリアーまたは希釈剤と共に調剤される。例
えば、脳内、非経口的、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、
または経口的に投与される。それぞれの患者に対して、
医師が投与に必要な経路を決めることができる。製薬キ
ャリアーまたは希釈剤は、例えば等張液である。
【００５０】産物の投与量は、様々なパラメーターにし
たがって、特に用いる物質、治療する患者の年齢、体
重、および症状、投与経路、必要投与計画にしたがって
決定される。しかし、適当な投与量は、例えば１〜４０
ｍｇ／ｋｇ体重等の、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重で
ある。この場合もやはり、それぞれの患者に対して、医
師が投与に必要な経路および投与量を決めることができ
る。
【００５１】本発明の構築物、細胞、または治療薬は、
実質的に単離された形で存在する。それらは意図した目
的を妨げないキャリアーまたは希釈剤と混合してもよい
が、それでもなお実質的に単離されているとみなされる
ことが理解されよう。よって、本発明の構築物、細胞、
または治療薬は、実質的に精製された形でもよく、その
ような場合には一般に、例えば９５％、９８％、あるい
は９９％のように、関連製剤重量の９０％以上を構成す
る。
【００５２】
【実施例】以下の実施例は、本発明を説明するものであ
る。
【００５３】実施例１：トランスジーンの構築 Ｔｈｙ−１−ＡＰＰトランスジーンは、スウェーデン家
族性変異を有するヒトＡＰＰ ｃＤＮＡ（ＡＰＰ６９
５）を、マウスＴｈｙ−１遺伝子を含むベクターに挿入
することにより作製した。この挿入はＴｈｙ−１遺伝子
のコード配列を置換し、トランスジーンの脳特異的発現
を可能にした（図１）。ＡＰＰコード配列の５’末端
は、平滑末端ＨｉｎｄＩＩＩ部位と強力なＫｏｚａｋ翻
訳開始配列に先行された。修飾はすべて、標準のクロー
ニング方法とＰＣＲに基づいた部位特異的突然変異誘発
を利用して行った。
【００５４】実施例２：トランスジェニックマウスの作
製と構築動物のスクリーニング 注入の前に、Ｔｈｙ−１−ＡＰＰ遺伝子融合ＤＮＡを、
最終濃度１０μｇ／ｍｌになるようにＴＥ（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８）に溶解した。ト
ランスジェニック株は、骨格のプラスミド配列を除去し
た後に、この断片をｃ５７ｂｌ／６ｘＣ３Ｈマウスの受
精卵母細胞へ前核マイクロインジェクションすることに
より作製した。
【００５５】標準の方法により尾部生検ＤＮＡを作製
し、（５０μｌのうち）１μｌを５’Ｔｈｙ−１プライ
マーと３’ＡＰＰプライマーを用いたＰＣＲ反応に利用
した。トランスジーンのコピー数は、１０μｇの変性し
た精製尾部ＤＮＡと放射標識した０．７ｋｂのＢａｍＨ
Ｉ断片を用いて、サザンブロットすることにより測定し
た。
【００５６】実施例３：トランスジーンの発現の解析 ＡＰＰトランスジーン産物は、１〜４ヶ月齢で殺したト
ランスジェニック構築動物の子孫で調べた。トランスジ
ェニックおよび同腹仔コントロールの脳由来のタンパク
質抽出物は、ＲＩＰＡ溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ ｐＨ８，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％デオキシコ
ール酸ナトリウム、１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ ，
プロテアーゼ阻害剤）で半脳をホモジナイズし、４℃で
２０分間、１３０００ｒｐｍで遠心分離することにより
調製した（Moecharsら, EMBO J.15(6), 1265-1274, 199
6）。この上清に最終濃度１％になるようにＳＤＳを添
加し、８％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより等量（２０μｇ）
のタンパク質を分画した。９つのＴＡＳ株（４４、１３
８、３６、１０２、１０、７４、２５、３９、および９
９）でのＡＰＰトランスジーンの発現は、ＬＮ２７モノ
クローナル抗ＡＰＰ抗体（Zymed）を用いて測定した。
データを以下の表１に示す。
【００５７】
【表１】
【００５８】長期的研究に利用するため、４つの最も発
現量の高い株（ＴＡＳ１０、２５、７４、および１０
２）をｃ５７ｂｌ／６マウスと交配し、ｃ５７ｂｌ／６
／Ｃ３Ｈｘｃ５７ｂｌ／６遺伝的バックグラウンドをも
つ多数のＦ２マウスを作製した。トランスジーンの発現
は、脳特異的であり、小脳と比較して海馬と皮質におい
て高いことが確認された。
【００５９】実施齢４：脳組織におけるβＡ４の解析 ４つの最も発現量の高いＴＡＳ株由来の６匹の非トラン
スジェニックコントロールマウスと６匹のトランスジェ
ニックマウスの脳を、全βＡ４レベルについて解析し
た。脳を摘出し、直ちに二等分した。組織学的解析のた
め半分は２％パラホルムアルデヒドで固定し、半分は海
馬、皮質、および小脳組織に解剖した。組織断片の正確
な質量を測定した後、グアニジン／カゼイン抽出バッフ
ァーを用いて組織サンプルを溶解した（Johnson-Wood
ら、PNAS USA 94(4), 1550-1555, 1997）。
【００６０】４Ｇ８キャプチャーとビオチン化６Ｅ１０
レポーター抗体（Kimら、Neurosci.Res. Comm. 7(2), 11
3-130, 1990; 図2）を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ
（Suzukiら、Science 264, 1336-1340, 1994）を実施し
た。サンプルは３連で試験し、βＡ４ １〜４０の検量
線（１〜２０ｎｇ／ｍｌ）の範囲に入る吸光度をピコモ
ルに変換し、非トランスジェニックまたはトランスジェ
ニックの各ＴＡＳ株について平均ｐｍｏｌ／ｇ湿組織と
して表した。
【００６１】各非トランスジェニックおよびトランスジ
ェニックＴＡＳ株についての平均βＡ４値（±ＳＥＭ）
を、６ヶ月で殺したマウスの海馬、皮質、および小脳組
織についてそれぞれ図３、４、および５に示す。値はｐ
ｍｏｌ／ｇ湿組織で表す。
【００６２】２、６、１２、１８、および２４ヶ月目に
殺されたＴＡＳ１０株の非トランスジェニック（図６
Ａ）およびトランスジェニックマウス（図６Ｂ）由来脳
サンプルの平均βＡ４値（±ＳＥＭ）を、海馬、皮質、
および小脳組織について示す。同腹仔野生型マウスの三
つの脳領域すべてにおいて、βＡ４負荷量は、長期実験
を通してバックグラウンドレベルと同等である。
【００６３】１〜４０および１〜４２ βＡ４レベルを
測定するのにも上記したようにサンドイッチＥＬＩＳＡ
を利用したが、βＡ４の１〜４０種を捕獲するためのペ
プチドＣＭＶＧＧＶＶに対する抗体と１〜４２ βＡ４
種を捕獲するためのペプチドＣＭＶＧＧＶＶＩＡに対す
る抗体を用いた。２、６、１２、１８、および２４ヶ月
目に殺されたＴＡＳ１０株の非トランスジェニック（図
７Ａ）およびトランスジェニックマウス（図７Ｂ）由来
脳サンプルの平均１〜４０ βＡ４および１〜４２ β
Ａ４値（±ＳＥＭ）を、海馬、皮質、および小脳組織に
ついて示す。
【００６４】脳をパラホルムアミド固定した後、免疫組
織学的解析を実施した。海馬および皮質を通る脳の切片
を、βＡ４に対する一連の抗血清で染色した。１２ヶ月
目に殺されたＴＡＳ株のトランスジェニックマウス由来
の脳の皮質で、アミロイド斑の症状が検出された。この
目的のため、βＡ４のアミノ酸１〜１７、３５〜４０、
および３５〜４２をそれぞれ認識する三つの抗血清を利
用した。
【００６５】１２、１８、および２４ヶ月目に殺された
トランスジェニックマウスの脳における齢依存性β−ア
ミロイド沈着を検出するため、βＡ４ １〜４０および
１〜４２に対する末端特異的抗血清を利用して、免疫組
織化学的解析も実施した。
【００６６】ＴＡＳ１０マウスの海馬における、斑の平
均の大きさ、数、および解剖学的に明らかとされる斑に
占有された領域の比率は、１８ヶ月目において、１２ヶ
月目よりも著しく高かった。
【００６７】チオフラビン(Thioflavin)Ｓのカウンター
染色(counter-staining)により、原線維斑は、１２ヶ月
齢のトランスジェニックのものよりも１８ヶ月齢のトラ
ンスジェニックにおいてより多く発症することが明らか
になった。年齢の同じ野生型同腹仔コントロールは、調
べたすべての領域において、アミロイド斑を欠く。
【００６８】細胞減少の徴候は、２４ヶ月目のＴＡＳ１
０トランスジェニックマウス脳の海馬で、チオフラビン
Ｓ陽性斑を囲む領域において明白であった。プログラム
細胞死を起こす細胞あるいはミクログリア等の炎症細胞
の存在を示唆するこの領域において、高度に色素沈着し
凝縮した細胞も見られた。
【００６９】グリア繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）
（Ｓｉｇｍａ，Ｇ９２６９）に対する抗体での染色によ
り、活性化アストロサイトが大きな皮質性アミロイド沈
着と共に局在化し、活性化アストロサイトが海馬全体に
存在することが示された。
【００７０】実施例５：神経学的評価と歩行運動活動 １２匹の雄ＴＡＳマウスおよび野生型同腹仔コントロー
ルからなる、試験グループを選択した。すべてのマウス
を、脊髄（屈曲）、髄質（角膜反射）、脳橋（正向反
射）、および自律神経性（唾液分泌）機能を調べる一連
の試験に供した。運動協調性はマウスロータロッドで評
価し、前肢の握力はグリッドフロア(gridfloor)と圧力
トランスデューサーで測定した。マウスを個々に活動モ
ニターケージに入れ、１時間、歩行運動活動を記録し
た。事前の習慣性はなかった。歩行運動活動（ＬＭＡ）
は、ビーム中断(beam break)の数を測定することにより
定量化した。
【００７１】表２は、６、１２、１８、および２４ヶ月
目の、野生型コントロールとの比較におけるＴＡＳ１０
マウスに例証される神経学的評価の結果を示す。いずれ
の齢においても、感覚／運動課題には顕著な違いは見ら
れなかった。
【００７２】表２：ＴＡＳ１０のＡＰＰ過剰発現マウス
と野生型コントロールの神経学的評価
【表２】
【００７３】実施例６：認識試験：Ｍｏｒｒｉｓ水迷路
試験 指示(cued)された回避プラットフォームを利用して、す
べてのマウスを４セッション訓練した（指示(cued)課
題）。マウスをプールにそっと入れ、プラットフォーム
を見つけるマウスの泳いだ経路を記録するコンピュータ
ー化トラッキングシステムに接続された頭上のカメラを
始動させ、各試験を開始した。指示課題の後、マウスに
隠されたプラットフォームを用いた８セッションを受け
させ、空間的参考学習を評価した。１２セッション後、
マウスにプラットフォームのない６０秒の試験からなる
プローブ試験(probe trial)を受けさせ、その間の探す
パターンを解析した。各象現で費やした時間を、全時間
のパーセンテージとして記録した。以前に隠されたプラ
ットフォームを含んでいた象現を探すのに費やした時間
を、他の象現で探すのに費やした時間と比較した。
【００７４】図８は、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路試験の結果を
示す。図８Ａは潜時を示し、図８Ｂは指示課題において
目に見えるプラットフォームを見つける（セッション１
〜４）、および隠されたプラットフォームを見つける
（セッション５〜１２）経路の長さを示し、図８Ｃはそ
こまで泳ぐスピードを示す。指示課題においては、遺伝
子型の主効果は見られなかった。しかし、ＴＡＳ１０ト
ランスジェニック株の６ヶ月齢マウスは、隠されたプラ
ットフォームを見つける際に遺伝子型の主効果を示し
（Ｆ，１，２１＝１０；ｐ＝０．０１）、これにより空
間的学習の欠損が示唆される。同様に、徹底的な試験に
より、このトランスジェニック株での空間的記憶障害の
徴候が示された（図９Ａおよびｂ）。
【００７５】実施例７：認識試験：Ｙ迷路自発的交互変
化 この迷路は、５０ｃｍ長、３０ｃｍ高、および１２ｃｍ
幅の３本の木製アームが同じ角度で収束して構成され
た。これらのアームを任意にＡ、Ｂ、およびＣと決め
た。各マウスをランダムにアームのうちのどれか一本の
端に置き、５分間、アームに侵入する数と順序を手動で
記録した。Ｙ迷路は、新しい環境を探るマウスの生来の
性向を利用したものであり、交互変化は連続的な選択に
おける全３本のアームへの侵入を説明するものである。
交互変化機会の最大数は全アームへの侵入数マイナス２
であり、パーセント交互変化は実際の交互変化を最大交
互変化機会で割ってｘ１００として計算された。
【００７６】対のないｔ−検定による解析から、２また
は６ヶ月齢において、自発的交互変化、位置的偏り、ま
たは全アーム侵入には遺伝型特異的な違いの証拠は示さ
れなかった（表３）。しかし、１２および１８ヶ月齢に
おいて、自発的交互変化行動の顕著な進行性の障害があ
り、ＡＰＰ過剰発現マウスでの作業記憶の欠損が示され
た。グループ間に、位置的偏りまたはアームへの侵入の
著しい違いはなかった（表３）。
【００７７】表３：Ｙ迷路におけるＴＡＳ１０トランス
ジェニックマウスと野生型コントロールの成績
【表３】
【００７８】実施例８：状況および指示恐怖条件づけ 最初に、バックグラウンド音を提供する白色騒音の存在
下で、マウスに訓練チャンバーを２分間自由に探索させ
た。２分間の探索時間後に、マウスに、１秒間の足ショ
ック（０．５ｍＡ）と同時終了するチャンバー内の２４
Ｗ光と共に、２０秒間の８０ｄＢ音を与えた。１秒間の
足ショック後に、さらに２回の音ショックの組み合わせ
を２分間の間隔で与えた。古い状況（光／音ショック提
示なし）存在下でマウスが示すすくみの秒数を測定し、
状況記憶を評価した。２時間後、新しい環境（異なる
色、感触）において同じマウスで、指示記憶を評価し
た。マウスを新しい状況に１分間置き、その後、２０秒
間の８０ｄＢ音を光と共に与えた。これを２回繰り返
し、２回の１分間データセットの平均を計算した。
【００７９】調べたいずれの齢においても、野生型とＡ
ＰＰ過剰発現マウス間に、状況または指示記憶の顕著な
違いはなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、スウェーデン家族性変異を有するヒト
ＡＰＰ ｃＤＮＡの６９５アイソフォーム（ＡＰＰ６９
５）をマウスＴｈｙ−１遺伝子を含むベクターに挿入す
ることにより作製された、Ｔｈｙ−１−ＡＰＰトランス
ジーンを示す。このトランスジーンは、マウスＴｈｙ−
１プロモーターの制御下でスウェーデン変異を有するＡ
ＰＰ６９５を過剰発現するＴＡＳ株のトランスジェニッ
クマウスを作製するのに利用された。
【図２】図２は、いかにしてＡＰＰ６９５がプロセシン
グを受けてβＡ４を生成するのかを図示したものであ
り、４Ｇ８と６Ｅ１０抗体によって認識されるβＡ４の
領域を示す。
【図３】図３は、それぞれ海馬、皮質、および小脳組織
の抽出物について、４Ｇ８キャプチャーとビオチン化６
Ｅ１０レポーター抗体を用いて実施したサンドイッチＥ
ＬＩＳＡアッセイの結果を示す。サンプルは３連で試験
し、βＡ４ １〜４０の検量線（１〜２０ｎｇ／ｍｌ）
の範囲に入る吸光度をピコモルに変換し、非トランスジ
ェニック（ｎｏｎ−ＴＧ）またはトランスジェニック
（ＴＧ）の各ＴＡＳ株について平均ｐｍｏｌ／ｇ湿組織
として表した。
【図４】図４は、それぞれ海馬、皮質、および小脳組織
の抽出物について、４Ｇ８キャプチャーとビオチン化６
Ｅ１０レポーター抗体を用いて実施したサンドイッチＥ
ＬＩＳＡアッセイの結果を示す。サンプルは３連で試験
し、βＡ４ １〜４０の検量線（１〜２０ｎｇ／ｍｌ）
の範囲に入る吸光度をピコモルに変換し、非トランスジ
ェニック（ｎｏｎ−ＴＧ）またはトランスジェニック
（ＴＧ）の各ＴＡＳ株について平均ｐｍｏｌ／ｇ湿組織
として表した。
【図５】図５は、それぞれ海馬、皮質、および小脳組織
の抽出物について、４Ｇ８キャプチャーとビオチン化６
Ｅ１０レポーター抗体を用いて実施したサンドイッチＥ
ＬＩＳＡアッセイの結果を示す。サンプルは３連で試験
し、βＡ４ １〜４０の検量線（１〜２０ｎｇ／ｍｌ）
の範囲に入る吸光度をピコモルに変換し、非トランスジ
ェニック（ｎｏｎ−ＴＧ）またはトランスジェニック
（ＴＧ）の各ＴＡＳ株について平均ｐｍｏｌ／ｇ湿組織
として表した。
【図６】図６は、非トランスジェニック（図６Ａ）また
はトランスジェニックＴＡＳ１０マウス（図６Ｂ）由来
の海馬、皮質、および小脳組織の抽出物について、４Ｇ
８キャプチャーとビオチン化６Ｅ１０レポーター抗体を
用いて実施したサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの結果
を示す。ｐｍｏｌ／ｇ湿組織（±ＳＥＭ）で表された全
βＢＡ４値は、各グループの６匹のマウスの平均値であ
る。
【図７】図７は、トランスジェニックＴＡＳ１０マウス
のそれぞれ海馬、皮質、および小脳組織の抽出物につい
て、４Ｇ８キャプチャーとビオチン化６Ｅ１０レポータ
ー抗体を用いて実施したサンドイッチＥＬＩＳＡアッセ
イの結果を示す。ｐｍｏｌ／ｇ湿組織（±ＳＥＭ）で表
されたβＡ４ １〜４０（図７Ａ）およびβＡ４１〜４
２（図７Ｂ）値は、各グループの６匹のマウスの平均値
である。
【図８】図８は、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路試験の結果を示
す。図８Ａは潜時を示し、図８Ｂは指示課題において目
に見えるプラットフォームを見つける（セッション１〜
４）、および隠されたプラットフォームを見つける（セ
ッション５〜１２）経路の長さを示し、図８Ｃはそこま
で泳ぐスピードを示す。
【図９】図９は、隠されたプラットフォームの４および
８セッション後の、徹底的な試験の結果を示す。図９Ａ
は各象現で費やした時間のパーセンテージを示し、図９
Ｂはプラットフォームを通過した回数を表す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (71)出願人 397009934 Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕｓ ｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇ ｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａ ｉｎ (72)発明者 ジル・キャロライン・リチャードソン イギリス国、エスジー１・２エヌワイ、ハ ートフォードシャー、スティーブンエイ ジ、ガンネルズ・ウッド・ロード（番地な し） グラクソ・ウェルカム・ピーエルシ ー (72)発明者 ハーマン・トーマス・レーン・ルプニアク イギリス国、エスジー１・２エヌワイ、ハ ートフォードシャー、スティーブンエイ ジ、ガンネルズ・ウッド・ロード（番地な し） グラクソ・ウェルカム・ピーエルシ ー

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 変異型K670NおよびM671Lのみを含むヒト
    APP695アイソフォームをコードするコード配列と、前記
    コード配列に動作的にリンクした脳特異的Thy-1調節配
    列とを含む組換えDNA構築物。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の構築物であって、前記
    調節配列は齧歯類Thy-1プロモータを含む構築物。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載の構築物であって、前記
    Thy-1プロモータはマウスThy-1プロモータである構築
    物。
  4. 【請求項４】 変異型K670NおよびM671Lのみを含むヒト
    APP695アイソフォームをコードするコード配列と、前記
    コード配列に動作的にリンクした脳特異的Thy-1調節配
    列とを含むDNAをゲノムに組込んだトランスジェニック
    非ヒト動物であって、前記変異型ヒトAPP695アイソフォ
    ームは、前記動物の脳細胞において、その中で発現する
    内因性APPの少なくとも5倍よりも多い量で発現するトラ
    ンスジェニック非ヒト動物。
  5. 【請求項５】 請求項４に記載のトランスジェニック非
    ヒト動物であって、前記脳細胞は海馬細胞、小脳細胞ま
    たは皮質細胞であるトランスジェニック非ヒト動物。
  6. 【請求項６】 請求項４または５に記載のトランスジェ
    ニック非ヒト動物であって、齧歯類であるトランスジェ
    ニック非ヒト動物。
  7. 【請求項７】 請求項６に記載のトランスジェニック非
    ヒト動物であって、マウスであるトランスジェニック非
    ヒト動物。
  8. 【請求項８】 請求項４〜７の何れか１項に記載のトラ
    ンスジェニック非ヒト動物であって、変異型ヒトPS-1、
    ヒトタウ、ヒトapoE2、ヒトapoE3またはヒトapoE4をも
    発現するトランスジェニック非ヒト動物。
  9. 【請求項９】 変異型K670NおよびM671Lのみを含むヒト
    APP695アイソフォームをコードするコード配列と、前記
    コード配列に動作的にリンクした脳特異的Thy-1調節配
    列とを含むDNAをゲノムに組込んだトランスジェニック
    非ヒト動物細胞であって、前記変異型ヒトAPP695アイソ
    フォームは、前記動物の脳細胞において、その中で発現
    する内因性APPの少なくとも5倍よりも多い量で発現する
    トランスジェニック非ヒト動物。
  10. 【請求項１０】 齧歯類細胞である、請求項９に記載の
    細胞。
  11. 【請求項１１】 マウス細胞である、請求項１０に記載
    の細胞。
  12. 【請求項１２】 請求項９〜１１の何れか１項に記載の
    細胞であって、変異型ヒトPS-1、ヒトタウ、ヒトapoE
    2、ヒトapoE3またはヒトapoE4をも過剰発現する細胞。
  13. 【請求項１３】 請求項４のトランスジェニック非ヒト
    同遺物を製造する方法であって： （ａ）請求項１〜３の何れか１項に定義した構築物を細
    胞または胚に導入することと； （ｂ）前記細胞または胚から前記動物を発生させること
    とを具備した方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１３に記載の方法であって、前
    記構築物を非ヒト動物受精卵の前核に注入する方法。
  15. 【請求項１５】 得られた創始者動物を繁殖させる、請
    求項１３または１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 変性脳症の治療に使用するための薬剤
    をスクリーニングする方法であって、請求項４〜８の何
    れか１項で定義したトランスジェニック非ヒト動物また
    は請求項９〜１２の何れか１項に定義したトランスジェ
    ニック非ヒト動物細胞を使用して、前記薬剤をスクリー
    ニングすることを具備した方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の方法であって、前
    記変性脳症がアルツハイマー病である方法。
  18. 【請求項１８】 変性脳症の治療に使用する薬剤をスク
    リーニングするためのキットであって、請求項９〜１２
    の何れか１項に定義したトランスジェニック非ヒト動物
    細胞と、被検薬剤が前記細胞における変異型APPの発現
    に伴う細胞変化を阻害するかどうかを決定するための手
    段とを具備したキット。
  19. 【請求項１９】 請求項１６または１７の方法または請
    求項１８のキットを使用して同定された薬剤。
  20. 【請求項２０】 変性脳症の治療に使用するための、請
    求項１９に記載の薬剤。
  21. 【請求項２１】 アルツハイマー病の治療用医薬の製造
    における請求項２０に記載の薬剤の使用。
  22. 【請求項２２】 変性脳症の治療における使用に適した
    薬学的組成物であって、薬学的に許容可能なキャリアま
    たは希釈剤と、活性成分として、請求項１６または１７
    の方法または請求項１８のキットを使用して同定された
    薬剤とを含有する薬学的組成物。
  23. 【請求項２３】 増大したアミロイド蓄積および付随す
    る年齢に相関した認識能力低下を示すトランスジェニッ
    ク非ヒト動物。
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