DE60317671T2

DE60317671T2 - Diagnostische und therapeutische verwendung von ensadin-0581 gen und protein für neurodegenerative erkrankungen

Info

Publication number: DE60317671T2
Application number: DE60317671T
Authority: DE
Inventors: Heinz Von Der Kammer; Johannes Pohlner; Jozef Hanes
Original assignee: Evotec Neurosciences GmbH
Current assignee: Evotec Neurosciences GmbH
Priority date: 2002-06-27
Filing date: 2003-06-26
Publication date: 2008-10-30
Anticipated expiration: 2023-06-27
Also published as: AU2003260301A8; WO2004003563A2; AU2003260301A1; DE60317671D1; EP1516189B1; WO2004003563A3; EP1516189A2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Diagnostizieren, Prognostizieren und Überwachen des Fortschritts von neurodegenerativen Krankheiten bei einem Patienten. Weiterhin werden Verfahren zur Therapiekontrolle und zur Suche nach Modulatoren von neurodegenerativen Krankheiten bereitgestellt. Die Erfindung offenbart auch pharmazeutische Zusammensetzungen, Kits und rekombinante Tiermodelle.
Neurodegenerative Krankheiten, insbesondere die Alzheimer-Krankheit (AD), haben einen stark schwächenden Einfluss auf das Leben eines Patienten. Weiterhin bilden diese Krankheiten eine enorme gesundheitliche, soziale und ökonomische Belastung. AD ist die häufigste neurodegenerative Krankheit, die für etwa 70% aller Demenzfälle verantwortlich ist, und es handelt sich wahrscheinlich um den verheerendsten altersbedingten neurodegenerativen Zustand, der etwa 10% der Bevölkerung im Alter von über 65 Jahren und bis zu 45% im Alter von über 85 Jahren betrifft (wegen eines neueren Übersichtsartikels, siehe Vickers et al., Progress in Neurobiology 2000, 60: 139–165). Zur Zeit ergibt dies schätzungsweise 12 Millionen Fälle in den USA, Europa und Japan. Diese Situation wird sich mit der demographischen Zunahme der Zahl alter Menschen ("Altwerden der geburtenstarken Jahrgänge") in Industrieländern unvermeidlich noch verschlechtern. Die neuropathologischen Kennzeichen, die in den Gehirnen von Individuen mit AD auftreten, sind senile Plaques, die aus Amyloid-β-Protein bestehen, und tiefgreifende Änderungen des Cytoskeletts, die mit dem Auftreten von abnormen filamentösen Strukturen und der Bildung von neurofibrillären Bündeln (Tangles) zusammenfallen.
Das Amyloid-β(Aβ)-Protein entwickelt sich ausgehend von der Spaltung des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) durch verschiedene Arten von Proteasen. Die Spaltung durch die β/γ-Secretase führt zur Bildung von Aβ-Peptiden unterschiedlicher Länge, typischerweise eines kurzen, besser löslichen und langsam aggregierenden Peptids, das aus 40 Aminosäuren besteht, und eines längeren Peptids aus 42 Aminosäuren, das außerhalb der Zellen schnell aggregiert und die charakteristischen Amyloidplaques bildet (Selkoe, Physiological Rev. 2001, 81: 741–66; Greenfield et al., Frontiers Bioscience 2000, 5: D72–83). Zwei Arten von Plaques, diffuse Plaques und neuritische Plaques, können im Gehirn von AD-Patienten nachgewiesen werden, wobei letztere dem klassischen, vorwiegenden Typ entsprechen. Man findet sie in erster Linie in der Hirnrinde und im Hippocampus. Die neuritischen Plaques haben einen Durchmesser von 50 μm bis 200 μm und bestehen aus unlöslichen fibrillären Amyloiden, Fragmenten von toten Neuronen, Mikroglia und Astrocyten sowie anderen Komponenten, wie Neurotransmittern, Apolipoprotein E, Glycosaminoglycanen, α1-Antichymotrypsin und anderen. Die Entstehung von toxischen Aβ-Ablagerungen im Gehirn beginnt sehr früh im Verlauf von AD, und es wird diskutiert, dass diese eine Schlüsselrolle bei den anschließenden destruktiven Vorgängen spielen, die zur AD-Pathologie führen. Die anderen pathologischen Kennzeichen von AD sind neurofibrilläre Bündel (Tangles; NFT) und abnorme Neurite, die als Neuropilfäden beschrieben werden (Braak und Braak, Acta Neuropathol. 1991, 82: 239–259). NFTs treten innerhalb von Neuronen auf und bestehen aus chemisch verändertem Tau-Protein, das paarweise angeordnete spiralige Filamente bildet, die umeinander gewunden sind. Zusammen mit der Bildung von NFT kann ein Verlust von Neuronen beobachtet werden. Es wird diskutiert, dass dieser Neuronenverlust vielleicht auf ein beschädigtes Mikrotubuli-assoziiertes Transportsystem zurückzuführen ist (Johnson und Jenkins, J. Alzheimer's Dis. 1996, 1: 38–58; Johnson und Hartigan, J. Alzheimer's Dis. 1999, 1: 329–351). Das Auftreten von neurofibrillären Bündeln und ihre steigende Zahl korreliert gut mit dem klinischen Schweregrad von AD (Schmitt et al., Neurology 2000, 55: 370–376).
AD ist eine fortschreitende Krankheit, die mit frühen Defiziten in der Gedächtnisbildung verbunden ist und letztlich zur vollständigen Erosion der höheren kognitiven Funktion führt. Zu den kognitiven Störungen gehören unter anderem Gedächtnisbeeinträchtigung, Aphasie, Agnosie und der Verlust der exekutiven Funktion. Ein charakteristisches Merkmal der Pathogenese von AD ist die selektive Anfälligkeit bestimmter Hirnbereiche und Teilpopulationen von Nervenzellen für den degenerativen Vorgang. Insbesondere der Schläfenlappenbereich und der Hippocampus sind während des Fortschritts der Krankheit früh und schwerer betroffen. Andererseits bleiben Neuronen innerhalb des frontalen Cortex, des okzipitalen Cortex und des Kleinhirns weitgehend intakt und sind vor Neurodegeneration geschützt (Terry et al., Annals of Neurology 1981, 10: 184–92).
Das Alter, in dem AD einsetzt, kann innerhalb eines Bereichs von 50 Jahren variieren, wobei früh einsetzendes AD bei Menschen auftritt, die jünger als 65 Jahre sind, und spät einsetzendes AD bei solchen auftritt, die älter als 65 Jahre sind. Etwa 10% aller AD-Fälle leiden unter früh einsetzendem AD, wobei nur 1–2% familiäre, vererbte Fälle sind.
Zur Zeit gibt es keine Heilung für AD und auch keine effektive Behandlung, die den Fortschritt von AD aufhalten oder AD auch nur mit hoher Wahrscheinlichkeit vor dem Tod diagnostizieren kann. Es wurden mehrere Risikofaktoren identifiziert, die ein Individuum prädisponieren, AD zu entwickeln, darunter vor allem das Epsilon-4-Allel von den drei verschiedenen existierenden Allelen (Epsilon 2, 3 und 4) des Apolipoprotein-E-Gens (ApoE) (Strittmatter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90: 1977–81; Roses, Ann. NY Acad. Sci. 1998, 855: 738–43). Das polymorphe Plasmaprotein ApoE spielt eine Rolle im interzellulären Cholesterin- und Phospholipidtransport durch Bindung von Rezeptoren für Lipoprotein geringer Dichte (LDL), und es scheint eine Rolle bei Neuritenwachstum und -regeneration zu spielen. Versuche, weitere Suszeptibilitätsgene und mit der Krankheit verknüpfte Polymorphismen nachzuweisen, führen zu der Annahme, dass spezifische Bereiche und Gene auf den humanen Chromosomen 10 und 12 mit spät einsetzendem AD verbunden sein können (Myers et al., Science 2000, 290: 2304–5; Bertram et al., Science 2000, 290: 2303; Scott et al., Am. J. Hum. Genet. 2000, 66: 922–32).
Es gibt zwar auch seltene Beispiele für früh einsetzendes AD, die genetischen Defekten in den Genen für das Amyloid-Vorläuferprotein (APP) auf Chromosom 21, Presenilin-1 auf Chromosom 14 und Presenilin-2 auf Chromosom 1 zugeordnet wurden, doch ist die vorherrschende Form des spät einsetzenden sporadischen AD von bisher unbekanntem ätiologischem Ursprung. Die bisher gefundenen Mutationen machen nur die Hälfte der familiären AD-Fälle aus, was weniger als 2% aller AD-Patienten entspricht. Das späte Einsetzen und die komplexe Pathogenese von neurodegenerativen Störungen bedeuten eine gewaltige Herausforderung für die Entwicklung von Therapeutika und Diagnostika. Es ist entscheidend, den Vorrat an potentiellen Wirkstoff-Angriffspunkten und diagnostischen Markern zu erweitern. Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Einblick in die Pathogenese von neurologischen Krankheiten zu gewähren und Verfahren, Materialien, Mittel, Zusammensetzungen und Tiermodelle bereitzustellen, die unter anderem für die Diagnose und Entwicklung einer Behandlung dieser Krankheiten geeignet sind. Dieses Ziel wurde durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche erreicht. Die Unteransprüche definieren bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung offenbart die differentielle Expression eines Gens, das für Ensadin-0581 codiert, in humanen Hirnproben von Alzheimer-Patienten durch Verwendung von suppressiver subtraktiver Hybridisierung und Screening von DNA-Biochips. Das Gen, das für Ensadin-0581 codiert, wurde ursprünglich aus einer humanen fetalen Hirn-cDNA-Bibliothek isoliert und kloniert (Genbank-Zugriffsnummer AK055292). Die humane cDNA von Ensadin-0581 ist zu einer großen humanen Consensussequenz, die aus den Sequenzen der Genbank-Einträge AK055292 und AB067487 (genomische Sequenzen AL033375, AL356958, AL023656) abgeleitet und zusammengesetzt wurde, hochgradig homolog. Das humane Ensadin-0581-Gen beherbergt ein vorausgesagtes offenes Leseraster, das für ein Protein mit einer Länge von 620 Aminosäuren, SEQ ID Nr. 1, mit einem ungefähren Molekulargewicht von etwa 70 kDa codiert. Das vorausgesagte Protein ist mit dem Proteinprodukt von Genbank-ID-Nr. BAB70899.1, BAB67793 (Protein ID Q96NJ5), das aus der Sequenz Genbank-Zugriffsnummer AK055292 abgeleitet ist, identisch. Das Ensadin-0581-Protein enthält im Vergleich zu dem Protein von Genbank-ID-Nr. BAB67793.1, das von einer cDNA mit der Genbank-Zugriffsnummer AB067487 abgeleitet ist, 38 zusätzliche Aminosäuren am N-Terminus. Humanes Ensadin-0581-Protein hat eine schwache Aminosäuresequenzidentität mit den Proteinprodukten der cDNAs "diablo" (dbo) (ca. 30% Identität) und "kelch" (ca. 25% Identität) der Fruchtfliege Drosophila melanogaster. Bisher wurde keine Homologie oder Ähnlichkeit mit irgendwelchen anderen bekannten Proteinen identifiziert. Auf der Basis von Strahlungshybridkartierungsstudien konnte das Ensadin-0581-Gen auf dem humanen Chromosom 6 lokalisiert werden (Nagase et al., DNA Research 2001, 8: 179–187).
Ensadin-0581 enthält Consensus-Motive, die man auch in anderen bekannten Proteinen findet. An seinem N-Terminus (Bereich von Aminosäuren 32 bis 171) besitzt das Ensadin-0581-Protein eine Struktur, die einer BTB/POZ-Domäne (Eric-a-brac, Tramtrack, Broad-Komplex/Pockenvirus-Zinkfinger) ähnelt (He et al., Int Rev Cytol 1995, 1628: 1–74), welche eine der am meisten konservierten Proteindomänen im humanen Genom ist. Mehr als 100 unterschiedliche BTB/POZ-haltige Proteine sind bisher beschrieben (Collins et al., Molecular and Cellular Biology 2001, 21: 3609–3615). Am meisten wurde die BTB/POZ-Domäne in Zinkfinger-Transcriptionsfaktoren identifiziert, aber sie wurde auch in anderen Proteinen, zum Beispiel in einigen Actin-bindenden Proteinen, identifiziert. Diese Domäne wurde mit Protein-Protein-Wechselwirkungen in Verbindung gebracht. Die Domäne ist ein aus 120 Aminosäuren bestehendes Motiv, das von sich aus ein Dimer bildet und die Dimerisierung und Oligomerisierung in Proteinen vermittelt und somit eine Rolle beim Zusammenfügen von großen Proteinkomplexen spielt. Außerdem ist es mit Gen-Repressionsaktivitäten assoziiert und an der Steuerung der Genexpression beteiligt. Das BTB/POZ-Motiv befindet sich am N-Terminus von Proteinen und tritt zusammen mit anderen Domänen auf, wie zum Beispiel kelch-, Zinkfinger oder GTPase-Motive, die man eher C-terminal findet. Dies gilt auch für Ensadin-0581, das an seinem C-Terminus (Bereich der Aminosäuren 335 bis 533) Homologie zu "kelch-Motiven" besitzt. Wenigstens vier solcher "kelch-artigen" Motive wurden identifiziert. "Kelch"-Domänen enthalten eine vorausgesagte Struktur von viersträngigen beta-Faltblatt-Wieder holungsmustern, die gemäß der Strukturanalyse sogenannte "Superbarrels" oder "beta-Propeller" bilden. Normalerweise bilden vier bis sieben dieser Motive mit einer Länge von jeweils 44–56 Aminosäuren und acht konservierten Schlüsselresten ein "kelch"-Domäne (Adams et al., Trends in Cell Biology 2000, 10: 17–24). Die genaue Rolle dieser Wiederholungsmuster ist noch nicht bekannt, aber sie können eine Funktion bei der Proteinfaltung, bei der Bindung von Actin und in der Protein-Protein-Wechselwirkung haben.
Die kelch-Domäne wurde ursprünglich als sechsfaches Tandemelement im "Kelch-ORF1"-Protein von Drosophila melanogaster identifiziert (Xue und Cooley, Cell 1993, 72: 681–693). Das "Kelch"-Protein ist für die Reifung der Oocyten und die Produktion von lebensfähigen Eiern erforderlich, da es eine Komponente der Ringkanäle ist, die intrazelluläre Brücken zwischen den Nährzellen und dem Oocyten bilden, und somit für den Transport von Cytoplasma zwischen beiden Zelltypen verantwortlich ist (Robinson und Cooley, Journal of Cell Biology 1997, 138: 799–810). Das kelch-Motiv ist mehreren Genen gemeinsam, von denen einige, aber nicht alle zur Kelch-Genfamilie mit fünf definierten Untergruppen gehören (Adams et al., Trends in Cell Biology 2000, 10: 17–24). Einige Proteine der Kelch-Familie wurden mit spinocerebellärer Ataxie-8 (SCA8) in Verbindung gebracht (Nemes et al., Human Molecular Genetics 2000, 9: 1543–1551), und mutante Formen dieser Proteine führen in Tiermodellen unter anderem zu einer Verschlechterung des Verhaltens und der Körperkontrolle.
Auf dem zellulären Niveau sind Proteine der Kelch-Familie weit verbreitet, einschließlich des extrazellulären Milieus, der intrazellulären Kompartimente und der Zelloberfläche. Somit erwartet man, dass Proteine, die ein kelch-artiges Motiv enthalten, an vielen Zellfunktionen beteiligt sind. Zum Beispiel enthalten mehrere Actin-bindende Proteine "kelch-artige" Wiederholungsmuster. Einige davon sind an der Organisation des Actin-Cytoskeletts in Hirnzellen beteiligt. Proteine, die hauptsächlich im Gehirn lokalisiert sind und die oben genannten Eigenschaften aufweisen, sind zum Beispiel NRP/B (für Zellkernmatrixprotein, das im Gehirn exprimiert wird), Mayven und Actinfilin (Kim et al., Journal of Cell Biology 1998, 141: 553–566; Soltysik-Espanola et al., Mol Biol Cell 1999, 10: 2361–2375; Chen et al., Journal of Biological Chemistry 2002, veröffentlicht als Manuskript M202076200). Das auf Actin basierende Cytoskelett sorgt nicht nur für ein strukturelles Gerüst für Zellen, sondern reguliert auch den Transport und die Verteilung von Proteinen, ganzen Organellen und mRNA. Weiterhin reguliert es Sekretionsereignisse und ist in neuronalen Geweben an der Bildung von Axonen und Dendriten beteiligt. Im Gehirn exprimiertes Protein, das ein "kelch"-Motiv enthält, könnte also relevant für die Bildung des Langzeitgedächtnisses und für die Aufrechterhaltung der neuronalen Funktion sein. Wie in der vorliegenden Erfindung offenbart ist, zeigte sich, dass das Ensadin-0581-Gen im humanen adulten Gehirn exprimiert wird. Es zeigte sich, dass ein hochgradig homologes Gen (Genbank-Zugriffsnummer AB067487) vorwiegend in humanem fetalem und adultem Gehirn exprimiert wird, mit mäßiger Expression in anderen Geweben, wie Niere und Eierstock. Im humanen adulten Zentralnervensystem war die Expression im Hippocampus, der Amygdala und dem Kleinhirn, in Corpus callosum, Substantia nigra, Thalamus, Rückenmark und im Nucleus caudatus und im Nucleus subthalamicus besonders stak ausgeprägt (Nagase et al., DNA Research 2001, 8: 179–187).
Die vorliegende Erfindung offenbart eine Dysregulation der Expression des Ensadin-0581-Gens auf dem Transcriptionsniveau im Bereich des temporalen Cortex relativ zum Stirnlappenbereich von Hirnproben, die von AD-Patienten entnommen wurden. In Proben, die von altersangepassten gesunden Kontrollen stammen, wird keine solche Dysregulation beobachtet. Bisher wurden keine Experimente beschrieben, die eine Beziehung zwischen einer Dysregulation der Expression des Ensadin-0581-Gens und der Pathologie von neurodegenerativen Krankheiten, insbesondere AD, nachweisen. Eine solche Verbindung, wie sie in der vorliegenden Erfindung offenbart wird, bietet unter anderem neue Methoden für die Diagnose und Behandlung dieser Krankheiten.
Die Singularformen "ein", "eine" und "der/die/das", wie sie hier und in den Ansprüchen verwendet werden, umfassen auch eine Bezugnahme auf den Plural, wenn der Zusammenhang nichts anderes erfordert. Zum Beispiel bedeutet "eine Zelle" auch eine Menge von Zellen usw. Der Ausdruck "und/oder", der in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet wird, impliziert, dass die Begriffe vor und nach diesem Ausdruck entweder als Alternativen oder als Kombination angesehen werden sollen. Zum Beispiel bedeutet die Formulierung "Bestimmung einer Konzentration und/oder einer Aktivität", dass entweder nur eine Konzentration oder nur eine Aktivität oder sowohl eine Konzentration als auch eine Aktivität bestimmt werden. Der hier verwendete Ausdruck "Konzentration" soll einen Wert oder ein Maß der Menge oder eine Konzentration eines Transcriptionsprodukts, zum Beispiel einer mRNA, oder einen Translationsprodukts, zum Beispiel eines Proteins oder Polypeptids, umfassen. Der hier verwendete Ausdruck "Aktivität" soll als Maß für die Fähigkeit eines Transcriptionsprodukts oder eines Translationsprodukts zur Erzeugung einer biologischen Wirkung oder als Maß für eine Menge an biologisch aktiven Molekülen verstanden werden. Der Ausdruck "Aktivität" bezieht sich auch auf enzymatische Aktivität. Die hier verwendeten Ausdrücke "Konzentration" und/oder "Aktivität" beziehen sich weiterhin auf Genexpressionsniveaus oder Genaktivität. Genexpression kann definiert werden als Verwendung der in einem Gen enthaltenen Information durch Transcription und Translation, was zur Produktion eines Genprodukts führt. "Dysregulation" soll eine Hochregulation oder Herunterregulation der Genexpression bedeuten. Ein Genprodukt umfasst entweder RNA oder Protein und ist das Ergebnis der Expression eines Gens. Die Menge eines Genprodukts kann verwendet werden, um zu messen, wie aktiv ein Gen ist. Der Ausdruck "Gen", der in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet wird, umfasst sowohl codierende Bereiche (Exons) als auch nichtcodierende Bereiche (z. B. nichtcodierende regulatorische Elemente, wie Promotoren oder Enhancer, Introns, Leit- und Trailersequenzen). Der Ausdruck "ORF" ist eine Bezeichnung für "offenes Leseraster" und bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, die in wenigstens einem Leseraster kein Stopcodon besitzt und daher potentiell in eine Sequenz von Aminosäuren translatiert werden kann. "Regulatorische Elemente" sollen induzierbare und nichtinduzierbare Promotoren, Enhancer, Operatoren und andere Elemente, die die Genexpression antreiben und regulieren, umfassen. Der hier verwendete Ausdruck "Fragment" soll z. B. ein alternativ gespleißtes oder verkürztes oder in anderer Weise gespaltenes Transcriptionsprodukt oder Translationsprodukt umfassen. Der hier verwendete Ausdruck "Derivat" bezieht sich auf ein mutantes oder RNA-editiertes oder chemisch modifiziertes oder in sonstiger Weise verändertes Transcriptions- oder Translationsprodukt. Zum Beispiel kann ein "Derivat" durch Verfahren wie veränderte Phosphorylierung oder Glycosylierung oder Acetylierung oder Lipidierung oder durch veränderte Signalpeptidabspaltung oder andere Typen der Reifungsspaltung erzeugt werden. Diese Vorgänge können auch posttranslational erfolgen. Der Ausdruck "Modulator", der in der vorliegenden Erfindung und in den Ansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das die Konzentration und/oder die Aktivität eines Gens oder eines Transcriptionsprodukts eines Gens oder eines Translationsprodukts eines Gens ändern oder verändern kann. Vorzugsweise kann ein "Modulator" die biologische Aktivität eines Transcriptionsprodukts oder eines Translationsprodukts eines Gens ändern oder verändern. Die Modulation kann zum Beispiel eine Erhöhung oder Senkung der Enzymaktivität, eine Änderung der Bindungseigenschaften oder jede andere Änderung oder Veränderung der biologischen, funktionellen oder immunologischen Eigenschaften des Translationsprodukts eines Gens sein. Die Ausdrücke "Mittel", "Reagens" oder "Verbindung" beziehen sich auf irgendeine Substanz, Chemikalie, Zusammensetzung oder Extrakt, die bzw. der eine positive oder negative biologische Wirkung auf eine Zelle, ein Gewebe, eine Körperflüssigkeit oder im Kontext irgendeines biologischen Systems oder irgendeines untersuchten Assaysystems hat. Es kann sich um Agonisten, Antagonisten, partielle Agonisten oder inverse Agonisten eines Angriffspunkts handeln. Solche Mittel, Reagentien oder Verbindungen können Nucleinsäuren, natürliche oder synthetische Peptide oder Proteinkomplexe oder Fusionsproteine sein. Es kann sich auch um Antikörper, organische oder anorganische Moleküle oder Zusammensetzungen, kleine Moleküle, Wirkstoffe und beliebige Kombinationen irgendwelcher der obigen Mittel handeln. Sie können zum Testen, für diagnostische oder therapeutische Zwecke verendet werden. Die Ausdrücke "Oligonucleotidprimer" oder "Primer" beziehen sich auf kurze Nucleinsäuresequenzen, die durch Hybridisierung der komplementären Basenpaare mit einem gegebenen Zielpolynucleotid assoziieren können und von einer Polymerase verlängert werden können. Sie können so gewählt werden, dass sie spezifisch für eine bestimmte Sequenz sind, oder sie können zufällig ausgewählt werden; zum Beispiel wirken sie als Primer für alle möglichen Sequenzen in einer Mischung. Die Länge der hier verwendeten Primer kann von 10 Nucleotiden bis 80 Nucleotiden variieren. "Sonden" sind kurze Nucleinsäuresequenzen aus den hier beschriebenen und offenbarten Nucleinsäuresequenzen oder damit komplementäre Sequenzen. Sie können Sequenzen mit voller Länge oder Fragmente, Derivate, Isoformen oder Varianten einer gegebenen Sequenz umfassen. Die Identifizierung von Hybridisierungskomplexen zwischen einer "Sonde" und einer Probe, die einem Assay unterzogen wird, ermöglicht den Nachweis der Anwesenheit anderer, ähnlicher Sequenzen innerhalb der Probe. Der hier verwendete Ausdruck "Homologes" oder "Homologie" ist ein Ausdruck, der in der Technik verwendet wird, um die Verwandtschaft einer Nucleotid- oder Peptidsequenz mit einer anderen Nucleotid- oder Peptidsequenz zu beschreiben, welche durch den Grad der Identität und/oder Ähnlichkeit zwischen den miteinander verglichenen Sequenzen bestimmt wird. Der Ausdruck "Variante", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid oder Protein in Bezug auf in der vorliegenden Erfindung offenbarte Polypeptide und Proteine, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren am N-Terminus und/oder am C-Terminus und/oder innerhalb der nativen Aminosäuresequenzen der nativen Polypeptide oder Proteine der vorliegenden Erfindung hinzugefügt und/oder substituiert und/oder deletiert und/oder inseriert sind. Weiterhin soll der Ausdruck "Variante" jede kürzere oder längere Version eines Polypeptids oder Proteins umfassen. "Varianten" sollen auch eine Sequenz umfassen, die wenigstens etwa 80% Sequenzidentität, besonders bevorzugt wenigstens etwa 90% Sequenzidentität und am meisten bevorzugt wenigstens etwa 95% Sequenzidentität mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 1 aufweist. Zu den "Varianten" eines Proteinmoleküls, das in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, gehören zum Beispiel Proteine mit konservativen Aminosäuresubstitutionen in hochkonservativen Bereichen. Zu den "Proteinen und Polypeptiden" der vorliegenden Erfindung gehören Varianten, Fragmente und chemische Derivate des Proteins, das SEQ ID Nr. 1 umfasst. Dazu können Proteine und Polypeptide gehören, die aus der Natur isoliert oder mit rekombinanten und/oder synthetischen Methoden hergestellt werden können. "Native Proteine oder Polypeptide" bezieht sich auf natürlich vorkommende verkürzte oder sezernierte Formen, natürlich vorkommende Variante Formen (z. B. Spleiß varianten) und natürlich vorkommende allelische Varianten. Der hier verwendete Ausdruck "isoliert" soll sich auf Moleküle beziehen, die aus ihrer natürlichen Umgebung entfernt, d. h. aus einer Zelle oder aus einem lebenden Organismus, wo sie normalerweise vorkommen, isoliert wurden, und die von den daneben vorliegenden Komponenten, mit denen man sie in der Natur vergesellschaftet antrifft, abgetrennt oder im Wesentlichen gereinigt wurden. Dieser Ausdruck bedeutet weiterhin, dass die Sequenzen, die solche Moleküle codieren, von menschlicher Hand mit Polynucleotiden, mit denen sie in ihrem natürlichen Zustand nicht verknüpft sind, verknüpft werden können und dass solche Moleküle mit rekombinanten und/oder synthetischen Methoden hergestellt werden können. Auch wenn diese Sequenzen für diese Zwecke mit Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, in lebende oder nichtlebende Organismen eingeführt werden können und auch wenn diese Sequenzen in den Organismen noch vorhanden sind, werden sie immer noch als isoliert angesehen. In der vorliegenden Erfindung sind die Ausdrücke "Risiko", "Anfälligkeit" und "Prädisposition" gleichbedeutend und werden in bezug auf die Wahrscheinlichkeit verwendet, eine neurodegenerative Krankheit, vorzugsweise Alzheimer-Krankheit, zu entwickeln.
Der Ausdruck "AD" soll Alzheimer-Krankheit bedeuten. Der hier verwendete Ausdruck "Neuropathologie des AD-Typs" bezieht sich auf neuropathologische, neurophysiologische, histopathologische und klinische Merkmale, wie sie in der vorliegenden Erfindung beschrieben werden und aus der einschlägigen Literatur üblicherweise bekannt sind (siehe: Iqbal, Swaab, Winblad und Wisniewski, Alzheimer's Disease and Related Disorders (Etiology, Pathogenesis and Therapeutics), Wiley & Sons, New York, Weinheim, Toronto, 1999; Scinto und Daffner, Early Diagnosis of Alzheimer's Disease, Humana Press, Totowa, New Jersey, 2000; Mayeux und Christen, Epidemiology of Alzheimer's Disease: From Gene to Prevention, Springer Press, Berlin, Heidelberg, New York, 1999; Younkin, Tanzi und Christen, Presenilins and Alzheimer's Disease, Springer Press, Berlin, Heidelberg, New York, 1998).
Neurodegenerative Krankheiten oder Störungen gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Chores Huntington, amyotrophe laterale Sklerose, Niemann-Pick-Krankheit, frontotemporale Demenz, progressive supranukleäre Paralyse, kortikobasale Degeneration, zerebrovaskuläre Demenz, Multi-System-Atrophie, Silberkorndemenz und andere Tauopathien sowie milde kognitive Beeinträchtigungen. Weitere Zustände, die neurodegenerative Vorgänge beinhalten, sind zum Beispiel altersabhängige Makuladegeneration, Narkolepsie, Motorneuronerkrankungen, Prionenkrankheiten, traumatische Nervenverletzung und -reparatur sowie multiple Sklerose.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Diagnostizieren oder Prognostizieren einer neurodegenerativen Krankheit bei einem Patienten oder zum Bestimmen, ob ein Patient ein erhöhtes Risiko hat, diese Krankheit zu entwickeln. Das Verfahren umfasst Folgendes: Bestimmen einer Konzentration oder einer Aktivität oder sowohl einer Konzentration als auch einer Aktivität von (i) einem Transcriptionsprodukt eines Gens, das für Ensadin-0581 codiert, und/oder (ii) einem Translationsprodukt eines Gens, das für Ensadin-0581 codiert, und/oder (iii) einem Fragment oder Derivat oder einer Variante des Transcriptions- oder Translationsprodukts in einer Probe von dem Patienten und Vergleichen der Konzentration und/oder der Aktivität mit einem Referenzwert, der einen bekannten Krankheits- oder Gesundheitszustand darstellt, wodurch die neurodegenerative Krankheit bei dem Patienten diagnostiziert oder prognostiziert wird oder bestimmt wird, ob der Patient ein erhöhtes Risiko hat, diese neurodegenerative Krankheit zu entwickeln.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Konstruktion und Verwendung von Primern und Sonden, die spezifisch für die in der vorliegenden Erfindung offenbarte Nucleinsäuresequenz oder Fragmente oder Varianten davon sind. Die Oligonucleotidprimer und/oder -sonden können mit fluoreszenten, biolumineszenten, magnetischen oder radioaktiven Substanzen spezifisch markiert sein. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf den Nachweis und die Produktion der Nucleinsäuresequenzen oder Fragmente und Varianten davon unter Verwendung der spezifischen Oligonucleotidprimer in geeigneten Kombinationen. PCR- Analyse, ein dem Fachmann wohlbekanntes Verfahren, kann mit den Primerkombinationen durchgeführt werden, um die genspezifischen Nucleinsäuresequenzen aus einer Probe, die Nucleinsäuren enthält, zu amplifizieren. Eine solche Probe kann entweder von gesunden oder von kranken Patienten stammen. Ob eine Amplifikation zu einem spezifischen Nucleinsäureprodukt führt oder nicht und ob ein Fragment mit unterschiedlicher Länge erhalten werden kann oder nicht, kann auf eine neurodegenerative Krankheit, insbesondere Alzheimer-Krankheit, hinweisen. Die Erfindung stellt also Nucleinsäuresequenzen, Oligonucleotidprimer und Sonden mit einer Länge von wenigstens 10 Basen bis zu den gesamten codierenden und Gensequenzen bereit, die zum Nachweis von Genmutationen und Einzelnucleotidpolymorphismen in einer gegebenen Probe, die zu untersuchende Nucleinsäuresequenzen umfasst und die mit neurodegenerativen Krankheiten, insbesondere Alzheimer-Krankheit, assoziiert sein kann, geeignet sind. Dieses Merkmal ist nützlich, um schnelle diagnostische Tests auf DNA-Basis, vorzugsweise auch im Format eines Kits, zu entwickeln.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Überwachung des Fortschritts einer neurodegenerativen Krankheit bei einem Patienten. Bestimmt wird eine Konzentration oder eine Aktivität oder sowohl eine Konzentration als auch eine Aktivität von (i) einem Transcriptionsprodukt eines Gens, das für Ensadin-0581 codiert, und/oder (ii) einem Translationsprodukt eines Gens, das für Ensadin-0581 codiert, und/oder (iii) einem Fragment oder Derivat oder einer Variante des Transcriptions- oder Translationsprodukts in einer Probe von dem Patienten. Die Konzentration und/oder Aktivität wird mit einem Referenzwert verglichen, der einen bekannten Krankheits- oder Gesundheitszustand darstellt. Dadurch wird der Fortschritt der neurodegenerativen Krankheit bei dem Patienten überwacht.
In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bewertung einer Behandlung auf eine neurodegenerative Krankheit, das Folgendes umfasst: Bestimmen einer Konzentration oder einer Aktivität oder sowohl einer Konzentration als auch einer Aktivität von: (i) einem Transcriptionsprodukt eines Gens, das für Ensadin-0581 codiert, und/oder (ii) einem Translationsprodukt eines Gens, das für Ensadin-0581 codiert, und/oder (iii) einem Fragment oder Derivat oder einer Variante des Transcriptions- oder Translationsprodukts in einer Probe, die von einem Patienten erhalten wurde, der auf die Krankheit behandelt wird. Die Konzentration oder die Aktivität oder sowohl die Konzentration als auch die Aktivität werden mit einem Referenzwert verglichen, der einen bekannten Krankheits- oder Gesundheitszustand darstellt, wodurch die Behandlung auf die neurodegenerative Krankheit bewertet wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der hier beanspruchten Verfahren, Kits, rekombinanten nichtmenschlichen Tiere, Moleküle, Assays und Verwendungen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Gen, das für Ensadin-0581-Protein codiert, um das in SEQ ID Nr. 2 gezeigte Gen oder um Fragmente, Derivate oder Varianten davon. Ebenso handelt es sich bei dem Ensadin-0581-Protein um das in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Protein oder um Fragmente, Derivate oder Varianten davon.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der hier beanspruchten Verfahren, Kits, rekombinanten Tiere, Moleküle, Assays und Verwendungen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der neurodegenerativen Krankheit oder Störung um die Alzheimer-Krankheit, und die Patienten leiden unter Alzheimer-Krankheit.
Die vorliegende Erfindung offenbart den Nachweis und die differentielle Expression und Regulation eines Gens, das für Ensadin-0581 codiert, in speziellen Hirnbereichen von AD-Patienten. Folglich können das Ensadin-0581-Gen und seine entsprechenden Transcriptions- und/oder Translationsprodukte eine kausale Rolle bei der regionalselektiven neuronalen Degeneration spielen, die man bei AD typischerweise beobachtet. Alternativ dazu kann Ensadin-0581 den verbleibenden überlebenden Nervenzellen eine neuroprotektive Funktion verleihen. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse ist die vorliegende Erfindung von Nutzen für die diagnostische Bewertung und Prognose sowie für die Identifizierung einer Prädisposition für eine neurodegenerative Krankheit, insbesondere AD. Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung Verfahren für die diagnostische Überwachung von Patienten bereit, die auf eine solche Krankheit behandelt werden.
Besonders bevorzugt ist die zu analysierende und zu bestimmende Probe aus der Gruppe ausgewählt, die aus Hirngewebe oder anderen Geweben oder Körperzellen besteht. Die Probe kann auch Liquor oder andere Körperflüssigkeiten umfassen, einschließlich Speichel, Urin, Blut, Serum, Plasma oder Schleim. Vorzugsweise können die Verfahren zur Diagnose, Prognose, Überwachung des Fortschritts oder Bewertung einer Behandlung einer neurodegenerativen Krankheit gemäß der vorliegenden Erfindung ex corpore durchgeführt werden, und solche Verfahren beziehen sich vorzugsweise auf Proben, zum Beispiel Körperflüssigkeiten oder Zellen, die von einem Individuum oder Patienten entnommen, gesammelt oder isoliert wurden.
In weiter bevorzugten Ausführungsformen ist der Referenzwert der Referenzwert einer Konzentration oder einer Aktivität oder sowohl einer Konzentration als auch einer Aktivität (i) eines Transcriptionsprodukts eines Gens, das für Ensadin-0581 codiert, und/oder (ii) eines Translationsprodukts eines Gens, das für Ensadin-0581 codiert, und/oder (iii) einem Fragment oder Derivat oder einer Variante des Transcriptions- oder Translationsprodukts in einer Probe von einem Patienten, der nicht an der neurodegenerativen Krankheit leidet.
In bevorzugten Ausführungsformen zeigt eine Veränderung der Konzentration und/oder Aktivität eines Transcriptionsprodukts des Gens, das für Ensadin-0581 codiert, und/oder eines Translationsprodukts eines Gens, das für Ensadin-0581 codiert, und/oder eines Fragments oder Derivats oder einer Variante davon in einer Probenzelle oder einem Gewebe oder einer Körperflüssigkeit von dem Patienten relativ zu einem Referenzwert, der einen bekannten Gesundheitszustand darstellt, eine Diagnose oder Prognose oder ein erhöhtes Risiko einer neurodegenerativen Krankheit, insbesondere AD, an.
In bevorzugten Ausführungsformen erfolgt die Messung der Konzentration von Transcriptionsprodukten eines Ensadin-0581-Gens in einer Probe von einem Patienten unter Verwendung einer quantitativen PCR-Analyse mit Primerkombinationen zur Amplifikation der genspezifischen Sequenzen ausgehend von cDNA, die durch Reverse Transcription von RNA erhalten wird, welche aus einer Probe eines Patienten extrahiert wurde. Ein Northern-Blot mit Sonden, die für das Gen spezifisch sind, kann ebenfalls angewendet werden. Es könnte weiterhin bevorzugt sein, Transcriptionsprodukte mit Hilfe von Mikroarraytechniken auf Chipbasis zu messen. Diese Techniken sind dem Fachmann bekannt (siehe Sambrook und Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001; Schena M., Microarray Biochip Technology, Eaton Publishing, Natick, MA, 2000). Ein Beispiel für einen Immunoassay ist der Nachweis und die Messung der Enzymaktivität, wie es in der Patentanmeldung WO 02/14543 offenbart und beschrieben ist.
Weiterhin können die Konzentration und/oder die Aktivität eines Translationsprodukts eines Ensadin-0581-Gens und/oder eines Fragments oder Derivats oder einer Variante des Translationsprodukts und/oder ein Niveau der Aktivität des Translationsprodukts und/oder des Fragments oder Derivats oder der Variante davon unter Verwendung eines Immunassays, eines Aktivitätsassays und/oder eines Bindungsassays nachgewiesen werden. Diese Assays können das Ausmaß der Bindung zwischen dem Proteinmolekül und einem Anti-Protein-Antikörper messen, wobei man enzymatische, chromogene, radioaktive, magnetische oder lumineszierende Marker verwendet, die entweder am Anti-Protein-Antikörper oder einem sekundären Antikörper, der den Anti-Protein-Antikörper bindet, befestigt werden. Außerdem können auch andere hochaffine Liganden verwendet werden. Zu den Immunassays, die verwendet werden können, gehören zum Beispiel ELISAs, Western-Blots und andere Techniken, die dem Fachmann bekannt sind (siehe Harlow und Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999, und Edwards R., Immunodiagnostics: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford; England, 1999). Alle diese Nachweistechniken können auch im Format von Mikroarrays, Proteinarrays, Antikörper-Mikroarrays, Gewebe-Mikroarrays oder Techniken auf der Basis von elektronischen Biochips oder Proteinchips eingesetzt werden (siehe Schena M., Microarray Biochip Technology, Eaton Publishing, Natick, MA, 2000).
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Konzentration oder die Aktivität oder sowohl die Konzentration als auch die Aktivität (i) eines Transcriptionsprodukts eines Gens, das für Ensadin-0581 codiert, und/oder (ii) eines Translationsprodukts eines Gens, das für Ensadin-0581 codiert, und/oder (iii) eines Fragments oder Derivats oder einer Variante des Transcriptions- oder Translationsprodukts in einer Reihe von Proben, die im Laufe der Zeit von dem Patienten entnommen wurden, miteinander verglichen, um den Fortschritt der Krankheit zu überwachen. In weiter bevorzugten Ausführungsformen erhält der Patient vor einer oder mehreren der Probenahmen eine Behandlung. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die Konzentration und/oder Aktivität vor und nach der Behandlung des Patienten bestimmt.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung einen Kit zum Diagnostizieren oder Prognostizieren von neurodegenerativen Krankheiten, insbesondere AD, bei einem Patienten oder zum Bestimmen der Neigung oder Prädisposition eines Patienten, eine neurodegenerative Krankheit, insbesondere AD, zu entwickeln, wobei der Kit Folgendes umfasst:

a) wenigstens ein Reagens, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgendem besteht: (i) Reagentien, die selektiv ein Transcriptionsprodukt eines Gens, das für Ensadin-0581 codiert, nachweisen, und (ii) Reagentien, die selektiv ein Translationsprodukt eines Gens, das für Ensadin-0581 codiert, nachweisen; und
b) eine Anleitung zum Diagnostizieren oder Prognostizieren einer neurodegenerativen Krankheit, insbesondere AD, oder zum Bestimmen der Neigung oder Prädisposition eines Patienten, eine solche Krankheit zu entwickeln, durch
– Nachweisen einer Konzentration oder einer Aktivität oder sowohl einer Konzentration als auch einer Aktivität des Transcriptionsprodukts und/oder des Translationsprodukts eines Gens, das für Ensadin-0581 codiert, in einer Probe von dem Patienten; und
– Diagnostizieren oder Prognostizieren einer neurodegenerativen Krankheit, insbesondere AD, oder Bestimmen der Neigung oder Prädisposition des Patienten, eine solche Krankheit zu entwickeln;

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein rekombinantes nichthumanes Tier, das eine nichtnative Gensequenz, die für Ensadin-0581 codiert, oder ein Fragment oder Derivat oder eine Variante davon umfasst. Die Erzeugung des rekombinanten nichthumanen Tiers umfasst (i) das Bereitstellen eines Genzielsteuerungskonstrukts, das die Gensequenz und eine Selektionsmarkersequenz umfasst, und (ii) das Einführen des Zielsteuerungskonstrukts in eine Stammzelle eines nichthumanen Tiers und (iii) das Einführen der Stammzelle des nichthumanen Tiers in einen nichthumanen Embryo und (iv) das Transplantieren des Embryos in ein pseudoträchtiges nichthumanes Tier und (v) das Entwickelnlassen des Embryos bis zur Reife und (vi) das Identifizieren eines genetisch veränderten nichthumanen Tiers, dessen Genom eine Modifikation der Gensequenz in beiden Allelen umfasst, und (vii) das Aufziehen des genetisch veränderten nichthumanen Tiers von Schritt (vi), so dass man ein genetisch verändertes nichthumanes Tier erhält, dessen Genom eine Modifikation des endogenen Gens umfasst, wobei das Gen fehlexprimiert oder unterexprimiert oder überexprimiert wird und wobei die Zerstörung oder Veränderung dazu führt, dass das nichthumane Tier eine Prädisposition aufweist, Symptome einer Neuropathologie zu entwickeln, die einer neurodegenerativen Krankheit, insbesondere AD, ähnlich ist. Strategien und Techniken für die Erzeugung und Konstruktion eines solchen Tiers sind dem Fachmann bekannt (siehe z. B. Capecchi, Science 1989, 244: 1288–1292, und Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1994, und Jackson und Abbott, Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, England, 1999). Vorzugsweise wird ein solches rekombinantes nichthumanes Tier als Tiermodell für die Untersuchung von neurodegenerativen Krankheiten, insbesondere Alzheimer-Krankheit, verwendet. Ein solches Tier kann geeignet sein, um bei der Entwicklung von Diagnostika und Therapeutika zur Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten, insbesondere Alzheimer-Krankheit, Verbindungen, Mittel und Modulatoren zu suchen, zu testen und zu bewerten.
In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung einen Assay zum Suchen nach einem Modulator von neurodegenerativen Krankheiten, insbesondere AD, oder verwandten Krankheiten und Störungen durch Screening von einer oder mehreren Substanzen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Folgenden besteht: (i) einem Gen, das für Ensadin-0581 codiert, und/oder (ii) einem Transcriptionsprodukt eines Gens, das für Ensadin-0581 codiert, und/oder (iii) einem Translationsprodukt eines Gens, das für Ensadin-0581 codiert, und/oder (iv) einem Fragment oder Derivat oder einer Variante von (i) bis (iii). Dieses Scree ningverfahren umfasst: (a) das In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit einer Testverbindung und (b) das Messen der Aktivität oder der Konzentration oder sowohl der Aktivität als auch der Konzentration von einer oder mehreren Substanzen, die in (i) bis (iv) genannt sind, und (c) das Messen der Aktivität oder der Konzentration oder sowohl der Aktivität als auch der Konzentration dieser Substanzen in einer Kontrollzelle, die nicht mit der Testverbindung in Kontakt gebracht wurde, und d) das Vergleichen der Konzentrationen der Substanz in den Zellen der Schritte (b) und (c), wobei eine Änderung der Aktivität und/oder der Konzentration der Substanzen in den kontaktierten Zellen anzeigt, dass die Testverbindung ein Modulator der Krankheiten und Störungen ist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Assay zum Suchen nach einem Modulator von neurodegenerativen Krankheiten, insbesondere AD, oder verwandten Krankheiten und Störungen durch Screening von einer oder mehreren Substanzen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Folgenden besteht: (i) einem Gen, das für Ensadin-0581 codiert, und/oder (ii) einem Transcriptionsprodukt eines Gens, das für Ensadin-0581 codiert, und/oder (iii) einem Translationsprodukt eines Gens, das für Ensadin-0581 codiert, und/oder (iv) einem Fragment oder Derivat oder einer Variante von (i) bis (iii), wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) das Verabreichen einer Testverbindung an ein Testtier, das prädisponiert ist, eine neurodegenerative Krankheit oder verwandte Krankheiten oder Störungen zu entwickeln, oder bereits entsprechende Symptome entwickelt hat, und b) das Messen der Aktivität und/oder der Konzentration von einer oder mehreren Substanzen, die in (i) bis (iv) genannt sind, und c) das Messen der Aktivität und/oder der Konzentration dieser Substanzen in einem angepassten Kontrolltier, das gleichermaßen prädisponiert ist, diese Symptome zu entwickeln, oder sie bereits entwickelt hat, wobei dem Kontrolltier keine solche Testverbindung verabreicht wurde, und d) das Vergleichen der Aktivität und/oder der Konzentration der Substanz in den Tieren der Schritte (b) und (c), wobei eine Änderung der Aktivität und/oder der Konzentration der Substanzen bei dem Testtier anzeigt, dass die Testverbindung ein Modulator der Krankheiten und Störungen ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Testtier und/oder das Kontrolltier ein rekombinantes nichthumanes Tier, das ein Gen, das für Ensadin-0581 codiert, oder ein Fragment oder Derivat davon unter der Kontrolle eines transcriptionsregulatorischen Elements, bei dem es sich nicht um das native transcriptionsregulatorische Element des Ensadin-0581-Gens handelt, exprimiert.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments bereit, das die folgenden Schritte umfasst: (i) Identifizieren eines Modulators von neurodegenerativen Krankheiten durch ein Verfahren der oben genannten Screening-Assays und (ii) Mischen des Modulators mit einem pharmazeutischen Träger. Der Modulator kann auch durch andere Typen von Screening-Assays identifizierbar sein.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eines Assay bereit zum Testen einer Verbindung, vorzugsweise zum Screening einer Menge von Verbindungen, auf Hemmung der Bindung zwischen einem Liganden und einem Translationsprodukt eines Gens, das für Ensadin-0581 codiert, oder einem Fragment oder Derivat oder einer Variante davon. Der Screening-Assay umfasst die folgenden Schritte: (i) Hinzufügen einer flüssigen Suspension des Ensadin-0581-Translationsprodukts oder eines Fragments oder Derivats oder einer Variante davon zu einer Menge von Behältern und (ii) Hinzufügen einer Verbindung oder einer Menge von Verbindungen, die einem Screening auf die Hemmung unterzogen werden sollen, zu der Menge von Behältern und (iii) Hinzufügen eines nachweisbaren, vorzugsweise fluoreszenzmarkierten Liganden zu den Behältern und (iv) Inkubieren des Ensadin-0581-Translationsprodukts oder des Fragments oder Derivats oder der Variante davon sowie der Verbindung oder Menge von Verbindungen und des nachweisbaren, vorzugsweise fluoreszenzmarkierten Liganden und (v) Messen des Ausmaßes der vorzugsweise Fluoreszenz, die mit dem Ensadin-0581-Translationsprodukt oder dem Fragment oder Derivat oder der Variante davon assoziiert ist, und (vi) Bestimmen des Grades der Hemmung der Bindung des Liganden an das Ensadin-0581-Translationsprodukt oder das Fragment oder Derivat oder die Variante davon durch eine oder mehrere der Verbindungen. Es könnte bevorzugt sein, das Ensadin-0581- Translationsprodukt oder das Fragment, Derivat oder die Variante davon in künstliche Liposomen zu rekonstituieren, um die entsprechenden Proteoliposomen zu erzeugen und so die Hemmung der Bindung zwischen einem Liganden und dem Ensadin-0581-Translationsprodukt zu bestimmen. Verfahren zur Rekonstitution von Ensadin-0581-Translationsprodukten aus Tensid in Liposomen wurden ausführlich beschrieben (Schwarz et al., Biochemistry 1999, 38: 9456–9464; Krivosheev und Usanov, Biochemistry-Moscow 1997, 62: 1064–1073). Anstatt einen fluoreszenzmarkierten Liganden zu verwenden, könnte es in einigen Aspekten auch bevorzugt sein, irgendeinen anderen nachweisbaren Marker, der dem Fachmann bekannt ist, z. B. radioaktive Marker, zu verwenden und diesen entsprechend nachzuweisen. Das Verfahren kann für die Identifizierung von neuen Verbindungen sowie für die Bewertung von Verbindungen, die in Bezug auf ihre Fähigkeit, die Bindung eines Liganden an ein Ensadin-0581-Translationsprodukt oder ein Fragment oder Derivat oder eine Variante davon zu hemmen, verbessert oder in anderer Weise optimiert wurden, nützlich sein. Ein Beispiel für einen Fluoreszenzbindungsassay, der in diesem Fall auf der Verwendung von Trägerteilchen beruht, ist in der Patentanmeldung WO 00/52451 offenbart und beschrieben. Ein weiteres Beispiel ist das kompetitive Assayverfahren, das im Patent WO 02/01226 beschrieben ist. Bevorzugte Signalnachweisverfahren für Screening-Assays der vorliegenden Erfindung sind in den folgenden Patentanmeldungen beschrieben: WO 96/13744 , WO 98/16814 , WO 98/23942 , WO 99/17086 , WO 99/34195 , WO 00/66985 , WO 01/59436 , WO 01/59416 .
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments bereit, das die folgenden Schritte umfasst: (i) Identifizieren einer Verbindung als Inhibitor der Bindung zwischen einem Liganden und einem Genprodukt des Gens, das für Ensadin-0581 codiert, durch den oben genannten inhibitorischen Bindungsassay und (ii) Mischen der Verbindung mit einem pharmazeutischen Träger. Die Verbindung kann jedoch auch durch andere Typen von Screening-Assays identifizierbar sein.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung eines Assay zum Testen einer Verbindung, vorzugsweise zum Screening einer Menge von Verbindungen, um den Grad der Bindung der Verbindungen an ein Translationsprodukt des Gens, das für Ensadin-0581 codiert, oder ein Fragment oder Derivat oder eine Variante davon zu bestimmen. Dieser Screening-Assay umfasst Folgendes: (i) Hinzufügen einer flüssigen Suspension des Ensadin-0581-Translationsprodukts oder eines Fragments oder Derivats oder einer Variante davon zu einer Menge von Behältern und (ii) Hinzufügen einer nachweisbaren, vorzugsweise fluoreszenzmarkierten Verbindung oder einer Menge von nachweisbaren, vorzugsweise fluoreszenzmarkierten Verbindungen, die einem Screening auf die Bindung unterzogen werden sollen, zu der Menge von Behältern und (iii) Inkubieren des Ensadin-0581-Translationsprodukts oder des Fragments oder Derivats oder der Variante davon sowie der nachweisbaren, vorzugsweise fluoreszenzmarkierten Verbindung oder Verbindungen und (iv) Messen des Ausmaßes der vorzugsweise Fluoreszenz, die mit dem Ensadin-0581-Translationsprodukt oder dem Fragment oder Derivat oder der Variante davon assoziiert ist, und (v) Bestimmen des Grades der Bindung eines oder mehrerer der Verbindungen an das Ensadin-0581-Translationsprodukt oder das Fragment oder Derivat oder die Variante davon. Bei diesem Typ von Assay könnte es bevorzugt sein, einen Fluoreszenzmarker zu verwenden. Jedoch könnte auch jeder andere Typ von nachweisbarem Marker eingesetzt werden. Die Assayverfahren können für die Identifizierung von neuen Verbindungen sowie für die Bewertung von Verbindungen, die in Bezug auf ihre Fähigkeit, ein Ensadin-0581-Translationsprodukt oder ein Fragment oder Derivat oder eine Variante davon zu binden, verbessert oder in anderer Weise optimiert wurden, nützlich sein.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments bereit, das die folgenden Schritte umfasst: (i) Identifizieren einer Verbindung als Verbindung, die an ein Genprodukt des Ensadin-0581-Gens bindet, durch die oben genannten Bindungsassays und (ii) Mischen der Verbindung mit einem pharmazeutischen Träger. Die Verbindung kann jedoch auch durch andere Typen von Screening-Assays identifizierbar sein.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Medikament bereit, das nach einem der Verfahren gemäß den hier beanspruchten Screening-Assays erhältlich ist. In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Medikament bereit, das nach einem der Verfahren gemäß den hier beanspruchten Screening-Assays erhalten wurde.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Proteinmolekül, das in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, wobei das Proteinmolekül ein Translationsprodukt des Gens, das für ein Ensadin-0581-Protein codiert, oder ein Fragment, Derivat oder eine Variante davon zur Verwendung als diagnostisches Ziel zum Nachweisen einer neurodegenerativen Krankheit, insbesondere Alzheimer-Krankheit.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Proteinmolekül, das in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, wobei das Proteinmolekül ein Translationsprodukt des Gens, das für ein Ensadin-0581-Protein codiert, oder ein Fragment, Derivat oder eine Variante davon zur Verwendung als Screening-Target für Reagentien oder Verbindungen, die eine neurodegenerative Krankheit, insbesondere Alzheimer-Krankheit, verhindern oder behandeln oder verbessern.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Antikörper, der spezifisch immunreaktiv gegenüber einem Immunogen ist, wobei das Immunogen ein Translationsprodukt eines Gens, das für Ensadin-0581, SEQ ID Nr. 1, codiert, oder ein Fragment oder Derivat oder eine Variante davon ist. Das Immunogen kann immunogene oder antigene Epitope oder Teile eines Translationsprodukts des Gens umfassen, wobei der immunogene oder antigene Teil eines Translationsprodukts ein Polypeptid ist und wobei das Polypeptid eine Antikörperantwort in einem Tier hervorruft und wobei das Polypeptid von dem Antikörper immunspezifisch gebunden wird. Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern sind in der Technik wohlbekannt (siehe Harlow et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988). Der Ausdruck "Antikörper", wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfasst alle Formen von Antikörpern, die in der Technik bekannt sind, wie polyklonale, monoklonale, chimäre, rekombinante, antiidiotypische, humanisierte oder einzelkettige Antikörper sowie Fragmente davon (siehe Dubel und Breitling, Recombinant Antibodies, Wiley-Liss, New York, NY, 1999). Antikörper der vorliegenden Erfindung sind zum Beispiel für eine Vielzahl von diagnostischen und therapeutischen Verfahren geeignet, die auf Methoden des Standes der Technik beruhen (siehe Harlow und Lane, Using Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999, und Edwards R., Immunodiagnostics: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, England, 1999), wie Enzym-Immunassays (z. B. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)), Radioimmunassays, Chemolumineszenz-Immunassays, Western-Blot, Immunfällung und Antikörper-Mikroarrays. Diese Verfahren beinhalten den Nachweis von Translationsprodukten des Ensadin-0581-Gens oder seiner Fragmente oder Derivate oder Varianten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Antikörper verwendet werden, um einen pathologischen Zustand einer Zelle in einer Probe von einem Patienten nachzuweisen, was die immuncytochemische Anfärbung der Zelle mit dem Antikörper umfasst, wobei ein veränderter Grad der Anfärbung oder ein verändertes Anfärbungsmuster in der Zelle im Vergleich zu einer Zelle, die einen bekannten Gesundheitszustand darstellt, auf einen pathologischen Zustand der Zelle hinweist. Vorzugsweise bezieht sich der pathologische Zustand auf eine neurodegenerative Krankheit, insbesondere AD. Die immuncytochemische Anfärbung einer Zelle kann mit mehreren verschiedenen experimentellen Verfahren durchgeführt werden, die in der Technik wohlbekannt sind. Es könnte jedoch bevorzugt sein, ein automatisiertes Verfahren zum Nachweis der Antikörperbindung anzuwenden, wobei die Bestimmung des Grades der Anfärbung einer Zelle oder die Bestimmung des zellulären oder subzellulären Anfärbungsmusters einer Zelle oder die topologische Verteilung eines Antigens auf der Zelloberfläche oder unter den Organellen und anderen subzellulären Strukturen innerhalb der Zelle gemäß dem Verfahren durchgeführt werden, das im US-Patent 6,150,173 beschrieben ist.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung von Figuren und Beispielen hervor, die nur zur Veranschaulichung dienen und den Rest der Offenbarung in keiner Weise einschränken sollen.
1 zeigt die Gehirnbereiche mit selektiver Anfälligkeit für Neuronenverlust und Degeneration bei AD. In erster Linie unterliegen Neuronen innerhalb des unteren Schläfenlappens, des entorhinalen Cortex, des Hippocampus und der Amygdala degenerativen Vorgängen bei AD (Terry et al., Annals of Neurology 1981, 10: 184–192). Diese Gehirnbereiche sind am meisten an der Verarbeitung von Lern- und Gedächtnisfunktionen beteiligt. Dagegen bleiben Neuronen innerhalb des frontalen Cortex, des okzipitalen Cortex und des Kleinhirns weitgehend intakt und sind vor neurodegenerativen Vorgängen bei AD geschützt. Für die hier offenbarten Beispiele wurden Hirngewebe aus dem frontalen Cortex (F), dem temporalen Cortex (T) und dem Hippocampus (H) von AD-Patienten und gesunden, altersangepassten Kontrollpersonen verwendet. Zu Veranschaulichungszwecken wurde das Bild eines normalen gesunden Gehirns einer Veröffentlichung von Strange (Brain Biochemistry and Brain Disorders, Oxford University Press, Oxford, 1992, S. 4) entnommen.
Die 2 und 3 zeigen die Bestätigung der differentiellen Expression des humanen Ensadin-0581-Gens in AD-Hirngeweben durch quantitative RT-PCR-Analyse. Die Quantifizierung von RT-PCR-Produkten aus RNA-Proben, die aus dem frontalen Cortex (F) und dem temporalen Cortex (T) von AD-Patienten (2a) gewonnen wurden, und von Proben aus dem frontalen Cortex (F) und dem Hippocampus (H) von AD-Patienten (3a) wurden durch die schnelle Technik des thermischen Wechsels LightCycler durchgeführt. Ebenso wurden Proben von gesunden, altersangepassten Kontrollindividuen damit verglichen (2b für den frontalen Cortex und temporalen Cortex, 3b für den frontalen Cortex und Hippocampus). Die Daten wurden auf die kombinierten durchschnittlichen Werte einer Menge von Standardgenen, die keine signifikanten Unterschiede in ihren Genexpressionsniveaus zeigten, normalisiert. Die Menge der Standardgene bestand aus Genen für Cyclophilin B, das ribosomale Protein S9, den Transferrin-Rezeptor, GAPDH und β-Actin. Die Figur zeigt die Kinetik der Amplifikation durch Auftragen der Zykluszahl gegen die Menge des amplifizierten Materials, die anhand seiner Fluoreszenz gemessen wurde. Man beachte, dass die Amplifikationskinetik von Ensadin-0581-cDNA sowohl vom frontalen als auch vom temporalen Cortex eines normalen Kontrollindividuums bzw. vom frontalen Cortex und Hippocampus eines normalen Kontrollindividuums während der exponentiellen Phase der Reaktion nebeneinandergestellt sind (2b und 3b, Pfeilspitzen), während es bei Alzheimer-Krankheit (2a und 3a, Pfeilspitzen) eine signifikante Trennung der entsprechenden Kurven gibt, was auf eine differentielle Expression des für Ensadin-0581 codierenden Gens in den jeweiligen analysierten Gehirnbereichen hinweist.
4 offenbart SEQ ID Nr. 1, die Aminosäuresequenz des Ensadin-0581-Proteins. Das humane Ensadin-0581-Protein in voller Länge umfasst 620 Aminosäuren.
5 zeigt SEQ ID Nr. 2, die Nucleotidsequenz der humanen Ensadin-0581-cDNA, die 3693 Nucleotide umfasst.
6 zeigt SEQ ID Nr. 3, die Nucleotidsequenz des 328 bp großen Ensadin-0581-cDNA-Fragments, das durch suppressive subtraktive Hybridisierung auf Biochips und anschließende Klonierung identifiziert und erhalten wurde (Sequenz in 5'→3'-Richtung).
In 7 ist der Sequenzvergleich von SEQ ID Nr. 3 mit der Consensussequenz der Nucleotidsequenzen GenBank-Zugriffs-Nr. AK055292 und AB067487 skizziert.
8 zeigt den schematischen Vergleich von SEQ ID Nr. 3 mit Ensadin-0581-cDNA. Das unausgefüllte Kästchen stellt das offene Leseraster von Ensadin-0581 dar, dünne Balken stellen den 5'- bzw. den 3'-untranslatierten Bereich (UTR) dar.
Tabelle 1 offenbart die anfängliche Identifizierung der differentiellen Expression des humanen Ensadin-0581-Gens durch subtraktive suppressive Microarray-Hybridisierungsexperimente. Identische Biochips, die cDNA-Klone von subtrahierten AD- und Kontroll-Hirn-cDNA-Bibliotheken wurden mit verschiedenen, mit Cyanin 3 (Cy3) und Cyanin 5 (Cy5) markierten cDNA-Sonden, die als Sonden A, B bzw. C bezeichnet wurden, cohybridisiert. Mit Cy3 und Cy5 markierte cDNA-Sonden (A) wurden erzeugt, indem man cDNAs aus dem frontalen oder temporalen Cortex von AD-Patienten bzw. Kontrollpersonen markiert, siehe Abschnitt (vi-a) der Beispielbeschreibung. Mit Cy3 und Cy5 markierte SMART-Sonden (B) wurden aus cDNAs erzeugt, die vom frontalen oder temporalen Cortex von AD-Patienten bzw. Kontrollpersonen abgeleitet waren, siehe Abschnitt (vi-b). Mit Cy3 und Cy5 markierte SSH-Sonden (C) wurden nach suppressiver subtraktiver Hybridisierung von Hirn-cDNAs aus dem frontalen und temporalen Cortex von AD-Patienten bzw. Kontrollindividuen von cDNA-Populationen abgeleitet, siehe Abschnitt (vi) (PF_SSH(1) = cDNA aus dem frontalen Cortex von AD-Patienten nach Subtraktion der cDNA aus dem temporalen Cortex von AD-Patienten; PF_SSH(2) = cDNA aus dem temporalen Cortex von AD-Patienten nach Subtraktion der cDNA aus dem frontalen Cortex von AD-Patienten). Die Tabelle führt das Genexpressionsniveau von Ensadin-0581 auf, das als Verhältnis der für den temporalen Cortex gemessenen Fluoreszenzintensität relativ zum frontalen Cortex von AD-Patienten angegeben ist. Die Verhältnisse der Fluoreszenzintensität spiegeln eine differentielle Regulation der humanen Ensadin-0581-RNA-Expression im temporalen und frontalen Cortex von AD-Patienten wider.
In Tabelle 2 sind die Ensadin-0581-Genexpressionsniveaus im temporalen Cortex relativ zum frontalen Cortex bei sieben AD-Patienten, die hier durch die internen Referenznummern P010, P011, P012, P014, P016, P017, P019 (1,01- bis 1,9573fach) identifiziert sind, und fünf gesunden, altersangepassten Kontrollindividuen, die hier durch die internen Referenznummern C005, C008, C011, C012, C014 (0,51- bis 1,02fach) identifiziert sind, aufgeführt. Das Streudiagramm macht individuelle Werte für die Verhältnisse der Regulation vom temporalen zum frontalen Cortex in Kontrollproben (Punkte) bzw. in Proben von AD-Patienten (Dreiecke) sichtbar. Die gezeigten Werte werden gemäß der hier beschriebenen Formel berechnet (siehe unten).
In Tabelle 3 sind die Genexpressionsniveaus im Hippocampus relativ zum frontalen Cortex für das Ensadin-0581-Gen bei sechs Alzheimer-Patienten, die hier durch die internen Referenznummern P010, P011, P012, P014, P016, P019 (0,99- bis 2,41fach) identifiziert sind, und drei gesunden, altersangepassten Kontrollindividuen, die hier durch die internen Referenznummern C004, C005, C008 (0,81- bis 2,04fach) identifiziert sind, aufgeführt. Das Streudiagramm macht individuelle Werte für die Verhältnisse der Regulation vom Hippocampus zum frontalen Cortex in Kontrollproben (Punkte) bzw. in Proben von AD-Patienten (Dreiecke) sichtbar. Die gezeigten Werte werden gemäß der hier beschriebenen Formel berechnet (siehe unten).
Beispiel I:
(i) Hirngewebedissektion aus Patienten mit AD:
Hirngewebe aus AD-Patienten und altersangepassten Kontrollpatienten wurde innerhalb von 6 Stunden nach dem Tod gewonnen und sofort auf Trockeneis eingefroren. Probenschnitte von jedem Gewebe wurden für die histopathologische Bestätigung der Diagnose in Paraformaldehyd fixiert. Gehirnbereiche für die differentielle Expressionsanalyse wurden identifiziert (siehe 1) und bei –80°C gelagert, bis RNA-Extraktionen durchgeführt wurden.
(ii) Isolierung von Gesamt-mRNA:
Gesamt-RNA wurde aus postmortalem Gehirngewebe extrahiert, indem man den RNeasy-Kit (Qiagen) nach den Anweisungen des Herstellers verwendete. Die genaue RNA-Konzentration und die RNA-Qualität wurden mit dem DNA-LabChip-System unter Verwendung des Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) bestimmt. Für zusätzliche Qualitätstests der hergestellten RNA, d. h. Ausschluss von partiellem Abbau und Testen auf DNA-Kontamination, wurden speziell gestaltete intronische GAPDH-Oligonucleotide und genomische DNA als Referenzkontrolle verwendet, um mit der LightCycler-Technologie eine Schmelzkurve zu erzeugen, wie es in den Anweisungen des Herstellers (Roche) beschrieben ist.
(iii) cDNA-Synthese und RsaI-Verdau
Um Veränderungen in der Genexpression in verschiedenen Geweben zu identifizieren, wurde ein Screening-Verfahren eingesetzt, bei dem cDNA-Synthese, suppressive subtraktive Hybridisierung (SSH) und das Screening von Microarray-Chips mit einer Vielzahl von cDNA-Sonden aus SSH miteinander kombiniert wurden. Bei dieser Technik werden verschiedene Populationen von mRNA miteinander verglichen und Klone von Genen bereitgestellt, die in einer Population von Zellen exprimiert werden, in der anderen Population von Zellen jedoch nicht oder auf einem niedrigeren Niveau. In der vorliegenden Erfindung wurden RNA-Populationen aus ausgewählten postmortalen Hirngeweben (frontaler und temporaler Cortex) von AD-Patienten und altersangepassten Kontrollprobanden miteinander verglichen.
Als Ausgangsmaterial für die suppressive subtraktive Mikroarray-Analyse wurde Gesamt-RNA extrahiert, wie es oben beschrieben ist (ii). Für die Herstellung von cDNAs, vorzugsweise in voller Länge, wurde das auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) beruhende Verfahren "SMART-cDNA-Synthese" gemäß den Anweisungen des Herstellers (Clontech) durchgeführt. Das Prinzip der "SMART-cDNA-Synthese" wurde ausführlich beschrieben (Chenchik et al., in Gene Cloning and Analysis by RT-PCR, Hrsg. Siebert und Larrick, Biotechniques Books, Natick 1998: 305–320). Für die SMART-cDNA-Synthese wurden vier RNA-Pools hergestellt, die jeweils aus 8 μg Gesamt-RNA bestanden. Jeder Pool enthielt jeweils 2 μg von vier verschiedenen Proben, d. h. vom unteren frontalen Cortex (CF) und vom unteren temporalen Cortex (CT) von Kontrollhirnen bzw. vom unteren frontalen Cortex (PF) und vom unteren temporalen Cortex (PT) von Patientenhirnen. Eine Menge von 1 μg Gesamt-RNA-Mischung wurde in einem Reaktionsvolumen von 50 μl (PCR-Cycler: Multi Cycler PTC 200, MJ Research) verwendet. Der zweite SMART-PCR-Schritt wurde unter Verwendung von 19 Zyklen durchge führt. SuperScript II RNaseH Reverse Transcriptase und 5 × Erster-Strang-Puffer (Invitrogen) wurden verwendet.
Nach der Extraktion und Reinigung der PCR-Produkte wurde ein Restriktionsverdau mit 30 E RsaI (MBI Fermentas) während 2,5 Stunden bei 37°C durchgeführt. RsaI-Restriktionsstellen befinden sich innerhalb der universellen Primingstellen der doppelsträngigen (ds) cDNA. Die Qualität des Verdaus wurde durch Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert, die verdauten Proben wurden gereinigt (QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen), und die cDNA-Konzentrationen wurden durch UV-Spektrophotometrie (Biorad) bestimmt.
(iv) Suppressive subtraktive Hybridisierung (SSH)
Vier SMART-cDNA-Pools (iii) wurden mit Hilfe von suppressiver subtraktiver Hybridisierung miteinander verglichen. Ein Pool von cDNA, die differenziell exprimierte Gene enthielt, wird dabei als "Tester" bezeichnet, der Referenz-cDNA-Pool wird als "Driver" bezeichnet. Die beiden Pools werden hybridisiert, und alle cDNAs, die in beiden Pools vorhanden sind, werden entfernt, d. h. der Driver-Pool wird vom Tester-Pool subtrahiert. Somit werden Klone von Genen erhalten, die vorwiegend in der Testerpopulation exprimiert werden.
Der "PCR-Select cDNA Subtraction Kit" wurde verwendet, um die subtraktive Hybridisierung durchzuführen (Clontech). Die "Tester"-SMART-cDNA-Pools, die vom frontalen und temporalen Cortex (CF und CT) von Kontrollgehirnen bzw. vom frontalen und temporalen Cortex (PF und PT) von Patientengehirnen stammen (iii), wurden jeweils in zwei Pools unterteilt. Jeder Pool wurde mit dem Adapter 1 bzw. Adapter 2 ligiert, so dass man 6 verschiedene "Tester"-cDNA-Pools erhielt. Die drei "Driver"-SMART-cDNA-Pools CT, PF und PT blieben unligiert. In einem ersten Hybridisierungsschritt, der verwendet wird, um differentiell exprimierte Sequenzen anzureichern, wurden die folgenden drei verschiedenen "Tester"-SMART-cDNA-Pools mit einem Überschuss der folgenden "Driver"-SMART-cDNAs kombiniert: SSH(1): PF-"Tester" und PT-"Driver"; SSH (2): PT-"Tester" und PF-"Driver"; SSH (3): CT-"Tester" und PT-"Driver"; SSH (4): PT-"Tester" und CT-"Driver". Nach einem Denaturierungsschritt während 1,5 min bei 98°C wurde die Hybridisierung 8 Stunden lang bei 68°C durchgeführt. In einem zweiten Schritt wurden die zwei entsprechenden primären Hybridisierungsproben von "Tester"-SMART-cDNA-Pools, die mit Adapter 1 bzw. 2 ligiert waren, miteinander gemischt und 15 Stunden lang bei 68°C rehybridisiert, mit einem Überschuss des "Driver"-SMART-cDNA-Pools, wie er vorher verwendet wurde. So wurden geeignete doppelsträngige cDNAs für die anschließende Amplifikation erzeugt, d. h. mit beiden Adaptersequenzen an ihren 5'- und 3'-Enden und daher mit unterschiedlichen Assoziationsstellen. Die folgenden PCR-Schritte wurden angewendet, um effizient amplifizierte spezifische Produkte zu erhalten und um unspezifische Amplifikation zu unterdrücken. In der ersten PCR wurden fehlende Stränge der Adapter durch DNA-Polymerase-Aktivität aufgefüllt. Jeweils 1 μl der erhaltenen Hybridisierungsprodukte wurden einer PCR unter Verwendung des entsprechenden "Primers 1" (10 μM) (Clontech) zusammen mit 1 × PCR-Reaktionspuffer (Clontech), 10 mM dNTP-Mix (dATP, dGTP, dCTP, dTTP, Amersham Pharmacia Biotech) und 0,5 μl 50 × Advantage cDNA Polymerase Mix (Clontech) in einem Endvolumen von 25 μl unterzogen. Die PCR-Bedingungen wurden wie folgt eingestellt: eine Runde bei 75°C während 5 min, anschließend 27 oder 30 Zyklen: 94°C während 30 s, 64°C oder 66°C während 30 s, 72°C während 1,5 min. Dem letzten Zyklus wurde noch ein letzter Schritt bei 72°C während 5 min hinzugefügt. Eine zweite Nested-PCR wurde so durchgeführt, wie es für die erste PCR beschrieben ist, außer dass anstelle von "Primer 1" die Nested-Primer "Nested Primer 1" und "2R" verwendet wurden und eine Assoziationstemperatur von 66°C oder 68°C und 12 oder 15 Zyklen angewendet wurden. PCR-Produkte, die unter unterschiedlichen Bedingungen erhalten wurden, wurden für die anschließende Analyse in einem Pool miteinander kombiniert. Wegen der verwendeten Primersequenzen, siehe Anhang B des Anwenderhandbuchs des Herstellers (Clontech).
(v) Klonierung von subtrahierten PCR-Produkten und Produktion von DNA-Biochips
Die doppelsträngigen SSH-SMART-cDNAs der vier verschiedenen Kombinationen SSH(1)–SSH(4), siehe (iv), wurden in den pCR2.1-Vektor ligiert, und INValphaF'-Zellen wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers (TA Cloning Kit, Invitrogen) damit transformiert. Bakterienkolonien wurden herausgesucht und durch Kolonie-PCR auf MTPs (Mikrotiterplatten, 96 Napf, Abgene) mit Hilfe von "Nested Primer 1" und "Nested Primer 2" analysiert. Diejenigen MTPs, die mehr als 90% positive Klone zeigten, wurden einem präparativen Kolonie-PCR-Ansatz unterzogen. Pro Napf wurde die folgende PCR-Mischung erzeugt: Die entsprechenden Oligonucleotide "Nested Primer 1" und "Nested Primer 2" (jeweils 0,5 μM), 1 × Titanium PCR-Puffer (Clontech), 200 μM dNTP-Mix (Amersham Pharmacia Biotech), 0,2 × Titanium Taq-DNA-Polymerase (Clontech) in einem Endvolumen von 120 μl. Die PCR-Bedingungen wurden wie folgt eingestellt: eine Runde bei 94°C während 30 s zum Denaturieren, der nächsten Runde folgten 35 Zyklen: 94°C während 30 s und 68°C während 3 min. Die Qualität der amplifizierten Produkte wurde überprüft und analysiert (DNA LabChip System, Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies), und dann wurde gereinigt (Multiscreen-PCR-Purification System, Millipore).
Außerdem wurden die folgenden Standardkontrollproben erzeugt: Drei verschiedene Arabidopsis-thaliana-Gene, PolyA-DNA, Lachssperma-DNA, humane Cot-1-DNA und 3 × SSC-Puffer wurden als negative Kontrollen verwendet (Microarray Validation System, Stratagene); beta-Actin und Xenopus-cDNA wurden als normierende Kontrollen verwendet.
Mehrere MTPs wurden jeweils aus den SSH-Kombinationen SSH(1)–(4) hergestellt und beherbergten Amplifikationsprodukte von 96 verschiedenen Klonen pro Platte. Die amplifizierten Produkte wurden von GeneScan Europe dreifach auf GAPS-Objektträger (CMT-GAPS, Corning) getüpfelt.
(vi) Sondensynthese und Identifizierung von differentiell exprimierten Genen durch Screening von DNA-Biochips
A: Synthese der cDNA-Sonde
Als Ausgangsmaterial für die Erzeugung von mit Cyanin 3 (Cy3) und Cyanin 5 (Cy5) markierten cDNA-Sonden wurde Gesamt-RNA extrahiert und so verwendet, wie es oben unter (ii) und (iii) beschrieben ist. Zwei Proben einer Mischung von 2 μg Gesamt-RNA und zusätzlich 2 ng Xenopus-RNA (Standard-RNA) pro Markierungsreaktion wurden einer spezifischen Reverse-Transcriptase-Reaktion unterzogen, wodurch die PolyA-mRNA in mit Fluorescein-12-dCTP (FL) oder Biotin-11-dCTP (B) markierte cDNA umgewandelt wurde. Die vom frontalen Cortex (CF) von Kontrollgehirnen stammenden RNA-Proben wurden mit Fluorescein und die RNA aus dem temporalen Cortex (PT) von Patientengehirnen mit Biotin markiert. Die cDNA-Reaktionen wurden gemäß dem Micromax TSA Labeling Protocol (NEN Life Science) durchgeführt. Die gereinigten cDNA-Sonden wurden in Hybridisierungspuffer resuspendiert und 7 min lang bei 100°C denaturiert. Anschließend wurden die Hälfte des Volumens der Fluoresceinmarkierungsreaktion (d. h. 1 μg RNA) und die Hälfte der Menge der Biotinsonde in 5 × SSC, 0,1% SDS, 25% Formamidpuffer miteinander gemischt und gleichmäßig auf einen vorhybridisierten (5 × SSC, 0,1% SDS, 1% BSA, 45 min bei 42°C) Microarray aufgetragen. Die Arrayhybridisierung wurde über Nacht bei 42°C durchgeführt.
Nach einem Waschschritt mit hoher Stringenz wurde der Nachweis der gebundenen Fluorescein- und Biotin-markierten Sonden gemäß den Anweisungen des TSA Detection Kit Protocol (NEN Life Science) durchgeführt. Dabei bindet in einem ersten Schritt Anti-FL-HRP (Fluorescein-Meerrettich-Peroxidase) an die FL-markierte cDNA-Sonde, und HRP katalysiert die Abscheidung des fluoreszierenden Reporters Cy3-Tyramid. In einem zweiten Schritt bindet Streptavidin-HRP an die B-markierte cDNA-Sonde und katalysiert die Abscheidung des fluoreszierenden Reportermoleküls Cy5-Tyramid. Biochip 3 wurde mit cDNA-Mischung PF(Cy3) und PT(Cy5) hybridisiert. Eine Durchmusterung der Microarrays mit den geeigneten Wellenlängen (635 nm, 532 nm) erlaubte den Nachweis beider Cyaninfarbstoffe gleichzeitig.
B: Synthese der SMART-Sonde
Für die Produktion von mit Cyanin 3 (Cy3) und Cyanin 5 (Cy5) markierten SMART-cDNA-Sonden wurde das auf PCR basierende Verfahren "SMART cDNA Synthesis" so durchgeführt, wie es in Abschnitt (iii) beschrieben ist. Hier verwendeten wir Gesamt-RNA als Ausgangsmaterial, das so extrahiert wurde, wie es oben (ii) beschrieben ist. Vier RNA-Mischungen wurden so hergestellt, wie es in Abschnitt (iii) beschrieben ist. 1 μg von jeder RNA-Mischung und 1 ng Xenopus-Gesamt-RNA wurden der SMART-cDNA-Reaktion unterzogen. Wegen der PCR-Amplifikation, Extraktion und Reinigung der cDNAs, Restriktionsverdau mit RsaI und anschließenden Reinigung der verdauten Proben, siehe Abschnitt (iii).
SMART-cDNA-Proben wurden entweder mit Cy3 oder mit Cy5 (Atlas Glass Fluorescent Labeling Kit, Clontech) markiert. Im ersten Markierungsschritt wurden aliphatische Aminogruppen, d. h. Aminoallyl-dUTP (Clontech) in denaturierte (100°C, 7 min), mit RsaI verdaute PCR-Produkte eingebaut. Die Reaktion wurde durch das Klenow-Fragment (MBI Fermentas) katalysiert. In einem zweiten Markierungsschritt wurden die fluoreszierenden Reporterfarbstoffe Cy3 oder Cy5 an die eingebauten Funktionen gekoppelt. Die gereinigten, mit Cy3 und Cy5 markierten SMART-cDNA-Sonden (Atlas NucleoSpin Extraction Kit, Clontech) wurden nach 7 min Denaturierung bei 100°C in Hybridisierungspuffer (5 × SSC, 0,1% SDS, 25% Formamid) resuspendiert. Anschließend wurde die Cy3-markierte SMART-Sonde mit der Cy5-markierten SMART-Sonde gemischt, und zusammen wurden sie gleichmäßig auf einen vorhybridisierten (5 × SSC, 0,1% SDS, 1% BSA, 45 min bei 42°C) Microarray aufgetragen. Die Arrayhybridisierung wurde über Nacht bei 42°C durchgeführt. Das Waschen der Biochips mit hoher Stringenz erfolgte gemäß den Anweisungen des TSA Detection Kit Protocol (NEN Life Science). Biochip 2 wurde mit SMART-cDNA-Mischung PF(Cy3) und PT(Cy5) hybridisiert. Eine Abtastung der Microarrays mit den geeigneten Wellenlängen (635 nm, 532 nm) erlaubte den Nachweis beider Cyaninfarbstoffe gleichzeitig.
C: Synthese der Subtraktionssonde
Für die Produktion von mit Cyanin 3 (Cy3) und Cyanin 5 (Cy5) markierten SSH-cDNA-Sonden wurde das auf PCR beruhende Verfahren "SMART cDNA Synthesis" so durchgeführt, wie es in Abschnitt (iii) beschrieben ist. Hier verwendeten wir Gesamt-RNA als Ausgangsmaterial, die so extrahiert wurde, wie es oben (ii) beschrieben ist. Vier RNA-Gemische wurden so hergestellt, wie es in Abschnitt (iii) offenbart ist. Jeweils 1 μg der RNA-Mischungen wurde der SMART-cDNA-Reaktion unterzogen. Wegen der PCR-Amplifikation, Extraktion und Reinigung der cDNAs, Restriktionsverdau mit RsaI und anschließenden Reinigung der verdauten Proben, siehe Abschnitt (iii). Für die subtraktive Hybridisierung wurde der PCR-Select cDNA Subtraction Kit (Clontech) verwendet, wie es im Einzelnen in Abschnitt (iv) beschrieben ist. Die subtrahierten PCR-Produkte der Kombinationen SSH(1) und SSH(2) bzw. SSH(3) und SSH(4) wurden gereinigt (StrataClean Kit, Stratagene), und Adapter 1 und 2 wurden durch Restriktionsverdau mit RsaI und SmaI (MBI Fermentas) entfernt. Die SSH-cDNA-Pools wurden entweder mit Cy3 oder mit Cy5 (Atlas Glass Fluorescent Labeling Kit, Clontech) markiert. Im ersten Markierungsschritt wurden aliphatische Aminogruppen, d. h. Aminoallyl-dUTP (Clontech) in die denaturierten (100°C, 7 min), mit RsaI und SmaI verdauten SSH-cDNA-Produkte eingebaut. Die Reaktion wurde durch das Klenow-Fragment (MBI Fermentas) katalysiert. In einem zweiten Markierungsschritt wurden die fluoreszierenden Reporterfarbstoffe Cy3 und Cy5 an die eingebauten Funktionen gekoppelt.
Die gereinigten, mit Cy3 und Cy5 markierten SSH-cDNA-Sonden (wegen der Reinigung, siehe Atlas NucleoSpin Extraktion Kit, Clontech) wurden nach 7 min Denaturierung bei 100°C in Hybridisierungspuffer (5 × SSC, 0,1% SDS, 25% Formamid) resuspendiert. Anschließend wurde die Cy3-markierte SSH1-Sonde mit der Cy5-markierten SSH2-Sonde und die Cy3-markierte SSH3-Sonde mit der Cy5-markierten SSH4-Sonde gemischt. Jede Kombination wurde gleichmäßig auf einen vorhybridisierten (5 × SSC, 0,1% SDS, 1% BSA, 45 min bei 42°C) Microarray aufgetragen. Die Arrayhybridisierung wurde über Nacht bei 42°C durchgeführt. Das Waschen der Biochips mit hoher Stringenz erfolgte gemäß den Anweisungen des TSA Detection Kit Protocol (NEN Life Science). Biochip 1 wurde mit der cDNA-Mischung SSH(1) (Cy3) und SSH(2) (Cy5) hybridisiert. Eine Abtastung der Microarrays mit den geeigneten Wellenlängen (635 nm, 532 nm) erlaubte den Nachweis beider Cyaninfarbstoffe gleichzeitig.
(vii) Bewertung der DNA-Biochips-Daten
Fluoreszenz-Rohdaten für Cy3 und Cy5, die bei 635 bzw. 532 gemessen wurden, wurden mehrmals (für jeden der drei Flecken pro cDNA) aufgenommen. Eine Menge von Messungen wurde innerhalb der Fleckenfläche (Signal) durchgeführt, und eine weitere Menge von Messungen wurde in der Nähe durchgeführt (Hintergrund). Anschließend wurde die Nettofluoreszenzintensität (FI₆₃₅, FI₅₃₂) der Flecken wie folgt berechnet: FI635/532 = (M FIFleck – 1SD FIFleck) – (M FIHintergrund – 1SD FIHintergrund).
Bei dieser Berechnung definiert M den Medianwert der Replikatmessungen pro Fleck, SD die Standardabweichung des entsprechenden Mittelwerts. Anschließend wurden für die weitere Bewertung nur FI₆₃₅- und FI₅₃₂-Werte > 2 berücksichtigt plus diejenigen FI₆₃₅- und FI₅₃₂-Werte < 2, bei denen der entsprechende Wert für die zweite Wellenlänge > 3 war.
Analog wurden die entsprechenden Werte für die Xenopus-cDNA-Kontrolle und die Menge der Standard-Gene (Haushaltsgene) bewertet. Die Xenopus-cDNA wurde als interne Eichsubstanz für die Effizienz der cDNA-Synthese der krankheitsrelevanten mRNAs verwendet. Dann wurde aus den hintergrundskorrigierten FI_635/532-Medianwerten der drei Replikatflecken der statistische Mittelwert berechnet, und das Signalverhältnis R für die cDNA-Sonden wurde mit Hilfe der folgenden Formel abgeleitet: R635/532 = FI635,geeicht/FI532,geeicht.
In einem letzten Bewertungsschritt wurden die Ergebnisse der verschiedenen Hybridisierungen auf logische Kohärenz überprüft.
(viii) Bestätigung der differentiellen Expression durch quantitative RT-PCR:
Eine positive Bestätigung der differentiellen Expression des für Ensadin-0581 codierenden Gens wurde unter Verwendung der LightCycler-Technologie (Roche) durchgeführt. Diese Technik beinhaltet einen schnellen thermischen Wechsel für die Polymerase-Kettenreaktion sowie eine Echtzeitmessung von Fluoreszenzsignalen während der Amplifikation und ermöglicht daher eine in hohem Maße genaue Quantifizierung von RT-PCR-Produkten durch Verwendung einer kinetischen Bestimmung anstelle einer Endpunktsbestimmung. Die Verhältnisse von Ensadin-0581-cDNA aus dem temporalen Cortex und dem frontalen Cortex bzw. aus dem Hippocampus und dem frontalen Cortex wurden bestimmt (relative Quantifizierung).
Zuerst wurde eine Standardkurve erzeugt, um die Effizienz der PCR mit für das für Ensadin-0581 codierende Gen spezifischen Primern (5'-GGCACCATCTGAAAAGCCAA-3' und 5'-CCCAGTATCCAACAGTCAGAGCT-3') zu bestimmen. Eine PCR-Amplifikation (95°C während 1 s, 56°C während 5 s und 72°C während 5 s) wurde in einem Volumen von 20 μl durchgeführt, das LightCycler-FastStart-DNA-Master-SYBR-Green-I-Mischung (enthält FastStart-Taq-DNA-Polymerase, Reaktionspuffer, dNTP-Mischung mit dUTP anstelle von dTTP, SYBR-Green-I-Farbstoff und 1 mM MgCl₂, Roche), 0,5 μM Primer, 2 μl einer cDNA-Verdünnungsreihe (Endkonzentration 40, 20, 10, 5, 1 und 0,5 ng humane Gesamt-Hirn-cDNA, Clontech) und je nach den verwendeten Primern zusätzliche 3 mM MgCl₂ enthielt. Eine Schmelzkurvenanalyse ergab einen einzigen Peak bei ungefähr 80°C ohne sichtbare Primerdimere. Die Qualität und Größe des PCR-Produkts wurde mit dem DNA-LabChip-System (Agilent 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies) bestimmt. Im Elektropherogramm der Probe wurde ein einziger Peak in der erwarteten Größe von 68 bp für das Ensadin-0581-Gen beobachtet.
Analog wurde die PCR-Anweisung angewendet, um die PCR-Effizienz einer Menge von Referenzgenen zu bestimmen, die als Referenzstandard für die Quantifizierung ausgewählt wurden. In der vorliegenden Erfindung wurde der Mittelwert von fünf solchen Referenzgenen bestimmt: (1) Cyclophilin B, wobei die spezifischen Primer 5'-ACTGAAGCACTACGGGCCTG-3' und 5'-AGCCGTTGGTGTCTTTGCC-3' verwendet wurden, mit Ausnahme von MgCl₂ (weitere 1 mM wurden hinzugefügt anstelle von 3 mM). Eine Schmelzkurvenanalyse zeigte einen einzigen Peak bei ungefähr 87°C ohne sichtbare Primerdimere. Eine Agarose-Gel-Analyse des PCR-Produkts zeigte eine einzige Bande mit der erwarteten Größe (62 bp). (2) Ribosomales Protein S9 (RPS9), wobei die spezifischen Primer 5'-GGTCAAATTTACCCTGGCCA-3' und 5'-TCTCATCAAGCGTCAGCAGTTC-3' verwendet wurden (Ausnahme: weitere 1 mM MgCl₂ wurden hinzugefügt anstelle von 3 mM). Eine Schmelzkurvenanalyse zeigte einen einzigen Peak bei ungefähr 85°C ohne sichtbare Primerdimere. Eine Agarose-Gel-Analyse des PCR-Produkts zeigte eine einzige Bande mit der erwarteten Größe (62 bp). (3) β-Actin, wobei die spezifischen Primer 5'-TGGAACGGTGAAGGTGACA-3' und 5'-GGCAAGGGACTTCCTGTAA-3' verwendet wurden. Eine Schmelzkurvenanalyse zeigte einen einzigen Peak bei ungefähr 87°C ohne sichtbare Primerdimere. Eine Agarose-Gel-Analyse des PCR-Produkts zeigte eine einzige Bande mit der erwarteten Größe (142 bp). (4) GAPDH, wobei die spezifischen Primer 5'-CGTCATGGGTGTGAACCATG-3' und 5'-GCTAAGCAGTTGGTGGTGCAG-3' verwendet wurden. Eine Schmelzkurvenanalyse zeigte einen einzigen Peak bei ungefähr 83°C ohne sichtbare Primerdimere. Eine Agarose-Gel-Analyse des PCR-Produkts zeigte eine einzige Bande mit der erwarteten Größe (81 bp). (5) Transferrin-Rezeptor TRR, wobei die spezifischen Primer 5'-GTCGCTGGTCAGTTCGTGATT-3' und 5'-AGCAGTTGGCTGTTGTACCTCTC-3' verwendet wurden. Eine Schmelzkurvenanalyse zeigte einen einzigen Peak bei ungefähr 83°C ohne sichtbare Primerdimere. Eine Agarose-Gel-Analyse des PCR-Produkts zeigte eine einzige Bande mit der erwarteten Größe (80 bp).
Für die Berechnung der Werte wurde zuerst der Logarithmus der cDNA-Konzentration gegen die Schwellenzykluszahl C_t für Ensadin-0581 und die fünf Referenzstandardgene aufgetragen. Die Steigungen und Achsenabschnitte der Standardkurven (d. h. der linearen Regressionen) wurden für alle Gene berechnet. In einem zweiten Schritt wurden cDNAs aus dem temporalen Cortex und dem frontalen Cortex bzw. dem Hippocampus und dem frontalen Cortex parallel analysiert und auf Cyclophilin B normiert. Die C_t-Werte wurden gemessen und unter Verwendung der entsprechenden Standardkurven in ng Gesamt-Hirn-DNA umgerechnet: 10 ^ ((Ct-Wert – Achsenabschnitt)/Steigung)[ng Gesamt-Hirn-cDNA]
Die Werte für die Ensadin-0581-cDNAs des temporalen und frontalen Cortex bzw. die Werte für die Ensadin-0581-cDNAs des Hippocampus und des frontalen Cortex wurden auf Cyclophilin B normiert, und die Verhältnisse wurden unter Verwendung der folgenden Formeln berechnet:
In einem dritten Schritt wurde die Menge der Referenzstandardgene parallel analysiert, um den mittleren durchschnittlichen Wert der temporal-zu-frontal-Verhältnisse bzw. der Hippocampus-zu-frontal-Verhältnisse der Expressionsniveaus der Referenzstandardgene für jede individuelle Hirnprobe zu bestimmen. Da in Schritt 2 und Schritt 3 Cyclophilin B analysiert wurde und das Verhältnis von einem Gen zu einem anderen Gen in verschiedenen Durchläufen konstant blieb, war es möglich, die Werte für Ensadin-0581 auf den mittleren durchschnittlichen Wert der Menge der Referenzstandardgene zu normieren, anstatt auf ein einziges Gen allein zu normalisieren. Die Berechnung wurde durchgeführt, indem man das oben gezeigte Verhältnis durch die Abweichung von Cyclophilin B vom Mittelwert aller Haushalts-Gene dividierte. Die Ergebnisse einer solchen quantitativen RT-PCR-Analyse für das Ensadin-0581-Gen sind in den 2 und 3 gezeigt. Tabelle 1: Identifizierung von differentiell exprimierten Genen in Microarray-Hybridisierungsexperimenten

Biochip Art der Sonde Verwendete Sonden (Cy5-/Cy3-markiert) Verhältnis Fluoreszenzintensität: temporaler/frontaler Cortex

1 C PT_SSH(2)/PF_SSH(1) 1,78

2 B PT/PF 1,58

3 A PT/PF 1,94
Tabelle 2:
Tabelle 3:
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Diagnostizieren oder Prognostizieren einer neurodegenerativen Erkrankung bei einem Patienten oder zum Bestimmen, ob ein Patient ein erhöhtes Risiko hat, diese Erkrankung zu entwickeln, umfassend: Bestimmen einer Konzentration und/oder einer Aktivität von: (i) einem Transkriptionsprodukt eines Gens, das für ein Protein mit der SEQ ID Nr. 1 codiert; und/oder (ii) einem Translationsprodukt eines Gens, das für ein Protein mit der SEQ ID Nr. 1 codiert; und/oder (iii) einem Fragment oder Derivat oder einer Variante des Transcriptions- oder Translationsprodukts, wobei die Variante wenigstens 95% Sequenzidentität mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 1 aufweist; in einer Probe von dem Patienten und Vergleichen der Konzentration und/oder der Aktivität mit einem Referenzwert, der einen bekannten Krankheits- oder Gesundheitszustand darstellt, wodurch die neurodegenerative Erkrankung bei dem Patienten diagnostiziert oder prognostiziert wird oder bestimmt wird, ob der Patient ein erhöhtes Risiko hat, diese neurodegenerative Erkrankung zu entwickeln.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei der neurodegenerativen Erkrankung um die Alzheimer-Erkrankung handelt.
Kit zum Diagnostizieren oder Prognostizieren einer neurodegenerativen Erkrankung, insbesondere Alzheimer-Erkrankung, bei einem Patienten oder zum Bestimmen der Neigung oder Prädisposition eines Patienten, eine solche Krankheit zu entwickeln, wobei der Kit Folgendes umfasst: a) wenigstens ein Reagens, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgendem besteht: (i) Reagentien, die selektiv ein Transkriptionsprodukt eines Gens, das für ein Protein mit der SEQ ID Nr. 1 codiert, nachweisen, und (ii) Reagentien, die selektiv ein Translationsprodukt eines Gens, das für ein Protein mit der SEQ ID Nr. 1 codiert, nachweisen; und b) eine Anweisung zum Diagnostizieren oder Prognostizieren einer neurodegenerativen Erkrankung, insbesondere Alzheimer-Erkrankung, oder zum Bestimmen der Neigung oder Prädisposition eines Patienten, eine solche Erkrankung zu entwickeln, durch (i) Nachweisen der Konzentration oder der Aktivität oder sowohl der Konzentration als auch der Aktivität des Transkriptionsprodukts und/oder des Translationsprodukts eines Gens, das für ein Protein mit der SEQ ID Nr. 1 codiert, in einer Probe von dem Patienten; und (ii) Diagnostizieren oder Prognostizieren einer neurodegenerativen Erkrankung, insbesondere Alzheimer-Erkrankung, oder Bestimmen der Neigung oder Prädisposition des Patienten, eine solche Erkrankung zu entwickeln, wobei eine variierte Konzentration oder Aktivität oder sowohl Konzentration als auch Aktivität des Transkriptionsprodukts und/oder des Translationsprodukts im Vergleich zu einem Referenzwert, der einen bekannten Gesundheitszustand darstellt, oder eine Konzentration oder Aktivität oder sowohl Konzentration als auch Aktivität des Transkriptionsprodukts und/oder Translationsprodukts, die einem Referenzwert, der einen bekannten Krankheitszustand darstellt, ähnlich oder gleich sind, eine Diagnose oder Prognose einer neurodegenerativen Erkrankung, insbesondere Alzheimer-Erkrankung, oder eine erhöhte Neigung oder Prädisposition, eine solche Krankheit zu entwickeln, anzeigt.
Rekombinantes nichthumanes Tier, das eine nichtnative Gensequenz, die für ein Protein mit der SEQ ID Nr. 1 codiert, oder ein Fragment oder Derivat oder eine Variante davon umfasst, wobei die Variante wenigstens 95% Sequenzidentität mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 1 aufweist, wobei das Tier erhältlich ist durch: (i) Bereitstellen eines Genzielsteuerungskonstrukts, das die Gensequenz und eine Selektionsmarkersequenz umfasst; und (ii) Einführen des Zielsteuerungskonstrukts in eine Stammzelle eines nichthumanen Tiers; und (iii) Einführen der Stammzelle des nichthumanen Tiers in einen nichthumanen Embryo; und (iv) Transplantieren des Embryos in ein scheinträchtiges nichthumanes Tier; und (v) Entwickelnlassen des Embryos bis zur Reife; und (vi) Identifizieren eines genetisch veränderten nichthumanen Tiers, dessen Genom eine Modifikation der Gensequenz in beiden Allelen umfasst; und (vii) Aufziehen des genetisch veränderten nichthumanen Tiers von Schritt (vi), so dass man ein genetisch verändertes nichthumanes Tier erhält, dessen Genom eine Modifikation des endogenen Gens umfasst, wobei der Eingriff dazu führt, dass das nichthumane Tier eine Prädisposition aufweist, eine neurodegenerative Erkrankung oder verwandte Erkrankungen oder Störungen zu entwickeln.
Assay zum Suchen nach einem Modulator von neurodegenerativen Krankheiten, insbesondere Alzheimer-Erkrankung, oder verwandten Erkrankungen oder Störungen durch Screening von einer oder mehreren Substanzen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Folgenden besteht: (i) einem Gen, das für ein Protein mit der SEQ ID Nr. 1 codiert; und/oder (ii) einem Transkriptionsprodukt eines Gens, das für ein Protein mit der SEQ ID Nr. 1 codiert; und/oder (iii) einem Translationsprodukt eines Gens, das für ein Protein mit der SEQ ID Nr. 1 codiert; und/oder (iv) einem Fragment oder Derivat oder einer Variante von (i) bis (iii), wobei die Variante wenigstens 95% Sequenzidentität mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 1 aufweist; wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit einer Testverbindung; b) Messen der Aktivität und/oder der Konzentration von einer oder mehreren Substanzen, die in (i) bis (iv) genannt sind; c) Messen der Aktivität und/oder der Konzentration von einer oder mehreren Substanzen, die in (i) bis (iv) genannt sind, in einer Kontrollzelle, die nicht mit der Testverbindung in Kontakt gebracht wurde; und d) Vergleichen der Konzentrationen und/oder Aktivitäten der Substanz in den Zellen der Schritte (b) und (c), wobei eine Änderung der Aktivität und/oder der Konzentration der Substanzen in den kontaktierten Zellen anzeigt, dass die Testverbindung ein Modulator der Erkrankungen oder Störungen ist.
Verfahren zum Suchen nach einem Modulator von neurodegenerativen Erkrankungen, insbesondere Alzheimer-Erkrankungen, oder verwandten Erkrankungen oder Störungen durch Screening von einer oder mehreren Substanzen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Folgenden besteht: (i) einem Gen, das für ein Protein mit der SEQ ID Nr. 1 codiert; und/oder (ii) einem Transkriptionsprodukt eines Gens, das für ein Protein mit der SEQ ID Nr. 1 codiert; und/oder (iii) einem Translationsprodukt eines Gens, das für ein Protein mit der SEQ ID Nr. 1 codiert; und/oder (iv) einem Fragment oder Derivat oder einer Variante von (i) bis (iii), wobei die Variante wenigstens 95% Sequenzidentität mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 1 aufweist; wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) das Verabreichen einer Testverbindung an ein nichthumanes Testtier, das prädisponiert ist, eine neurodegenerative Erkrankung oder verwandte Erkrankungen oder Störungen zu entwickeln, oder bereits entsprechende Symptome entwickelt hat, in Bezug auf die Substanzen, die in (i) bis (iv) genannt sind; b) das Messen der Aktivität und/oder der Konzentration von einer oder mehreren Substanzen, die in (i) bis (iv) genannt sind; c) das Messen der Aktivität und/oder der Konzentration von einer oder mehreren Substanzen, die in (i) oder (iv) genannt sind, in einem angepassten nichthumanen Kontrolltier, das prädisponiert ist, Symptome einer neurodegenerativen Krankheit oder von verwandten Krankheiten oder Störungen zu entwickeln, oder sie bereits entwickelt hat, in Bezug auf die Substanzen, die in (i) bis (iv) genannt sind, wobei dem Kontrolltier keine solche Testverbindung verabreicht wurde; d) das Vergleichen der Aktivität und/oder der Konzentration der Substanz in den Tieren der Schritte (b) und (c), wobei eine Änderung der Aktivität und/oder der Konzentration der Substanzen bei dem Testtier anzeigt, dass die Testverbindung ein Modulator der Erkrankungen oder Störungen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Testtier und/oder das Kontrolltier ein rekombinantes Tier, das ein Gen, das für ein Protein mit der SEQ ID Nr. 1 codiert, oder ein Fragment oder ein Derivat oder eine Variante davon, wobei die Variante wenigstens 95% Sequenzidentität mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 1 aufweist, unter der Kontrolle eines transkriptionsregulatorischen Elements, bei dem es sich nicht um das native transkriptionsregulatorische Element eines Proteins mit der SEQ ID Nr. 1 handelt, exprimiert.
Assay zum Testen einer Verbindung, vorzugsweise zum Durchmustern (Screening) einer Menge von Verbindungen, zum Bestimmen des Grades der Bindung der Verbindungen an ein Translationsprodukt mit SEQ ID Nr. 1 oder an ein Fragment oder Derivat oder eine Variante davon, wobei die Variante wenigstens 95% Sequenzidentität mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 1 aufweist, wobei der Assay die folgenden Schritte umfasst: (i) Hinzufügen einer flüssigen Suspension des Translationsprodukts mit der SEQ ID Nr. 1 oder des Fragments oder Derivats oder der Variante davon, wobei die Variante wenigstens 95% Sequenzidentität mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 1 aufweist, zu einer Menge von Behältern; (ii) Hinzufügen einer nachweisbaren, insbesondere fluoreszenzmarkierten Verbindung oder einer Menge von nachweisbaren, insbesondere fluoreszenzmarkierten Verbindungen, die in Bezug auf die Bindung an die Menge von Behältern durchmustert werden sollen; (iii) Inkubieren des Translationsprodukts mit der SEQ ID Nr. 1 oder des Fragments oder Derivats oder der Variante davon und der nachweisbaren, insbesondere fluoreszenzmarkierten Verbindung oder der fluoreszenzmarkierten Verbindungen; (iv) Messen der Mengen an vorzugsweise Fluoreszenz, die mit dem Translationsprodukt mit der SEQ ID Nr. 1 oder dem Fragment oder Derivat oder der Variante davon, wobei die Variante wenigstens 95% Sequenzidentität mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 1 aufweist, verbunden ist; und (v) Bestimmen des Grades der Bindung durch eine oder mehrere der Verbindungen an das Translationsprodukt mit SEQ ID Nr. 1 oder das Fragment oder Derivat oder die Variante davon, wobei die Variante wenigstens 95% Sequenzidentität mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Proteinmolekül, das in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, oder ein Fragment oder Derivat oder eine Variante davon, wobei die Variante wenigstens 95% Se quenzidentität mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 1 aufweist, zur Verwendung als diagnostisches Target zum Nachweisen einer neurodegenerativen Erkrankung, vorzugsweise Alzheimer-Erkrankung.
Proteinmolekül, das in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, oder ein Fragment oder Derivat oder eine Variante davon, wobei die Variante wenigstens 95% Sequenzidentität mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 1 aufweist, zur Verwendung als Screening-Target für Reagentien oder Verbindungen, die eine neurodegenerative Erkrankung, vorzugsweise Alzheimer-Erkrankung, verhindern oder behandeln oder lindern.
Antikörper, der gegenüber einem Immunogen spezifisch immunreaktiv ist, wobei das Immunogen ein Translationsprodukt eines Gens, das für ein Protein mit der SEQ ID Nr. 1 codiert, oder ein Fragments oder Derivat oder eine Variante davon ist, wobei die Variante wenigstens 95% Sequenzidentität mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 1 aufweist.
Verwendung eines Antikörpers gemäß Anspruch 11 zum Nachweis eines pathologischen Zustands einer Zelle in einer Probe von einem Patienten, der das immunozytochemische Anfärben der Zelle mit dem Antikörper umfasst, wobei ein veränderter Grad der Anfärbung oder ein verändertes Anfärbungsmuster in der Zelle im Vergleich zu einer Zelle, die einen bekannten Gesundheitszustand repräsentiert, einen pathologischen Zustand der Zelle anzeigt.