JP2011523352A - 抗hmga1モノクローナル抗体、それらの作製のための方法およびhmga1の定量のためのそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】肥満および糖尿病などの病変におけるインスリン抵抗性の新しい治療アプローチのためおよび/または予防/診断/治療のためのツールを提供する。
【解決手段】本発明は、高速移動群A1タンパク質(HMGA1)に対するモノクローナル抗体のパネルおよびそれらを作製するための方法、ならびに生体液中またはリンパ球細胞に由来するタンパク質溶解産物中のHMGA1の定量のための前記抗体の使用に関する。 本発明はまた、HMGA1タンパク質の発現に関連する危険因子を評価するための診断キットに関する。
【選択図】図1
【解決手段】本発明は、高速移動群A1タンパク質(HMGA1)に対するモノクローナル抗体のパネルおよびそれらを作製するための方法、ならびに生体液中またはリンパ球細胞に由来するタンパク質溶解産物中のHMGA1の定量のための前記抗体の使用に関する。 本発明はまた、HMGA1タンパク質の発現に関連する危険因子を評価するための診断キットに関する。
【選択図】図1
Description
本発明は、高速移動群A1タンパク質(HMGA1)に対するモノクローナル抗体のパネルおよびそれらを作製するための方法、ならびにHMGA1タンパク質の発現に関連する危険因子を評価するための診断キットの開発に関する。
HMGA構造タンパク質は、真核生物における遺伝子発現の活性化を調節する核生化学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。増殖および分化過程を調節するうえでのこれらのタンパク質の役割の可能性は、HMGAタンパク質がヒトにおいていくつかのタイプの新生物の病因に関与するという所見によって裏付けられる。インスリン受容体(IR)の遺伝子発現の調節へのこれらのタンパク質の関与の可能性が最近記述され、インスリン作用の生理病理学および、ホルモンシグナルの伝達におけるその役割という仮説が立てられた。
癌および、しばしば腫瘍性疾患に結びつく、インスリン抵抗性の一部の状態(2型糖尿病および肥満)で、ホルモンおよび増殖シグナルの伝達においてHMGAタンパク質が果たす正確な役割を理解するために、適合された生物学的および分子的試験が実施されてきた。HMGAタンパク質によるIRの遺伝子発現の調節に関する研究は、インスリン抵抗性症候群の生理病理学的理解において、ならびにIRの欠損およびインスリンシグナルの伝達異常を有する個体でのその他の病的状態において適切である。
いくつかの実験証拠は、癌において異常発現されるHMGAタンパク質が、癌でその変化が頻繁に起こり、形質転換された表現型の発現と維持のために重要であると思われる、インスリン様増殖因子(IGF)(IRはその成分の1つである)系の機能的調節において役割を有し得ることを示す。
IGF系の調節不全を導く分子的因子の説明は、新しい抗腫瘍治療の開発における重要な支援となり得る。IGFの変化を引き起こす腫瘍マーカーの同定およびそれらの生物学的機能の理解は、この疾患の診断と治療における重要な要素であり得る。
増殖シグナルの伝達におけるHMGAタンパク質の分子的役割の理解は、従って、選択的な抗腫瘍治療の創製のために新たな示唆を与えることができるであろう。
HMGA核タンパク質のファミリー(高速移動群A)は、HMGA1a、HMGA1bおよびHMGA2として知られる低分子量(約11kDa)の3つのタンパク質から成る。これらのタンパク質は一般に転写活性クロマチンに関連する。タンパク質HMGA1aとHMGA1bは同じ遺伝子によってコードされ、染色体6p21に位置しており、選択的スプライシング機構の結果として発現される。タンパク質HMGA1aとHMGA1bは、11アミノ酸の内部領域が異なる。その代わりに、タンパク質HMGA2は、実際上染色体12q14.3に位置する異なる遺伝子によってコードされる。タンパク質HMGA1およびHMGA2の遺伝子は物理的に異なる染色体上に位置するが、それにもかかわらずそれらは相同である。HMGA遺伝子は胚発生の間に高発現され、反対に、細胞および完全に分化した組織ではそれらの発現レベルは低下する。
HMGAタンパク質は約100アミノ酸残基から成り、互いに高度に相同である。それらは、「ATフック」と呼ばれる3つのDNA結合ドメインの存在によって特徴づけられる。これらの部位は、二重螺旋の副溝のレベルでアデニンおよびチミンに富むDNA配列に選択的に結合する。HMGAタンパク質は、DNAの構造修飾の誘導および他の核タンパク質との相互作用を介して遺伝子活性を調節するそれらの能力のゆえに、しばしば「構造転写因子」と定義される。
実際に、それらの固有の柔軟性のために、HMGAタンパク質は特異的なタンパク質−DNA相互作用またはタンパク質間相互作用に干渉し、クロマチンの構造変化および、数多くの遺伝子の発現を調節する、プロモーター/エンハンサーDNA配列上の「エンハンセオソーム」と呼ばれる高分子量(高次)の立体特異的複合体の形成の両方を誘導する。
HMGAタンパク質はクロマチンタンパク質のネットワークにおける重要な節と見なされるが、それらの役割および生理的/病理学的意味はあまり明らかではない。このため、これらのタンパク質をコードする遺伝子がより高いレベルで発現される(トランスジェニックマウス)かまたは発現されない(ノックアウト)、動物または細胞モデルが実験室において作製されてきた。
HMGAタンパク質はクロマチンタンパク質のネットワークにおける重要な節と見なされるが、それらの役割および生理的/病理学的意味はあまり明らかではない。このため、これらのタンパク質をコードする遺伝子がより高いレベルで発現される(トランスジェニックマウス)かまたは発現されない(ノックアウト)、動物または細胞モデルが実験室において作製されてきた。
実験的細胞および/またはトランスジェニック動物モデルは、いくつかのタイプの腫瘍に関して、腫瘍性形質転換におけるHMGAタンパク質の役割を明らかにした。この所見は非常に明白であり、認められたHMGAタンパク質の高濃度は、腫瘍性形質転換およびより高い転移の可能性についての実際のマーカーとみなすことができる。例えば、HMGA1の発現レベルの上昇は、前立腺、甲状腺、子宮頸、結腸−直腸、膵臓、乳房および卵巣腫瘍などの種々のタイプの腫瘍の診断マーカーとして示唆されてきた。全体として、これらの所見は腫瘍性形質転換および腫瘍転移進行におけるHMGAタンパク質の役割を有効に支持する。
HMGA2タンパク質についての実験的細胞および/またはノックアウト動物モデルは、HMGA2の部分的または完全な欠損を有するマウスが、食餌による肥満の誘導に対して抵抗性であることを明らかにし、脂肪細胞の増殖におけるHMGA2タンパク質の役割を示唆し、この遺伝子を肥満の治療における可能性のある標的として提案した。実際に「ピグミー」ノックアウトマウスは、その大きさのかなりの縮小(野生型マウスにおけるよりも約60%小さい)によって特徴づけられる脂肪組織の病変と表現型異常を呈する。このHMGA2タンパク質の完全なまたは部分的欠失は、脂肪組織の重度の欠損に関連する身体寸法の縮小を生じさせる。
HMGA1タンパク質についての実験的ノックアウト動物モデルは、2型糖尿病に関連する心肥大を示し、心筋細胞の増殖およびグリシド代謝の調節におけるHMGA1タンパク質の役割を示唆する。
従って、これらのタンパク質が、その構造的および機能的特徴により、いかにして細胞において重要な役割を果たし、DNAおよび他の核タンパク質の両方と相互作用して、数多くの生理的過程(成長、増殖、分化、アポトーシス)および病的過程(肥満、腫瘍の増殖と進行)に影響を及ぼすかは明らかである。
また、HMGAタンパク質が、シスエレメントの立体配座変化を誘導し、他の転写因子と直接相互作用して隣接する核因子を相互に連結する、遺伝子調節に関与することは公知である。
特に、ウイルス感染後のヒトINF−βの転写誘導の研究は、HMGA1の2つの分子が協力してこの遺伝子のエンハンサー領域に結合し、二本鎖DNAのアロステリック立体配座を変化させて、それによりNF−kBおよびATF−2/c−Junのハウジングを可能にすることを示した。このようにしてエンハンセオソームの構築が開始し、HMGA1と転写活性化因子の間でのタンパク質間相互作用を介してその形成が完了する。この多タンパク質構造の構築の結果として、様々な転写因子の活性化ドメインが、転写を誘導する、CREB結合タンパク質(CBP)ならびにP/CAFおよびRNAポリメラーゼIIホロ酵素などのそれに関連するタンパク質を動員することができる新たな活性化表面を作製する。その後、CBPによって媒介されるHMGA1のアセチル化がDNAに対するHMGA1の親和性の低下を生じさせ、その結果としてエンハンセオソームの破壊を引き起こす。従ってHMGA1タンパク質は、ヒトINF−βの遺伝子発現を調節するうえでの実際の分子スイッチとして挙動する。
HMGA1タンパク質の発現は、免疫系の遺伝子が発現される、リンパ球の活性化の間または炎症応答において一時的に誘導される。
成体組織では、HMGA1タンパク質の発現はサイレントであるかまたは著明に低下する。ヒトインスリン受容体の遺伝子発現の調節へのHMGA1タンパク質の関与は完全には説明されていないが、HMGA1タンパク質は、他の転写因子(Sp1およびC/EBPβ)と結合することにより、IR遺伝子の転写を制御する核タンパク質複合体の構築を画策することができると思われる。
インスリンの生物学的作用における最初の段階は、標的細胞の細胞質膜上に位置する糖タンパク質、インスリン受容体(IR)とのその相互作用であり、その役割はインスリン作用の生理病理学において必須である。末梢組織(筋、肝臓および脂肪)のレベルでのインスリン抵抗性は、糖尿病の病因・病態(aetiopathogenesis)における主要な特徴である。糖尿病の高い罹患率を有する集団に関して実施された研究は、インスリン抵抗性(同じ代謝効果を得るために、どの程度より多くの量のインスリンが必要とされるかを示す、糖代謝の特定の状態)が本格的な糖尿病の発症に先行し、この疾患についての実際の予測マーカーを構成することを示す。多くの糖尿病患者においてIRは正常であり、インスリン作用の欠陥は受容体後である。また別の症例(2型糖尿病を有する患者の10%超)では、機能的異常および/またはIR遺伝子のコード領域のレベルでの特異的な遺伝的欠陥の存在によるIRの発現異常が存在する。これらの症例の多くにおいて、異常な受容体タンパク質の合成を決定する点突然変異または欠失が存在する。その代わりに、別の症例では、遺伝子は正常であり、欠陥は、IR遺伝子の機能調節に関与する他の遺伝子に影響を及ぼす異常(トランスでの欠陥)によるものである。
本発明の目的は、肥満および糖尿病などの病変におけるインスリン抵抗性の新しい治療アプローチのためおよび/または予防/診断/治療のためのツールを提供することである。
本発明の目的はまた、腫瘍性疾患の診断および/または観測のためのツールを提供することである。
本発明の目的はさらに、肥満および糖尿病などの病変におけるインスリン抵抗性の新しい治療アプローチのためおよび/または予防/診断/治療のためのツールとして使用されるのに適した生成物のクラスを提供することである。
本発明のさらなる目的は、長期化した高インスリン血症を有する個体における癌の予防としての、インスリン抵抗性の新しい治療アプローチのためおよび/または予防/診断/治療のための生成物のクラスを提供することである。
本発明の目的はまた、HMGA1の生理的レベルを回復するための方法である。
本発明のさらなる目的は、細胞においてHMGA1の生理的レベルを回復するための特異的発現ベクターの使用である。
本発明のもう1つの目的は、生体液中のHMGA1タンパク質を認識し、それに結合して、その存在を測定することができる組換え抗HMGA1モノクローナル抗体のパネルを提供することである。
本発明のもう1つの目的は、組換え抗HMGA1モノクローナル抗体を選択するための方法である。
本発明のさらにもう1つの目的は、組換え抗HMGA1モノクローナル抗体の作製と発酵のための方法、ならびにインスリン抵抗性病変の診断および/または予防のためのキットの使用である。
以下でより詳細に説明されるこれらや他の目的およびさらなる利点は、肥満および糖尿病などの病変におけるインスリン抵抗性の新しい治療アプローチのためおよび/または予防/診断/治療のためのツールの実現ならびにツールとして使用されるのに適した生成物のクラスの実現を通して達成される。
HMGA1タンパク質がヒトIRをコードする遺伝子に関連すること、および特異的調節タンパク質(しばしば、Sp1およびC/EBPβなどの他の公知の転写因子と共に立体特異的多タンパク質複合体の形態で組織化される)がHMGA1タンパク質を含むことの証拠は、HMGA1タンパク質は、IR遺伝子のプロモーター領域に結合することにより、Sp1およびC/EBPβのこのレベルで、動員を介してその転写を活性化することができると主張することを可能にする。
高レベルのIRを有する細胞(IM−9ヒトリンパ芽球様細胞およびHepGwヒト肝細胞癌細胞)におけるHMGA1の機能的阻害は、これらの細胞の細胞質膜上での受容体の発現を有意に低下させることができる。逆に、低レベルのIRを有する細胞におけるHMGA1の発現誘導は受容体タンパク質の発現を上昇させ、HMGA1タンパク質がIR遺伝子の転写活性化において重要な役割を果たすことを明らかにする。
IR発現の欠損が、IR遺伝子の突然変異不在で、インスリン抵抗性症候群および2型糖尿病を有する患者において報告されている。これらのすべての症例において、受容体異常は、ほとんど常にその後に、インスリン作用によって標的される組織のレベルでのホルモンシグナルの伝達異常が起こり、その結果として正常な生化学的プロセスの変化を伴う。
これらの所見は、低いIRレベルを有し、IR遺伝子の遺伝子突然変異が存在しない個体におけるインスリン抵抗性および2型糖尿病の形態でのHMGA1タンパク質の病因的関与の可能性という仮説を可能にする。この仮説は、低いIRレベルを有する一部の糖尿病個体の細胞および組織に関して得られた所見に基づくものであり、個体では、HMGA1の発現が極めて低く、Sp1およびC/EBPβによるIRプロモーターのトランス活性化が健常対照被験者の細胞および組織で認められるよりも有意に低かった。
本発明は、従ってまた、HMGA1遺伝子のアンチセンス配列をコードすることができる、Ad−Yasと呼ばれるアデノウイルス構築物に関する。HMGA1のコード化を抑制することができるこのウイルスはまた、ヒトまたはラットの、未分化癌に由来する様々な甲状腺細胞株(AROおよびFB−1など)の死を導くことができるが、正常な甲状腺細胞の死は誘導しない。その代わりに、同じ細胞を対照アデノウイルス構築物に感染させた場合には作用は得られなかった。
従って、その態様の1つによれば、本発明は、HMGA1タンパク質のアデノウイルス構築物に関する。
粘着末端を作製するために制限酵素HindIIで切断した後、1,500塩基対(bp)の長さを有するHMGA1のcDNAをベクターpac−CMVpLpaにセンス(s)およびアンチセンス(as)方向で挿入し、以下の構築物:Pac−CMV−HMGAls pac−CMV−HMGAlasを作製した。両方の構築物をアデノウイルスpJM17と共にヒト胚腎293(HEK−293)細胞株(ATCC番号:CRL−1573)に同時トランスフェクトし、細胞内でのベクターの融合により、最終的構築物Ad5CMV−HMGA1(Y)s(Ad−Ys)およびAd5CMV−HMGA1(Y)as(Ad−Yas)を作製する。(Ad−Ys)または(Ad−Yas)に感染させた細胞株HEK−293(ATCC)を感染の36〜40時間後に溶解し、ウイルス力価を測定する。
従って、そのもう1つの態様によれば、本発明は組換えHMGA1タンパク質に関する。組換えHMGA1は、好ましくはヒスチジンまたはGSTなどの尾部もしくはタグまたは精製のための等価物を提示し得る。
従って、そのもう1つの態様によれば、本発明は精製HMGA1タンパク質に関する。
特に、精製HMGA1タンパク質を、このタンパク質に対する抗体の産生を刺激するためにBALB/cマウスを免疫するのに使用した。前記マウスの免疫は、高い抗体力価を得るために、好ましくは3回のサイクルで、好ましくは腹腔内注射を介して実施した。細胞融合操作に使用する脾臓を採取するために前記免疫マウスを犠死させた。
従って、本発明はまた、免疫マウスの脾細胞と不死化細胞株の融合によって得られるハイブリドーマに関し、好ましくは、前記不死化細胞株は腫瘍性であり、好ましくは、前記不死化細胞株はマウスであり、より好ましくは、前記マウス細胞株は免疫グロブリンを分泌しない骨髄腫であり、さらに一層好ましくは、前記非分泌性骨髄腫のマウス細胞株は、例えばNSO(免疫グロブリンを分泌しないBALB/cマウスのマウス骨髄腫細胞株)である。好ましくは、脾細胞とマウス細胞株の融合の操作はPEG1500の存在下で実施される。特に、免疫マウスの脾臓を、均質化後に、骨髄腫細胞と融合し、適切な培養条件下に置く。
前記適切な培養条件は、例えば、前記ハイブリドーマの増殖のための適切な培地の使用、例えばDMEM、より好ましくはHATおよびHybridimaxを添加したDMEM培地の使用から成り、さらに一層好ましくは、添加物を含む前記DMEMは、培地の総容量に対して少なくとも10%のHATおよび2%のHybridimaxを含有する。
上述したように作製されたハイブリドーマは、HMGA1タンパク質に対するmAb(モノクローナル抗体)を産生する。HMGA1タンパク質に対する認識および結合の高い親和性を有するmAbを得るため、ハイブリドーマの細胞を、マルチウエルプレートでの平板培養を介して制限増殖条件下に置いた。前記平板培養操作は、各々のウエルについて、HMGA1に対する1つの種類の抗体だけを特異的に発現するクローン株を産生する。
従って、そのもう1つの態様によれば、本発明はまた、クローン集団および個々のクローンの増殖と選択の方法、ならびに組換え抗HMGA1抗体を精製するための方法に関する。
好ましくは、増殖方法は、特殊なマルチウエルプレートで前記ハイブリドーマを平板培養し、増殖させ、収集することから成る。
本発明のさらなる態様は、前記増殖方法によって生成された細胞クローンの選択および同定である。好ましくは、前記選択および同定は、間接ELISAおよびアイソタイプ分析による、一次および二次の2つの連続工程で達成される。従って、40クローンを一次工程から陽性として同定し、二次工程から32クローンを同定する。前記培養方法による安定化後、32のクローンの群から、表1に列挙する20クローン、特に15、詳細には4クローンを選択し、これらの中で特に2G16または21G6(従って本明細書では2G16と21G6という用語は正確に同じクローンを指す)として同定されたものを2008年3月18日に「Centro Biotecnologie Avanzate」(CBA)in Genoa,Italyに以下の番号:PD 08001で寄託した。
本発明のもう1つの目的は、上述した培養、増殖、選択および同定の前記方法に従って、前記の好ましいクローン2G16(PD 08001)によって産生されたクローンの亜集団、好ましくは、2008年3月18日にCentro Biotecnologie Avanzate(CBA)in Genoa,Italyに以下の番号:PD 08002で寄託された、21G6/18としても同定されるクローン2G16/18(従って本明細書では2G16/18と21G6/18という用語は正確に同じクローンを指す)の亜集団である。
特に、本発明のさらなる目的は、あらゆる単一選択クローンによって産生され、かつ精製工程を介してHMGA1タンパク質を対象とするモノクローナル抗体である、前記細胞クローンによって産生される抗体のパネルである。前記精製工程は、クロマトグラフィーによって、より好ましくはアフィニティークロマトグラフィーによって、さらに一層好ましくはHiTrap−Proteina Gカラム(General Electric)でのアフィニティークロマトグラフィーによって実施される。
本発明に従って生産される抗HMGA1 mAbはIgG型である。アイソタイプの評価は、好ましくはISOTRIPキットの指示に従って実施される。
さらなる目的は、HMGA1タンパク質に対する前記mAbの工業的生産の方法であり、好ましくは、前記生産方法はバイオリアクターにおいて、より好ましくは12.5Kdaのカットオフ値を有するminiPerm/Viva Science Sartoriusバイオリアクターにおいて実施される。特に、前述した内容に従ってパネルから選択される任意のクローン細胞を、無血清培地(SFM)およびハイブリドーマ用完全培地、好ましくは75%濃度のSFMおよび25%濃度のハイブリドーマ用完全培地を含む一定容量の培地に接種し、増殖させる。
本発明のさらなる目的は、前述したようなクロマトグラフィーによる、HMGA1タンパク質に対するmAbの精製である。
本発明のもう1つの目的は、前述したクローンパネルからのmAbの任意の1つを使用した生体液中のHMGA1の定量であり、好ましくは、定量は精製mAb 2G16/18を用いて実施される。前述した方法に従って得られる前記mAb 2G16/18を、未変性条件および還元条件下でのSDS−PAGEによって、ならびにウエスタンブロット分析(WB)によってさらに特徴づけた。分子量はIgGクラスのもの、すなわち約150Kdであり、WBは、選択した抗体がHMGA1に対して特異的であることを明らかにした。好ましくは、生体液中のHMGA1の定量は、競合型のELISAによって実施される。
精製抗体21G6/18を、生体液中のHMGA1を定量するためのアッセイの調製に使用した。アッセイは、抗原に対する特異的抗体の存在下で、固相中のHMGA1と溶液中のHMGA1の間での結合の競合に基づく競合的ELISAである。HMGA1濃度の定量は、精製HMGA1タンパク質を使用して得られる標準曲線に対して試料を定量化して実施する。最初のアッセイは、マルチウエルプレートを被覆するために使用するHMGA1の量を決定するためおよび抗体の標準曲線を作成するために実施した。種々のタンパク質濃度を、種々の抗体濃度を有するマイクロタイタープレートに分注し、被覆のために使用すべきHMGA1の最適濃度が0.5μg/ml(0.05ml/ウエル)であり、最適抗体濃度が0.002μg/mlであることを確認した。ペルオキシダーゼに結合した二次抗体の最良希釈を最適化するため、標準抗体の4つの濃度を研究し、二次抗体の希釈を変化させた。選択した希釈は1:2000であった。
アッセイおよび結果の再現性と精度を評価するため、マトリックスの等価性に関する検討も実施し、抗体標準曲線の希釈緩衝液への10%および20%血清の添加の影響を研究して、好ましくは、適切な条件は10%である。
アッセイの感受性を定義するため、HMGA1の標準曲線を、mAbの任意の1つ、例えば21G6/18を10μg/mlから0.001μg/mlの間の様々な濃度のHMGA1タンパク質と共にインキュベートすることによって決定した。HMGA1の0.01〜0.1μg/mlの区間で用量反応曲線を得た。アッセイの感受性は、生体液中またはリンパ球細胞に由来するタンパク質溶解産物中のHMGA1の定量を許容するものである。
好ましくは、各々のアッセイは以下の同時分析を企図する:
−種々の濃度(二重/三重盲検評価で8−2−0.5−0.125−0.031−0.0078−0.002−0μg/ml)の精製HMGA1に関して得られる標準競合曲線
−希釈せずに、かつ1:2希釈して評価される分析試料
−スパイクを添加した分析試料[スパイクは、回復の完全性を明らかにするために溶液に添加する既知量の分析物を意味する]。
生体液を定量するための数値の決定のために、以下を計算するための分析を実施した:
−標準曲線の競合パーセンテージの平均値
−相対濃度の対数
−補間法による線形回帰
−勾配およびr2。
−種々の濃度(二重/三重盲検評価で8−2−0.5−0.125−0.031−0.0078−0.002−0μg/ml)の精製HMGA1に関して得られる標準競合曲線
−希釈せずに、かつ1:2希釈して評価される分析試料
−スパイクを添加した分析試料[スパイクは、回復の完全性を明らかにするために溶液に添加する既知量の分析物を意味する]。
生体液を定量するための数値の決定のために、以下を計算するための分析を実施した:
−標準曲線の競合パーセンテージの平均値
−相対濃度の対数
−補間法による線形回帰
−勾配およびr2。
アッセイは、0.96<r2<1の間のr2値に関しておよび予想される既知の値の25%未満の変動でHMGA1のスパイクの回復を示す分析試料に関して信頼できる。アッセイは、分析する試料、例えば検査し得る生体液の試料、例えばリンパ球成分などの、前記液体の成分中に存在するHMGA1の濃度を計算するための曲線を得ることを可能にする。HMGA1の定量のためのアッセイは、約0.035μg/mlの測定限界の感受性を示す。
本発明のさらなる目的は、生体液中またはリンパ球細胞に由来するタンパク質溶解産物中のHMGA1タンパク質の濃度に関してレベル間の関係をアッセイによって確認するための方法である。
本発明はまた、2型糖尿病および肥満などの、インスリン抵抗性に密接に関係する一部の病変の存在(または素因)をアッセイによって確認するための方法に関する。特に、アッセイは、HMGA1タンパク質の低レベルと、多大の社会的および医学的影響を及ぼすインスリン抵抗性病変の発症の素因(または本格的な存在)との間の関係の測定を可能にする。表2に示す結果の場合には、健常被験者についての値は7.5〜18.7μg/ml(平均±SEM、11.51±0.79、n=15)にわたる濃度区間内にあり、一方インスリン抵抗性被験者については、同じ値は2.9〜7.5μg/ml(平均±SEM、5.92±0.31、n=17)にわたる濃度区間内にある(P<0.0001)。
本発明はまた、構築物および組換え抗HMGA1モノクローナル抗体の使用に関する。
本発明の目的はまた、肥満および糖尿病などのインスリン抵抗性に関連する病変の予防/診断/治療のためのキットを含む。
前記説明に基づき、本発明は以下の態様および目的から成る:
・HMGA1タンパク質をコードする遺伝子のセンスおよびアンチセンス配列をコードする組換えアデノウイルス構築物の作製
・作製したアデノウイルス構築物によるHEK−293細胞株の感染
・HEK−293細胞からの組換えHMGA1タンパク質の精製
・BALB/cマウスにおける精製組換えHMGA1タンパク質の接種および免疫
・犠死させた免疫マウスからの脾臓の切除
・採取した脾細胞と腫瘍細胞、好ましくは免疫グロブリンを分泌しない骨髄腫の細胞との融合を介したハイブリドーマの作製
・適切な増殖および培養条件下での、すなわちマルチウエルプレートでの平板培養を介した、ハイブリッド細胞のプールの増殖
・最良クローンを同定するための、ELISAによって得たクローンパネルの一次選択(1回目のスクリーニング)
・最良クローンの同定および限界増殖条件でのさらなる選択工程である二次選択(2回目のスクリーニング)
・アイソタイプの評価
・クロマトグラフィーによる抗HMGA1 mAbの精製
・バイオリアクターでの生産およびその後のクロマトグラフィーによる抗HMGA1 mAbの精製
先の箇所で述べたようにして得られたmAbの使用を介した、生体液中またはリンパ球細胞に由来するタンパク質溶解産物中のHMGA1の量を測定するためのアッセイ
生体液中およびリンパ球細胞に由来するタンパク質溶解産物中のHMGA1タンパク質の濃度に関してのレベル間の関係、ならびに糖尿病または肥満などのインスリン抵抗性に関連する病変の存在または何らかの素因を評価するための方法
・肥満、糖尿病などのインスリン抵抗性に関連する病変の予防/診断/治療のためのキット。
・HMGA1タンパク質をコードする遺伝子のセンスおよびアンチセンス配列をコードする組換えアデノウイルス構築物の作製
・作製したアデノウイルス構築物によるHEK−293細胞株の感染
・HEK−293細胞からの組換えHMGA1タンパク質の精製
・BALB/cマウスにおける精製組換えHMGA1タンパク質の接種および免疫
・犠死させた免疫マウスからの脾臓の切除
・採取した脾細胞と腫瘍細胞、好ましくは免疫グロブリンを分泌しない骨髄腫の細胞との融合を介したハイブリドーマの作製
・適切な増殖および培養条件下での、すなわちマルチウエルプレートでの平板培養を介した、ハイブリッド細胞のプールの増殖
・最良クローンを同定するための、ELISAによって得たクローンパネルの一次選択(1回目のスクリーニング)
・最良クローンの同定および限界増殖条件でのさらなる選択工程である二次選択(2回目のスクリーニング)
・アイソタイプの評価
・クロマトグラフィーによる抗HMGA1 mAbの精製
・バイオリアクターでの生産およびその後のクロマトグラフィーによる抗HMGA1 mAbの精製
先の箇所で述べたようにして得られたmAbの使用を介した、生体液中またはリンパ球細胞に由来するタンパク質溶解産物中のHMGA1の量を測定するためのアッセイ
生体液中およびリンパ球細胞に由来するタンパク質溶解産物中のHMGA1タンパク質の濃度に関してのレベル間の関係、ならびに糖尿病または肥満などのインスリン抵抗性に関連する病変の存在または何らかの素因を評価するための方法
・肥満、糖尿病などのインスリン抵抗性に関連する病変の予防/診断/治療のためのキット。
[実施例]
実験部分
実験部分
[実施例1]
[組換えアデノウイルス構築物の作製]
1,500塩基対(bp)の長さを有するHMGA1のcDNAをベクターpac−CMVpLpaにセンス(s)およびアンチセンス(as)方向で挿入し、制限酵素HindIIで切断した後、粘着末端を利用して組換え構築物:pac−CMV−HMGAls およびpac−CMV−HMGAlasを作製した。得られたベクターとアデノウイルスpJM17をヒト胚腎細胞株HEK293(ATCC)に同時トランスフェクトし、組換えウイルス構築物Ad5CMV−HMGA1(Y)s(Ad−Ys)およびAd5CMV−HMGA1(Ad−Yas)を作製した。ウイルス株をHEK293細胞において増殖させ、注入の36〜40時間後に収集した後、溶解した。ウイルス力価を測定し、HEK293細胞におけるプラーク形成単位(pfu)を評価した。ベクターAdCMV−lacZ(Ad−lacZ)(Quantum Biotechnology)を対照として使用した。
1,500塩基対(bp)の長さを有するHMGA1のcDNAをベクターpac−CMVpLpaにセンス(s)およびアンチセンス(as)方向で挿入し、制限酵素HindIIで切断した後、粘着末端を利用して組換え構築物:pac−CMV−HMGAls およびpac−CMV−HMGAlasを作製した。得られたベクターとアデノウイルスpJM17をヒト胚腎細胞株HEK293(ATCC)に同時トランスフェクトし、組換えウイルス構築物Ad5CMV−HMGA1(Y)s(Ad−Ys)およびAd5CMV−HMGA1(Ad−Yas)を作製した。ウイルス株をHEK293細胞において増殖させ、注入の36〜40時間後に収集した後、溶解した。ウイルス力価を測定し、HEK293細胞におけるプラーク形成単位(pfu)を評価した。ベクターAdCMV−lacZ(Ad−lacZ)(Quantum Biotechnology)を対照として使用した。
[組換えHMGA1タンパク質の作製]
HMGA1bのcDNAをプラスミドpET2c/Hisにクローニングした。大腸菌BL21株の細胞を発現ベクターpET2c/His−Hmga1bで形質転換し、LB中で増殖させた。1Mイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)(Promega)200μlを添加することによってタンパク質の発現を誘導した。細菌を、フッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)、プロテアーゼ阻害剤(Roche)およびTriton X−100を添加した冷PBS(140mM NaCl、20mMリン酸ナトリウム、pH7.4)20ml中に最終濃度1%で再懸濁した。フレンチプレスを使用して細菌の溶解を実施した。硫酸ニッケル活性化樹脂を溶解試料の上清に添加した。PBS中最終濃度500mMのイミダゾールから成る溶液で溶出を実施した。
HMGA1bのcDNAをプラスミドpET2c/Hisにクローニングした。大腸菌BL21株の細胞を発現ベクターpET2c/His−Hmga1bで形質転換し、LB中で増殖させた。1Mイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)(Promega)200μlを添加することによってタンパク質の発現を誘導した。細菌を、フッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)、プロテアーゼ阻害剤(Roche)およびTriton X−100を添加した冷PBS(140mM NaCl、20mMリン酸ナトリウム、pH7.4)20ml中に最終濃度1%で再懸濁した。フレンチプレスを使用して細菌の溶解を実施した。硫酸ニッケル活性化樹脂を溶解試料の上清に添加した。PBS中最終濃度500mMのイミダゾールから成る溶液で溶出を実施した。
[BALB/cマウスの免疫]
精製組換えHMGA1タンパク質を使用して、7週齢の3匹の雌性BALB/cマウスを免疫した。マウスに、融合の60日前に腹腔内経路で不完全フロイントアジュバント中のタンパク質50μgを注射した。同じ操作を同じ条件で30日後に実施した。マウス血清中の抗体力価を、処置動物の尾から採取した試料から間接ELISAによって測定した。タンパク質50μgのさらなる注射を、融合の3日前に1:10,000より高い抗体力価を示した動物に関して実施した。
精製組換えHMGA1タンパク質を使用して、7週齢の3匹の雌性BALB/cマウスを免疫した。マウスに、融合の60日前に腹腔内経路で不完全フロイントアジュバント中のタンパク質50μgを注射した。同じ操作を同じ条件で30日後に実施した。マウス血清中の抗体力価を、処置動物の尾から採取した試料から間接ELISAによって測定した。タンパク質50μgのさらなる注射を、融合の3日前に1:10,000より高い抗体力価を示した動物に関して実施した。
[ハイブリドーマの作製および1回目の限界希釈(LD)]
60日間の免疫の終了時にマウスを犠死させ、無菌条件下で各々の動物から脾臓を採取して、ハイブリドーマの形成用と凍結用の2つの部分に分けた。凍結する脾臓部分は、FCS(90%)および10%DMSO(ジメチルスルホキシド)中に保持する。
60日間の免疫の終了時にマウスを犠死させ、無菌条件下で各々の動物から脾臓を採取して、ハイブリドーマの形成用と凍結用の2つの部分に分けた。凍結する脾臓部分は、FCS(90%)および10%DMSO(ジメチルスルホキシド)中に保持する。
脾臓の部分を機械的解離によって均質化し、以下のように処理した:
−DMEM培地5ml中で1回目の洗浄
−DMEM培地30〜40ml中で2回目の洗浄
−脾細胞と、免疫グロブリンを分泌しないマウスの骨髄腫のNSOマウス細胞株との融合。5×107のNSO細胞の量を、PEG1500を添加した培地20mlに懸濁した(5個の脾細胞に対して約1個のNSO細胞)。
−10%HAT、2%Hybridimaxを添加したDMEMへのハイブリドーマの再懸濁
−96穴を有する10のプレートへのハイブリドーマの接種
一次スクリーニング、1回目のLD
−DMEM培地5ml中で1回目の洗浄
−DMEM培地30〜40ml中で2回目の洗浄
−脾細胞と、免疫グロブリンを分泌しないマウスの骨髄腫のNSOマウス細胞株との融合。5×107のNSO細胞の量を、PEG1500を添加した培地20mlに懸濁した(5個の脾細胞に対して約1個のNSO細胞)。
−10%HAT、2%Hybridimaxを添加したDMEMへのハイブリドーマの再懸濁
−96穴を有する10のプレートへのハイブリドーマの接種
一次スクリーニング、1回目のLD
陽性クローン、すなわちHMGA1−GSTタンパク質に対する組換えモノクローナル抗体を産生するクローンを同定するためにクローン集団に関して間接ELISAを実施した。
96穴のプレート(Hysorb NUNC)をpH7.2のPBS 1x中1mg/mlの濃度のHMGA1溶液で被覆した。溶液50μlの容量を各々のウエルに分配し、4℃で約12時間インキュベートした。
このように操作したプレートをPBS−Tween20 0.05%中で3〜4回洗浄し、次に室温で1時間、PBS−BSA 3%中で飽和させた。この操作により非特異的結合を回避することができる。
プレートから内容物を取り出し、50μl/ウエルの容量のハイブリドーマの上清を室温で1時間半のインキュベーション時間中添加した。
次のプレートを洗浄し、1:1000希釈のペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体と共に室温で1時間インキュベートした。
3〜4回洗浄した後、プレートを、クエン酸緩衝液、pH5、1.7mM H2O2中1mg/mlのOPD(O−フェニレンジアミン)の溶液200μl/ウエルと共にインキュベートした。対照条件(抗原なしおよび抗体なし)に関して490nmの光学密度で色の発現を観察する。
40の陽性クローンを同定し、これらの中でクローン21G6(PD 08001)が好ましかった。
[二次スクリーニング、2回目のLD]
HMGA1を認識する特異的組換え抗体を産生する40の陽性クローンをLD法でさらに選択した。クローンを30細胞/プレート(96穴のプレートにおいて)の細胞密度で接種し、3プレート/クローンの三重サンプリングとした。
HMGA1を認識する特異的組換え抗体を産生する40の陽性クローンをLD法でさらに選択した。クローンを30細胞/プレート(96穴のプレートにおいて)の細胞密度で接種し、3プレート/クローンの三重サンプリングとした。
制限増殖条件は、抗原に対する特異的抗体を産生するモノクローナル細胞株を得ることを可能にする。一次選択についての表1に示すように、それぞれ選択した40および32クローンのうちで、および20クローンの培養での安定化後に、好ましいクローンは2G16/18(PD 08002)である。
[アイソタイプによるクローンの分類]
[組換え抗HMGA1モノクローナル抗体のアイソタイプの決定]
Isostripキットを使用して免疫グロブリンのサブクラスを決定した。試験する上清をPBS中で1/10希釈し、マウス免疫グロブリンの軽鎖に対する直接抗体で被覆した凍結乾燥ビーズを含む試験管に150μlを分注した。特異的抗マウス抗体が固定化されたストリップを、再懸濁した試薬を含む試験管に挿入した。キットの製造者によって提供される指示に従って、対照レーンの出現後に、特異的抗体クラスの特徴的なレーン、すなわちIgGの存在を認めた。
[組換え抗HMGA1モノクローナル抗体のアイソタイプの決定]
Isostripキットを使用して免疫グロブリンのサブクラスを決定した。試験する上清をPBS中で1/10希釈し、マウス免疫グロブリンの軽鎖に対する直接抗体で被覆した凍結乾燥ビーズを含む試験管に150μlを分注した。特異的抗マウス抗体が固定化されたストリップを、再懸濁した試薬を含む試験管に挿入した。キットの製造者によって提供される指示に従って、対照レーンの出現後に、特異的抗体クラスの特徴的なレーン、すなわちIgGの存在を認めた。
[SDS−PAGEおよびウエスタンブロット法]
レムリ緩衝液中の前記mAbを、適切な対照と共に、均一な密度(20%ポリアクリルアミド)および勾配(4〜15%または8〜25%のポリアクリルアミド)を有する前充填アクリルアミドゲル(PhastGel,GE)上に置いて、産生された抗体の分子量の正確さを評価する。SDS−PAGE用の緩衝液(SDS−Buffer Strips,GE)を使用して、電気泳動システム(PhastSystem,GE)を用いて15℃で電気泳動を実施する。次に試料をニトロセルロースに転写するために、図1に示すように別のゲルを調製する。転写装置(GE)を用いて転写を実施し、転写後、ニトロセルロース膜でELISAを実施して、二次ペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG抗体(Sigma)と共にインキュベートし、その後N,N−ジメチルホルムアミドで複合体を明らかにする。
レムリ緩衝液中の前記mAbを、適切な対照と共に、均一な密度(20%ポリアクリルアミド)および勾配(4〜15%または8〜25%のポリアクリルアミド)を有する前充填アクリルアミドゲル(PhastGel,GE)上に置いて、産生された抗体の分子量の正確さを評価する。SDS−PAGE用の緩衝液(SDS−Buffer Strips,GE)を使用して、電気泳動システム(PhastSystem,GE)を用いて15℃で電気泳動を実施する。次に試料をニトロセルロースに転写するために、図1に示すように別のゲルを調製する。転写装置(GE)を用いて転写を実施し、転写後、ニトロセルロース膜でELISAを実施して、二次ペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG抗体(Sigma)と共にインキュベートし、その後N,N−ジメチルホルムアミドで複合体を明らかにする。
[実施例2]
[miniPERMバイオリアクターにおけるモノクローナル抗体の生産]
miniPERMバイオリアクターにおいてSMF(無血清培地)での適応後にモノクローナル抗体の選択生産を実施した。この単回使用の円筒形バイオリアクターは、細胞を接種する培養チャンバー(容積30ml)および細胞に栄養を与えるための培地を入れる、培養チャンバーに取り付けられたプラスチック容器(容積350ml)を含んだ。チャンバーと容器は、栄養分だけを培養チャンバーに通過させ、抗体が容器内に拡散して希釈されるのを防ぐ限外ろ過膜によって分離されている。バイオリアクターを37℃、5%CO2のインキュベーター内の回転ローラー上に置く。この方法は、非常に濃縮された容積の抗体を得ることを可能にする。
miniPERMバイオリアクターにおいてSMF(無血清培地)での適応後にモノクローナル抗体の選択生産を実施した。この単回使用の円筒形バイオリアクターは、細胞を接種する培養チャンバー(容積30ml)および細胞に栄養を与えるための培地を入れる、培養チャンバーに取り付けられたプラスチック容器(容積350ml)を含んだ。チャンバーと容器は、栄養分だけを培養チャンバーに通過させ、抗体が容器内に拡散して希釈されるのを防ぐ限外ろ過膜によって分離されている。バイオリアクターを37℃、5%CO2のインキュベーター内の回転ローラー上に置く。この方法は、非常に濃縮された容積の抗体を得ることを可能にする。
[実施例3]
[クロマトグラフィーによる精製]
HiTrap−Protein G(General Electric)でのアフィニティークロマトグラフィーによってIgGクラス抗体の精製を実施する。カラムを20mMリン酸緩衝液pH7.4で再生し、リン酸緩衝液pH8で再平衡させて、抗体を含む初期試料をカラムに負荷する。同じ緩衝液で洗浄した後、抗体をグリシン緩衝液(再蒸留水中0.1Mグリシン、pH2.7)で溶出し、次に70%飽和の硫酸アンモニウム中の沈殿で濃縮し、その後6〜8000Daのカットオフ値を有する膜(Millipore)を使用してPBSに対して透析する。透析した試料を分光光度計によってタンパク質用量に関して定量し(Biorad)、280nmで読み取る。
HiTrap−Protein G(General Electric)でのアフィニティークロマトグラフィーによってIgGクラス抗体の精製を実施する。カラムを20mMリン酸緩衝液pH7.4で再生し、リン酸緩衝液pH8で再平衡させて、抗体を含む初期試料をカラムに負荷する。同じ緩衝液で洗浄した後、抗体をグリシン緩衝液(再蒸留水中0.1Mグリシン、pH2.7)で溶出し、次に70%飽和の硫酸アンモニウム中の沈殿で濃縮し、その後6〜8000Daのカットオフ値を有する膜(Millipore)を使用してPBSに対して透析する。透析した試料を分光光度計によってタンパク質用量に関して定量し(Biorad)、280nmで読み取る。
[SDS−PAGEおよびウエスタンブロット法]
産生された抗体の分子量の正確さを調べるため、それらを、適切な対照と共に、レムリ緩衝液中で均一な密度(20%ポリアクリルアミド)および勾配(4〜15%または8〜25%のポリアクリルアミド)を有する前充填アクリルアミドゲル(PhastGel,GE)に負荷する。SDS−PAGE用の緩衝液(SDS−Buffer Strips,GE)を使用して、電気泳動システム(PhastSystem,GE)を用いて15℃で電気泳動を実施する。試料をニトロセルロースに転写するために別のゲルを調製する。転写装置(GE)を用いて転写を実施し、転写後、ニトロセルロース膜上でELISAを実施して、二次ペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG抗体(Sigma)と共にインキュベートし、その後N,N−ジメチルホルムアミドで複合体を明らかにした。
産生された抗体の分子量の正確さを調べるため、それらを、適切な対照と共に、レムリ緩衝液中で均一な密度(20%ポリアクリルアミド)および勾配(4〜15%または8〜25%のポリアクリルアミド)を有する前充填アクリルアミドゲル(PhastGel,GE)に負荷する。SDS−PAGE用の緩衝液(SDS−Buffer Strips,GE)を使用して、電気泳動システム(PhastSystem,GE)を用いて15℃で電気泳動を実施する。試料をニトロセルロースに転写するために別のゲルを調製する。転写装置(GE)を用いて転写を実施し、転写後、ニトロセルロース膜上でELISAを実施して、二次ペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG抗体(Sigma)と共にインキュベートし、その後N,N−ジメチルホルムアミドで複合体を明らかにした。
[無血清培地への適応および生産速度]
選択した細胞クローンを1×104細胞/cm2の濃度で四重に反復して24穴のプレートに接種し、24穴のプレートにおいて、ひとたびそれらが集密に達すれば、漸次、ハイブリドーマ用完全培地中のより高い濃度の無血清培地(SFM)(0%、25%、50%、75%、100%)中に入れた。細胞の適応を、細胞の生存能および組換え抗HMGA1モノクローナル抗体の産生として評価した。適応細胞を6日間、フラスコでの生産速度検査(production kinetic)に供し、同時に以下のパラメータ:生存能、グルコース消費、乳酸産生、抗HMGA1抗体の産生を制御した。
選択した細胞クローンを1×104細胞/cm2の濃度で四重に反復して24穴のプレートに接種し、24穴のプレートにおいて、ひとたびそれらが集密に達すれば、漸次、ハイブリドーマ用完全培地中のより高い濃度の無血清培地(SFM)(0%、25%、50%、75%、100%)中に入れた。細胞の適応を、細胞の生存能および組換え抗HMGA1モノクローナル抗体の産生として評価した。適応細胞を6日間、フラスコでの生産速度検査(production kinetic)に供し、同時に以下のパラメータ:生存能、グルコース消費、乳酸産生、抗HMGA1抗体の産生を制御した。
[実施例4]
[バイオリアクターにおける生産]
少なくとも80%の生存能を有する選択細胞クローンを計数し、トリパンブルーで着色した。5.5×107細胞を、75%SFMおよび25%ハイブリドーマ用完全培地を含む一定容量の培地に接種した。接種は、12.5Kdaのカットオフ値を有するminiPerm/Vivascience Sartorius生産モジュールにおいて滅菌シリンジによって実施した。生産モジュールを供給モジュールに取り付け、バイオリアクター全体をCO2インキュベーター中の回転支持体上で撹拌した。生存能、生産および代謝パラメータを調べるため、生産モジュールにおいて層流フード下で滅菌シリンジを使用して試料を採取した。生産工程の終了時に、約35mlの容量の抗体を細胞と共に生産モジュールから採取し、次に抗体を遠心分離によって細胞から分離した。実施例3で述べた方法に従って、抗体をHiTrap−Proteina Gカラム(General Electric)でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
少なくとも80%の生存能を有する選択細胞クローンを計数し、トリパンブルーで着色した。5.5×107細胞を、75%SFMおよび25%ハイブリドーマ用完全培地を含む一定容量の培地に接種した。接種は、12.5Kdaのカットオフ値を有するminiPerm/Vivascience Sartorius生産モジュールにおいて滅菌シリンジによって実施した。生産モジュールを供給モジュールに取り付け、バイオリアクター全体をCO2インキュベーター中の回転支持体上で撹拌した。生存能、生産および代謝パラメータを調べるため、生産モジュールにおいて層流フード下で滅菌シリンジを使用して試料を採取した。生産工程の終了時に、約35mlの容量の抗体を細胞と共に生産モジュールから採取し、次に抗体を遠心分離によって細胞から分離した。実施例3で述べた方法に従って、抗体をHiTrap−Proteina Gカラム(General Electric)でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
[生体液中のHMGA1を定量するための競合的ELISA]
ELISA用の96穴のプレート(Maxisorp−NUNC)をPBS pH7.3中のHMGA−hisの溶液0.05ml/ウエル(1μg/ml)と共に4℃で約12時間インキュベートした。インキュベーション後、PBSを捨てて満たすという工程によってプレートを洗浄し、その後PBS中のBSAの溶液0.1ml/ウエルにより室温で2時間ブロックした。
ELISA用の96穴のプレート(Maxisorp−NUNC)をPBS pH7.3中のHMGA−hisの溶液0.05ml/ウエル(1μg/ml)と共に4℃で約12時間インキュベートした。インキュベーション後、PBSを捨てて満たすという工程によってプレートを洗浄し、その後PBS中のBSAの溶液0.1ml/ウエルにより室温で2時間ブロックした。
プレートを洗浄せずに空にした。あらかじめPBS中室温で2時間インキュベートした以下の成分:0.3%BSA、0.05%Tween 20の溶液0.05ml/ウエルをプレートに添加した。種々の実験条件を試験した:
1)固定量のHMGA1と漸減濃度の抗HMGA1抗体(1μg/ml〜0.001μg/ml)
2)固定濃度の抗HMGA1抗体と漸減濃度のHMGA1またはHMGA1を含有する生物学的試料
3)対照細胞に関して1)および2)の条件、次に漸減濃度の抗HMGA1抗体および/または緩衝液単独。
プレートを室温で2時間インキュベートし、その後PBS−Tween 0.05%で洗浄した。
2)固定濃度の抗HMGA1抗体と漸減濃度のHMGA1またはHMGA1を含有する生物学的試料
3)対照細胞に関して1)および2)の条件、次に漸減濃度の抗HMGA1抗体および/または緩衝液単独。
プレートを室温で2時間インキュベートし、その後PBS−Tween 0.05%で洗浄した。
PBS−Tween 0.05%中で1:1000希釈した二次ペルオキシダーゼ結合抗マウスIg抗体F(ab’)2 0.05ml/ウエルをプレートに添加し、室温で1時間半放置してインキュベートした。プレートをPBS−Tween 0.05%で洗浄し、その発色基質0.15ml(0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液、pH5中1g/Lのo−フェニレンジアミン(OPD)および3.5mmol/Lの過酸化水素)を添加した。30分後に0.05ml/ウエルの4.5M硫酸を添加することによって発色を停止させ、10分後にTEKSCANを用いて492nmで吸光度を測定した。mAb濃度の関数としてプロットすることによって、すなわち吸光度(1mg/Lでの最大吸光度)の対数変換によって標準曲線を得た。
[HMGA1の定量]
精製抗体21G6/18を、生体液中のHMGA1を定量するためのアッセイの調製に使用した。アッセイは、抗原に対する特異的抗体の存在下で、固相中のHMGA1と溶液中のHMGA1の間での結合の競合に基づく競合的ELISAである。HMGA1濃度の定量は、精製HMGA1タンパク質を使用して得られた標準曲線に対して試料を滴定して実施する。最初のアッセイは、マルチウエルプレートを被覆するために使用するHMGA1の量を決定するためおよび抗体の標準曲線を作成するために実施した。種々のタンパク質濃度を、種々の抗体濃度を有するマイクロタイタープレートに分注し、被覆のために使用すべきHMGA1の最適濃度が0.5μg/ml(0.05ml/ウエル)であり、最適抗体濃度が0.002μg/mlであることを確認した。ペルオキシダーゼに結合した二次抗体の最良希釈を最適化するため、標準抗体の4つの濃度を試験し、二次抗体の希釈を変化させた。選択した希釈は1:2000であった。
精製抗体21G6/18を、生体液中のHMGA1を定量するためのアッセイの調製に使用した。アッセイは、抗原に対する特異的抗体の存在下で、固相中のHMGA1と溶液中のHMGA1の間での結合の競合に基づく競合的ELISAである。HMGA1濃度の定量は、精製HMGA1タンパク質を使用して得られた標準曲線に対して試料を滴定して実施する。最初のアッセイは、マルチウエルプレートを被覆するために使用するHMGA1の量を決定するためおよび抗体の標準曲線を作成するために実施した。種々のタンパク質濃度を、種々の抗体濃度を有するマイクロタイタープレートに分注し、被覆のために使用すべきHMGA1の最適濃度が0.5μg/ml(0.05ml/ウエル)であり、最適抗体濃度が0.002μg/mlであることを確認した。ペルオキシダーゼに結合した二次抗体の最良希釈を最適化するため、標準抗体の4つの濃度を試験し、二次抗体の希釈を変化させた。選択した希釈は1:2000であった。
アッセイおよび結果の再現性と精度を確実にするため、マトリックスの等価性に関する検討も実施し、抗体標準曲線の希釈緩衝液への10%および20%血清の添加の影響を試験した。最適条件は10%であった。
ひとたび使用する最良抗体濃度が決定されれば、アッセイの感受性を定義するため、抗体を10μg/ml〜0.001μg/mlの間の様々な濃度のタンパク質と共にインキュベートすることによってHMGA1の標準曲線を決定した。HMGA1の0.01〜0.1μg/mlの区間で用量反応曲線を得た。アッセイの感受性は、生体液中またはリンパ球細胞に由来するタンパク質溶解産物中のHMGA1の定量を許容するものである。
各々のアッセイは以下の同時分析を企図する:
−二重/三重盲検評価で種々の濃度(8−2−0.5−0.125−0.031−0.0078−0.002−0μg/ml)の精製HMGA1に関して得られる標準競合曲線
−希釈せずに、かつ1:2希釈して評価される分析試料
−スパイクを添加した分析試料。
−二重/三重盲検評価で種々の濃度(8−2−0.5−0.125−0.031−0.0078−0.002−0μg/ml)の精製HMGA1に関して得られる標準競合曲線
−希釈せずに、かつ1:2希釈して評価される分析試料
−スパイクを添加した分析試料。
標準曲線の競合パーセンテージの平均値および相対濃度の対数を計算した。切片、勾配およびr2パラメータを、線形回帰関数を用いて計算した。r2値<0.96の場合および/またはHMGA1スパイクを含む試料が期待値から>25%逸脱する場合は、アッセイを反復しなければならない。このようにして得られた曲線から、分析する試料中に存在するHMGA1の濃度を計算することが可能である。このようにして調製したアッセイは、0.035μg/mlの測定限界を示す。
生物学的試料の血清中のHMGA1を定量するための競合的ELISAの結果を表2に示す。
特にシリーズ1とシリーズ2に関する表2では、異なる被験者の試料を異なる時点で定量した。特に、シリーズ1では試料1、2、4、5、6、7、8、10、11は健常対照被験者を示し、列挙される残りの試料は、おそらくインスリン抵抗性または糖尿病被験者を示す。特に、シリーズ2では試料1、2、3、4、5、6は健常対照被験者を示し、列挙される残りの試料は、おそらくインスリン抵抗性または糖尿病被験者を示す。μg/mlで示す数値は、試料中のHMGA1タンパク質の濃度を表す。
[実施例5]
[HMGA1の定量]
精製抗体21G6/18を、リンパ球からの核タンパク質抽出物中のHMGA1の量を測定するために使用した。アッセイは、抗原に対する特異的抗体の存在下で、固相中のHMGA1と溶液中のHMGA1の間での結合の競合に基づく競合的ELISAである。HMGA1濃度の定量は、精製HMGA1タンパク質を使用して得られる標準曲線に対して試料を定量化して実施する(実施例4で述べたように)。
精製抗体21G6/18を、リンパ球からの核タンパク質抽出物中のHMGA1の量を測定するために使用した。アッセイは、抗原に対する特異的抗体の存在下で、固相中のHMGA1と溶液中のHMGA1の間での結合の競合に基づく競合的ELISAである。HMGA1濃度の定量は、精製HMGA1タンパク質を使用して得られる標準曲線に対して試料を定量化して実施する(実施例4で述べたように)。
リンパ球からの核タンパク質抽出物中のHMGA1を定量するための競合的ELISAの結果を表3に示す。
特に、健常被験者と罹患被験者に関する表3において、種々の個体の定量した試料を示す。表に示す値は、実施例4の結果から既に明らかになった内容を確認する、すなわちHMGA1の低濃度は糖尿病またはインスリン抵抗性の病的状態に関連する。μg/mlで表した表3に示す値は、試料中のHMGA1タンパク質の濃度を表す。健常被験者についての欄では、一部の試料(11、12、18、20、23、24、25、29)は、HMGA1の高濃度が健常被験者の特徴であるという一般的傾向から逸脱する。試験は、再現性および統計的有意性として理解される、その信頼性を確認する。P値は、実際に0.05より低く、詳細にはP<0.0015である。表3に示すデータは、従って、試験の高い信頼性を確認する。
また、罹患被験者からの試料中のHMGA1タンパク質の濃度の値を分析することにより、タンパク質濃度の検出限界が具体的にどの程度有効であり、非常に低い濃度値でも識別することができ、極めて近い数値範囲でも高い感受性を有するかを確認することも可能である。データは、0.035μg/mlをアッセイにおけるHMGA1の濃度の検出限界として示す、実施例4から既に明らかになった内容を確認する。
Claims (33)
- HMGA1遺伝子のセンスまたはアンチセンス配列の発現のための、アデノウイルス構築物Ad−YsまたはAd−Yas。
- 細胞株の感染のための、請求項1に記載のアデノウイルス構築物Ad−YsまたはAd−Yasの使用。
- 前記細胞株がHEK−293であることを特徴とする、請求項2に記載の使用。
- HMGA1タンパク質を得るための、請求項1に記載の構築物の使用。
- マウスの免疫のための、請求項4に記載のHMGA1タンパク質の使用。
- 前記HMGA1タンパク質が精製されていることを特徴とする、請求項5に記載の使用。
- 前記精製タンパク質がBALB/cマウスの免疫のために使用されることを特徴とする、請求項6に記載の使用。
- HMGA1で免疫されたマウスの脾細胞と不死化細胞株の融合工程を含む、ハイブリドーマの作製のための方法。
- 前記不死化細胞株が腫瘍性であることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 前記腫瘍細胞株がマウスであることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 前記マウス腫瘍細胞株が非分泌性骨髄腫であるであることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記の非分泌性骨髄腫の株がNSOであることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 前記ハイブリドーマの前記融合工程がPEG1500の存在下で実施されることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- DMEM培地における前記ハイブリドーマの増殖工程を含むことを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- HATおよびHybridimaxが前記DMEM培地に添加されることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 10%HATおよび2%Hybridimaxが前記DMEM培地に添加されることを特徴とする、請求項15に記載の方法。
- マルチウエルプレートにおける平板培養によって実施されることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 前記ハイブリドーマの一次および二次選択ならびに同定工程を含み、前記工程がELISAおよびアイソタイプ分析によって実施されることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 前記選択および同定が間接ELISAおよびIsostripキットによって得られることを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- 請求項8〜19に記載の方法によって得られるクローン集団。
- クローン2G16(PD 08001)。
- クローン2G16/18(PD 08002)。
- 請求項20に記載の前記クローン集団によって産生されるモノクローナル抗体。
- 請求項21に記載のクローン2G16(PD 08001)によって産生されるモノクローナル抗体。
- 請求項22に記載のクローン2G16/18(PD 08002)によって産生されるモノクローナル抗体。
- 無血清培地(SFM)およびハイブリドーマ用完全培地における任意のクローンの接種および増殖工程を含む、請求項23〜25に記載のモノクローナル抗体の作製のための方法。
- バイオリアクターにおいて実施されることを特徴とする、請求項26に記載の方法。
- 前記バイオリアクターが、miniPermまたはViva Science Sartoriusバイオリアクターであることを特徴とする、請求項27に記載の方法。
- 前記接種および増殖が75%SFMおよび25%ハイブリドーマ用培地で実施されることを特徴とする、請求項26に記載の方法。
- アフィニティークロマトグラフィー工程を含む、請求項23〜25に記載のモノクローナル抗体の精製のための方法。
- 生体液中のHMGA1の定量のための、請求項23〜24に記載のモノクローナル抗体の使用。
- 生体液中のHMGA1の定量のための、請求項25に記載のモノクローナル抗体の使用。
- 請求項23〜25に記載の前記モノクローナル抗体を含む、HMGA1の定量のためのキット。
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