CN104231053A

CN104231053A - 调节β淀粉样蛋白生理毒性的多肽

Info

Publication number: CN104231053A
Application number: CN201310421560.XA
Authority: CN
Inventors: 王琛; 杨爱华; 王晨轩; 杨延莲
Original assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Current assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Priority date: 2013-06-08
Filing date: 2013-09-16
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2033-09-16
Also published as: CN104231053B

Abstract

本发明公开了一种调控Aβ42蛋白生理毒性的多肽，其编码序列、包含其编码序列的重组载体与重组细胞以及它们的应用。本发明的多肽可有效地改变淀粉样蛋白的聚集动力学过程和聚集行为，实现对Aβ42蛋白毒性的调控为淀粉样蛋白相关疾病的多肽类先导化合物的发现和预测，提供药物母核的设计模型；同时还可用于Aβ42蛋白的检测。本发明设计的多肽对于Aβ42截短体Aβ28、Aβ40，以及其点突变体Aβ43可能也有调节其生理毒性的作用。

Description

调节β淀粉样蛋白生理毒性的多肽

相关申请

本发明要求2013年6月8日提交的专利申请第201310229016.5号的优先权。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，发明一种调控β淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）生理毒性的多肽，其编码序列、包含其编码序列的重组载体与重组细胞以及它们的应用。

背景技术

阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s disease，AD），即我们常说的老年痴呆症，是一种中枢神经系统变性病，其起病隐秘，病程呈慢性进行性进展，是老年痴呆症最常见的一种类型。AD的主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能，甚至最终失去生活能力，对人类健康和生活有着巨大威胁，造成家庭和社会的巨大经济负担。阿尔茨海默氏病的发病机制尚未完全确定，目前比较流行的是Aβ级联学说、中枢胆碱能损伤学说、兴奋性氨基酸毒性学说以及Tau蛋白学说等。

AD病特征性的病理改变为Aβ蛋白沉积形成的细胞外老年斑和Tau蛋白过度磷酸化并聚集形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。

Aβ蛋白由39-43个氨基酸组成，分子量约4kDa，由β淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)水解而来，由细胞分泌，是大脑皮质老年斑的主要成分，其可溶性二聚体可以有效削弱突触结构和功能，在细胞基质沉淀聚积后具有很强的神经毒性作用，其在人体内发生错误折叠，以沉淀的形式聚集在神经细胞表面，被认为是导致阿尔茨海默氏病的一个重要原因（A.Kajava,FASEB J.,2010,24,1311.）。因此，基于Aβ蛋白的结构特征，设计并实现对其的特异性结合，干扰该蛋白的聚集过程，对减缓AD的发展，或治疗AD病有着积极的意义（E.Gazit,Curr.Med.Chem.,2002,9,1725.）。但是，由于Aβ蛋白的难结晶性，无法获得高分辨率的结构解析，使相关的药物结构预测与发现还存在诸多困难（D.Lynn,J.Struct.Biol.,2000,130,153）。当前，对Aβ蛋白分子的聚集过程起抑制或促进调节作用的药物分子，按种类可分为非特异性渗透压调节分子，及对淀粉样蛋白具有特异性识别作用的有机小分子与多肽分子（C.Wang,Nanoscale,2012,4,1895.）。

有机小分子类先导化合物的设计思路是以已报道的具有调节多肽聚集动力学能力的分子（如刚果红等）或对多肽分子具有强亲和性的分子（如硫磺素T及其衍生物等）作为母核，开展合成化学和组合化学对药物分子进行筛选（C.Stains,ChemMedChem,2007,2,1674）。

多肽类先导化合物的设计思路是筛选具有调节靶标蛋白聚集动力学过程的多肽片段，如阻止Aβ聚集的KLVFF片段，并结合组合化学改造分子结构等（L.Tjernberg,J.Biol.Chem.,1996,271,8545）。基于多肽分子在合成上与有机小分子相比更易于实现，且多肽分子易于在体内参与代谢过程，是实现有效抑制Aβ的神经毒性，发展可行的药物的有效途径。根据靶蛋白Aβ的序列和结构，设计与Aβ特异性结合的多肽片段，实现从体外实验中对Aβ蛋白的聚集结构和聚集动力学的调控，到体外实验的生理毒性的抑制，到治疗淀粉样蛋白相关疾病的最终目的的一系列多肽分子。

发明内容

本发明的目的在于提供可调节Aβ蛋白聚集动力学，其生理毒性并治疗淀粉样蛋白相关疾病的一系列多肽分子。

在本发明的第一方面，提供了一种序列为SEQ ID NO：1的抑制β淀粉样蛋白（Aβ42）生理毒性的多肽、其同源序列或其具有所述多肽功能的对SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、添加修饰的变体。

本发明的抑制Aβ42生理毒性的多肽，其序列还可以为SEQ ID NO：2-64、66-68，其具体序列如下所示。

编号	氨基酸序列
		2	DDKSGYKVDDQD
3	ADKSGYKVDDQD
		4	DAKSGYKVDDQD
5	DDASGYKVDDQD
		6	DDKAGYKVDDQD
7	DDKSAYKVDDQD
		8	DDKSGAKVDDQD
9	DDKSGYAVDDQD
		10	DDKSGYAVDDQD
11	DDKSGYKADDQD
		12	DDKSGYKVADQD
13	DDKSGYKVDAQD
		14	DDKSGYKVDDAD
15	DDKSGYKVDDQA
		16	GDKSGYKVDDQD
17	DGKSGYKVDDQD
		18	DDGSGYKVDDQD

19	DDKGGYKVDDQD
		20	DDKSGYKVDDQD
21	DDKSGGKVDDQD
		22	DDKSGYGVDDQD
23	DDKSGYGVDDQD
		24	DDKSGYKGDDQD
25	DDKSGYKVGDQD
		26	DDKSGYKVDGQD
27	DDKSGYKVDDGD
		28	DDKSGYKVDDQG
29	DDKSGYKVDDQD
		30	EEKSGYKVEEQE
31	DDHSGYHVDDQD
		32	DDRSGYRVDDQD
33	DDKCGYKVDDQD
		34	DDKGGYKVDDQD
35	DDKQGYKVDDQD
		36	DDKQGYKVDDQD
37	DDKNGYKVDDQD
		38	DDKNGYKVDDQD
39	DDKYGYKVDDQD
		40	DDKTGYKVDDQD

41	DDKSGCKVDDQD
		42	DDKSGGYKVDDQD
43	DDKSGQKVDDQD
		44	DDKSGNKVDDQD
45	DDKSGTKVDDQD
		46	DDKSGYHVDDQD
47	DDKSGYRVDDQD
		48	DDKSGYKFDDQD
49	DDKSGYKADDQD
		50	DDKSGYKLDDQD
51	DDKSGYKMDDQD
		52	DDKSGYKIDDQD
53	DDKSGYKWDDQD
		54	DDKSGYKPDDQD
55	DDKSGYKVEDQD
		56	DDKSGYKVDEQD
57	DDKSGYKVDDQE
		58	DDKSGYKVDDSD
59	DDKSGYKVDDCD
		60	DDKSGYKVDDGD
61	DDKSGYKVDDND
		62	DDKSGYKVDDYD

63	DDKSGYKVDDTD
		64	DDKSGYKVDDQD
66	DDKSGAKVDDQD
		67	GDKSGYKVDDQD
68	EEKSGYKVEEQE

在本发明的第二方面，提供了编码如第一方面所述的多肽的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，提供了包含如第二方面所述的核苷酸序列的重组载体。

在本发明的第四方面，提供了包含如第三方面所述的重组载体的重组细胞。

在本发明的第五方面，提供了如第一方面所述的的多肽，如第二方面所述的核苷酸序列，如第三方面所述的重组载体或如第四方面所述的重组细胞在抑制Aβ42蛋白生理毒性中用途。其中，所述所述抑制Aβ42蛋白生理毒性可以是指调节Aβ42蛋白的聚集过程。

在本发明的第六方面，提供了如第一方面所述的的多肽，如第二方面所述的核苷酸序列，如第三方面所述的重组载体或如第四方面所述的重组细胞在用于诊断和/或治疗与β淀粉样蛋白相关的疾病的药物的制备中的用途。其中，所述疾病可以是阿尔茨海默氏症。

本发明的有益效果：

（1）本发明设计与目标淀粉样蛋白分子结合的多肽序列，实现对Aβ42蛋白毒性的抑制；

（2）本发明所涉及的多肽序列有效地改变淀粉样蛋白的聚集动力学过程，和聚集行为；

（3）本发明设计的多肽序列，对于淀粉样蛋白相关疾病的多肽类先导化合物的发现和预测，提供药物母核的设计模型；

（4）本发明设计的靶向Aβ蛋白的多肽还可以被应用于通过酶联免疫吸附方法，表面等离激元共振技术，石英晶体微天平技术，等温滴定微量热技术等检测Aβ蛋白。

（5）本发明设计的靶向Aβ蛋白的多肽可以经过量子点修饰，荧光素基团修饰，辣根过氧化物酶修饰可以用于酶联免疫吸附，荧光发射光谱，紫外吸收光谱等分析方法中检测Aβ蛋白分子。

附图说明

图1：Aβ42分子单体会在溶液中向聚集体形式转变。而A3分子可以与Aβ42结合，从而抑制Aβ42的聚集。

图2：Aβ42与加入A3的Aβ42的ThT聚集曲线。绿色曲线为Aβ42。紫色曲线为加入A3之后的Aβ42溶液。

图3：(a)Aβ42聚集体形貌的透射电子显微镜（TEM）图像。(b)A3分子聚集体形貌的TEM图像。(c)A3分子与Aβ42分子混合体系的聚集体形貌的TEM图像。(d)Aβ42聚集体形貌的原子力显微镜（AFM）图像。(e)A3聚集体的AFM形貌图像。(f)A3分子与Aβ42混合体系的AFM形貌图像。

图4：(a)Aβ42对SY5Y细胞活力的影响。(b)A3多肽分子对SY5Y细胞活力的影响。(c)A3浓度梯度对40μM的Aβ42细胞毒性的影响。（d）A17、A25与A39浓度梯度对40μM的Aβ42细胞毒性的影响。（e）A17、A25与A39多肽分子对SY5Y细胞活力的影响。

图5：(a)正常的秀丽隐杆线虫与发生运动障碍的线虫示意图。(b)秀丽隐杆线虫随时间保持正常运动能力的比例。紫色曲线为秀丽隐杆线虫系CL4176。绿色曲线为秀丽隐杆线虫系CL802，作为CL4176的对照组。红色曲线为喂食A3多肽的秀丽隐杆线虫系CL4176。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

实施例1评估多肽分子A3分子对β淀粉样蛋白生理毒性的调控作用

1、所使用物质的化学结构

β淀粉样蛋白(Aβ42)：

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA（SEQ IDNO：65）

A3：DDKSGYKVDDQD（SEQ ID NO：1）

本研究中针对多肽分子A3，评估其对β淀粉样蛋白生理毒性的调控作用，发现：如图1所示，Aβ42会在溶液中自发地由单体向具有生理毒性的聚集体转变。而A3多肽分子会与Aβ42分子结合，从而抑制Aβ42的聚集。

2、测定方法

2.1硫磺素T染色检测设计多肽对Aβ42聚集能力的调节作用

配制1×PBS溶液：称取0.4g NaCl，0.01g KCl，182mg Na₂HPO₄·12H₂O，12mg KH₂PO₄，0.01g NaN₃，使用50ml二次水溶解，用0.22μm水相滤膜过滤，待用。

配制ThT储液：称取15.9mg的ThT，14.36g Na₂HPO₄·12H₂O，1.36g KH₂PO₄，量取100mL二次水使溶解，超声5分钟使充分溶解。

配制10μM的ThT测试液：称取2mL ThT储液，718mg Na₂HPO₄·12H₂O，68mg KH₂PO₄，使用二次水定溶至100mL。用0.22μm水相滤膜过滤，待用。

Aβ42分散方法：现将Aβ42粉末1mg，在玻璃瓶中，溶于1mL六氟异丙醇中。超声5分钟，待充分溶解后，将玻璃瓶放在摇床上，120转每分钟，摇12小时。将Aβ42的六氟异丙醇溶液按每瓶100μL浓度为1mg/mL分装在玻璃瓶中。用氮气将六氟异丙醇溶剂吹干，将含有Aβ42的玻璃瓶至于冷冻干燥机中抽真空冻干45分钟。此时每瓶中含有0.1mg已分散的Aβ42。

多肽分散方法：多肽分子在1×PBS中配成2400μM的1×PBS储液待用。

Aβ42-多肽混合溶液配制方法：向含有已分散的0.1mg Aβ42的玻璃瓶中加入2μL DMSO，超声5分钟，使Aβ42溶解完全。向每瓶分子中加入设计的A3多肽分子的1×PBS溶液，以1×PBS定容。最终使溶液中的Aβ42和多肽多肽分子的浓度均为30μM。向每瓶中各加一颗直径为400–600μm的玻璃球(SigmaAldrich)。将玻璃瓶置于37℃恒温摇床中在120rpm孵育110h。以1PBS溶液作为阴性对照。

从样品配制完成的时刻开始计时，每隔3小时，从测试溶液中取出20μL样品溶液，与180μL的10μM的ThT测试液混合，加到Corning黑色低吸附量96孔细胞培养板中。在连续光谱多功能酶标仪(Tecan infinite M200)中，以450nm作为激发波长，收集482nm的发射光信号，增益值为100。

ThT染色实验反映了多肽的组装结构随时间的变化。如图2所示，Aβ42分子在溶液中自发地由无规卷曲结构向β片层转变，在第50小时转变完全。向Aβ42分子中加入A3后，其ThT荧光增强强度增强，且使Aβ42分子提前转变成稳定聚集体，即A3可以加速Aβ42蛋白向β折叠的转变动力学过程。

2.2TEM检测A3多肽对Aβ42聚集过程的影响

Aβ42分散方法：同2.1所述。

多肽分子处理方法：多肽使用纯水溶解，配成2400μM储液。

Aβ42-设计多肽分子混合溶液配制方法：向含有已分散的0.1mg的Aβ42分子的玻璃瓶中加入2μL DMSO，超声5分钟，使Aβ42分子溶解完全。分别加入多肽分子的三次水溶液。最终使溶液中的Aβ42分子和设计的多肽分子浓度均为30μM。向每瓶中各加一颗直径为400–600μm的玻璃球(Sigma Aldrich)。将玻璃瓶置于37℃恒温摇床中在120rpm下孵育110h。

110小时老化之后，从测试液中取50μL样品溶液，滴在超薄镀碳铜网表面，静置20分钟，将剩余液体吸走。在沉积样品的铜网表面滴20μL的1mg/mL磷钨酸铵水溶液，沉积10分钟，将剩余液体吸走。用三次水清洗铜网三次。在干燥器中干燥过夜。

利用200kV六硼化镧透射电子显微镜(Tecnai G220S-TWIN)成像。图3a所示，Aβ42分子会自组装成为纤维状结构。图3b所示，A3在溶液中为无规膜状或结构。图3c所示，A3能抑制Aβ42分子的纤维化趋势，形成无规膜状结构。即A3多肽分子通过抑制Aβ42分子的纤维化趋势，达到调控其生理毒性的功能。

2.3原子力显微技术检测设计多肽对Aβ42聚集形貌的影响

Aβ42分散方法：同2.1所述。

多肽分子处理方法：同2.2所述。

Aβ42-设计多肽分子混合溶液配制方法：同2.2所述。

110小时老化之后，从测试液中取10μL样品溶液，滴在新解理的云母表面，静置10分钟，再用高纯氮气吹干。

利用扫描探针显微镜(Dimension3100，Veeco公司，美国)，原子力探针轻敲模式，对测试样品在云母表面的形貌进行成像。图3d所示，Aβ42分子会自组装成为纤维状结构。图3e所示，A3能在云母表面中形成颗粒状结构。图3f所示，A3能抑制Aβ42分子的纤维状组装行为。即A3多肽分子通过抑制Aβ42分子的纤维化趋势，达到调控其生理毒性的功能。

2.4A3多肽对Aβ42细胞毒性的影响

Aβ42分散方法：同2.1所述。DMSO含量0.2%，配成600μM储液。

多肽分子处理方法：同2.2所述。

以神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系作为研究模型。在Corning96孔板中，每孔培养1万个细胞，使用RPMI-1640培养基(含10%北美小牛血清，1%链青霉素)。在种入细胞后24小时，向培养板中加入Aβ42分子孵育。在孵育后的第48小时，向培养板中每孔加入10μL的5mg/mL噻唑蓝(MTT)生理盐水溶液。在37摄氏度反应4小时。将培养板中溶液吸走，每孔用100μL的DMSO溶解MTT产生的甲瓒沉淀。在连续光谱多功能酶标仪(Tecan infinite M200)中，测定其在490nm处的吸光度值。如图4a所示，当Aβ42分子浓度为40μM时，细胞的活力为63%。当Aβ42分子浓度为80μM时，细胞的活力为55%，但此时Aβ42分子由于浓度过高而无法充分溶解。故选择Aβ42分子浓度为40μM评价设计的多肽分子毒性。

以神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系作为研究模型。在Corning96孔板中，每孔培养1万个细胞，使用RPMI-1640培养基(含10%北美小牛血清，1%链青霉素)。在种入细胞后24小时，向培养板中加入设计的多肽分子孵育。在孵育后的第48小时，向培养板中每孔加入10μL的5mg/mL噻唑蓝(MTT)生理盐水溶液。在37摄氏度反应4小时。将培养板中溶液吸走，每孔用100μL DMSO溶解MTT产生的甲瓒沉淀。在连续光谱多功能酶标仪(Tecan infinite M200)中，测定其在490nm处的吸光度值。如图4b所示，A3多肽分子无显著的细胞毒性。

以神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系作为研究模型。在Corning96孔板中，每孔培养1万个细胞，使用RPMI-1640培养基(含10%北美小牛血清，1%链青霉素)。在种入细胞后24小时，向培养板中加入Aβ42分子及设计多肽分子孵育。在孵育后的第24小时，向培养板中每孔加入10μL的5mg/mL噻唑蓝(MTT)生理盐水溶液。在37摄氏度反应4小时。将培养板中溶液吸走，每孔用100μLDMSO溶解MTT产生的甲瓒沉淀。在连续光谱多功能酶标仪(Tecan infinite M200)中，测定其在490nm处的吸光度值。

如图4c所示，向同40μM的Aβ42分子共孵育的SH-SY5Y细胞中加入0–180μM的A3多肽分子后，细胞的活力随加入的A3含量的增加而增加。当A3多肽分子浓度为10μM至60μM时，细胞的活力均大于90%，即A3多肽分子可以有效抑制Aβ42的细胞毒性。

在此基础上，我们还考察了A3多肽分子同源序列（A17：DDKSGAKVDDQD（SEQ ID NO：66）、A25：GDKSGYKVDDQD（SEQ ID NO：67）、A39：EEKSGYKVEEQE（SEQ ID NO：68））对细胞活力的影响。如图4d所示，向与40μM的Aβ42分子共孵育的SH-SY5Y细胞中分别加入0–180μM的A17、A25与A39多肽后，得到细胞活力与多肽浓度的关系。与A3相比，A17与A25使细胞活力增加的程度略低，多肽浓度为10～20μM时，细胞活力增长至88～90%；加入A39多肽对细胞活力的调节作用不明显。作为对照，还考察了多肽分子在0-180μM浓度范围内对细胞活力的影响。如图4e所示，A17与A25在此大浓度范围内对细胞活力没有明显影响，基本维持在94～98%之间；而A39对细胞活力有一定影响：0～60μM，细胞活力不低于86%；多肽浓度达到180μM时，细胞活力只有78%，说明这条多肽自身对SHSY-5Y细胞有毒性，因此这条多肽在高浓度时不适合在细胞系统中作为Aβ42聚集调节剂。

2.5转基因秀丽隐杆线虫评估设计多肽A3对Aβ42生理毒性的影响

转基因秀丽隐杆线虫系CL4176为通过转基因构建的过表达APP的线虫。秀丽隐杆线虫系CL802是转空质粒线虫，作为CL4176空白对照。一个直径5cm板子上种50条线虫，每次统计100条线虫行为。将多肽与大肠杆菌混合作为线虫食物，A3的大肠杆菌溶液浓度为500μM。每个板子加200μL。线虫在喂食设计的多肽24小时之后统计行为。统计出现运动障碍的虫子个数。

如图5a所示，细胞中积累过量的Aβ42的线虫将表现出不同于不产生Aβ42线虫的行动障碍。如图5b所示，CL802在观察期间始终不表现出运动障碍。而CL4176在温度上调后出现运动障碍的线虫数量逐渐增多。在给CL4176喂食A3多肽后，线虫出现瘫痪行为的趋势会在一定程度上得到延缓。以上结果说明，A3多肽分子可在动物模型体系---线虫中缓解Aβ42生理毒性。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用材料和步骤的等效替换以及辅助材料和步骤的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种序列为SEQ ID NO：1的抑制β淀粉样蛋白（Aβ42）生理毒性的多肽、其同源序列或其具有所述多肽功能的对SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、添加修饰的变体。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，其序列为SEQ ID NO：2-64、66-68。

3.编码如权利要求1或2所述的多肽的核苷酸序列。

4.包含如权利要求3所述的核苷酸序列的重组载体。

5.含有如权利要求4所述的重组载体的重组细胞。

6.如权利要求1或2所述的多肽，如权利要求3所述的核苷酸序列、如权利要求4所述的重组载体或如权利要求5所述的重组细胞在抑制Aβ42蛋白生理毒性中用途。

7.如权利要求6所述的用途，其中所述抑制Aβ42蛋白生理毒性是指调节Aβ42蛋白的聚集过程。

8.如权利要求1或2所述的多肽，如权利要求3所述的核苷酸序列、如权利要求4所述的重组载体或如权利要求5所述的重组细胞在用于诊断和/或治疗与β淀粉样蛋白相关的疾病的药物的制备中的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其中所述疾病是阿尔茨海默氏症。