JPH04320694A

JPH04320694A - ヒトグリア細胞増殖抑制因子に対するモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH04320694A
Application number: JP3118043A
Authority: JP
Inventors: Taiji Kato; 加藤　泰治; Kiyobumi Asai; 浅井　清文; Nagayoshi Kaneko; 金子　修至
Original assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1991-04-22
Filing date: 1991-04-22
Publication date: 1992-11-11

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒトグリア細胞増殖抑制
因子を特異的に認識するモノクローナル抗体に関するも
のである。

【０００２】

【発明の背景】脳を構成する細胞には大別して神経細胞
とグリア細胞が存在する。脳の働きは基本的には神経細
胞の働きによる。グリア細胞は神経細胞の働きを支持す
る。具体的には神経細胞の保護および支持作用、ミエリ
ン鞘の形成、血液脳関門の形成、神経細胞への栄養補給
、神経伝達物質の代謝、さらには脳発育過程における神
経細胞の増殖および分化作用の制御などが考えられてい
る。グリア細胞には多種多様な細胞が含まれる。中枢神
経系ではアストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミク
ログリアなどがあり、末梢神経系にはシュワン（Ｓｃｈ
ｗａｎｎ　）細胞、マントル（ｍａｎｔｌｅ）細胞など
があり、また脳室内皮に存在するエペンダイマル（ｅｐ
ｅｎｄｙｍａｌ　）細胞もグリア細胞のひとつである。

【０００３】神経細胞の増殖および分化は出生前にのみ
行なわれ、出生後は行なわれない。一方、グリア細胞の
増殖および分化は出生後もさかんに行なわれる。グリア
細胞の増殖または分化に関与する因子はこれまでに多数
知られている。例えば、アストロサイトは、血小板由来
成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、グリ
ア細胞成長因子（ＧＭＦ）、グリア成長因子（ＧＧＦ）
などの因子に反応して増殖または分化が促進される。ま
た、オリゴデンドログリアに作用する成長因子としては
、グリア促進因子（ＧＰＦ）およびインターロイキン２
（ＩＬ−２）がある（詳細については蛋白質核酸酵素，
３３巻（Ｎｏ．１０　），１６６７頁（１９８８年）参
照のこと）。

【０００４】

【従来の技術】最近、本発明者のうちの一部のものは、
レックリングハウゼン（Ｖｏｎ　Ｒｅｃｋｌｉｎｇｈａ
ｕｓｅｎ）氏病（多発性神経線維腫）患者より得られた
神経線維腫（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａ）　組織中に、
新たなヒトグリア細胞増殖抑制因子（ｇｌｉａｌ　ｇｒ
ｏｗｔｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ、以下
ヒトＧＧＩＦと略記する。）が存在することを見い出し
、部分精製を行なった。

【０００５】このヒトＧＧＩＦは神経線維腫の粗抽出液
よりアフィニティークロマト、陰イオン交換カラム、疎
水性クロマトカラム、ヒドロキシアパタイトカラムを用
いて部分精製された。該ＧＧＩＦはゲルろ過法により分
子量約１００ｋｄと推定され、また酸処理（ｐＨ２．３
　）、熱処理（１００℃、１０分間）およびパパイン処
理（３７℃、５時間）で生物活性がなくなることからタ
ンパク性の因子であると考えられる。さらに、精製過程
において本因子の生物活性は徐々に失われる傾向にあっ
たが、ＳＨ基酸化防止剤であるジチオスレイトール（ｄ
ｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を加えることにより活性
を保つことができた。

【０００６】本ヒトＧＧＩＦは、種々のグリア性細胞、
例えばラットグリオーマ細胞（Ｃ６）、ラットシュワノ
ーマ（３５４Ａ）、ヒトグリオブラストーマ（ＧＢ−１
、Ｔ９８Ｇ）、ヒトアストロサイトーマ（ＮＡＣ−１、
ＮＡＣ−２）等のＤＮＡ合成低下（すなわち、増殖抑制
）を促進させたが、神経細胞、例えばヒト神経芽腫細胞
（ＧＯＴＯ、ＴＧＷ）等には無影響であった。また本ヒ
トＧＧＩＦは、グリア細胞の増殖と分化をともに促進さ
せる因子（ＧＭＦ）との共存下において、ＧＭＦの増殖
促進作用は阻害したが、分化促進作用は阻害しなかった
。なお、本ヒトＧＧＩＦの詳細については、１９９０年
度第３３回神経化学会抄録集、２７２　頁（１９９０年
）に記載されている。

【０００７】これまでに細胞の増殖を抑制する因子は多
数知られている。例えば、トランスフォーミング成長因
子（ＴＧＦ−β）、肝の分化抑制因子（ＨＰＩ）、サプ
レッシン（ＳＰＮ）、種々のインターロイキン（ＩＬ−
１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−
６等）、インターフェロン（ＩＦＮ−α等）、ガン壊死
因子（ＴＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ
）等がある。また、グリア細胞の増殖を抑制する因子と
してもいくつか知られている。例えば、ＲｒａｉｎＲｅ
ｓ．，　４３０，　１５３（１９８７）には、マウス腹
水型神経芽腫細胞が産出するラットグリア細胞に対する
増殖抑制因子が記載されている。

【０００８】しかしながら、本ヒトＧＧＩＦは、前述の
細胞増殖抑制因子やグリア細胞の増殖抑制因子とは、因
子の物理化学的性質（分子量等）および生物活性の点か
らみて異なる因子であり、まったく新規な因子であると
考えられる

【０００９】

【発明の目的】本発明者らは、前記したＧＧＩＦをさら
に詳細に研究するために、該ＧＧＩＦに対するモノクロ
ーナル抗体を作製することを鋭意検討した。そして該Ｇ
ＧＩＦを特異的に認識するモノクローナル抗体を見い出
して本発明を完成した。先にも記載したように、本発明
のモノクローナル抗体の抗原であるヒトＧＧＩＦはまっ
たく新規な因子である。従って、本発明のモノクローナ
ル抗体は完全に新規な抗体であることは言うまでもない
。

【００１０】

【発明の構成】本発明は、ヒトＧＧＩＦを特異的に認識
するマウスモノクローナル抗体に関するものである。本
発明には、本発明の実施例で得られたモノクローナル抗
体の抗原結合部位以外の抗原結合部位を有するモノクロ
ーナル抗体も含まれる。また免疫グロブリンのクラスお
よびサブクラスも特に限定されるものではないが、好ま
しくはＩｇＧまたはＩｇＭクラスであり、特に好ましく
はＩｇＧクラスである。

【００１１】本発明に含まれるモノクローナル抗体の具
体的な例としては、Ｇ−１２Ｅ３、Ｇ−１３Ｅ２、Ｇ−
１３Ｅ８、Ｇ−１６Ｄ８、Ｇ−１６Ｄ９、Ｇ−１６Ｅ９
、Ｇ−１６Ｆ８およびＧ−１９Ｅ７が挙げられるが、本
発明はこれらのモノクローナル抗体に限定されるもので
はない。

【００１２】本発明のモノクローナル抗体は、１００μ
ｇ／ｍｌの濃度でヒトＧＧＩＦの生物活性を２０％以上
阻害する。例えば、実施例１で得られた本発明のモノク
ローナル抗体は１００μｇ／ｍｌの濃度でヒトＧＧＩＦ
の生物活性を２０〜５５％程度阻害することが確認され
ている。

【００１３】さらに、本発明のモノクローナル抗体の免
疫グロブリンのクラスおよびサブクラスは、Ｇ−１２Ｅ
３、Ｇ−１６Ｄ８、Ｇ−１６Ｄ９、Ｇ−１６Ｆ８、およ
びＧ−１９Ｅ７の６種の抗体がＩｇＧ１　・κであり、
Ｇ−１３Ｅ２がＩｇＧ２ａ・κであり、Ｇ−１６Ｅ９が
ＩｇＧ３　・κであり、そしてＧ−１３Ｅ８がＩｇＭ・
κであった。

【００１４】本発明のモノクローナル抗体は、（１）ヒ
トＧＧＩＦを免疫抗原としてマウスを感作し、（２）感
作マウス脾細胞とマウスミエローマ細胞を細胞融合し、
（３）得られたハイブリドーマよりヒトＧＧＩＦに対す
るモノクローナル抗体を産生する細胞をスクリーニング
し、（４）目的とする抗体産生ハイブリドーマをクロー
ニングし、（５）クローン化された抗体産生ハイブリド
ーマを増殖させ、（６）産生された抗体を分離精製する
ことによって調製することができる。

【００１５】より具体的に各ステップを説明すると以下
のようになる。（１）の免疫感作の肯定は、初回免疫感作時にはヒトＧ
ＧＩＦ（天然のものでも、遺伝子操作によって作製され
たものでもよい。また完全に純粋なものでも部分精製し
ただけのものでも使用できる。）を生理的食塩含有リン
酸緩衝液（以下、ＰＢＳと略記する）中に溶解し、フロ
イントの完全アジェバント（ＦＣＡ）と１：１の割合で
乳化させたものをマウスに腹腔内投与し、２週間後、同
様にヒトＧＧＩＦを含むＰＢＳをフロイントの不完全ア
ジェバント（ＦＩＣＡ）と１：１：の割合で乳化させた
ものを腹腔内投与し、さらに２週間後、ヒトＧＧＩＦを
含むＰＢＳを腹腔内投与することによって行なわれる。用いられるマウスの種類は特に限定されないが、好まし
くはＢＡＬＢ／ｃである。感作の回数および抗原の投与
量は特に限定されないが、１回につき１〜１００μｇ　
のヒトＧＧＩＦを３回投与すれば十分である。

【００１６】（２）の細胞融合は、まず（１）で免疫感
作したマウスの脾臓を摘出し、常法に従って、脾細胞の
懸濁液を調製し、次に得られた脾細胞とマウスミエロー
マ細胞との混合物に３７℃でポリエチレングリコール（
好ましくは、ＰＥＧ１５００）を加えることによって行
なわれる。マウスミエローマ細胞にはＰ３×６３Ａｇ８
、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、ＳＰ−２／０−Ａｇ
−１４など数種類が知られており、いずれも容易に入手
可能である。ミエローマ細胞はＨＡＴ培地（ヒポキサン
チン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地）では
生存できないＨＧＰＲＴ（ヒポキサンチン・グアニン・
ホスホリボシル・トランスフェラーゼ）欠損細胞株が有
用であり、さらにミエローマ細胞自身が抗体を分泌しな
い細胞株であることが望ましい。好適にはＳＰ−２／０
−Ａｇ−１４が用いられる。

【００１７】次に、得られた融合細胞の混合物を、低細
胞密度で９６マイクロウェルプレートに分注し、ＨＡＴ
培地中で培養する。１〜２週間の培養で未融合のミエロ
ーマ細胞、ミエローマ細胞同志のハイブリドーマ、さら
に未融合の脾細胞、脾細胞同志のハイブリドーマは生存
条件が満足されないため死滅し、脾細胞とミエローマ細
胞とのハイブリドーマのみが増殖してくる。

【００１８】（３）のスクリーリングは、ハイブリドー
マ培養上清中の抗ヒトＧＧＩＦ活性を測定することによ
り行なわれる。活性が減弱またはゼロとなった検体は目
的とするモノクローナル抗体を産生していると判定でき
る。

【００１９】（４）の工程は、抗体産生ハイブリドーマ
を軟寒天培養法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ，３７２　頁（１９８０）参照のこと］にした
がってクローニングすることによって行なわれる。この
際、限界希釈法を用いることも可能である。

【００２０】（５）の工程は、クローン化されたハイブ
リドーマを通常の培地で培養し、その培養上清から分離
精製することによって得られるが、より大量の抗体を効
率よく得るにはハイブリドーマをマウス腹腔内に投与し
増殖させ、その腹水中より分離精製する方法が用いられ
る。

【００２１】（６）の工程は、通常の方法、例えば塩析
、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水性ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
等により精製できるが、より効果的には、サブクラスが
ＩｇＧであるモノクローナル抗体についてはアフィゲル
プロテインＡ（Ａｆｆｉｇｅｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　
）ＭＡＳＰＩＩカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ　社製）を用い
たアフィニティークロマトグラフィーが用いられ、サブ
クラスがＩｇＭであるモノクローナル抗体についてはハ
イドロキシアパタイトカラムが用いられる。

【００２２】

【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体はヒトＧＧ
ＩＦを特異的に認識するので、ヒトＧＧＩＦの精製、例
えばアフィニティークロマトグラフィー等に利用するこ
とができる。また、本発明抗体のうち、ヒトＧＧＩＦの
活性を強力に阻害する抗体、例えば１３Ｅ２または１６
Ｄ８等は、それら自身あるいはそれらとヒトＩｇＧとの
キメラ抗体の形で、あるいはそれらをヒト型ＩｇＧに変
換した形でヒトＧＧＩＦの異常産生を伴うと考えられる
種々の疾患、例えばアルツハイマー病や各種の神経変性
疾患、例えば、小脳変性症、クロイツフェルトヤコブ病
、シュパッツ病等の治療および／または予防に用いるこ
とができる。

【００２３】さらに、本発明のモノクローナル抗体は、
ヒトＧＧＩＦの免疫学的定量法への適用によって、上述
の患者の血中や組織中のＧＧＩＦ濃度を測定することに
より病態の診断に利用することができる。また、該定量
法はヒトＧＧＩＦによる治療を必要とする疾患、例えば
脳腫瘍などの治療時に該因子をモニターするために利用
することができる。

【００２４】免疫学的定量法には一点結合測定法と二点
結合測定法（いわゆるサンドイッチ法）がよく知られて
いるが、精度および検出限界の点で二点結合測定法がす
ぐれている。二点結合測定法は、（１）固相化したヒト
ＧＧＩＦに対するモノクローナル抗体（第１抗体）に、
ヒトＧＧＩＦを含有するサンプルを添加して、該モノク
ローナル抗体とヒトＧＧＩＦを結合させ、（２）（１）
で得られた結合物にヒトＧＧＩＦに対するポリクローナ
ル抗体（第２抗体）を結合させ、（３）（２）で得られ
た結合物に、第２抗体を認識し、かつ標識物で標識され
た抗体（第３抗体）を結合させ、（４）該標識物の活性
を測定することによって、サンプル中のヒトＧＧＩＦを
測定する方法である。

【００２５】第１抗体としては、本発明のモノクローナ
ル抗体が用いられる。免疫学的定量法に用いられる固相
および固定化方法はよく知られている（千畑一郎編、固
定化酵素（１９７５年、講談社発行）参照のこと）。例
えば、固相としてはポリスチレンプレート、ポリスチレ
ンビーズ、ナイロンビーズ、ガラスビーズ、プロテイン
Ａアガロースビーズ、プロテインＧアガロースビーズ、
ポリスチレンチューブ、スタフィロコッカス・アウレウ
ス・コーワン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒ
ｅｕｓ　Ｃｏｗａｎ　）Ｉ株の死菌などが挙げられる。固定化は物理的吸着や共有結合による不溶化法が用いら
れる。第１抗体とサンプル中のヒトＧＧＩＦとの反応は
２４℃で１晩放置することで行なわれる。

【００２６】第２抗体はヒトＧＧＩＦに対するポリクロ
ーナル抗体であれば感作する動物種に制限はない。該ポ
リクローナル抗体の作製は公知の方法により行なわれる
。例えば、ヒトＧＧＩＦ（天然のものでも遺伝子操作に
よって作製されたものでもよい。また完全に純粋なもの
でも部分精製しただけのものでも使用できる。）と適当
なアジェバントとの混合物を感作動物（例えば、ラット
、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ等、
好ましくはウサギ）に適当な投与間隔で数回静脈内、皮
下または腹腔内投与して感作する。感作後血清を採取し
て、アフィニティークロマトグラフィー等により分離精
製して、所望の抗体画分を得ることにより目的とするヒ
トＧＧＩＦに対するポリクローナル抗体が作製される。第１抗体ＧＧＩＦ結合物と第２抗体との反応は２４℃で
数時間、好ましくは２時間放置することで行なわれる。

【００２７】第３抗体は第２抗体を認識する抗体であれ
ば特に制限はない。標識物としては一般に酵素が用いら
れるがラジオアイソトープ、蛍光物質も使用できる。こ
こで用いられる酵素としては一般的に酵素免疫測定に用
いられる酵素であれば何でもよく、例えば、ペルオキシ
ダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスフ
ァターゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、アルコ
ール脱水素酵素等が挙げられる。第１抗体−ＧＧＩＦ−
第２抗体の結合物と第３抗体との反応は２４℃で数時間
、好ましくは２時間放置することにより行なわれる。

【００２８】（４）の標識物の活性の測定も公知の方法
により行なわれる。例えば、第３抗体をペルオキシダー
ゼで標識した場合には基質としてオルトフェニレンジア
ミンを用いて過酸化水素を反応させ、反応生成物のＯ．
Ｄ．４９０　を測定することによって行なわれる。この
場合、基質として３−（４−ヒドロキシフェニル）プロ
ピオン酸や３，３′，５，５′−テトラメチルベンチジ
ンを使用することもできる。これ以外の場合でも適当な
基質を用いて行なわれる。

【００２９】二点結合測定法のより簡便な方法として、
第２抗体を標識物で標識し、第３抗体との反応を省略す
る方法が知られている。この場合、ヒトＧＧＩＦに対す
るポリクローナル抗体自身を標識することもできるが、
該抗体をパパインで分解したＦａｂフラグメント、ある
いはペプシンで分解したＦ（ａｂ′）２　フラグメント
、あるいは該フラグメントをさらに還元的に開裂させた
Ｆａｂ′フラグメントを標識して第２抗体として用いる
こともできる。

【００３０】さらに、前記した二点結合測定法の応用と
して、第１抗体としてヒトＧＧＩＦに対するポリクロー
ナル抗体を用い、第２抗体としてヒトＧＧＩＦに対する
モノクローナル抗体を用いて、標識された第３抗体（例
えば、標識された、マウスＩｇＧに対するポリクローナ
ル抗体）で検量する方法やあるいは該方法において、第
２抗体自身、またはそのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ
′）２フラグメント、Ｆａｂ′フラグメントを標識して
、第３抗体との反応を省略する方法も行なうことができ
る。

【００３１】また、ヒトＧＧＩＦに対するポリクローナ
ル抗体の代わりに、ヒトＧＧＩＦに対して互いに抗原認
識部位の異なる二種類のモノクローナル抗体を選び出し
、一方の抗体を第１抗体として用い、他方の抗体または
そのＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２　画分を直接、
前記の標識物で標識して第２抗体とし、第３抗体との反
応を省略するヒトＧＧＩＦの二点結合測定法も可能であ
る。

【００３２】本発明のモノクローナル抗体は一点結合測
定法によるヒトＧＧＩＦの定量方法にも用いることがで
きる。一点結合測定法は、（１）ヒトＧＧＩＦを含有す
るサンプルを固相に固定化し、（２）ヒトＧＧＩＦに対
するモノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体（
第１抗体）を添加して、ヒトＧＧＩＦと結合させ、（３
）（２）で得られた結合物に、第１抗体を認識し、かつ
標識物で標識されたポリクローナル抗体を結合させ、（
４）該標識物の活性を測定することによって行なわれる
。また第１抗体を直接前記の標識物で標識して該標識物
の活性を測定する方法も可能である。固相、固定化方法
、標識物、反応条件等は二点結合測定法に準じて任意に
選択できる。

【００３３】

【実施例】以下に実施例をあげて本発明をより具体的に
説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものでは
ない。実施例１　　ヒトＧＧＩＦに対するモノクローナル抗体（１）抗
原の精製（部分精製）レックリングハウゼン氏（Ｖｏｎ
　Ｒｅｃｋｌｉｎｇｈａｕｓｅｎ）病患者より得られた
神経線維腫の腫瘍塊（３０ｇ）をプロテアーゼインヒビ
ター（１０μＭロイペプチン、１０μＭペプスタチンＡ
、０．２　ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオライド
）および１ｍＭジチオスレイトールを含む２０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５　）（以下、バッファーＡ
と略記する。）（６０ｍｌ）中でホモジネートした後遠
心分離（２５０００　×ｇ　、１時間）して上清（８０
ｍｌ）を集めた。バッファーＡで平衡化したブルートヨ
パールカラム（東洋ソーダ社製、２２×８０ｍｍ）に上
清を添加し、バッファーＡ（１７５ｍｌ）で洗浄した後
、４Ｍ塩化ナトリウムを含むバッファーＡで溶出した。それぞれの分画についてヒトＧＧＩＦ活性（測定方法は
後述する。）を測定したところ、活性成分はすべて素通
り分画に回収された。

【００３４】次にこの活性成分を陰イオン交換カラム（
商品名ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ　、ファルマシア社
製、３２×８０ｍｍ）に吸着させ、バッファーＡにおい
て０．５　Ｍ塩化ナトリウム濃度を初期０％から最終１
００％まで経時的に変化させて溶出した（１ｍｌ／ｍｉ
ｎ）。主たる活性成分は塩化ナトリウム濃度が０．１５
Ｍ〜０．３　Ｍのところに溶出した。活性画分を集め塩
化ナトリウムを４Ｍとなるように加えた後、あらかじめ
４Ｍ塩化ナトリウムを含むバッファーＡにて平衡化した
疎水性クロマトカラム（商品名ブチルトヨパ−ル、東洋
ソーダ社製、７×２５０ｍｍ）に吸着させ、バッファー
Ａにおいて４Ｍ塩化ナトリウム濃度を初期１００％から
最終０％まで経時的に変化させて溶出した（１ｍｌ／ｍ
ｉｎ）。活性のある画分は０．２　Ｍ付近に溶出した。この画分をセントリプレップ（アミコン社製）にて０．
５ｍｌ　まで濃縮し、ハイドロキシアパタイトカラム（
三井東圧社製、７．６　×１００ｍｍ）に吸着させ、２
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して０．
５　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を初期０
％から最終１００％まで経時的に変化させて溶出した（
１ｍｌ／ｍｉｎ）。活性のある画分は素通りピークの直後に溶出した（図１
参照）。

【００３５】ヒトＧＧＩＦ活性はラットアストロサイト
ーマ細胞（Ｃ６）の増殖阻害活性を指標にして測定した
。すなわち、Ｃ６細胞１×１０５　個を１００μｌ　の
培養液（１０％ウシ胎児血清を含むＦ−１０）に懸濁し
、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社製
）にまいて３７℃４時間インキュベートした。これに被
検サンプルを１０μｌ　加え、さらにトリチウムチミジ
ン（２０ｎＣｉ／カルチャ−）を加えてさらに１６時間
培養を続けた。その後マルチセルハーベスター（ラボマ
ッシュ社製）を用いて細胞をグラスファイバーろ紙上に
採取し、乾燥させた後、液体シンチレーションカウンタ
ーを用いて高分子画分へのトリチウムチミジンの取込量
を測定した。なお、ＧＧＩＦ活性の単位は、５０％増殖
阻害を示す被検サンプルの量より算出した。例えば、１
００μｌ　培養液中に２μｌ　の被検サンプルを含むと
きに５０％増殖阻害を示した場合、この被検サンプルは
５００Ｕ／ｍｌ　［（１００μｌ　／２μｌ　）×１０
＝５００］となる。

【００３６】（２）マウスの感作前記（１）で作製したＧＧＩＦの部分精製蛋白（１００
μｇ　）（精製ＧＧＩＦとして約１０μｇ　含有してい
ると推定される。）を含有するＰＢＳ（０．５ｍｌ　）
とＦＣＡ（０．５ｍｌ　）からなるエマルジョンをＢＡ
ＬＢ／ｃ雌性マウス２匹のそれぞれに腹腔内投与した。２週間後、前回と同様に調製した、ＰＢＳに溶解したＧ
ＧＩＦの部分精製蛋白とＦＩＣＡ（１：１）からなるエ
マルジョンを腹腔内投与して追加免疫を行なった。さら
に２週間後、ＰＢＳ（１ｍｌ）に溶解したＧＧＩＦの部
分精製蛋白を腹腔内投与した。

【００３７】（３）細胞融合最終免疫から３日後に、感作マウスから脾臓を摘出し脾
細胞を調製した。得られた脾細胞とマウス骨髄腫細胞［
ＳＰ−２／０−Ａｇ１４、Ｎａｔｕｒｅ，　２７６，　
２６９　（１９７８）　記載の方法により調製した］を
１０：１の割合で混合し、ポリエチレングリコール［Ｐ
ＥＧ１５００（登録商標）、ＭＡバイオプロダクト社製
］を５０％の濃度で加えて、Ｇｏｄｉｎｇの方法［Ｊ．
　Ｉｍｍｕｎｏｌ，　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　３９，　２８
５　（１９８０）　参照のこと］に準じて細胞融合を行
なった。融合操作後の細胞混合物を、１０％ウシ胎児血
清（ＦＢＳ）、１０％ウマ血清（ＨＳ）、１０％ＮＣＴ
Ｃ１０９培地（登録商標、ＭＡバイオプロダクト社製）
、ヒポキサンチン（１３．６μｇ／ｍｌ）、チミジン（
３．９　μｇ／ｍｌ）およびグリシン（２．０　μｇ／
ｍｌ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（以下、
ＤＭＥと略記する）（４．５ｇ／ｌグルコース含有タイ
プ、ギブコ社製）を浮遊させ、９６ウェルプレートに分
注して３７℃、７％ＣＯ２　含有大気下で培養した。培
養後２、４および７日目に、培地の半量をＨＡＴ培地（
アミノプテリン０．１８μｇ／ｍｌを含有する上記イー
グル培地）に変換し培養を続けた。培養１０日目ごろよ
り、いくつかのウェルではブドウの房状のコロニーが形
成され、最終的に１４１７ウェルにおいてハイブリドー
マの増殖が認められた。

【００３８】（４）モノクローナル抗体産生株のスクリ
ーニングスクリーニングは金子らの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈ
ｅｍ．，　２６２，　６７４１　（１９８７）　記載］
に準じて行なった。すなわち、２０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）（１００μｌ　）に懸濁させた黄色
ブドウ状球菌（５μｇ　）にマウスＩｇＧに対するウサ
ギポリクローナル抗体（ＩｇＧ画分）（６０μｇ　）を
加えて、ブドウ状球菌と該抗体を結合させ、未結合の抗
体はＰＢＳによる洗浄および遠心分離（１５００×ｇ　
、１０分間）を繰り返して除いた。

【００３９】得られた結合物にハイブリドーマ培養上清
（５０μｌ　）を加えて、ＰＢＳによる洗浄および遠心
分離をした後、得られたペレットをＧＧＩＦ（３Ｕ）を
含有する２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（１０μｌ　）に
懸濁させ、室温で３０分間、さらに０℃で３０分間イン
キュベーションした後遠心分離して、得られた上清中の
ＧＧＩＦ活性を測定し、該活性が減少または消失してい
る場合をヒトＧＧＩＦに対する抗体を産生しているウェ
ルであると判定した。なお、ヒトＧＧＩＦ活性は前記（
１）に記載した方法により測定した。

【００４０】（５）抗体産生ハイブリドーマ細胞の培養
９６ウェルプレートの段階でヒトＧＧＩＦに対する抗体
を産生していると判定されたウェルは１４１７ウェル中
３２ウェルあった。そのうち、ＧＧＩＦ活性に対する阻
害活性が強いもの、または阻害活性は弱いがＧＧＩＦと
の結合力が強いと考えられるもの８ウェルを選択し、Ｋ
ｅｎｎｅｔｔ　の方法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ　，３７２　頁（１９８０）参照のこと
］に従って軟寒天培養法でクローニングした。クローン
化した細胞株名は、Ｇ−１２Ｅ３株、Ｇ−１３Ｅ２株、
Ｇ−１３Ｅ８株、Ｇ−１６Ｄ８株、Ｇ−１６Ｄ９株、Ｇ
−１６Ｅ９株、Ｇ−１６Ｆ８株およびＧ−１９Ｅ７株で
ある。

【００４１】クローン化した株細胞１０７　個をあらか
じめプリスタン処理しておいたＢＡＬＢ／ｃ雌性マウス
の腹腔内に移植した。約２週間後、腹水が大量に蓄積さ
れた時点で腹水を採取した。得られた腹水を５０％飽和
硫安で分画した後、ＩｇＧタイプのモノクローナル抗体
についてはアフィゲルプロテインＡ　　ＭＡＰＳＩＩカ
ラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ　社製）を用いたアフィニティー
カラムクロマトグラフィーで精製してＩｇＧ画分を得た
。なお、Ｇ−１２Ｅ３株、Ｇ−１３Ｅ２株、Ｇ−１３Ｅ
８株、Ｇ−１６Ｄ８株、Ｇ−１６Ｄ９株、Ｇ−１６Ｅ９
株、Ｇ−１６Ｆ８株およびＧ−１９Ｅ７株から産生され
た本発明のモノクローナル抗体は、それぞれＧ−１２Ｅ
３、Ｇ−１３Ｅ２、Ｇ−１３Ｅ８、Ｇ−１６Ｄ８、Ｇ−
１６Ｄ９、Ｇ−１６Ｅ９、Ｇ−１６Ｆ８およびＧ−１９
Ｅ７と命名した。Ｇ−１３Ｅ２株、Ｇ−１６Ｄ８株およ
びＧ−１６Ｄ９株は、微生物工業技術研究研所に、それ
ぞれ、寄託番号微工研条寄第３３５４号（ＦＥＲＭ　Ｂ
Ｐ−３３５４）、同第３３５２号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３
３５２）および同第３３５３号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３３
５３）で１９９１年４月１１日に寄託されている。

【００４２】実施例２本発明のモノクローナル抗体の諸性質（１）イムノグロブリンサブクラス実施例１で作製したモノクローナル抗体について、マウ
ス　Ｍｏｎｏ　Ａｂ−ＩＤＥＩＡキット（Ｚｙｍｅｄ　
社製）を用いてサブクラスをスクリ−ニングした。その
結果、Ｇ−１２Ｅ３、Ｇ−１６Ｄ８、Ｇ−１６Ｄ９、Ｇ
−１６Ｆ８およびＧ−１９Ｅ７の５種の抗体のサブクラ
スはＩｇＧ１　・κであり、Ｇ−１３Ｅ２のサブクラス
はＩｇＧ２ａ・κであり、Ｇ−１６Ｅ９のサブクラスは
ＩｇＧ３　・κであり、Ｇ−１３Ｅ８のサブクラスはＩ
ｇＭ・κであった。

【００４３】（２）生物学的性質実施例１で作製したモノクローナル抗体について、ヒト
ＧＧＩＦの生物活性に及ぼす効果を検討した。なお、ヒ
トＧＧＩＦ活性は実施例１（１）に記載した方法により
測定した。結果を図２に示す。図からわかるように、い
ずれの抗体も、抗体の濃度に比例して、ヒトＧＧＩＦに
対する阻害活性を示し、１００μｇ／ｍｌでは２０〜５
５％程度の阻害を示した。しかしいずれの抗体も１００
μｇ／ｍｌの濃度では完全阻害するには至らなかった。

【００４４】（３）ウエスタンブロッティング実施例１
（１）に記載した部分精製ヒトＧＧＩＦに対して、本発
明のモノクローナル抗体（Ｇ−１２Ｅ３、Ｇ−１３Ｅ２
、Ｇ−１６Ｄ８、Ｇ−１６Ｄ９、Ｇ−１６Ｅ９、Ｇ−１
６Ｆ８およびＧ−１９Ｅ７）を用いて、Ｐｒｏｃ．　Ｎ
ａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，７６
，４３５０（１９７９）　記載の方法に従ってウエスタ
ンブロッティングを行なった。いずれのモノクローナル
抗体を用いた場合も、分子量５０ｋｄ付近に強い単一の
バンドが、また分子量１００ｋｄ付近に弱い単一のバン
ドが検出された。このことからヒトＧＧＩＦは分子量約
５０ｋｄのサブユニットからなる二量体であると推定さ
れる。

【００４５】また、これらのモノクローナル抗体は、既
知の細胞増殖抑制因子のうち、ヒトＩＬ−１、ヒトＩＬ
−２、ヒトＩＬ−３、ヒトＩＬ−４、ヒトＩＬ−５、ヒ
トＩＬ−６、ヒトＧ−ＣＳＦ、ヒトＴＮＦα、ヒトＴＧ
Ｆα、ヒトＴＧＦβ１　、ヒトＩＦＮα、ラットＧプロ
テインアソシエイティッドプロテイン（ＧＡＰ）、マウ
スＥＧＦ、マウス神経成長因子（ＮＧＦ）とは交叉しな
かった。

【００４６】参考例本発明のモノクローナル抗体を用いたヒトＧＧＩＦの精
製実施例１で作製した本発明のモノクローナル抗体、Ｇ−
１６Ｄ９を、新生化学実験講座（東京化学同人発行）、
第１巻、４０３〜４０６頁に記載の方法に従って、アフ
ィゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　社製）に結合させ、抗体アフ
ィニティーカラムを作製した。このアフィニティーカラ
ム（１ｍｌ）に、実施例１（１）に記載した神経線維腫
のホモジネート上清（１ｍｌ）を添加し、２０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５　）（１５ｍｌ）で洗浄し
た後、０．５　Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５　）（１０ｍｌ）でヒトＧＧＩ
Ｆを溶出した。溶出物を、精製モノクローナル抗体、Ｇ
−１６Ｄ８を用いてウエスタンブロッティングを行なっ
た結果、分子量５０ｋｄ付近と分子量１００ｋｄ付近に
強いバンドが認められ、効率的なヒトＧＧＩＦの精製法
であることが判った。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１（１）で行なったハイドロキシアパタ
イトカラムのチャートである。

【図２】本発明のモノクローナル抗体の、ヒトＧＧＩＦ
の生物活性に及ぼす効果を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　ヒトグリア細胞増殖抑制因子を特異的
に認識するマウスモノクローナル抗体。
【請求項２】　　前記抗体の免疫グロブリンのクラスが
ＩｇＧである請求項第１項記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】　　前記抗体の免疫グロブリンのクラスが
ＩｇＭである請求項第１項記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】　　前記抗体がＧ−１２Ｅ３である請求項
第２項記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】　　前記抗体がＧ−１３Ｅ２である請求項
第２項記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】　　前記抗体がＧ−１６Ｄ８である請求項
第２項記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】　　前記抗体がＧ−１６Ｄ９である請求項
第２項記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】　　前記抗体がＧ−１６Ｅ９である請求項
第２項記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】　　前記抗体がＧ−１６Ｆ８である請求項
第２項記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】　　前記抗体がＧ−１９Ｅ７である請求
項第２項記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】　　前記抗体がＧ−１３Ｅ８である請求
項第３項記載のモノクローナル抗体。