CN108472344A

CN108472344A - 用于针对人患者中的自身抗原的疫苗接种方法

Info

Publication number: CN108472344A
Application number: CN201680064233.5A
Authority: CN
Inventors: G.加拉博瓦; S.施米德胡伯; A.施尼伯杰; A.冯博尼; D.温特; J.齐默曼
Original assignee: Affiris AG
Current assignee: AC Immune SA
Priority date: 2015-11-03
Filing date: 2016-11-02
Publication date: 2018-08-31
Also published as: AU2016348610B2; WO2017076873A1; CA3003943A1; US20190091306A1; RU2734924C2; KR20180079406A; RU2018120009A; RU2018120009A3; JP7378931B2; AU2016348610A1; JP2018532782A; BR112018008697A2; JP2023175708A; EP3370761A1

Abstract

公开了用于针对人患者中的自身抗原接种疫苗的方法，其中将具有有效量的自身抗原的剂量施用于患者以引发初次免疫应答，所述方法的特征在于对所述患者进行所述自身抗原的加强施用，其中用于加强施用的剂量中的自身抗原的量高于在用于初次免疫应答的施用中使用的剂量中自身抗原的量。

Description

用于针对人患者中的自身抗原的疫苗接种方法

本发明涉及针对人患者中的自身抗原的疫苗接种方法以及适用于此类疫苗接种的一组疫苗配制剂。

使用自身蛋白抗原的主动免疫包括产生涉及T细胞和B细胞两者的免疫应答，其导致通过特定结构(生发中心，GC)诱导高度有效的B细胞分化途径，其中抗原特异性B细胞增殖并分化成抗体分泌性浆细胞和记忆B细胞。鉴于自身免疫是解决自身蛋白的疫苗的主要副作用的实情(例如Gilman et al.,Neurology 64(2005),1553-1562)，潜在成功的疫苗必须满足一系列标准。

首先，其抗原性组分必须不活化T细胞，而是充当B细胞抗原。因此，Ag需要由抗原呈递细胞在其MHC分子上呈递。与它们结合需要肽Ag(i)具有一定长度(在I类MHC的情况下为8-9aa(氨基酸残基))和(ii)在所谓的锚定位置中表现出限定的氨基酸残基(Rudolph,Ann.Rev.Immunol.24(2006),419-466)。通常，抗原表位必须足够短以防止T细胞活化，但足够长以充当抗体表位。然而，IgG型抗体应答的产生也依赖于T辅助(TH)细胞，因此疫苗必须含有能够活化T辅助(TH)细胞的表位。这些不得与感兴趣的Ag相关，因为这可以导致细胞自身免疫。理想情况下，它们必须是强TH表位，并且已知不能活化与人中发现的分子/结构起交叉反应的抗体。在这方面，不同的蛋白质载体已经在临床前和临床上显示为T细胞辅助的有力活化剂。钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Haemocyanin，KLH)充分描述为“对于人免疫系统外来的”蛋白质，当与特定的抗原性表位，例如抗原性肽序列物理连接时产生强大的抗体应答。

修改靶向自体蛋白的疫苗的抗体应答是真正的挑战。它需要在不攻击相关结构的情况下解决期望的结构。这要求一次满足两个标准。一，制备的抗体需要结合限定的靶物，这对疫苗的意图活性至关重要。二，它们然而必须不结合相关或同源结构，这是必需的安全性特征。

帕金森氏病(Parkinson’s disease，PD)是第二常见的神经变性性病症。它是一种复杂的系统性疾病，引发一大批令人虚弱的运动和非运动症状。通常，PD的呈现迹象是不确定的、非运动症状，包括：神经精神病症(例如抑郁、REM睡眠障碍)、胃肠病症(如便秘)和自主神经病症。PD的主要运动症状包括休息性震颤、运动徐缓、强直和姿势不稳定可以在其非运动组分发作后开始达十年。PD目前影响全球约500万人，并且随着全球人口老龄化，其流行性正在上升。

尽管投入相当大，但目前未获得具有疾病缓解(disease modifying)特性的试剂。PD治疗主要通过使用多巴胺能药策略(左旋多巴或多巴胺激动剂、COMT和MAO-B抑制剂)、抗胆碱能药物、或深部脑刺激(其仅具有症状益处并且充满副作用)来解决运动症状。已经进行或目前正在进行用潜在的疾病缓解剂的超过20项临床试验；然而，它们都没有达到其临床端点(AlDakheel et al.,Neurotherapeutics 11,(2014)6-23)。因此，迫切需要开发新的改变疾病的治疗策略。

越来越多的证据指向α-突触核蛋白(aSyn)寡聚体在导致PD中神经变性的过程中的因果作用。路易(Lewy)体或路易神经突是PD的组织病理学标签(signature)标志物；它们主要出现在神经元中，并且主要由错误折叠的纤维状aSyn构成。在生理条件下，aSyn呈现为核和突触前末梢中富集的胞质、胞内、未折叠的蛋白质；已经提出aSyn可以在生理上与突触可塑性有关。在PD中，aSyn的病理性聚集形式(可能包括aSyn的寡聚体)似乎通过以朊病毒线(prion-line)方式从细胞扩散到细胞而传播路易体病理以及疾病。此外，动物模型中的几条证据支持减少寡聚aSyn的积聚可以具有疾病缓解效应的理论(Games et al.,Am.J.Pathol.182(2013),940；Kim et al.,J.Neurochem.107(2008),303；Recasens etal.,Ann.Neurol.75(2014),351；以及Winner et al.,J.Neurosci.32(2012),16906)。因此，承认减少aSyn聚集体的治疗具有阻碍疾病进展的潜力(Lee et al.,Neurosci.Res.70(2011),339；Valera et al.,Pharmacol.Ther.138(2013),311)。在过去十年中，开发用于清除aSyn聚集体的免疫治疗方法取得了重大进展。已经显示针对aSyn的免疫策略在动物模型中促进aSyn聚集体的降解(Masliah et al.,Neuron.46(2005),857)，阻止细胞与细胞的传播(Bae et al.,J.Neurosci.32(2012),13454；Benner et al.,PNAS 101(2004),9435；Games et al.,J.Neurosci.34(2014),9441)，并减少行为缺陷(Masliah et al.,PLoSOne.6(2011),e19338)。综合起来，这些研究提供了针对aSyn的免疫接种在人中可以具有疾病改变特性的证据。

开发用于治疗突触核蛋白病(synucleinopathies)如PD的PD01A(参见：AFFiRiS新闻稿，报道PD01A的第一临床数据；http://www.affiris.com/news/first-clinical-data-of-therapeutic-parkinsons-disease-vaccine-encourage-s-continued-development/)。PD01A是肽-KLH缀合物，其中肽部分模拟人aSyn的c-端区域(WO2009/103105A2)。它靶向aSyn，而避免密切相关的蛋白质家族成员，包括可能具有神经保护特性的β-突触核蛋白(bSyn)(Vigneswara et al.,PLoS One 8(2013),e61442)。越来越多的证据指向α-突触核蛋白(aSyn)寡聚体在导致PD中神经变性过程中的因果作用。路易体或路易神经突是PD的组织病理学标签标志物；它们主要出现在神经元中，并且主要由错误折叠的纤维状aSyn构成。此外，动物模型中的几条证据支持减少寡聚体aSyn的积累可以具有疾病缓解作用的理论。因此，减少aSyn聚集体的治疗可以具有阻碍疾病进展的潜力。

最近显示了用PD01A的疫苗接种导致突触核蛋白病，涵盖PD和MSA(多系统萎缩)的两个小鼠模型中减少的aSyn寡聚体积累和改善的记忆和运动缺陷(Mandler et al.,ActaNeuropathol.127(2014),861；Mandler et al.,Molecular Neurodegeneration 10(2015),10)。尽管有重大的临床投入，但目前未获得在人中具有疾病缓解特性的治疗活性剂。PD的治疗主要通过使用多巴胺能药策略、抗胆碱能药物或深部脑刺激(其仅具有症状益处并且充满副作用)来解决运动症状。已经进行或目前正在进行用潜在的疾病缓解剂的超过20项临床试验；然而，它们都没有达到其临床端点。因此，迫切需要开发新的改变疾病的治疗策略。

本发明的一个目的提供了基于用自身抗原免疫的更有效的、改变疾病的治疗策略。

因此，本发明提供了用于针对人患者中的自身抗原接种疫苗的方法，其中将一定剂量的有效量的自身抗原施用于患者以引发初次免疫应答，所述方法的特征在于对患者进行所述自身抗原的加强施用，其中用于加强施用的剂量中的自身抗原的量高于用于初次免疫应答的施用中使用的剂量中的自身抗原的量(即高于用于引发免疫应答的剂量中的自身抗原的量)。

在本发明的过程内，申请人已经获得了临床数据，显示了在针对自身抗原对患者接种疫苗的过程中，加强施用在获得有效的免疫学和治疗效果方面发挥中心作用。还证明了用常见(非自身抗原，如病原体抗原)获得的数据与针对自身抗原的疫苗接种策略没有可比性或一致性。用本申请获得的结果显示了，在用相对少量的抗原引发初次免疫(即获得初次免疫应答)并且用比在用于初次免疫应答的施用中高的自身抗原量引发加强免疫时是有利的。

尽管在AFF008试验过程中获得了有希望的初步结果(参见上文的新闻稿)，但令人惊讶的是根据本发明的加强剂疫苗接种方案的具体选择显著触发应用的各种剂量方案的总体表现的临床结果。具体而言，从长期来看，疫苗在加强阶段(相对于引发阶段)中的剂量对于疫苗的特异性抗体应答和特异性反应性是极为重要的。这是特别令人惊讶的，因为当用于加强施用的剂量中的自身抗原的量高于在用于初次免疫应答的施用中使用的剂量中的自身抗原的量时，获得了有利的结果。这既不能从提示针对此类抗原的疫苗接种的现有技术(例如WO 2009/103105A2,WO 2011/009152A1,WO 2014/033158A2等)中得出，也不能从关于应用此类疫苗的小鼠模型的科学报告(Mandler et al.,Mol.Neurodeg.10(2015):10；Mandler et al.,Acta Neuropathol.127(2014):861-879)中得出。这从现有技术中甚至更加不可预测，因为认为如先前报道的引发剂量和加强剂量的效果是对特定的疫苗和特定剂量或甚至对特定个体是特异性的(例如Shete et al.,J.Aids & Clin.Res.5(2014),DOI:10.4172/2155-6113.1000293；Morera et al.,Vaccine 30(2012):368-377；Gonzales etal.,Hum.Vaccines 3(2007):8-13)，但不对根据本发明的自身抗原疫苗类型，尤其是对如本文中具体公开并且在本发明实施例部分中显示的自身抗原，即淀粉样蛋白-β、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin型9(PSCK9)、IgE类型的膜结合免疫球蛋白、亨廷顿蛋白、CD26或α突触核蛋白是特异性的(参见下文)。对于本发明至关重要的是，用于初次免疫应答的每次施用的剂量是低的，即低于在加强施用中，从而可以在疫苗接种的此初次阶段中选择最具特异性的B细胞。此类策略防止引发不太特异性的B细胞和抗原受体。另一方面，就解决尽可能多的B细胞(在初次免疫应答的情况下创建)的抗原量而言，应当以高剂量(即比初次免疫应答中更高)进行加强施用，无论其目前位置在何处(骨髓、淋巴结、脾等)。因此，根据本发明使用的较高量实现加强，其能够建立(基于用初次免疫应答引发的最特异性的B细胞)针对自身抗原的有效免疫以及最终建立通过本疫苗接种方法对此自身抗原的有效控制。在此背景中，也重要的是注意，初次免疫应答的引发可以通过将初始剂量的自身抗原一次或多次施用于要接种疫苗的个体来实现。优选地，用两种，更优选三种，特别是四次自身抗原施用引发初始免疫应答。这些用于初次免疫应答的施用优选在至少两周，更优选至少三周，尤其是至少四周的时间间隔内施用。许多疫苗接种方案应用两周或每月疫苗接种间隔，因此其是特别优选的。加强施用也是如此；如已经叙述，实现本发明目的(即就自身抗原而言引发总体有效免疫应答)的基本要素是每次施用的剂量，不是施用的所有剂量的(总)量。

对于本发明，这已经在临床试验中具体显示，该临床试验关注借助于aSyn模拟表位靶向作为自身抗原的α突触核蛋白(“aSyn”)的针对PD的疫苗接种策略，以调节aSyn聚集体，即PD情况下的病理性蛋白聚集体的脑水平。

本发明的申请人最近完成了人首例(first-in-humans)阶段I期临床试验，其评估对早期PD患者施用的两种剂量(15μg和75μg)治疗性疫苗PD01A的安全性和耐受性。所有不利事件在严重性上均为轻度或中等，并且认为治疗是耐受良好的。证明了抗原(PD01A)施用(每月施用4次)引起滤泡外应答，其导致(低)IgG抗体的出现，所述IgG抗体与(i)PD01A(疫苗的肽组分)以及(ii)靶定的aSyn肽序列起反应(图1)。随着B细胞在生发中心中增殖并分化成浆细胞，IgG抗体滴度增加至峰值，在第三次免疫后4周(V8)达到。

为了更好地理解通过免疫诱导功能性抗体，例如aSyn特异性抗体、引发免疫时间点时的剂量与所得抗体应答之间的关系、以及针对自身抗原(例如，aSyn)的引发免疫应答(PD01A诱导的应答)可以在人中以何种程度“再活化”，AFF008研究的PD01A治疗患者在第二项临床试验中进行分析。为此，在115周(平均)后用一剂15μg或75μg PD01A加强经PD01A免疫的PD患者。在AFF08A试验中，对抗原PD01A的“加强剂”暴露在活化免疫记忆并导致针对PD01A和靶向的aSyn肽序列的抗体滴度迅速增加(见图1)，证明了真正的二次免疫应答。一般而言，短寿命的浆细胞在几周内维持峰值抗体水平-此后血清抗体滴度最初以与初始免疫后相同的快速动力学下降。已经达到骨髓中存活生态位(niche)的长寿命的浆细胞继续产生抗原特异性抗体，然后以较慢的动力学下降。

许多决定簇调节疫苗诱导的GC的强度以及因此峰抗体应答的强度。主要决定簇是疫苗抗原的性质及其内在的免疫原性。

初次疫苗抗体应答的另一个重要因素是使用最佳剂量的疫苗抗原，其可以通过实验确定。通常，较高剂量的抗原(达到某个阈值)引发较高的初次抗体应答。在阈值剂量上，可以看到钟形或平台类型的应答。当免疫能力受限时，这可以是特别有用的。

限制剂量的疫苗可以限制初次免疫应答，但增加B细胞对滤泡树突状细胞相关抗原的竞争，从而导致对较高亲和力GC-B细胞的较严格选择以及较强的二次“加强”应答。因此，在人中，在“引发”阶段时以及再次在“加强”阶段中仅抗原剂量的特定组合，例如最佳抗原性给药窗将提供足以能够调节病理性蛋白质聚集体，PD的情况下aSyn聚集体的表达的抗体应答。

如上文已经叙述，根据本发明的疫苗作为解决自身抗原(“自身蛋白”)的合适疫苗满足相关标准，所述合适疫苗针对对于接种疫苗的个体而言“自身”的抗原，但是在施用时不必导致作为副作用的自身免疫。因此，自身抗原的抗原性组分不必活化T细胞，而是充当B细胞抗原。因此，抗原需要由抗原呈递细胞在其MHC分子上呈递。Rudolph,Ann.Rev.Immunol.24(2006),419-466报道的必要性也适用。通常，抗原性表位必须足够短以防止T细胞活化，但足够长以充当抗体表位。此外，IgG型抗体应答的产生也依赖于T辅助(TH)细胞，因此疫苗必须含有能够活化T辅助(Th)细胞的表位(与感兴趣的抗原无关)(以防止细胞自身免疫))。理想地，根据本发明的疫苗是强Th表位并且已知不能活化与人中发现的其他分子/结构交叉反应的抗体。因此，(蛋白质)载体，如钥孔血蓝蛋白(KLH)，已经显示在临床前以及临床上是T细胞辅助的有力活化剂。例如，KLH充分描述为“对于人免疫系统外来的”蛋白质，当与特定的抗原性表位，例如抗原性肽序列物理连接时产生强大的抗体应答。本疫苗的免疫应答需要在不攻击相关结构的情况下解决期望的结构。因此，在接种疫苗的个体中产生的抗体需要结合限定的靶物(自身抗原)，这对疫苗的意图活性至关重要；此外，这些疫苗引发的抗体不得与相关或同源结构结合(作为基本安全特征)。

优选地，根据本发明的自身抗原是已经报道或提出作为本领域中科学合理的候选疫苗物或疫苗接种靶物的那些抗原。

因此，根据本发明的方法原则上适用于所有类型的自身抗原疫苗接种策略；然而，优选将本方法应用于已知在获得有效免疫应答方面存在问题的自身抗原。因此，根据本发明优选的自身抗原选自下组：淀粉样蛋白-β、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PSCK9)、IgE型膜结合免疫球蛋白、亨廷顿蛋白、CD26和α突触核蛋白抗原，优选α突触核蛋白抗原，尤其是含有表位DMPVDPDN和/或KNEEGAP的α突触核蛋白抗原。

已经显示了如果应用与天然序列相比至少具有相同(优选改善的)免疫特征的自身抗原的天然序列的变异，则可以进一步改善通过疫苗接种的免疫。因此，显然对于本发明，天然自身抗原氨基酸序列的此类变异将包括在根据本发明的术语“自身抗原”内，只要就引发特异性(天然)自身抗原结合抗体而言的免疫特征(至少)得以保留(或优选改善)。此类变异可以通过技术(例如公开于Schneeberger et al.Human Vacc.6(2010),1-5)来提供。由技术提供的这些变异称为并且披露于例如WO2004/062556 A和WO2006/005707 A(对于淀粉样蛋白β)、WO2009/103105 A和WO2011/020133 A(对于aSyn)、WO2011/009152 A(对于AngII)、WO2013/174920 A(对于C5a)、WO2014/033158 A和WO2015/128287 A(对于PCSK9)中。这些文献中公开的也是根据本发明的优选的自身抗原。

因此，在本发明中优选使用自身抗原的天然序列的变异作为自身抗原，即(其也可以称为“模拟表位”，其是含有与自身抗原的原始天然序列相比含有序列变异的序列，但是该模拟表位表现出相似(相同或改进)的免疫特征，即能够引发与用天然序列获得的免疫应答相似或更高的免疫应答；因此，模拟表位与天然自身抗原一样被相同的单抗或多克隆抗体(pAb)识别，但引起更强的免疫应答或与严重不良反应如神经炎症不相关的免疫应答)。因此，优选在根据本发明的疫苗接种中使用α突触核蛋白模拟表位、血管紧张肽II模拟表位或PCSK9模拟表位作为自身抗原，更优选选自下组的α突触核蛋白模拟表位：DQPVLPD,DMPVLPD,DSPVLPD,DSPVWAE,DTPVLAE,DQPVLPDN,DMPVLPDN,DSPVLPDN,DQPVTAEN,DSPVWAEN,DTPVLAEN,HDRPVTPD,DRPVTPD,DVPVLPD,DTPVYPD,DTPVIPD,HDRPVTPDN,DRPVTPDN,DNPVHPEN,DVPVLPDN,DTPVYPDN,DTPVIPDN,DQPVLPDG,DMPVLPDG,DSPVLPDG,DSPVWAEG,DRPVAPEG,DHPVHPDS,DMPVSPDR,DSPVPPDD,DQPVYPDI,DRPVYPDI,DHPVTPDR,EYPVYPES,DTPVLPDS,DMPVTPDT,DAPVTPDT,DSPVVPDN,DLPVTPDR,DSPVHPDT,DAPVRPDS,DMPVWPDG,DAPVYPDG,DRPVQPDR,YDRPVQPDR,DMPVDPEN,DMPVDADN,EMPVDPDN,DNPVHPE,KNDEGAP,ANEEGAP,KAEEGAP,KNAEGAP,RNEEGAP,HNEEGAP,KNEDGAP,KQEEGAP,KSEEGAP,KNDDGAP,RNDEGAP,RNEDGAP,RQEEGAP,RSEEGAP,ANDEGAP,ANEDGAP,HSEEGAP,ASEEGAP,HNEDGAP,HNDEGAP,RNAEGAP,HNAEGAP,KSAEGAP,KSDEGAP,KSEDGAP,RQDEGAP,RQEDGAP,HSAEGAP,RSAEGAP,RSDEGAP,RSEDGAP,HSDEGAP,HSEDGAP,和RQDDGAP；尤其是DQPVLPD,DSPVLPD,DVPVLPD,DSPVLPDG,YDRPVQPDR,DHPVHPDS,DAPVRPDS,KNDEGAP,KQEEGAP,或KSEEGAP；选自下组的血管紧张肽II模拟表位：DPVYIHPF,DAVYIHPF,DRHYIHPF,DAAYIHPF,DRAYAHPF,DPGYIHPF,DRAYDHPF,AAYIHPF,RAYAHPF,和PGYIHPF，尤其是DRAYAHPF,RAYAHPF,DPGYIHPF或PGYIHPF；或选自下组的PCSK9模拟表位：SIPWSLERIT,SIPWSLERITPPR,SIPWSLERTTPPR,VIPWNLERILPPR,SVPWNLERIQPPR,SIPWSLERTT,SIPWSLERLT,SIPWSLERLTPPR,SIPWSLERIQ,SIPWSLERIQPPR,VIPWNLERIL和SVPWNLERIQ，尤其是SIPWSLERIT,VIPWNLERIL或SVPWNLERIQ。

优选使用比用于初次免疫引发的剂量中显著更高的用于加强施用的剂量中的自身抗原量。因此，用于加强施用的剂量中的自身抗原的量与用于初次免疫应答的施用中使用的量相比高至少20％，优选至少50％，更优选至少100％，尤其至少200％。

在绝对量中，优选使用用于加强施用的剂量中的自身抗原量至少20μg，优选至少50μg。在此背景中，重要的是注意，本发明中提到的“μg自身抗原”是指剂量中的抗原肽的量，并且不包括疫苗缀合物的载体或接头部分(如果存在的话)。

对于本发明，重要的是在初次免疫应答已经过去的时间点时施用加强免疫接种，即当用此初次接种疫苗引发的抗体滴度(由初次免疫应答引发过程内的1、2、3、4或更多次疫苗施用引发)已经下降到超出显著水平(例如超出给定的阈值水平或甚至超出适合于测试大量样品的(优选相当不敏感的)测定的检测极限)，或者至少已经去到初次疫苗接种过程中存在的最大抗体水平的30％下，优选20％下，尤其10％下。此类水平在不同的自身抗原疫苗间可以有所不同，但通常在初次疫苗接种后至少6个月后存在。因此，在首次施用自身抗原以引发初次免疫应答后，加强施用可以在优选的实施方案中施用至少6个月，优选至少12个月。也可以有下述策略，其中施用增强剂优选在稍后的时间点进行，例如在初次免疫应答疫苗接种后18个月、2年、3年或5年。

根据本发明的施用途径通常是与目前疫苗接种途径相同的途径。因此，自身抗原的优选施用是皮下、皮内或肌内施用。

根据本发明的优选实施方案，将自身抗原与佐剂，优选氧氢氧化铝一起施用。根据此最优选的实施方案，本发明涉及欧洲药典级(氧氢氧化铝，专论1664)的使用，更具体地涉及针对EP顺从性测试的由Brenntag Biosector(2％铝胶)制造的产品。铝胶以三种品种可用：铝胶1.3％；铝胶2％和铝胶“85”。选择铝胶2％为氢氧化铝凝胶的国际标准制剂。将根据本发明的药物制剂无菌配制到合适的缓冲液中，优选等张磷酸盐缓冲液(1mM至100mM)，优选浓度≥1.0mg/ml铝胶(以Al₂O₃当量给出；此量度(Al为“Al₂O₃当量”)通常用于本发明；因此，本申请中提及的所有剂量和量，只要它们涉及氧氢氧化铝，指Al₂O₃当量(氧氢氧化铝(铝胶))，甚至更优选浓度≥1.5mg/ml的铝胶(以Al₂O₃当量给出)，最优选浓度≥2.0mg/ml铝胶(以Al₂O₃当量给出)。铝胶的铝盐量以Al₂O₃当量给出，与如由制造商叙述的强度一致(即2％铝胶等于2％Al₂O₃，即20mg/mL)。通过使用相应的分子量(20mg/mL Al₂O₃(Mw 101,96)对应于10.6mg/mL铝(分子量26,98))，可以将此浓度直接转化成相应的铝浓度。

根据本发明的优选的自身抗原是包含7至30，优选7至20，更优选7至16，最优选8个氨基酸残基的多肽。将这些肽抗原偶联于药学可接受载体，优选蛋白质载体，特别是KLH(匙孔血蓝蛋白)、Crm-197、破伤风类毒素(TT)或白喉毒素(DT)也是优选的(并且通常是获得免疫应答必需的)。

根据另一个优选的实施方案，在一段时间后，例如在一年、两年、三年、五年或十年后重复加强施用。优选地，第二次或另外的加强以与首次加强施用相同或类似的方式进行，即以与初次疫苗接种的剂量相比增加量的自身抗原。

根据另一方面，本发明还涉及用于针对人患者中的自身抗原的疫苗接种的试剂盒，其包含

-第一疫苗配制剂，其含有有效量的自身抗原以引发针对自身抗原的初次免疫应答，和

-第二疫苗配制剂，其含有有效量的自身抗原以引发针对自身抗原的加强免疫应答，

其中第二疫苗配制剂中的自身抗原的量高于第一疫苗配制剂中的自身抗原的量。

在此试剂盒中，提供了根据本发明的疫苗配制剂(即如本文所公开的)。

本发明还涉及根据本发明的试剂盒在制造用于引发针对人患者中的自身抗原的免疫应答的疫苗中的用途。

本发明还提供了用于针对自身抗原对人患者接种疫苗的疫苗，其中将具有有效量的自身抗原，尤其是自身抗原的模拟表位的剂量施用于患者以引发初次免疫应答，其中对所述患者进行所述自身抗原的加强施用，并且其中所述加强施用的剂量中的所述自身抗原的量高于用于初次免疫应答的施用中使用的剂量中的自身抗原量。

在以下实施例和附图中进一步公开了本发明，但不限于此。

图1A-D显示了在引发后20个月注射aSyn模拟表位PD01A导致免疫增强效应。(C)当用15μg PD01A的每月4次注射进行引发并且用75μg PD01A进行加强时看到最明显的免疫效应。(D)用75μg的加强仍增强抗体应答，高于引发期间达到的水平；图1E-H显示了人血清中的aSyn特异性抗体；图1I-L显示人血清中的KLH特异性抗体。

图2A-D显示了针对AngII的滴度(每两周3次疫苗接种5μg以及在第22周用50μg和第33周用50μg加强)。

图3显示了针对huPCSK9的滴度(长期(每两周3次疫苗接种(两种剂量)和52周随访)；第52周时用30μg再接种疫苗)。

图4显示了AFF008A临床试验的疫苗配制剂。

图5显示了AFF008A临床试验中患者的基线特征。

图6显示了AFF008A临床试验的免疫日程表和随访。

图7显示了根据AFF008A临床试验研究组的AE。

图8显示了根据AFF008A临床试验研究组的具有SOC项的AE。

图9显示了AFF008A临床试验中的PD01特异性抗体滴度。

实施例

实施例1：PD疫苗接种加强

PD01A开发用于治疗突触核蛋白病如PD(WO 2009/103105A2)。PD01A是肽-KLH缀合物，其中肽部分模拟人aSyn的C端区域(具有天然表位DMPVDPDN)。它靶向aSyn，而避免密切相关的蛋白质家族成员，包括可以具有神经保护特性的β-突触核蛋白(bSyn)(Vigneswara et al.,PLoS One 8(2013),e61442)。最近显示了用PD01A的疫苗接种在PD的两种小鼠模型中导致减少的aSyn寡聚体积累和改善的记忆和运动缺陷(Mandler etal.,Acta Neuropathol.127(2014),861；Mandler et al.,MolecularNeurodegeneration10:10(2015))。

参与者：

试验参与者从奥地利维也纳和周边地区招募。为了纳入临床试验，患者必须具有PD的确诊。患有特发性帕金森氏病的个体，其疾病已知少于4年并且以Hoehn&Yahr I/II期(Goetz et al.,Mov.Disord.19(2004),1020；Hoehn et al.,Neurology 17(1967),427)呈现并满足英国帕金森氏病学会脑库标准(Hughes et al.,J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry 55(1992),181)。

多巴胺转运蛋白-单光子发射计算机断层摄影术(DAT-SPECT)检查患者脑和磁共振成像(MRI)扫描的结果必须与PD的诊断一致。所有用常规PD治疗的潜在参与者必须在研究期前接受稳定剂量至少3个月，并且意图在整个试验期期间继续。

所有研究受试者均提供自愿知情同意。试验方案、患者信息、知情同意书和所有其他需要的试验文件已提交给独立的伦理委员会。

材料和方法：

首先将PD01A应用于AFF008中患有早期PD的24名个体，所述AFF008是设计为主要评估疫苗安全性和耐受性以及其次评估免疫学和临床活性(探索性分析)的I期临床试验。为此目的，以4周时间间隔将两种剂量(15μg或75μgPD01A(即与相应量的KLH偶联的15μg或75μg肽C-DMPVDPDN)吸附至1mg铝胶(作为Al₂O₃当量))施用4次。将每剂应用于12名患者。此外，多达8名患者参与未处理的对照组。获得的结果(i)确认疫苗的安全性和耐受性，(ii)证明了疫苗特异性IgG应答的诱导，并且(iii)提供了有利于意图临床活性的证据。给所有32名患者提供随访观察研究(AFF008E)，31名(24名疫苗患者和7名对照)接受研究，并且30名完成研究。低剂量组的一名患者失访。给AFF008E参与者提供低剂量(15μg；通过床边混合自高剂量得出)或高剂量(75μg)配制剂的单次“加强注射”，产生4种不同的治疗组：低剂量(AFF008)-低剂量(AFF08A)；低剂量-高剂量；高剂量-低剂量和高剂量-高剂量。未治疗对照组的患者。共有28名(22/6)接受AFF008A研究，并且所有28名完成AFF008A研究。

由主要研究者对s.c.注射应用注射。所有施用都在试验场地进行。将治疗组中的患者随机化以接受15μg或75μgPD01A。这两种配制剂都含有0.5mg铝当量。

依照良好临床实践(GCP)、赫尔辛基宣言修订版(2013)和当地法律法规要求(奥地利药物法)和适用的国际规定进行试验。试验注册于经批准的临床试验库(www.clinicaltrials.gov，标识符：NCT01568099,NCT02216188)。

图1A-L中显示了结果。图1A-D显示在引发后20个月注射aSyn模拟表位PD01A导致免疫增强效应。(C)当用15μg PD01A的每月4次注射进行引发并且用75μg PD01A进行加强时看到最明显的免疫效应。(D)用75μg的加强仍增强抗体应答，高于引发期间达到的水平。

图1E-H显示了aSyn表位应答；图I-L显示了KLH应答。所有图1A-L显示来自人血清的抗体滴度。

图1E-H和图1I-L类似于图1A-D构建。虚线红线代表组平均值。图的标题表示疫苗剂量：引发剂量(AFF008)/加强剂量(AFF008A)。组大小：n＝4(15μg/15μg)，对于所有其他组，n＝6。图上涵盖的时间段：3.5年。早期帕金森氏病患者(由Hoehn和Yahr I/II期定义)以28天的时间间隔以15或75μg的剂量进行了4次引发免疫。通过ELISA定量针对免疫肽(PD01)、针对靶定的α-突触核蛋白表位(aa110-130；配制为BSA缀合物)和针对KLH的抗体。引发剂量主要就抗体应答的寿命而言是有帮助的：低剂量触发的抗体应答持续时间长于高剂量，这两种应答的量级是相当的。类似地，加强的结果由剂量决定：低剂量实现了抗体应答再活化到引发应答水平。比较而言，与在引发阶段期间获得的应答相比，高剂量将抗体应答增强高达十倍。形成本发明基础的最佳应答见于用于引发和加强的低剂量高剂量组合。

实施例2：AngII疫苗接种加强

疫苗

通过异双功能接头GMBS(4-马来酰亚胺基丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)将肽DRAYAHPF、RAYAHPF、DPGYIHPF和PGYIHPF缀合至KLH(匙孔血蓝蛋白)或CRM197(交叉反应性物质197)。用氢氧化铝悬浮指示量的偶联肽(1、5、30、150μg)(氢氧化铝的终浓度为0.2％)。作为缓冲液，使用PBS或甘露醇/磷酸盐。

动物实验

将雌性BALB/c小鼠保持在12小时光照/黑暗周期下，并随意获得食物和水。实验开始时的小鼠龄为8至10周左右。

皮下免疫每组10只Balb/c小鼠。最初以2周的间隔给小鼠三次注射总共1ml体积(对左侧和右侧肩部区域的2x 500μl)。第三次注射后，定期抽血几次。本文呈现的数据来自第三次注射后约8个月时采集的血浆(标记为P3i)。第三次注射后约8.5个月，每组中剩余小鼠的半数用与前三次免疫相同量的抗原加强或用更高/更低量免疫，见下述方案。在第四次疫苗接种后6周采集最终血浆(表示为P4b)。

一般设置：

*由于实验的持续时间，一些小鼠在实验结束前已经死亡。因此，对于某些组显示了来自较少小鼠的数据。

对于AngII肽实验，根据下表对10只Balb/c小鼠皮下注射：

肽ELISA

为了确定疫苗的免疫原性，用0.1M NaHCO₃,pH 9.2-9.4中1μM相应注射的与牛血清白蛋白(BSA)偶联的肽包被96孔Nunc-Maxisorb板。通过与封闭缓冲液(PBS中的5％BSA)温育来封闭非特异性结合。将适当的血清稀释液添加到孔中，以1:2倍连续稀释，并在37℃温育约1小时。通过与生物素化的山羊抗小鼠IgG温育，然后与链霉亲合素偶联的辣根过氧化物酶检测结合的抗体。当添加底物ABTS并且在Microwell读板仪中测量405nm处的光密度(OD)。滴度定义为达到测定法中的50％OD_max的血清稀释度。

为了计算再加强后抗体的诱导倍数，将第四次免疫后测定的个体小鼠的抗注射肽滴度除以第三次免疫后约8个月测定的滴度。图中描绘了每组获得的均值因子。

图2A-D中显示了结果。各组BALB/c小鼠(n＝10)通过注射5μg偶联至KLH(A)和(B)的血管紧张肽II模拟肽、偶联至CRM(C)和(D)的血管紧张肽II模拟肽在第0、2和4周时接受引发疫苗接种。用任一种疫苗的免疫导致引发Ang II特异性IgG抗体应答。所有疫苗就动力学而言显示类似的应答，但在一定程度上就幅度而言不同。无论疫苗类型/配制剂如何，在第22周应用的用低剂量，即5μg相应疫苗的加强未能显著增强Ang II特异性抗体应答。比较而言，在第33周时以高剂量即50μg应用相应的疫苗明显增强Ang II特异性抗体应答，超出在引发阶段期间已经达到的水平。

实施例3：PCSK9疫苗接种加强

材料和方法

疫苗：

通过异双功能接头GMBS(4-马来酰亚胺基丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)将肽SIPWSLERIT、VIPWNLERIL和SVPWNLERIQ缀合至KLH(匙孔血蓝蛋白)。

动物实验：

将5只BALB/c小鼠皮下免疫。小鼠随意获取食物和水，并保持在12小时光照/黑暗周期。21个实验开始时的小鼠龄为8至10周。以2周的时间间隔给小鼠三次注射总体积1ml中的5μg或25μg净肽，其与KLH偶联并且吸附到作为佐剂的铝胶。每次注射后约2周并且在最后的第3次免疫后以每月间隔(长达一年)采集血液。在引发免疫后第52周时，以总共1ml的体积用25μg与KLH偶联并吸附到作为佐剂的铝胶的净肽对小鼠再接种疫苗(第4次免疫)。第4次免疫后2周和4周采集血液(分别为血浆4a和4b)。

蛋白质ELISA：

为了确定疫苗的免疫原性，从而鉴定免疫动物血浆中PCSK9特异性抗体的量，进行ELISA免疫测定法。ELISA免疫测定法产生信号，所述信号可以容易地定量并且代表疫苗诱导的PCSK9特异性抗体的量的定量测量。因此，如通过ELISA测量的滴度直接与处理动物的血浆样品中的靶物特异性抗体的量(μg/ml)相关。在最终的免疫后两周收集所有血浆样品并进行等同性处理(equality treated)。为了具有直接比较，同时对所有样品进行通过PCSK9蛋白ELISA免疫测定法对疫苗诱导的PCSK9特异性抗体的定量评估和与其相对对照(原始序列和阴性对照)的比较。为此目的，用重组表达的人PCSK9蛋白质包被ELISA板。通过与封闭缓冲液(PBS中的1％BSA)温育来封闭非特异性结合。将适当的血清稀释液(具有起始稀释度1:100的合并物)添加到孔，以1:2倍连续稀释(12个稀释步骤)并温育约1小时。通过与抗小鼠IgG抗体温育来检测结合的抗体，添加ABTS作为底物并测量405nm处的OD。作为阴性对照，分析来自用无关肽注射的对照组的血清。滴度定义为达到测定法中的50％OD_max的血清稀释度。

图3中显示了结果。各组小鼠通过注射5或25μg靶向PCSK9的AFFITOPE疫苗在第0、2和4周接受引发疫苗接种。阴性对照小鼠接受与KLH偶联并且用铝作为佐剂的无关肽。对于两个治疗组在引发后48和52周仍可检测到针对人PCSK9的抗体。然而，应答在已经接受较低剂量的动物组中更明显。比较而言，阴性对照动物不表现出对人PCSK9的抗体应答。在第52周用25μgAFFITOPE疫苗的单次加强的应用导致huPCSK9抗体的更明显的增加，低剂量(5μg)/高剂量(25μg)组中达到的水平是高剂量(25)/高剂量(25)组的约2倍。25μg AFFITOPE疫苗的单次注射在对照小鼠(其之前尚未暴露于AFFITOPE疫苗)中不导致抗体应答。

实施例4：AFF008A：针对α突触核蛋白(“aSyn”)的现有免疫应答的成功增强

在临床试验过程(“AFF008A”)中，在早期阶段帕金森氏病(PD)患者中分析用aSyn靶序列(肽DQPVLPD；“PD01A”)的疫苗方法的安全性和免疫学分析，所述疫苗方法以基于的疫苗方法为基础。

PD是一种常见的进行性神经变性性病症，其流行性是年龄相关的，并且影响年龄85岁以上的人的高达4％。该疾病的第一个临床体征是运动病症。然而，非运动症状如嗅觉障碍、便秘、抑郁和直立性低血压也是疾病发作的特征，而在疾病进展期间可能发生对痴呆的认知障碍。尽管深入科学参与了解疾病的发病机制，但目前可用的治疗仅限于有症状的，但缺乏疾病缓解特性。认为α-突触核蛋白(αSyn)，且特别是其寡聚结构是疾病发病机理的主要病理标志，因此是开发针对PD的疗法的有吸引力的靶物。

本研究的目的是开发靶向aSyn的基于的疫苗(称为PD01A；图4)，用于长期治疗或预防PD。

研究设计和方法：

评估用基于肽的PD01A的免疫的I期研究AFF008A(NCT02216188–随访加强)是患者盲的(patient-blinded)、单中心、随机化、对照、平行组，其评估两种“加强”剂量(15μg和75μg)。研究在早期PD患者中进行(图5)。主要端点是一次s.c.加强注射的耐受性和安全性(图6)。在先前接受过用15μg或75μgPD01A(NCT01568099,“AFF008”；见实施例1)的四次引发免疫的患者中测试每种剂量。次要端点是通过两种PD01A给药方案诱导的加强后的免疫应答。此外，通过ELISA监测对免疫肽、KLH(载体蛋白)、和aSyn靶序列特异性的IgG抗体的抗体滴度。另外，还通过ELISA测量针对aSyn重组蛋白的反应性。

结果：

使用两种不同剂量的基于的PD01A疫苗的加强是耐受良好的(图7，8)。与研究的未处理对照分组相比，探索性效力变量显示治疗组中的临床症状无恶化。用PD01A的加强疫苗接种导致以剂量依赖性方式在引发免疫后约两年再激活特异性免疫应答：用低剂量(AFF008)免疫4次并用高剂量(AFF008A)加强的PD患者显示明显的免疫加强。免疫应答贯穿整个24周的观察期持续(图9)。

在22名接种疫苗的PD患者中的19名(86％)中看到针对PD01A的免疫应答。这19名PD患者中的14名(73％)产生针对aSyn原始表位的特异性抗体。

结论：

早期PD患者中的PD01A疫苗方法是耐受良好的，导致长期免疫应答并且可加强。

Claims

1.用于针对人患者中的自身抗原接种疫苗的方法，其中将具有有效量的自身抗原的剂量施用于患者以引发初次免疫应答，所述方法的特征在于对所述患者进行所述自身抗原的加强施用，其中用于所述加强施用的剂量中的所述自身抗原的量高于在用于所述初次免疫应答的施用中使用的所述剂量中自身抗原的量。

2.根据权利要求1的方法，其中所述自身抗原选自下组：淀粉样蛋白β、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PSCK9)、IgE型膜结合免疫球蛋白、亨廷顿蛋白、CD26和α突触核蛋白抗原，优选α突触核蛋白抗原，尤其是含有表位DMPVDPDN和/或KNEEGAP的α突触核蛋白抗原。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述自身抗原是模拟表位，优选α突触核蛋白模拟表位、血管紧张肽II模拟表位或PCSK9模拟表位，更优选选自下组的α突触核蛋白模拟表位：DQPVLPD、DMPVLPD、DSPVLPD、DSPVWAE、DTPVLAE、DQPVLPDN、DMPVLPDN、DSPVLPDN、DQPVTAEN、DSPVWAEN、DTPVLAEN、HDRPVTPD、DRPVTPD、DVPVLPD、DTPVYPD、DTPVIPD、HDRPVTPDN、DRPVTPDN、DNPVHPEN、DVPVLPDN、DTPVYPDN、DTPVIPDN、DQPVLPDG、DMPVLPDG、DSPVLPDG、DSPVWAEG、DRPVAPEG、DHPVHPDS、DMPVSPDR、DSPVPPDD、DQPVYPDI、DRPVYPDI、DHPVTPDR、EYPVYPES、DTPVLPDS、DMPVTPDT、DAPVTPDT、DSPVVPDN、DLPVTPDR、DSPVHPDT、DAPVRPDS、DMPVWPDG、DAPVYPDG、DRPVQPDR、YDRPVQPDR、DMPVDPEN、DMPVDADN、EMPVDPDN、DNPVHPE、KNDEGAP、ANEEGAP、KAEEGAP、KNAEGAP、RNEEGAP、HNEEGAP、KNEDGAP、KQEEGAP、KSEEGAP、KNDDGAP、RNDEGAP、RNEDGAP、RQEEGAP、RSEEGAP、ANDEGAP、ANEDGAP、HSEEGAP、ASEEGAP、HNEDGAP、HNDEGAP、RNAEGAP、HNAEGAP、KSAEGAP、KSDEGAP、KSEDGAP、RQDEGAP、RQEDGAP、HSAEGAP、RSAEGAP、RSDEGAP、RSEDGAP、HSDEGAP、HSEDGAP、和RQDDGAP；尤其是DQPVLPD,DSPVLPD、DVPVLPD、DSPVLPDG、YDRPVQPDR、DHPVHPDS、DAPVRPDS、KNDEGAP、KQEEGAP，或KSEEGAP；选自下组的血管紧张肽II模拟表位：DPVYIHPF、DAVYIHPF、DRHYIHPF、DAAYIHPF、DRAYAHPF、DPGYIHPF、DRAYDHPF、AAYIHPF、RAYAHPF、和PGYIHPF，尤其是DRAYAHPF、RAYAHPF、DPGYIHPF或PGYIHPF；或选自下组的PCSK9模拟表位：SIPWSLERIT、SIPWSLERITPPR、SIPWSLERTTPPR、VIPWNLERILPPR、SVPWNLERIQPPR、SIPWSLERTT、SIPWSLERLT、SIPWSLERLTPPR、SIPWSLERIQ、SIPWSLERIQPPR、VIPWNLERIL和SVPWNLERIQ，尤其是SIPWSLERIT、VIPWNLERIL或SVPWNLERIQ。

4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中用于所述加强施用的剂量中的自身抗原量比用于所述初次免疫应答的施用剂量中使用的量高至少20％，优选至少50％，更优选至少100％，尤其至少200％。

5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中用于所述加强施用的剂量中的自身抗原量为至少20μg，优选至少50μg。

6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中在首次施用所述自身抗原以引发所述初次免疫应答后至少6个月，优选至少12个月施用所述加强施用。

7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中所述自身抗原的施用是皮下、皮内或肌内施用。

8.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述自身抗原与佐剂，优选氧氢氧化铝(aluminium oxyhydroxide)一起施用。

9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中所述自身抗原，尤其是所述自身抗原的模拟表位是包含7至30，优选7至20，更优选7至16，最优选8个氨基酸残基的多肽，并且与药学可接受载体，优选蛋白质载体，特别是KLH(匙孔血蓝蛋白)、Crm-197、破伤风类毒素(TT)或白喉毒素(DT)偶联。

10.根据权利要求1至9中任一项的方法，其中重复所述加强施用，优选在至少三年后且以与所述首次加强施用中相同的量施用。

11.用于针对人患者中的自身抗原的疫苗接种的试剂盒，其包含：

-第一疫苗配制剂，其含有有效量的自身抗原以引发针对所述自身抗原的初次免疫应答，和

-第二疫苗配制剂，其含有有效量的自身抗原以引发针对所述自身抗原的加强免疫应答，

其中所述第二疫苗配制剂中的自身抗原的量高于第一疫苗配制剂中的自身抗原的量。

12.根据权利要求11的试剂盒，其中所述疫苗配制剂根据权利要求1至10中任一项定义。

13.根据权利要求11或12的试剂盒在制备用于引发针对人患者中的自身抗原的免疫应答的疫苗中的用途。

14.用于针对自身抗原对人患者接种的疫苗，其中对患者施用一定剂量的有效量的自身抗原以引发初次免疫应答，其中对所述患者进行所述自身抗原的加强施用，并且其中用于所述加强施用的剂量中的自身抗原的量高于用于所述初次免疫应答的施用的剂量中的自身抗原的量。