ES2356159T5 - Anticuerpos selectivos de protofibrillas mejorados y su uso - Google Patents

Description

Anticuerpos selectivos de protofibrillas mejorados y su uso

Campo de la invención

Esta invención se refiere a la prevención, tratamiento y diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas, en particular enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades similares. Más exactamente, a anticuerpos de elevada afinidad 10-7 M, preferiblemente 10-8 M, incluso menos de 10-9 M o menos de 10-10 M o 10-11 M, selectivos para la proteína beta amiloide (A1) en su conformación protofibrilar y de clase IgG y subclases IgG1 o IgG4 o sus combinaciones o sus mutaciones, que conservan elevada unión al receptor de Fc y baja unión a C1 (C1q), eficaces en la eliminación de protofibrillas A1 y con riesgo de inflamación reducido.

Antecedentes

La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad neurodegenerativa progresiva e irreversible que causa trastornos cognitivos, de memoria y de comportamiento. Es la causa más común de demencia en la población de la tercera edad que afecta aproximadamente al 5% de la población mayor de 65 años y al 20% mayor de 80 años. La AD se caracteriza por la aparición gradual y deterioro progresivo en múltiples funciones cognitivas. La neuropatología implica depósitos proteináceos argirófilos extracelulares e intracelulares. Los depósitos extracelulares, denominados placas neuríticas, consisten principalmente en proteína beta amiloide (A1) rodeada de neuritas distróficas (procesos neuronales inflamatorios, deformados). En el interior de estos depósitos extracelulares la A1 tiene un carácter fibrilar con una estructura de lámina 1 plegada. En estos depósitos la A1 puede teñirse con diferentes colorantes, por ejemplo, rojo Congo, y muestra una ultra estructura fibrilar. Estas características, adoptadas por la A1 en su estructura fibrilar en placas neuríticas, son la definición del término genérico amiloide. La clásica lesión patológica intracelular de la AD es el ovillo neurofibrilar (NFT) que consiste en estructuras filamentosas denominadas filamentos helicoidales pareados (PHF), compuestos por cadenas retorcidas de proteína tau hiperfosforilada asociada a microtúbulos. Las placas neuríticas y los depósitos en ovillo neurofibrilares frecuentes en el cerebro son criterios de diagnóstico para la AD, según autopsias realizadas. Cerebros con AD también presentan atrofia cerebral macroscópica, pérdida de neuronas, inflamación local (microgliosis y astrocitosis) y a menudo angiopatia amiloide cerebral (CAA) en las paredes de los vasos cerebrales.

En la AD, las placas neuríticas presentan dos formas de péptidos A1, como especies dominantes, A140 y A142, siendo la A140 la especie destacada en el amiloide cerebrovascular asociada con la AD. Las actividades enzimáticas permiten que la A1 se forme de manera continua a partir de una proteína más grande denominada proteína precursora amiloide (APP) tanto en individuos sanos como en individuos que padecen la AD en todas las células del cuerpo. Dos eventos principales de procesamiento de la APP mediante actividades 1 y y-secretasa permiten la producción de A1, mientras que una tercera enzima denominada a-secretasa, impide la generación de A1 por escisión dentro de la secuencia A1 (Selkoe, 1994; Ester 2001; US5604102). La A142 es un péptido de cuarenta y dos aminoácidos de longitud, es decir, una longitud de dos aminoácidos más en el extremo C- terminal, en comparación con la A140. La A142 es más hidrófoba y se agrega más fácilmente dentro de estructuras más largas de péptidos de A1 (Jarret 1993) tales como dímeros A1, trímeros A1, tetrámeros A1, oligómeros A1, protofibrillas A1 o fibrillas A1. Las fibrillas A1 son hidrófobas e insolubles, mientras que las otras estructuras son menos hidrófobas y solubles. Todas estas estructuras moleculares más grandes de péptidos A1 se definen individualmente basándose en su aspecto biofísico y estructural, por ejemplo, a microscopia electrónica y sus características bioquímicas, por ejemplo, por análisis con cromatografía de exclusión por tamaño/transferencia de Western. Estos péptidos A1, particularmente A142, se ensamblarán gradualmente dentro de una diversidad de estructuras moleculares más grandes de A1 durante el periodo de vida. La AD, que es un trastorno fuertemente dependiente de la edad, se producirá en etapas tempranas de la vida si este proceso de ensamblaje se produce másrápidamente. Éste es el fundamento de la "hipótesis de la cascada amiloide" de la AD que reivindica que el procesamiento de la APP, los niveles de A142 y su ensamblaje en estructuras moleculares mas grandes son una causa central de la AD. El resto de neuropatologías de cerebros con AD y los síntomas de la AD, tales como demencia, están de alguna manera producidos por la A1 o sus formas ensambladas.

La A1 puede tener diferentes longitudes, es decir, 1-39, 1-40, 1-42 y 1-43 y tamaños de fragmentos, es decir, 1-28 y 25-35. Los truncamientos pueden producirse en el extremo N del péptido. Todos estos péptidos pueden agregarse y formar intermedios solubles y fibrillas insolubles, teniendo cada forma molecular una conformación estructural y propiedades biofísicas únicas. Por ejemplo, la A11-42 monomérica, es un péptido de 42 aminoácidos de longitud soluble y no tóxico, que se supone que está implicado en las funciones normales de sinapsis. En determinadas condiciones, la A11-42 puede agregarse en dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros hasta 12 oligómeros y formas oligoméricas más grandes, todas con sus propiedades fisicoquímicas diferentes tales como tamaño molecular, estructura EM y forma molecular AFM (microscopio de fuerzas atómicas). Un ejemplo de una forma A1 oligomérica soluble de mayor peso molecular es la protofibrilla (Walsh 1997), que tiene un peso molecular aparente > 100 kDa y una estructura curvilínea de 4-11 nm de diámetro y < 200 nm de longitud. Recientemente se ha

demostrado que los péptidos A1 oligoméricos solubles tales como protofibrillas A1 perjudican la potenciación a largo plazo (LTP) una medida de la plasticidad sináptica que se cree que refleja la formación de memoria en el hipocampo (Walsh 2002). Por otro lado, los péptidos A1 Árticos oligoméricos presentan efecto inhibidor mucho más profundo que los A1ts (de tipo silvestre) en la LTP en el cerebro, probablemente debido a su fuerte tendencia para formar protofibrillas A1 (Klyubin 2003).

Además existen otras formas oligoméricas solubles descritas en la bibliografía que son claramente diferentes de las protofibrillas. Una de dichas formas oligoméricas es el ADDL (Ligando Difusible Derivado de Amiloides) (Lambert 1998). Análisis AFM del ADDL revelaron especies globulares predominantemente pequeñas de 4,7-6,2 nm a lo largo del eje z con pesos moleculares de 17-42 kDa (Stine 1996). Otra forma se denomina ASPD (esferas amiloides) (Hoshi 2003). Las ASPD son oligómeros esféricos de A11-40.

Estudios de toxicidad demostraron que las ASPD esféricas > 10 nm eran más tóxicas que las formas molecularesmás pequeñas (Hoshi 2003). Esta idea ganó apoyo a partir del reciente descubrimiento de la mutación Ártica de la APP (E693), que produce aparición temprana de la AD (documento US 2002/0162129 A1; Nilsberth et al., 2001). La mutación se localiza dentro de la secuencia peptídica de la A1. Los transportadores de la mutación generarán por lo tanto variantes de péptidos de A1, por ejemplo A140 Ártica y A142 Ártica. Tanto la A140 Ártica como la A142 Ártica se ensamblarán mucho más fácilmente dentro de estructuras moleculares más grandes, es decir, protofibrillas. Portanto, el mecanismo patógeno de la mutación Ártica sugiere que las protofibrillas solubles de moléculas más grandes son causantes de la AD y contienen un epítopo específico único, es decir, "el epítopo de la enfermedad de AD".

En el cerebro que presenta la enfermedad de Alzheimer (AD), las placas amiloides extracelulares se encuentran típicamente en el parénquima y en las paredes de los vasos. Las placas están compuestas de amiloide (péptidos auto-agregantes e hidrófobos de A1 de 38-43 aminoácidos de longitud) que se polimerizan gradualmente antes de la deposición de la placa. Se ha propuesto que especies oligoméricas de A1 solubles se correlacionan mejor con la enfermedad que las propias placas amiloides (McLean et al., 1999; Näslund et al., 2000). Entre estas especies A1 intermedias pre-fibrilares, se han observado formas oligoméricas que provocan efectos biológicos adversos tanto in vitro como in vivo (Walsh et al., 2002) y pueden, por tanto, desempeñar un papel fundamental en la patogénesis de la enfermedad. Se conocen diversas especies A1 oligoméricas de diversos tamaños moleculares. De manera significativa, la conformación de formas monoméricas, oligoméricas y fibrilares de la A1 es diferente y puede dirigirse por anticuerpos selectivos conformacionales. La identidad del principal patógeno de la A1 es incierta, aunque algunas pruebas sugieren oligómeros A1 de elevado peso molecular que son especialmente neurotóxicos (Hoshi et al., 2003).

Se han descrito mutaciones patógenas en el gen de la proteína precursora amiloide (APP), que causa la aparición temprana de la AD. Una de éstas, la mutación Sueca de la APP (Mullan et al., 1992), produce niveles aumentados de A1. Se observó que la otra mutación Ártica de la APP (E693G) localizada dentro del dominio A1, potenciaba la formación de protofibrillas, oligómeros A1 largos, sugiriendo que estos intermedios de A1 son particularmentepatógenos (documento US 2002/0162129 A1; Nilsberth et al., 2001). La identificación de la mutación Ártica de APP y el esclarecimiento de efectos tóxicos para protofibrillas A1 han aumentado el interés sobre los oligómeros A1 en la patogénesis de la AD.

La inmunización activa como una estrategia terapéutica para la enfermedad de Alzheimer la describen por primera vez (Schenk et al., 1999). La diana de la estrategia de inmunización fue la forma fibrilar de A1 encontrada en placas de Alzheimer. Un reciente experimento clínico en fase I/II de vacunación activa con A1 usando A1 fibrilar como una vacuna (AN-1792) tuvo que interrumpirse debido al desarrollo de meningoencefalitis en un pequeño número de pacientes (Bayer et al., 2005). Los efectos secundarios observados en este estudio se produjeron probablemente por anticuerpos anti-A1 que reaccionaban contra el amiloide fibrilar en las paredes de los vasos. El amiloide fibrilar en la CAA (angiopatía amiloide cerebral ) está muy cerca de la barrera hematoencefálica (BHE) y la reacción antígenoanticuerpo puede por tanto generar lesiones en la BHE conduciendo a infiltración de linfocitos T dentro del SNC (Pfeifer et al., 2002; Racke et al., 2005). Por otra parte, sólo una minoría de los pacientes participantes mostró una respuesta inmunitaria a la vacuna contra A1. Aunque el estudio terminó antes de tiempo, parece dar a entender que la inmunización activa contra A1 puede ser beneficiosa solamente en un subconjunto de pacientes con AD.

Se han descrito anticuerpos monoclonales selectivos de protofibrillas A1 humanas (documento US 2002/0162129 A1). El método para generar protofibrillas A1 humanas muy puras y estables, implica el uso de péptidos A142 sintéticos con la mutación Ártica (Glu22Gly). La mutación facilita inmunización y exploración de hibridomas para anticuerpos selectivos de protofibrillas A1. Es importante destacar que estos anticuerpos se unen tanto a protofibrillas A1 de tipo silvestre como a protofibrillas A1-Arc (documento WO 2005/123775).

Se han descrito anticuerpos que son selectivos contra otras conformaciones de A1 tales como fibrillas A1 (O´Nua/lain 2002), A1 micelar (Kayed 2003), ADDL (Lambert 2001). Sin embargo, ninguno de estos es selectivo de protofibrillas A1.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos mejorados, es decir, anticuerpos selectivos de protofibrillas A1 de elevada afinidad (menos de 10-7 M) de clase IgG y subclase IgG1 o IgG4 o sus combinaciones o sus mutaciones, con riesgo de inflamación reducido, para la prevención, tratamiento y diagnóstico mejorado de la enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down u otros trastornos neurodegenerativos. Dichos anticuerpos se han desarrollado por técnicas de híbridoma clásicas y modificación de anticuerpos por ingeniería genética.

La invención describe la secuencia consenso de aminoácidos de las regiones CDR1-3 de las cadenas VL y VH de anticuerpos que se unen selectivamente a formas A1 oligoméricas, es decir protofibrillas A1 que constituyen el "epítopo de la enfermedad de Alzheimer", en combinación con modificaciones de la región Fc para reducir la unión al factor de complemento C1q, reduciendo el riesgo de activación e inflamación del complemento.

La región constante de un anticuerpo tiene muchas funciones importantes en particular la unión a receptores Fc y al factor del complemento C1q. La última función se ha inactivado para evitar reacciones inflamatorias.

En resumen, este tipo de anticuerpos selectivos de protofibrillas de elevada afinidad tienen las siguientes ventajas distintivas en comparación con otras modalidades de tratamiento inmunoterapéuticas conocidas:

1) dirigen la enfermedad produciendo protofibrillas A1 con elevada afinidad 2) reducen el riesgo de efectos secundarios inflamatorios es decir meningoencefalitis, sin unirse o uniéndose muy poco al factor del complemento C1q 3) la elevada afinidad del anticuerpo reduce la dosis clínica necesaria para un tratamiento eficaz 4) proporciona una modalidad de dosificación exacta 5) se une menos a fibrillas A1 en la pared de los vasos sanguíneos es decir CAA, reduciendo el riesgo de efectos secundarios inflamatorios. 6) en la periferia se unen menos anticuerpos, por lo tanto atravesarán más la barrera hematoencefálica y estarán disponibles para la unión y eliminación de formas oligoméricas A1 en el cerebro.

Un aspecto de la invención es el descubrimiento de la secuencia consenso de aminoácidos del anticuerpo de las regiones CDR que se unen a protofibrillas A1 humanas de tipo silvestre (Ejemplo 1). Éste descubrimiento define los sitios de unión (regiones CDR) que confieren elevada afinidad y elevada selectividad para protofibrillas A1 humanas de tipo silvestre para su uso como agentes terapéuticos o de diagnóstico.

La estructura básica de una molécula de inmunoglobulina (IgG) comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas unidas entre sí por puentes de disulfuro (Figura 1). La cadena ligera, que es lambda o kappa, tiene una región variable (VL) y una región constante (CL) de aproximadamente 110 restos aminoacídicos cada una. La cadena pesada tiene una región variable (VH) de aproximadamente 110 restos aminoacídicos, pero una región constante (CH) mucho más larga de 300-400 restos aminoacídicos, que comprende las regiones o dominios CHy1, CHy2 y CHy3.

La región constante (Fc) activa el sistema del complemento y se une a un receptor de Fc en macrófagos, microglia y neutrófilos, que ingieren y destruyen microorganismos infecciosos o antígenos extraños/no propios. Esta función es particularmente importante ya que es parte del principio terapéutico del anticuerpo, es decir fagocitosis microglial y eliminación de protofibrillas A1 mediada por el receptor de Fc. Otros mecanismos de eliminación mediados por anticuerpos también funcionan, es decir, propiedades anti-agregado de anticuerpos contra A1 y eliminación de protofibrillas A1 en la periferia, de acuerdo con la hipótesis de drenaje.

La región variable de las cadenas pesada y ligera contiene 3 regiones hiper-variables denominadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las regiones CDR son cortos tramos de aproximadamente 13-23 aminoácidos de longitud, localizadas en las regiones VL y VH. Las seis regiones CDR en un "brazo" del anticuerpo forman la "cavidad" que se une al antígeno. La figura 1 muestra la estructura básica de una inmunoglobulina IgG y sus subdominios.

Otro aspecto la invención se refiere a anticuerpos selectivos de protofibrillas de elevada afinidad. Se describen afinidades en el intervalo de 10-7 M preferiblemente 10-8 M, incluso menores de 10-9 M, menores de 10-10 M, o menores de 10-11 M para protofibrillas (Ejemplo 2). Éstos anticuerpos tienen la ventaja de que pueden administrarse a dosis reducidas en comparación con anticuerpos con afinidades en el intervalo de 10-6 M. Esto tiene la ventaja clínica significativa de que estos anticuerpos de elevada afinidad, que se administran por inyección, pueden proporcionarse por vía subcutánea ya que solamente se necesita una pequeña cantidad del anticuerpo para conseguir la eficacia. Las modalidades de administración no se limitan a inyecciones subcutáneas. Por otro lado, las dosis reducidas necesarias para la eficacia reducirán costes de los productos para la producción del anticuerpo.

Otro aspecto de la invención es que los anticuerpos son de la clase IgG, adecuados para el uso terapéutico ya que

puede atravesar la barrera hematoencefálica. La eliminación de las protofibrillas A1 en el parénquima cerebral se consigue por fagocitosis por células microgliales mediada por el receptor de Fc. Probablemente también funcionan otros mecanismos de eliminación anti-A1. Esta eliminación de protofibrillas A1 solubles es un mecanismo central del tratamiento. Se considera que las protofibrillas A1 son muy neurotóxicas, iniciando y dirigiendo el proceso de la enfermedad. La eliminación de protofibrillas A1 en el cerebro tiene un valor clínico significativo. Además de la eliminación de protofibrillas A1, otras formas oligoméricas A1 incluyendo fibrillas A1, se reducirán indirectamente mediante la eliminación de protofibrillas A1 ya que diferentes formas agregadas A1, es decir dímeros, trímeros, tetrámeros y formas oligoméricas superiores, incluyendo protofibrillas y fibrillas, están en equilibrio. En un modelo de ratón transgénico con Alzheimer (APPsue) se muestra un ejemplo de reducción de placas, que contienen fibrillas A1, 72 horas después del tratamiento con un anticuerpo selectivo de protofibrillas de elevada afinidad (mAb 158) (Ejemplo 3). Por lo tanto, la eliminación de protofibrillas A1 por dicho anticuerpo también tendrá la ventaja de reducir indirectamente otras formas agregadas u oligoméricas de A1.

Otro aspecto más de la invención es un anticuerpo selectivo de protofibrillas A1 humanas de elevada afinidad de subclase IgG1, que tiene una elevada afinidad por receptores de FcyRI humanos presentes en las células microgliales en el cerebro. Un anticuerpo de elevada afinidad dará lugar a una eliminación eficaz de protofibrillas A1 que será de valor terapéutico significativo. Por lo tanto, los anticuerpos presentarán eliminación de protofibrillas A1, tanto en el SNC como en el periférico en comparación con otras estrategias inmunoterapéuticas tales como vacunación activa o tratamientos con anticuerpos monoclonales con otros anticuerpos monoclonales de subclase IgG1 que dirigen otras formas A1. Es importante destacar que, el tratamiento será eficaz al inicio del proceso de la enfermedad cuando especies A1 solubles tóxicas, tales como protofibrillas A1, están presentes a niveles elevados, aunque también más adelante en el proceso de la enfermedad. Se han descrito niveles elevados de formas A1 oligoméricas en un modelo de ratón transgénico que presenta la APPsueart, mutaciones Sueca y Ártica (Lord A. et al., 2006).

Otro aspecto más de la invención es que la elevada afinidad de anticuerpos selectivos de protofibrillas A1 puede reducir o inhibir la agregación A1 reduciendo por lo tanto niveles de formas A1 oligoméricas solubles en el cerebro.

Incluso, otro aspecto de la invención es que los anticuerpos selectivos de protofibrillas A1 de elevada afinidad pueden unirse a formas oligoméricas de A1, es decir, a protofibrillas A1 fuera del SNC también, modificando por tanto el equilibrio de dichas formas A1 a través de la barrera hematoencefálica de tal manera que se reducen los niveles de dichas formas A1 en el SNC (drenaje).

Como se ha comentado anteriormente, el estudio clínico Elan usando una vacuna contra A1 (AN-1792) selectiva para fibrillas A1 para tratar pacientes con Alzheimer da como resultado un efecto secundario, es decir meningoencefalitis, en el 6% de los casos. La estrategia para dirigir fibrillas A1, que son el núcleo de las placas amiloides presentes en el parénquima cerebral aunque importantes también en las paredes de los vasos sanguíneos, da como resultado graves efectos secundarios. Estos efectos secundarios se produjeron más probablemente por la unión de los anticuerpos a CAA (Angiopatía Amiloide Cerebral) en las paredes de los vasos sanguíneos del cerebro, iniciando un proceso inflamatorio. Los anticuerpos selectivos de protofibrillas de elevada afinidad mejorados impiden este problema clínico significativo disminuyendo la actividad de activación del complemento. Estos anticuerpos conservarán elevada eficacia de eliminación de protofibrillas A1 con riesgo reducido de efectos secundarios, es decir meningoencefalitis.

Otro aspecto de la inversión es que los anticuerpos selectivos de protofibrillas de elevada afinidad tienen una baja unión a fibrillas A1 (véase el ejemplo 2), reduciendo el riesgo de efectos secundarios, uniéndose menos a fibrillas A1 presentes en CAA.

Otro aspecto adicional de la invención es que los anticuerpos de IgG selectivos de protofibrillas A1 de elevada afinidad, se modifican por ingeniería genética para reducir la unión del factor del complemento C1q al dominio CH2 de la IgG1 y reducir la activación del complemento y el riesgo de inflamación. Esta modificación puede realizarse de diferentes maneras. Una manera es preparar un anticuerpo quimérico en el que se haya delecionado el dominio CHy2 de la región constante de IgG1 e intercambiado por el dominio de IgG4 correspondiente o parte del dominio que confiere la unión a C1q. Está bien establecido que la IgG4 no se une a C1q y por lo tanto no activa la cascada del complemento. Para conseguir esto la región constante de la cadena pesada (CH) se modifica por ingeniería genética de manera que se combina el dominio del receptor de Fc de elevada afinidad (CHy3) en la IgG1 con el dominio de IgG4 (CHy2) que no tiene unión para el factor del complemento C1q. Este nuevo anticuerpo que contiene la cadena pesada constante quimérica (IgG1:CHy1, CHy2:IgG4, CHy3:IgG1) tendrá las propiedades trascendentales tanto de eliminación eficaz de protofibrillas A1 mediante fagocitosis mediada por el receptor de Fc como de riesgos reducidos de efectos secundarios, es decir, inflamación tal como meningoencefalitis.

Otra manera más de reducir el riesgo de inflamación es modificar la estructura de los oligosacáridos del anticuerpo lo que reducirá la unión del factor del complemento C1q y la activación del complemento. En la IgG1 humana, se han descrito 30 estructuras diferentes de los oligosacáridos biantenarios complejos en Asn-297. Se cree que la ausencia

de hidratos de carbono asociados con CH2 produce un cambio conformacional en la región "bisagra" del anticuerpo, reduciendo eficacias de interacción con moléculas efectoras y pérdida de la función de la activación del complemento y la unión al C1q.

La modificación de un anticuerpo selectivo de protofibrillas A1 humanas de elevada afinidad por mutagénesis dirigida del Asn-297 a cualquier otro aminoácido generará un anticuerpo de unión al receptor de Fc conservada con menos unión a C1q y por lo tanto riesgo de inflamación reducido en particular en la barrera hematoencefálica. Una alternativa para modificar la glucosilación en el anticuerpo es expresar el anticuerpo en un tipo de célula en el que se haya inactivado la enzima N-acetilglucosaminil-transferasa l. Esto producirá un anticuerpo con estructura de hidratos de carbono modificada en Asn-297. Se forma una estructura Man5GlcNAc2, pero no limitado a esta estructura. Esta modificación de hidratos de carbono reducirá la unión al factor del complemento C1q e inhibirá la inflamación (Wright et al., 1998). Como alternativa, pueden obtenerse anticuerpos selectivos de protofibrillas glucosilados cultivando células que expresen anticuerpos en presencia de tunicamicina, que inhibe la glucosilación. Estos anticuerpos tendrán modificada la actividad de activación del complemento así como la función del receptor de Fc (Leatherbarrow et al., 1985). La selección de clones que expresen anticuerpos con baja activación del complemento y elevada unión al receptor de Fc, generarán anticuerpos selectivos de protofibrillas que presentaran elevada eliminación, mediada por Fc, de protofibrillas A1 y baja unión a C1q.

Otro aspecto adicional de la invención es un anticuerpo selectivo de protofibrillas A1 humanas de elevada afinidad, de subclase IgG1, en el que se ha modificado el sitio de unión al factor del complemento C1q, es decir Pro331>Ser331 (Xu et al., 1994), de tal manera que se reduce o se inhibe la unión del factor del complemento C1q, para el tratamiento o prevención de AD. El resto de prolina en la posición 331 en la IgG1 humana también puede cambiarse por una treonina o glicina o por cualquier otro aminoácido polar. Esta modificación puede conseguirse por técnicas de biología molecular convencionales tales como mutagénesis dirigida o delecciones de ADN.

Otro aspecto adicional de la invención es el uso de anticuerpos de IgG selectivos de protofibrillas A1 humanas de elevada afinidad para determinar específicamente niveles de protofibrillas en tejidos humanos, particularmente en el líquido cefalorraquídeo (LCR), sangre, orina o saliva como una herramienta de diagnóstico o biomarcador para la enfermedad de Alzheimer. Los niveles de protofibrillas A1 humanas en el LCR o en la sangre son probablemente diferentes en comparación con un grupo de control correspondiente de personas de edad avanzada que no presentan la enfermedad de Alzheimer. Es probable que una persona que está desarrollando la enfermedad de Alzheimer tenga niveles aumentados de protofibrillas A1 en el LCR o en la sangre. Por lo tanto, determinando los niveles de protofibrillas A1 en el LCR o en la sangre puede realizarse un diagnóstico precoz de la enfermedad. Esto puede lograrse con los nuevos anticuerpos selectivos de protofibrillas A1 de alta afinidad en combinación con un método ELISA de tipo sándwich (Ejemplo 2A), en el que las protofibrillas A1 se han determinado por debajo del nivel de 10 pM. La interferencia de otras formas A1 tales como fibrillas A1, monómeros A1 y fragmentos A1 (1-16; 17-40) en el ensayo, es del 10% o menor.

Adicionalmente la invención se refiere al uso de anticuerpos específicos de protofibrillas de elevada afinidad para determinaciones de protofibrillas A1 en tejidos de seres humanos y de animales, por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, sangre, suero, orina y tejido cerebral, pero sin limitarse a estos tejidos, proporcionando un método de diagnóstico posible para la enfermedad de Alzheimer. Los métodos adecuados para ensayar protofibrillas A1 en estos tejidos así como en cultivos celulares usando un anticuerpo anti- protofibrilla A1 son inmunoensayos tales como ELISA, RIA, transferencia de Western o transferencia puntual. El método sería adecuado para seguir la eficacia del tratamiento (reducción de protofibrillas) en estudios clínicos y adecuado como un ensayo de diagnóstico para la enfermedad de Alzheimer o el síndrome de Down.

Dado que los niveles de protofibrillas A1 son muy bajos en el LCR y en la sangre, para poder medir niveles bajos de protofibrillas A1, se necesita un anticuerpo selectivo de protofibrillas A1 de elevada afinidad en un ensayo de diagnóstico basado en un método ELISA. Para aumentar la sensibilidad, pueden usarse otros métodos extremadamente sensibles, tales como, ligamiento por proximidad (Ejemplo 4) (Gullberg 2004) o sistemas de amplificación similares o técnicas de Biacore o similar. La técnica de ligamiento por proximidad se basa en el descubrimiento de que diferentes anticuerpos, sensibilizados contra diferentes epítopos en un analito, (en este caso una proteína), pueden unirse cerca entre sí en dicho analito. Si dichos anticuerpos diferentes se conjugan con oligonucleótidos, la distancia entre dichos oligonucleótidos será suficientemente corta para un oligonucleótido conector, con la ayuda de componentes de ligamiento, para formar un puente entre los oligonucleótidos. También se añaden componentes de amplificación, después de lo cual puede realizarse RT-PCR. Mediante este principio, se genera una secuencia de ADN amplificable, que refleja la identidad y la cantidad de la proteína diana. Esta técnica hace posible obtener una respuesta de señal potenciada y por lo tanto detectar menores concentraciones de analito.

Sorprendentemente, los presentes inventores descubrieron que también podía usarse una técnica de ligamiento por proximidad modificada con sus anticuerpos específicos de protofibrillas A1, para detectar bajas concentraciones de estructuras peptídicas A1 más grandes, es decir protofibrillas A1 pero no monómeros de A1. Estos descubrieron que los péptidos A1, en la conformación protofibrilar, presentaban una estructura (unidades repetitivas) que hacía posible que dos anticuerpos, de acuerdo con la presente invención, se uniesen suficientemente cerca entre sí en la protofibrilla. Si dichos anticuerpos se conjugan con oligonucleótidos, dichos oligonucleótidos pueden formar puentes

de unión usando un oligonucleótido conector. La PCR se realizó usando componentes de amplificación. Mediante este principio, se genera una secuencia de ADN amplificable, que refleja la identidad y la cantidad de la protofibrilla diana (véase la Figura 4).

El ligamiento por proximidad o una versión de la técnica denominada “círculo rodante”, es una técnica muy sensible y particularmente muy adecuada para la detección de estructuras poliméricas con secuencias repetidas, tales como protofibrillas A1 para usar en el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos neurodegenerativos.

La invención también se refiere al uso de anticuerpos específicos de protofibrillas de elevada afinidad en la formación de imágenes para la detección, localización y cuantificación de protofibrillas A1 en tejidos de seres humanos y animales. El anticuerpo podría marcarse con un ligando radiactivo tal como I131, C14, H3 o Galio68, pero sin limitarse a estos radioisótopos, con fines de detección. El método sería adecuado como una herramienta de diagnóstico para la enfermedad de Alzheimer o el síndrome de Down.

Otro aspecto adicional de la invención consiste en prepara especies de anticuerpos específicas para su uso en medicina veterinaria. Los métodos de diagnóstico indicados también son adecuados para el uso veterinario.

Otro aspecto de la invención es la humanización de dichos anticuerpos para impedir efectos secundarios, es decir impedir una respuesta inmunológica contra dichos anticuerpos en seres humanos cuando se usan como un agente de diagnóstico o terapéutico.

Otro aspecto adicional es a una formulación del anticuerpo en un tampón fisiológico, por ejemplo en PBS, pero sin limitarse al PBS, adecuado para la administración a seres humanos y animales. El producto del anticuerpo puede liofilizarse para conseguir una mejor estabilidad. La formulación liofilizada puede contener un excipiente tal como manitol, pero sin limitarse al manitol, para estabilizar el producto después de la liofilización.

El producto del anticuerpo puede contener un agente antibacteriano.

Los anticuerpos o fragmentos de acuerdo con las invenciones pueden presentar deleciones, sustituciones e inserciones de aminoácidos dentro de dichas regiones CDR y/o sus armazones. Los aminoácidos insertados o sustituidos también pueden ser aminoácidos derivados, siempre que la afinidad y especificidad del anticuerpo permanezca intacta.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan con objeto de ilustrar sin pretender limitar la invención a estos ejemplos específicos.

Ejemplo 1.

Se clonaron y se secuenciaron anticuerpos monoclonales selectivos de protofibrillas A1 de tipo silvestre humanas. En la Tabla 1 se muestra la secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada variable (VH) y la región de cadena ligera variable (VL). En las Tablas 2 y 3 también se destacan y se muestran las posiciones de las regiones CDR 1-3. Las secuencias de aminoácidos de las regiones CDR forman la base estructural para la unión a protofibrillas A1 de tipo silvestre humanas constituyendo el “epítopo de la enfermedad de Alzheimer”.

En las Tablas 1, 2 y 3 se muestra la secuencia de aminoácidos de las regiones CDR 1-3 de las cadenas VL y VH para un anticuerpo específico de protofibrillas de elevada afinidad BA9/158.

Los datos de secuenciación de otros anticuerpos selectivos de protofibrillas (BA2, BA3, BA4 y BA7) proporcionan secuencias de aminoácidos alternativas de las regiones CDR pero sin limitarse a estas.

Las secuencias de aminoácidos combinadas de las regiones CDR 1-3 de las cadenas VH y VL crean la “cavidad” molecular que une protofibrillas de tipo silvestre A1 humanas con elevada especificidad y afinidad. Esta “cavidad” forma la base estructural del “epítopo de la enfermedad de Alzheimer”. Las variaciones observadas en la longitud de la secuencia de aminoácidos de las CDR, tanto en la cadena VH como en la VL, son compatibles con la unión a protofibrillas A1 humanas (Tablas 2 y 3). Una región CDR más corta proporciona una estructura tridimensional más restrictiva de la cavidad de unión del anticuerpo, mientras que una más larga es más flexible.

Los inventores reivindican las secuencias de las CDR como se muestra en las Tablas 1, 2 y 3 así como las secuencias de aminoácidos en las regiones “flanqueantes de ratón” de las cadenas VH y VL, es decir, fuera de las regiones CDR así como las regiones flanqueantes VH y VL humanas para anticuerpos específicos de protofibrillas como se muestra en las Tablas 4 y 5, pero sin limitarse a estas.

En las tablas 4 y 5 se muestra la secuencia de aminoácidos de la región flanqueante de las regiones 1-3 VL y VH de las cadenas VL y VH de un anticuerpo específico de protofibrillas de elevada afinidad BA9/158.

En las regiones CDR, otra sustitución de aminoácidos distinta a la mostrada en las Tablas 1, 2 y 3 son compatibles con afinidad y especificidad elevadas, a unirse a protofibrillas A1 de tipo silvestre humanas. Cuando un aminoácido polar está presente en una posición particular en una región CDR este aminoácido particular puede sustituirse por otro aminoácido polar, conservando y mejorando la elevada afinidad y especificidad de unión a protofibrillas A1. Del mismo modo, si un aminoácido no polar o cargado negativa o positivamente está presente en una determinada posición, este aminoácido puede sustituirse por un aminoácido similar del mismo grupo.

Además, un aminoácido o aminoácidos particulares se intercambian en cualquier posición en las regiones CDR por equivalentes funcionales que confieren al anticuerpo una función y estructura similares.

Ejemplo 2. Caracterización por ELISA de un anticuerpo monoclonal selectivo de protofibrillas de tipo silvestre A1 humanas de elevada afinidad.

El Ejemplo 2 muestra un anticuerpo selectivo de protofibrillas de elevada afinidad que reacciona de manera cruzada 200-1000 veces menos con monómeros A1 y menos de 40 veces con fibrillas A1, según mediciones realizadas mediante un ELISA de tipo sándwich (Figura 2A). A partir de experimentos ELISA competitivos, el anticuerpo tiene una fuerte afinidad por las protofibrillas de tipo silvestre A142 humanas, pero sólo una afinidad muy débil por la parte N-terminal del péptido A1 y monómeros A1. No se observó unión con el fragmento C-terminal de A1 (Figura 2B). Además, el anticuerpo no reacciona de manera cruzada con otros tipos de amiloides, como medina o transtirretina. Además el anticuerpo no reconoce la APP humana, el cuantioso precursor de A1.

En la Figura 2A, se muestra un ELISA de tipo sándwich. El anticuerpo 158 se recubrió en los pocillos y después se añadieron, a los pocillos, diferentes formas de A1 aumentando las concentraciones. La medición de formas A1 unidas se realizó añadiendo mAb 158 biotinilado y estreptavidina marcada con HRP. El desarrollo del color se midió de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante.

En la figura 2B se muestra un ELISA competitivo. Se recubrió una placa ELISA con protofibrillas A1 humanas. Posteriormente el anticuerpo 158 se incubó con cantidades en aumento de diferentes formas de A1 (competición). La mezcla de incubación se añadió a los pocillos de la placa de microtitulación y se dejó que el anticuerpo libre se uniese a las protofibrillas inmovilizadas en los pocillos.

Usando procedimientos convencionales, con un segundo anticuerpo se midió el anticuerpo 158 unido.

Ejemplo 3

En un modelo de ratón transgénico (APPsue) con Alzheimer, se determinó la eficacia del anticuerpo selectivo de protofibrillas A1 de alta afinidad por inyección intracraneal aguda. Los ratones transgénicos usados para la evaluación de eficacia expresaban la APP humana, con la mutación sueca (APPsue). En este paradigma, los anticuerpos se inyectaron directamente en regiones del parénquima cerebral ricas en placas y 72 horas después, se evaluaron los efectos sobre la neuropatología (Wilcock et al., 2003). Otros estudios habían demostrado que la aplicación directa de anticuerpos anti-A1 produjeron una rápida eliminación de depósitos amiloides in vivo (Bacskai et al., 2001; Brendza et al., 2005). La inyección del anticuerpo selectivo de protofibrillas A1 de elevada afinidad conduce a una reducción significativa de placas en el modelo de ratón APPsue (Figura 3).

En la Figura 3 se ensayó la eficacia terapéutica de un anticuerpo selectivo de protofibrillas de elevada afinidad en un modelo de ratón transgénico (APPsue). A un ratón transgénico APPsue de 14 meses, se le inyectó por vía intracraneal, A: PBS y B: anticuerpo selectivo de protofibrillas de elevada afinidad (158) a 1 μg/μl y se examinó 72 horas después de la inyección. En el subículo, cerca del sitio de la inyección (B; flecha), se aprecia una notable eliminación de carga de A1 en comparación con control de al lado (A; flecha).

Ejemplo 4

Ligamiento por proximidad en combinación con el anticuerpo selectivo de protofibrillas de elevada afinidad para medir protofibrillas A1.

Se detectaron protofibrillas A1 de tipo silvestre humanas por debajo del intervalo de 10 pM mientras que en la preparación del monómero A1 no se detectó del todo. La combinación del método de ligamiento por proximidad hipersensible y de un anticuerpo de elevada afinidad es particularmente ventajosa ya que proporciona un sistema para determinar solamente formas oligoméricas del analito, lo cual es particularmente adecuado cuando se diagnostica la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades de "agregamiento” de proteínas tales como enfermedades por priones, enfermedad de Creutzfelt-Jacob, amiloidosis y Parkinson.

En la Figura 4 las protofibrillas A1 humanas se miden a niveles pM con la técnica de ligamiento por proximidad. Ensayo de ligamiento por proximidad: descripción del método (de Gullberg et al., 2004): Etapa 1, incubación de la muestra con un par de sondas de proximidad (:1 h); etapa 2, adición de todos los componentes necesarios para el ligamiento y detección por PCR cuantitativa (tiempo de ligamiento :5 min). En el ensayo, se usó un anticuerpo

monoclonal selectivo de protofibrillas de elevada afinidad; etapa 3, PCR cuantitativa (:2 h). Se diluyeron preparaciones sintéticas de monómero A1 y protofibrilla A1 y se ensayaron para determinar su reactividad en el ensayo de ligamiento por proximidad descrito anteriormente.

Ejemplo 5

El mAb158 no reconoce un epítopo amiloide genérico.

La conformación de A1 descrita anteriormente, dependiente de anticuerpos, había demostrado que se une a oligómeros y fibrillas de otras proteínas amiloidogénicas, lo que sugiere que en todos los agregados amiloides, está presente un epítopo común. Debido a dificultades técnicas en cuanto a la generación de protofibrillas de otras proteínas amiloidogénicas distintas a A1, se ensayó el mAb158 en su lugar contra diferentes fibrillas amiloides. En estos experimentos se usó el ensayo de transferencia puntual ya que el ELISA de inhibición, en el que las reacciones anticuerpo-antígeno se realizan en solución, no es adecuado para antígenos insolubles de tipo fibrillas. Sin embargo, el ensayo de transferencia puntual no es adecuado para evaluar la especificidad de anticuerpos para determinadas formas A1, es decir para medir diferencias en cuanto a selectividad para protofibrillas y fibrillas. Sobre una membrana de nitrocelulosa, se inmovilizaron fibrillas de medina, polipéptido amiloide de los islotes (IAPP) y asinucleína, para conservar sus conformaciones originales. El mAb158 no presentó reactividad con ningún amiloide distinto a la fibrilla A1 (Figura 5A). La unión de mAb158 a fibrillas A1 sugiere que en la estructura de fibrilla A1 también está presente parte del epítopo de protofibrilla A1. Como controles positivos se usaron los anticuerpos 6E10 (A1), pAb179 (medina), pAbA110 (IAPP) y mAb211 (a-sinucleína) (Figura 5B). Transferencias representativas de experimentos repetidos (n=3).

El mAb158 no se une a la APP

En muestras biológicas tales como LCR y homogeneizado de cerebro los niveles de APP y fragmentos de APP solubles comúnmente superan los niveles de A1 y por lo tanto una reacción de manera cruzada de anticuerpos-A1 con APP podría inhibir un tratamiento mediante la unión a APP, dando como resultado menos anticuerpo libre para la unión y eliminación de protofibrillas A1. Además, esto podría modificar las mediciones de protofibrillas A1 en muestras biológicas mediante un ensayo ELISA de tipo sándwich de A1. Para aclarar si mAb158 se une a la APP original, se realizaron experimentos de inmunoprecipitación. Se inmunoprecipitaron medios de cultivo de células HEK (simulado, APPSue y APPArt-Sue) y homogeneizados de cerebro de ratón (no transgénico, APPSue y APPArt-Sue) con mAb158 o 6E10, seguido de una transferencia de Western desnaturalizante con 6E10 como anticuerpo de detección (Figura 5C). Como se observa en la figura 5C, el mAb158 no inmunoprecipita con las aAPP de los medios de cultivo de células ni con la APP de longitud completa de los homogeneizados de cerebro de ratón, mientras que, como era de esperar, sí lo hizo 6E10. Las protofibrillas A1 sintéticas usadas como control inmunoprecipitaron igualmente con los dos anticuerpos (Figura 5C). Transferencias representativas de experimentos repetidos (n=3).

Ejemplo 6

Establecimiento de un ELISA de tipo sándwich específico para protofibrillas A{.

Para poder realizar mediciones de protofibrillas A1 en muestras biológicas se estableció un ELISA de tipo sándwich con mAb158 capturando y detectando el anticuerpo. Este ensayo mide las protofibrillas A1 con un límite de detección de 1 pM y con un intervalo lineal de hasta 250 pM (en la Figura 6A, las líneas indican regresión lineal de las curvas patrón). Debido a incertidumbres con respecto al tamaño de las protofibrillas A1 usadas en la curva patrón, la concentración 1 pM se basó en el peso molecular de un monómero A1 (4514 g/mol). No obstante, dado que se había calculado que el peso molecular de una protofibrilla era al menos de 100 kDa, el límite de detección calculado como protofibrillas A1 molar podría ser tan bajo como 50 fM. Una curva patrón de protofibrillas A1Art proporcionó una menor señal que las protofibrillas A1 de tipo silvestre, posiblemente debido a diferencias en cuanto al tamaño de la protofibrilla A1 (Figuras 6A, 6B). Se tituló A1-BPM sintética (A1 de Bajo Peso Molecular). La expresión “A1 de Bajo Peso Molecular”, significa monómeros, dímeros y trímeros de A1 que tienen un peso molecular de aproximadamente 4-12 kDa. Para validar la especificidad de conformación del ELISA, se usaron protofibrillas A1 y A11-16 (Figura 6B), mientras que se usó el péptido hidrófilo A11-16 ya que no se esperaba agregar. Un ELISA compuesto de dos anticuerpos idénticos necesita al menos un dímero de una proteína para producir una señal y como estaba previsto, A11-16 no se detectó con el mAb158 en el ELISA de tipo sándwich incluso a concentraciones μM (Figura 6B). Cuando se realizó el pre-tratamiento de la A1-BPM y las protofibrillas A1 con ácido fórmico al 70% (AF), que se sabe que disocia A1 agregados en monómeros, la señal del ELISA de tipo sándwich se perdió (datos no mostrados). Por tanto, la detección de A1-BPM a elevadas concentraciones nM (Figura 6B) se debe probablemente a un pequeño contenido de agregado de la preparación del péptido.

Un exceso grande de A1 monomérica, holoAPP y fragmentos de APP, de origen natural en muestras biológicas, podría interferir con el análisis de protofibrillas A1 ocupando sitios de unión del revestimiento del anticuerpo de captura, inhibiendo por tanto a las protofibrillas de la unión. Este problema se investigó añadiendo un exceso en aumento de A11-16 a una concentración fija de protofibrillas A1 (50 pM, expresado como unidades monoméricas) y analizándolo con mAb158 y con 6E10-6E10 en un ELISA de tipo sándwich (Figura 6C). Un exceso molar de 500.000

veces de A11-16, en comparación con protofibrillas A1, no modificó las mediciones con el mAb158 en el ELISA de tipo sándwich, como se esperaba ya que A11-16 se une mal al anticuerpo de captura. En cambio, un exceso de 500 veces de A11-16 fue suficiente para disminuir la señal en el ELISA con 6E10-6E10, en el cual A11-16 se une con elevada afinidad al anticuerpo de captura (Figura 6C). Además, cuando se añadieron protofibrillas A1 sintéticas a medios de cultivo de células HEK simulados o a homogeneizados de cerebro de ratón no transgénico, se recuperó el 90% de la señal (datos no mostrados).

Ejemplo 7

Medición de protofibrillas A{ en muestras biológicas

Se ha sugerido la presencia de protofibrillas A1 en células y modelos de ratón llevando la mutación Ártica, aunque esta ahora no ha habido ningún método para ensayar directamente las protofibrillas A1 en muestras biológicas. Por lo tanto, el ELISA de tipo sándwich con mAb158 proporciona la primera oportunidad para medir niveles de protofibrillas A1 en dichas células y modelos de ratón y compararlos con modelos sin esta mutación intra-A1. Se compararon muestras de células y de ratones que llevaban solo la mutación Sueca con la curva patrón de protofibrillas A1 de tipo silvestre, mientras que las muestras de células y de ratones que expresaban A1 con la mutación Ártica se compararon con la curva patrón de protofibrillas A1Art (Figura 6A). Para garantizar que todas las A1 medidas en este ensayo estaban en un estado soluble, y para excluir cualquier posible interferencia de fibrillas A1, todas las muestras se centrifugaron durante 5 minutos a 17900 x g antes del análisis. Se analizaron grupos de medios de células HEK transfectadas transitoriamente con APPSue y APPArt-Sue y se compararon con medios de cultivo simulados de células HEK. A partir de curvas patrón, se calcularon los niveles de protofibrillas A1 (Figura 6A) como el valor medio de triplicados y después se normalizaron a niveles de APP para compensar diferencias en los niveles de transfección (de acuerdo con Stenh et al.). La concentración de protofibrillas A1 en el medio de cultivo de células HEK APPArt-Sue era de 28 pM (±2), significativamente superior (p<0,0001) al 8,2 pM (±0,3) observado en APPSue (Figura 7A). En el medio simulado no pudieron detectarse protofibrillas A1. También se midieron los niveles de protofibrillas A1 en cerebros de ratones transgénicos APPArt-Sue y APPsue de 10 meses con placas y patología A1 intraneuronal (de acuerdo con Lord et al.). Los cerebros se homogeneizaron en TBS y se centrifugaron antes del análisis para recuperar la fracción A1 soluble. De manera similar al análisis usando medios de cultivo de células, los niveles de protofibrillas A1 difirieron significativamente (p=0,005) entre los grupos, con 397 pM (±59) en cerebros de ratones transgénicos APPArt-Sue y 108 pM (±14) en APPSue (Figura 7B).

En las figuras mencionadas anteriormente (Figuras 6 y 7), el número de muestras era; células simuladas (n=3) y transfectadas transitoriamente con APPSue (n=8) y APPArt-Sue (n=11). Los niveles de protofibrillas A1 en medios con APPArt-Sue eran aproximadamente 9 veces superiores a los de los medios con APPSue, mientras que los medios simulados no proporcionaron ninguna señal (A). Las mediciones de los niveles de protofibrillas A1 en la fracción soluble en TBS, de homogeneizados de cerebro de ratón no transgénico (n=6), se compararon con las de ratones transgénicos (APPSue n=3 y APPArt-Sue n=6) (B) De manera similar a los medios de cultivo de células, los niveles de protofibrillas A1 de ratones APPArt-Sue fueron 7 veces superiores que los de ratones APPSue. Se muestran barras de error ± DTM.

Ejemplo 8

El mAb158 disminuye significativamente las protofibrillas A{ y A{ total en ratones transgénicos APPsueart después de administración i.p.

A ratones APPsueart de 9-10 meses, se les inyectó, por vía i. p., el mAb158 (12 mg/kg) semanalmente durante 18 semanas. Después del estudio, los cerebros se aislaron y se homogeneizaron en TBS y posteriormente se centrifugaron para sedimentar el material insoluble. El material insoluble se disolvió en ácido fórmico. Por lo tanto, se obtuvieron dos fracciones procedentes de cerebros de ratón, es decir, una fracción en TBS y una fracción en ácido fórmico. Los niveles de protofibrillas A1 en las fracciones en TBS se determinaron mediante un ELISA. Se encontró una reducción significativa de protofibrillas A1 en el grupo de tratamiento con mAb158 en comparación con el grupo placebo (Figura 8). La Figura 8 muestra los niveles de protofibrillas A1 en extractos de TBS con cerebro de ratón transgénico APPsueart 4 meses después del tratamiento con mAb158 o con placebo.

El nivel de A1 total en la fracción de ácido fórmico se determinó mediante un ELISA (el ácido fórmico se usó para disolver todas las formas A1, para preparar todas las formas A1 detectables). Se observó una reducción significativa de A1 total en el grupo de tratamiento en comparación con el grupo placebo (Figura 9). La Figura 9 muestra los niveles de A1 totales en extractos de ácido fórmico con cerebro de ratón transgénico APPsueart 4 meses después del tratamiento con mAb158 o con placebo.

Ejemplos 9-11

Abreviaturas A Adenina Protocolo Ab protocolo biomédico AERES

10 11 12 13

BHK

riñón de cría de hámster

pb

pares de bases

C

Centígrado

C

Citosina

5

CHO Ovario de hámster Chino

CMF

Calcio y Magnesio Libre

COS 7

Línea celular de fibroblastos de riñón de mono verde africano

dhfr

dihidrofolato-reductasa

DMEM

Medio de Eagle modificado con Dubelcco

10

DMSO Dimetil sulfóxido

ADN

Ácido desoxirribonucleico

ELISA

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

SFT

Suero fetal de ternero

g

gramos

15

G Guanina

hr

horas

HRP

peroxidasa de rábano picante

IgG

Inmunoglobulina

K

G o T (convención IUPAC)

20

LSAP Producto Amiloide Soluble Grande

mAb

anticuerpo monoclonal

sec

segundo

min

minuto

M

A o C (convención IUPAC)

25

MTX Metotrexato

NIMR

Instituto Nacional para la Investigación Médica (Reino Unido)

nm

nanómetro

DO

densidad óptica

PBS

Solución Salina Tamponada con Fosfato

30

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

R

A o G (convención IUPAC)

TA

Temperatura Ambiente

S

C o G (convención IUPAC)

T

Timina

35

UV Ultra Violeta

V

variable

V

A o C o G (convención IUPAC)

VH

región variable de cadena pesada de inmunoglobulina

VK

región variable de cadena ligera kappa de inmunoglobulina

40

W A o T (convención IUPAC)

Y

C o T (convención IUPAC)

Materiales

Equipo

Equipo

Proveedor de Reino Unido Número de Catálogo

Termociclador de ADN: GeneAmp 9600

Perkin Elmer N801-0177

Un laboratorio de cultivo de tejidos diseñado que contiene un gabinete de seguridad microbiológico de clase II equipado con una lámpara UV

Walker Safety Cabinets Ltd. N/a

Agitador de sobremesa para incubadora Innova®

New Brunswick Scientific 4000

Centrifugadora de sobremesa

Fisher Scientific CEK-126-010N

Incubadora a 37ºC con CO2 gasificado

RossLab plc HS0-501TVBB

Incubadora microbiológica

Kendro / Heraeus B6060

Modelo Electroporator: Gene Pulser II

Bio-Rad Laboratories Ltd. 341BR-3092

Lector ELISA: Lector de Microplaca 3550

Bio-Rad Laboratories Ltd. 3550

Paquete informático de análisis de datos Microplate Manager® 2.2 para ordenador Macintosh

Bio-Rad Laboratories Ltd. N/a

Sistema PCR 9700 de GeneAmp de 96 pocillos

ABI N8050200

Analizador Genético ABI PRISM 310

Applied Biosystems 310-00-100/120

Detector de resonancia de plasmón superficial T100

Biacore

Consumibles de plástico

Artículo

Proveedor de Reino Unido Número de Catálogo

Matraz de cultivo de tejido de 175 cm2

Sarstedt Ltd 83.1812.002

Matraz de cultivo de tejido de 25 cm2

Coming Costar 3056

Envase universal de 30 ml

Sterilin 128C

Matraz de cultivo de tejido de 75 cm2

Sarstedt Ltd 83.1813.002

Cubetas de electroporación

Bio-Rad Laboratories Ltd. 165-2088

Placas de ELISA: Nunc MaxiSorp

Invitrogen Life Technologies 43945ª

Tubos de reacción PCR GeneAmp™

Perkin Elmer N801-0180

Portaobjetos de recuento dedeshechable Glasstic®

células Bio-stat Diagnostic 887144

Agujas de inoculación Nunc

Life Technologies 254399

Placa de Petri de cultivo de tejidos 100x20mm, multi-vent

Helena Biosciences 93100

Placa de cultivo de tejido: 6 pocillos + tapa

Corning C3516

Placa de cultivo de tejido: 24 pocillos + tapa

Corning C3526

Reactivos inmunológicos y de biología molecular

Artículo

Proveedor de Reino Unido Nº de catálogo Nº de Lote

Kit de síntesis de 1ª cadena

Amersham Biosciences 27-9261-01 3375313

Kit para PCR Advantage®-HF 2

Clontech 639123 6040151

Agarosa (UltraPure™)

Invitrogen 15510-027 3019491

Albúmina de suero bovino (BSA)

Calbiochem 126575 B65755

Ampicilina

Sigma A-9518 63H0992

Apa I

Promega R636 16007003

Termoprime + ADN Polimerasa

Abgene AB0301 014/0103/11 019/0607/13 020/1808/13

Bam HI

Promega R602 15851606

Ciclo Terminador v3.0 BigDye®

ABI 4390242 0605143

Kit de reacción preparado para secuenciación

0608154

Bromuro de etidio (10 mg/ml)

Sigma E-1510 43H9414

Anticuerpo anti IgG humana (fragmento específico de Fc) de cabra

Stratech Scientific 109-005-098 68215

Conjugado de peroxidasa de rábano picante con anti- cadena kappa humana de cabra

Sigma A7164 032K9157

Hind III

Promega R604 16834803

anticuerpo humano IgG1/kappa.

The Binding Site BP078 223729

Sustrato K-Blue HRP

SkyBio 308176 060823

Oligonucleótidos

Sigma n.a.

Comprimidos PBS

Sigma P4417 11 K8204

Kit QIAGEN Plasmid Maxi (25)

Qiagen 12162 124114870

Kit QlAprep Spin Miniprep

Qiagen 27106 124117906

Kit de purificación QlAquick gel

Qiagen 28704 11549740

Kit de purificación PCR QlAquick

Qiagen 28106 G10.1.12

Solución de detención roja (Para Azul K)

SkyBio Ltd, 301475 060104

Qiagen

74106 10916587

Fosfatasa alcalina de camarón

USB 70092Y 107635

Subclonación Efficiency™ DH5a™ químicamente competente de E. coli

Invitrogen 44 0098 1164658

ADN ligasa de T4

Promega M1801 167080

Sustrato uni-etapa TMB para HRP

SkyBio Ltd, KB176

Kit TOPO-TA Cloning®

Invitrogen 45-0641 1350772

X-Gal

Sigma B-9146 20965701

Soluciones procedentes del Instituto Nacional de Investigación Médica

Nombre de la solución:

Componentes Cantidad

PBS 'A ' Dulbecco (Sin Ca ni Mg)

NaCI KCI Na2HPO4 KH2PO4 Agua 8g 0,2g 1,15g 0,2g 1l

LB

Bacto Triptona Extracto de levadura NaCI Agua 10g 5g 10g 1l

Agar LB

LB Agar (Difco) 1l 15g

Reactivos de cultivo

Artículo

Proveedor de Reino Unido Número catálogo de Número de lote Fecha de caducidad

Medio de Eagle modificado por Dulbecco DMEM (1X) (alto contenido en glucosa) con GlutaMAX™ I, D-Glucosa 4500mg/l, piruvato de sodio

Invitrogen 41966-047 9206 07/07

DMSO (Dimetil sulfóxido)

Sigma D2650 125K2409 12/07

Penicilina y Estreptomicina

Invitrogen 15070-063 1298401

Suero: Clon Fetal I

Perbio Science SH30080 AMM177 79 12/07

SOC

Invitrogen 15544-034 1306051

Azul Tripano

Sigma T8154 19H2388

Solución Tripsina-EDTA, ensayada en cultivo celular, 0.25%

Sigma T4049 48K2342 04/08

Ejemplo 9 – Secuencia de ADN del anticuerpo 158 5

9.1 – preparación de ARN

El 3 de Octubre del 2006 se recibieron por TAG sedimentos de células del hibridoma 158 de ratón, (viales con la etiqueta Nº 060824, 5x106 células 158), congeladas instantáneamente. Estas células se conservaron congeladas 10 hasta el procesamiento usando el kit Qiagen Rneasy midi para aislar el ARN siguiendo el protocolo de los fabricantes.

9.2 – síntesis de la 1ª cadena

Aproximadamente 5 microgramos de ARN 158 se sometieron a transcripción inversa para producir ADNc 158 usando el kit de síntesis de 1ª cadena Amersham Biosciences siguiendo el protocolo de los fabricantes. Esto se repitió para generar 3 productos de ADNc independientes (rondas 1, 2 y 3) con objeto de obviar mutaciones de ADN debidas a la reacción de transcripción inversa RT.

9.3 Clonación del ADNc de inmunoglobulina de 158

El ADNc del hibridoma 158 se amplificó por PCR en 23 reacciones distintas. Se amplificó el ADNc de la región variable de cadena kappa (VK) de inmunoglobulina usando 11 cebadores para VK (MKV1-11) en combinación con el cebador de la región constante kappa MKC (Tabla 6). De manera similar, el ADNc de la región variable de cadena pesada (VH) de inmunoglobulina se amplificó por PCR usando 12 cebadores para VH diferentes (MHV 1-12) en combinación con una mezcla de cuatro cebadores de la región constante de IgG (MHCG1/2a/2b/3: Tabla 7).

El resultado del conjunto inicial de las reacciones PCR de IgH fue el único producto de amplificación usando el cebador MHV5. Ninguno de los otros 11 pares de cebadores proporcionó ningún producto PCR. El producto de la reacción PCR cebada con los cebadores oligonucleotídicos: MHV5+ (mezcla de MHCG1/2a/2b/3) se ligó en el vector pCR2.1®-TOPO® usando el kit TOPO-TA cloning®. El resultado del conjunto inicial de las reacciones PCR de IgK fue de sólo dos productos de amplificación usando los cebadores MKV1 y MKV2 con MKC. Los otros 9 pares de cebadores no generaron ningún producto. Los productos de la reacción PCR cebada con los cebadores oligonucleotídicos: MKV1 o MKV2 + MKC se ligaron en el vector pCR2.1®-TOPO® usando el kit TOPO-TA cloning®.

En placas de agar con LB/ampicilina/X-gal, se clonaron bacterias de E.coli TOP10 transformadas con el vector ligado, se recogieron en rejillas de agar y en una mezcla de selección por PCR. Los insertos plasmídicos clonados se seleccionaron por amplificación PCR. Los productos de la PCR se sometieron a electrofóresis en gel y se identificaron clones que producían el producto de amplificación de PCR de tamaño correcto (500 pb aprox.). Se procesaron cultivos de cada clon (5 ml) durante una noche usando el protocolo del kit QIAprep Spin Miniprep para producir mini preparaciones plasmídicas de ADN.

9.4 – Determinación de las secuencias de ADNc

El ciclo completo de RT-PCR, la clonación y el análisis de la secuencia de ADN se repitió para obtener tres conjuntos de información de secuencia completamente independientes, para cada cadena de inmunoglobulina. Los clones de los plásmidos de cada conjunto independiente de las regiones RT-PCR se secuenciaron en las dos direcciones usando los cebadores 1212 y 1233 (Tabla 10). Los plásmidos se secuenciaron usando el kit de reacción preparado para secuenciación de ciclo BigDye® Terminator v3.0 (ABI), se ciclaron en un aparto de PCR GeneAmp9600 y se analizaron en un secuenciador capilar ABI 310.

9.5 – Secuencia de ADN de la VK de 158

Las secuencias de los clones de VK generados usando los cebadores de PCR, MKV2 y MKC en las rondas 1 y 2 de los ADNc de 1ª cadena, fueron idénticas a las de un transcrito estéril de kappa originado del compañero de fusión del mieloma tal como MOPC-21, SP2 y Ag8. Este es un transcrito estéril. En la Tabla 11 se muestra la secuencia consenso (VK de 158) de clones de VK generados usando cebadores de PCR, MKV1 y MKC, en las rondas 1-3 de los ADNc de 1ª cadena. Esta es una reorganización funcional. La Tabla 11 muestra algunas diferencias de la secuencia mostradas en las Tablas 1, 4 y 5. Estas diferencias están en la región FW1 en la que se localizó el cebador de PCR. La secuencia líder de VK de ratón más parecida al fragmento del líder de VK de 158, no codificada por los cebadores de la invención, era la Nº K5.1(Tabla 12). La predicción para que el péptido de señal escindiese correctamente la secuencia de señal Nº K5.1 se realizó mediante un programa de predicción. Más probablemente el sitio de escisión previsto estaba correctamente entre los restos aminoacídicos 19 y 20 (Tabla 13). En la Tabla 14 se muestra la secuencia de la proteína quimérica de 158VK y de ADN.

9.6 Secuencia de ADN de 158 VH

En la Tabla 15 se muestra la secuencia consenso (158 VH) de clones VH generados usando cebadores de PCR, MHV5 y una mezcla de MHCG1/2a/2b/3 en las rondas 1-3 de los ADNc de 1ª cadena. Como con 158 VK, existen algunas diferencias de la secuencia FW1 mostrada en las Tablas 1, 4 y 5. La secuencia líder de VH de ratón más parecida a la del fragmento del líder, no codificada por los cebadores de la invención, fue NL-1 (Tabla 16).

Ejemplo 10 – Construcción de vectores de expresión quiméricos

La construcción de vectores de expresión quiméricos conlleva añadir una secuencia líder adecuada a VH y VK, precedida por un sitio de restricción Hin dIII y una secuencia de Kozak. La secuencia de Kozak (Tabla 8) garantiza la traducción eficaz de la secuencia de región variable. Esta define el codón AUG correcto a partir del cual un ribosoma puede comenzar la traducción y la base más crítica es la adenina en la posición -3, aguas arriba del inicio AUG. La

secuencia líder se selecciona como la secuencia líder de ratón más similar en la base de datos de Kabat. Estas adiciones se codifican dentro de los cebadores directos (Tabla 9). Por otro lado, la construcción de los vectores de expresión quiméricos conlleva introducir un fragmento 5’ de la región constante y1 humana, hasta un sitio de restricción Apa I natural, contiguo al extremo 3’ de la región J de 158. La CH se codifica en el vector de expresión aguas abajo de la secuencia VH insertada pero carece del intrón V-C. Para la cadena ligera, se añade el sitio donante de corte y empalme natural (Tabla 8) y un sitio Bam HI aguas abajo de la región V. La secuencia donante de corte y empalme facilita el corte y empalme fuera del intrón V:C kappa que es necesario para la unión en lectura del VK con la región constante. Los genes de ratón VK y VH se analizaron para identificar cualquiera de los sitios donantes de corte y empalme, sitios aceptores de corte y empalme, secuencias Kozak no deseados y para identificar la presencia de cualquiera de los sitios de restricción de subclonación extras que pudieran interferir más tarde con la subclonación y/o expresión del anticuerpo completo funcional. En este caso no se encontró ninguno.

10.1 – Vectores de expresión

Se purificaron preparaciones de ADN de plásmidos de los vectores de expresión pKN100 y pG1D200 usando kits Qiagen Maxi siguiendo el protocolo de los fabricantes. La purificación de ADN de plásmidos usando los kits midi y maxi QIAGEN Plasmid, procedentes de cultivos de 500 ml de bacterias TOP10 se transfectaron con cada vector. En las Figuras 10 y 11 se muestran los mapas de los vectores.

10.2 -Los cebadores de quimerización de cadena ligera

La secuencia líder de ratón Nº K5.1se incorporó en el diseño del 158 VK quimérico. Los cebadores se diseñaron para generar un producto PCR que contenía esta secuencia líder completa y la región 158 VK, con sitios de restricción terminales Hind III y Bam HI para la clonación en el vector de expresión pKN100 (Tabla 9). El cebador directo 158v1 introduce un sitio de restricción Hind III; un sitio Kozak y la secuencia líder Nº K5.1. El cebador inverso 158vlrev introduce: un sitio donante de corte y empalme y un sitio de restricción Bam HI.

10.3 – Los cebadores de quimerización de cadena pesada

La secuencia líder NL-1 se incorporó en el diseño del 158 VH quimérico. Los cebadores se diseñaron para generar un producto PCR que contenía esta secuencia líder y la región 158 VH, con sitios de restricción terminales Hin dIII y Apa I para la clonación en el vector de expresión pG1D200. Esto se muestra en la Tabla 9. El cebador directo, 158vh, introduce un sitio de restricción de Hin dIII, un sitio de inicio de la traducción de Kozak y la secuencia líder NL-1. El cebador inverso, 158vhrev, introduce el extremo 5’ de la región C y1 y un sitio de restricción Apa I natural. En la Tabla 17 se muestra la predicción del sitio de escisión del péptido de señal para la secuencia líder K5.1 de VK.

10.4 – Generación de la construcción quimérica 158 VH: pG1D200158VH

El fragmento de ADN de 158 VH se amplificó con los cebadores 158vh y 158vhrev (Tabla 9). El producto PCR de 450pb (aprox) se ligó a T-A en el vector pCR2.1 y se usó para transformar bacterias TOP10 químicamente competentes. Los clones se seleccionaron por tamaño de inserto apropiado y se secuenciaron usando el cebador 1212 (Tabla 10). El inserto de correcta expresión se subclonó en el vector de expresión pG1D200 y el subclon correcto se seleccionó por secuenciación de ADN usando el cebador BDSH61R (Tabla 10). Este clon se cultivó en un cultivo de 200 ml para producir ADN plasmídico usando el kit Qiagen Maxi usando el protocolo de los fabricantes. En la Tabla 18 se muestra la secuencia de la proteína quimérica 158VH y del ADN.

10.5 -Generación de la construcción quimérica 158 VK: pKN100158VK

El fragmento de ADN de 158 VK se amplificó con los cebadores 158v1 y 158vlrev (Tabla 9). El producto PCR de 450bp (aprox) se ligó a T-A en el vector pCR2.1 y se uso para trasformar bacterias TOP10 químicamente competentes. Los clones se seleccionaron por tamaño de inserto y se secuenciaron usando el cebador 1212 (Tabla 10). El clon correcto se subclonó en el vector de expresión pKN100. El subclon correcto se seleccionó explorando el tamaño de inserto y la secuenciación de ADN usando el cebador Hu-K2 (Tabla 10). Este clon se cultivó en un cultivo de 200 ml para producir el ADN plasmídico usando el kit Qiagen Maxi usando el protocolo del fabricante.

Ejemplo 11- Producción y propiedades de unión del anticuerpo quimérico 158

11.1- Transformación de células COS 7 y cultivo de células

Se descongeló un vial de células COS 7 y se cultivaron en DMEM complementado con suero de clon fetal I al 10% y antibióticos. Una semana después, se realizó la electroporación de las células (0,8ml a 107/ml) con pG1D200158VH más pKN100158VK (10 μg de ADN cada uno). Las células se cultivaron durante 3 días en placas de Petri en 8 ml de medio de crecimiento.

11.2. Producción de anticuerpo quimérico

Para medir las concentraciones de anticuerpo en los sobrenadantes de COS 7, se usó un ELISA de tipo sándwich.

El anticuerpo quimérico 158VH x 158 VK se expresó a 0,3 μg/ml y posteriormente a 3,7 μg/ml (Tabla 19) en medios acondicionados de células COS co-transfectadas transitoriamente.

11.3- Actividad del anticuerpo quimérico

5 Para analizar la unión del anticuerpo quimérico 158 al antígeno, se usaron dos ELISA. Usando el medio acondicionado del anticuerpo quimérico de 3,7 μg/ml, se midió la unión al monómero A1 mediante un protocolo ELISA directo (Figura 12) y se comparó con la IgG 158 de ratón. En segundo lugar, se realizó un ELISA competitivo usando monómero o protofibrilla mezclado en la fase líquida con antibiótico, que posteriormente se unió al

10 monómero A1 en la fase sólida (Figura 13). Esto demostró que el anticuerpo quimérico 158 se une a monómeros A1 y protofibrillas amiloides de manera similar al anticuerpo de ratón 158 original.

Comentario

15 Secuenciación posterior ha mostrado que los datos de secuencias del anticuerpo de ratón, como se muestra en las tablas 1 y 4, contienen errores en ambas cadenas VH y VK en el extremo 5’. Los inventores sugieren que esto se debe al uso de cebadores localizados dentro de la región V. En secuenciación posterior, se usaron cebadores localizados dentro de las secuencias líder, que no puede introducir mutaciones dentro de las regiones V. La secuenciación posterior mostró diferencias de secuencia (véanse las Tablas 15 y 11). Sin embargo, dichas

20 diferencias no se localizan dentro de las regiones CDR.

El anticuerpo quimérico se une a monómeros A1 y protofibrillas amiloides como se muestra mediante el ELISA de unión directo y el ELISA competitivo, respectivamente. Esta prueba confirma que la combinación de cadenas 158VH y 158VK codifica el anticuerpo–LSAP 158 e indica que estas secuencias son adecuadas para el procedimiento de

25 humanización para generar un anticuerpo 158 humanizado.

Ejemplo 12- Diseño y discusión del anticuerpo humanizado

Abreviaturas y definiciones

30 158 Anticuerpo 158 monoclonal de ratón anti-LSAP™ 158 VH VH del anticuerpo 158 de ratón. 158 VK VK del anticuerpo 158 de ratón 158RKAss Versión humanizada de 158 VK conservando sitios de corte y empalme crípticos 158RKA Versión humanizada de 158 VK con sitios de corte y empalme crípticos eliminados. 158RHAss Versión humanizada de 158 VH conservando sitios de corte y empalme crípticos 158RHA Versión humanizada de 158 VH con sitios de corte y empalme

crípticos eliminados A Adenina Pb Pares de bases C Citosina CDR Región determinante de la complementariedad en las regiones variables de inmunoglobulina,

definida usando el sistema de numeración de Kabat Gen D Gen de diversidad ADN Ácido desoxirribonucleico FW Región flanqueante: las regiones variables de inmunoglobulina excluyendo las regiones CDR G Guanina IgG Inmunoglobulina G Gen J Gen de acoplamiento Kabat Un sistema de alineamiento y numeración de inmunoglobulina cuyo pionero fue Elvin A

Kabat mAb Anticuerpo monoclonal MRCT Tecnología del Consejo de Investigación Médica T Timina VCI Resto flanqueante clasificado como interfaz VH-VL o de vernier o canónico Gen V El segmento génico que se transpone junto con un gen J (y D para VH) para generar una VH

o VK completa

Región V El segmento de cadenas de IgG que es variable en la secuencia entre diferentes anticuerpos. Se extiende hasta el resto de Kabat 109 en la cadena ligera y 113 en la cadena pesada

VH Región variable de cadena pesada de inmunoglobulina VK Región variable de cadena ligera kappa de inmunoglobulina

Equipamiento

Equipo y programa informático

Origen

Ordenador SGWC2

Silicon Graphics

Ordenador PC

Hewlett Packard

SR 7.6

Steve Searle, Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge

Lasergene 6.0

DNAstar Inc.

Modeler 9.0

Accelrys Ltd.

P de señal

www.cbs.dtu.dk

BlastP

www.ncbi.nlm.nih.gov

12.1- Bases de datos del gen V humano

5 Para recopilar una base de datos de secuencias de proteínas de inmunoglobulina en el alineamiento de Kabat, se usaron las secuencias de proteínas de inmunoglobulinas humanas y de ratón procedentes de la Base de Datos de Inmunogenética Internacional 2006 y de la Edición 5 de la Base de Datos de Kabat de secuencias de proteínas de interés inmunológico (última actualización 17 de noviembre de 1999). La base de datos de la invención contiene 9322 secuencias VH humanas y 2689 VK humanas. Para averiguar las bases de datos de VH y VK humanas con las

10 secuencias de proteínas de 158 VK y 158 VH (Tabla 20), se usó el programa de análisis de secuencias, SR 7.6.

12.2-Selección de un resto flanqueante humano para 158RHA

12.2.1- Comparación de 158 VH con secuencias VH humanas

15 En la Tabla 21 se muestran las secuencias VH humanas con mayor identidad a 158 VH en restos (VCI) de Vernier (Foote, J. And G.Winter.1992. Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops. J Mol.Biol 224:487-499.), Canónicos (Morea,V., A.M.Lesk, and A.Tramontano. 2000. Antibody modeling: implications for engineering and desing. Methods 20:267-279.) y de la Interfaz VH-VL (Chothia ,C., J.Novotny, R.Bruccoleri, and

20 M.Karplus. 1985. Domain association in immunoglobulin molecules. The packing of variable domains. J Mol.Biol. 186:651-663.), localizadas dentro de la región flanqueante (FW) de V. También se muestra el número de restos VCI (puntuación VCI) y restos FW (puntuación FW) idénticos a 158. Como se muestra en la Tabla 22, todas estas secuencias de VH comparten idénticos restos VCI y longitudes de CDR. En este conjunto de datos AJ556669 tiene una Pro74 inusual no observada en las otras secuencias humanas, lo que conduce a descartarla en el análisis

25 inicial. Sin embargo, Pro74 está presente en la secuencia 158VH, por lo que AJ556669 podría considerarse como una FW alternativa para la humanización, si la construcción de VH basada en AF062243 no se une el antígeno. El alineamiento de estas secuencias (Tabla 23) pone de manifiesto sus diferencias. En este conjunto de datos, AF062243 únicamente tiene el cambio conservativo T(82a)S y la conservación de F79. Las otras características de AF062243 son los cambios conservativos D1E, K19R, A23S, T77S, S118T. El resto de los cambios de FW fueron

30 comunes a todas las regiones flanqueantes en la Tabla 23. AF062243 se seleccionó como región flanqueante en la cual se basa 158RHA.

12.3- Generación de 158RHA.

35 El diseño de 158RHA es simplemente el injerto de la CDR 1, 2 y 3 de 158 VH en la FW aceptora de AF062243. El gen V de la línea germinal humana más idéntico a AF062243 es M99649 de VH (VH3-07), (Tabla 24) a partir del cual se extrajo el péptido líder (Tabla 25). El algoritmo del P de señal (Nielsen, H., J. Engelbrecht, S. Brunak y G. von Heijne. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Eng 10:1-6.) predijo que este se cortaría apropiadamente con peptidasa de señal (Tabla 26). La tabla 27

40 muestra el esquema del injerto de las CDR 1, 2 y 3 de 158 VH en la FW de AF062243, para generar una secuencia de proteína 158RHA. La tabla 28 muestra la generación de la secuencia de ADN de 158 RHAss a partir de secuencias de ADN naturales de 158 VH y AF062243. El análisis de la secuencia de ADN de 158RHAss predijo la presencia de sitios donantes de corte y empalme, cuyas puntuaciones de predicción se muestran en la tabla 29. Se introdujeron mutaciones no codificantes para inactivar estos sitios de corte y empalme predichos, como se muestra

45 en la Tabla 30 para generar la secuencia final de ADN de 158RHA (Tabla 31)

12.4- Selección de una región flanqueante humana para 158RKA

12.4.1- Comparación de 158 VK con secuencias VK humanas 50

En la Tabla 32 se muestran las secuencias de VK humanas con mayor identidad a 158VK en los restos VCI junto con el número de restos VCI (puntuación VCI) y restos FW (puntuación FW) idénticos a 158 VK. Once secuencias tenían todos los restos VCI idénticos a 158 VK.

55 La Tabla 33 muestra que todas estas secuencias tienen longitudes de CDR idénticas a 158 VK. La Tabla 34 pone de

manifiesto sus diferencias, mostrando que K45 se conserva únicamente en AB0064054, que también conserva I85. El cambio de G100P no es llamativo porque P100 es común, con una incidencia del 15% en la base de datos de VK humana de la invención. Las dos sustituciones: T7S y K74R, son conservativas y las restantes sustituciones son comunes a todas las secuencias en la Tabla 34. Por estas razones, para generar 158RNA se seleccionó AB064054.

12.5 - Generación de 158 RKA

El diseño de 158RHA es simplemente el injerto de las CDR 1, 2 y 3 de 158VK en la FW aceptora de AB064054 humana. El gen V de la línea germinal más cercano a AB064054 es A19 (Tabla 35), a partir del cual se extrajo el péptido líder (Tabla 36). El algoritmo del P de señal predijo el corte apropiado (Tabla 37) de este péptido líder. La Tabla 38 muestra la generación de la secuencia de la proteína de 158RKA intercalando las CDR de 158 VK en la FW de AB064054. La Tabla 39 muestra la generación de la secuencia de ADN de 158RKAss a partir de la secuencia natural de ADN de 158 VK y AB064054. El análisis de la 158RKAss predijo la presencia de sitios donantes de corte y empalme, cuyas puntuaciones se muestran en la Tabla 40. Se introdujeron mutaciones no codificantes (41) para inactivar estos sitios y generar la construcción final de ADN de 158RKA (Tabla 42).

12.6 Actividad de unión del anticuerpo humanizado (BAN2401)

Se insertaron los genes 158RKA y 158RHA en un vector de expresión que contenía la región constante de IgG1. Esta construcción se expresó en células COS para generar el anticuerpo 158 humanizado. El anticuerpo 158 humanizado se ensayó para determinar la actividad y especificidad de unión en un ensayo competitivo ELISA. El anticuerpo humanizado mostró propiedades de unión idénticas a las de mAb158 y a las del anticuerpo quimérico 158 (véase la Figura 14).

12.7 Mutaciones adicionales en las cadenas 158RHA y 158RKA

Comparando genes V de la línea germinal de ratón AAK71612 de VH con 158 VK se identificó una sola mutación somática A60G en la CDR2. Por otro lado, el modelo molecular del anticuerpo158 contiene tres restos en FW de VHdentro de 5Å de restos CDR que no están conservados en 158RHA. Estas sustituciones son D1E, P74A y T82S(Tabla 43). De manera similar, existen dos restos en FW de VK dentro de 5Å de restos CDR que no están conservados en 158RKA. Esta sustitución es L3V y G100P (Tabla 44). En las Tablas 43 y 44, se muestra la introducción de retromutaciones en las posiciones VH-1, VH-74, VH-82, VK-3 y VK-100 en 158RHA y 158RKA, en versiones humanizadas 158RHB, 158RHC, 158RHD, 158RKB y 158RKC.

Referencias

Bacskai et al., Nat.Med.7:369-372, 2001. Bard et al., Nat, Med. 6:916-919, 2000. Bayer et al., Neurology 64:94-101, 2005. Brendza et al., J.Clin. Invest. 115:428-33, 2005. Chen et al., Nature 408:975-9, 2000. Chothia, C. et al., J.Mol.Biol., 186:651-663, 1985. Ester W.P. Science 293, 1449-1459, 2001. Gullberg et al., Proc. Natl Acad Sci, 101:8420-4, 2004. Foote, J. et al., J Mol.Biol., 224:487-499, 1992. Hosti et al., Proc, Natl Acad. Sci, 100:6370-6375, 2003. Jarret J.T. , Biochemistry, 32, 4693-4697,1993. Leatherbarrow R.J. et al., Mol. Inmunol. 22, 407, 1985. Lord et al., Neurobiol. Aging, 27:67-77, 2006 McLean et al., Ann. Neurol 46:860-866, 1999. Morea, V. et al., Methods 20:267-279, 2000. Mullan et al., Nat Genet 1:345-347, 1992. Nielsen, H. et al., Protein Eng 10:1-6,1997. Nilsberth et al., Nat Neurosci. 4:887-893, 2001. Näslund et al., JAMA, 283:1571-1577, 200 Pfeifer et al ., Science 298:1379, 2002. Racke et al., J. Neurosci 25:629-36, 2005. Schenk D. et al., Nature, 400, 173-177, 1999. Stenh et al., Ann. Neurol. 58:147-50, 2005. Walsh D.M.et al., 272, 22364-22372, 1997. Walsh D.M. et al., Nature, 416, 535-9, 2002. Wilcock et al., J. Neurosci., 23:3745-51, 2003. Wright A.et al., J. of Immunology, 3393-3402, 1998. Xu Y. et al. J.Biol. Chem. 269, 3469-3474, 1994.

Claims (27)

1. REIVINDICACIONES

   1.Un anticuerpo o fragmento del mismo que es selectivo y que tiene una elevada afinidad por protofibrillas A1 humanas, en el que el anticuerpo o el fragmento en sus seis regiones CDR posee las siguientes secuencias consenso:

   VH-CDR1 SFGMH VH-CDR2 YISSGSSTIYYGDTVKG VH-CDR3 EGGYYYGRSYYTMDY VL-CDR1 RSSQSIVHSNGNTYLE VL-CDR2 KVSNRFS VL-CDR3 FQGSHVPPT
2. 2.El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es monoclonal.
3. 3.El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el aminoácido prolina en la posición 331 en la IgG1 humana se cambia por serina o por otro aminoácido polar.
4. 4.El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo es de la clase IgG.
5. 5.El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo es de la subclase IgG1 o IgG4.
6. 6.El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho anticuerpo es una quimera de las subclases IgG1 e IgG4, en el que la región constante de cadena pesada CH2 o una parte de CH2 es de IgG4 y las regiones CH1 y CH3 son de IgG1.
7. 7.El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho anticuerpo comprende la secuencia completa de aminoácidos de cadena pesada de acuerdo con la Tabla 31 y la secuencia completa de aminoácidos de cadena ligera de acuerdo con la Tabla 42.
8. 8.Un anticuerpo que se une a protofibrillas A1 humanas, en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos 158RHA en la Tabla 27 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos 158RKA en la Tabla 38.
9. 9.El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho anticuerpo comprende mutaciones en la cadena pesada (VH) de acuerdo con la Tabla 43, seleccionándose dichas mutaciones de E a D en la posición de Kabat 1, de A a P en la posición de Kabat 74 y de S a T en la posición de Kabat 82A, y/o mutaciones en la cadena ligera (VK) de acuerdo con la Tabla 44, seleccionándose dichas mutaciones de V a L en la posición de Kabat 3 y de P a G en la posición de Kabat 100, o combinaciones de estas mutaciones VH y VK.
10. 10.El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho anticuerpo comprende la secuencia de cadena pesada completa de acuerdo con la Tabla 31 y la secuencia de cadena ligera completa de acuerdo con la Tabla 42, con la excepción de que en la cadena pesada se ha introducido la mutación S23A.
11. 11.El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho anticuerpo es humano o humanizado o ha mutado para reducir la antigenicidad en seres humanos.
12. 12.El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 5 ó 6, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo de ratón.
13. 13.El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12 en el que dicho anticuerpo comprende la secuencia de cadena ligera completa codificada por la secuencia de ADN 158VK de acuerdo con la Tabla 11 y la secuencia de cadena pesada completa codificada por la secuencia de ADN 158VH de acuerdo con la Tabla 15.
14. 14.Composición que comprende el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y un tampón farmacéuticamente aceptable.
15. 15.La composición de acuerdo con la reivindicación 14 que comprende adicionalmente un agente anti-bacteriano.
16. 16.La composición de acuerdo con la reivindicación 14 ó 15, en el que la composición esta liofilizada.
17. 17.La composición de acuerdo con la reivindicación 16, en la que la composición esta liofilizada junto con un excipiente para aumentar la estabilidad del anticuerpo durante y después de la liofilización.
18. 18.La composición de acuerdo con la reivindicación 17, en la que el excipiente es manitol o trehalosa.
19. 19.Un método de detención de protofibrillas A1 in vitro, que comprende las etapas de: -añadir el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 a una muestra biológica que comprende o se piensa que comprende protofibrillas A1. -medir la concentración del complejo formado entre dichas protofibrillas A1 y dicho anticuerpo.
20. 20.El método de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicho método de detección es un inmunoensayo.
21. 21.El método de acuerdo con la reivindicación 19 en la que dicho método de detección es un ensayo de ligamiento por proximidad.
22. 22.Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para su uso en un método de

    diagnostico de la enfermedad de Alzheimer, comprendiendo el método: -añadir el anticuerpo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 a una muestra extraída de un sujeto; y -medir la concentración del complejo formado ente dicho anticuerpo y cualquiera de las protofibrillas A1 en dicha muestra.
23. 23.Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para su uso en un método de

    diagnóstico del síndrome de Down, demencia por cuerpos de Lewy o demencia vascular, comprendiendo el método: -añadir el anticuerpo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 a una muestra extraída de un sujeto; y -medir la concentración del complejo formado entre dicho anticuerpo y cualquiera de las protofibrillas A1 en dicha muestra.
24. 24..El uso del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14-18 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
25. 25.El uso del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14-18 por la preparación de un medicamento para el tratamiento del síndrome de Down, demencia por cuerpos de Lewy o demencia vascular.
26. 26.El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14-18 para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
27. 27.El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14-18 para su uso en el tratamiento del síndrome de Down, demencia por cuerpos de Lewy o demencia vascular.

    21 22

    Tabla 2.

    Secuencias de aminoácidos de las regiones CDR 1-2 de cadena VH de un anticuerpo selectivo de protofibrillas y sustituciones de aminoácidos que son compatibles con la unión de elevada afinidad a protofibrillas A1 de tipo silvestre humanas

    Anticuerpo 158 Sustituciones*

    Región CDR-2 de cadena VH Anticuerpo 158 Sustituciones* Sustituciones*

    Región CDR-3 de cadena VH Anticuerpo 158 Sustituciones y deleciones* Sustituciones y deleciones*

    * Las sustituciones de aminoácidos (aminoácidos distintos a los del anticuerpo 158) se muestran con un código de letra del aminoácido. Las deleciones se muestran con (x).

    Tabla 3.

    Secuencias de aminoácidos de las regiones CDR 1-3 de cadena VL de un anticuerpo selectivo de protofibrillas y sustituciones de aminoácidos que son compatibles con la unión de elevada afinidad a protofibrillas A1 de tipo silvestre humanas

    Anticuerpo 158 Sustituciones y deleciones*

    Región CDR-2 de cadena VL Anticuerpo 158 Sustituciones*

    Región CDR-3 de cadena VL Anticuerpo 158 Sustituciones *

    * Las sustituciones de aminoácidos (aminoácidos distintos a los del anticuerpo 158) se muestran con un código de letra del aminoácido. Las deleciones se muestran con (x).

    24 25 26 Tabla 6 - Cebadores de PCR para la clonación de VK de ratón

    27 Tabla 7. Cebadores PCR para la clonación de la VH pesada de ratón

    Leyenda: Las bases cambiantes se definen en abreviatura (Sección 2).

    Tabla 8. Secuencias vitales para la expresión eficaz de inmunoglobulina en células de mamíferos.

    Nombre

    Secuencia de ADN consenso (5'�3')

    Sitio Kozak de inicio de la traducción

    Sitio donante de corte y empalme de cadena ligera kappa

    Sitio donante de corte y empalme de cadena pesada

    Sitio aceptor de corte y empalme de inmunoglobulina

    Leyenda: Las bases en negrita se consideran invariantes dentro de cada secuencia consenso. Los sitios de corte y empalme se definen mediante el símbolo "::". Las bases cambiantes se definen en abreviatura (véanse los Ejemplos 9-11)

    28 Tabla 9. Cebadores oligonucleotídicos usados para generar 158 quimérico

    Leyenda: Los sitios de restricción se indican subrayados. Las secuencias de Kozak se indican en negrita.

    29 30 31 32 33 34 35 36 37 Tabla 21. Mejores puntuaciones VCl de la región flanqueante VH humana en comparación con 158 VH.

    Leyenda: En esta tabla los restos canónicos se enumeran de acuerdo con la CDR a la que están asociados. La puntuación FW y la puntuación VCI son el número de restos en la definición de FW o VCI respectivamente, que son idénticos a su equivalente en 158. Los restos idénticos a los de 158 VH se indican con un punto.

    38 39 40 41 42 43

    Leyenda: Secuencia de ADN de 158RHA en comparación con 158RHAss (Tabla 5.7.2) que contiene sitios de corte y empalme predichos. Las posiciones idénticas a 158RHA se identifican con un punto.

    44 45 Tabla 32. Mejores puntuaciones VCI de VK humana con comparación con 158K

    Leyenda: En esta tabla los restos canónicos se enumeran de acuerdo con la CDR a la que están asociados. La puntuación FW y la puntuación VCI son el número de restos en la definición de FW o VCI respectivamente, que son idénticos a su equivalente en 158. Los restos idénticos a los de 158 VH se indican con un punto..

    46 47 48

    Tabla 35. Selección del péptido de señal de VK - Alineamiento de 158 VK con la línea germinal humana A19 y AB064054 humana

    > Secuencia longitud = 50 # Medición Posición Valor Límite? ¿péptido de señal? máx C 21 0,853 0,32 SÍ máx Y 21 0,831 0,33 SÍ máx S 13 0,990 0,87 SÍ media S 1-20 0,932 0,48 SÍ

    D 1-20 0,881 0,43 SÍ # La mayor probabilidad para la escisión está entre los restos aminoacídicos 20 y 21; SSG-DV Leyenda: el algoritmo10 del P de señal genera la puntuación de combinación Y, de la puntuación del sitio de escisión C, y la puntuación del péptido señal S

    49 50 51

    Leyenda: secuencia de ADN de 158RKA comparada con 158RKAss (Tabla 5.13.2) que contiene sitios de corte y empalme predichos. Los restos idénticos a 158RKA se identifican con un punto.

    52 53 54 Figura 1

    Figura 2: Caracterización de un anticuerpo monoclonal selectivo de protofibrillas de elevada afinidad

    Figura 3. Eficacia terapéutica de un anticuerpo selectivo de protofibrillas de elevada afinidad en un modelo de ratón transgénico (APPsue)

    Figura 4

    Figura 6

    Figura 7

    Fig. 8 Niveles de protofibrillas A1 en extractos de TBS con cerebro de ratón transgénico APPsueart 4 meses después del tratamiento con mAb 158 o con placebo

    Fig. 9 Niveles de A1 total en extractos de ácido fórmico con cerebro de ratón transgénico APPSuert 4 meses después

    Fig. 10 Vector pkN100 Figura 11. Vector pG1D200

    Leyenda: ELISA directo cubierto con A1 1-40 (217 ng/pocillo) y usando diluciones en serie de mAb. La cantidad de SFT a la mayor concentración (1 g/ml) es de 2,7%, Detección con conjugados de cadena ligera anti k de ratón o anti k humana.

    Fig. 13 Competencia de A1 monomérico o protofibrilar para la unión al anticuerpo quimérico 158 ó 158 de ratón

    Leyenda: Se incubaron A 11-40 monoméricos ( ) o protofibrillas (PF) ( ) en solución con 158 quimérico ( )

    o 158 de ratón ( ). La concentración final de SFT fue de 0,3%. Después de 1 h de incubación, la mezcla se añadió a una placa cubierta con monómeros A1. La unión del anticuerpo a la placa se detectó por conjugados de cadena ligera anti-K de ratón o anti-K humana.

    Fig. 14 Competencia de A1 monomérico o protofibrilar para la unión al anticuerpo quimérico 158, 158 de ratón y 158 humanizado (BAN2401).

    Leyenda: Se incubaron A1 1-40 monoméricos o protofibrillas (PF) en solución con anticuerpo 158 quimérico (quim), anticuerpo 158 de ratón (mAb158) o anticuerpo 158 humanizado BAN2401 (Hum). La concentración final de SFT fue del 0,3%. Después de 1 h de incubación la mezcla se añadió a una placa cubierta con monómeros A1. La unión del anticuerpo a la placa se detectó por conjugados de cadena ligera anti-K de ratón o anti-K humana.