JPH08245424A - 糖尿病性腎症診断剤 - Google Patents
糖尿病性腎症診断剤Info
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- JPH08245424A JPH08245424A JP7045459A JP4545995A JPH08245424A JP H08245424 A JPH08245424 A JP H08245424A JP 7045459 A JP7045459 A JP 7045459A JP 4545995 A JP4545995 A JP 4545995A JP H08245424 A JPH08245424 A JP H08245424A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 抗血管内皮細胞増殖因子抗体を有効成分とし
て含む糖尿病性腎症診断剤。 【効果】 本発明により、糖尿病性腎症の診断剤として
有用な抗血管内皮細胞増殖因子抗体が提供される。
て含む糖尿病性腎症診断剤。 【効果】 本発明により、糖尿病性腎症の診断剤として
有用な抗血管内皮細胞増殖因子抗体が提供される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗血管内皮細胞増殖因
子抗体を有効成分として含む糖尿病性腎症診断剤に関す
る。
子抗体を有効成分として含む糖尿病性腎症診断剤に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】血管新生、すなわち毛細血管内皮細胞の
増殖、遊走および組織への浸潤は、胎児の生長、創傷治
癒、癌細胞の増殖などの生理的または病的現象において
重要な役割を果たしていることが知られている（Folkma
n,J.,Cancer Res.46:467,1986）。その血管新生を誘導
する因子としては、直接的に血管内皮細胞に作用する物
質としては、塩基性線維芽細胞増殖因子(basic fibrobl
ast growth factor,bFGF) 、酸性線維芽細胞増殖因子(a
cidic fibroblast growth factor,aFGF)、血管内皮細胞
増殖因子／血管透過性因子(vascular endothelial cell
growth factor/vascular permeability factor,VEGF/V
PF)、血小板由来内皮細胞増殖因子(platelet-derived e
ndothelial cell growth factor,PD-ECGF)などが、また
間接的に血管内皮細胞に作用する物質としては、transf
orming growth factor-α(TGF-α)、transforming grow
th factor-β(TGF-β)、angiogenin、tumor necrosis f
actor-α(TNF-α)などが知られている（Folkman,J. & S
hing,Y.,J.Biol.Chem.,267:10931,1992）。
増殖、遊走および組織への浸潤は、胎児の生長、創傷治
癒、癌細胞の増殖などの生理的または病的現象において
重要な役割を果たしていることが知られている（Folkma
n,J.,Cancer Res.46:467,1986）。その血管新生を誘導
する因子としては、直接的に血管内皮細胞に作用する物
質としては、塩基性線維芽細胞増殖因子(basic fibrobl
ast growth factor,bFGF) 、酸性線維芽細胞増殖因子(a
cidic fibroblast growth factor,aFGF)、血管内皮細胞
増殖因子／血管透過性因子(vascular endothelial cell
growth factor/vascular permeability factor,VEGF/V
PF)、血小板由来内皮細胞増殖因子(platelet-derived e
ndothelial cell growth factor,PD-ECGF)などが、また
間接的に血管内皮細胞に作用する物質としては、transf
orming growth factor-α(TGF-α)、transforming grow
th factor-β(TGF-β)、angiogenin、tumor necrosis f
actor-α(TNF-α)などが知られている（Folkman,J. & S
hing,Y.,J.Biol.Chem.,267:10931,1992）。
【０００３】一方、糖尿病は種々の合併症を伴う疾患で
あることが知られており、神経障害、糖尿病性網膜症、
および糖尿病性腎症が三大合併症であると言われてい
る。これら合併症の発症には著しい個人差が見られるこ
とから、発症に至るには複雑な素因が影響しあっている
ものであると推測されている。近年、三大合併症の一
つ、糖尿病性網膜症において血管内皮細胞増殖因子が重
要な働きをしていることを示唆する報告がハーバード大
学らのグループによってなされた（Aiello, L.P. et a
l., The New England Journal of Medicine, 1994; 33
1: 1480-1487)。すなわち、かかる報告は、糖尿病性網
膜症などの虚血性網膜疾患において、血管内皮細胞増殖
因子が血管新生を誘起することによって病態発症に関わ
るものであることを示唆するものである。
あることが知られており、神経障害、糖尿病性網膜症、
および糖尿病性腎症が三大合併症であると言われてい
る。これら合併症の発症には著しい個人差が見られるこ
とから、発症に至るには複雑な素因が影響しあっている
ものであると推測されている。近年、三大合併症の一
つ、糖尿病性網膜症において血管内皮細胞増殖因子が重
要な働きをしていることを示唆する報告がハーバード大
学らのグループによってなされた（Aiello, L.P. et a
l., The New England Journal of Medicine, 1994; 33
1: 1480-1487)。すなわち、かかる報告は、糖尿病性網
膜症などの虚血性網膜疾患において、血管内皮細胞増殖
因子が血管新生を誘起することによって病態発症に関わ
るものであることを示唆するものである。
【０００４】網膜における微小血管障害はきわめて示唆
に富んだ知見であると思われた。すなわち、腎症の起こ
る臓器である腎臓も微小血管に富んだ臓器であるため、
微小血管が豊富な網膜で微小血管障害が起こるように、
糖尿病による合併症である微小血管障害が腎臓でも起こ
り、そこに血管内皮細胞増殖因子が関与している可能性
が推測される。従って、腎臓での血管内皮細胞増殖因子
の発現を高感度に検出することができれば、糖尿病の合
併症（腎症）の早期発見・早期治療に役立つことが期待
できる。
に富んだ知見であると思われた。すなわち、腎症の起こ
る臓器である腎臓も微小血管に富んだ臓器であるため、
微小血管が豊富な網膜で微小血管障害が起こるように、
糖尿病による合併症である微小血管障害が腎臓でも起こ
り、そこに血管内皮細胞増殖因子が関与している可能性
が推測される。従って、腎臓での血管内皮細胞増殖因子
の発現を高感度に検出することができれば、糖尿病の合
併症（腎症）の早期発見・早期治療に役立つことが期待
できる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、糖尿病性腎
症に関与すると考えられる血管内皮細胞増殖因子の検出
を目的とした糖尿病性腎症診断剤を提供することを目的
とする。
症に関与すると考えられる血管内皮細胞増殖因子の検出
を目的とした糖尿病性腎症診断剤を提供することを目的
とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】糖尿病性腎症の組織学的
特徴は、腎糸球体毛細血管基底膜の肥厚および糸球体メ
サンギウム領域の拡大であるとされている。発明者ら
は、上述のとおり糖尿病性網膜症において血管内皮細胞
増殖因子が血管新生を介して重要な役割を果しているで
あろうという知見、および血管内皮細胞増殖因子は別名
血管透過性因子（ＶＰＦ）とも呼ばれており、血管から
の高分子物質の透過を促進する活性を持つことでも知ら
れていること、すなわち、血管内皮細胞増殖因子が基底
膜やメサンギウムを構成する生体高分子物質の蓄積に関
与する可能性も存在することに着目し、鋭意研究を行っ
た。その結果、糖尿病モデルであるＧＫラットの腎臓に
おいて血管内皮細胞増殖因子濃度が有意に上昇している
ことを見い出し、本発明を完成するに至った。
特徴は、腎糸球体毛細血管基底膜の肥厚および糸球体メ
サンギウム領域の拡大であるとされている。発明者ら
は、上述のとおり糖尿病性網膜症において血管内皮細胞
増殖因子が血管新生を介して重要な役割を果しているで
あろうという知見、および血管内皮細胞増殖因子は別名
血管透過性因子（ＶＰＦ）とも呼ばれており、血管から
の高分子物質の透過を促進する活性を持つことでも知ら
れていること、すなわち、血管内皮細胞増殖因子が基底
膜やメサンギウムを構成する生体高分子物質の蓄積に関
与する可能性も存在することに着目し、鋭意研究を行っ
た。その結果、糖尿病モデルであるＧＫラットの腎臓に
おいて血管内皮細胞増殖因子濃度が有意に上昇している
ことを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明は、抗血管内皮細胞増殖
因子抗体を有効成分として含む糖尿病性腎症診断剤であ
る。以下、本発明を詳細に説明する。
因子抗体を有効成分として含む糖尿病性腎症診断剤であ
る。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】血管内皮細胞増殖因子（以下「ＶＥＧＦ」
という）に対する抗体の種類としては特に限定されず、
ポリクローナル抗体のほか、モノクローナル抗体であっ
てもよい。そして、ポリクローナル抗体又はモノクロー
ナル抗体は次のようにして製造される。
という）に対する抗体の種類としては特に限定されず、
ポリクローナル抗体のほか、モノクローナル抗体であっ
てもよい。そして、ポリクローナル抗体又はモノクロー
ナル抗体は次のようにして製造される。
【０００９】（１）ポリクローナル抗体の製造 本発明の抗ＶＥＧＦポリクローナル抗体は、例えば、ヒ
ト前骨髄性白血病細胞HL-60 より単離したＶＥＧＦのｃ
ＤＮＡ（特表平５−501350号公報）を大腸菌の中でグル
タチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合蛋白として発
現させ、得られた蛋白質を抗原として得ることができ
る。抗体は、常法に従い、該抗原によりウサギを免疫
し、抗体価の上昇した血清からＤＥＡＥのクロマトグラ
フィーでＩｇＧを分画することにより得られる。
ト前骨髄性白血病細胞HL-60 より単離したＶＥＧＦのｃ
ＤＮＡ（特表平５−501350号公報）を大腸菌の中でグル
タチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合蛋白として発
現させ、得られた蛋白質を抗原として得ることができ
る。抗体は、常法に従い、該抗原によりウサギを免疫
し、抗体価の上昇した血清からＤＥＡＥのクロマトグラ
フィーでＩｇＧを分画することにより得られる。
【００１０】例えば、免疫用ウサギには、ニュージーラ
ンドホワイト種、ジャパニーズホワイト種等が用いら
れ、免疫ウサギ１匹に対してＶＥＧＦ10〜500 μｇの量
を抗原として１〜４週間ごとに２〜10回接種し免疫を行
う。最終免疫後１〜10日目に採血し、得られる血清か
ら、免疫に用いた特異タンパク質への結合性を指標と
し、抗体価の上昇したものをクロマトグラフィーに掛
け、IgG 分画を得る。
ンドホワイト種、ジャパニーズホワイト種等が用いら
れ、免疫ウサギ１匹に対してＶＥＧＦ10〜500 μｇの量
を抗原として１〜４週間ごとに２〜10回接種し免疫を行
う。最終免疫後１〜10日目に採血し、得られる血清か
ら、免疫に用いた特異タンパク質への結合性を指標と
し、抗体価の上昇したものをクロマトグラフィーに掛
け、IgG 分画を得る。
【００１１】尚、ポリクローナル抗体が調製されたこと
の確認は、ウエスタンブロッティング法、免疫電気泳動
法、オクタロニー法等を適当に組み合わせて行うことが
できる。例えば、抗体をペルオキシダーゼと結合させ、
酵素標識抗体を得る。次に、ヒトＶＥＧＦ産生細胞であ
るHela/v5 （FERM P-13185）を培養した培養物から硫安
塩析等によりタンパク質を取り出し、得られるタンパク
質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に掛け、
上記方法により得られた抗体を反応させてウエスタンブ
ロッティングを行う。
の確認は、ウエスタンブロッティング法、免疫電気泳動
法、オクタロニー法等を適当に組み合わせて行うことが
できる。例えば、抗体をペルオキシダーゼと結合させ、
酵素標識抗体を得る。次に、ヒトＶＥＧＦ産生細胞であ
るHela/v5 （FERM P-13185）を培養した培養物から硫安
塩析等によりタンパク質を取り出し、得られるタンパク
質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に掛け、
上記方法により得られた抗体を反応させてウエスタンブ
ロッティングを行う。
【００１２】（２）モノクローナル抗体の製造 モノクローナル抗体は、マウスをヒトＶＥＧＦで免疫
し、脾細胞を取り出し、これとマウスミエローマ細胞と
を融合して得たハイブリドーマ細胞を培養することによ
り製造することができる。このハイブリドーマの製造
は、例えばKohlerとMilsteinの方法〔Nature 256:495(1
975)〕等により行うことができる。
し、脾細胞を取り出し、これとマウスミエローマ細胞と
を融合して得たハイブリドーマ細胞を培養することによ
り製造することができる。このハイブリドーマの製造
は、例えばKohlerとMilsteinの方法〔Nature 256:495(1
975)〕等により行うことができる。
【００１３】 抗体産生細胞の調製 免疫用マウスには、BALB/C、C57BL/6系マウス、C3H系マ
ウス等が用いられる。そして、免疫マウス１匹（８〜12
週齢）に対してＶＥＧＦ50〜100μｇの量を抗原として
２〜３週間ごとに２〜３回接種して免疫を行う。マウス
の飼育及び脾細胞の採取は常法に従ってよい。尚、免疫
の際には、ＶＥＧＦに例えばグルタチオンＳ−トランス
フェラーゼ等を融合させ、得られた蛋白質を抗原として
用いることもできる。
ウス等が用いられる。そして、免疫マウス１匹（８〜12
週齢）に対してＶＥＧＦ50〜100μｇの量を抗原として
２〜３週間ごとに２〜３回接種して免疫を行う。マウス
の飼育及び脾細胞の採取は常法に従ってよい。尚、免疫
の際には、ＶＥＧＦに例えばグルタチオンＳ−トランス
フェラーゼ等を融合させ、得られた蛋白質を抗原として
用いることもできる。
【００１４】 ミエローマ細胞の調製 ミエローマ細胞としては、Sp2/0-Ag14(Sp2)、P3/NS1/1-
Ag4-1(NS-1)、P3X63Ag8U.1 等が挙げられる。これら細
胞の継代培養は常法に従う。 細胞融合 脾細胞とミエローマ細胞とを１：１〜10：１の割合で混
合し、分子量1000〜4000のポリエチレングリコール（以
下ＰＥＧという）、ダルベッコ改変イーグル培地中、両
細胞を30〜40℃、１〜３分間インキュベートすることに
より細胞融合を行うことができる。
Ag4-1(NS-1)、P3X63Ag8U.1 等が挙げられる。これら細
胞の継代培養は常法に従う。 細胞融合 脾細胞とミエローマ細胞とを１：１〜10：１の割合で混
合し、分子量1000〜4000のポリエチレングリコール（以
下ＰＥＧという）、ダルベッコ改変イーグル培地中、両
細胞を30〜40℃、１〜３分間インキュベートすることに
より細胞融合を行うことができる。
【００１５】 ハイブリドーマの選択 融合細胞（ハイブリドーマ）の選択は、ヒポキサンチン
（10-3〜10-5Ｍ）、アミノプテリン（10-6〜10-7Ｍ）、
チミジン（10-5〜10-6Ｍ）、ペニシリン（100〜200単位
／ml）、牛胎児血清（10〜20％）、ストレプトマイシン
（100〜200μg/ml）、２−メルカプトエタノール（10-5
〜10-6Ｍ）を含む基礎培地を用いて培養し、生育してく
る細胞をハイブリドーマとして選択することができる。
基礎培地としては、動物細胞の培養に一般に用いられる
ＲＰＭＩ１６４０培地、イーグルＭＥＭ培地、イスコフ
改変ダルベッコ培地等が用いられる。
（10-3〜10-5Ｍ）、アミノプテリン（10-6〜10-7Ｍ）、
チミジン（10-5〜10-6Ｍ）、ペニシリン（100〜200単位
／ml）、牛胎児血清（10〜20％）、ストレプトマイシン
（100〜200μg/ml）、２−メルカプトエタノール（10-5
〜10-6Ｍ）を含む基礎培地を用いて培養し、生育してく
る細胞をハイブリドーマとして選択することができる。
基礎培地としては、動物細胞の培養に一般に用いられる
ＲＰＭＩ１６４０培地、イーグルＭＥＭ培地、イスコフ
改変ダルベッコ培地等が用いられる。
【００１６】 ハイブリドーマの培養 ハイブリドーマのクローン化は、限界希釈法により、少
なくとも２回繰り返して行う。ハイブリドーマを通常の
動物細胞の培養と同様にして培養すれば、培地中に抗体
が産生される。通常、５〜10×105個／mlのハイブリド
ーマ細胞を、牛胎児血清（10％）、ペニシリン（100単
位／ml）、ストレプトマイシン（100μg/ml）、２−メ
ルカプトエタノール（５×10-5Ｍ）を含むＲＰＭＩ１６
４０培地中で５％ＣＯ2存在下、37℃、３〜４日間培養
することによって培養液中に抗体が分泌、蓄積される。
また、ハイブリドーマ細胞をBALB/C系マウスの腹腔内に
移植して増殖することにより、腹水中に本発明の抗体を
蓄積させることもできる。
なくとも２回繰り返して行う。ハイブリドーマを通常の
動物細胞の培養と同様にして培養すれば、培地中に抗体
が産生される。通常、５〜10×105個／mlのハイブリド
ーマ細胞を、牛胎児血清（10％）、ペニシリン（100単
位／ml）、ストレプトマイシン（100μg/ml）、２−メ
ルカプトエタノール（５×10-5Ｍ）を含むＲＰＭＩ１６
４０培地中で５％ＣＯ2存在下、37℃、３〜４日間培養
することによって培養液中に抗体が分泌、蓄積される。
また、ハイブリドーマ細胞をBALB/C系マウスの腹腔内に
移植して増殖することにより、腹水中に本発明の抗体を
蓄積させることもできる。
【００１７】 モノクローナル抗体の精製 ハイブリドーマ細胞の培養液中又は腹水中に蓄積したモ
ノクローナル抗体は以下のようにして採取され、精製さ
れる。即ち、従来から用いられている硫安分画法、ＰＥ
Ｇ分画法、陰イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾
過クロマトグラフィーを用いる方法である。また、プロ
テインＡやプロテインＧ等のアフィニティークロマトグ
ラフィーによる方法も利用できる。
ノクローナル抗体は以下のようにして採取され、精製さ
れる。即ち、従来から用いられている硫安分画法、ＰＥ
Ｇ分画法、陰イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾
過クロマトグラフィーを用いる方法である。また、プロ
テインＡやプロテインＧ等のアフィニティークロマトグ
ラフィーによる方法も利用できる。
【００１８】モノクローナル抗体の選別には、酵素免疫
測定法、ウエスタンブロッティング法等が用いられる。
また、モノクローナル抗体のＩｇＧアイソタイプの決定
は、モノクローナル抗体の酵素免疫測定法又はオクタロ
ニー法によって行うことができる。
測定法、ウエスタンブロッティング法等が用いられる。
また、モノクローナル抗体のＩｇＧアイソタイプの決定
は、モノクローナル抗体の酵素免疫測定法又はオクタロ
ニー法によって行うことができる。
【００１９】（４）糖尿病性腎症診断剤 本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は糖尿病性腎症診断剤として使
用可能である。例えば、ＥＬＩＳＡ法等により、検体
（腎組織）中のＶＥＧＦを検出することを特異目的とし
て本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を用いることができる。尚、
固相への固定用及び検出用として使用する上記抗ＶＥＧ
Ｆ抗体としては、ともにポリクローナル抗体、ともにモ
ノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体とモノクロ
ーナル抗体との組み合わせのいずれをも用いることがで
きる。
用可能である。例えば、ＥＬＩＳＡ法等により、検体
（腎組織）中のＶＥＧＦを検出することを特異目的とし
て本発明の抗ＶＥＧＦ抗体を用いることができる。尚、
固相への固定用及び検出用として使用する上記抗ＶＥＧ
Ｆ抗体としては、ともにポリクローナル抗体、ともにモ
ノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体とモノクロ
ーナル抗体との組み合わせのいずれをも用いることがで
きる。
【００２０】〔試験例〕本発明の抗ＶＥＧＦ抗体が糖尿
病性腎症診断剤として有効であることを裏付ける試験例
を以下に説明する。
病性腎症診断剤として有効であることを裏付ける試験例
を以下に説明する。
【００２１】（１）試験材料の調製 糖尿病モデル動物としてＧＫラットを用いた。ＧＫラッ
トは、Wistarラットから耐糖能の低下を指標に選抜交配
を繰り返すことにより育成された系であり、慢性高血糖
状態のインシュリン非依存性の糖尿病モデルである（鈴
木研一ら、糖尿病動物：1987; 5; 125-133) 。糖尿病合
併症としては、６ヵ月齢ＧＫラットにて尿中アルブミン
が有意に増加し、メサンギウム基質、糸球体毛細血管基
底膜へのアルブミン沈着が観察され、光学顕微鏡的及び
電子顕微鏡的に腎糸球体毛細血管基底膜の肥厚も観察さ
れる（松野雅博ら、糖尿病動物：1991; 5; 154-157) 。
27週齢のＧＫラットおよび対照の正常ラットの腎臓を摘
出し、それぞれ緩衝液中にてホモジナイズして、遠心分
離した上清をあらかじめ総蛋白定量して検体とした。
トは、Wistarラットから耐糖能の低下を指標に選抜交配
を繰り返すことにより育成された系であり、慢性高血糖
状態のインシュリン非依存性の糖尿病モデルである（鈴
木研一ら、糖尿病動物：1987; 5; 125-133) 。糖尿病合
併症としては、６ヵ月齢ＧＫラットにて尿中アルブミン
が有意に増加し、メサンギウム基質、糸球体毛細血管基
底膜へのアルブミン沈着が観察され、光学顕微鏡的及び
電子顕微鏡的に腎糸球体毛細血管基底膜の肥厚も観察さ
れる（松野雅博ら、糖尿病動物：1991; 5; 154-157) 。
27週齢のＧＫラットおよび対照の正常ラットの腎臓を摘
出し、それぞれ緩衝液中にてホモジナイズして、遠心分
離した上清をあらかじめ総蛋白定量して検体とした。
【００２２】（２）ＥＬＩＳＡ測定系 抗ＶＥＧＦ抗体を96穴のイムノアッセイプレートに吸着
させ、２％ウシ血清アルブミンでコートし、これを測定
プレートとした。各穴に測定サンプルを入れ、室温で２
時間置いた後、穴をＰＢＳ（phosphate buffered salin
e)にて６回洗浄する。これにペルオキシダーゼで標識し
た抗ＶＥＧＦ抗体を加え、室温で１時間置いた後、穴を
ＰＢＳで９回洗浄する。この後各穴にペルオキシダーゼ
酵素基質を加えて反応させ、発色を測定することによっ
てサンプル中のＶＥＧＦを測定した。ＶＥＧＦの濃度
は、ヒトＶＥＧＦ121 を標準物質として求めた検量線か
ら推定した。ヒトとラットとの種差に起因する抗体の抗
原への反応性の違いによって、求めたＶＥＧＦの絶対量
は影響を受けている可能性があるが、測定値同士の相対
的関係は保持されていると考えられる。従って、本発明
者らが見い出した「糖尿病性腎症においてＶＥＧＦ量が
上昇する」という知見には何ら影響を及ぼすものではな
い。
させ、２％ウシ血清アルブミンでコートし、これを測定
プレートとした。各穴に測定サンプルを入れ、室温で２
時間置いた後、穴をＰＢＳ（phosphate buffered salin
e)にて６回洗浄する。これにペルオキシダーゼで標識し
た抗ＶＥＧＦ抗体を加え、室温で１時間置いた後、穴を
ＰＢＳで９回洗浄する。この後各穴にペルオキシダーゼ
酵素基質を加えて反応させ、発色を測定することによっ
てサンプル中のＶＥＧＦを測定した。ＶＥＧＦの濃度
は、ヒトＶＥＧＦ121 を標準物質として求めた検量線か
ら推定した。ヒトとラットとの種差に起因する抗体の抗
原への反応性の違いによって、求めたＶＥＧＦの絶対量
は影響を受けている可能性があるが、測定値同士の相対
的関係は保持されていると考えられる。従って、本発明
者らが見い出した「糖尿病性腎症においてＶＥＧＦ量が
上昇する」という知見には何ら影響を及ぼすものではな
い。
【００２３】５匹の健常ラットおよび５匹のＧＫラット
の腎組織抽出液中のＶＥＧＦ濃度を表１に示す。それぞ
れの測定結果を、健常ラット群とＧＫラット群とに分け
てプロットした散布図を図１に示した。単位は、ヒトＶ
ＥＧＦ121 を標準物質として求めた検量線から読み取っ
たもの（補正値）である（pg/ml 抽出液) 。それぞれの
群の測定結果を統計処理し（表２）、ｔ検定を行った結
果、ＧＫラットでのＶＥＧＦ値の上昇は統計的に有意で
あることが示された（ｐ＝0.037 ）。
の腎組織抽出液中のＶＥＧＦ濃度を表１に示す。それぞ
れの測定結果を、健常ラット群とＧＫラット群とに分け
てプロットした散布図を図１に示した。単位は、ヒトＶ
ＥＧＦ121 を標準物質として求めた検量線から読み取っ
たもの（補正値）である（pg/ml 抽出液) 。それぞれの
群の測定結果を統計処理し（表２）、ｔ検定を行った結
果、ＧＫラットでのＶＥＧＦ値の上昇は統計的に有意で
あることが示された（ｐ＝0.037 ）。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【表２】
【００２６】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。
明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。
【００２７】〔実施例１〕抗ＶＥＧＦポリクローナル抗
体の作製 単離したヒトＶＥＧＦのｃＤＮＡを、グルタチオンＳ−
トランスフェラーゼ（GST）との融合蛋白（GST-VEGF）
として大腸菌で発現させることにより抗原として使用す
る蛋白を得た。次いで、得られた蛋白を抗原として常法
に従って抗ＶＥＧＦポリクローナル抗体を作製した。す
なわち、15週齢のニュージーランドホワイトウサギに上
記タンパク質200μgをフロイントのコンプリートアジュ
バントとともに２週おきに５回接種し、免疫した。
体の作製 単離したヒトＶＥＧＦのｃＤＮＡを、グルタチオンＳ−
トランスフェラーゼ（GST）との融合蛋白（GST-VEGF）
として大腸菌で発現させることにより抗原として使用す
る蛋白を得た。次いで、得られた蛋白を抗原として常法
に従って抗ＶＥＧＦポリクローナル抗体を作製した。す
なわち、15週齢のニュージーランドホワイトウサギに上
記タンパク質200μgをフロイントのコンプリートアジュ
バントとともに２週おきに５回接種し、免疫した。
【００２８】最終免疫３日後にウサギから採血し、室温
にて血液を凝固させた後、上清を遠心分離し、血清を得
た。抗体価の測定は、次のようにして行った。即ち、イ
ムノプレートに抗原タンパクを固定し、ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）でブロッキングしたものに500〜16000倍
希釈した血清を添加し、室温で１時間反応させた後、Ｐ
ＢＳで６回洗浄した。洗浄後、ペルオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）標識した抗ウサギＩｇＧ抗体液を添加し、室温で１
時間反応させた後、ＰＢＳで９回洗浄した。洗浄後、Ｐ
ＯＤの酵素基質液を添加し、発色を比較した。
にて血液を凝固させた後、上清を遠心分離し、血清を得
た。抗体価の測定は、次のようにして行った。即ち、イ
ムノプレートに抗原タンパクを固定し、ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）でブロッキングしたものに500〜16000倍
希釈した血清を添加し、室温で１時間反応させた後、Ｐ
ＢＳで６回洗浄した。洗浄後、ペルオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）標識した抗ウサギＩｇＧ抗体液を添加し、室温で１
時間反応させた後、ＰＢＳで９回洗浄した。洗浄後、Ｐ
ＯＤの酵素基質液を添加し、発色を比較した。
【００２９】次に、抗体価の上昇した血清サンプル20ml
をDEAE陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥ52；ワッ
トマン社製）に掛けた。条件は血清を67mＭリン酸バッ
ファー（pH8.25，電導度1.7 mΩ-1）に対して透析した
後ＤＥ52に通し、素通りした画分を画分とした。更に
レジンを電導度5.0mΩ-1に調製した同バッファーで洗浄
し、その画分を画分とした。その結果、画分及び画
分に分画された抗ＶＥＧＦポリクローナル抗体を得
た。
をDEAE陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥ52；ワッ
トマン社製）に掛けた。条件は血清を67mＭリン酸バッ
ファー（pH8.25，電導度1.7 mΩ-1）に対して透析した
後ＤＥ52に通し、素通りした画分を画分とした。更に
レジンを電導度5.0mΩ-1に調製した同バッファーで洗浄
し、その画分を画分とした。その結果、画分及び画
分に分画された抗ＶＥＧＦポリクローナル抗体を得
た。
【００３０】さらに、ＧＳＴに反応する抗体を除く目的
で、ＧＳＴを固定化したカラムを通して素通り画分を得
る、又は、ＶＥＧＦに反応する抗体を得る目的で、ＶＥ
ＧＦを固定化したカラムを通して吸着画分を得るといっ
た方法で、より精製度の高い抗ＶＥＧＦポリクローナル
抗体も得た。
で、ＧＳＴを固定化したカラムを通して素通り画分を得
る、又は、ＶＥＧＦに反応する抗体を得る目的で、ＶＥ
ＧＦを固定化したカラムを通して吸着画分を得るといっ
た方法で、より精製度の高い抗ＶＥＧＦポリクローナル
抗体も得た。
【００３１】〔実施例２〕抗ＶＥＧＦモノクローナル抗
体の作製 （１）ＶＥＧＦモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマの作製 単離したヒトＶＥＧＦのｃＤＮＡを、グルタチオンＳ−
トランスフェラーゼ（GST）との融合蛋白（GST-VEGF）
として大腸菌で発現させることにより抗原として使用す
る蛋白を得た。
体の作製 （１）ＶＥＧＦモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマの作製 単離したヒトＶＥＧＦのｃＤＮＡを、グルタチオンＳ−
トランスフェラーゼ（GST）との融合蛋白（GST-VEGF）
として大腸菌で発現させることにより抗原として使用す
る蛋白を得た。
【００３２】次いで、得られた蛋白を抗原として常法に
従ってマウスモノクローナル抗体を作製した。すなわ
ち、GST-VEGF(100μg)をフロイント完全アジュバントと
等量混合し、該混合物をBALB/Cマウスの腹腔内に０日、
14日後、25日後の３回投与することにより免疫したマウ
スの脾細胞とマウスミエローマ細胞（SP2）とをポリエ
チレングリコール存在下で１分間インキュベーションす
ることにより細胞融合させた。得られた融合細胞をＨＡ
Ｔ培地〔ヒポキサンチン（１×10-4Ｍ）、アミノプテリ
ン（４×10-7Ｍ）、チミジン（1.6×10-5Ｍ）、ペニシ
リン（100単位／ml）、ストレプトマイシン（100μg/m
l）、牛胎児血清（20％）、２−メルカプトエタノール
（２×10-5Ｍ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地〕中で培養
することによりハイブリドーマを選別した。得られたハ
イブリドーマは限界希釈法によりクローニングした。
従ってマウスモノクローナル抗体を作製した。すなわ
ち、GST-VEGF(100μg)をフロイント完全アジュバントと
等量混合し、該混合物をBALB/Cマウスの腹腔内に０日、
14日後、25日後の３回投与することにより免疫したマウ
スの脾細胞とマウスミエローマ細胞（SP2）とをポリエ
チレングリコール存在下で１分間インキュベーションす
ることにより細胞融合させた。得られた融合細胞をＨＡ
Ｔ培地〔ヒポキサンチン（１×10-4Ｍ）、アミノプテリ
ン（４×10-7Ｍ）、チミジン（1.6×10-5Ｍ）、ペニシ
リン（100単位／ml）、ストレプトマイシン（100μg/m
l）、牛胎児血清（20％）、２−メルカプトエタノール
（２×10-5Ｍ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地〕中で培養
することによりハイブリドーマを選別した。得られたハ
イブリドーマは限界希釈法によりクローニングした。
【００３３】一方、ヒトＶＥＧＦを産生する酵母を、単
離したヒトＶＥＧＦのｃＤＮＡを含む環状ＤＮＡを酢酸
リチウム法で酵母Saccharomyces cerevisiaeに導入する
ことにより作成し、この酵母の培養液中から陽イオン交
換クロマトグラフィー（東ソー製；TSK-SP650）、硫安
沈殿及びゲル濾過クロマトグラフィー（ファルマシア
製；Superdex-75）を行うことにより、酵母由来のヒト
ＶＥＧＦを調製した。かかる酵母由来のヒトＶＥＧＦと
クローン化したハイブリドーマの培養上清の反応性を酵
素免疫測定法により調べ、酵母由来のヒトＶＥＧＦと反
応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを
選択した。またこのハイブリドーマが産生するモノクロ
ーナル抗体をMV303と命名した。尚、得られたモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマは、通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-14347として
寄託されている。
離したヒトＶＥＧＦのｃＤＮＡを含む環状ＤＮＡを酢酸
リチウム法で酵母Saccharomyces cerevisiaeに導入する
ことにより作成し、この酵母の培養液中から陽イオン交
換クロマトグラフィー（東ソー製；TSK-SP650）、硫安
沈殿及びゲル濾過クロマトグラフィー（ファルマシア
製；Superdex-75）を行うことにより、酵母由来のヒト
ＶＥＧＦを調製した。かかる酵母由来のヒトＶＥＧＦと
クローン化したハイブリドーマの培養上清の反応性を酵
素免疫測定法により調べ、酵母由来のヒトＶＥＧＦと反
応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを
選択した。またこのハイブリドーマが産生するモノクロ
ーナル抗体をMV303と命名した。尚、得られたモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマは、通商産業省工
業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-14347として
寄託されている。
【００３４】（２）抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の調
製 選択したハイブリドーマをヌードマウスの腹腔内に移植
し、モノクローナル抗体を大量に含む腹水を採取した。
この腹水中からプロテインＧアフィニティーカラム（MA
bTrap GII、ファルマシア社製）を用いてモノクローナ
ル抗体を精製した。また抗体のクラスを抗マウス免疫グ
ロブリンサブクラス特異的抗体を用いた酵素免疫測定法
により調べた結果、MV303抗体のクラスはIgG2aであっ
た。
製 選択したハイブリドーマをヌードマウスの腹腔内に移植
し、モノクローナル抗体を大量に含む腹水を採取した。
この腹水中からプロテインＧアフィニティーカラム（MA
bTrap GII、ファルマシア社製）を用いてモノクローナ
ル抗体を精製した。また抗体のクラスを抗マウス免疫グ
ロブリンサブクラス特異的抗体を用いた酵素免疫測定法
により調べた結果、MV303抗体のクラスはIgG2aであっ
た。
【００３５】
【発明の効果】本発明により、糖尿病性腎症診断薬とし
て有用な抗ＶＥＧＦ抗体が得られる。
て有用な抗ＶＥＧＦ抗体が得られる。
【図１】腎臓の組織抽出液中のＶＧＥＦ濃度を、健常ラ
ット群およびＧＫラット群別にそれぞれプロットした散
布図である。
ット群およびＧＫラット群別にそれぞれプロットした散
布図である。
Claims (1)
- 【請求項１】 抗血管内皮細胞増殖因子抗体を有効成分
として含む糖尿病性腎症診断剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7045459A JPH08245424A (ja) | 1995-03-06 | 1995-03-06 | 糖尿病性腎症診断剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7045459A JPH08245424A (ja) | 1995-03-06 | 1995-03-06 | 糖尿病性腎症診断剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08245424A true JPH08245424A (ja) | 1996-09-24 |
Family
ID=12719950
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7045459A Pending JPH08245424A (ja) | 1995-03-06 | 1995-03-06 | 糖尿病性腎症診断剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08245424A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001036972A3 (en) * | 1999-11-16 | 2002-01-03 | Genentech Inc | Elisa for vegf |
| JP2006030183A (ja) * | 2004-07-07 | 2006-02-02 | F Hoffmann La Roche Ag | １型および２型糖尿病に対する、ｐ１ｇｆに基づく多重マーカーパネル |
| JP2006265145A (ja) * | 2005-03-23 | 2006-10-05 | Okayama Univ | 糖尿病性腎症の治療用医薬組成物 |
-
1995
- 1995-03-06 JP JP7045459A patent/JPH08245424A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001036972A3 (en) * | 1999-11-16 | 2002-01-03 | Genentech Inc | Elisa for vegf |
| JP2003515136A (ja) * | 1999-11-16 | 2003-04-22 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | Ｖｅｇｆに対するエライザ |
| US6855508B2 (en) | 1999-11-16 | 2005-02-15 | Genentech, Inc. | ELISA for VEGF |
| US7541160B2 (en) | 1999-11-16 | 2009-06-02 | David Tai Wai Fei | ELISA for VEGF |
| JP2006030183A (ja) * | 2004-07-07 | 2006-02-02 | F Hoffmann La Roche Ag | １型および２型糖尿病に対する、ｐ１ｇｆに基づく多重マーカーパネル |
| JP2006265145A (ja) * | 2005-03-23 | 2006-10-05 | Okayama Univ | 糖尿病性腎症の治療用医薬組成物 |
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