JP2007503839A - 新規ＵＢＰ８ｒｐポリペプチドおよび乾癬の治療におけるその使用 - Google Patents

新規ＵＢＰ８ｒｐポリペプチドおよび乾癬の治療におけるその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、ユビキチン−プロテオソーム経路のタンパク質（UBP8rp）をコードする新規遺伝子に関する。本発明はまた、調節物質をスクリーニングするためのUBP8rpポリペプチドの使用と、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、および多発性硬化症のような慢性炎症性疾患を治療するための該調節物質の使用に関する。本発明はさらに、該慢性炎症性疾患を診断するためのUBP8rp遺伝子中に位置する2対立遺伝子性マーカーの使用に関する。

Description

本発明は、ユビキチン−プロテオソーム経路のタンパク質（UBP8rp）をコードする新規遺伝子に関する。本発明はまた、調節物質をスクリーニングするためのUBP8rpポリペプチドの使用と、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、および多発性硬化症のような慢性炎症性疾患を治療するための該調節物質の使用に関する。本発明はさらに、該慢性炎症性疾患を診断するためのUBP8rp遺伝子中に位置する2対立遺伝子性マーカーの使用に関する。
1. 乾癬
乾癬は、銀色の鱗屑と種々の大きさの斑（盛り上がった皮疹）で認識される慢性で再発性の疾患である。皮膚の細胞の異常に高い増殖速度とターンオーバーがうろこ状のはがれを引き起こす。この急速な細胞増殖の原因は不明であるが、免疫機構が関与していると考えられている。この症状はしばしば家族性である。乾癬は一般的であり、白人の2〜4％が罹患するが黒人はこの疾患には罹りにくい。乾癬は10〜40代に発症することが多いが、すべての年齢群が罹患する。
1.1. 症状
乾癬は通常1つ以上の乾癬性斑として始まり、これは極端に薄片状にはがれやすい。その周りに小さい隆起が出現し始める。最初の斑は自然になくなるが、まもなく別の斑が出てくる。いくつかの斑は親指大のままであるが、その他は体の広い面積を覆うようになり、目立つ環模様またはらせん模様になることがある。
乾癬は典型的には、頭皮、肘、膝、背中、および臀部に発症する。はがれはふけが多いことと誤解されるが、完全に正常な部位にはがれが分散しているという乾癬の性質により、ふけとは区別される。乾癬はまた爪の周りや下に発症し、爪が厚く変形する。眉、脇の下、へそ、および鼠蹊部にも発症する。通常乾癬ははがれがあるのみである。かゆみもまれである。はがれの部位が治癒すると、皮膚は完全に正常な外観を呈し、毛髪の成長は変化が無い。限定された乾癬を有するほとんどの患者は、はがれ以外の問題が無いが、皮膚の外観が気になる。
しかしながら、広範な乾癬、又は乾癬の重篤の作用を経験する人もいる。乾癬性関節炎は、関節リウマチに非常によく似た症状を示す。まれに乾癬が全身に広がり、剥脱性乾癬性皮膚炎を発症して皮膚全体が腫れてくる。この型の乾癬は火傷のように、皮膚が損傷及び感染に対する防御バリアーとして機能することを妨げるため、非常に重症である。別のまれな乾癬である膿疱性乾癬では、手のひらや足の裏に大小の膿で満たされた丘疹（膿疱）が形成される。時にこれらの膿疱が体全体に拡散する。
乾癬は明らかな理由無く発症するか、または重症の日焼け、皮膚炎症、抗マラリア剤、リチウム、ベータ遮断薬（例えばプロプラノロールおよびメトプロロール）、またはほとんどすべての医療軟膏またはクリーム剤により発症する。連鎖球菌感染症（特に小児）、打撲傷、およびひっかき傷もまた、新しい斑の形成を刺激する。
1.2. 分子的機序
乾癬は慢性の炎症性疾患である。乾癬の炎症性事象は、複雑な一連の誘導性およびエフェクタープロセスからなり、これには多様な炎症促進性遺伝子の制御された発現が必要である。NF-κBは、これらの多くの炎症促進分子の最大転写に必要なタンパク質転写因子である。これは、阻害性サブユニットIκBに密着して結合して細胞質中に不活性で保持されるp50タンパク質とp65タンパク質のヘテロダイマーから成る。活性化されると、IκBは急速かつ順にIκBキナーゼの作用によりリン酸化され、ユビキチン化され、ユビキチン−プロテオソームにより分解される。活性サブユニット（p50とp51）は核に転位され、ここで同種のDNA配列に結合し、炎症促進性遺伝子の遺伝子転写を刺激する。
1.3. 診断
乾癬は、多くの他の疾患が同様の斑とはく離を示すため、最初は誤診断されやすい。診断を確定するために医師は、皮膚試料を採取し、これを顕微鏡観察して皮膚生検を行う。
1.4. 治療
斑の数が少なく小さい時は、皮膚をなめらかにする軟膏剤やクリーム剤（皮膚軟化薬）を1日1回または2回適用すると、皮膚を湿った状態に維持することができる。コルチコステロイド、ビタミンDクリーム、サリチル酸またはコールタールを含有する軟膏剤が、限定された乾癬を有する多くの患者で有効である。アントラリンのようなより強い薬剤も時に使用されるが、これらは皮膚を刺激し、シーツや衣服にシミを作る。頭皮が冒された場合、これらの活性成分を含有するシャンプーがしばしば使用される。膿疱性乾癬のための、2つの最も有効な薬剤はエトレチネートとイソトレチノインであり、これらはまた重症のざ瘡を治療するためにも使用される。紫外線もまた乾癬の除去に役立つ。実際夏期に、皮膚の露出部位は自然にきれいになる。日光浴は、体のより大きい領域の斑を除去することを助長し、制御された条件下での紫外線への暴露は、別の一般的な治療法である。
重い副作用の無い重症型の乾癬を治療する薬剤は、未だ販売されていない。広範な乾癬のための、紫外線療法はソラレン（紫外線の作用に対して皮膚をさらに敏感にする薬剤）を補足してよい。ソラレンと紫外線の組合せ（PUVA）は通常有効であり、数ヶ月間皮膚をきれいにすることができる。しかしPUVA治療は、紫外線による皮膚癌のリスクを上昇させることがある；従って、治療は医師がしっかり監視する必要がある。ほとんどの重症の乾癬と広く拡散した乾癬については、医師はメトトレキセートを投与する。いくつかの型の癌を治療するのに使用されるこの薬剤は皮膚細胞の成長と増殖を妨害する。これは極端な症例で有効となり得るが、骨髄、腎臓、および肝臓に悪影響を及ぼすことがある。別の有効な薬剤であるシクロスポリンはまた、重症の副作用がある。
現在開発中の新世代薬剤には、ヒト抗CD11a抗体であるエファリズマブ（Efalizumab）（ラプチバ（Raptiva）（商標））がある。エファリズマブを週に1回皮下投与すると、中度〜重度の斑乾癬の患者で臨床的有用性を示す（Catherら (2003) Expert Opin Biol Ther. 3:361-370）。エファリズマブは、乾癬の治療のための新しい治療選択肢を与え、改良されたより安全な長期の連続的な「維持」療法の可能性を与える。
2. 乾癬感受性遺伝子座
乾癬の多因性の病因は充分確立されている。環境因子（例えば連鎖球菌感染）は疾患の発症に影響を与えるが、家族性の研究では強い遺伝的要素を示している。双生児の研究は、二卵性双生児での15〜20％の一致率に対して一卵性双生児の一致率が65〜70％であることを証明している（Farberら、1974）。家族性の研究は、一親等の親類のリスクが8〜23％であることを推定している。しかしいくつかの環境因子（連鎖球菌感染、及びストレスを含む）が疾患の発症と提示に影響を与えることが知られている。
いくつかの乾癬感受性遺伝子座がマッピングされている：6p21上のPSORS1、17q上のPSORS2、4q上のPSORS3、1cen-q21上のPSORS4、3q21上のPSORS5、19p上のPSORS6、1p上のPSORS7、および4q31上のPSORS8。6pと17q上の遺伝子座は充分確立されているようである。追加の推定される乾癬候補遺伝子座は、16qと20p上で報告されている。
乾癬の主要な感受性遺伝子座はPSORS1である（Nairら、1997；Trembathら、1997；Okaら、1999；Leeら、2000；Vealら、2001）。いくつかの位置候補遺伝子は、乾癬のPSORS1感受性遺伝子座内に位置する；HLA-C（白血球抗原C）、HCR（α−ヘリックス−コイルド−コイル−ロッド相同体）、POU5F1（オクタマー転写因子3）、TCF19（細胞増殖制御遺伝子）、コルネオデスモシン遺伝子、プレクチン様タンパク質をコードする遺伝子、および任意のDNAデータベース中の任意の公知の配列との相同性を示さない3つの遺伝子である。
Vealらは、感受性遺伝子座を精製するためにPSORS1のSNPハプロタイプに基づく連関解析を行った（Vealら、2002）。彼らは、乾癬の感受性の10kb主要領域を同定した。彼らは、この限定された領域が2つの2対立遺伝子マーカー（SNP n.7とn.9）を含んで成り、確率値がすでに研究されているすべての他のマーカーを明らかに超えることを証明した。この10kb領域は、任意の公知の遺伝子を含有しなかった。さらにこの限定領域のデータベース解析は、発現されない偽遺伝子を同定したが、発現された遺伝子の同定を可能にしなかった。SNP n.7とn.9はHLA-Cの動原体のそれぞれ7kbと4kbの非コード領域中にあるため、Vealらは、SNP n.7とn.9がHLA-Cの発現に影響を与える制御領域内にあるかも知れないと結論付けた。
3. ユビキチン−プロテオソーム経路
ユビキチン−プロテオソーム経路は、細胞内タンパク質の選択的分解において中心的役割を有する。プロテオソームにより調節される特に主要なタンパク質は、炎症性プロセスの制御、細胞サイクル制御、細胞増殖、および遺伝子発現に関与するものがある。プロテオソームは、高度に保存された20Sコア構造を示すすべての真核細胞中に存在する大きな多量体プロテアーゼである。プロテオソームは、ポリユビキチン鎖で「タグ付け」された後のタンパク質基質の分解に関与する。これらのうちでプロテオソームは、IκBの分解に関与することが知られている（Regnierら、1997、Cell 90:373-383）。すなわちプロテオソーム阻害は、阻害タンパク質IκBの分解を阻止することによりNF-κB活性化を阻害し、そしてプロテオソームの阻害は、乾癬のようなT細胞で仲介される疾患を治療するための可能な手段として提唱されている（Zollnerら、2002 J. Clin. Invest. 109：671-9）。
ユビキチン−プロテオソーム経路を介するタンパク質の選択的分解には、タンパク質標的へのポリユビキチン鎖の共有結合を生成するシグナル伝達カスケードの活性化が関与する。標的への複数のユビキチン分子の付加により形成されるポリユビキチン鎖は、プロテオソーム（大きな多量体タンパク質複合体）による分解のシグナルとして作用する。ユビキチンの結合には、3つの主要な酵素：ユビキチン活性化酵素E1、ユビキチン結合酵素E2、およびユビキチンリガーゼE3、の存在が必要である。
脱ユビキチン化活性は、特定の細胞のユビキチンの蓄積を促進することができ、またプロテオソームによる分解の前に結合タンパク質からポリユビキチン鎖を除去することにより、E2/E3介在結合の作用を打ち消すと考えられている。これはプロテオソームによる分解を防止する手段を意味するか、またはタンパク質分解を目的としないユビキチン化プロセスの一部かも知れない。脱ユビキチン化酵素は2つの大きなグループに細分される：ユビキチンC末端ヒドロラーゼ（UCH）およびユビキチンイソペプチダーゼ（UBP）（Wilkinson, 1997）。UBPについての多くの公表されている報告に関する限りは、一定のUBPが特異性の高い機能を有することを示す。IsoT（詳細に研究されているこのファミリーのメンバー）は、線状およびイソペプチド結合ユビキチンを切断することができ、最適活性のために遊離ユビキチンC末端を必要とするようである（Wilkinson, 1995）。
Naviglioらは、1998年にUBP8 ユビキチンイソペプチダーゼをクローン化し特徴化した（EMBO J. 17:3241-3250）。UBP8の生化学的活性を測定し、UBP8がユビキチン−イソペプチダーゼ結合の加水分解と、精製した線状のユビキチン鎖の切断の両方を行うことができることが証明された。UBP8のダウンレギュレーションは、全体の細胞タンパク質ユビキチン化の実質的な異常を引き起こすことから、UBP8はユビキチン経路において一般的役割を果たすことをが示された。さらに休止ヒト細胞中のアンチセンスUBP8 cDNAの微量注入は、S期に入るのを阻止し、成長している骨肉腫細胞中のアンチセンスUBP8 cDNAの微量注入は、S期の細胞の蓄積を決定する。すなわちNaviglioらは、細胞ユビキチンイソペプチダーゼUBP8の阻害が細胞増殖に対して顕著な作用を有することを証明した。2000年にUBP8は、インビトロと培養細胞の両方でHrs結合タンパク質に結合していることが証明された（Katoら、J. Biol. Chem. 275:37481-37487）。Hrs結合タンパク質はHrsと一緒に、早期エンドソームを介して増殖因子−受容体複合体のエンドサイトーシス輸送において制御的役割を果たす。Katoらは、Hbpと関連するUBP8が、増殖因子受容体のプロテオソームおよび／またはリソソーム性分解において積極的な制御的役割を果たすという仮説を立てた。
従ってユビキチン−プロテオソーム経路のタンパク質は、細胞サイクル調節、細胞増殖の調節、および炎症に関与するタンパク質の分解などにおいて重要な役割を果たすことが証明されている。従ってユビキチン−プロテオソーム経路のタンパク質の調節は、癌および慢性炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、多発性硬化症、および乾癬）の治療選択肢である。
発明の概要
本発明は、乾癬の主要な感受性遺伝子座を規定する10kb領域内のヒト染色体6p21上に位置する発現した遺伝子の発見に由来する。この遺伝子（UBP8rp遺伝子）は、ユビキチン−プロテオソーム経路のタンパク質をコードする。UBP8rp遺伝子は、配列番号1のヌクレオチド1018〜1046位および配列番号1の1676〜1718位に位置する2つのイントロンを含む。UBP8rp遺伝子から転写された4つの異なるスプライス変異体（配列番号2、53、55、および56に対応する）が単離されている。本発明はさらに、UBP8rp遺伝子が高度に多型性遺伝子であるという発見に基づく。96個のUBP8rp関連2対立遺伝子マーカー（2対立遺伝子マーカー1〜96と呼ぶ）は、本発明の枠内で開示される。
従って本発明の第1の観点は、(1)配列番号1のヌクレオチド1018〜1046；および(2)配列番号1のヌクレオチド1676〜1718の配列を有するイントロンを含む単離された遺伝子に関する。
本発明はさらに、UBP8rp遺伝子から転写されるメッセンジャーRNAに相補的な単離されたUBP8rpポリヌクレオチドに関する。
本発明はさらに、以下よりなる群から選択されるUBP8rpポリヌクレオチドに関する：
a)配列番号2を含むポリヌクレオチド；
b)配列番号52を含むポリヌクレオチド；
c)配列番号54を含むポリヌクレオチド；
d)配列番号55を含むポリヌクレオチド；
e)(a)〜(d)のいずれかと比較して少なくとも1つの多型性変化を含む(a)〜(d)のいずれかの対立遺伝子変異体（ここで、該多型性変化はUBP8rp関連2対立遺伝子マーカー番号1〜96よりなる群から選択される）；
f)(a)〜(e)のいずれかに相補的なポリヌクレオチド。
本発明はさらに、UBP8rp遺伝子またはUBP8rpポリヌクレオチドによりコードされる単離されたUBP8rpポリペプチドに関する。
本発明はさらに、UBP8rp遺伝子またはUBP8rpポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。
上記発現ベクターを含む宿主細胞は、本発明のさらなる観点である。
本発明はさらに、UBP8rpポリペプチドの作成方法であって、本発明の宿主細胞内でのUBP8rpポリペプチドの産生に適した条件下で、該宿主細胞を培養する工程を含む方法に関する。
本発明のさらなる観点は、UBP8rpポリペプチドに特異的に結合する抗体に関する。
天然の結合パートナーをスクリーニングするための標的としてのUBP8rpポリペプチドの使用、候補調節物質をスクリーニングするための標的としてのUBP8rpポリペプチドの使用、および慢性炎症性疾患の治療用薬剤を調製するためのUBP8rpポリペプチドの調節物質の使用もまた、本発明の範囲内である。
さらに本発明は、乾癬の治療のためのUBP8rpポリペプチドの調節物質の効力を評価する方法であって、乾癬の動物モデルに該調節物質を投与することを含み、該調節物質が該動物モデルの乾癬の代表的な特徴を緩和するという測定は、該調節物質が乾癬の治療用の薬剤であることを示すことを特徴とする方法に関する。
さらなる観点において本発明は、2対立遺伝子マーカーと慢性炎症性疾患との間に有意な関連があるかどうかを測定するための、2対立遺伝子マーカー番号1、2、4、6、7、10、12〜19、21〜30、31〜35、および37〜96よりなる群から選択される少なくとも1つのUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーの使用に関する。
本発明はさらに、個体が慢性炎症性疾患に罹っているかまたは罹るリスクがあるかを診断するための、2対立遺伝子マーカー番号1、2、4、6、7、10、12〜19、21〜30、31〜35、および37〜96よりなる群から選択される少なくとも1つのUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーの使用に関する。
本発明はまた、(a)生物学的試料から核酸を単離する工程；および(b)2対立遺伝子マーカー番号1、2、4、6、7、10、12〜19、21〜30、31〜35、および37〜96よりなる群から選択されるUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーの1つ以上に存在するヌクレオチドを検出する工程、を含む遺伝子型判定法に関する。
配列リストの配列の簡単な説明
配列番号1は、UBP8rp遺伝子を含むゲノム領域（対立遺伝子A3）に対応する。
配列番号2は、UBP8rpをコードするCDS（対立遺伝子A3）に対応する。
配列番号3は、対立遺伝子A3によりコードされるUBP8rpのタンパク質配列に対応する。
配列番号4は、UBP8のタンパク質配列に対応する。
配列番号5〜21および58〜79は、プライマーに対応する。
配列番号52、54、および55は、対立遺伝子A9から転写された3つのスプライス変異体のメッセンジャーRNAに対応する。
配列番号53は、配列番号52によりコードされるタンパク質に対応する。
配列番号56は、配列番号55によりコードされるタンパク質に対応する。
配列番号57は、抗UBP8rp抗体を作成するのに使用されるペプチドに対応する。
発明の詳細な説明
本発明は、乾癬の主要な感受性遺伝子座を規定する10kb領域内のヒト染色体6p21に位置する発現した遺伝子の発見に由来する。この遺伝子は、ユビキチン−プロテオソーム経路の新規タンパク質であるUBP8rpをコードする。さらに、UBP8rp遺伝子の特異的対立遺伝子（対立遺伝子A9）は、乾癬に罹っていない個体より乾癬にかかった個体でより頻度が高いことが証明されている。さらにUBP8rp遺伝子の発現レベルを定量的PCRにより研究し、免疫学的分析を行ってUBP8rpの発現プロファイルを測定した。特にUBP8rpは、培養物中の正常なヒトケラチン細胞の増殖と発生中に調節されること、およびUBP8rpタンパク質がヒトの皮膚と全血液細胞中に存在することが証明された。まとめるとこれらの結果は、UBP8rpの特異的変異体が乾癬性ケラチン細胞に異常な増殖能を付与し得ることを示唆する。
従って本発明は、新規UBP8rpポリペプチドと、乾癬および他の慢性炎症性疾患（例えば、乾癬性関節炎、関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、および多発性硬化症）の治療に有用な化合物を同定するための手段を提供する。特に本発明は、その調節物質をスクリーニングするための標的としてのUBP8rpポリペプチドの使用に関する。乾癬および他の慢性炎症性疾患を治療するための該調節物質の使用、および乾癬および他の慢性炎症性疾患を診断するためのUBP8rp遺伝子中に位置する新規2対立遺伝子マーカーの使用は、本発明のさらなる観点である。
1. 本発明のポリヌクレオチド
本発明の第1の観点は、(i)配列番号1のヌクレオチド1018〜1046；および(ii)配列番号1のヌクレオチド1676〜1718の配列を有するイントロンを含む単離された遺伝子に関する。
本明細書において用語「イントロン」は、遺伝子のタンパク質コード配列を遮断するヌクレオチドの配列を意味する。イントロンは転写されて一次RNAになるが、一次RNAから切断除去されて、メッセンジャーRNAを生成し、これはタンパク質に翻訳される。
本明細書において用語「遺伝子」は、具体的なタンパク質をコードする特定の染色体上の特定の位置に存在するヌクレオチドの配列を意味する。遺伝子は通常、エキソン、イントロン、5'非翻訳領域および3'非翻訳領域、および上流と下流の制御配列を含む。遺伝子は、同じタンパク質の異なるアイソフォームをコードし得る。これらのアイソフォームは、例えば代替スプライシングにより、または代替開始コドンの翻訳の開始により生成され得る。本明細書において用語「遺伝子」は、偽遺伝子を含まない。
さらに本明細書において使用される用語「UBP8-rp遺伝子」は、配列番号1のヌクレオチド1018〜1046とヌクレオチド1676〜1718のイントロンを含む遺伝子を意味する。この遺伝子は、乾癬の主要な感受性遺伝子座内の遺伝子座6p21内に位置し、UBP8rpタンパク質をコードする。用語「UBP8-rp遺伝子」は、かかる遺伝子のすべての天然に存在する対立遺伝子を包含する。特に用語「UBP8-rp遺伝子」は、少なくとも1、2、3、4、5、10、15、または20個のUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーを含むすべての対立遺伝子を包含する。特に用語「UBP8-rp遺伝子」は、UBP8rp遺伝子の少なくとも1つのイントロンが少なくとも1つの多型性変化を含み、該変化がUBP8rp関連2対立遺伝子マーカー番号12、49、69、および70よりなる群から選択される、対立遺伝子変異体を包含する。
さらに当業界で公知の方法を使用して、本明細書に開示の配列からの情報を使用してUBP8rp遺伝子の他の対立遺伝子変異体を得ることができる。例えば本明細書で提供される配列から適当なプローブもしくはプライマーを作成し、当業者に公知の任意の技術を使用して対立遺伝子変異体の適当な核酸源をスクリーニングすることにより、他の対立遺伝子変異体を単離及び同定してもよい。
用語「含む」、「よりなる」、または「本質的によりなる」は、明確な意味を有する。しかし各用語は、本発明の範囲を変化させるために、互いに代用してもよい。
本発明の他の観点は、請求項1の遺伝子から転写されるメッセンジャーRNAに相補的な単離されたポリヌクレオチドに関する。
本明細書において用語「メッセンジャーRNA」（mRNA）は、任意のイントロン配列を含まない処理されたRNA分子を意味する。用語メッセンジャーRNAは、UBP8rp遺伝子から翻訳されるすべての代替スプライス変異体を包含する。
かかるメッセンジャーRNAは、UBP8rp遺伝子のエキソンの任意の組合せを含んでよい。１つの態様において、UBP8rpポリヌクレオチドは、配列番号2のヌクレオチド1〜167を含むエキソン1またはその対立遺伝子変異体を含む。別の態様においてUBP8rpポリヌクレオチドは、配列番号2のヌクレオチド168〜796を含むエキソン2またはその対立遺伝子変異体を含む。さらに別の態様において、UBP8rpポリヌクレオチドは、配列番号2のヌクレオチド797〜1449、または配列番号52のヌクレオチド797〜1458を含むエキソン3、或いはその対立遺伝子変異体を含む。さらに別の態様においてUBP8rpポリヌクレオチドは、配列番号55のヌクレオチド797〜1035を含むエキソン3Aまたはその対立遺伝子変異体を含む。好ましくは、UBP8rpポリヌクレオチドは、配列番号2、配列番号52、配列番号55、またはその対立遺伝子変異体を含む。好ましくは、対立遺伝子変異体は、UBP8rp関連2対立遺伝子マーカー番号1〜96よりなる群から選択される少なくとも1つの多型性変化を含む。さらに好ましくは、少なくとも1つの多型性変化はコード配列内に位置する。最も好ましくは少なくとも1つの多型性変化は、コードされるポリペプチドの配列の変化変化を導く。
本発明の他の観点は、以下よりなる群から選択されるポリヌクレオチドに関する：
a)配列番号2を含むポリヌクレオチド；
b)配列番号52を含むポリヌクレオチド；
c)配列番号54を含むポリヌクレオチド；
d)配列番号55を含むポリヌクレオチド；
e)(a)〜(d)のいずれかと比較して少なくとも1つの多型性変化を含む(a)〜(d)のいずれかの対立遺伝子変異体（ここで、以下に示す該多型性変化はUBP8rp関連2対立遺伝子マーカー番号1〜96よりなる群から選択される）；
f)(a)〜(e)のいずれかに相補的なポリヌクレオチド。
Figure 2007503839
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さらに本明細書において用語「UBP8rpポリヌクレオチド」は、UBP8rp遺伝子から転写されたメッセンジャーRNAに相補的な単離されたポリヌクレオチド、前記段落の(a)〜(f)の任意のポリヌクレオチド、またはその断片を意味する。
UBP8rpポリヌクレオチドの断片は、少なくとも100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、または2000ヌクレオチドの長さでもよい。
当業界で公知の任意の方法を使用して、UBP8rpポリヌクレオチドを得ることができる。UBP8rpポリヌクレオチドは、例えば実施例1に記載のように得ることができる。
本発明はまた、プライマーおよびプローブとして使用されるUBP8rpポリヌクレオチドを包含する。かかるプライマーは、試験試料中のUBP8rpポリヌクレオチド、その相補体、または変異体の少なくとも1つのコピーの存在を検出するために有用である。本発明のプローブは多くの目的に有用である。これらは好ましくは、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーションで使用することができる。プローブはまたPCR増幅産物を検出するのに使用することができる。これらはさらに、in situハイブリダイゼーションで使用してもよい。本発明の好適なプライマーは、配列番号5〜51のものである。
本発明はまた、UBP8rpポリペプチドの断片をコードするポリヌクレオチドであるUBP8rpポリヌクレオチドを包含する。断片は例えば、UBP8rpの抗原性エピトープからなり、抗体の産生に有用である。
本発明のポリヌクレオチド、プライマー、およびプローブのいずれかも、固体支持体（例えばマイクロアレイ）上に都合よく固定化することができる。本発明の複数のオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを含む基質は、UBP8rp遺伝子中の標的配列を検出もしくは増幅するために使用され、UBP8rp mRNAのコード配列もしくは非コード配列中の突然変異を検出するために使用され、および異なる状況（例えば異なる組織、プロセスの異なる段階（胚発生、疾患治療）でUBP8rp mRNAの発現を測定するために使用され、患者対健常者で使用され得る。
2. 本発明のポリヌクレオチド
本発明の別の観点は、UBP8rp遺伝子またはUBP8rpポリヌクレオチドによりコードされる精製されたポリペプチドに関する。
好適な態様においてUBP8rpポリペプチドは、以下よりなる群から選択される：
a)配列番号3を含むポリペプチド；
b)配列番号3の少なくとも470アミノ酸の範囲を含むポリペプチド；
c)配列番号3の少なくとも15アミノ酸の範囲を含むポリペプチド（ここで該範囲は、配列番号3のアミノ酸467〜482内にある）；
d)(a)〜(c)のいずれかと比較して少なくとも1つの多型性変化を含む(a)〜(c)のいずれかの対立遺伝子変異体（ここで該多型性変化は、UBP8rp関連2対立遺伝子マーカー番号1〜96よりなる群から選択されるUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーを含むコドンによりコードされる）；
e)アミノ酸配列は、(a)〜(c)の配列の少なくとも1つと少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有する、(a)〜(c)のいずれかのムテイン；
f)高ストリンジェント条件下で(a)〜(c)のいずれかをコードするDNA配列の相補体にハイブリダイズする核酸によりコードされる、(a)〜(c)のいずれかのムテイン；および
g)アミノ酸配列中の任意の変化は、(a)〜(c)中のアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換である、(a)〜(c)のいずれかのムテイン。
別の好適な態様において、UBP8rpポリペプチドは、以下よりなる群から選択される：
a)配列番号53を含むポリペプチド；
b)配列番号53の少なくとも470アミノ酸の範囲を含むポリペプチド；
c)配列番号53の少なくとも15アミノ酸の範囲を含むポリペプチド（ここで該範囲は、配列番号53のアミノ酸467〜485内にある）；
d)アミノ酸配列は(a)〜(c)中の配列の少なくとも1つと少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有する、(a)〜(c)のいずれかのムテイン；
e)高ストリンジェント条件下で(a)〜(c)のいずれかをコードするDNA配列の相補体にハイブリダイズする核酸によりコードされる、(a)〜(c)のいずれかのムテイン；および
f)アミノ酸配列中の変化は、(a)〜(c)中のアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換である、(a)〜(c)のいずれかのムテイン。
別の好適な態様においてUBP8rpポリペプチドは、以下よりなる群から選択される：
a)配列番号56を含むポリペプチド；
b)配列番号56の少なくとも270アミノ酸の範囲を含むポリペプチド；
c)配列番号56の少なくとも15アミノ酸の範囲を含むポリペプチド（ここで該範囲は、配列番号56のアミノ酸266と267を含む）；
d)アミノ酸配列は(a)〜(c)中の配列の少なくとも1つと少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有する、(a)〜(c)のいずれかのムテイン；
e)高ストリンジェンント条件下で(a)〜(c)のいずれかをコードするDNA配列の相補体にハイブリダイズする核酸によりコードされる、(a)〜(c)のいずれかのムテイン；および
f)アミノ酸配列中の任意の変化は、(a)〜(c)中のアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換である、(a)〜(c)のいずれかのムテイン。
本明細書において用語「UBP8rpポリペプチド」は、本発明のポリペプチドのすべてを包含するのに使用される。
好適な態様においてUBP8rpポリペプチドは、全長UBP8rpタンパク質に対応する。UBP8rpタンパク質は、実施例1に記載のようにユビキチン−プロテオソーム経路のメンバーである。UBP8rpは、該細胞内タンパク質を脱ユビキチン化することにより、またはユビキチン化およびで脱ユビキチン化酵素を制御することにより、細胞内タンパク質のユビキチン結合と脱ユビキチン化においてある役割を果たす。UBP8rpポリペプチドの生物活性は、UBP8rpによる細胞内タンパク質のユビキチン化状態の調節を意味する。
本発明はまた、配列番号3、53または56の少なくとも10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、または480アミノ酸の断片からなるポリペプチドに関する。好ましくは、該断片は、配列番号3のアミノ酸467〜482、配列番号53のアミノ酸467〜485内にあるか、または配列番号56のアミノ酸266と267を含む。
本発明はまた、任意の上記断片を含む天然の、組換え型の、またはキメラポリペプチドに関する。
ある態様は、配列番号3の107位のアミノ酸がアルギニンであるUBP8rpポリペプチドに関する。別の態様は、配列番号3の107位のアミノ酸がリシンであるUBP8rpポリペプチドに関する。
ある態様は、配列番号3の128位のアミノ酸がトレオニンであるUBP8rpポリペプチドに関する。別の態様は、配列番号3の128位のアミノ酸がメチオニンであるUBP8rpポリペプチドに関する。
ある態様は、配列番号3の183位のアミノ酸がアスパラギンであるUBP8rpポリペプチドに関する。別の態様は、配列番号3の183位のアミノ酸がヒスチジンであるUBP8rpポリペプチドに関する。
ある態様は、配列番号3の189位のアミノ酸がアスパラギンであるUBP8rpポリペプチドに関する。別の態様は、配列番号3の189位のアミノ酸がチロシンであるUBP8rpポリペプチドに関する。
ある態様は、配列番号3の203位のアミノ酸がグリシンであるUBP8rpポリペプチドに関する。別の態様は、配列番号3の203位のアミノ酸がグルタミン酸であるUBP8rpポリペプチドに関する。
ある態様は、配列番号3の204位のアミノ酸がアスパラギンであるUBP8rpポリペプチドに関する。別の態様は、配列番号3の204位のアミノ酸がリシンであるUBP8rpポリペプチドに関する。
ある態様は、配列番号3の209位のアミノ酸がグリシンであるUBP8rpポリペプチドに関する。別の態様は、配列番号3の209位のアミノ酸がバリンであるUBP8rpポリペプチドに関する。
ある態様は、配列番号3の251位のアミノ酸がグリシンであるUBP8rpポリペプチドに関する。別の態様は、配列番号3の251位のアミノ酸がアルギニンであるUBP8rpポリペプチドに関する。
ある態様は、配列番号3の325位のアミノ酸がグルタミン酸であるUBP8rpポリペプチドに関する。別の態様は、配列番号3の325位のアミノ酸がリシンであるUBP8rpポリペプチドに関する。
ある態様は、配列番号3の420位のアミノ酸がアラニンであるUBP8rpポリペプチドに関する。別の態様は、配列番号3の420位のアミノ酸がトレオニンであるUBP8rpポリペプチドに関する。
さらなる態様は、配列番号3のポリペプチドまたはその断片の対立遺伝子変異体に関する。好適な対立遺伝子変異体は、本発明の少なくともUBP8rp2対立遺伝子マーカーを含むものである。
さらなる態様は、ムテインに関する。本明細書において用語「ムテイン」は、天然のUBP8rpの1つ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基により置換されているか、または欠失しているか、或いは1つ以上のアミノ酸残基がUBP8rpの天然の配列に付加されていても、生じる生成物の活性が野生型UBP8rpと比較して大きく低下していないUBP8rpの類似体を意味する。これらのムテインは、公知の合成法および／または部位特異的突然変異誘発法、または任意の適切な公知の方法により調製される。
本発明で使用できるUBP8rpのムテイン、またはこれをコードする核酸は、本明細書に示す教示および指導に基づき、不要な実験をすることなく、当業者が日常的に得ることができる置換ペプチドもしくはポリヌクレオチドとしての実質的に対応する配列の有限集合を含む。
本発明のUBP8rpポリペプチドは、中程度にまたは高度にストリンジェント条件下で、本発明のUBP8RPbをコードする、DNAまたはRNAにハイブリダイズする核酸（例えばDNAまたはRNA）によりコードされるタンパク質を含む。用語「ストリンジェント条件」は、ハイブリダイゼーションと以後の洗浄条件を意味し、当業者はこれを通常「ストリンジェント」と呼ぶ。アウスベル（Ausubel）ら、「分子生物学の現代のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」（前述）、インターサイエンス（Interscience）、ニューヨーク州、セクション6.3と6.4（1987、1992）、およびサムブルーク（Sambrook）ら（Sambrook, J.C., Fritsch, E.F.およびManiatis, T.）（1989）、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク州）を参照されたい。
特に限定されないが、ストリンジェント条件の例には試験されるハイブリッドの計算されたTmより12〜20℃低い温度での洗浄条件、例えば2×SSCと0.5％ SDSで5分；2×SSCと0.1％ SDSで15分；0.1×SSCと0.5％ SDSで、37℃で30〜60分、次に0.1×SSCと0.5％ SDSで、68℃で30〜60分がある。ストリンジェンシー条件はまた、DNA配列、オリゴヌクレオチドプローブ（例えば10〜40塩基）、または混合オリゴヌクレオチドプローブの長さに依存することを、当業者は理解するであろう。混合プローブが使用される場合、SSCの代わりにテトラメチルアンモニウムクロライド（TMAC）を使用することが好ましい。
本発明のポリペプチドは、本発明のUBP8RPbポリペプチドと、少なくとも50％同一の、さらに好ましくは少なくとも60％同一の、およびさらに好ましくは70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一のアミノ酸配列を有するムテインを含む。例えば本発明の問題のアミノ酸配列と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドでは、問題のアミノ酸配列の各100個のアミノ酸について最大5つのアミノ酸の変化を含む以外は、対象ポリペプチドのアミノ酸配列が問題の配列と同一であることを意味する。すなわち、問題のアミノ酸配列と少なくとも95％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対象の配列中の最大5％（100のうちの5）のアミノ酸残基が、挿入、欠失、または他のアミノ酸により置換されてよい。
正確な対応が無い配列については、「％同一性」が測定される。一般に比較すべき2つの配列は、配列間の最大の相関を与えるために整列される。これは整列の程度を上昇させるために、いずれかまたは両方の配列に「ギャップ」を挿入することを含む。％同一性は、比較すべき配列のそれぞれの全長にわたって測定され（いわゆる全体的整列）、これは同じかまたは同様の長さの配列、または短い規定の長さの配列に特に適しており（いわゆる局所的整列）、これは長さが等しくない配列により適している。2つ以上の配列の同一性や相同性を比較する方法は当業界で公知である。すなわち、例えばウィスコンシン配列解析パッケージ（Wisconsin Sequence Analysis Package）バージョン9.1（Devereux J.ら、（1984）Nucleic Acids Res. 12:387-395）で入手できるプログラム（例えばプログラムBESTFITとGAP）を使用して、2つのポリヌクレオチドの間の％同一性、および2つのポリペプチド配列の間の％同一性と％相同性を決定してもよい。BESTFITはSmithとWaterman（1981, J．Mol. Evol. 18:38-46）の「局所的相同性」アルゴリズムを利用し、2つの配列の間の類似性の最良の単一の領域を見つける。配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムも当業界で公知であり、例えばBLASTファミリーのプログラム（Altschulら、（1990） J. Mol. Biol. 215:403-410、ワールドワイドウェブサイトのncbi.nlm.nih.govのNCBIのホームページからアクセスできる）およびFASTA（Pearson（1990）Methods in Enzymology, 183:63-99；PearsonとLipman（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448）がある。
本発明のムテインの好適な変化は、「保存的」置換として知られているものである。UBP8rpポリペプチドの保存的アミノ酸置換には、群のメンバー間の置換が分子の生物学的機能を維持するものと充分に同様の物理化学的性質を有する群内の同義のアミノ酸を含む（Grantham（1974）Science 185:862-864）。特にアミノ酸の挿入または欠失が数個のアミノ酸（例えば30個未満、好ましくは10個未満）を含むのみなら、そして機能的コンフォメーションに決定的に重要なアミノ酸を除去または置換しない（例えばシステイン残基）なら、その機能に影響を与えることなく上記配列中にアミノ酸の挿入と欠失を行うことができることは明らかである。かかる欠失および／または挿入により産生されるタンパク質およびムテインは、本発明の範囲内である。
好適な同義のアミノ酸群は表Iに記載のものである。より好適な同義のアミノ酸群は表IIに記載のものである；および最適な同義のアミノ酸群は表IIIに記載のものである。
Figure 2007503839
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本発明で使用されるポリペプチドであるUBP8rpのムテインを得るために使用できるタンパク質中のアミノ酸置換の作成の例には、任意の公知の方法、例えばMarkらの米国特許第4,959,314号、4,588,585号、および4,737,462号；Kothsらの米国特許第5,116,943号、Namenらの米国特許第4,965,195号；Chongらの米国特許第4,879,111号；およびLeeらの米国特許第5,017,691号；および米国特許第4,904,584号（Shawら）に記載のリシン置換タンパク質を含む。
好ましくは本発明のムテインは、これが対応するUBP8RPbポリペプチドと実質的に同じ生物活性を示す。
別の態様においてUBP8rpポリペプチドは、これが対応するUBP8RPbポリペプチドのような生物活性を示さない。本発明のポリペプチドの他の使用には、特にエピトープマッピングにおけるエピトープタグとしての使用、および当業者に公知の方法を使用するSDS-PAGEゲルまたはモレキュラーシーブゲルろ過カラム上の分子量マーカーとしての使用を含む。かかるポリペプチドを使用して、UBP8rp発現を検出するための、またはUBP8rpを精製するための測定法で有用なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を取り上げることができる。例えばUBP8rpポリペプチドのさらなる特異的な使用は、さらに後述されるように本発明の候補調節物質であるUBP8rp結合タンパク質を捕捉するための酵母2ハイブリッド系でのかかるポリペプチドの使用である。
3. 本発明のベクター、宿主細胞、および宿主生物
本発明はまた、UBP8rp遺伝子またはUBP8rpポリヌクレオチドを含むベクターに関する。さらに詳しくは本発明は、UBP8rp遺伝子またはUBP8rpポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。好ましくはかかる発現ベクターは、UBP8rpポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
本明細書において用語「ベクター」は、2本鎖または1本鎖であって、細胞宿主または単細胞のもしくは多細胞の宿主生物中に輸送される本発明の少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む、環状または線状DNAまたはRNA化合物を示すのに使用される。「発現ベクター」は、ベクター中に適切なシグナルを含み、該シグナルは種々の制御要素（例えば、宿主細胞中の挿入されたポリヌクレオチドを発現させるウイルス源および哺乳動物源からのエンハンサー／プロモーター）を含む。薬剤選択マーカーの発現をポリペプチドの発現に連結させる要素のように、例えば優性薬剤選択のような生成物を発現する永久的な安定な細胞クローンを樹立するための選択マーカーは、一般に本発明の発現ベクターに含まれる。発現ベクターはまた増幅マーカーを含んでよい。この増幅可能なマーカーは、例えばアデノシンデアミナーゼ（ADA）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）、多剤耐性遺伝子（MDR）、オルニチン脱炭酸酵素（ODC）およびN-(ホスホンアセチル)-L-アスパラギン酸耐性（CAD）よりなる群から選択される。
さらに発現ベクターは、UBP8rpポリペプチドと異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドを発現させる融合ベクターでもよい。例えば異種ポリペプチドは、選択マーカー（例えば、発光タンパク質）、または融合ポリペプチドの精製を可能にするポリペプチドでもよい。
本発明のポリヌクレオチドは、例えばコードされたポリペプチドを産生するための宿主細胞中でコードされたポリペプチドを発現するのに使用され得る。本発明のポリヌクレオチドは、スクリーニング測定法のために宿主細胞中でコードされたポリペプチドを発現するのにさらに使用され得る。スクリーニング測定法は、後に詳述されるようにUBP8rpポリペプチドの調節物質および／または結合パートナーを同定するために特に関係がある。本発明のポリヌクレオチドはまた、有益な効果を生成するために宿主生物中でコードされたポリペプチドを発現するのに使用され得る。かかる方法において、コードされるタンパク質は宿主生物中で一時的に発現されるか、または宿主生物中に安定的に発現される。コードされたポリペプチドは、前記の任意の性質を有し得る。コードされたポリペプチドは、宿主生物に欠如しているタンパク質であるか、またはコードされたタンパク質は宿主生物中のタンパク質の既存のレベルを増強し得る。
ある態様において発現ベクターは遺伝子治療ベクターである。遺伝子治療に応用されるウイルスベクター系は、例えばアデノウイルスベクター及びレトロウイルスベクターから得られている。
本発明の他の目的は、UBP8rp遺伝子またはUBP8rpポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。かかる宿主細胞はUBP8rpポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて形質転換、トランスフェクト、または形質導入することができた。また、例えば上記の1つのような組換えベクターを用いて形質転換、トランスフェクト、または形質導入された宿主細胞が含まれる。本発明の細胞宿主は、本発明の任意のポリヌクレオチドを含むことができる。
当業者に公知の任意の宿主細胞が使用され得る。本発明のポリヌクレオチドおよび発現ベクターのための受容体として使用される好適な宿主細胞には以下がある：
a)原核宿主細胞：大腸菌（E．coli）株（すなわち、DH5-α株）、枯草菌（Bacillus subtilis）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、およびシュードモナス（Pseudomonas）、ストレプトミセス（Streptomyces）およびスタフィロコッカス（Staphylococcus）のような種からの株。
b)真核宿主細胞：CHO（ATCC CCL-61）、HeLa細胞（ATCC CCL2；CCL2.1；CCL2.2）、Cv1細胞（ATCC CCL70）、COS細胞（ATCC CRL1650；CRL1651）、Sf-9細胞（ATCC CRL1711）、C127細胞（ATCC CRL-1804）、3T3（ATCC CRL-6361）、ヒト腎293（ATCC 45504；CRL-1573）、BHK（ECACC 84100501；84111301）、サッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）株、例えばAH109とY184、およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）株。
本発明の他の目的は、組換え法により上記ベクターと宿主細胞とを作成する方法を含む。本発明のベクターを構築し送達するのに、発現ベクターを構築しこれを細胞に送達する任意の周知の方法が使用され得る。かかる方法には、特に限定されないが、実施例に詳述したような方法を含む。
本発明の他の目的は、複数の細胞内にクローン化された組換えUBP8rpポリヌクレオチドを含むトランスジェニック動物である。本明細書において用語「トランスジェニック動物」または「宿主動物」は、本発明の核酸の1つを含むように遺伝的におよび人工的に操作されたゲノムを有する動物を意味するのに使用される。影響を受ける細胞は体細胞、生殖細胞、またはその両方でもよい。好適な動物は非ヒト哺乳動物であり、本発明の核酸の挿入により人工的および遺伝的に改変されたゲノムを有するハツカネズミ属（Mus）（例えばマウス）、クマネズミ属（Rattus）（例えばラット）、およびオリクトガルス属（Oryctogalus）（例えばウサギ）から選択される属に属するものを含む。ある態様において本発明は、本発明の組換えベクターまたはノックアウトベクターとの相同的組換えにより破壊されたUBP8rpポリヌクレオチドを含む非ヒト宿主哺乳動物および動物を包含する。
好適な態様においてこれらのトランスジェニック動物は、UBP8rp機能に関連する多様な病態を研究するための良好な実験モデルであり得る。特に(i)天然に存在するUBP8rp mRNAに結合するアンチセンスmRNAが転写される；または(ii)UBP8rpポリペプチドを発現するmRNAが転写されるトランスジェニック動物は、乾癬および／または他の慢性炎症性疾患のための良好な動物モデルであり得る。
4. 本発明のポリペプチドの作成法
本発明はまた、UBP8rpポリペプチドの作成法に関する。
ある態様において本発明のUBP8rpポリペプチドは、天然の供給源（ヒトまたは非ヒト動物の、組織及び細胞（直接単離された細胞または培養細胞）を含む）から単離される。可溶性型のUBP8rpは体液から単離される。天然の膜にわたるタンパク質を抽出し精製する方法は当業界で公知であり、粒子を破壊するための洗剤またはカオトロピック物質の使用を含み、次に例えばイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、密度沈降、およびゲル電気泳動によるポリペプチドの示差的抽出と分離を行う。例えば実施例4に記載の方法が使用され得る。本発明のポリペプチドはまた、タンパク質精製の分野で周知の方法を使用して、本明細書に開示のような本発明のポリペプチドに対する抗体を使用して天然供給源から精製することもできる。
好適な態様において本発明のUBP8rpポリペプチドは、当業界で公知のありきたりの発現法を使用して組換え産生される。所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、任意の便利な宿主に適した発現ベクター中でプロモーターに作用可能式に結合している。組換えポリペプチドを形成するのに、真核生物および原核生物宿主系の両方が使用できる。次に溶解細胞からポリペプチドが単離されるか、または可溶性型が産生される場合は培地から単離され、目的の使用に必要な程度まで精製される。
従って本発明のさらなる態様は、以下の工程を含む本発明のポリペプチドの作成方法である：
a)UBP8rpポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得る工程；
b)ポリヌクレオチドがプロモーターに作用可能式に結合するように、発現ベクター中に該ポリヌクレオチドを挿入する工程；および
該発現ベクターを宿主細胞中に導入し、こうして宿主細胞が該ポリペプチドを産生するようにさせる工程。
好適な態様においてこの方法はさらに、ポリペプチドを単離する工程を含む。この方法の任意の工程を別々に実施できることを当業者は理解するであろう。各工程の生成物は、以後の工程を実施するために別の工程に移してよい。
さらなる態様において該ポリペプチドはコード配列からなる。この態様の他の態様では、該ポリヌクレオチドは配列番号2を含むポリヌクレオチドまたはその断片である。
本発明のさらなる態様は、ポリペプチドの作成方法であって、UBP8rpポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を、該宿主細胞内のUBP8rpポリペプチドの産生に適した条件下で培養する工程を含む方法に関する。好適な態様においてこの方法は、培養物から該ポリペプチドを精製する工程をさらに含む。
別の態様において、分泌もしくはリーダー配列、プロ配列、精製を助ける配列（例えば多ヒスチジン残基またはGSTタグ）、または組換え産生中の安定性のための追加の配列をコードする追加のヌクレオチド配列を、UBP8rpポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドに付加することがしばしば有利である。UBP8rpポリペプチドの可溶性部分は、例えば安定な可溶性変異体を生成するためにIg-Fc部分に連結していてもよい。
本発明のポリペプチドは、特に限定されないが、示差的抽出、硫酸アンモニウム沈殿もしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、免疫クロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法により、組換え細胞培養物から回収し精製することができる。
発現されたUBP8rpポリペプチドは、任意の標準的免疫クロマトグラフィー法を使用して精製され得る。かかる方法において、目的のポリペプチドを含有する溶液（例えば培養培地または細胞抽出物）は、クロマトグラフィーマトリックスに結合したポリペプチドに対する抗体を有するカラムに適用される。組換えタンパク質が免疫クロマトグラフィーカラムに結合することが許容される。次にカラムを洗浄して、非特異的結合タンパク質を除去する。特異的に結合した分泌タンパク質は次にカラムから放出され、標準的方法を使用して回収される。
任意のこれらの方法により得られた精製UBP8rpポリペプチドは、さらに調製されて医薬組成物になる。
5. 本発明の抗体
本発明はさらに、本発明のUBP8rpポリペプチドに特異的に結合する抗体に関する。さらに本明細書において、かかる抗体は「抗UBP8rp抗体」と呼ばれる。さらに詳しくは、この抗体は本発明のポリペプチドのエピトープに結合する。本発明の抗体には、IgG（IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含む）、IgA（IgA1とIgA2を含む）、IgD、IgE、またはIgM、およびIgYを含む。用語「抗体」（Ab）は、少なくとも1つの結合ドメインを含んで成るポリペプチドまたはポリペプチド群であり、ここで結合ドメインは、抗原との免疫学的反応を可能にする、抗原の抗原決定基の特徴に相補的な内部表面形と電荷分布を有する3次元結合スペースを生成するための抗体化合物の可変ドメインの折り畳みにより生成される。本明細書において用語「抗体」は、全抗体（1本鎖全抗体、およびその抗原結合断片を含む）を含む。好適な態様において本発明の抗体はヒト抗原結合抗体断片であり、特に限定されないが、Fab、Fab'F(ab)2、およびF(ab')2、Fd、1本鎖Fvs（scFv）、1本鎖抗体、ジスルフィド結合Fvs（sdFv）、およびVLまたはVHドメインを含む断片を含む。抗体は、任意の動物起源（鳥および哺乳動物を含む）であってよい。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリ由来である。本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む。
ある態様において抗UBP8rp抗体は、UBP8rpポリペプチドのすべての対立遺伝子変異体に特異的に結合する。好ましくはかかる抗体は、UBP8rp関連2対立遺伝子マーカーを含まないエピトープを認識する。好適なかかる抗体には、配列番号3、53および56のポリペプチドに共通の領域内に位置するエピトープを認識するものを含む。
別の態様において抗UBP8rp抗体は、UBP8rpポリペプチドの所定の対立遺伝子変異体に特異的に結合する。
別の態様において抗UBP8rp抗体は、所定の多型性変化を含むUBP8rpポリペプチドの対立遺伝子変異体に特異的に結合する。
本発明の好適な抗体は、配列番号3のアミノ酸467〜482内の少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープを認識し、ここで該1つ以上のアミノ酸は、UBP8rpポリペプチドへの抗体の結合に必要である。
本発明の好適な抗体は、配列番号52のアミノ酸483〜485内の少なくとも1つのアミノ酸を含むエピトープを認識し、ここで該少なくとも1つのアミノ酸は、UBP8rpポリペプチドへの抗体の結合に必要である。
本発明の好適な抗体は、配列番号57の免疫原性ポリペプチドを使用して生成される抗体である。
本発明の好適な態様は、本発明の抗体をUBP8rpポリペプチドに特異的に結合させる方法である。この方法は、該抗体が該ポリペプチドに特異的に結合できる条件下で本発明の抗体をUBP8rpポリペプチドに接触させる工程を含む。かかる条件は当業者に周知である。この方法は、UBP8rpポリペプチドの活性を例えば検出、精製、または活性化もしくは阻害するために使用され得る。
本発明はさらに、本発明のポリペプチドの調節物質として作用する抗体に関する。好適な抗体は、これらが結合するUBP8rpポリペプチドの結合活性または生物活性を増強する調節物質である。これらの抗体は、UBP8rpポリペプチドの生物活性の調節物質として作用し得る。
6. 本発明のポリペプチドの使用
本発明はまた、候補調節物質をスクリーニングするための標的としてのUBP8rpポリペプチドの使用に関する。
本明細書において用語「調節物質」は、UBP8rpポリペプチドの任意の性質を上昇または低下させる化合物を意味する。本明細書において「UBP8rp調節物質」は、UBP8rpポリペプチドの活性を上昇または低下させる化合物、および／またはUBP8rp mRNAの転写レベルを上昇または低下させる化合物を意味する。用語「調節物質」は、アゴニストとアンタゴニストの両方を包含する。
本明細書において「UBP8rpアンタゴニスト」は、UBP8rpポリペプチドの活性を低下させる化合物、および／または該ポリペプチドをコードするUBP8rp mRNAの発現レベルを低下させる化合物を意味する。用語「アンタゴニスト」および「インヒビター」は、同義と見なされ、本開示において区別無く使用できる。
本明細書において「UBP8rpアゴニスト」は、UBP8rpポリペプチドの活性を上昇させる化合物、および／または該ポリペプチドをコードするUBP8rp mRNAの発現レベルを上昇させる化合物を意味する。用語「アゴニスト」および「アクチベーター」は、同義と見なされ、本開示において区別無く使用できる。
UBP8rpポリペプチドの活性を上昇または低下させるか、またはUBP8rp mRNAの発現を上昇または低下させる能力について、調節物質を試験するために使用できる方法は、当業界で周知であり後に詳述される。これらの測定法は、インビトロまたはインビボで行うことができる。
本発明の候補化合物には、天然の化合物および合成化合物がある。かかる化合物は、例えば天然のリガンド、小分子、アンチセンスmRNA、抗体、アプタマー、および小干渉性RNAを含む。本明細書において用語「天然のリガンド」は、インビボでPP2A/Bγを含むリン酸塩に結合する任意のシグナル伝達分子を意味し、例えば脂質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、および無機分子などの分子を含む。本明細書において用語「小分子」は、有機化合物を意味する。本明細書において用語「抗体」は、抗原に結合する免疫系の細胞、またはその断片により産生されるタンパク質を意味する。本明細書において用語「アンチセンスmRNA」は、通常処理されてmRNAになり翻訳される鎖に相補的なRNA分子、またはその領域に相補的なRNA分子を意味する。本明細書において用語「アプタマー」は、人工的核酸リガンドを意味する（例えば、EllingtonとSzostak（1990）Nature 346:818-498を参照）。本明細書において用語「小干渉性RNA」とは、配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを誘導する2本鎖RNAを意味する（例えば、Elbashirら（2001）Nature 411:494-498を参照）。
かかる候補化合物は、当業界で公知のコンビナトリアルライブラリー法の無数のアプローチのいずれか（例えば、生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能なパラレル固相ライブラリーもしくは液相ライブラリー、および親和性クロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含む）を使用して得ることができる。生物学的ライブラリーアプローチは一般に、ペプチドライブラリーとともに使用され、他の4つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、アプタマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用される。
調節物質について候補化合物をスクリーニングするのに使用される方法の1つの例は：
a)UBP8rpポリペプチドに候補化合物を接触させる工程；および
b)該候補化合物の存在下で該UBP8rpポリペプチドの活性を試験する工程、
を含む方法であり、ここで該化合物の非存在下での活性と比較した該化合物の存在下での該UBP8rpポリペプチドの活性の差は、化合物が該UBP8rpポリペプチドの調節物質であることを示す。
あるいは該測定法は：
a)UBP8rpポリペプチドを発現する細胞に候補化合物を接触させる工程；および
b)該候補化合物の存在下で該UBP8rpポリペプチドの活性を試験する工程、
を含む細胞ベースの測定法であり、ここで該化合物の非存在下での活性と比較した該化合物の存在下での該UBP8rpポリペプチドの活性の差は、化合物が該UBP8rpポリペプチドの調節物質であることを示す。
調節物質はインヒビターでもアクチベーターでもよい。インヒビターはUBP8rp活性を、該インヒビターの非存在下でのUBP8rp活性と比較して、例えば10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、または100％低下させ得る。アクチベーターはUBP8rp活性を、該アクチベーターの非存在下でのUBP8rp活性と比較して、例えば10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、または100％上昇させ得る。
調節物質は、該UBP8rpポリペプチドの任意の活性を調節する。調節物質は例えば、細胞内のUBP8rp mRNA発現を調節し、UBP8rpポリペプチドの酵素活性を調節し、またはその天然の結合パートナーへのUBP8rpポリペプチドの結合を調節し得る。好ましくはUBP8rpポリペプチドの活性は、タンパク質のユビキチン化状態を測定することにより評価される。
ある態様においてUBP8rpポリペプチドの活性は、タンパク質のユビキチン−結合および／または脱ユビキチン化を測定することにより評価される。タンパク質のユビキチン−結合および／または脱ユビキチン化を測定ための測定法は、当業者に公知である。かかる測定法は、例えばNaviglioら（1998, EMBO J. 17:3241-3250）、およびGnesuttaら（2001, J. Biol. Chem. 276:39448-39454）により発表されている。
好適な態様においてUBP8rpポリペプチドの活性は、該ポリペプチドの脱ユビキチン化活性を測定することにより評価される。UBP8rpポリペプチドの脱ユビキチン化活性は、Naviglioら（1998）の3248頁に記載の脱ユビキチン化測定法でUBP8rpポリペプチドをUBP8で置換することにより測定され得る。
別の態様においてUBP8rpポリペプチドの活性は、該UBP8rpポリペプチドの存在下でUBP8の脱ユビキチン化活性を測定することにより評価される。
さらに好適な態様においてUBP8RPポリペプチドの活性は、細胞内のUBP8rp mRNAレベルを測定することにより評価される。この態様において活性は、例えばUBP8RP mRNAに特異的なプライマーとプローブを用いてノーザンブロット、RT-PCR、定量的RT-PCRを使用して測定することができる。あるいはUBP8RP mRNAの発現が、免疫測定法（例えば、ELISA測定法、RIA測定法、ウェスタンブロット、または免疫組織化学測定法）でUBP8rpポリペプチドに特異的に結合する標識抗体を使用することにより、ポリペプチドレベルで測定される。
上記の任意のスクリーニングで見出され得るUBP8rpポリペプチドの調節物質は、慢性炎症性疾患の治療のための候補薬剤である。すなわち本発明の好適な態様は、慢性炎症性疾患の治療用の候補薬剤のために、候補化合物をスクリーニングするためのターゲットとしてのUBP8rpポリペプチドの使用である。
本明細書において用語「慢性炎症性疾患」は、個体の組織または臓器の慢性の病的炎症を意味する。慢性炎症性疾患は、例えば乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、および多発性硬化症を含む。好ましくは、該慢性炎症性疾患は乾癬である。
本発明のさらなる観点は、慢性炎症性疾患の治療用の薬剤のスクリーニングのためのUBP8rpポリペプチドの調節物質の使用である。慢性炎症性疾患の治療用の薬剤のスクリーニングのために、および／または慢性炎症性疾患の治療用のUBP8rpポリペプチドの調節物質の効力を評価するために、使用することができる方法の1つの例は、該調節物質を該慢性炎症性疾患の動物モデルに投与する工程を含む方法であり、ここで該調節物質が該動物モデルで該慢性炎症性疾患の代表的特徴を緩和するという測定は、該調節物質が該慢性炎症性疾患の治療用の薬剤であることを示す。好ましくは、該慢性炎症性疾患は乾癬である。
慢性炎症性疾患の動物モデル、および化合物が該動物モデルで慢性炎症性疾患の代表的特徴を緩和するかどうかを測定するための測定法は、当業者に公知である。乾癬の好適な動物モデルは、Zollnerら（2002, J. Clin. Invest. 109:671-679）が発表したSCID-huマウスである。
調節物質が慢性炎症性疾患の代表的特徴を緩和するかどうかの測定は、当業界で利用できるいくつかの方法を使用して行ってよい。特に乾癬を研究している時は、代表的特徴は、国立乾癬財団乾癬スコア（National Psoriasis Foundation Psoriasis Score）（NPF-PS）、乾癬部位重症度指数スコア（Psoriasis Area Severity Index score）（PASI）、または医師の全体的評価スコア（Physician's Global Asssessment score）（PGA）であろう（Gottliebら（2003）J．Drugs Dermatol. 2:260-266を参照）。
本発明のある好適な態様における代表的特徴は、乾癬部位と重症度指数スコア（Psoriasis Area and Severity Index score）である。乾癬部位と重症度指数（Psoriasis Area and Severity Index）は、全体的乾癬重症度と範囲の尺度である（Fredrikssonら（1978）Dermatologica 157:238-244）。これは、乾癬治療の臨床治験で一般的に使用される尺度である。
さらなる態様において、UBP8rpポリペプチドの調節物質が乾癬の動物モデルのPASIスコアを緩和するという測定は、該調節物質が乾癬の治療用の薬剤であることを示す。好ましくはPASIスコアの50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、またはそれ以上の改善は、該調節物質が乾癬の治療用の薬剤であることを示す。最も好ましくはPASIスコアの75％またはそれ以上の改善（PASI75）は、該調節物質が乾癬の治療用の薬剤であることを示す。
本発明のさらなる観点は、慢性炎症性疾患の治療用の薬剤を調製するためのUBP8rpポリペプチドの調節物質の使用に関する。かかる薬剤は、UBP8rpポリペプチドの調節物質を任意の生理学的に許容される担体との組合せ中に含む。生理学的に許容される担体は当業者に公知の任意の方法により調製することができる。生理学的に許容される担体には、特に限定されないがレミントンの薬剤科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）（マックパブリッシング社（Mack Publishing Company）、イーストン（Easton）、アメリカ合衆国 1985）に発表されたものがある。UBP8rpポリペプチドの調節物質と生理学的に許容される担体とを含む医薬組成物は、例えば静脈内、局所的塗布、直腸内、局所的、吸入、皮下、皮内、筋肉内、経口、脳内、およびくも膜下用途でもよい。組成物は、液体（例えば、液剤、懸濁剤）、固体（例えば丸剤、錠剤、坐剤）、または半固体（例えばクリーム剤、ゲル剤）型でもよい。投与量は、個体のニーズ、所望の効果、および選択された投与経路に依存する。
実施例7での検討のようにUBP8rpの特異的変異体は、乾癬病変中の免疫適格細胞の特定の比率での存在のために乾癬性ケラチン細胞に異常な増殖能力を付与し得る。従ってUBP8rpアンタゴニストは、慢性炎症性疾患の治療用の好適な候補薬剤である。
本発明の(i)UBP8rp調節物質；または(ii)遺伝子治療ベクターを含むかかる薬剤は、慢性炎症性疾患の治療用の任意の公知の薬剤との組合せにおいて使用される。例えば乾癬を治療する場合、調節物質は、ラプチバ（Raptiva）、タザロチン（Tazarotene）、アナプソス（Anapsos）、アレファセプト（Alefacept）、ミカノール（Micanol）、エファリス（Efalith）、オロパタジン（Olopatadine）、カルシポトリオール（Calcipotriol）、シクロスポリンA（Cyclosporin A）、プロピオン酸ハロベタゾール（Halobetasol propionate）、ハロメタゾン（Halometason）、アシトレチン（Acitretin）、GMDP、シルキス（Silkis）、ベタメタゾンムース（Betamethasone mousse）、プロピオン酸クロベタゾールフォーム（Clobetasol propionate foam）、タカルシトール（Tacalcitol）、および／またはファレカルシトリオール（Falecalcitriol）との組合せにおいて投与され得る。
本発明はさらに、天然の結合パートナーをスクリーニングするためのUBP8rpポリペプチドの使用に関する。UBP8rpポリペプチドを標的として使用することは、乾癬に関与するタンパク質の同定に、および慢性炎症性疾患の治療における新しい介入点の提供に、大きな有用性がある。UBP8rpポリペプチドの天然の結合パートナーをスクリーニングするためのかかる方法は、当業界で周知である。本発明のUBP8rpポリペプチドと相互作用する候補物質をスクリーニングするための1つの方法は、以下の工程を含む：
a)UBP8rpポリペプチドからなるポリペプチドを提供する工程；
b)候補ポリペプチドを得る工程；
c)該ポリペプチドを該候補ポリペプチドに接触させる工程；
d)該ポリペプチドと該候補ポリペプチドとで形成される複合体を検出する工程。
上記スクリーニング法のある態様において、ポリペプチドと候補物質とで形成される複合体は、UBP8rpポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の存在下でさらにインキュベートされる。
スクリーニング法の詳細な態様において、候補は、ファージベクターに含有されるDNA挿入体の発現生成物である（ParmleyとSmith（1988）Gene 73:305-318）。具体的には、ランダムペプチドファージライブラリーが使用される。ランダムDNA挿入体は、8〜20アミノ酸の長さのポリペプチドをコードする（例えば、Oldenburgら（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393-5397；Valadonら（1996）J. Immunol. Methods 197:171-179を参照）。この詳細な態様によれば、固定化UBP8rpポリペプチドに結合するポリペプチドを発現する組換えファージが保持され、UBP8rpポリペプチドと組換えファージとで形成される複合体は次に、UBP8rpポリペプチドに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体により免疫沈降され得る。
スクリーニング法のさらなる詳細な態様では、結合パートナーは2ハイブリッドスクリーニング測定法により同定される。酵母2ハイブリッド系は、インビボのタンパク質−タンパク質相互作用を研究するように設計され（FieldsとSong（1989）Nature 340:245-6）、酵母Gal4タンパク質のDNA結合ドメインへのえさ（bait）タンパク質の融合に依存する。この方法はまた、米国特許第5,667,973号および5,283,173号に発表されている。2ハイブリッド測定法によるライブラリースクリーニングの一般的方法は、例えばFromont-Racineら（1997, Nat Gent. 16:277-282）により発表されたように行わてよく、えさポリペプチドはUBP8rpポリペプチドからなる。より正確にはUBP8rpポリヌクレオチドは、GAL4タンパク質のDNA結合ドメインをコードするポリヌクレオチドにフレーム内で融合され、融合ヌクレオチド配列は、適当な発現ベクター（例えばpAS2またはpM3）に挿入される。
スクリーニング法のさらなる詳細な態様では、結合パートナーは親和性クロマトグラフィーにより同定される。UBP8rpポリペプチドは、適切なカラムマトリックス（例えば、アガロース、アフィゲル（Affi Gel）（商標）など）への化学結合を含む従来法を使用して、カラムに結合され得る。この方法のある態様において親和性カラムは、UBP8rpポリペプチドまたはその断片がグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）に融合したキメラタンパク質を含有する。上記のように細胞タンパク質の混合物または発現されたタンパク質のプールは親和性カラムに適用される。次にカラムに結合したUBP8rpポリペプチドと相互作用するポリペプチドが単離され、例えばRamnsenら（1997, Electrophoresis, 18:588-598）が発表したように2-D電気泳動ゲル上で分析される。あるいは親和性カラムに保持されたタンパク質は、電気泳動に基づく方法により精製し配列決定することができる。
スクリーニング法のさらなる詳細な態様では、結合パートナーはバイオセンサー法により同定される（例えば、EdwardsとLeatherbarrow, 1997を参照）。この方法は、標識分子を必要とすることなく、リアルタイムでの分子間の相互作用の検出を可能にする。
7. 本発明の2対立遺伝子マーカー
本発明は、該2対立遺伝子マーカーと慢性炎症性疾患との間に有意な相関があるかどうかを測定するための、後述の2対立遺伝子マーカーよりなる群から選択される少なくとも1つのUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーの使用に関する。
本明細書において用語「2対立遺伝子マーカー」は、集団中にかなり高い頻度で2つの対立遺伝子を有する多型性、好ましくは単一ヌクレオチド多型性を意味する。典型的には本発明の2対立遺伝子マーカーのあまり一般的ではない対立遺伝子の頻度が、1％より大きいことが証明されており、好ましくは、頻度は10％より大きく、さらに好ましくは頻度は少なくとも20％（すなわち、ヘテロ接合性率が少なくとも0.32）、さらにより好ましくは頻度が少なくとも30％（すなわち、ヘテロ接合性率が少なくとも0.42）である。本明細書において用語「2対立遺伝子マーカー」は、多型性と多型性を有する遺伝子座の両方を意味するのに使用される。本明細書において用語「UBP8rp関連2対立遺伝子マーカー」は、UBP8rp遺伝子のエキソン中に、UBP8rp遺伝子のイントロン中に、またはUBP8rp遺伝子の制御領域中に位置する2対立遺伝子マーカーを意味する。用語「本発明のUBP8rp関連2対立遺伝子マーカー」は、前述のおよび実施例3に記載の2対立遺伝子マーカー1、2、4、6、7、10、12〜19、21〜30、31〜35、および37〜96を意味する。
該2対立遺伝子マーカーと慢性炎症性疾患との間に有意な相関があるかどうかを調べることは、当業者に公知の任意の方法を使用して行われる。例えば本発明のUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーは、試験すべき炎症疾患の症例集団と対照集団で遺伝子型判定される。症例と対照とのマーカーの対立遺伝子頻度は、例えばピアソンカイ（Pearson Chi）二乗検定を使用して研究され得る。EM（予測最大）アルゴリズム（Excoffier LとSlatkin M, 1995）を使用して、試験下にある個体群のハプロタイプが推定される。あるいはハプロタイプ頻度推定は、OMNIBUS確率比検定（PCT公報WO01/091026）を適用して行われる。本発明のUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーと乾癬との相関はまた、Vealら（2002）により発表されたように行われる。
本発明のUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーに関するすべての観点と態様において、慢性炎症性疾患は好ましくは、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、および多発性硬化症よりなる群から選択される。最も好ましくは、慢性炎症性疾患は乾癬である。
本発明はさらに、個体が慢性炎症性疾患に罹っているかまたは罹るリスクがあるかどうかを診断するための、本発明の少なくとも1つのUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーの使用に関する。特に該個体中の対立遺伝子A9の存在は、個体が慢性炎症性疾患に罹っているかまたは罹るリスクがあることを示す。
ある態様において、個体の遺伝子型を測定することにより個体が慢性炎症性疾患に罹っているかまたは罹るリスクがあるかを診断するために、単一の2対立遺伝子マーカーが使用される。別の態様において、個体のハプロタイプを測定することにより個体が慢性炎症性疾患に罹っているかまたは罹るリスクがあるかを診断するために、いくつかの2対立遺伝子マーカーの組合せが使用され得る。例えば、2マーカーハプロタイプ、3マーカーハプロタイプ、または4マーカーハプロタイプが測定され得る。
本明細書において用語「遺伝子型」は、個体または試料中に存在する対立遺伝子の本体を意味する。用語「遺伝子型」は、個体のゲノム中に存在する単一の2対立遺伝子マーカーの両方のコピーの説明に関する。ゲノム中に存在する2対立遺伝子マーカーの2つの対立遺伝子が同一である場合、その個体はホモ接合性である。ゲノム中に存在する2対立遺伝子マーカーの2つの対立遺伝子が異なる場合、その個体はヘテロ接合性である。
2対立遺伝子マーカーについて試料または個体を「遺伝子型判定」するという用語は、2対立遺伝子マーカーで個体が有する特異的対立遺伝子または特異的ヌクレオチドを測定することを含む。
本明細書において用語「ハプロタイプ」は、1つの染色体上に存在して一緒に遺伝する傾向のある密接に連関した2対立遺伝子マーカーの一式の対立遺伝子を意味する。
個体が有する対立遺伝子、遺伝子型、またはハプロタイプを決定する方法は当業者に周知であり、後に詳述される。
本発明に関連して、個体は一般的にヒトであると理解される。
UBP8rp関連2対立遺伝子マーカー20および36は乾癬に高度に関連し、10-9以下のp値を与える（Vealら、2002）。すなわち本発明の好適な態様は、(i)本発明の少なくとも1つのUBP8rp関連2対立遺伝子マーカー；および(ii)個体が乾癬に罹っているかまたは罹るリスクがあるかを診断するための2対立遺伝子マーカー20および／または2対立遺伝子マーカー36の使用に関する。
実施例4に開示されるように、UBP8rp遺伝子の11個の対立遺伝子が本発明の枠内で同定されている。本明細書において「UBP8rpの対立遺伝子」は、UBP8rp遺伝子の所定の変異体を意味する。表4〜7は、配列番号1のヌクレオチド位置829〜2525に位置するUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーに存在するヌクレオチドを示す。表4〜7に詳述される対立遺伝子A9が、正常な個体より乾癬に罹った個体により頻繁に見つかることが実施例5にさらに証明される。
本発明の使用と方法に使用されるUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーの好適なセットは、表4〜7に示す2対立遺伝子マーカーのセットである。
本発明はさらに、以下の工程を含む遺伝子型判定法に関する：
a)生物学的試料から核酸を単離する工程；および
b)本発明の1つ以上のUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーに存在するヌクレオチドを検出する工程。
好ましくは、該生物学的試料は単一の個体から得られる。該2対立遺伝子マーカーでのヌクレオチドの本体は、該個体のゲノム中に存在する該2対立遺伝子マーカーの両方のコピーについて測定されることが好ましい。好適な態様において該2対立遺伝子マーカーでのヌクレオチドの本体は、微量配列決定法により測定される。好ましくは2対立遺伝子マーカーを含む配列の部分は、ヌクレオチドの本体の測定前に増幅される。増幅は好ましくはPCRにより行われる。遺伝子型判定の方法は当業者に周知であり、任意の他の公知のプロトコールが使用され得る。本発明のUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーに存在するヌクレオチドは、例えば実施例3に記載のように測定される。該個体中の対立遺伝子A9の存在は、該個体が該慢性炎症性疾患に罹っているかまたは罹るリスクがあることを示す。
2対立遺伝子多型性を検出するための遺伝子型判定に使用される当業者に周知の方法には、従来のドットブロット分析、1本鎖コンフォメーション多型分析（SSCP）（Oritaら（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766-2770）、変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）（Borresenら（1988）Mutat Res. 202:77-83）、ヘテロ2本鎖分析（Lessaら（1989）Mol Ecol. 2:119-129）、ミスマッチ切断検出（Grompeら（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5888-5892）がある。特定の多型性部位に存在するヌクレオチドの本体を測定するための別の方法は、米国特許第4,656,127号の発表のように特殊なエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体を使用する。オリゴニクレオチドマイクロアレイまたは固相捕捉ジデオキシヌクレオチド、および質量スペクトル法も使用され得る（Wenら（2003）World J Gastroenterol. 9:1342-1346；Kimら（2003）Anal. Biochem. 316:251-258）。好適な方法では、配列決定法、微量配列決定法、酵素ベースのミスマッチ検出法、またはハイブリダイゼーション測定法により、2対立遺伝子マーカー部位に存在するヌクレオチドの本体が直接測定される。
本明細書において用語「生物学的試料」は、核酸を含む試料を意味する。精製型または非精製型の核酸の任意の供給源を、所望の特定の核酸配列を含有するかまたは含有することが疑われる場合は、出発核酸として利用することができる。DNAまたはRNAは、細胞、組織、体液などから抽出され得る。
遺伝子型判定法は、例えば相関試験で症例−対照集団を遺伝子型判定するのに、ならびに所定の形質と関連することが公知の2対立遺伝子マーカーの対立遺伝子の検出において個体を遺伝子型判定するのに使用される。本発明に関連して、好適な形質は、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、喘息、炎症性腸疾患、および多発性硬化症よりなる群から選択される慢性炎症性疾患であり、最も好ましくは乾癬である。
ある態様において上記遺伝子型判定法は、遺伝子型判定工程の結果を慢性炎症性疾患に罹るリスクと相関付ける工程をさらに含む。
本発明はさらに、個体のハプロタイプを測定するための本発明の少なくとも1つのUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーの使用に関する。個体のハプロタイプを測定する時は、各単一の染色体を独立に研究すべきである。個体のハプロタイプを測定する方法は当業界で周知であり、例えば非対称PCR増幅（Newtonら（1989）Nucleic Acids Res. 17:2503-2516；Wuら（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2757-2760）、限界希釈による単一染色体の単離後のPCR増幅（Ruanoら（1990）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6296-6300）、および充分に近接した2対立遺伝子マーカーのためには、特異的対立遺伝子の2重PCR増幅（SarkarとSommer（1991）Biotechniques 10:436-440）がある。
すなわち本発明はさらに、個体のハプロタイプを測定するための本発明のUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーの少なくとも1つの使用に関する。例えば個体の2対立遺伝子マーカーのセットのハプロタイプを測定するための方法は、a)少なくとも1つのUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーについて該個体を遺伝子型判定する工程、b)第2の2対立遺伝子マーカーのヌクレオチドの本体を測定することにより第2の2対立遺伝子マーカーについて該個体を遺伝子型判定する工程を含む。ある態様において両方のマーカーは、本発明のUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーである。別の態様において、1つのマーカーは本発明のUBP8rp関連マーカーであり、他の2対立遺伝子マーカーは2対立遺伝子マーカー20または36である。
個体中の本発明の少なくとも1つのUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーを含む3つ以上の2対立遺伝子マーカーの組合せについてハプロタイプを測定する方法もまた、本発明により包含される。かかる方法において工程(b)は組合せの追加のマーカーのそれぞれについて繰り返される。かかる組合せは、例えば3、4または5個の2対立遺伝子マーカーを含み得る。
集団中のハプロタイプ頻度を推定する時、各個体にハプロタイプを割り当てることのない方法を使用してもよい。かかる方法は、ハプロタイプ測定の統計的方法を使用する。すなわち本発明の別の観点は、集団中の一式の2対立遺伝子マーカーについてハプロタイプの頻度を推定する方法であって、a)該集団中の各個体を少なくとも1つのUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーについて遺伝子型判定する工程、b)該集団中の各個体を、第2の2対立遺伝子マーカーのヌクレオチドの本体を測定することにより、第2の2対立遺伝子マーカーについて遺伝子型判定する工程、およびc)工程a)とb)で測定されたヌクレオチドの本体にハプロタイプ測定法を適用して該頻度の推定値を得ることを含んでなる方法を包含する。かかる方法はまた、3つ以上の2対立遺伝子マーカーの組合せについて行われ得る。工程(c)は、集団中のハプロタイプの頻度を測定または推定するための当業界で任意の公知の方法を使用して行われ得る。好ましくは、ハーディ−ワインバーグ（Hardy-Weinberg）比率（ランダム交配）を仮定して、ハプロタイプ頻度の最大−確率推定値を与える予測−最大（EM）アルゴリズムに基づく方法（Dempsterら（1977）JRSSB, 39:1-38；ExcoffierとSlatkin（1995）Mol Biol Evol. 12:921-7）が、工程(c)について使用される。
本発明を詳細に説明したため、本発明の精神と範囲を逸脱することなくかつ不要な実験をすることなく、広範囲の同等のパラメータ内で同じことを実施できることは当業者により理解されるであろう。
本発明をその具体例に関連して説明したが、さらなる修飾が可能であることは理解されるであろう。本出願は一般的に本発明の原理に従って、および本発明が関連する分野内の公知のまたは通常の行為内で、かつ添付の請求項の範囲内に開示されるように、これまで説明した基本的な特徴に適用されるように、本開示からの逸脱を含み、本発明の任意の変更、使用、または改変を包含すると意図される。
本明細書で引用したすべての文献（雑誌論文、または抄録、公開されたかまたは未公開の特許出願、発行された特許または任意の他の文献を含む）は、引用文献中のすべてのデータ、表、図および本文を含み、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに本明細書に引用された文献内に引用された文献の全内容もまた参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
公知の方法の工程、従来法の工程、公知の方法、または従来法への言及は、本発明の観点、記載または態様が、関連分野で開示され、教示され、または示唆されていることを認めるものではない。
特定の態様の前記説明は、本発明の一般的性質を完全に開示しているため、他人は当業界の技術（本明細書に引用された文献の内容を含む）内の知識を適用することにより、不要な実験をすることなく、本発明の一般的概念から逸脱することなく、かかる特定の態様を種々の適用のために容易に修飾および／または改変できる。従って、かかる改変および修飾は、本明細書に記載の教示と指導に基づき、開示された態様の同等物の意味と範囲内にあると考えられる。本明細書の言い回しまたは用語は説明のためであって限定するためではなく、本出願の用語または言い回しは、通常の当業者の知識と組合せて、本明細書に示した教示と指導を考慮することにより、当業者により理解されるであろう。
UBP8rp遺伝子の同定
1.1 UBP8rp mRNAの単離
ストラタジーン（Stratagene）からのポリA+ RNA（参照番号778021と778022）についてRT-PCRを行った。各RNA試料についてオリゴ（dT）とランダムプライマーを用いてRt-for-PCRキット（クロンテク（Clontech））の助けを借りてcDNAを合成した。反応物について得られたcDNA量は、反応につき0.6〜1.5μgのcDNAで変動した。100μlのRT-PCR試料のうちの5μl、配列番号5と6のプライマー、およびrTth酵素を使用してPCR反応を行った。サイクルは以下の通りであった：94℃で5分；94℃で20秒、67℃で3分を32サイクル；72℃で10分。
最初のPCR反応物を5倍希釈し、その2％を使用して、配列番号7と8のプライマーを用いてネステッドPCRを行った。サイクル条件は上記と同じであった。
得られた生成物を配列番号9〜35のプライマーを使用して配列決定した。配列決定はABI377シーケンサーで行った。増幅生成物の配列は、色素ターミネーターサイクル配列決定プロトコールを用いて、自動ジデオキシターミネーター配列決定反応を使用して測定した。配列決定反応の生成物を配列決定ゲル上に流し、ゲル画像分析を使用して測定した（ABIプリズムDNA配列決定分析ソフトウェア（2.1.2バージョン））。
cDNAは配列番号2の読みとり枠を含有した。この読みとり枠は、482アミノ酸長のタンパク質（UBP8rpタンパク質）（配列番号3）をコードする。
1.2 UBP8rp遺伝子の同定と注釈
UBP8rpタンパク質をコードするゲノム領域を、バイオインフォマティック手段を使用して同定した。UBP8rp遺伝子を配列番号1に示す。この遺伝子は、10kbの乾癬感受性主要領域内に位置し、これはVealら（2002）により同定された。UBP8rp遺伝子は、配列番号1のヌクレオチド位置1018〜1046と1676〜1718に位置する2つのイントロンを含む（図1参照）。
すなわち予想外に、10kbの乾癬感受性主要領域内に新規発現遺伝子が存在することが発見された。先行技術の文献では、UBP8rpをコードする遺伝子は、任意の読みとり枠を含まないサイレント偽遺伝子要素として説明された。
1.3. UBP8rpタンパク質の分析
UBP8rpタンパク質は、UBP8ユビキチンイソペプチダーゼと有意な相同性を示す。ブラスト（BLAST）バージョン2.0プログラム（Altschul ら、1990, J. Mol. Biol. 215:403-410）を使用してUBP8rpをUBP8と比較すると、UBP8rpはUBP8と74％同一であることがわかる（図2）。さらに詳しくはUBP8rpのアミノ酸57〜466は、UBP8のアミノ酸78〜492と相同性を示す（81％の同一性）。
SignalPとToppredプログラム（Nielsenら、1999 Protein Engineering 12:3-9, von Heijne. 1992 J. Mol. Biol. 225:487-494）を使用して、UBP8rpは細胞内タンパク質であることがわかった。UBP8rpはさらに、HMMER 2.1.1プログラム（Eddy. 1996 Current Opinion in Structural Biology 6:361-365）を使用して分析された。図3に示すようにUBP8rpは、アミノ酸位置164〜433にローダナーゼ様Pfamドメインを示す（スコア：32.7；e値：8.3e-06）。UBP8とサッカロミセス・セレビッシェ（Saccharomyces cerevisiae）のユビキチンイソペプチダーゼ7は単一のローダナーゼ様ドメインを示すため、ローダナーゼ様ドメインの存在はUBPの共通の特徴である。
すなわちUBP8rpはUBPファミリーの新規メンバーである。UBP8rpはユビキチン−プロテオソーム経路に属するようであり、細胞内タンパク質の選択的分解においてある役割を果たし得る。
定量的PCRによるUBP8rp発現の分析
2.1. 異なる組織中のUBP8rpの発現
成人の皮膚、胎児の皮膚、睾丸、脳、脂肪組織、小腸、および結腸中のUBP8rpの発現レベルを、市販の総RNA（クロンテク（Clontech））を使用して測定した。さらに成人の皮膚中のUBP8rpの発現レベルをまた、パスツール病院（l'Hospital Pasteur）（パリ、フランス）からの皮膚生検試料を使用して測定した。
20μlの市販の総RNAを4単位のRNase不含DNaseI（アンビオン（Ambion））により処理した。cDNAは、「Advantage RT for PCR」キット（クロンテク（Clontech））を使用して業者の説明書に従って得た。タックマンユニバーサルPCRマスターミックスNOアンペラーゼUNG（TaqMan Universal PCR Master mix NO AmpErase UNG）（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems））を使用して、定量的PCRを行った。反応は、25ngのcDNA、300nMの各プライマー、および200nMのタクマン（Taqman）プローブを用いて行った。適用したプログラムは以下の通りであった：95℃で10分、95℃で数秒、60℃で1分を40〜50サイクル。
7900HTアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）機械で実験を行った。各実験は、以下の表1に詳述するように配列番号36〜38のプライマーまたは配列番号39〜41のプライマーを用いて行った。選択されたプライマーの効力は、ユーザー会報・アプライド・バイオシステムズ（User Bulletin Applied Biosystems）（1997−更新10/2001）ABI PRISM 7700配列検出システムに記載のように計算した。遺伝子発現の相対的定量。ユーザー会報＃2。
Figure 2007503839
発現はLivakとSchmittgen（2001, Methods 25:402-408）が記載したように計算した。Ctは、遺伝子の相対的発現レベルを示す絶対値である。20未満のCtは、高度に発現された遺伝子であることを示す。35〜40のCtは、弱く発現された遺伝子であることを示す。2-ΔΔCtの計算は、研究すべき標的組織中の遺伝子の発現レベルと参照組織中の遺伝子の発現レベルを比較することを可能にする。
プライマーがUBP8rpを特異的に増幅し、他の遺伝子は増幅しないことを確認するために、定量的PCRにより得られるアンプリコンを、QPCRを行うのに使用される前進プライマーと逆進プライマーとを使用して配列決定した。PCRにより増幅されたcDNAはUBP8rp cDNAに有効に対応することがわかった。
定量的発現分析の結果を表2に示す。2-ΔΔCt値は、睾丸（睾丸では多くの遺伝子が高レベルで発現されている）を参照組織として使用して計算した。
Figure 2007503839
市販のRNAを使用して、UBP8rpは睾丸、胎児の皮膚、および低レベルではあるが結腸で、有意に発現されていることがわかった。さらにUBP8rpは、成人の皮膚、脳、脂肪組織、および小腸中では非常に低レベルで発現されていることがわかった。
皮膚生検試料からのRNAを使用すると、UBP8rpは成人の皮膚で有意に発現されていることがわかる。特に配列番号36〜38のプライマーおよび配列番号39〜41のプライマーの両方を用いると、UBP8rpの発現は他のどの組織より成人の皮膚で高いことがわかる。配列番号36〜38のプライマーを使用して実験を行うと、UBP8rpの発現は、睾丸より成人の皮膚で2.5倍高いことがわかる。
2.2. ケラチン細胞の発生中のUBP8rpの発現
発生中のケラチン細胞中でのUBP8rpの発現を調べた。ケラチン細胞はスキネティック（Skinethic）社（ニース、フランス）により細胞発生の種々の時点で供給された。3日目（D3）、5日目（D5）、7日目（D7）、10日目（D10）、13日目（D13）および17日目（D17）。UBP8rp、UBP8、サイトケラチン15、およびソリアシン（Psoriasin）の発現レベルを定量的PCRにより測定した。
異なるケラチン細胞培養物からの総RNAを、RNeasy（商標）ミニキットキアゲン（RNeasy Mini kit Qiagen）により提供された説明書に従って抽出した。DNA混入はDNaseI（キアゲン（Qiagen））によりRNAから除去し、試料をDEPC（ジエチルピロカーボネート）処理水に再懸濁した。濃度は、ジーンクアントプロ（GeneQuant pro）RNA-DNAカルキュレーター（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech））を使用して分光光度法260/280nmにより測定した。性質は、RNA 6000ナノアッセイラボチップ（商標）と試薬（アジレントテクノロジーズ（Agilent Technologies）、ワルドブロン（Waldbronn）、ドイツ）を使用してアジレント（Agilent）2100バイオアナライザーで業者の説明書に従って測定した。
cDNAは、「Advantage RT for PCR」キット（クロンテク（Clontech））を使用して業者の説明書に従って得た。UBP8とUBP8rp遺伝子については、タックマンユニバーサルPCRマスターミックスNOアンペラーゼUNG（TaqMan Universal PCR Master mix NO AmpErase UNG）（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems））を使用して、サイトケラチン15とソリアシンについてはSYBRグリーンPCRマスターミックス（SYBR Green PCR Master Mix）（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems））を使用して、定量的PCRを行った。適用したプログラムは以下の通りであった：95℃で10分、95℃で15秒、60℃で1分を40サイクル。
7900HTアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）機械で実験を行った。各実験は、以下の表2に詳述する配列番号のプライマーを用いて行った。選択されたプライマーの効力は、ユーザー会報・アプライド・バイオシステムズ（User Bulletin Applied Biosystems）（1997−更新10/2001）ABI PRISM 7700配列検出システムに発表のように計算した。遺伝子発現の相対的定量。ユーザー会報＃2。
Figure 2007503839
発現はLivakとSchmittgen（2001, Methods 25:402-408）が発表したように計算した。Ctは、遺伝子の相対的発現レベルを示す絶対値である。2-ΔΔCtの計算は、研究すべき標的組織中の遺伝子の発現レベルと参照組織中の遺伝子の発現レベルを比較することを可能にする。
遺伝子サイトケラチン15とソリアシン（S100A7とも呼ぶ）を対照として使用した。ソリアシンは乾癬中でアップレギュレートしていることが知られているため使用した（Sempriniら（2002）Hum Genet. 111:310-313）。サイトケラチン15はケラチン細胞分化のマーカーであるため使用した。サイトケラチン16と17もまた、対照として試験したが、サイトケラチン15は最も再現性ある結果を与えた（Leubeら（1988）J. Cell. Biol. 106:1249-1261）
結果を表2Bと図4に示す。
Figure 2007503839
表2Bに示した比率の生データは、例えば：
− UBP8発現は、3日目の発現と比較して5日目に1.36倍アップレギュレートされている；および
− サイトケラチン15発現は、3日目の発現と比較して5日目に0.87倍アップレギュレートされている、ことを示す。
図4から、UBP8rpの転写レベルは、培養している正常なヒトケラチン細胞の増殖および進化中に調節されていると結論することができる。乾癬は、ケラチン細胞の高増殖とケラチン細胞の分化の変化とを特徴とする炎症性皮膚疾患であるため、これらの結果は、UBP8rpが乾癬において役割を果たし得ることをさらに示す。
UBP8rp遺伝子中に位置する2対立遺伝子マーカーの同定
BM番号17〜19、22、25、27〜29、31〜35および37〜101を後述のように同定した。Celeraにより提供された配列データを使用して、15個の2対立遺伝子マーカーが同定された（BM番号1、2、4、6、7、10、12〜16、21、23、24および26）。
リンパ芽球性細胞株LucyまたはBoleth（CEPHコレクション）からのゲノムDNA 50〜100ngを使用して、配列番号42と43のプライマーを用いてPCR反応を行った。PCRアッセイは、以下のプロトコールを使用して行った：
− 5単位のアンプリタク（AmpliTaq）酵素（パーキンエルマー（Perkin Elmer）、番号808-0101）
− 10×供給されたTaq緩衝液との30μlの反応混合物
− 250μMずつのdNTP
− 15μMの各プライマー
− サイクリング：94℃で10分、次に3つの工程（94℃で30秒；55℃で30秒；72℃で30秒）を30サイクル、次に72℃で10分。
PCR生成物を、増幅プライマーを用いて配列決定した。配列はゲノム配列に対してブラスト（blast）し配列曲線を比較した。こうして、2対立遺伝子性マーカー番号17〜19と22を同定した。
リンパ芽球性細胞株LucyまたはBoleth（CEPHコレクション）からのゲノムDNA 50〜100ngを使用して、配列番号44と45のプライマーを用いて長期PCR反応を行った。PCRアッセイは、以下のプロトコールを使用して行った：
− 2単位のrTTh XL酵素（パーキンエルマー（Perkin Elmer）
− 供給された3.3×緩衝液と200μMの各dNTPとの50μlの反応混合物
− 20μMずつの各プライマー
− 1.1ｍMのMgOAc
− サイクリング：94℃で5分、次に2つの工程（94℃で20秒；66℃で4分）を32サイクル、次に72℃で10分。
得られた生成物を以下のプライマー対（配列番号46と47、配列番号48と49、配列番号50と51）を用いて配列決定した。配列はブラスト（blast）と配列電気泳動図の用手法的検査により比較した。
配列番号46と47による配列決定は、2対立遺伝子マーカー番号25の同定を可能にした。配列番号48と49による配列決定は、2対立遺伝子マーカー番号27〜29および31の同定を可能にした。配列番号50と51による配列決定は、2対立遺伝子マーカー番号27〜29および31の同定を可能にした。
乾癬に罹っている個体および対照個体からのゲノムDNA試料をクローン化し、配列番号67〜77を用いて配列決定した。
これらの試料は以下に対応する：
− 乾癬に罹っているロシア人からの19個の皮膚生検試料。これらの人は、オナーセプト（Onercept）の効力を評価するための臨床治験を受けていた。
− 精神分裂病にかかっていないロシア人の血液からの20個のDNA試料。これらの人が乾癬に罹っているかどうかは不明である。
− 外科的介入が行われている個人からの5つの皮膚試料。これらの人が乾癬に罹っているかどうかは不明である。
これらの試料の配列決定は、2対立遺伝子マーカー番号42〜101の同定を可能にした。
2対立遺伝子マーカー番号1〜101の別の対立遺伝子とUBP8rp遺伝子内のその位置を表3に示す。2対立遺伝子マーカー20と36（乾癬と高度に関連していることが知られている）を太字で示す。
Figure 2007503839
Figure 2007503839
Figure 2007503839
11個の異なる対立遺伝子の同定
上記の各試料の各UBP8rp関連2対立遺伝子マーカーでのヌクレオチドの本体を表4〜7に示す。
見出し欄は試料の名前を示す。
乾癬に罹っているロシア人からの試料は、「P」で始まる名前により特定される。以下の表4〜7において、精神分裂病にかかっていないロシア人からの試料は「DNA」で始まる名前により特定される。以下の表4〜7において、外科的介入が行われている個人からの試料は「S」で始まる名前により特定される。リンパ芽球性細胞株Lucy及びBolethについてわかった配列をさらに示す。
文字「P」、「DNA」または「S」の後に2つの数字が続く。最初の数字は試料の識別番号である（例えば、「S4」は外科的介入が行われている個人に由来する試料の第4番を意味する）。UBP8rpは常染色体上に存在するため、各個体はUBP8rp遺伝子の2つのコピーを有する。すなわち第2の数字は、配列がUBP8rp遺伝子の「第1の」コピーまたは「第2の」コピーについてわかったことを示す。
最後に表はさらに、データベースで入手できるゲノム配列を示す（受け入れ番号を名前として示す）。
見出しの行は、2対立遺伝子マーカーの名前を示す（表3の中の記載に対応する）。この数字は、配列番号1上の2対立遺伝子マーカーの位置に対応する。
第2の行は、多型性変化を示す。標準的PCT命名法が使用されている。「N+」は、多型性変化が配列番号1上の特定の位置の後の「N」ヌクレオチドの挿入に対応することを示す。対応する欄では「0」の存在は対立遺伝子が挿入を示さないことを示す。「dN」は、多型性変化が「N」ヌクレオチドの欠失に対応することを示す。対応する欄では「0」の存在は対立遺伝子が欠失を示すことを示す。
第3の行はアミノ酸の変化（もしあれば）を示す。用語「ORF-」は、読みとり枠がさらに多型性変化に変化していることを示す。用語「SSP」は、多型性変化がプレメッセンジャーRNAのスプライシングのコンセンサス内に位置することを示す。
太字で示されるヌクレオチドは、配列番号1上の同じ位置のものとは異なるヌクレオチドに対応する。
すべてのこれらの配列の整列は、UBP8rp遺伝子のいくつかの対立遺伝子の同定を可能にし、これは11個の「主要な対立遺伝子」に分類されている（対立遺伝子A1〜A11）。「主要な対立遺伝子」のいくつかはさらに「サブ対立遺伝子」に分類される。「サブ対立遺伝子」は、1つのSNPのみが「主要な対立遺伝子」とは異なる。例えば対立遺伝子A9は、3つの「サブ対立遺伝子」に分類される（A9.1、A9.2およびA9.3と呼ぶ）。対立遺伝子の名前は、表4〜7の第2の欄に示される。
Figure 2007503839
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乾癬との関連
表4〜7のデータを使用して、以下に列記したサブグループ中の主要な対立遺伝子の6つの頻度を計算した：
− ランダム：外科的介入が行われている個人（DNA）、LucyとBoleth細胞株、データベースからの配列。
− 対照：精神分裂病にかかっていないロシア人（S）。
− 乾癬に罹っているロシア人（P）。
Figure 2007503839
すなわち対立遺伝子A9は、他のサブグループより乾癬に罹っている個体に対応するサブグループで、はるかに高頻度であると結論することができる。従って個体中の対立遺伝子A9の存在は、該個体が乾癬に罹っているかまたは罹るリスクがあることを示す。
UBP8rpの代替スプライス型
UBP8rp遺伝子によりコードされる3つの異なるスプライス変異体（配列番号52、54および55）を、乾癬患者の皮膚生検試料からRT cDNA PCRクローニングにより単離した。これらのスプライス変異体は対立遺伝子A9から発現される。対立遺伝子A9を有さない個体からこれらの3つのスプライス変異体を単離する試みは失敗した。従って、配列番号52、54および55のUBP8rpポリヌクレオチドは、乾癬に罹っている個体によって、特異的に発現されると結論することができる。
6.1. プロトコール
・cDNAの調製
乾癬に罹っている患者からの生検試料のRNA抽出物からcDNAを調製した。この調製のためにクロンテク（Clontech）RT-for-PCRkitを使用した。cDNAプライミングのために各試料について、オリゴ（dT）とランダムプライマーの両方を使用した。1反応当たり約0.5〜1μgのRNAを採取した。
・増幅
5μlの各cDNAについてネステッドPCRを行った。最初のプライマー対は配列番号67と68のプライマーであり、次に最初のPCR生成物を1：50希釈し、希釈物の3μlを配列番号78と79のプライマー（これは制限部位を含有した）により再増幅した。
PCR生成物をPTC-200装置にのせ、両方のPCR生成物について同じプログラムを使用した：94℃で5分
---
94℃で20秒
67℃で3分
35サイクル
---
72℃で10分
第2のPCRにより得られたバンドをフェノール−クロロホルム混合物により精製し、MICROCON-100カラムで2回洗浄した。
・クローニング
精製PCRバンドをBamHI-BglIIにより消化した。消化混合物をクロロホルムにより精製し、MICROCON-100カラムで500μlのH2Oにより2回洗浄した。
BamHIで消化したpGEM11Zfベクターでクローニングを行った。10ngのベクター消化物を、15μlの混合物中の各総PCR消化物と、0.5μl（100U）のT4 DNAリガーゼ（バイオラボズ（Biolabs））を使用して16℃で一晩結紮した。
クロロホルムで精製し、MICROCON-100結紮物を、コンピタントなDH10B細胞中で電気穿孔した。白色のコロニーを選択し、挿入体の存在をPCRにより配列決定して確認した。
クローンを配列番号70〜79のプライマーを用いて配列決定した。スプライス変異体を、既知の対立遺伝子変異体のゲノムDNAとの配列比較により同定した。
これらのスプライス変異体のイントロン／エキソン構造を図5に略図で示す。配列番号52は配列番号53のタンパク質をコードする。配列番号55は配列番号56のタンパク質をコードする。配列番号54は任意の機能性タンパク質をコードしない。イントロン1はスプライシングされないため、配列番号54の読みとり枠の初めに停止コドンが存在する。
配列番号53、56および2の整列を図6に示す。
UBP8rpの免疫学的分析
7.1. プロトコール
・分析した組織と細胞
抗UBP-relペプチドポリクローナル抗体を用いて試験した組織は以下の通りである：皮膚（ヒトとマウス）、脊髄、胎児の脳、視床下部、頭頂葉、肝臓、肺、腎臓、心臓、平滑筋、骨格筋、および臍帯。
抗UBP8rpペプチドポリクローナル抗体を用いて試験したヒト初代培養物と細胞株は以下の通りである：PBMC、Bリンパ球、分化しているケラチン細胞、HaCat、HEK293、およびHUVEC。
・細胞の溶解
組織または細胞（皮膚または白血球）を、NP40 1％、トリス塩酸 10mM（pH8）、PMSF 1mM、プロテアーゼインヒビターロシュ（Roche）で、4℃で一晩溶解した。溶解物を14000rpmで、4℃で15分遠心分離し、タンパク質をブラッドフォード（Bradford）法により定量した。
・SDS-PAGE
50μgのタンパク質を10％アクリルアミドゲル（NuPage）にのせた。実験後、タンパク質を15Vで30分ニトロセルロース膜に移した。膜をTBS-Tween、5％ミルクによりブロックし、1/1000のペプチド抗体を加え室温で一晩インキュベートした。4回洗浄後、膜を、抗ウサギペルオキシダーゼ免疫グロブリン結合体を用いて1時間インキュベートした。洗浄後、膜をECLにより視覚化した。
・2D-PAGE（2次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
1次元IEF（等電点電気泳動）をZoom IPG ストリップ（pH3〜10）で8M尿素2％ CHAPS、0.5％ アンホライト（pH3〜10）、0.002％ブロモフェノールブルーを使用して行った。等電点電気泳動は600Vで7時間行った。ストリップをNuPAGE LDS試料緩衝液（インビトロゲン（Invitrogen））で平衡化し、4〜12％NuPAGEゲルで2次元を行った。
・ELISA（酵素結合免疫吸着測定法）
マイクロタイタープレート（F96マキシソープヌンク（maxisorp Nunc））のウェルを、15mM Na2CO3と35mM NaHCO3（pH9.6）中の100μlのペプチドで、4℃で一晩被覆した。残存する結合部位をTBST中1％ BSAを用いて室温（RT）で1時間インキュベートして飽和させた。洗浄後、0.05％Tween20と1％ BSAとを含有するTBS（pH7.4）で希釈した抗ペプチド血清（100μl／ウェル）を室温で3時間インキュベートした。洗浄後、抗ウサギペルオキシダーゼ免疫グロブリン結合体を1時間加えた。ABTS基質を用いて405nmの吸光度を測定した。
7.2. 結果
抗UBP8rpポリクローナル抗体を作成するために、配列番号57のペプチドを使用した。これらの抗体は大腸菌（E．coli）中で産生した組換えUBP8rpタンパク質を認識することがSDS-PAGEにより証明された。このタンパク質の分子量は約45kDaである。
UBP78pに対応する45kDaタンパク質の有無を、異なる組織と試料でSDS-PAGEにより分析した。結果を表9と10に示す。さらに、全血と皮膚で検出される45kDaタンパク質を2D-PAGEにより確認した。
Figure 2007503839
Figure 2007503839
結論として、45kDa UBP8rpタンパク質はヒト皮膚と全血細胞中に存在するが、培養リンパ芽球細胞株や他の調べたヒト組織中には存在しないことが証明された。
従って：
− UBP8rpはユビキチン−プロテオソーム経路に属し、これは細胞増殖の制御において役割を果たす；
− UBP8rpは皮膚と血液細胞（いずれも免疫適格細胞の亜集団を有する）で発現される；
− UBP8rpの発現レベルは、分化したケラチン細胞より発生中のケラチン細胞中で高い；
UBP8rpの特異的変異体は、乾癬病変中の免疫適格細胞の特定の画分中に存在するため、乾癬性ケラチン細胞に異常な増殖能を付与するかも知れない。従って乾癬性ケラチン細胞の異常増殖能は、UBP8rpの局所的発現のためにUBP8機能の脱制御に関連しているかも知れない。従ってUBP8rpタンパク質を阻害することは、増殖および分化しているケラチン細胞と皮膚特異的免疫適格細胞との病的相互作用を妨害することにより、乾癬を治療するのに有用かも知れない。
酵母2ハイブリッドスクリーニング
えさ（bait）としてUBP8rp cDNAを用いる酵母2ハイブリッドスクリーニングを行って、UBP8rpポリペプチドの機能活性を調節するか、またはその天然の結合パートナーへのUBP8rpポリペプチドの結合を調節し、従って間接的に機能活性を調節することができるポリペプチド性結合パートナーを見いだした。
クロンテク（Clontech）により販売されているMatchMaker（商標）システムからの材料を使用して、酵母2ハイブリッドスクリーニングを行った。クロンテク（Clontech）のマニュアルに記載されるように、同時形質転換と交配実験を行った。
配列番号52のUBP8rpポリヌクレオチド（これは配列番号53のUBP8rpポリペプチドをコードする）を、pGBKT7ベクター中に挿入した。得られたえさ（bait）構築体を、MatchMaker（商標）cDNAライブラリーのスクリーニングのために使用した。ヒト成体皮膚、ヒト胎児の皮膚、およびヒト骨髄から得られたcDNAライブラリーを調べた。
調べた他の組織は、ヒト培養ケラチン細胞、ヒトリンパ球、およびヒト白血球である。配列番号52の断片を含む構築体をさらに調べた。
Figure 2007503839
Figure 2007503839
図1A〜1Gは、UBP8rpをコードする遺伝子の注釈である。
図2は、UBP8rp（配列番号3）とUBP8（配列番号4）との整列を示す。
図3は、UBP8rp（配列番号3）のローダナーゼ（rhodanase）ドメインを示す。
図4は、実施例2で測定したUBP8rp、UBP8、サイトケラチン15、及びソリアシン（psoriasin）の発現レベルを示す。発現レベルは、発生中の正常なケラチン細胞で測定し、値を3日目と対照遺伝子平均により標準化した。
図5は、UBP8rpの対立遺伝子A9によりコードされる3つのスプライス変異体の構造の略図である。
図6は、対立遺伝子A3によりコードされるUBP8rpタンパク質（配列番号3）と対立遺伝子A9によりコードされる2つのスプライス変異体（配列番号53と56）との整列を示す。

Claims (43)

  1. (i)配列番号1のヌクレオチド1018〜1046；および
    (ii)配列番号1のヌクレオチド1676〜1718
    の配列を有するイントロンを含む単離された遺伝子。
  2. 請求項1の遺伝子から転写されるメッセンジャーRNAに相補的な単離されたポリヌクレオチド。
  3. 以下よりなる群から選択されるポリヌクレオチド：
    a)配列番号2を含むポリヌクレオチド；
    b)配列番号52を含むポリヌクレオチド；
    c)配列番号54を含むポリヌクレオチド；
    d)配列番号55を含むポリヌクレオチド；
    e)(a)〜(d)のいずれかと比較して少なくとも1つの多型性変化を含む(a)〜(d)のいずれかの対立遺伝子変異体であって、ここで、該多型性変化は、以下に示すUBP8rp関連2対立遺伝子マーカー番号1〜96よりなる群から選択され；
    f)(a)〜(e)のいずれかに相補的なポリヌクレオチド。
    Figure 2007503839
    Figure 2007503839
    Figure 2007503839
  4. 請求項1〜3のいずれかのポリヌクレオチドによりコードされる単離されたポリペプチド。
  5. 以下よりなる群：
    a)配列番号3を含むポリペプチド；
    b)配列番号3の少なくとも470アミノ酸の範囲を含むポリペプチド；
    c)配列番号3の少なくとも15アミノ酸の範囲を含むポリペプチドであって、ここで該範囲は、配列番号3のアミノ酸467〜482内にあり；
    d)(a)〜(c)のいずれかと比較して少なくとも1つの多型性変化を含む(a)〜(c)のいずれかの対立遺伝子変異体であって、ここで該多型性変化は、請求項3に示す表のUBP8rp関連2対立遺伝子マーカー番号を含むコドンによりコードされる；
    e)該アミノ酸配列は、(a)〜(c)の配列の少なくとも1つと少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有する、(a)〜(c)のいずれかのムテイン；
    f)高ストリンジェント条件下で(a)〜(c)のいずれかをコードするDNA配列の相補体にハイブリダイズする核酸によりコードされる、(a)〜(c)のいずれかのムテイン；および
    g)アミノ酸配列中の変化は、(a)〜(c)中のアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換である、(a)〜(c)のいずれかのムテイン
    から選択される請求項4のポリペプチド。
  6. 以下よりなる群：
    a)配列番号53を含むポリペプチド；
    b)配列番号53の少なくとも470アミノ酸の範囲を含むポリペプチド；
    c)配列番号53の少なくとも15アミノ酸の範囲を含むポリペプチドであって、ここで該範囲は、配列番号53のアミノ酸467〜485内にあり；
    d)アミノ酸配列は(a)〜(c)中の配列の少なくとも1つと少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有する、(a)〜(c)のいずれかのムテイン；
    e)高ストリンジェント条件下で(a)〜(c)のいずれかをコードするDNA配列の相補体にハイブリダイズする核酸によりコードされる、(a)〜(c)のいずれかのムテイン；および
    f)該アミノ酸配列中の任意の変化は、(a)〜(c)中のアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換である、(a)〜(c)のいずれかのムテイン、
    から選択される請求項4のポリペプチド。
  7. 以下よりなる群：
    a)配列番号56を含むポリペプチド；
    b)配列番号56の少なくとも270アミノ酸の範囲を含むポリペプチド；
    c)配列番号56の少なくとも15アミノ酸の範囲を含むポリペプチドであって、ここで該範囲は、配列番号56のアミノ酸266と267を含むみ；
    d)該アミノ酸配列は(a)〜(c)中の配列の少なくとも1つと少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有する、(a)〜(c)のいずれかのムテイン；
    e)高ストリンジェント条件下で(a)〜(c)のいずれかをコードするDNA配列の相補体にハイブリダイズする核酸によりコードされる、(a)〜(c)のいずれかのムテイン；および
    f)該アミノ酸配列中の任意の変化は、(a)〜(c)中のアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換である、(a)〜(c)のいずれかのムテイン、
    から選択される請求項4のポリペプチド。
  8. 請求項1または2の遺伝子を含む発現ベクター。
  9. 請求項3または4のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  10. 該ポリヌクレオチドは請求項5〜7のいずれかのポリペプチドをコードする、請求項8または9の発現ベクター。
  11. 該ベクターは遺伝子治療ベクターである、請求項8〜10のいずれかのベクター。
  12. 請求項8〜10のいずれかの発現ベクターを含む宿主細胞。
  13. 該宿主細胞内で請求項4または5のポリペプチドの産生に適した条件下で請求項12の宿主細胞を培養する工程を含む、ポリペプチドの作成方法。
  14. 該ポリペプチドを培養物から精製する工程をさらに含む、請求項13の方法。
  15. 該ポリペプチドを医薬組成物に調製する工程をさらに含む、請求項14の方法。
  16. 請求項4のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
  17. 天然の結合パートナーをスクリーニングするための標的としての、請求項4〜7のいずれかのポリペプチドの使用。
  18. 候補調節物質をスクリーニングするための標的としての、請求項4〜7のいずれかのポリペプチドの使用。
  19. 該候補調節物質は、天然のリガンド、小分子、アプタマー、アンチセンスmRNA、小干渉性RNA、および抗体よりなる群から選択される、請求項18の使用。
  20. 該調節物質は慢性炎症性疾患の治療用の候補薬剤である、請求項18または19の使用。
  21. 請求項4〜7のいずれかのポリペプチドの活性は、請求項4〜7のいずれかのポリペプチドの存在下でUBP8の脱ユビキチン化活性を測定することにより評価される、請求項18〜20のいずれかの使用。
  22. 慢性炎症性疾患の治療用の薬剤を調製するための、請求項4〜7のいずれかのポリペプチドの調節物質の使用。
  23. 該調節物質は該慢性炎症性疾患用の公知の薬剤と組合せて使用される、請求項22の使用。
  24. 該慢性炎症性疾患は乾癬である、請求項20〜23のいずれかの使用。
  25. 該候補調節物質はUBP8rpアンタゴニストである、請求項20〜24のいずれかの使用。
  26. 乾癬の動物モデルに調節物質を投与することを含んでなる、乾癬の治療用の請求項4〜7のいずれかのポリペプチドの調節物質の効力を評価する方法であって、該調節物質が該動物モデルの乾癬の代表的特徴を緩和するという測定は、該調節物質が乾癬の治療用の薬剤であることを示す方法。
  27. 該代表的特徴は乾癬部位と重症度指数スコアである、請求項26の方法。
  28. 乾癬部位と重症度指数スコア（PASI75）の75％以上の改善は、該調節物質が乾癬の治療用の薬剤であることを示す、請求項27の方法。
  29. 該動物モデルはSCID-huマウスである、請求項26〜38のいずれかの方法。
  30. 2対立遺伝子マーカーと慢性炎症性疾患との間に有意な相関があるかどうかを調べるための少なくとも1つのUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーの使用であって、該UBP8rp関連2対立遺伝子マーカーは、請求項3の表に記載の2対立遺伝子マーカー番号1、2、4、6、7、10、12〜19、21〜30、31〜35、および37〜96よりなる群から選択されることを特徴とする使用。
  31. 該慢性炎症性疾患は乾癬である、請求項30の使用。
  32. 個体が慢性炎症性疾患に罹っているかまたは罹るリスクがあるかどうかを診断するための、請求項3の表に記載の2対立遺伝子マーカー番号1、2、4、6、7、10、12〜19、21〜30、31〜35、および37〜96よりなる群から選択される少なくとも1つのUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーの使用。
  33. 該個体中の対立遺伝子A9の存在は、該個体が慢性炎症性疾患に罹っているかまたは罹るリスクがあることを示す、請求項32の使用。
  34. 該慢性炎症性疾患は乾癬である、請求項32または33の使用。
  35. 以下の工程：
    a)生物学的試料から核酸を単離する工程；および
    b)請求項3の表に記載の2対立遺伝子マーカー番号1、2、4、6、7、10、12〜19、21〜30、31〜35、および37〜96よりなる群から選択される1つ以上のUBP8rp関連2対立遺伝子マーカーに存在するヌクレオチドを検出する工程、
    を含む遺伝子型判定法。
  36. 該生物学的試料は単一の個体から得られる、請求項35の方法。
  37. 該2対立遺伝子マーカーでのヌクレオチドの本体は、該個体のゲノム中に存在する該2対立遺伝子マーカーの両方のコピーについて測定される、請求項36の方法。
  38. 該測定は微量配列決定法により行われる、請求項35〜37のいずれかの方法。
  39. 2対立遺伝子マーカーを含む配列の部分をヌクレオチドの本体の測定前に増幅することをさらに含む、請求項35〜38のいずれかの方法。
  40. 該増幅はPCRにより行われる、請求項39の方法。
  41. 遺伝子型判定工程の結果を、慢性炎症性疾患に罹るリスクに関連付ける工程をさらに含む、請求項35〜40のいずれかの方法。
  42. 該個体中の対立遺伝子A9の存在は、該個体が該慢性炎症性疾患に罹っているかまたは罹るリスクがあることを示す、請求項36〜41のいずれかの方法。
  43. 該慢性炎症性疾患は乾癬である、請求項42の方法。
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