BRPI0709050B1 - anticorpo ou fragmento do mesmo, composição, métodos para detectar protofibrilas ab in vitro, e, uso do anticorpo - Google Patents

anticorpo ou fragmento do mesmo, composição, métodos para detectar protofibrilas ab in vitro, e, uso do anticorpo Download PDF

Info

Publication number
BRPI0709050B1
BRPI0709050B1 BRPI0709050A BRPI0709050A BRPI0709050B1 BR PI0709050 B1 BRPI0709050 B1 BR PI0709050B1 BR PI0709050 A BRPI0709050 A BR PI0709050A BR PI0709050 A BRPI0709050 A BR PI0709050A BR PI0709050 B1 BRPI0709050 B1 BR PI0709050B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
antibody
seq
protofibrils
fact
composition
Prior art date
Application number
BRPI0709050A
Other languages
English (en)
Inventor
Sehlin Dag
Ekholm Pettersson Frida
Englund Hillevi
Lannfelt Lars
Gellerfors Pär
Original Assignee
Bioarctic Neuroscience Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38522718&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BRPI0709050(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bioarctic Neuroscience Ab filed Critical Bioarctic Neuroscience Ab
Publication of BRPI0709050A2 publication Critical patent/BRPI0709050A2/pt
Publication of BRPI0709050B1 publication Critical patent/BRPI0709050B1/pt

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/464—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another
    • C07K16/465—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another with additional modified FR-residues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/38—Pediatrics
    • G01N2800/385—Congenital anomalies
    • G01N2800/387—Down syndrome; Trisomy 18; Trisomy 13

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Abstract

anticorpo ou fragmento do mesmo, composição, metodos para prevenir ou tratar, e para diagnosticar disturbios, metodo para detectar protofibrilas ab in vitro, e, uso do anticorpo. a presente invenção é ligada à prevenção, tratamento e diagnose de doenças neurodegenerativas, em particular mal de alzheimer, e outra doença similar. mais especificamente a anticorpos de alta afinidade seletivos para proteína beta amilóide (a<225>) em sua conformação de protofibrila e de classe igg e subelasse igg1 ou igg4 ou combinações destes ou mutações destes, retendo alta ligação de receptor fc e baixa ligação de cl(clq), efetivos em depuração de protofibrilas a<225> e com risco reduzido de inflamação.

Description

“ANTICORPO OU FRAGMENTO DO MESMO, COMPOSIÇÃO,
MÉTODOS PARA DETECTAR PROTOFIBRILAS AB IN VITRO, E, USO
DO ANTICORPO”
CAMPO DA INVENÇÃO
Esta invenção é ligada à prevenção, tratamento e diagnose de doenças neurodegenerativas, em particular mal de Alzheimer, e outra doença similar. Mais precisamente, à alta afinidade 10’ M, preferivelmente 10' M, ainda menos do que 1 0'9M ou menos do que 10’10M ou 10’nM de anticorpos, seletivos para proteína beta amilóide (Αβ) em sua conformação de protofibrila e de classe IgG e subclasse IgGl ou IgG4 ou combinações destes ou mutações destes, retendo alta ligação de receptor Fc e baixa ligação de Cl(Clq), efetivos em depuração de protofibrilas Αβ e com risco reduzido de inflamação.
INTRODUÇÃO
Mal de Alzheimer (AD) é uma desordem neurodegenerativa progressiva e irreversível causando deficiência cognitiva, de memória e comportamental. Ele é a causa mais comum de demência na população idosa afetando aproximadamente 5% da população acima de 65 anos e 20% acima de 80 anos de idade. AD é caracterizado por um início insidioso e deterioração progressiva em múltiplas funções cognitivas. A neuropatologia envolve tanto depósitos proteináceos argirofílicos extracelulares como intracelulares. Os depósitos extracelulares, referidos como placas neuríticas, consistem principalmente de proteína beta amilóide (Αβ) circundada por neuritos distróficos (inchados, processos neuronais distorcidos). Αβ dentro destes depósitos extracelulares são fibrilares em seu caráter com uma estrutura de folha β-pregueada. Αβ nestes depósitos podem ser coloridos com certos corantes, e.g. Vermelho Congo, e apresentam uma estrutura ultra fibrilar. Estas características, adotadas por Αβ em sua estrutura fibrilar em placas neuríticas, são a definição do termo genérico amilóide. A lesão patológica intracelular clássica de AD é o emaranhado neurofibrilar (NFT) que consiste de estruturas filamentosas chamadas filamentos helicoidais pareados (PHFs), compostas de fitas trançadas de proteína tau associada a microtúbulo hiperfosforilada. Placas neuríticas freqüentes e depósitos de emaranhado neurofibrilar no cérebro são critérios diagnósticos para AD, como realizado após a morte. Cérebros com AD também apresentam atrofia cerebral macroscópica, perda de célula nervosa, inflamação local (microgliose e astrocitose) e freqüentemente angiopatia amilóide cerebral (CAA) em paredes de vasos cerebrais.
Duas formas de peptídeos Αβ, Αβ40 e Al342, são as espécies dominantes em placas neuríticas de AD enquanto A1340 é a espécie proeminente em amilóide cerebrovascular associado com AD. Atividades enzimáticas permitem que Αβ seja continuamente formado a partir de uma proteína maior chamada proteína precursora de amilóide (APP) tanto em indivíduos saudáveis como afligidos por AD em todas as células do corpo. Dois principais eventos de processamento de APP através de atividades de βe γ-secretase possibilitam produção de Αβ, enquanto uma terceira enzima chamada α-secretase, previne geração de Αβ por clivagem dentro da seqüência de Αβ (Selkoe, 1994; Ester 2001;US5604102). Ο Αβ42 é um peptídeo de quarenta e dois aminoácidos de comprimento, i.e. dois aminoácidos maior no término C, se comparado com Αβ40. Αβ42 é mais hidrofóbico, e se agrega mais facilmente em estruturas maiores de peptídeos Αβ (Jarret 1993) tal como dímeros Αβ, trímeros Αβ, tetrâmeros Αβ, oligômeros Αβ, protofibrilas Αβ ou fibrilas Αβ. Fibrilas Αβ são hidrofóbicas e insolúveis, enquanto as outras estruturas são todas menos hidrofóbicas e solúveis. Todas estas estruturas moleculares superiores de peptídeos Αβ são individualmente definidas baseado em sua aparência biofísica e estrutural e.g. em microscopia eletrônica, e suas características bioquímicas e.g. por análise com cromatografia de exclusão por tamanho/westem blot. Estes peptídeos
Αβ, particularmente Αβ42, irão se reunir gradualmente em várias estruturas moleculares superiores de Αβ durante o tempo de vida. AD, que é uma desordem fortemente dependente de idade, irá ocorrer mais cedo em vida se este processo de agregação ocorre mais rapidamente. Este é o centro da hipótese de cascata de amilóide de AD que reivindica que processamento de APP, os níveis de Αβ42 e sua agregação em estruturas moleculares superiores é uma causa central de AD. Toda outra neuropatologia de cérebro com AD e os sintomas de AD tal como demência são de alguma forma causados por Αβ ou formas agregadas deste.
Αβ pode existir em diferentes comprimentos i.e. 1-39,1-40,142 e 1-43 e tamanhos de fragmentos i.e. 1-28 e 25-35. Truncamentos podem ocorrer no término N do peptídeo. Todos estes peptídeos podem se agregar e formar intermediários solúveis e fibrilas insolúveis, cada forma molecular tendo uma exclusiva conformação estrutural e propriedade biofísica. Αβ1-42 monomérico por exemplo, é um peptídeo solúvel e não tóxico de 42 aminoácidos de comprimento, que é sugerido estar envolvido em funções sinápticas normais. Em certas condições, ο Αβ1-42 pode se agregar em dímeros, trímeros, tetrâmeros, pentâmeros até 12-mero e formas oligoméricas maiores, todas com sua propriedade físico-química distinta tal como tamanho molecular, estrutura de EM e formato molecular de AFM (microscopia de força atômica). Um exemplo de uma forma oligomérica de Αβ de peso superior é a protofibrila (Walsh 1997), que tem um peso molecular aparente >100 kDa e uma estrutura curvilínea de 4-11 nm em diâmetro e < 200 nm de comprimento. Recentemente foi demonstrado que peptídeos Αβ oligoméricos solúveis tal como protofibrilas Αβ prejudicam potenciação de longo prazo (LTP) uma medida de plasticidade sináptica que, acredita-se, reflete formação de memória no hipocampo (Walsh 2002). Além disso, peptídeos Αβ oligoméricos Árticos apresentam efeito inibidor muito mais profundo do que \νίΑβ em LTP no cérebro, provavelmente devido a sua forte propensão para formar protofibrilas Αβ (Klyubin 2003).
Também existem outras formas oligoméricas solúveis descritas na literatura que são distintamente diferentes de protofibrilas. Uma tal forma oligomérica é ADDL (Ligante Difusível Derivado de Amilóide) 5 (Lambert 1998). Análise AFM de ADDL revelou predominantemente espécies globulares pequenas de 4,7-6,2 nm ao longo do eixo z com pesos moleculares de 17-42 kDa (Stine 1996). Outra forma é chamada ASPD (Amiloidesferóides) (Hoshi 2003). ASPD são oligômeros esféricos de Αβί40. Estudos de toxicidade mostraram que ASPD esféricos >10 nm foram mais 10 tóxicos do que formas moleculares inferiores (Hoshi 2003). Esta idéia ganhou suporte a partir de recente descoberta da mutação Ártica (E693) de APP, que causa AD de início precoce (Patente Norte-Americana 2002/0162129 Al; Nilsberth et al., 2001). A mutação está localizada dentro da seqüência de peptídeo Αβ. Carreadores de mutação com isso irão gerar variantes de 15 peptídeos Αβ e.g. Αβ40 Ártico e Αβ42 Ártico. Tanto Αβ40 Ártico como Αβ42 Ártico irão se agrupar muito mais facilmente em estruturas moleculares superiores i.e. protofibrilas. Assim, o mecanismo patogênico da mutação Ártica sugere que as protofibrilas moleculares superiores solúveis estão causando AD e contém um epítopo específico exclusivo i.e. o epítopo de 20 doença AD.
No cérebro com mal de Alzheimer (AD), placas amilóides extracelulares tipicamente são encontradas em parênquima e paredes de vasos. As placas são compostas de peptídeos amilóides (Αβ) de 8-43 aminoácidos de comprimento hidrofóbicos e auto-agregantes, que se 25 polimerizam gradualmente antes de deposição de placa. A espécie oligomérica Αβ solúvel foi proposta como sendo melhor correlação de doença do que as próprias placas amilóides (McLean et al., 1999; Neislund et al., 2000). Dentre estas espécies Αβ intermediárias pré-fibrilares, formas oligoméricas mostraram provocar efeitos biológicos adversos tanto in vitro como in vivo (Walsh et al., 2002) e assim podem desempenhar um papel central em patogênese de doença. Diversas espécies Αβ oligoméricas de vários tamanhos moleculares são conhecidas. Com importância, a conformação de formas monoméricas, oligoméricas e fibrilares de Αβ são 5 diferentes e podem ser visadas por anticorpos conformacionais. A identidade do principal patógeno de Αβ não está clara, embora alguma evidência sugira que oligômeros Αβ de alta peso molecular sejam especialmente neurotóxicos (Hoshi et al., 2003).
Mutações patogênicas no gene de proteína precursora de 10 amilóide (APP), causando AD de início precoce foram descritas. Uma delas, a mutação APP Sueca (Mullan et al., 1992), causa níveis aumentados de Αβ. A outra a mutação APP Ártica (E693G) localizada dentro do domínio Αβ, foi encontrada estimulando a formação de protofibrilas, oligômeros Αβ grande, sugerindo que estes intermediários de Αβ sejam particularmente patogênicos 15 ((Patente Norte-Americana 2002/0162129 Al; Nilsberth et al., 2001). A identificação da mutação APP Ártica e a elucidação de efeitos tóxicos para protofibrilas Αβ aumentaram o foco em oligômeros Αβ em patogênese de AD.
Imunização ativa como uma estratégia terapêutica para mal de 20 Alzheimer foi primeiramente relatada por (Schenk et al. 1999). O alvo para a estratégia de imunização foi a forma fibrilar de Αβ encontrada em placas de Alzheimer. Um teste clínico recente de fase I/II de vacinação ativa de Αβ usando Αβ como uma vacina (AN-1792) teve que ser interrompido devido ao desenvolvimento de meningoencefalite em um pequeno número de pacientes 25 (Bayer et al., 2005). Os efeitos colaterais vistos neste estudo provavelmente foram causados por anticorpos anti-Αβ reagindo contra amilóide fibrilar em paredes de vasos. O amilóide fibrilar em CAA está em íntima proximidade com a barreira hematoencefálica (BBB) e a reação antígeno-anticorpo pode assim gerar dano a BBB levando à infiltração de linfócitos T no CNS (Pfeifer et al., 2002; Racke et al., 2005). Além disso, apenas uma minoria dos pacientes participantes apresentaram uma resposta imune à vacina Αβ.
Embora o estudo tenha terminado prematuramente, ele parece indicar que imunização ativa de Αβ pode ser benéfica apenas para um subconjunto de pacientes com AD.
Anticorpos monoclonais seletivos para protofibrilas Αβ humanas foram descritos (Patente Norte-Americana 2002/0162129 Al). O Método de gerar protofibrilas Αβ humanas altamente puras e estáveis, envolve o uso de peptídeos Αβ42 sintéticos com a mutação Ártica (Glu22Gly). A mutação facilita imunização e triagem de hibridoma para anticorpos protofibrila Αβ seletivos. Com importância, estes anticorpos se ligam tanto a protofibrilas Αβ tipo selvagem como protofibrilas Αβ-Árc (PCT/SE 2005/000993).
Anticorpos que são seletivos para outras conformações de Αβ tal como fibrilas Αβ (0 'Nuallain 2002), Αβ micelar (Kayed 2003), ADDL (Lambert 2001), foram descritos. Entretanto, nenhum destes é protofibrila Αβ seletivo.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção é ligada a anticorpos melhorados i.e. anticorpos protofibrila Αβ seletivos de alta afinidade (menos do que 10’ M) de classe IgG e subclasse IgGl ou IgG4 ou combinação destes ou mutações destes, com risco reduzido de inflamação, para prevenção, tratamento e diagnose melhorados de mal de Alzheimer, síndrome de Down ou outros distúrbios neurodegenerativos. Ditos anticorpos foram desenvolvidos por técnicas clássicas de hibridoma e engenharia de anticorpo.
A invenção descreve a seqüência de aminoácidos de consenso das regiões CDR1-3 nas cadeias VL e VH de anticorpos que se ligam seletivamente a formas oligoméricas de Αβ, i.e. protofibrilas Αβ constituindo o epítopo de mal de Alzheimer , combinadas com modificações da região
Fc para reduzir ligação de fator de complemento Cl q, reduzindo o risco de ativação de complemento e inflamação.
A região constante de um anticorpo tem muitas funções importantes particularmente ligando receptores Fc e fator de complemento
Clq. A última função foi inativada para evitar reações inflamatórias.
Em resumo, este tipo de anticorpos protofibrila seletivos de alta afinidade têm as seguintes vantagens marcantes se comparados com outras modalidades conhecidas de tratamento imunoterápico:
1) visa protofibrilas Αβ causando doença com alta afinidade
2) reduz o risco de efeitos colaterais inflamatórios i.e. meningoencefalite, por baixa ou nenhuma ligação a fator de complemento Clq
3) anticorpo de alta afinidade reduz a dose clínica necessária para um tratamento efetivo
4) fornece uma modalidade de dosagem acurada
5) menos ligação a fibrilas Αβ na parede de vaso sanguíneo i.e. CAA, reduzindo o risco de efeitos colaterais inflamatórios.
6) Menos anticorpo é ligado na periferia, assim mais irão cruzar a barreira hematoencefálica e estarão disponíveis para ligação e eliminação de formas oligoméricas de Αβ no cérebro.
Um aspecto da invenção é a descoberta da seqüência de aminoácidos de consenso de anticorpo das regiões CDR que se ligam a protofibrilas Αβ humanas tipo selvagem (Exemplo 1). Esta descoberta define os sítios de ligação (regiões CDR) que conferem alta afinidade e alta seletividade para protofibrilas Αβ humanas tipo selvagem para uso como agentes terapêuticos ou diagnósticos. A estrutura básica de uma molécula de imunoglobulina (IgG) compreende duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas ligadas juntas por pontes dissulfeto (Figura 1). A cadeia leve, que é ou lambda ou capa, tem uma região variável (VL) e uma região constante (CL) de aproximadamente 110 resíduos de aminoácidos cada. A cadeia pesada tem uma região variável (VH) de cerca de 110 resíduos de aminoácidos, mas uma região constante (CH) muito maior de 300-400 resíduos de aminoácidos, compreendendo regiões ou domínios CHyl, CHy 2 e
CHy3.
A região constante (Fc) ativa o sistema de complemento e se liga a um receptor Fc em macrófagos, micróglia e neutrófilos, o qual ingere e destrói microorganismos infectantes ou antígenos exógenos/não próprios. Esta função é particularmente importante uma vez que ela é parte do princípio terapêutico do anticorpo, i.e. fagocitose de micróglia mediada por receptor Fc e depuração de protofibrilas Αβ. Outros mecanismos de depuração mediados por anticorpo também são operantes, i.e. propriedades de anti-agregação de anticorpos Αβ e depuração de protofibrilas Αβ na periferia, de acordo com a hipótese de dissipação.
A região variável das cadeias pesadas e leves contém 3 regiões hipervariáveis chamadas regiões determinantes de complementaridade ou CDRs. As regiões CDR são trechos curtos de cerca de 13-23 aminoácidos de comprimento, localizados nas regiões VL e VH. As seis regiões CDRs em um braço do anticorpo formam a cavidade que se liga ao antígeno. Figura 1 mostra a atividade básica de uma imunoglobulina IgG e seus subdomínios.
Outro aspecto da invenção é ligado a anticorpos protofibrila seletivos de alta afinidade. Afinidades no intervalo de 10' M preferivelmente 10‘8M, ainda menos do que 10'9M, menos do que IO40 M, ou menos do que 10nM para protofibrilas são descritas (Exemplo 2). Estes anticorpos têm a vantagem de que eles podem ser administrados em doses menores comparados com anticorpos com afinidades no âmbito de 10'6 M. Isto tem vantagem clínica significante já que estes anticorpos de alta afinidade, que são administrados por injeção, podem ser dados subcutaneamente uma vez que apenas uma pequena quantidade do anticorpo é necessária para atingir eficácia. Modalidades de administração não são limitadas a injeções subcutâneas. Além disso, as menores doses necessárias para eficácia irão reduzir custo de bens para produção do anticorpo.
Outro aspecto da invenção é que os anticorpos são de classe IgG, adequados para uso terapêutico uma vez que eles podem passar através da barreira hematoencefálica. Depuração de protofibrilas Αβ no parênquima cerebral é atingida por fagocitose mediada por receptor Fc por células de micróglia. Outros mecanismos de depuração anti-Αβ são propensos a operar também. Esta depuração de protofibrilas Αβ solúveis é um mecanismo central do tratamento. Protofibrilas Αβ são consideradas altamente neurotóxicas, iniciando e dirigindo o processo de doença. Depuração de protofibrilas Αβ no cérebro é de valor clínico significante. Em adição a depuração de protofibrilas Αβ, outras formas oligoméricas de Αβ incluindo fibrilas Αβ, será reduzida indiretamente através de remoção de protofibrilas Αβ uma vez que diferentes formas Αβ agregadas, i.e. dímeros, trímeros, tetrâmeros e formas oligoméricas superiores incluindo protofibrilas e fibrilas, estão em equilíbrio. Exemplo de redução de placas, que contêm fibrilas Αβ, é mostrado em um modelo de camundongo transgênico com Alzheimer (APPswe) depois de tratamento por 72 horas com um anticorpo protofibrila seletivo de alta afinidade (mAb 158) (Exemplo 3). Por conseguinte, depuração de protofibrilas Αβ por dito anticorpo também terá a vantagem de reduzir indiretamente outras formas agregadas ou oligoméricas de Αβ.
Ainda outro aspecto da invenção é um anticorpo protofibrila Αβ humana seletivo de alta afinidade de subclasse IgGl, que tem uma alta afinidade para receptores FcyRI humanos presentes em células de micróglia no cérebro. Um anticorpo de alta afinidade irá levar a eficiente depuração de protofibrilas Αβ o que será de valor terapêutico significante. Por conseguinte, os anticorpos irão exibir depuração de protofibrilas Αβ, tanto em CNS como periferia se comparado com outras estratégias imunoterapêuticas tal como vacinação ativa ou tratamentos com anticorpo monoclonal ou com anticorpos monoclonais de subclasse IgGl visando outras formas Αβ. Com importância, o tratamento será eficiente no começo de processo de doença quando espécies Αβ solúveis tóxicas tal como protofibrilas Αβ estão presentes em níveis elevados mas também no fim de processo de doença. Níveis elevados de formas oligoméricas de Αβ foram descritos em um modelo de camundongo transgênico exibindo as mutações Sueca e Ártica APP swearc (Lord A. et al. 2006).
Ainda outro aspecto da invenção é que os anticorpos protofibrila Αβ seletivos de alta afinidade podem reduzir ou inibir agregação de Αβ com isso reduzindo níveis de formas oligoméricas de Αβ solúveis no cérebro
Ainda outro aspecto da invenção é que os anticorpos protofibrila Αβ seletivos de alta afinidade podem se ligar a formas oligoméricas de Αβ, i.e. protofibrilas Αβ fora de CNS também, com isso mudar o equilíbrio de ditas formas Αβ através da barreira hematoencefálica de uma forma tal a diminuir níveis em CNS de ditas formas Αβ (drenagem).
Como discutido acima, o estudo clínico de Elan usando uma vacina Αβ (AN-1792) seletiva para fibrilas Αβ para tratar pacientes com Alzheimer resultou em um efeito colateral, i.e. meningoencefalite, em 6% dos casos. A estratégia para atingir fibrilas Αβ, que são o centro de placas amilóides presentes no parênquima cerebral mas com importância também nas paredes de vasos sanguíneos, resultou em efeitos colaterais severos. Os efeitos colaterais foram mais provavelmente causados pela ligação dos anticorpos a CAA (Angiopatia Amilóide Cerebral) nas paredes de vasos sanguíneos do cérebro, começando um processo inflamatório. Este problema clínico significante é evitado pelos anticorpos protofibrila seletivos de alta afinidade melhorados com atividade reduzida de ativação de complemento. Estes anticorpos irão reter alta eficácia de depuração de protofibrilas Αβ reduzindo risco de efeitos colaterais, i.e. meningoencefalite.
Outro aspecto da invenção é que os anticorpos protofibrila seletivos de alta afinidade têm fraca ligação de fibrila Αβ (Veja exemplo 2), reduzindo o risco de efeitos colaterais, por menos ligação a fibrilas Αβ presentes em CAA.
Ainda outro aspecto da invenção é que os anticorpos IgG protofibrila Αβ seletivos de alta afinidade são manipulados para reduzir ligação de fator de complemento Clq ao domínio CH2 de IgGl e reduzir ativação de complemento e risco de inflamação. Esta modificação pode ser feita de diversas maneiras diferentes. Uma forma é fazer um anticorpo quimérico onde o domínio CHy2 da região constante de IgGl foi deletado e trocado pelo domínio correspondente de IgG4 ou parte do domínio que confere ligação de Clq. Está bem estabelecido que IgG4 não se liga a Clq e por conseguinte não ativa a cascata de complemento. Para atingir isto a região constante da cadeia pesada (CH) é manipulada de uma forma tal a combinar o domínio de receptor Fc de alta afinidade (CHy3) em IgGl com o domínio (CHy2) de IgG4 que não tem nenhuma ligação para o fator de complemento Clq. Este novo anticorpo contendo a cadeia pesada constante quimérica (IgGlrCHyl, CHy2:IgG4, CHy3:IgGl) terá as propriedades importante tanto de depuração eficiente de protofibrilas Αβ através de fagocitose mediada por receptor Fc e risco reduzido de efeitos colaterais, i.e inflamação tal como meningoencefalite.
Ainda outra forma de reduzir o risco de inflamação é alterar a estrutura de oligossacarídeos do anticorpo o que irá reduzir ligação de fator de complemento Clq e ativação de complemento. 30 estruturas diferentes dos oligossacarídeos complexos bi-particulados em Asn-297 em IgGl humana foram descritas. Acredita-se que a ausência de carboidratos associados a CH2 cause uma mudança conformacional na região de articulação do anticorpo, reduzindo eficácias de interação com moléculas efetoras e perda de função de ativação de complemento e ligação de Clq.
A modificação de um anticorpo protofibrila Αβ humana seletivo de alta afinidade por mutagênese sítio dirigida de Asn-297 para qualquer outro aminoácido irá gerar um anticorpo de ligação de receptor Fc mantida com menos ligação de Clq e por conseguinte risco reduzido de inflamação em particular na barreira hematoencefálica. Uma alternativa para modificar a glicosilação no anticorpo é expressar o anticorpo em um tipo celular onde a enzima N-acteilglucosaminil-transferase I foi inativada. Isto irá produzir um anticorpo com estrutura alterada de carboidrato em Asn297. Uma estrutura de Man5GlcNAc25 mas não limitado a esta estrutura, é formada. Esta modificação de carboidrato irá reduzir ligação de fator de complemento Clq e inibir inflamação (Wright at al. 1998). Altemativamente, anticorpos protofibrila seletivos glicosilados podem ser atingidos cultivando células expressando anticorpos na presença de tunicamicina, o que inibe glicosilação. Estes anticorpos terão atividade de ativação de complemento alterada assim como função de receptor Fc alterada (Leatherbarrow el al. 1985). Triagem de clones expressando anticorpos com fraca ativação de complemento e forte ligação de receptor Fc irá gerar anticorpos protofibrila seletivos que exibem forte depuração mediada por Fc de protofibrilas Αβ e fraca ligação de Clq.
Ainda outro aspecto da invenção é um anticorpo protofibrila Αβ humana seletivo de alta afinidade, de subclasse IgGl, onde o sítio de ligação de fator de complemento Clq foi modificado, i.e. Pro331>Ser331 (Xu et al. 1994), de uma maneira tal a reduzir ou inibir ligação de fator de complemento Clq, para o tratamento ou prevenção de AD. O resíduo de prolina em posição 331 em IgGl humana também pode ser trocado por uma treonina ou glicina ou qualquer outro aminoácido polar. Esta modificação pode ser atingida por técnicas padrão de biologia molecular tal como mutagênese sítio dirigida ou deleções de DNA.
Ainda outro aspecto da invenção é o uso de anticorpos IgG protofibrila Αβ humana seletivos de alta afinidade para determinar especificamente níveis de protofibrila em tecidos humanos, em particular em fluido cerebroespinhal, sangue, urina ou saliva como uma ferramenta diagnostica ou biomarcador para mal de Alzheimer. Níveis de protofibrilas Αβ humanas em CSF ou sangue são propensos a serem diferentes se comparados com um grupo de controle idoso combinado não tendo mal de Alzheimer. Uma pessoa que está desenvolvendo mal de Alzheimer é propensa a ter níveis aumentados de níveis de protofibrila Αβ em CSF ou sangue. Por conseguinte, por determinação de níveis de protofibrila Αβ em CSF ou sangue uma diagnose precoce da doença pode ser feita. Isto é possível de atingir com os novos anticorpos protofibrila Αβ seletivos de alta afinidade em combinação com um método de ELISA sanduíche (Exemplo 2A), onde protofibrilas Αβ foram determinadas até o nível de 10 pM. Interferência de outras formas Αβ tal como fibrilas Αβ, monômeros Αβ e fragmentos Αβ (116; 17-40) no ensaio, é 10% ou menos.
A invenção é adicionalmente ligada ao uso de uns anticorpos protofibrila específicos de alta afinidade para determinações de protofibrilas Αβ em tecidos humanos e animais, por exemplo, fluido cerebroespinhal, sangue, soro, urina e tecido cerebral mas não limitado a estes tecidos, sustentando um possível método diagnóstico para mal de Alzheimer. Métodos adequados para ensaiar protofibrilas Αβ nestes tecidos assim como em culturas celulares usando um anticorpo anti-protofibrila Αβ são imunoensaios tal como ELISA, RIA, Western blotting ou dot blotting. O método deve ser adequado para acompanhar eficácia de tratamento (redução de protofibrila) em testes clínicos e adequado como um teste diagnóstico para mal de Alzheimer ou síndrome de Down.
Uma vez que níveis de protofibrilas Αβ são muito baixos em CSF e sangue, um anticorpo protofibrila Αβ seletivo de alta afinidade é necessário em um teste diagnóstico baseado em um método ELISA, para ser capaz de medir baixos níveis de protofibrilas Αβ. Outros métodos super sensíveis tal como ligação de proximidade (Exemplo 4) (Gullberg 2004) ou sistemas de amplificação similares ou Biacore ou técnicas similares, podem ser usados para aumentar sensibilidade. A técnica de ligação de proximidade é baseada na descoberta de que diferentes anticorpos, produzidos contra diferentes epitopos em um analito (neste caso uma proteína), podem se ligar perto um do outro em dito analito. Se ditos diferentes anticorpos estão conjugados a oligonucleotídeos, a distância entre ditos oligonucleotídeos será curta o suficiente para que um oligonucleotídeo conector, com o auxílio de componentes de ligação, forme uma ponte entre os oligonucleotídeos. Componentes de amplificação também são adicionados, mediante o que RTPCR pode ser realizado. Por este princípio, uma seqüência de DNA amplificável, refletindo a identidade e quantidade da proteína alvo, é gerada. Esta técnica toma possível obter uma resposta com sinal aumentado para detectar concentrações inferiores de analito.
Os presentes requerentes surpreendentemente descobriram que uma técnica de ligação de proximidade modificada também pode ser usada com seus anticorpos protofibrila Αβ específicos, para detectar baixas concentrações de estruturas de peptídeo Αβ maiores, i.e. protofibrilas Αβ mas não monômeros Αβ. Foi descoberto que os peptídeos Αβ, na conformação de protofibrila, exibe uma estrutura (unidades repetitivas) que toma possível para dois anticorpos, de acordo com a presente invenção, se ligar suficientemente próximos um ao outro na protofibrila. Se ditos anticorpos estão conjugados a oligonucleotídeos, ditos oligonucleotídeos podem ser ligados usando um oligonucleotídeo conector. PCR é realizado usando componentes de amplificação. Por este princípio, uma seqüência de DNA amplificável, refletindo a identidade e quantidade da protofibrila alvo, é gerada (veja Fig 4A).
Ligação de proximidade ou uma versão da técnica chamada círculo rolante, é uma técnica altamente sensível e particularmente bem adequada para detecção de estruturas poliméricas com seqüências repetidas, tal como protofibrilas Αβ a serem usadas para diagnose de mal de Alzheimer e outros distúrbios neurodegenerativos.
A invenção é adicionalmente ligada ao uso de anticorpos protofibrila específicos de alta afinidade em imagiologia para detecção, localização e quantificação de protofibrilas Αβ em tecidos humanos e animais. O anticorpo pode ser marcado com um ligante radioativo tal como 1131, C14, n. ou Gálio68, mas não limitado a estes radioisótopos, para propósitos de detecção. O método será adequado como uma ferramenta diagnostica para mal de Alzheimer ou síndrome de Down.
Ainda outro aspecto da invenção é fazer as espécies de anticorpos específicos para uso em medicina veterinária. Os métodos diagnósticos descritos também são adequados para uso veterinário.
Outro aspecto da invenção é a humanização de ditos anticorpos para evitar efeito colateral, i.e. para evitar uma resposta imune contra ditos anticorpos em humanos quando usados como um agente terapêutico ou diagnóstico.
Ainda outro aspecto é uma formulação do anticorpo em um tampão fisiológico, por exemplo PBS mas não limitado a PBS, adequado para administração a humanos e animais. O produto de anticorpo pode ser liofilizado para melhor estabilidade. A formulação liofilizada pode conter um excipiente tal como manitol mas não limitado a manitol para estabilizar o produto depois de liofilização.
O produto de anticorpo pode conter um agente antibacteriano.
Os anticorpos ou fragmentos de acordo com as invenções podem exibir deleções, substituições e inserções de aminoácidos dentro de ditas regiões CDR e/ou sua estrutura. Aminoácidos inseridos ou substituídos também podem ser derivados de aminoácido, com a condição de que a afinidade e especificidade do anticorpo sejam ainda intactas.
EXEMPLOS
Os exemplos seguintes são fornecidos para ilustração e não são pretendidos para limitar a invenção a estes exemplos específicos.
Exemplo 1.
Anticorpos monoclonais protofibrila Αβ humana tipo selvagem seletivos foram clonados e seqüenciados. A seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) e da região variável de cadeia leve (VL) são mostradas em Tabela 1. As posições das regiões CDR 1-3 são sublinhadas e mostradas também em Tabela 2 e 3. As seqüências de aminoácidos das regiões CDR formam a base estrutural para ligar protofibrilas Αβ humanas tipo selvagem constituindo o epitopo de mal de Alzheimer .
A seqüência de aminoácidos das regiões CDR 1-3 das cadeias VL e VH para um anticorpo protofibrila específico de alta afinidade BA9/158 são mostradas em Tabela 1, 2 e 3.
Dados de seqüenciamento de outros anticorpos protofibrila seletivos (BA2, BA3, BA4 e BA7) fornecem seqüências de aminoácidos alternativas das regiões CDR mas não limitado a estas. As seqüências de aminoácidos combinadas das regiões CDR1-3 das cadeias VH e VL criam a cavidade molecular que se liga a protofibrilas Αβ humanas tipo selvagem com alta afinidade e especificidade. Esta cavidade forma a base estrutural do epitopo de mal de Alzheimer. Variações no comprimento da seqüência de aminoácidos de CDR são observadas em ambas cadeias VH e a VL é compatível se ligando a protofibrilas Αβ humanas (Tabela 2 e 3). Uma região CDR mais curta fornece uma estrutura tridimensional mais restrita da cavidade de ligação do anticorpo, ao passo que uma mais longa é mais flexível.
São reivindicadas as seqüências de CDR como mostrado em
Tabelas 1, 2 e 3 assim como seqüências de aminoácidos nas regiões de estrutura de camundongo das cadeias VH e VL, i.e. fora das regiões CDR assim como as regiões de estrutura de VL e VH humanas para anticorpos protofibrila específicos como mostrado em Tabela 4 e 5, mas não limitado a estes.
A seqüência de aminoácidos da região de estrutura de regiões VL e VH 1-3 das cadeias VL e VH de um anticorpo protofibrila específico de alta afinidade BA9/158 é mostrada em Tabela 4 e 5.
Outra substituição de aminoácido nas regiões CDR do que a que é mostrada em Tabela 1, 2 e 3 são compatíveis com ligação de alta afinidade e alta especificidade a protofibrilas Αβ humanas tipo selvagem. Onde um aminoácido polar está presente em uma posição particular em uma região CDR tal aminoácido particular pode ser substituído por outro aminoácido polar, com ligação de alta afinidade e especificidade mantida ou melhorada para protofibrilas Αβ. Da mesma maneira, se um aminoácido não polar ou negativamente ou positivamente carregado está presente em uma certa posição, tal aminoácido pode ser substituído por um aminoácido similar do mesmo grupo.
Também, um aminoácido ou aminoácidos particulares são trocados em qualquer posição nas regiões CDR por equivalentes funcionais que conferem uma função e estrutura similar ao anticorpo.
Exemplo 2. Caracterização de um anticorpo monoclonal protofibrila Αβ humana tipo selvagem seletivo de alta afinidade por ELISA
Exemplo 2 shows um anticorpo protofibrila seletivo de alta afinidade que reage de forma cruzada umas 200-1000 vezes menos com monômeros Αβ e menos do que 40 vezes com fibrilas Αβ, se medido por um ELISA sanduíche (Fig.2A). A partir de experimentos de ELISA competitivo, o anticorpo tem uma forte afinidade para protofibrilas Αβ42 humanas tipo selvagem, mas apenas afinidade muito fraca para a parte N-terminal do peptídeo Αβ e monômeros Αβ. Nenhuma ligação foi observada ao fragmento
C-terminal de Αβ (Fig.2B). Além disso, o anticorpo não reage de forma cruzada com outros tipos de amilóides, como medina ou transtiretina. Além disso o anticorpo não reconhece APP humano, o precursor abundante de Αβ.
Na Figura 2A um ELISA sanduíche é mostrado. Anticorpo 158 foi revestido nos poços e diferentes formas de Αβ subseqüentemente adicionadas ao poço em concentrações crescentes. Mensuração de formas de Αβ ligadas foi feita adicionando mAb 158 biotinilado e Estreptavidina marcada com HRP. Desenvolvimento de cor foi medido de acordo com o procedimento recomendado pelo fabricante.
Na Figura 2B um ELISA competitivo é mostrado. Uma placa de ELISA foi revestida com protofibrilas Αβ humanas. Anticorpo 158 foi subseqüentemente incubado com quantidades crescentes de diferentes formas de Αβ (competição). A mistura de incubação foi adicionada aos poços de placa de microtítulo e anticorpo livre foi permitido se ligar a protofibrilas imobilizadas nos poços. Anticorpo 158 ligado foi medido por um segundo anticorpo usando procedimentos padrão.
Exemplo 3
A eficácia de anticorpo protofibrila Αβ seletivo de alta afinidade foi determinada em um modelo de camundongo transgênico com Alzheimer (APPswe) por uma injeção intracranial aguda. Camundongos transgênicos usados para avaliação de eficácia expressam APP humano, com a mutação Sueca (APPswe). Neste paradigma, anticorpos são injetados diretamente em regiões ricas em plaquetas do parênquima cerebral e efeitos em neuropatologia são verificados depois de 72 horas (Wilcock et al., 2003). Outros estudos mostraram que a aplicação direta de anticorpos anti-Αβ resulta em uma rápida depuração de depósitos amilóides in vivo (Bacskai et al., 2001; Brendza et al., 2005). A injeção de anticorpo protofibrila Αβ seletivo de alta afinidade leva a uma significante redução de placas no modelo de camundongo APPSwe (Figura 3).
Na Figura 3 a eficácia terapêutica de um anticorpo protofibrila seletivo de alta afinidade em modelo de camundongo transgênico (APPswe) foi testada. A: Um camundongo transgênico APPSwe de 14 meses de idade foi intracranialmente injetado com PBS e B: anticorpo protofibrila seletivo de alta afinidade (158) a 1 pg/μΙ e avaliado 72 horas depois de injeção. Depuração acentuada de carga de Αβ é notável no subiculum perto do sítio de injeção (B; seta) se comparado com o lado de controle (A; seta).
Exemplo 4
Ligação de proximidade em combinação com anticorpo protofibrila seletivo de alta afinidade para mensuração de protofibrilas Αβ. Protofibrilas Αβ humanas tipo selvagem foram detectadas até intervalo de 10 pM ao passo que a preparação de monômero Αβ não foi nem um pouco detectada. A combinação do método de ligação de proximidade hipersensível e de um anticorpo de alta afinidade é particularmente vantajosa uma vez que ela fornece um sistema parar determinar apenas formas oligoméricas do analito, o que é particularmente adequado quando diagnosticando mal de Alzheimer e outras doenças de agregação de proteínas tal como doença de príon, Creutzfelt-Jacob, amiloidose e mal de Parkinson.
Na Figura 4 protofibrilas Αβ humanas são medidas em níveis de pM pelo técnica de ligação de proximidade. Ensaio de ligação de proximidade: Descrição de método (a partir de Gullberg et al., 2004): Etapa 1, incubação de amostra com par de sondas de proximidade (pJl h); etapa 2, adição de todos os componentes requeridos para ligação e detecção por PCR quantitativo (tempo de ligação de 5 min). Um anticorpo monoclonal protofibrila seletivo de alta afinidade foi usado no ensaio; etapa 3, PCR quantitativo (2 h). Preparações sintéticas de monômero Αβ e protofibrila Αβ foram diluídas e testadas para sua reatividade em ensaio de ligação de proximidade descrito acima.
Exemplo 5 mAb 158 não reconhece um epítopo de amilóide genérico.
Anticorpos dependentes de conformação de Αβ previamente relatados mostraram se ligar a oligômeros e fibrilas de outras proteínas amiloidogênicas, sugerindo que um epítopo comum está presente em todos os agregados amilóides. Devido a dificuldades técnicas para gerar protofibrilas a partir de outras proteínas amiloidogênicas do que Al3, mAb 158 foi ao contrário testado contra fibrilas amilóides diferentes. O ensaio dot blot foi usado para estes experimentos uma vez que ELISA de inibição, onde as reações anticorpo-antígeno ocorrem em solução, não é adequado para antígenos insolúveis como fibrilas. O ensaio dot blot entretanto não é adequado para avaliação de especificidade de anticorpo para várias formas de Αβ, i.e. para medir diferenças em seletividade para protofibrilas e fibrilas. Fibrilas de medina, polipeptídeo amilóide de ilhota (IAPP) e a-sinucleína foram imobilizados em uma membrana de nitrocelulose para manter suas conformações nativas. mAbl58 não exibiu reatividade com qualquer amilóide outro do que fibrila Αβ (Fig 5A). A ligação de mAb 158 s fibrilas Αβ sugere que parte do epítopo de protofibrila Αβ está presente também na estrutura de fibrila Αβ. Como controles positivos os anticorpos 6E10 (A(3), pAbl79 (medina), pAbAllO (IAPP) e mAb211 (α-sinucleína) foram usados (Fig 5B). Blots representativos de experimentos repetidos (n=3).
mAb 158 não se liga a APP
Níveis de APP e fragmentos solúveis de APP comumente excedem os níveis de Αβ em amostras biológicas tal como CSF e homogenado cerebral, e portanto uma reatividade cruzada de anticorpo Αβ para APP pode inibir um tratamento através de ligação a APP, resultando em menos anticorpo livre para ligação e eliminação de protofibrilas Αβ e/ou oligômeros Αβ. Também, ela podería perturbar mensurações de protofibrilas Αβ em amostras biológicas por um ensaio ELISA sanduíche de Αβ. Para elucidar se mAb 158 se liga a APP nativo, experimentos de imunoprecipitação foram realizados. Meio de cultura de células HEK (não expostas ao vetor, APPswe e APPArc_swe) e homogenados cerebrais de camundongo (não transgênico, APPswe e APPArc-swe) foram imunoprecipitados com mAb 158 ou 6E10, seguido por um Western blot desnaturante com 6E10 como anticorpo de detecção (Fig 5C). Como visto em Figura 5C, mAb 158 não imunoprecipitou aAPPs de meio de cultura celular ou APP de comprimento completo a partir de homogenados cerebrais de camundongo, ao passo que, como esperado, 6E10 sim. As protofibrilas Αβ sintéticas usadas como controle foram imunoprecipitadas igualmente bem por ambos anticorpos (Fig 5C). Blots representativos de experimentos repetidos (n=3).
Exemplo 6
Estabelecimento de um ELISA sanduíche protofibrila Αβ específico. Para possibilitar mensurações de protofibrilas Αβ em amostras biológicas um ELISA sanduíche com mAb 158 tanto como anticorpo de captura como de detecção foi estabelecido. Este ensaio mede protofibrilas Αβ com um limite de detecção de 1 pM e com um intervalo linear de até 250 pM (Fig 6A, linhas indicam regressão linear das curvas padrão). Devido a incertezas em relação ao tamanho das protofibrilas Αβ usadas na curva padrão, a concentração 1 pM é baseada no peso molecular de um monômero Αβ (4514 g/mol). De qualquer forma, uma vez que o peso molecular de uma protofibrila foi estimado como sendo pelo menos 100 kDa, o limite de detecção calculado como protofibrilas Αβ molares pode ser tão baixo quanto 50 fM. Lima curva padrão de protofibrilas ΑβΑτο produziu um sinal mais fraco do que protofibrilas Αβ tipo selvagem, possivelmente devido a diferenças em tamanho de protofibrila Αβ (Fig 6A, 6B). LMW-Αβ sintético titulado (Αβ de Baixo Peso Molecular). Pelo termo “β de Baixo Peso Molecular, é pretendido monômeros, dímeros e trímeros de Αβ tendo um peso molecular de aproximadamente 4-12 kDa. Protofibrilas Αβ e Αβ1-16 foram usadas para validar a especificidade de conformação do ELISA (Fig 6B), onde o peptídeo Αβ1-16 hidrofílico foi usado uma vez que não é esperado que ele se agregue. Um ELISA composto de dois anticorpos idênticos requer pelo menos um dímero de uma proteína para produzir um sinal e como previsto, Αβ1-16 não foi detectado com o ELISA sanduíche de mAb 158 mesmo em concentrações de μΜ (Fig 6B). Ao pré-tratar o LMW-Αβ e protofibrilas Αβ com 70% de ácido fórmico (FA), conhecido por dissociar Αβ agregado em monômeros, o ELISA sanduíche o sinal foi perdido (dados não mostrados). Por conseguinte, a detecção de LMW-Αβ em altas concentrações de nM (Fig 6B) provavelmente é devido a um pequeno conteúdo de agregado da preparação de peptídeo.
Um grande excesso de Αβ monomérico, holoAPP e fragmentos de APP, naturalmente ocorrentes em amostras biológicas, pode interferir na análise de protofibrila Αβ ocupando sítios de ligação do revestimento de anticorpo de captura, assim inibindo a ligação de protofibrilas. Este problema foi investigado adicionando um excesso crescente de Αβ1-16 a uma concentração fixa de protofibrilas Αβ (50 pM, expresso como unidades de monômero) e analisando ele tanto com o ELISA de mAbl58 como um ELISA sanduíche de 6E10-6E10 (Fig 6C). Um excesso molar de 500 000 vezes de Αβ1-16, se comparado com protofibrilas Αβ, não perturbou as mensurações com o ELISA sanduíche de mAb 158, como esperado uma vez que Αβ1-16 se liga fracamente ao anticorpo de captura. Em contraste, um excesso de 500 vezes de Αβ1-16 foi suficiente para diminuir o sinal no ELISA de 6E10-6E10, onde Αβί16 se liga com alta afinidade ao anticorpo de captura (Fig 6C). Além disso, quando protofibrilas Αβ sintéticas foram adicionadas a meios de cultura de célula HEK não exposta ao vetor ou homogenados cerebrais de camundongo não transgênico, 90% do sinal foi recuperado (dados não mostrados).
Exemplo 7
Mensuração de protofibrilas Αβ em amostras biológicas.
A presença de protofibrilas Αβ em modelos celulares e de camundongos carregando a mutação Ártica foram sugeridos, embora até agora não tenha havido nenhum Método de ensaio direto de protofibrilas Αβ em amostras biológicas. O ELISA sanduíche de mAbl58 portanto fornece a primeira oportunidade para medir níveis de protofibrila Αβ em tais modelos celulares e de camundongos e para comparar eles a modelos sem esta mutação intra-Αβ. Amostras de células e camundongos carregando apenas a mutação Sueca foram comparadas com a curva padrão de protofibrila Αβ tipo selvagem, ao passo que amostras de células e camundongos expressando Αβ com a mutação Ártica foram comparadas com a curva padrão de protofibrila ΑβΑτο (Fig 6A). Para assegurar que todo ο Αβ medido neste ensaio estivesse no estado solúvel, e para excluir qualquer interferência possível de fibrilas Αβ, todas as amostras foram centrifugadas por 5 min a 17 900 x g antes de análise. Grupos de meio celular de células HEK APPswe e APPArc-swe transientemente transfectadas foram analisados e comparados a meios de cultura de célula HEK não exposta ao vetor. Níveis de protofibrila Αβ foram calculados a partir das curvas padrão (Fig 6A) como o valor médio de triplicatas e foram então normalizados para níveis de APP para compensar as diferenças em níveis de transfecção (de acordo com Stenh et al.). A concentração de protofibrila Αβ em meio de cultura de célula HEK APPArc-swe foi 28 pM (L2), significantemente maior (p<0,0001) do que a 8,2 pM (±0,3) vista em APPswe (Fig 7A). Nenhuma protofibrila Αβ pode ser detectada em meio não exposto ao vetor. Níveis de protofibrilas Αβ também foram medidos em cérebros de camundongos transgênicos APPArc-Swe e APPswe com 10 meses de idade tanto com placas como patologia intraneuronal Αβ (de acordo com Lord et al.). Cérebros foram homogeneizados em TBS e centrifugados antes de análise a fim de recuperar a fração solúvel de Αβ. Similar à análise usando meio de cultura celular, níveis de protofibrila Αβ diferiram signifícantemente (p=0,005) entre os grupos, com 397 pM (±59) em cérebros de camundongos transgênicos APPMcSwe e 108 pM (±14) em APPswe (Fig
7B).
Nas figuras mencionadas acima (Figs. 6 e 7) o número de amostras foram; células não expostas ao vetor (n=3) e transientemente transfectadas com APPswe (n=8) e APPArc-swe(n~l 1). Níveis de protofibrilas Αβ em meio APPAre_swe foram aproximadamente 9 vezes maiores do que em meio APPswe, ao passo que meio não exposto ao vetor não produziu nenhum sinal (A). Mensurações de níveis de protofibrila Αβ na fração solúvel de TBS de homogenados cerebrais de camundongos não transgênicos (n~6) foram comparadas a camundongos transgênicos (APPswe, n=3, e AppArc-swe, n=6) (B). Similar ao meio de cultura celular, níveis de protofibrila Αβ de camundongos APPAre_swe foram 7 vezes maiores do que em camundongos APPswe. Barras de erro mostram ± SEM.
Exemplo 8 mAbl58 diminui significantemente protofibrilas Αβ e Αβ total em camundongos APPswearc transgênicos depois de administração i.p.
mAbl58 (12 mg/kg) foi injetado i.p. uma vez por semana por 18 semanas em camundongos APPswearc com 9-10 meses de idade. Depois do estudo, cérebros foram isolados e homogeneizados em TBS e subseqüentemente centrifugados para sedimentar material insolúvel. O material insolúvel foi solubilizado em ácido fórmico. Por conseguinte, duas frações foram obtidas a partir de cérebros de camundongos i.e. uma fração de TBS e uma fração de ácido fórmico. Níveis de protofibrila Αβ nas frações de TBS foram determinados por um ELISA. Uma redução significante de protofibrilas Αβ foi encontrada no grupo de tratamento com mAbl58 comparado com o grupo de placebo (Fig 8). Figura 8 mostra os níveis de protofibrila Αβ em extratos de TBS de cérebro de camundongo transgênico APPswearc depois de tratamento por 4 meses ou com mAbl58 ou placebo.
Αβ total na fração de ácido fórmico foi determinado por um ELISA (o ácido fórmico foi usado para solubilizar todas as formas de Αβ, a fim de tomar todas as formas de Αβ detectáveis. Uma redução significante de Αβ total foi observada no grupo de tratamento comparado com o grupo de placebo (Fig 9). Figura 9 mostra os níveis de Αβ total em extratos de ácido fórmico de cérebro de camundongo transgênico APPswearc depois de tratamento por 4 meses ou com mAbl58 ou placebo.
Exemplos 9-11
Abreviações
A Adenina
protocolo Ab protocolo biomédico de AERES
BHK rim de filhote de hamster
bp pares de bases
C Centígrado
C Citosina
CHO Ovário de Hamster Chinês
CMF Livre de Cálcio e Magnésio
COS 7 linhagem celular de fibroblasto de rim de macaco verde Africano
dhfr Dihidrofolato redutase
DMEM meio de Dulbecco modificado por Eagle
DMSO Dimetil sulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucléico
ELISA Ensaio imunoenzimático
FCS Soro Fetal Bovino
g gramas
G Guanina
h hora
HRP peroxidase de rábano
IgG Imunoglobulina
K G ou T (convenção IUPAC)
LSAP Produto Amilóide Solúvel Grande
mAb anticorpo monoclonal
seg min segundo minuto
M A ou C (convenção IUPAC)
MTX Metotrexato
NIMR National Institute for Medicai Research (UK)
nm nanômetro
OD densidade ótica
PBS Salina tamponada com fosfato
PCR Reação em cadeia da polimerase
R A ou G (convenção IUPAC)
RT Temperatura ambiente
S C ou G (convenção IUPAC)
T Timina
UV Ultra Violeta
V variável
V A ou C ou G (convenção IUPAC)
VH Região variável de cadeia pesada de imunoglobulina
VK Região variável de cadeia leve capa de imunoglobulina
W A ou T (convenção IUPAC)
Y C ou T (convenção IUPAC)
Materiais
Equipamento
Equipamento Fornecedor UK Número de Catálogo
ciclador térmico de DNA: GeneAmp 9600 Perkin Elmer N801-0177
Um laboratório de cultura de tecido designado contendo uma cabine de segurança microbiológico de classe II equipado com uma lâmpada UV Walker Safety Cabinets Ltd. N/a
Agitador de Incubadora de topo de bancada Innova® New Brunswick Scientific 4000
Centrífuga de topo de bancada Fisher Scientific CEK-126-010N
Incubadora com gás CO2 a 37° RossLab plc HS0-501TVBB
Incubador microbiológico Kendro/Heraeus B6060
Modelo de Eletroporador: Gene Pulser II Bio-Rad Laboratories Ltd. 341BR-3092
Leitor de ELISA: Microplater Reader 3550 Bio-Rad Laboratories Ltd. 3550
Pacote de software para análise de dados Microplate Manager® 2.2 para computador Macintosh Bio-Rad Laboratories Ltd. N/a
PCR System 9700 de 90 poços GeneAmp ABI N8050200
Analisador Genético ABI PRISM 310 Applied Biosystems 310-00-100/120
Detector de ressonância de plasmônio de superfície TI00 Biacore
Consumíveis plásticos
Artigo Fornecedor UK Número de Catálogo
Frasco de cultura de tecido de 175 cm2 Sarstedt Ltd 83.1812.002
Frasco de cultura de tecido de 25 cm2 Coming Costar 3056
Recipiente universal de 30 ml Sterilin 128C
Frasco de cultura de tecido de 75 cm2 Sarstedt Ltd 83.1813.002
Cuvetas de eletroporação Bio-Rad Laboratories Ltd. 165-2088
Placas de ELISA:Nunc MaxiSorp Invitrogen Life Technologies 43945A
Tubos de reação PCR GeneAmp™ Perkin Elmer N801-0180
Lâmina de contagem de células descartável Glasstic® Bio-stat Diagnostic 887144
Agulhas inoculantes Nunc Life Technologies 254399
petri de cultura de tecido 100x20mm, de multi-suspiros Helena Biosciences 93100
Placa de cultura de tecido: 6 poços + tampa Coming C3516
Placa de cultura de tecido: 24 poços + tampa Coming C3526
Reagentes de imunologia e biologia molecular
Artigo Fornecedor UK No. de Catálogo No. de Lote
1° kit de síntese de filamento Amersham Biosciences 27-9261-01 3375313
Kit de PCR Advantage®-HF 2 Clontech 639123 6040151
Agarose (UltraPure™) Invitrogen 15510-027 3019491
Albumina bovina (BSA) Calbiochem 126575 B65755
Ampicilina Sigma A-9518 63H0992
Apa I Promega R636 16007003
Themoprime+ DNA Polimerase Abgene AB0301 014/0103/11 019/0607/13 020/1808/13
Bam Hl Promega R602 15851606
Kit de Reação Pronto de Seqüência de Ciclo BigDye® Terminador v3.0 ABI 4390242 0605143 0608154
Brometo de Etídio (10 mg/ml) Sigma E-1510 43H9414
Anticorpo de cabra anti-IgG humana (fragmento Fc específico) Stratech Scientific 109-005-098 68215
Conjugado de peroxidase de rábano de cadeia capa anti-humana de cabra Sigma A7164 032K9157
Hind III Promega R604 16834803
Anticorpo IgGl/capa humano. 0 sítio de ligação BP078 223729
substrato K-Blue HRP SkyBio 308176 060823
Oligonucleotídeos Sigma n.a.
Comprimidos de PBS Sigma P4417 11K8204
kit Maxi de Plasmídeo QIAGEN (25) Qiagen 12162 124114870
kit Miniprep de fuso QlAprep Qiagen 27106 124117906
kit de purificação de gel QlAquick Qiagen 28704 11549740
kit de purificação de PCR QlAquick Qiagen 28106 G10.1.12
Solução de Parada Vermelha (Para K Azul) SkyBio Ltd, 301475 060104
Qiagen 74106 10916587
fosfatase alcalina de camarão USB 70092Y 107635
Subcloagem de E. coli quimicamente competente Efficiency™ DH5a™ Invitrogen 44 0098 1164658
T4 DNA Ligase Promega M1801 167080
substrato TMB de uma etapa para HRP SkyBio Ltd, KB 176
kit TOPO-TA Cloning® Invitrogen 45-0641 1350772
X-Gal Sigma B-9146 20965701
Soluções de National Institute of Medicai Research
Nome de solução: Componentes Quantidade
PBS Ά' Dulbeccos (Ca & NaCl 8g
Mg Free) 0,2g
KC1 l,15g 0,2g
Na2HPO4 ΚΉ2ΡΟ4 água 1L
LB Bacto Triptona 10g
Extrato de Levedura 5g
NaCl 10g
água 1L
LB ágar LB 1L
Agar (Difco) 15g
Reagentes de Cultura
Artigo Fornecedor UK Número de catálogo Números de lote Data de validade
Meio de Eagle modificado por DMEM (IX) Dulbecco's (alto teor de glicose) com GlutaMAX™ I, 4500mg/L DGlicose, Piruvato de Sódio Invitrogen 41966- 047 9206 07/07
DMSO (Dimetil sulfóxido) Sigma D2650 125K24 09 12/07
Penicilina & Estreptomicina Invitrogen 15070- 063 1298401
Soro: Clone Fetal I Perbio Science SH3008 0 AMM17 7 79 12/07
SOC Invitrogen 15544- 034 1306051
Azul Tripano Sigma T8154 19H238 8
Solução de Tripsina-EDTA, cultura celular testada, 0,25% Sigma T4049 48K234 2 04/08
Exemplo 9 - Seqüência de DNA de anticorpo 158
9.1- Preparação de RNA
Glóbulos celulares congelados do hibridoma de camundongo
158, (frascos marcados 060824# 158 5x106 células) foram recebidos por TAG em 3 de Outubro de 2006. Estas células foram armazenadas congeladas até processamento usando o kit Qiagen RNeasy midi para isolar RNA seguindo o protocolo do fabricante.
9.2 - Síntese de primeira fita
Cerca de 5 microgramas de RNA de 158 foi indivíduo à transcrição reversa para produzir cDNA de 158 usando o kit de síntese de primeira fita de Amersham Biosciences seguindo o protocolo do fabricante Isto foi repetido para gerar 3 produtos de cDNA independentes (ciclos 1, 2 e 3) a fim de evitar mutações de DNA devido à reação RT.
9.3 Clonagem do cDNA de imunoglobulina 158 cDNA de hibridoma 158 foi amplificado por PCR em 23 reações separadas. cDNA de região variável de cadeia capa de imunoglobulina (VK) foi amplificado usando 11 iniciadores VK (MKV1-11) em combinação com o iniciador de região constante capa MKC (Tabela 6). Similarmente, cDNA de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) foi amplificado por PCR usando 12 diferentes iniciadores VH (MHV112) em combinação com uma mistura dos quatro iniciadores de região constante de IgG (MHCGl/2a/2b/3: Tabela 7).
O resultado do conjunto inicial de reações de PCR de IgH foi o único produto de amplificação usando iniciador MHV5. Nenhum dos outros 11 pares de iniciadores geraram um produto de PCR. O produto da reação de PCR iniciada pelos iniciadores de oligonucleotídeos: MHV5 + (mistura de MHCGl/2a/2b/3) foi ligado no vetor pCR2.1°-TOPO° usando o kit TOPOTA cloning®. O resultado do conjunto inicial de reações de PCR de IgK foi dois únicos produtos de amplificação usando iniciadores MKV1 e MKV2 com MKC. Os outros 9 pares de iniciadores não geraram nenhum produto. Os produtos da reação de PCR iniciada pelos iniciadores de oligonucleotídeos: MKV1 ou MKV2 + MKC foram ligados no vetor pCR2.1°-TOPO° usando o kit TOPO-TA cloning®.
Bactérias E. coli transformadas com o vetor ligado foram clonadas em placas de LB/ampicilina/X-gal ágar, separando em grade de ágar e em mistura de triagem de PCR. Os insertos de plasmídeos clonados foram triados por amplificação por PCR. Os produtos de PCR passaram por eletroforese em gel e clones produzindo produto de amplificação por PCR de tamanho correto (500bp aprox) foram identificados. Culturas noturnas (5ml) de cada clone foram processadas usando o Protocolo de Kit QlAprep Spin
Miniprep, para produzir minipreps de plasmídeo de DNA.
9.4 - Determinação de seqüência de cDNA
O ciclo completo de RT-PCR, clonagem, e análise de seqüência de DNA foi repetido para obter três conjuntos completamente independentes de informação de seqüência para cada cadeia de imunoglobulina. Clones de plasmídeos de cada conjunto independente de reações de RT-PCR foram seqüenciados em ambas as direções usando os iniciadores 1212 e 1233 (Tabela 10). Plasmídeos foram seqüenciados usando o Kit BigDye® Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction (ABI), ciclados em uma máquina de PCR de GeneAmp9600 PCR e analisados em um seqüenciador capilar ABI 310.
9.5 - Seqüência de DNA de VK de 158
Seqüências de clones de VK gerados usando iniciadores de PCR MKV2 e MKC em ciclos 1 e 2 de cDNAs de primeira fita, foram idênticas a um transcrito capa estéril originado a partir do parceiro de fusão de mieloma tal como MOPC-21, SP2 e Ag8. Isto é um transcrito estéril.
A seqüência de consenso (VK de 158) de clones de VK gerados usando iniciadores de PCR MKV1 e MKC em ciclos 1-3 de cDNAs de primeira fita é mostrada em Tabela 11. Isto é um rearranjo funcional. Tabela 11 mostra algumas diferenças da seqüência mostrada em Tabelas 1, 4 e 5. Estas diferenças estão na região FW1 onde o iniciador de PCR foi localizado. A seqüência líder de VK de camundongo mais idêntica ao fragmento de líder em VK de 158, não codificada pelos iniciadores de requerentes, foi K5.1# (Tabela 12). A previsão de o peptídeo sinal clivar corretamente a seqüência sinal #K5.1 foi feita por um programa de previsão.
Sítio de clivagem mais propenso previsto foi corretamente entre resíduo de aminoácido 19 e 20. (Tabela 13). A proteína quimérica 158VK e seqüência de
DNA são mostradas em Tabela 14.
9.6 - Seqüência de DNA de VH de 158
A seqüência de consenso (VH de 158) de VH clones gerados usando iniciadores de PCR MHV5 e mistura de MHCGl/2a/2b/3 em ciclos 13 de cDNAs de primeira fita é mostrada em Tabela 15. Como com VK de 158, existem algumas diferenças da seqüência de FW1 mostrada em Tabelas 1, 4 e 5. A seqüência líder de VH de camundongo mais idêntica ao fragmento de líder, não codificada pelos iniciadores de requerentes, foi NL-1 (Tabela 16).
Exemplo 10 - Construção de vetores de expressão quiméricos
Construção de vetores de expressão quiméricos exige adicionar uma seqüência líder adequada a VH e VK, precedida por um sítio de restrição HindIII e uma seqüência Kozak. A seqüência Kozak (Tabela 8) assegura tradução eficiente da seqüência de região variável. Ela define o códon AUG correto a partir do qual um ribossomo pode começar tradução, e a base mais crítica é a adenina em posição -3, antes do começo de AUG. A seqüência líder é selecionada como a seqüência líder de camundongo mais no banco de dados de Kabat. Estas adições estão codificadas dentro dos iniciadores diretos (Tabela 9). Além disso, a construção dos vetores de expressão quiméricos exige introduzir um fragmento 5' da região constante γΐ humana, até um sítio de restrição Apa I natural, contíguo com a extremidade 3' da região J de 158. O CH é codificado no vetor de expressão depois da seqüência de VH inserida mas carece do íntron V-C. Para a cadeia leve, o sítio doador de processamento natural (Tabela 8) e um sítio Bam Hl são adicionados depois da região V. A seqüência doadora de processamento facilita remoção do íntron V:C de capa o que é necessário para acoplamento em quadro do VK à região constante.
Os genes VH e VK de camundongo foram analisados para identificar quaisquer sítios doadores de processamento indesejados, sítios aceptores de processamento, seqüências Kozak e para a presença de quaisquer sítios de restrição de subclonagem extra que podem posteriormente interferir na subclonagem e/ou expressão de anticorpo funcional inteiro. Neste caso nenhum foi encontrado.
10.1 - Vetores de expressão
Preparações de DNA de plasmídeo dos vetores de expressão pKNlOO, e pGlD200 foram purificadas usando kits Maxi da Qiagen seguindo o protocolo do fabricante. Purificação de DNA de plasmídeo usando Kits Plasmid Midi and Maxi da QIAGEN, a partir de culturas de 500ml de bactérias TOP 10 transfectadas com qualquer vetor. Os mapas de vetores são mostrados em Figs 10 e 11.
10.2 - Os iniciadores de quimerização de cadeia leve
A seqüência líder de camundongo K5.1# foi incorporada no modelo do VK de 158 quimérico. Iniciadores foram concebidos para gerar um produto de PCR contendo este líder completo, e VK de 158, com sítios de restrição terminais Hind III e Bam HI para clonagem no vetor de expressão pKNlOO (Tabela 9). O iniciador direto 158vl introduz um sítio de restrição Hind III; um sítio Kozak e a seqüência líder K5.1#. O iniciador reverso 158vlrev introduz: um sítio doador de processamento e um sítio de restrição Bam HI.
10.3 - Os iniciadores de quimerização de cadeia pesada
A seqüência líder NL-1 foi incorporada no modelo do VH de 158 quimérico. Iniciadores foram concebidos para gerar um produto de PCR contendo este líder, e a região VH de 158, com sítios de restrição terminais Hin dlll e Apa I para clonagem no vetor de expressão pGlD200. Estes são mostrados em Tabela 9. O iniciador direto, 158vh, introduz um sítio de restrição Hin dlll; um sítio de início de tradução Kozak e a seqüência líder NL-1. O iniciador reverso, 158vhrev, introduz a extremidade 5' da região C γΐ e um sítio de restrição Apa I natural. Esta previsão de sítio de divagem de peptídeo sinal para seqüência líder K5.1 de VK é mostrada em Tabela 17.
10.4 - Geração da construção quimérica de VH de 158: pGlD200158VH
O fragmento de DNA de VH de 158 foi amplificado com iniciadores: 158vh e 158vhrev (Tabela 9). O produto de PCR de 450bp (aprox) foi T-A ligado no vetor pCR2.1 e usado para transformar bactérias TOP 10 quimicamente competentes. Clones foram selecionados por tamanho de inserto apropriado e seqüenciados usando o iniciador 1212 (Tabela 10). O inserto de expressão correto foi subclonado em vetor de expressão pGlD200 e o subclone correto foi selecionado por seqüenciamento de DNA usando iniciador BDSH61R (Tabela 10). Este clone foi crescido em cultura de 200 ml para produzir DNA de plasmídeo usando o Kit Maxi de Qiagen usando o protocolo de fabricante. A proteína quimérica 158VH e seqüência de DNA são mostradas em Tabela 18.
10.5 - Geração da construção quimérica de VK de 158: pKN100158VK
- O fragmento de DNA de VK de 158 foi amplificado com iniciadores 158vl e 158vlrev (Tabela 9). O produto de PCR de 450bp (aprox) foi T-A ligado no vetor pCR2.1 e usado para transformar bactérias TOP 10 quimicamente competentes. Clones foram selecionados tamanho de inserto e seqüenciados usando o iniciador 1212 (Tabela 10). O clone correto foi subclonado em vetor de expressão ρΚΝΙΟΟ. O subclone correto foi selecionado triando por tamanho de inserto e seqüenciamento de DNA usando iniciador Hu-K2 (Tabela 10). Este clone foi crescido em cultura de 200 ml para produzir DNA de plasmídeo usando o Kit Maxi da Qiagen usando o protocolo de fabricante.
Exemplo 11 - Produção e propriedades de ligação de anticorpo quimérico 158
11.1- Transformação de célula COS 7 e cultura celular
Um frasco de células COS 7 foi descongelado e crescido em DMEM suplementado com 10% de soro de clone I fetal e antibióticos. Uma semana depois, células (0,8ml a 10 /ml) foram eletroporadas com pGlD200158VH mais pKN100158VK (10pg de cada DNA). As células foram crescidas em 8ml de meio de crescimento em placas de petri por 3 dias.
11.2 - Produção de anticorpo quimérico
Um ELISA sanduíche foi usado para medir concentrações de anticorpo nos sobrenadantes de COS 7. Anticorpo quimérico 158 VH x 158 VK foi expresso a 0,3pg/ml e subseqüentemente a 3,7pg/ml (Tabela 19) em meio condicionado com célula COS transientemente co-transfectada.
11.3 - Atividade de anticorpo quimérico
Dois ELISAs foram usados para analisar a ligação de antígeno de 158 quimérico. Usando o meio condicionado com anticorpo quimérico a 3,7pg/ml, ligação de monômero Αβ foi medida por um protocolo de ELISA direto (Figura 12) e comparada com a IgG 158 de camundongo. Secundariamente, um ELISA de competição foi feito usando ou monômero ou protofibrila misturada na fase fluida com anticorpo, que subseqüentemente se ligou a monômero Αβ na fase sólida (Figura 13). Estes mostraram que o anticorpo 158 quimérico se liga a monômero e protofibrila amilóide Αβ similarmente ao anticorpo 158 de camundongo original.
Comentário
Seqüenciamento posterior mostrou que os dados de seqüência de anticorpo de camundongo, como mostrado em Tabelas 1 e 4 contêm erros tanto em cadeias VH como VK na extremidade 5'. Os requerentes sugerem que isto é devido ao uso de iniciadores localizados dentro da região V. Em seqüenciamento posterior, iniciadores localizados dentro das seqüências líderes, que não podem introduzir mutações dentro das regiões V, foram usados. O seqüenciamento posterior mostrou diferenças de seqüências (veja
Tabelas 15 e 11). Ditas diferenças entretanto não estão localizadas dentro das regiões CDR.
O anticorpo quimérico se liga a monômero e protofibrilas de amilóide Αβ como mostrado pelo ELISA de ligação direta e o ELISA de competição respectivamente. Esta evidência confirma que a combinação de cadeias 158 VH e 158 VK codifica o anticorpo 158 anti-LSAP e indica que estas seqüências são adequadas para o procedimento de humanização para gerar um anticorpo 158 humanizado.
Exemplo 12 - Concepção e discussão de anticorpo humanizado Abreviações e definições
158 anticorpo monoclonal 158 de camundongo anti-LSAP™
158 VH VH de anticorpo 158 de camundongo
158 VK VK de anticorpo 158 de camundongo
158RKAss Versão humanizada de VK de 158 retendo sítios de processamento críticos
158RKA Versão humanizada de VK de 158 com sítios de processamento críticos removidos 158RHAss Versão humanizada de 158 VH retendo sítios de processamento críticos
158RHA Versão humanizada de 158 VH com sítios de processamento críticos removidos
A Adenina bp pares de bases
C Citosina
CDR região determinante de complementaridade nas regiões variáveis de imunoglobulina, definida usando o sistema
de numeração de Kabat
D-gene gene de diversidade
DNA Ácido desoxirribonucléico
FW Região de estrutura: as regiões variáveis imunoglobulina excluindo as regiões CDR de
G Guanina
IgG Imunoglobulina G
J-gene Gene de acoplamento
Kabat um sistema de alinhamento e numeração imunoglobulina fundado por Elvin A Kabat de
mAb anticorpo monoclonal
MRCT Medicai Research Council Technology
T Timina
VCI Resíduo de estrutura classificado como nônio canônico ou interface VH-VL ou
V-gene 0 segmento de gene que é rearranjado junto com um gene J (e D para VH) para gerar um VH ou VK completo
Região V O segmento de cadeias de IgG que é variável em seqüência entre diferentes anticorpos. Ela se estende a resíduo 109 de Kabat na cadeia leve e 113 na cadeia pesada.
VH Região variável de cadeia pesada de imunoglobulina
VK Região variável de cadeia leve capa de imunoglobulina
Equipamento
Hardware & software Origem
Computador SGWO2 Silicon Graphics
Computador PC Hewlett Packard
SR 7.6 Steve Searle, Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge.
Lasergene 6.0 DNAstar Inc
Modeler 9.0 Accelrys Ltd.
SignalP www.cbs.dtu.dk
BlastP www.ncbi.nlm.nih.gov
12.1 - Bancos de dados de gene V humano
As seqüências protéicas de imunoglobulinas humanas e de camundongo da Intemational
Inununogenetics Database 2006 e da Publicação 5 de Banco de Dados de Kabat de Seqüências de Proteínas de Interesse Imunológico (última atualização 17-Nov-1999) foram usadas para compilar um banco de dados de seqüências protéicas de imunoglobulina em alinhamento de Kabat. O banco de dados dos requerentes contém 9322 seqüências de VH humano e 2689 de VK humano. O programa de análise de seqüências, SR 7.6, foi usado para consultar os bancos de dados de VH e VK humano com seqüências protéicas de VH de 158 e VK de 158 (Tabela 20).
12.2 - Seleção de uma estrutura humana para 158RHA
12.2.1 - Comparação de VH de 158 com seqüências de VH humano
Seqüências de VH humano com maior identidade para VH de 158 em resíduos (VCI) Nônios (Foote,J. and G.Winter. 1992. Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops. JMol.Biol. 224:487-499.), Canônicos (Morea,V., A.M.Lesk, and A.Tramontano. 2000. Antibody modeling: implications for engineering and design. Methods 20:267-279.) e VH-VL Interface (Chothia,C., J.Novotny, R.Bruccoleri, and M.Karplus. 1985. Domain association in immunoglobulin molecules. The packing of variable domains. J MoLBioL 186:651-663.), localizadas dentro da estrutura de região V (FW), são mostradas em Tabela 21. O número de resíduos VCI (escore de VCI) e resíduos FW (escore de FW) idênticos a 158 também são mostrados. Todas estas seqüências de VH compartilham resíduos VCI idênticos, e comprimentos de CDR, como mostrado em Tabela 22. AJ556669 tem uma Pro74 incomum não vista nas outras seqüências humanas neste conjunto de dados, levando os requerentes a descontá-la na análise inicial. Pro74, entretanto, está presente na seqüência 158VH, então AJ556669 pode ser considerado como um FW alternativo para humanização, se a construção VH baseada em AF062243 não se liga a antígeno. O alinhamento destas seqüências (Tabela 23) destaca suas diferenças. AF062243 especificamente dentro deste conjunto de dados tem a mudança conservativa T(82a)S e a conservação de F79. As outras características de AF062243 são as mudanças conservativas D1E, K19R, A23S, T77S, S118T. Todas as outras mudanças de FW foram comuns a todos as estruturas em Tabela 23. AF062243 foi selecionado como o estrutura em qual basear 158RHA.
12.3 - Geração de 158RHA
A concepção de 158RHA é simplesmente o enxerto de CDR 1, 2 e 3 de VH de 158 no FW aceptor de AF062243. O gene V de linhagem germinativa humana mais idêntico a AF062243 é VH M99649 (VH3-07), (Tabela 24) do qual o peptídeo líder foi extraído (Tabela 25). O algoritmo SignalP (Nielsen,H., J.Engelbrecht, S.Brunak, and G.von Heijne. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Eng 10:1-6.) previu que ele seria cortado apropriadamente com peptidase sinal (Tabela 26). Tabela 27 mostra o esquema de enxertar CDR 1, 2 e 3 de VH de 158 no FW de AF062243, para gerar seqüência protéica 158RHA. Tabela 28 mostra a geração da seqüência de DNA 158RHAss das seqüências de DNA naturais de VH de 158 e AF062243. Análise da seqüência de DNA de 158RHAss previu a presença de sítios doadores de processamento, os escores de previsão dos quais são mostrados em Tabela 29. Mutações não codificantes foram introduzidas para inativar estes sítios de processamento previstos, como mostrado em Tabela 30 para gerar a seqüência de DNA 158RHA final (Tabela 31).
12.4 - Seleção de uma estrutura humana para 158RKA
12.4.1 - Comparação de VK de 158 com seqüências de VK humano
As seqüências de VK humano com maior identidade para VK de 158 em resíduos VCI são mostradas em Tabela 32 junto com o número de resíduos VCI (escore de VCI) e resíduos de FW (escore de FW) idênticos a VK de 158. Onze seqüências têm todos os resíduos VCI idênticos a VK de 158. Tabela 33 mostra que todas estas seqüências têm comprimentos de CDR idênticos a VK de 158. Tabela 34 destaca suas diferenças, mostrando que K45 é mantido em AB064054 apenas, que também retém 185. A mudança G1 00P é desinteressante porque P100 é comum, tendo uma incidência de 15% em banco de dados de VK humano de requerentes. As duas substituições: T7S e K74R, são conservativas, e todas as outras substituições são comuns a todas as seqüências em Tabela 34. Por estas razões AB064054 foi selecionado para gerar 158RKA.
12.5 - Geração de 158RKA
A concepção de 158RKA é simplesmente o enxerto dos CDRs 1, 2 e 3 de VK de 158 no FW aceptor de AB064054 humano. O gene V de linhagem germinativa mais próxima a AB064054 é A19 (Tabela 35), a partir do qual o peptídeo líder foi extraído (Tabela 36). O algoritmo SignalP previu incisão apropriada (Tabela 37) deste peptídeo líder. Tabela 38 mostra a geração da seqüência protéica de 158RKA por intercalação das CDRs de VK de 158 no FW de AB064054. Tabela 39 mostra a geração da seqüência de DNA de 158RKAss da seqüência de DNA natural de VK de 158 e AB064054. Análise dos 158RKAss previu a presença de sítios doadores de processamento, os escores dos quais são mostrados em Tabela 40. Mutações não codificantes (41) foram introduzidas para inativar estes sítios e gerar a construção de DNA de 158RKA final (Tabela 42).
12.6 Atividade de ligação de anticorpo humanizado (BAN2401)
Os genes 158RKA e 158RHA foram inseridos em um vetor de expressão contendo a região constante de IgGl. Esta construção foi expressa em células COS para gerar o anticorpo 158 humanizado. O anticorpo 158 humanizado foi testado para atividade e especificidade de ligação em um
ELISA competitivo. O anticorpo humanizado exibiu propriedades de ligação idênticas a mAbl58 e ao anticorpo quimérico 158 (veja Figura 14.)
12.7 Mutações adicionais nas cadeias 158RHA e 158RKA.
Comparando genes V de linhagem germinativa de camundongo VH AAK71612 a VH de 158 uma única mutação somática A6OG na CDR2 foi identificada. Além disso, o modelo molecular de anticorpo 158 que contém três resíduos VH FW dentro de 5A de resíduos de CDR que não são conservados em 158RHA. Estas substituições são D1E, P74A e T82S (Tabela 43). Similarmente, existem dois resíduos VK FW dentro de 5A de resíduos de CDR que não é conservada em 158RKA. Esta substituição é L3V e Gl 00P (Tabela 44). Introdução de mutações reversas em posições VH-1, VH-74, VH-82, VK-3 e VK-100 em 158RHA e 158RKA, em versões humanizadas 158RHB, 158RHC, 158RHD, 158RKB e 158RKC são mostradas em Tabela 43 e 44.
REFERÊNCIAS
Bacskai et al., Nat.Med. 7:369-372, 2001.
Bard et al., Nat. Med. 6:916-919, 2000.
Bayer et al., Neurology 64:94-101, 2005.
Brendza et al., J. Clin. Invest. 115:428-33, 2005.
Chen et al., Nature, 408:975-9, 2000.
Chothia,C. et al, J Mol.Biol., 186:651-663, 1985.
Ester W.P. Science 293, 1449-1459, 2001.
Gullberg et al., Proc. Natl Acad Sei, 101:8420-4, 2004.
Foote, J. et al., JMol.Biol., 224:487-499, 1992.
Hoshi et al. Proc. Natl Acad. Sei, 100:6370-6375, 2003.
Jarret J.T., Biochemistry, 32, 4693-4697,1993.
Leatherbarrow RJ. et al., Mol. Immunol. 22, 407, 1985.
Lord et al., Neurobiol. Aging, 27:67-77, 2006.
McLean et al., Ann. Neurol. 46:860-866, 1999. Morea,V. et al., Methods 20:267-279, 2000. Mullan et al., Nat Genet. 1:345-347, 1992. Nielsen,H. et al. Protein Eng 10:1-6, 1997.
5 Nilsberth et al., Nat Neurosci. 4:887-893, 2001. Naslund et al., JAMA, 283:1571-1577, 2000. Pfeifer et al., Science 298:1379, 2002. Racke et al., J.Neurosci 25 :629-36, 2005. SchenkD. etal. Nature, 400, 173-177, 1999.
10 Stenh et al., Ann. Neurol. 58:147-50, 2005. Walsh D. M. et al., 272, 22364-22372,1997 Walsh D. M.et al., Nature, 416, 535-9, 2002. Wilcock et al., J. Neurosci., 23:3745-51, 2003. Wright A. et al., J. of Immunology, 3393-3402, 1998.
15 Xu Y. et al. J.Biol. Chem. 269, 3469-3474,1994.
REIVINDICAÇÕES

Claims (28)

1. Anticorpo ou fragmento do mesmo sendo seletivo e tendo alta afinidade para protofibrilas Αβ humanas, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento em suas seis regiões CDR tem as seguintes seqüências de consenso:
VH-CDR1 SFGMH (SEQ ID NO. 1)
VH-CDR2 YISSGSSTIYYGDTVKG (SEQ ID NO. 2) VH-CDR3 EGGYYYGRSYYTMDY (SEQ ID NO. 3) VL-CDR1 RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO. 4) VL-CDR2 KVSNRFS (SEQ ID NO. 5) VL-CDR3 FQGSHVPPT (SEQ ID NO. 6).
2. Anticorpo de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é monoclonal.
3. Anticorpo de acordo com reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o aminoácido prolina na posição 331 no IgGl é modificado para serina ou um outro aminoácido polar.
4. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é de classe IgG.
5. Anticorpo de acordo com reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é de subclasse IgGl ou IgG4.
6. Anticorpo de acordo com reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é uma quimera de subclasses IgGl e IgG4, onde a região constante de cadeia pesada CH2 ou parte de CH2 é derivada de IgG4 e as regiões CHI e CH3 são derivadas de IgGl.
7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo compreende a seqüência de aminoácidos de cadeia pesada completa de acordo com Tabela 31 (SEQ ID N°178) e a seqüência de aminoácidos de cadeia leve completa de acordo com Tabela 42 (SEQ ID N°264).
8. Anticorpo que se liga a protofibrilas Αβ humanas, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos 158RHA na Tabela 27 (SEQ ID N°158) e a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos 158RKA na Tabela 38 (SEQ ID N° 244).
9. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo compreende mutações na cadeia pesada (VH) de acordo com Tabela 43 (SEQ ID N°265), ditas mutações sendo selecionadas a partir de E a D na posição 1 de Kabat (ElD na SEQ ID N°265), A a P na posição 74 de Kabat (A75P na SEQ ID N° 265) e S a T na posição 82A de Kabat (S84T na SEQ ID N° 265), e/ou mutações na cadeia leve (VK) de acordo com Tabela 44 (SEQ ID N°269), ditas mutações sendo selecionadas de V a L na posição 3 de Kabat (V3L na SEQ ID N°269) e P a G na posição 100 de Kabat (P105G na SEQ ID N°269), ou combinações destas mutações VH e VK.
10. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo compreende a seqüência de cadeia pesada completa de acordo com Tabela 31 (SEQ ID N°178) e a seqüência de cadeia leve completa de acordo com Tabela 42 (SEQ ID N°264), com a exceção de que na cadeia pesada a mutação S23A foi introduzida (S42A na SEQIDN°178).
11. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é humano ou humanizado ou mutado para reduzir antigenicidade em humanos.
12. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a proporção de especificidade entre monômeros e protofibrilas Αβ é pelo menos 1:200 como determinado por ELISA competitivo.
13. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações
I a 6, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo é um anticorpo de camundongo.
14. Anticorpo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo compreende a seqüência de cadeia leve completa codificada pela sequência de DNA 158 VK de acordo com Tabela
II (SEQ ID N° 97) e a seqüência de cadeia pesada completa codificada pela sequência de DNA 158 VH de acordo com Tabela 15 (SEQ ID N°106).
15. Composição, caracterizada pelo fato de compreender o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14 e um tampão farmaceuticamente aceitável.
16. Composição de acordo com reivindicação 15, caracterizada por compreender adicionalmente um agente antibacteriano.
17. Composição de acordo com reivindicação 15 ou 16, caracterizada pelo fato de que a composição é liofilizada.
18. Composição de acordo com reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a composição é liofilizada junto com um excipiente para aumentar estabilidade do anticorpo durante e depois de liofilização.
19. Composição de acordo com reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o excipiente é manitol ou trealose.
20. Método para detectar protofibrilas Αβ in vitro, caracterizado por compreender as etapas de:
- adicionar o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14 a uma amostra biológica compreendendo ou suspeita de compreender protofibrilas Αβ.
- medir a concentração do complexo formado entre dita protofibrila Αβ e dito anticorpo.
21. Método de acordo com reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que dito método de detecção é um imunoensaio.
22. Método de acordo com reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que dito método de detecção é um ensaio de ligação de proximidade.
23. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de ser para o uso no diagnóstico de mal de Alzheimer.
24. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de ser para o uso no diagnóstico de síndrome de Down, demência com corpos de Lewy ou demência vascular.
25. Uso do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14 ou da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizado por ser para a preparação de um medicamento para tratamento de mal de Alzheimer.
26. Uso do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14 ou da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizado por ser para a preparação de um medicamento para tratamento de síndrome de Down, demência com corpos de Lewy ou demência vascular.
27. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizado por ser para uso no tratamento de mal de Alzheimer.
28. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizado por ser para uso no tratamento de síndrome de Down, demência com corpos de Lewy ou demência vascular.
BRPI0709050A 2006-03-23 2007-03-23 anticorpo ou fragmento do mesmo, composição, métodos para detectar protofibrilas ab in vitro, e, uso do anticorpo BRPI0709050B1 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE0600662-1 2006-03-23
SE0600662 2006-03-23
SE0602591 2006-11-30
SE06025910 2006-11-30
PCT/SE2007/000292 WO2007108756A1 (en) 2006-03-23 2007-03-23 Improved protofibril selective antibodies and the use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BRPI0709050A2 BRPI0709050A2 (pt) 2011-06-21
BRPI0709050B1 true BRPI0709050B1 (pt) 2018-12-26

Family

ID=38522718

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0709050A BRPI0709050B1 (pt) 2006-03-23 2007-03-23 anticorpo ou fragmento do mesmo, composição, métodos para detectar protofibrilas ab in vitro, e, uso do anticorpo

Country Status (25)

Country Link
US (2) US8025878B2 (pt)
EP (2) EP2325209A3 (pt)
JP (1) JP5033868B2 (pt)
KR (1) KR101413615B1 (pt)
CN (1) CN101421303B (pt)
AT (1) ATE492561T1 (pt)
AU (1) AU2007227813B2 (pt)
BR (1) BRPI0709050B1 (pt)
CA (1) CA2630344C (pt)
CY (1) CY1111337T1 (pt)
DE (1) DE602007011415D1 (pt)
DK (1) DK2004688T4 (pt)
HK (1) HK1120056A1 (pt)
HR (1) HRP20110203T4 (pt)
IL (1) IL191331A (pt)
MX (1) MX2008012223A (pt)
MY (1) MY169492A (pt)
NO (1) NO347079B1 (pt)
NZ (1) NZ567888A (pt)
PL (1) PL2004688T5 (pt)
RS (1) RS51723B2 (pt)
RU (1) RU2429244C2 (pt)
SI (1) SI2004688T2 (pt)
WO (1) WO2007108756A1 (pt)
ZA (1) ZA200805805B (pt)

Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2082749A3 (en) 2000-07-07 2010-06-30 Bioarctic Neuroscience AB Prevention and treatment of Alzheimer's disease
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
SE0401601D0 (sv) 2004-06-21 2004-06-21 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril specific antibodies and uses thereof
DK1976877T4 (en) 2005-11-30 2017-01-16 Abbvie Inc Monoclonal antibodies to amyloid beta protein and uses thereof
PT1954718E (pt) 2005-11-30 2014-12-16 Abbvie Inc Anticorpos anti-globulómeros aβ, suas porções de ligação ao antigénio, correspondentes hibridomas, ácidos nucleicos, vectores, células hospedeiras, métodos de produção dos ditos anticorpos, composições compreendendo os ditos anticorpos, usos dos ditos anticorpos e métodos para uso dos ditos anticorpos
RU2429244C2 (ru) 2006-03-23 2011-09-20 Байоарктик Ньюросайенс Аб Улучшенные селективные в отношении протофибрилл антитела и их применение
WO2007114319A1 (ja) 2006-03-31 2007-10-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の血中動態を制御する方法
CN101500608A (zh) 2006-06-08 2009-08-05 中外制药株式会社 炎性疾病的预防或治疗药
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
JP2010515717A (ja) 2007-01-11 2010-05-13 フィリップス−ウニベルジテート・マールブルク アルツハイマーおよび他の神経性認知症疾患の診断ならびに処置
WO2008104386A2 (en) 2007-02-27 2008-09-04 Abbott Gmbh & Co. Kg Method for the treatment of amyloidoses
US8613923B2 (en) 2007-06-12 2013-12-24 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
US8048420B2 (en) 2007-06-12 2011-11-01 Ac Immune S.A. Monoclonal antibody
WO2009041613A1 (ja) 2007-09-26 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体定常領域改変体
CN101874042B9 (zh) 2007-09-26 2019-01-01 中外制药株式会社 利用cdr的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法
AU2008311367B2 (en) 2007-10-05 2014-11-13 Ac Immune S.A. Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases
MY158903A (en) * 2007-11-16 2016-11-30 Univ Rockefeller Antibodies specific for the protofibril form of beta-amyloid protein
ES2834741T3 (es) * 2007-12-05 2021-06-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-NR10 y uso del mismo
PT2246427T (pt) * 2008-02-08 2017-03-03 Immunas Pharma Inc Anticorpos capazes de se ligar especificamente a oligómeros beta amilóides e a sua utilização
PT2282758T (pt) 2008-04-29 2019-02-12 Bioarctic Ab Anticorpos e vacinas para uso em métodos terapêuticos e diagnósticos para perturbações relacionadas com a alfa-sinucleína
US9085614B2 (en) * 2008-08-01 2015-07-21 Immunas Pharma, Inc. Antibodies that specifically bind to Aβ oligomers and uses thereof
EP2328930B1 (en) * 2008-08-20 2014-12-24 Probiodrug AG Antibodies directed against pyroglutamate monocyte chemoattractant protein-1 (mcp-1 n1pe)
TWI544077B (zh) 2009-03-19 2016-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody constant region change body
EP2409991B1 (en) 2009-03-19 2017-05-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
ES2641612T3 (es) 2009-04-17 2017-11-10 Immunas Pharma, Inc. Anticuerpos que se unen específicamente a oligómeros de beta A y uso de los mismos
FR2945538B1 (fr) 2009-05-12 2014-12-26 Sanofi Aventis Anticorps humanises specifiques de la forme protofibrillaire du peptide beta-amyloide.
DK2448968T3 (da) * 2009-06-29 2021-04-12 Bioarctic Ab ANTISTOFFER SOM ER SELEKTIVE FOR N-TERMINAL-TRUNKEREDE AMYLOID-ß PROTOFIBRILLER/OLIGOMERER
EP2273273A1 (en) * 2009-07-11 2011-01-12 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Inhibitors of the nitration of amyloid ß peptides and their uses in the diagnosis and treatment of alzheimer's disease
CN102574915B (zh) 2009-08-06 2014-10-22 伊缪纳斯制药株式会社 特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其用途
JP5599454B2 (ja) * 2009-08-06 2014-10-01 イムナス・ファーマ株式会社 Ａβオリゴマーに特異的に結合する抗体およびその利用
US10266585B2 (en) 2009-08-28 2019-04-23 The Board Of Regents Of The Univerity Of Texas System Methods of treating brain injury
DK2504363T3 (da) 2009-11-24 2019-07-29 Alethia Biotherapeutics Inc Anti-clusterin-antistoffer og antigenbindende fragmenter og deres anvendelse til reducering af tumorvolumen
EP2539366B1 (en) 2010-02-26 2017-11-08 BioArtic Neuroscience AB Protofibril-binding antibodies and their use in therapeutic and diagnostic methods for parkinson's disease, dementia with lewy bodies and other alpha-synucleinopathies
MX360403B (es) 2010-04-15 2018-10-31 Abbvie Inc Proteinas de union a amiloide beta.
WO2011151076A2 (en) 2010-06-04 2011-12-08 Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts, Universitätsmedizin MONOCLONAL ANTIBODIES TARGETING Αβ OLIGOMERS
CN103179981B (zh) 2010-07-30 2017-02-08 Ac免疫有限公司 安全和功能性的人源化抗β‑淀粉样蛋白抗体
EP2603524A1 (en) 2010-08-14 2013-06-19 AbbVie Inc. Amyloid-beta binding proteins
AU2011315920B2 (en) 2010-10-15 2016-04-28 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Antibodies that bind amyloid oligomers
EP2663579B1 (en) 2011-01-14 2017-04-26 The Regents of the University of California Therapeutic antibodies against ror-1 protein and methods for use of same
EP2497782A1 (en) 2011-03-08 2012-09-12 Alzinova AB Anti oligomer antibodies and uses thereof
IN2014CN03555A (pt) 2011-10-25 2015-07-03 Onclave Therapeutics Ltd
JP2013159596A (ja) * 2012-02-08 2013-08-19 Nihon Univ β−アミロイド前駆体タンパク質のマイクロ凝集体に特異的なモノクローナル抗体
EP2817028A4 (en) 2012-02-22 2015-11-04 Alethia Biotherapeutics Inc COMMON USE OF A CLUSTERIN INHIBITOR AND EGFR INHIBITOR FOR TREATING CANCER
JP6462680B2 (ja) 2013-07-09 2019-01-30 アネクソン，インコーポレーテッド 抗補体因子Ｃ１ｑ抗体及びその使用
CN112457403B (zh) 2013-09-13 2022-11-29 广州百济神州生物制药有限公司 抗pd1抗体及其作为治疗剂与诊断剂的用途
EP3071597B1 (en) * 2013-11-21 2020-07-29 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
KR102130600B1 (ko) 2014-07-03 2020-07-08 베이진 엘티디 Pd-l1 항체와 이를 이용한 치료 및 진단
DK3166970T3 (da) 2014-07-10 2021-05-25 Bioarctic Ab FORBEDREDE Aß-PROTOFIBRILBINDENDE ANTISTOFFER
RU2711141C2 (ru) 2014-07-22 2020-01-15 СиБи ТЕРЕПЬЮТИКС, ИНК. Антитела против pd-1
SG10201901057UA (en) 2014-08-05 2019-03-28 Cb Therapeutics Inc Anti-pd-l1 antibodies
CN107207587B (zh) 2014-11-05 2022-04-19 安尼艾克松股份有限公司 人源化抗-补体因子c1q抗体及其应用
US10357563B2 (en) 2014-12-18 2019-07-23 The University Of Chicago Methods and composition for neutralization of influenza
BR112017022101A2 (pt) 2015-04-14 2018-07-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha composição farmacêutica para prevenção e/ou tratamento de dermatite atópica contendo antagonista de il-31 como ingrediente ativo
WO2017013599A1 (en) 2015-07-21 2017-01-26 Bioarctic Neuroscience Ab Method for treatment of traumatic brain injury targeting aggregated peptides
US10723788B2 (en) 2015-11-24 2020-07-28 Annexon, Inc. Anti-complement factor C1q Fab fragments and uses thereof
JP2017132742A (ja) * 2016-01-29 2017-08-03 国立大学法人 大分大学 Ａβオリゴマー特異的抗体の新規薬理用途
TWI798751B (zh) 2016-07-01 2023-04-11 美商美國禮來大藥廠 抗－N3pGlu類澱粉β肽抗體及其用途
CN109475536B (zh) 2016-07-05 2022-05-27 百济神州有限公司 用于治疗癌症的PD-l拮抗剂和RAF抑制剂的组合
RU2019102746A (ru) 2016-07-14 2020-08-14 Биоарктик Аб Белок для транспорта в мозг
CN118252927A (zh) 2016-08-19 2024-06-28 百济神州有限公司 使用包含btk抑制剂的组合产品治疗癌症
JP2019536471A (ja) 2016-09-27 2019-12-19 セロ・セラピューティクス・インコーポレイテッドＣＥＲＯ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． キメラエンガルフメント受容体分子
SG11201903601QA (en) 2016-10-27 2019-05-30 Eisai R&D Man Co Ltd Composition comprising an anti-abeta protofibril antibody and a beta-secretase bace1 inhibitor for the treatment of alzheimer's disease
CN110461847B (zh) 2017-01-25 2022-06-07 百济神州有限公司 (S)-7-(1-(丁-2-炔酰基)哌啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的结晶形式、其制备及用途
AU2018290532A1 (en) 2017-06-26 2019-11-21 Beigene, Ltd. Immunotherapy for hepatocellular carcinoma
CA3067597C (en) 2017-06-29 2023-03-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chimeric antibodies for treatment of amyloid deposition diseases
US11382974B2 (en) 2017-08-01 2022-07-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods and compositions for treatment of amyloid deposition diseases
AU2018341244A1 (en) 2017-09-26 2020-03-05 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric engulfment receptor molecules and methods of use
WO2019108795A1 (en) 2017-11-29 2019-06-06 Beigene Switzerland Gmbh Treatment of indolent or aggressive b-cell lymphomas using a combination comprising btk inhibitors
EP3753952A4 (en) * 2017-12-13 2022-04-13 XDCExplorer (Shanghai) Co., Ltd. EGFRVIII ANTIBODY AND CONJUGATE, METHOD FOR THE PREPARATION AND USE THEREOF
WO2019191332A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric engulfment receptors and uses thereof for neurodegenerative diseases
US12018069B2 (en) 2018-06-28 2024-06-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods and compositions for imaging amyloid deposits
CN111094340B (zh) 2018-07-17 2022-11-22 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗Abeta抗体、其抗原结合片段及应用
IL280315B2 (en) * 2018-07-24 2024-06-01 Eisai R&D Man Co Ltd Methods for treating and preventing Alzheimer's disease
BR112022006590A2 (pt) 2019-11-20 2022-06-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Preparação contendo anticorpos
US20230108300A1 (en) * 2020-01-29 2023-04-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods of t cell receptor vb family member targeting for the treatment of t cell associated disease
AU2021298222A1 (en) 2020-06-26 2022-12-15 Bioarctic Ab α-synuclein protofibril-binding antibodies
TW202300517A (zh) 2021-03-12 2023-01-01 美商美國禮來大藥廠 抗類澱粉β抗體及其用途
WO2022251048A1 (en) 2021-05-24 2022-12-01 Eli Lilly And Company Anti-amyloid beta antibodies and uses thereof
JP2024522627A (ja) 2021-06-11 2024-06-21 バイオアークティック アクティエボラーグ 二重特異性結合分子
JP2024525559A (ja) 2021-07-09 2024-07-12 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 アルツハイマー病治療用バイオマーカー
KR20240053620A (ko) 2021-08-30 2024-04-24 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 항-a베타 프로토피브릴 항체의 피하 제형 및 이를 사용하는 방법
WO2023099788A1 (en) 2021-12-03 2023-06-08 Neurimmune Ag Novel potency assay for antibody-based drugs and useful means therefor
CA3242280A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Eisai R&D Management Co., Ltd. Methods of using an anti-amyloid beta protofibril antibody and anti-tau antibody
WO2023111618A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Eisai R&D Management Co., Ltd. Methods of using an anti-amyloid beta protofibril antibody and anti-tau antibody
KR20240142535A (ko) 2022-02-02 2024-09-30 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 P-tau181 수준을 사용한 치료 방법
WO2024118665A1 (en) 2022-11-28 2024-06-06 Eisai R&D Management Co., Ltd. Methods of treatment using a tau pet level
WO2024155876A1 (en) 2023-01-20 2024-07-25 Mabwell Therapeutics, Inc. ANTI-AMYLOID β PROTOFIBRIL/OLIGOMER ANTIBODIES AND USES THEREOF

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5231000A (en) 1987-10-08 1993-07-27 The Mclean Hospital Antibodies to A4 amyloid peptide
US5753624A (en) * 1990-04-27 1998-05-19 Milkhaus Laboratory, Inc. Materials and methods for treatment of plaquing disease
US6174916B1 (en) * 1990-04-27 2001-01-16 Milkhaus Laboratory, Ltd. Methods for treating herpes virus infections
ATE153534T1 (de) 1990-04-27 1997-06-15 John Mcmichael Verfahren und zusammensetzung zur behandlung von erkrankungen des zns hervorgerufen durch abnormales beta-amyloid-protein
US5604102A (en) 1992-04-15 1997-02-18 Athena Neurosciences, Inc. Methods of screening for β-amyloid peptide production inhibitors
AU702293B2 (en) * 1993-10-27 1999-02-18 Athena Neurosciences, Inc. Transgenic animals harboring APP allele having Swedish mutation
AU686818B2 (en) 1994-05-25 1998-02-12 John Mcmichael Materials and methods for treatment of plaquing diseases
US6114133A (en) * 1994-11-14 2000-09-05 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of Alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41)
US7427392B1 (en) * 1994-11-14 2008-09-23 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41) and tau
US5786180A (en) * 1995-02-14 1998-07-28 Bayer Corporation Monoclonal antibody 369.2B specific for β A4 peptide
US6303567B1 (en) * 1995-03-14 2001-10-16 Praecis Pharmaceuticals, Inc . Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids
ES2175083T3 (es) * 1995-03-14 2002-11-16 Praecis Pharm Inc Moduladores de la agregacion de amiloides.
US5817626A (en) * 1995-03-14 1998-10-06 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of beta-amyloid peptide aggregation
US5854215A (en) * 1995-03-14 1998-12-29 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of β-amyloid peptide aggregation
US5985242A (en) * 1995-10-27 1999-11-16 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of β-amyloid peptide aggregation comprising D-amino acids
JPH09178743A (ja) 1995-12-27 1997-07-11 Oriental Yeast Co Ltd 可溶性ａｐｐの定量法
WO1997041856A1 (en) 1996-05-08 1997-11-13 Massachusetts Institute Of Technology ORGANOMETALLIC LIGANDS FOR THE LOCALIZATION AND QUANTIFICATION OF AMYLOID IN VIVO AND $i(IN VITRO)
US6218506B1 (en) * 1997-02-05 2001-04-17 Northwestern University Amyloid β protein (globular assembly and uses thereof)
US20030068316A1 (en) * 1997-02-05 2003-04-10 Klein William L. Anti-ADDL antibodies and uses thereof
US20060178302A1 (en) * 1997-02-05 2006-08-10 Northwestern University & The University Of Southern California Amyloid beta protein (globular assembly and uses thereof)
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US7964192B1 (en) 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
ES2253839T3 (es) 1997-12-03 2006-06-01 Neuralab, Ltd. Supresion de cambios relacionados con amiloide beta en la enfermedad de alzheimer.
AU2486900A (en) 1998-12-29 2000-07-31 University Of Georgia Research Foundation, Inc., The Rubredoxin fusion proteins, protein expression system and methods
US6670195B1 (en) 1999-05-26 2003-12-30 New York University Mutant genes in Familial British Dementia and Familial Danish Dementia
UA81216C2 (en) 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
PE20010212A1 (es) 1999-06-01 2001-02-22 Neuralab Ltd Composiciones del peptido a-beta y procesos para producir las mismas
ATE445639T1 (de) 1999-08-04 2009-10-15 Univ Southern California Globularer aufbau vom amyloid-beta- protein und deren verwendungen
AU784312B2 (en) 1999-11-29 2006-03-09 Bellus Health (International) Limited Vaccine for the prevention and treatment of alzheimer's and amyloid related diseases
DE60108111T2 (de) 2000-05-22 2005-12-08 New York University Synthetische immunogene jedoch nicht amyloidogene peptide, die homolog zu amyloid beta sind und deren verwendung zur induktion einer immunantwort gegen amyloid beta und amyloidaggregate
EP2082749A3 (en) 2000-07-07 2010-06-30 Bioarctic Neuroscience AB Prevention and treatment of Alzheimer's disease
US20030187011A1 (en) * 2001-12-20 2003-10-02 Lashuel Hilal A. Apomorphine inhibitors of amyloid-beta (Abeta) fibril formation and their use in amyloidosis based disease
KR20040082421A (ko) * 2002-02-11 2004-09-24 제넨테크, 인크. 빠른 항원 결합 속도를 갖는 항체 변이체
EP1497321B1 (en) * 2002-04-19 2011-06-29 The Governing Council Of The University Of Toronto Immunological methods and compositions for the treatment of alzheimer's disease
JP2003334075A (ja) * 2002-05-21 2003-11-25 Japan Tobacco Inc 簡便な変異抗体の製造方法
US20040049134A1 (en) * 2002-07-02 2004-03-11 Tosaya Carol A. System and methods for treatment of alzheimer's and other deposition-related disorders of the brain
WO2004024090A2 (en) * 2002-09-12 2004-03-25 The Regents Of The University Of California Immunogens and corresponding antibodies specific for high molecular weight aggregation intermediates common to amyloids formed from proteins of differing sequence
EP1545582A4 (en) 2002-10-01 2008-09-17 Univ Northwestern DIFFUSIBLE DERIVATIVES DERIVED FROM AMYLOID BETA (ADDL), ADDL SUBSTITUTE, ADDL BINDING MOLECULES, AND USES THEREOF
AU2003285151A1 (en) * 2002-11-04 2004-06-07 Bioarctic Neuroscience Ab Methods for the identification of agents that modulate the structure and processing of beta-amyloid precursor protein
DE10303974A1 (de) * 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
WO2005011599A2 (en) * 2003-08-01 2005-02-10 Northwestern University Antibodies specific for toxic amyloid beta protein oligomers
EP1668369B1 (en) 2003-08-20 2016-01-06 ProMIS Neurosciences Inc. Epitope protection assay and method for detecting protein conformations
JP2007527865A (ja) 2003-09-12 2007-10-04 ザ・レジェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア 種々の配列を有するタンパク質から形成されたアミロイドに共通の高分子量凝集中間体に特異的なモノクローナル抗体
SE0400707D0 (sv) 2004-03-22 2004-03-22 Bioarctic Neuroscience Ab Transgenic animal model
SE0401601D0 (sv) * 2004-06-21 2004-06-21 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril specific antibodies and uses thereof
AU2005269940A1 (en) 2004-07-02 2006-02-09 Northwestern University Monolocal antibodies that target pathological assemblies of amyloid beta (Abeta)
US20060079447A1 (en) * 2004-10-08 2006-04-13 Wetzel Ronald B Stabilized A-beta protofibrillar aggregates
US20080044356A1 (en) 2004-10-22 2008-02-21 Regents Of The University Of Minnesota Assemblies of Oligomeric Amyloid Beta Protein and Uses Thereof
AU2005306997B2 (en) 2004-10-25 2012-07-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-ADDL antibodies and uses thereof
WO2006066233A1 (en) * 2004-12-15 2006-06-22 Neuralab Limited An immunoprecipitation-based assay for predicting in vivo efficacy of beta-amyloid antibodies
EP1853299A4 (en) 2005-01-14 2009-11-11 Univ California COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING THE PRESENCE OF DRUGS AND DIAGNOSING OR TREATING DRUG-INDUCED DISEASES
GT200600031A (es) * 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
US7731962B2 (en) * 2005-02-14 2010-06-08 Merck & Co., Inc. Anti-ADDL monoclonal antibody and use thereof
US7700099B2 (en) * 2005-02-14 2010-04-20 Merck & Co., Inc. Non-immunostimulatory antibody and compositions containing the same
AU2006222193B2 (en) 2005-03-05 2011-11-17 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Screening method, process for purifying of non-diffusible A-beta oligomers, selective antibodies against said non-diffusible A-beta oligomers and a process for manufacturing of said antibodies
EP1921137A4 (en) 2005-06-21 2011-01-26 Med & Biological Lab Co Ltd ANTIBODIES WITH INHIBITOR EFFECT ON THE FORMATION OF AMYLOID FIBRILLES
TW200726774A (en) 2005-06-30 2007-07-16 Merck & Co Inc Composition and method for producing stable amyloid beta oligomers
TW200726482A (en) 2005-06-30 2007-07-16 Merck & Co Inc Method for preparing a covalently cross linked oligomer of amyloid beta peptides
EP1940466B1 (en) 2005-10-21 2012-11-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-addl monoclonal antibodies and use thereof
CA2630964A1 (en) 2005-11-22 2007-05-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Antibody treatment of alzheimer's and related diseases
RU2429244C2 (ru) 2006-03-23 2011-09-20 Байоарктик Ньюросайенс Аб Улучшенные селективные в отношении протофибрилл антитела и их применение
MY158903A (en) 2007-11-16 2016-11-30 Univ Rockefeller Antibodies specific for the protofibril form of beta-amyloid protein
DK2448968T3 (da) 2009-06-29 2021-04-12 Bioarctic Ab ANTISTOFFER SOM ER SELEKTIVE FOR N-TERMINAL-TRUNKEREDE AMYLOID-ß PROTOFIBRILLER/OLIGOMERER

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20110203T4 (hr) 2014-05-09
BRPI0709050A2 (pt) 2011-06-21
MY169492A (en) 2019-04-15
HK1120056A1 (en) 2009-03-20
CN101421303B (zh) 2013-06-12
NO347079B1 (no) 2023-05-08
DE602007011415D1 (de) 2011-02-03
CN101421303A (zh) 2009-04-29
RS51723B (en) 2011-10-31
KR20080106288A (ko) 2008-12-04
NZ567888A (en) 2010-08-27
KR101413615B1 (ko) 2014-07-18
US8025878B2 (en) 2011-09-27
EP2004688B2 (en) 2014-03-05
MX2008012223A (es) 2008-12-17
RU2008141905A (ru) 2010-04-27
JP2009530374A (ja) 2009-08-27
EP2004688B8 (en) 2011-03-02
AU2007227813A1 (en) 2007-09-27
ZA200805805B (en) 2010-09-29
IL191331A (en) 2015-07-30
PL2004688T3 (pl) 2011-06-30
SI2004688T1 (sl) 2011-03-31
RS51723B2 (sr) 2018-03-30
CA2630344A1 (en) 2007-09-27
DK2004688T3 (da) 2011-03-21
HRP20110203T1 (en) 2011-04-30
SI2004688T2 (sl) 2014-05-30
WO2007108756A1 (en) 2007-09-27
ATE492561T1 (de) 2011-01-15
RU2429244C2 (ru) 2011-09-20
EP2325209A2 (en) 2011-05-25
US20120076726A1 (en) 2012-03-29
US20090258009A1 (en) 2009-10-15
JP5033868B2 (ja) 2012-09-26
CA2630344C (en) 2015-04-28
EP2004688B1 (en) 2010-12-22
US9034334B2 (en) 2015-05-19
EP2325209A3 (en) 2011-08-03
PL2004688T5 (pl) 2014-09-30
DK2004688T4 (da) 2014-05-12
NO20084445L (no) 2008-10-22
AU2007227813B2 (en) 2012-09-27
CY1111337T1 (el) 2015-08-05
EP2004688A1 (en) 2008-12-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BRPI0709050B1 (pt) anticorpo ou fragmento do mesmo, composição, métodos para detectar protofibrilas ab in vitro, e, uso do anticorpo
JP6261621B2 (ja) アルファ−シヌクレイン抗体及びその使用
JP4738696B2 (ja) Ａβペプチドを隔離するヒト化抗体
TW201900682A (zh) 抗ｐｈｆ－ｔａｕ抗體及其用途
BRPI1012853B1 (pt) Anticorpo humanizado específico para a forma protofibrilar do peptídeo beta-amiloide e seu processo de produção, composição farmacêutica, polinucleotídeo e vetor recombinante
BRPI0719763A2 (pt) Anticorpo, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, célula, composição, mistura, uso de um anticorpo quimérico ou um fragmento do mesmo ou um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo e/ou uma parte funcional e/ou uma composição farmacêutica ou uma mistura, métodos para a preparação de uma composição farmacêutica ou de uma mistura, para prevenir, tratar ou aliviar os efeitos de uma doença, de diagnóstico de uma doença ou condição associada com amilóide em um paciente e de determinação do grau da carga de placa amiloidogênica em um tecido e/ou fluidos corporais, kits de teste para a detecção e diagnóstico de doenças e condições associadas com amilóide, região variável de cadeia leve, região variável de cadeia pesada, linhagem de célula, gene de anticorpo, e, métodos para desagregar fibras de beta-amilóide pré formadas, para prevenir a degradação de neurônio induzida por abeta, para diagnosticar uma predisposição a uma doença ou condição associada com amilóide em um paciente, para monitorar doença residual mínima em um paciente, para prognosticar a responsividade de um paciente que é tratado com um anticorpo ou uma composição de vacina, para reduzir a carga de placa no cérebro de um animal, para reduzir a quantidade de placas no cérebro de um animal, para diminuir a quantidade total de abeta solúvel no cérebro de um animal e para reter ou aumentar a capacidade de memória cognitiva em um mamífero.
BRPI0619357B1 (pt) Anticorpos monoclonais, composição farmacêutica, vacina, uso dos mesmos para tratamento ou prevenção de doença de alzheimer, métodos in vitro para diagnosticar e para identificar compostos apropriados para imunização de doença de alzheimer e kits
CN102869680A (zh) 原细纤维结合抗体及其在帕金森氏症、路易体痴呆和其他α-共核蛋白病的治疗和诊断方法中的应用
JP2023521763A (ja) 抗ｐｈｆ－タウ抗体及びその使用
CN111263820A (zh) 抗序列相似家族19成员a5抗体用于治疗和诊断情绪障碍的用途
JP2024512589A (ja) 抗タウ抗体及びその使用
TWI608014B (zh) 抗β-類澱粉抗體或其抗原結合片段、其用途及使用方法
US20240059766A1 (en) Tau binding compounds
ES2356159T5 (es) Anticuerpos selectivos de protofibrillas mejorados y su uso
Class et al. Patent application title: PROTOFIBRIL SELECTIVE ANTIBODIES AND THE USE THEREOF Inventors: Par Gellerfors (Lidingo, SE) Lars Lannfelt (Stockholm, SE) Dag Sehlin (Uppsala, SE) Frida Ekholm Pettersson (Uppsala, SE) Hillevi Englund (Uppsala, SE) Assignees: BIOARCTIC NEUROSCIENCE AB

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B25G Requested change of headquarter approved

Owner name: BIOARCTIC NEUROSCIENCE AB (SE)

B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]

Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI

B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 23/03/2007, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.

B21F Lapse acc. art. 78, item iv - on non-payment of the annual fees in time

Free format text: REFERENTE A 14A ANUIDADE.

B24D Patent annual fee: restoration after fee payment
B22O Other matters related to patents and certificates of addition of invention: legal action concerning patent

Free format text: INPI NO 52402.007865/2024-53 ORIGEM: 7A VARA FEDERAL CIVEL DA SJDF (TRF1) PROCESSO NO: 1119731-84.2023.4.01.3400 ACAO PELO PROCEDIMENTO COMUM AUTOR: BIOARCTIC AB. REU(S): AGENCIA NACIONAL DE VIGILANCIA SANITARIA E INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL