BR112019027365A2

BR112019027365A2 - anticorpos, agentes, composição farmacêutica, kit, ácido nucleico, célula hospedeira, métodos de tratamento ou prevenção de doenças, de modulação de células, identificação de linfócitos e de seleção de pacientes e métodos in vitro de modulação e de determinação

Info

Publication number: BR112019027365A2
Application number: BR112019027365-4A
Authority: BR
Inventors: Stéphanie Cornen; Benjamin Rossi; Nicolai Wagtmann; Laurent Gauthier
Original assignee: Innate Pharma
Priority date: 2017-07-10
Filing date: 2018-07-09
Publication date: 2020-07-14
Also published as: KR20200026253A; JP2020526214A; EP3652208A1; CN111263769B; CA3066514A1; WO2019011855A1; AU2018298676A1; US20200369765A1; JP7293188B2; CN111263769A; US11623954B2

Abstract

Siglec-9 possui atividade inibidora em células imunes. A presente invenção refere-se a agentes que ligam Siglec-9 humano e neutralizam a sua atividade inibidora. Esses agentes podem ser utilizados para o tratamento de cânceres ou doenças infecciosas.

Description

“ANTICORPOS, AGENTES, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, KIT, ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS DE TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE DOENÇAS, DE MODULAÇÃO DE CÉLULAS, IDENTIFICAÇÃO DE LINFÓCITOS E DE SELEÇÃO DE PACIENTES E MÉTODOS !/N VITRO DE MODULAÇÃO E DE DETERMINAÇÃO” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica o benefício dos Pedidos Provisórios Norte-Americanos nº 62/530.463, depositado em 10 de julho de 2017, e 62/554.750, depositado em 6 de setembro de 2017; ambos os quais são integralmente incorporados ao presente como referência, incluindo quaisquer desenhos e listagens de sequências.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O presente pedido de patente está sendo depositado em conjunto com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de Sequências é fornecida na forma de arquivo intitulado “Sig794 PCT ST25.txt”, criado em 3 de julho de 2018, com tamanho de 154 kB. As informações no formato eletrônico da Listagem de Sequências são integralmente incorporadas ao presente como referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção refere-se a agentes que ligam proteínas Siglec humanas que possuem atividade inibidora em células NK e/ou outras imunes e que neutralizam a atividade inibidora desse Siglec. Esses agentes podem ser utilizados para o tratamento de cânceres ou doenças infecciosas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] Células NK são células mononucleares que se desenvolvem na medula óssea a partir de progenitores linfoides e características morfológicas e propriedades biológicas incluem tipicamente a expressão dos determinantes de conjuntos (CDs) CD16, CD56 e/ou CD57; a ausência do complexo de TCR alfa/beta ou gama/delta sobre a superfície celular; a capacidade de ligar e matar células alvo que deixarem de expressar proteínas — “próprias"' do complexo de histocompatibiidade maior (MHC)/antígeno de leucócitos humanos (HLA); e a capacidade de matar células de tumores ou outras células doentes que expressam ligantes para ativação de receptores NK. Células NK são caracterizadas pela sua capacidade de ligar e matar diversos tipos de linhagens de células de tumores sem necessidade de imunização ou ativação anterior. Células NK podem também liberar citoquinas e proteínas solúveis que exercem efeito regulador sobre o sistema imunológico; e podem sofrer diversas rodadas de divisão celular e produzir células filhotes com propriedades biológicas similares à célula parental. Células saudáveis normais são protegidas contra lise por células NK.

[005] Com base nas suas propriedades biológicas, foram propostas na técnica diversas estratégias de vacina e terapêuticas que dependem da modulação de células NK. A atividade de células NK é regulada, entretanto, por um mecanismo complexo que envolve sinais estimulantes e inibidores. Resumidamente, a atividade lítica de células NK é regulada por diversos receptores da superfície celular que realizam transdução de sinais intracelulares positivos ou negativos mediante interação com ligantes sobre a célula alvo. O equilíbrio entre sinais positivos e negativos transmitidos por meio desses receptores determina se a célula alvo é ou não lisada (morta) por uma célula NK. Sinais estimulantes de células NK podem ser mediados por Receptores da Citotoxicidade Naturais (NCR), tais como NKp30, NKp44 e NKp46; bem como receptores NKG2C, receptores NKG2D, certos receptores similares a lg matadores (KIRs) ativadores e outros receptores NK ativadores (Lanier, Annual Review of Immunology 2005; 23: 225-74). Sinais inibidores das células NK podem ser mediados por receptores como CD94/NKG2-A, bem como certos KIRs inibidores, que reconhecem moléculas da classe | do complexo de histocompatibilidade maior (MHC) (Wagtmann et al (1995), Immunity 5: 439-449). Esses receptores inibidores ligam-se a determinantes polimórficos de moléculas MHC classe | (incluindo HLA classe |) presentes sobre outras células e inibem a lise mediada por células NK.

[006] A atividade lítica de células NK pode ser também regulada por polipeptídeos Siglec. Siglecs (lectinas similares a imunoglobulina que ligam ácido siálico) são um subconjunto de lectinas do tipo | que se ligam a sialoglicanos e são predominantemente expressas sobre células do sistema hematopoiético de forma dependente do tipo e diferenciação celular. Embora ácido siálico seja expresso de forma onipresente, tipicamente na posição terminal de glicoproteínas e lipídios, somente estruturas de sialoglicano distintas muito específicas são reconhecidas por receptores Siglec individuais, dependendo da identidade e da ligação a porções de carboidrato subterminais. Siglecs possuem afinidade geral apenas baixa às estruturas de sialosida de mamíferos comuns que contêm ligações a2-6 e a2-3 de ácido N- acetilneuramínico (Neu5Ac).

[007] Siglecs são geralmente divididos em dois grupos, um primeiro subconjunto composto de Siglec-1, 2, 4 e 15 e o grupo relativo a CD33 de Siglecs que inclui Siglec-3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 e 16. Os Siglecs relativos a CD33 são caracterizados, entre outros, por baixa conservação evolutiva e sequência de rápida evolução por diversos mecanismos.

[008] Siglec-7 (CD328), proteína transmembrana do tipo 1 clonada e caracterizada em primeiro lugar em 1999 pelo grupo Moretta em Gênova, Itália, e pertencente aos receptores Siglec relativos a CD33 humanos, é caracterizado por um domínio Ig conjunto V N-terminal que liga ácido siálico, dois domínios I|g conjunto C2 e uma região intracitoplasmática que contém um motivo inibidor com base em tirosina receptor imune (ITIM) e um motivo similar a ITIM. Siglec-7 é expresso constitutivamente sobre células NK, células dendríticas, monócitos e neutrófilos. O domínio extracelular desse receptor liga preferencialmente ácidos dissiálicos ligados (2,8) e resíduos de a 2,6-sialila ramificados, tais como os exibidos pelo gangliosídeo GD3.

[009] Siglec-9 (CD329) foi caracterizado em 2000 pelo grupo Varki (vide, por exemplo, Angata et al, J. Biol. Chem. 2000; 275: 2212722135) e é expresso sobre monócitos, neutrófilos, células dendríticas, células CD34+ e células NK. Concluiu-se que Siglec-9 (bem como Siglec-8) possui especificidade diferencial para ligantes de sialosida que contêm ácido siálico e sulfato, em que a posição do sulfato é determinante importante da especificidade. Concluiu-se que Siglec-9 liga MUC16 que é sobre-expresso sobre células de câncer. Como Siglec-7, Siglec-9 também contém um domínio lg conjunto V N-terminal que liga ácido siálico, dois domínios Ig conjunto C2 e uma região intracitoplasmática que contém um motivo inibidor com base em tirosina receptor imune (ITIM) e um motivo similar a ITIM. Domínio Ig conjunto V N-terminal de Siglec-9 humano compartilha identidade de sequência de aminoácidos geral de cerca de 77% com domínio Ig conjunto V N-terminal de Siglec-7 humano e esses dois Siglecs exibem diferentes especificidades de ligação de ácido siálico.

[0010] Testes de ligação relataram que, de forma similar a Siglec- 7, Siglec-9 reconheceu ácido siálico na ligação a2,3 ou a2,6-glicosídica a galactose. Utilizando mAb específico de Siglec-9, Zhang et al ((2000), J. Biol. Chem. Vol. 275, nº 29: 22121-22126) relataram que se concluiu que Siglec-9 é expresso em níveis altos ou intermediários por monócitos, neutrófilos e uma população menor de células CD16+, CD56-. Observou-se, entretanto, expressão mais fraca em cerca de 50% de células B e células NK e subconjuntos menores de células T CD8+ e células T CD4+. Os autores concluíram que, apesar do seu alto grau de similaridade de sequências, Siglec- 7 e Siglec-9 possuem perfis de expressão distintos.

[0011] Apesar do perfil de expressão interessante de Siglec-9 em células NK e outras imunes e do potencial interesse terapêutico na neutralização de Siglec-9, até o momento nenhum possível agente terapêutico que neutralize especificamente Siglec-9 foi adiantado ou proposto para uso terapêutico. Relatou-se que o envolvimento de Siglec-9 em células da linhagem mielomonocítica por ligantes de ácido siálico associados a tumores inibe a imunovigilância e morte de células de tumores por células NK, bem como por neutrófilos, granulócitos especializados que reconhecem e matam diretamente os micro-organismos (Laubli et al (2014), Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 111 (39): 14211-14216). Carlin et al ((2009) Blood 113: 3333-3336) relataram que o mimetismo de glicanos sialilados hospedeiros permite que patógenos bacterianos acionem o neutrófilo Siglec-9 e amorteçam a reação imunológica inata. Carlin et al descreveram anticorpo anti-Siglec-9 191240 (R&D Systems, Inc.) como ligando-se ao local de ligação de ácido siálico em Siglec-9 e inibindo a interação com ácido siálico. Carlin et al relataram adicionalmente que, ao contrário de um anticorpo não de bloqueio (clone E10-286, BD Biosciences Inc.), o clone 191240 ampliou a ativação de neutrófilos para células bacterianas. De forma similar, Laubli et al (2014) acima relataram que o clone de anticorpo anti-Siglec-9 191240 foi capaz de ampliar a morte de células de tumores por neutrófilos, em comparação com o clone E10-286 que não ampliou a morte de células de tumores por neutrófilos.

[0012] Anticorpos —anti-Siglec-7 foram descritos na Patente Europeu 1238282B1 (Moretta et al) e Vitale et al ((1999), Proc. Nat. Acad. Sci. 96 (26): 15091-96), referente ao anticorpo anti-Siglec-7 murino QA79, bem como em Falco et al (1999), J. Exp. Med. 190: 793-801, que relatam anticorpo anti-Siglec-7 2176.

[0013] Hudak et al (2014), Nat. Chem. Biol. 10: 69-77 relataram que o bloqueio de anticorpos anti-Siglec-7 inibiu a proteção mediada por Siglec-7 de células alvo de tumores contra a lise por células NK. Com relação a Siglec-9, entretanto, anticorpos anti-Siglec-9 (utilizou-se o clone 191240) não foram capazes de inibir a proteção mediada por Siglec-9 de células alvo de tumores contra lise por células NK purificadas de doadores humanos (vide Hudak et al (2014)), apesar da capacidade de ampliar a morte de células de tumores por neutrófilos (vide Laubli et al (2014)). O clone de anticorpo de ligação bivalente E10-286, relatado em Laubli et al (2014) como não bloqueador e não amplificador da morte de células de tumores por neutrófilos também deixou de inibir a proteção mediada por Siglec-9 de células de tumores alvo contra lise por células NK primárias (Jandus et al (2014), J. Clin. Invest. 124 (4): 1810-18020).

[0014] Apesar do interesse em Siglec-7 e 9, nenhum agente terapêutico dirigido a esses receptores foi desenvolvido. Existe, portanto, a necessidade de agentes que se dirjam a esses receptores para uso no tratamento de doenças como câncer.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0015] Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpos ligantes com alta afinidade que agem como potentes neutralizadores de Siglecs humanos, notadamente sobre células NK de indivíduos humanos que expressam níveis mais baixos de Siglec da superfície celular em comparação com neutrófilos e/ou outras células e que agem como receptores da superfície celular inibidores em linfócitos efetores (Siglec-7 e Siglec-9).

[0016] Em uma realização, a presente invenção fornece inibidores de Siglec (por exemplo, Siglec-9 expresso na superfície da célula), incluindo inibidores competitivos e não competitivos de Siglec-9. Os inibidores correspondentes possuem potência particularmente alta na neutralização da atividade inibidora de Siglec, com ou sem bloqueio substancial da interação entre o Siglec e um de seus ligantes de ácido siálico.

[0017] Em uma realização, o inibidor de Siglec é uma proteína que compreende um domínio de ligação de antígenos de imunoglobulina que se liga especificamente a uma proteína Siglec-9 humana, tal como um anticorpo ou fragmento de anticorpo, ou uma proteína que a compreende. Em uma realização, o inibidor de Siglec liga-se especificamente a proteína Siglec-9 humana sem ligar-se a Siglec-7 humano e/ou outros Siglecs humanos da Tabela 1 (exemplificados por mAbLsA, B, C, D,/ E e F). Em uma realização, o inibidor de Siglec liga-se especificamente à proteína Siglec-9 humana e à proteína Siglec-7 humana, ainda opcionalmente sem ligar-se a outros Siglecs humanos da Tabela 1 (exemplificados por mAbs4, 5 e 6). Em uma realização, o inibidor de Siglec é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente à proteína Siglec-9 humana, proteína Siglec-7 humana e à proteína Siglec-12 humana, ainda opcionalmente sem ligar-se a outros Siglecs humanos da Tabela 1 (exemplificados por mAbs1, 2 e 3). Em uma realização, o inibidor de Siglec é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que é capaz de ligação bivalente a uma proteína Siglec-9 humana (o inibidor compreende dois domínios de ligação de antígenos, cada qual capaz de ligar-se a uma proteína Siglec-9 humana).

[0018] Em uma realização, a presente invenção fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a um polipeptídeo Siglec-9 humano e neutraliza a atividade inibidora do polipeptídeo Siglec-9, opcionalmente em que o anticorpo não bloqueia substancialmente a interação entre o polipeptídeo Siglec-9 e um de seus ligantes de ácido siálico (exemplificados por mAbs1, 2 e 3, vide o Exemplo 10), opcionalmente em que o anticorpo bloqueia a interação entre o polipeptídeo Siglec-9 e um de seus ligantes de ácido siálico (exemplificados por mAbsA, B e C, vide o Exemplo

10). Opcionalmente, o polipeptídeo Siglec-9 é expresso na superfície de uma célula, tal como um linfócito efetor, célula NK, tal como célula NK primária, célula NK CD56*"" de indivíduos humanos. Em uma realização, o anticorpo liga-se adicionalmente a um polipeptídeo Siglec-7 humano e neutraliza a atividade inibidora do polipeptídeo Siglec-7, ainda opcionalmente em que o anticorpo não bloqueia substancialmente a interação entre o polipeptídeo Siglec-7 e um de seus ligantes de ácido siálico. Em outra realização, o anticorpo não se liga a um polipeptídeo Siglec-7 humano.

[0019] Em um aspecto, a presente invenção surge, entre outros, da descoberta de anticorpos que ligam especificamente Siglec-9 humano e que aumentam a atividade (por exemplo, citotoxicidade) de células NK (por exemplo, células NK primárias) para uma célula alvo que contém ligante ácido siálico. Ao contrário de anticorpos anteriores que podem aumentar a citotoxicidade apenas em neutrófilos, transfectantes Siglec e/ou outras células que expressam ou são levadas a expressar altos níveis de Siglec-9 na sua superfície celular, os anticorpos descritos no presente são funcionais mesmo em células que expressam baixos níveis de Siglec-9, tais como células NK em seres humanos (por exemplo, células NK CD56%""), A capacidade de aumento da citotoxicidade dessas células NK com baixa expressão de Siglec-9 possui a vantagem de ser capaz de mobilizar adicionalmente essa população de células contra células alvo de doenças, tais como células de tumores, células com infecções virais e/ou células bacterianas.

[0020] Em uma realização, é fornecido um anticorpo ou fragmento de anticorpo (ou uma proteína que compreende esse fragmento) que liga especificamente Siglec-9 humano e aumenta e/ou restaura a citotoxicidade de células NK (células NK primárias) em um teste de citotoxicidade in vitro por quatro horas padrão no qual células NK que expressam Siglec-9 são incubadas com células alvo que expressam um ligante ácido siálico de Siglec-9. Em uma realização, as células alvo são marcadas com Cr antes da adição de células NK e, em seguida, a morte (citotoxicidade) é estimada como proporcional à liberação de Cr das células para o meio. Opcionalmente, pode-se conduzir um teste de acordo com os métodos dos Exemplos do presente; vide, por exemplo, o Exemplo 8. Em uma realização, o anticorpo ou fragmento de anticorpo é capaz de restaurar a citotoxicidade de células NK que expressam Siglec-9 pelo menos ao nível observado com células NK que não expressam Siglec-9 (por exemplo, conforme determinado de acordo com os métodos dos Exemplos do presente).

[0021] Em qualquer aspecto do presente, células NK (por exemplo, células NK primárias) podem ser especificadas como sendo células NK novas purificadas de doadores, opcionalmente incubadas por uma noite a 37 “C antes do uso. Em qualquer aspecto do presente, células NK ou células NK primárias podem ser especificadas como expressando Siglec-9; para uso em testes, por exemplo, as células podem ser fechadas sobre Siglec-9 por meio de citometria de fluxo. Vide, por exemplo, células NK conforme descrito no Exemplo 8 do presente.

[0022] Em outra realização, é fornecido um anticorpo ou fragmento de anticorpo (ou uma proteína que compreende esse fragmento) que liga especificamente Siglec-9 humano e neutraliza a atividade inibidora do polipeptídeo Siglec-9 em células dendríticas derivadas de monócitos (moDC). Em uma realização, a moDC contém ligantes de ácido siálico de Siglec-9 na sua superfície. Em uma realização, a moDC contém, na sua superfície, polipeptídeos Siglec-9 dedicados a interações cis com ácidos siálicos. Em uma realização, o anticorpo aumenta a ativação ou sinalização em moDC. Em uma realização, o anticorpo neutraliza a atividade inibidora do polipeptídeo Siglec-9 em uma moDC que contém ligantes de ácido siálico de Siglec-9, em que a moDC é uma célula na qual o tratamento da moDC com neuramidase para remover ligantes de ácido siálico resulta em ECso inferior para ligação de anticorpo à moDC.

[0023] Em outro aspecto, a presente invenção surge, entre outros, da descoberta de anticorpos anti-Siglec que ligam polipeptídeos Siglec-7 e Siglec-9 com afinidade comparável. Esses anticorpos possuem características farmacológicas vantajosas. Conforme exibido no presente, células NK podem expressar a proteína Siglec-7 inibidora e a proteína Siglec-9 inibidora, mas Siglec-7 e Siglec-9 podem também possuir perfis de expressão diferentes ao longo de diferentes populações celulares. Além disso, demonstrou-se que células de tumores podem expressar os ligantes naturais (glicanos) para Siglec-7 e para Siglec-9. Consequentemente, agentes terapêuticos que inibem um Siglec mas não o outro podem apresentar eficiência máxima de neutralização da restrição mediada por Siglec da atividade de NK e/ou outras populações de células imunes. A inibição de Siglec 7 e 9 pode, portanto, ser vantajosa. Siglec-9 compartilha, entretanto, identidade de sequências de aminoácidos geral de apenas cerca de 77% com domínio Ig conjunto V N- terminal de Siglec-7 humano. Além disso, esses dois Siglecs exibem diferentes especificidades de ligação de ácido siálico, o que sugere diferenças estruturais da região que é ligada por ligantes de ácido siálico.

[0024] Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpos ligantes com alta afinidade que neutralizam a atividade inibidora de Siglec-7 e/ou Siglec-9 e são capazes de ligar-se especificamente ao polipeptídeo Siglec-7 humano inibidor e ao polipeptídeo Siglec-9 humano com afinidade comparável. Os anticorpos que ligam Siglec-7 e Siglec-9 com afinidade comparável podem, por exemplo, possuir, em certas realizações, maior capacidade de bloquear as interações entre cada um dos Siglecs e um ou mais de seus ligantes de ácido siálico (exemplificados por mAbs4, 5 e 6, vide o Exemplo 6). Os anticorpos que ligam Siglec-9 podem, em outras realizações,

ser caracterizados como neutralizadores da atividade inibidora de Siglec-9, sem bloquear substancialmente as interações entre Siglec-9 e um ou mais de seus ligantes de ácido siálico, particularmente um ácido siálico que compreende uma estrutura Neu5SAca2-3Galb1-4GIcNAcb (exemplificado por mAbs1, 2 e 3, vide o Exemplo 9).

[0025] Conforme exibido no presente, Siglec-9 humano liga-se a Sia1 (NeuSAca2-3Galb1-4GIcNAcb) e Sia2 (6'-sialil-lactose), enquanto Siglec-7 liga-se apenas a Sia2. São fornecidos, em um aspecto, anticorpos que são capazes de bloquear a interação desse(s) polipeptídeo(s) Siglec e um ligante de ácido siálico de Siglec-9 e Siglec-7, tal como um ácido siálico Sia2. Em uma realização, o ácido siálico é trissacarídeo sialilado. Em uma realização, o ácido siálico compreende uma estrutura de 6'-sialil-lactose.

[0026] É fornecido em outro aspecto um anticorpo que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano e neutraliza sua atividade inibidora, em que o anticorpo é capaz de bloquear a interação de ambos, Sia1 (NeuS5Aca2-3Galb1- 4GICNAcb) e Sia2 (G6-siall-lactose) com um polipeptíideo Siglec-9 (exemplificado por mAbs1, 2 e 3; vide o Exemplo 10).

[0027] Em uma realização, anticorpos que são capazes de ligar Siglec-7 e Siglec-9 possuem ECrso para ligação a polipeptídeo Siglec-7 humano que difere em menos de 1-log da sua ECs5o para ligação a polipeptídeo Siglec-9 humano, conforme determinado por meio de citometria de fluxo para ligação a células que expressam, na sua superfície, Siglec-7 ou Siglec-9 (por exemplo, células CHO transfectadas com um dos Siglecs correspondentes, mas que não expressam o outro Siglec). Em uma realização, o anticorpo possui EC5so para ligação a polipeptídeo Siglec-7 humano e polipeptídeo Siglec-9 humano que difere em não mais de 0,5 log, 0,3 log, 0,2 log ou 0,1 log, conforme determinado por meio de citometria de fluxo para ligação a células que expressam, na sua superfície, Siglec-7 ou Siglec-9. As células que expressam,

na sua superfície, Siglec-7 ou Siglec-9 podem ser caracterizadas como expressando o Siglec correspondente em níveis de expressão comparáveis.

[0028] Em uma realização, os anticorpos ligam-se ainda a Siglec de primatas não humanos com afinidade comparável a Siglec-7 e/ou 9 humano. Em uma realização, o anticorpo possui ECs5o para ligação a polipeptídeo Sigle-7 humano, polipeptídeo Siglec-9 humano e Siglec de primata não humano que difere em não mais de 1 log, 0,5 log, 0,3 log, 0,2 log ou 0,1 log, conforme determinado por meio de citometria de fluxo para ligação a células que expressam, na sua superfície, Siglec-7 ou Siglec-9 (por exemplo, células CHO transfectadas com o Siglec correspondente).

[0029] EM uma realização, é fornecido um anticorpo que neutraliza a atividade de Siglec-9 humano e possui ECso para ligação a polipeptídeo Siglec-9 humano e Siglec de primata não humano que difere em não mais de 1 log, 0,5 log, 0,3 log, 0,2 log ou 0,1 log, conforme determinado por meio de citometria de fluxo para ligação a células que expressam, na sua superfície, Siglec-9 (por exemplo, células CHO transfectadas com Siglec).

[0030] Em uma realização, o anticorpo possui KD para afinidade de ligação, conforme determinado, por exemplo, por meio de seleção de ressonância de plasma de superfície (SPR) (por exemplo, por meio de análise com um dispositivo analítico SPR BIAcoreO) que difere em não mais de 10 vezes, 5 vezes, 3 vezes ou 2 vezes pela ligação a um polipeptídeo Siglec-7 humano e a um polipeptídeo Siglec-9 humano (e ainda, opcionalmente, Siglec de primata não humano).

[0031] Em uma realização, o anticorpo possui KD de não mais de 1 x 107 M para ligação a um polipeptídeo Siglec-9 humano (e ainda, opcionalmente, um polipeptídeo Siglec-7 humano e/ou Siglec de primata não humano). Em uma realização, o anticorpo possui KD de cerca de 1x 107 Ma cerca de 1 x 101º M ou cerca de 1 x 10º M a cerca de 1 x 10º M, para ligação a um polipeptídeo Siglec-9 humano (e ainda, opcionalmente, um polipeptídeo Siglec-7 humano e/ou Siglec de primata não humano). Em uma realização, anticorpos anti-Siglec-9 possuem KD de cerca de 1 x 107 M a cerca de 1 x 10º 1º M, cerca de 1 x 10º M a cerca de 1 x 101º M ou cerca de 1 x 10º M a cerca de 1 x 107º M, para ligação (por exemplo, afinidade monovalente) a um polipeptídeo Siglec-9 humano, em que o anticorpo não possui ligação substancial a um polipeptídeo Siglec-7 humano. Em qualquer realização do presente, afinidade de ligação monovalente de um anticorpo é determinado quando o anticorpo é testado como fragmento de Fab”.

[0032] Em uma realização, os anticorpos adicionalmente não ligam substancialmente nenhum dentre Siglecs-3, 5, 6, 8, 10, 11 e 12 humanos. Em uma realização, os anticorpos adicionalmente não ligam substancialmente nenhum dentre Siglecs-1l4 e 16. Em uma realização, os anticorpos adicionalmente não ligam substancialmente Siglec-6 humano. Em uma realização, os anticorpos adicionalmente não ligam substancialmente Siglec-12 humano.

[0033] Em qualquer uma das realizações do presente, os anticorpos anti-Siglec podem ser caracterizados por ligação a polipeptídeos expressos sobre a superfície da célula (por exemplo, célula NK, célula levada a expressar Siglec-7 e/ou Siglec-9, tal como uma célula hospedeira CHO recombinante levada a expressar Siglec-7 e/ou Siglec-9 na sua superfície, conforme exibido nos Exemplos) e, opcionalmente, em que o anticorpo liga-se ainda com alta afinidade conforme determinado por meio de citometria de fluxo. Um anticorpo pode, por exemplo, ser caracterizado por ECso, conforme determinado por meio de citometria de fluxo, de não mais de 5 ug/ml, não mais de 1 pg/ml, não mais de 0,5 pg/ml, não mais de 0,2 ug/ml ou não mais de 0.1 uvg/ml, para ligação a células NK primárias (por exemplo, células NK purificadas a partir de uma amostra biológica de um doador ou indivíduo humano),

opcionalmente células NK CD56%", EC5so pode ser determinada, por exemplo, de acordo com os métodos do Exemplo 9; por exemplo, quatro ou mais doadores humanos saudáveis testados, manchas obtidas em BD FACS Canto Il e analisadas utilizando-se o software FlowJo e ECso foi calculada utilizando- se enquadramento logístico com quatro parâmetros.

[0034] Em outro aspecto, a presente invenção fornece anticorpos ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, um domínio de ligação de antígenos ou proteína que o compreende) que se ligam especificamente a polipeptídeos Siglec-7 e/ou 9 humanos e são capazes de neutralizar a atividade inibidora desse(s) Siglec(s) em células imunes e capazes de bloquear a interação desse(s) polipeptídeo(s) Siglec com um de seus ligantes de ácido siálico. Em uma realização, o ácido siálico é trissacarídeo sialilado. Em uma realização, o ácido siálico compreende uma estrutura NeuSAca2-3Galb1- 4GICNAcb. Em uma realização, o ácido siálico compreende uma estrutura de 6'-sialil-lactose. Em uma realização, o anticorpo ou fragmento de anticorpo liga- se especificamente a um polipeptídeo Siglec-7 e/ou 9 humano e é capaz de neutralizar a atividade inibidora desse(s) Siglec(s) em células NK humanas (por exemplo, células NK primárias humanas; células NK CD56%") em monócitos humanos, células dendríticas humanas, macrófagos humanos (notadamente macrófagos M2 ou imunossupressores), células T CD8 e/ou em neutrófilos humanos. Em uma realização, o anticorpo ou fragmento de anticorpo liga-se especificamente a um polipeptídeo Siglec-7 e/ou 9 humano e é capaz de neutralizar a atividade inibidora desse(s) Siglec(s) em macrófagos imunossupressores (por exemplo, macrófagos M2) de um doador humano, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo reduz a atividade ou capacidade imunossupressora dos macrófagos.

[0035] Conforme discutido, Siglec-9 humano liga-se a Siai (Neu5Aca2-3Galb1-4GIcNAcb) e Sia2 (6'-sialil-lactose), enquanto Siglec-7 liga-

se apenas a Sia2. São fornecidos em certos aspectos anticorpos que são capazes de bloquear a interação desse(s) polipeptídeo(s) Siglec-9 com um ácido siálico que é ligante de Siglec-9, mas não Siglec-7, tal como um ácido siálico Sia1. Em uma realização, o ácido siálico é trissacarídeo sialilado. Em uma realização, o ácido siálico compreende uma estrutura NeusAca2-3Galb1- 4GIcCNAcb. Em uma realização, o anticorpo não bloqueia substancialmente a interação de um ou mais polipeptídeos Siglec-7 com um ácido siálico que é ligante de Siglec-7 mas não Siglec-9, tal como ácido siálico que contém 6"- sialil-lactose.

[0036] São também fornecidos fragmentos e derivados desses anticorpos. Em uma realização, o anticorpo compreende um domínio de ligação de antígenos (por exemplo, um único domínio de ligação de antígenos, um domínio composto de um domínio variável de cadeia leve e pesada etc.) capaz de ligar-se ao polipeptídeo Siglec-7 humano e/ou polipeptídeo Siglec-9 humano. Em uma realização, o domínio de ligação de antígenos liga polipeptídeo —Siglec-9 humano e não polipeptíideo Siglec-7 humano (exemplificado por mAbsA, B, C, D, E e F). Em uma realização, o domínio de ligação de antígenos liga polipeptídeo Siglec-9 humano e polipeptídeo Siglec-7 humano (exemplificado por mAbs1, 2, 3, 4, 5e 6). Em uma realização, é fornecida uma proteína (por exemplo, anticorpo, proteína multimérica e/ou multiespecífica) ou ácido nucleico que codifica esse domínio de ligação de antígenos.

[0037] Em uma realização, o anticorpo anti-Siglec neutralizante de acordo com a presente invenção atenua a atividade inibidora exercida por Siglec-7 e/ou 9 em células imunes, aumentando a capacidade de linfócitos de reconhecer eficientemente e/ou eliminar células de câncer que expressam ligantes de ácido siálico de Siglec-7 e/ou ligantes de ácido siálico de Siglec-9. Os anticorpos (ou fragmentos de anticorpos) reduzem a capacidade de células de câncer de escapar da lise devido à expressão de um ou dos outros tipos de ligantes e, portanto, eles aumentam a vigilância de tumores pelo sistema imunológico. No compartimento de NK, Siglec-9 é principalmente expresso em células NK CD56*", enquanto Siglec-7 é expresso em células NK CD56*" e CD56Gtrihante Células NK CD56%" (CD56%"CD16*KIR*) representam cerca de 90% de células NK do baço e do sangue periférico, expressam perforina e granzimas e são o principal subconjunto citotóxico, enquanto células NK CD5Gtrihante (CD5EbrihanteÇCD 1 gdin-KIR-) constituem a maior parte das células NK em nódulos linfáticos e amídalas e, mediante ativação, reagem principalmente com a produção de citoquinas. Em uma realização, é fornecido um anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga especificamente Siglec-9 humano e atenua a atividade inibidora exercida por Siglec-9 em células NK humanas (por exemplo, células NK primárias humanas; células NK CD56*""), ampliando a capacidade das células NK de efetivamente reconhecer e/ou eliminar células de câncer que expressam ligantes de ácido siálico de Siglec-9. Em uma realização, é fornecido um anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga especificamente Siglec-7 e Siglec-9 humano e atenua a atividade inibidora exercida por Siglec-7 e Siglec-9 em células NK humanas (por exemplo, células NK primárias humanas; células NK CD56%"), aumentando a capacidade das células NK de efetivamente reconhecer e/ou eliminar células de câncer que expressam ligantes de ácido siálico de Siglec-7 e Siglec-9.

[0038] Em uma realização, anticorpos de acordo com a presente invenção podem ligar Siglec-7 e Siglec-9 e podem neutralizar a inibição mediada por Siglec-7 e Siglec-9 da citotoxicidade de linfócitos (por exemplo, células NK e células T CD8+). Em um aspecto, o anticorpo aumenta a ativação de linfócitos na presença de células alvo (por exemplo, uma célula que expressa um ligante de Siglec-7 e/ou um ligante de Siglec-9, uma célula de tumor). Em uma realização, o anticorpo aumenta a citotoxicidade de células

NK, conforme determinado em um teste de citotoxicidade in vitro padrão no qual células NK que expressam Siglec-9 são purificadas a partir de doadores humanos e incubadas com células alvo que expressam um ligante de ácido siálico de Siglec-9. Em uma realização, determina-se o aumento da ativação ou neutralização da inibição da citotoxicidade por meio do aumento de um marcador da citotoxicidade/potencial citotóxico, tal como a expressão de CD107 e/ou CD137 (mobilização). Em uma realização, o aumento da ativação ou neutralização da inibição da citotoxicidade é determinado pelo aumento da liberação de Cr em um teste de liberação de *Cr. Siglec-7 pode compreender uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 1. Siglec-9 pode compreender uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 2. Em outra realização, Siglec-9 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 160.

[0039] Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção é capaz de ligar-se a um polipeptídeo Siglec-9 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 2 (que possui uma lisina na posição 100, representativa de cerca de 49% da população) e a um polipeptídeo Siglec-9 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 160 (que possui ácido glutâmico em posição correspondente ao resíduo 100 de SEQ ID Nº 2, representativa de cerca de 36% da população). Em qualquer realização, um anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser especificado como sendo capaz de neutralizar a atividade inibidora de Siglec-9 em indivíduos que expressam (ou cujas células expressam) um polipeptídeo Siglec-9 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 2, bem como em indivíduos que expressam (ou cujas células expressam) um polipeptídeo Siglec-9 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 160.

[0040] EM uma realização, são fornecidos anticorpos ou fragmentos de anticorpos (ou proteínas que compreendem esses fragmentos)

que ligam polipeptídeo Siglec-9 humano e são capazes de neutralizar a atividade inibidora de polipeptídeo Siglec-9 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 2 e um polipeptídeo Siglec-9 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 160. Em uma realização, são fornecidos anticorpos ou fragmentos de anticorpos (ou proteínas que compreendem esses fragmentos) ligam polipeptídeo Siglec-9 humano e são capazes de neutralizar a atividade inibidora de polipeptídeo Siglec-9 em células NK que expressam polipeptídeos Siglec-9 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 2 e em células NK que expressam polipeptídeos Siglec-9 que compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 160. Em uma realização, o anticorpo aumenta a citotoxicidade de células NK, conforme determinado em um teste de citotoxicidade in vitro padrão no qual células NK que expressam o Siglec-9 específico são purificadas a partir de doadores humanos e incubadas com células alvo que expressam um ligante de ácido siálico de Siglec-9.

[0041] Em um aspecto de acordo com qualquer das realizações do presente, o anticorpo é um anticorpo tetramérico (por exemplo, fragmento de F(ab)2 com comprimento total) ou fragmento de anticorpo que liga um epítopo presente sobre o domínio extracelular de Siglec de forma bivalente. O anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga Siglec de forma bivalente pode compreender, por exemplo, dois domínios de ligação de antígenos, cada qual capaz de ligar um polipeptídeo Siglec-9 ou cada qual capaz de ligar-se a um epítopo presente nos dois polipeptídeos, Siglec-7 e 9. Em outro aspecto de qualquer das realizações do presente, o anticorpo liga-se a Siglec de forma monovalente e não possui atividade agonista de cada Siglec, tal como Siglec-7 e/ou Siglec-9. Em uma realização, o anticorpo que liga Siglec de forma monovalente é um fragmento de Fab. Em qualquer uma das realizações do presente, o anticorpo liga-se a Siglec em forma monovalente ou bivalente e é livre de atividade agonista em Siglec-9. Para uso terapêutico, o anticorpo é preferencialmente um anticorpo não esgotador. Opcionalmente, o anticorpo compreende um domínio Fc capaz de ser ligado pelo receptor de Fc neonatal humano (FcRn), mas que substancialmente não possui ligação, por meio do seu domínio Fc, a um FcyR humano (por exemplo, CD16' e, opcionalmente, um ou mais ou cada um dentre polipeptídeos CD16A, CD16B, CD32A, CD32B e/ou CD64 humanos). Opcionalmente, o anticorpo compreende um domínio Fc de isótipo I9G1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humano que compreende uma modificação de aminoácidos (por exemplo, uma ou mais substituições) que reduz a afinidade de ligação do anticorpo para um ou mais ou cada um dentre os polipeptídeos CD16A, CD16B, CD32A, CD32B e/ou CD64 humanos.

[0042] Em uma realização, o anticorpo compreende um ou mais (por exemplo, dois) domínios de ligação de antígenos que se ligam a Siglec-9, opcionalmente ainda a Siglec-7. Em realização específica, o anticorpo é um anticorpo tetramérico, opcionalmente com comprimento total, que compreende dois domínios de ligação de antígenos idênticos (opcionalmente, dois pares de região variável de cadeia leve e pesada) e que liga e neutraliza a atividade inibidora de Siglec-9, opcionalmente também Siglec-7, compreende um domínio Fc capaz de ser ligado pelo receptor de Fc neonatal humano (FcRn) e que substancialmente não possui ligação a FcyR humano (por exemplo, CD16; opcionalmente, um ou mais ou cada um dentre polipeptídeos CD16A, CD16B, CD32A, CD32B e/ou CD64 humanos).

[0043] Em qualquer uma das realizações do presente, mediante ligação a Siglec sobre um linfócito humano, o anticorpo monoclonal possui a capacidade de ampliar ou reconstituir a lise de uma célula humana alvo que possui um ligante ácido siálico do Siglec sobre a superfície de células alvo e/ou possui a capacidade de aumentar a ativação de linfócitos (por exemplo, conforme determinado por aumento da expressão de CD107 e/ou CD137 sobre um linfócito), quando a célula alvo entrar em contato com o mencionado linfócito, tal como um linfócito efetor, célula NK ou T CD8+ de indivíduos humanos, tal como célula NK CD56*%", Em uma realização, é fornecido um anticorpo que neutraliza primeiro Siglec expresso por primeiro subconjunto de linfócitos (por exemplo, Siglec-9 expresso em células NK CD56*"") e neutraliza segundo Siglec expresso por segundo subconjunto de linfócitos (Siglec-7 expresso em células NK CD56?rilhante), O primeiro e o segundo subconjunto de linfócitos humanos (por exemplo, células NK, células T CD8+, monócitos, células dendríticas, macrófagos, macrófagos M2 ou imunossupressores) podem, por exemplo, ser caracterizados por diferentes marcadores da superfície celular ou diferentes propriedades funcionais, ou pela capacidade de lisar ou reconhecer (por exemplo, ser ativados por) diferentes células alvo. Em uma realização, o anticorpo reduz (bloqueia) a ligação de Siglec a um de seus ligantes de sialosida (por exemplo, um ligante presente sobre células de tumores).

[0044] Em qualquer uma das realizações do presente, o ligante ácido siálico ou sialosida de Siglec é um ligante natural, tal como um ligante de ácido siálico (ligante que compreende ácido siálico) conhecido por ligar-se ao polipeptídeo Siglec ao qual se liga o anticorpo. Ácidos siálicos, uma família de monossacarídeos ácidos com nove carbonos, são tipicamente considerados os ramos terminais de N-glicanos, O-glicanos e glicolipídios. Acredita-se que Siglecs reconheçam muitos aspectos da molécula de ácido siálico, como a ligação de ácido siálico da posição 2, as disposições de ácidos siálicos e sua forma de apresentação. Em qualquer uma das realizações do presente, o ligante de Siglec compreende principalmente derivado de ácido 5-N- acetilneuramínico (Neu5SAc) e pode compreender outros derivados de ácido siálico, como derivados de ácido 5-N-glicolilheuramínico (NeusGc). Em uma realização, o ligante de Siglec-9 e/ou Siglec-7 é um ácido siálico presente sobre uma glicoproteína (por exemplo, mucina) ou glicolipídio. Em uma realização, o ligante de Siglec-7 compreende um ácido dissiálico a2,8-ligado apresentado sobre gangliosídeos da série b, tais como GD2, GD3 e GT1b. Em uma realização, o ligante de Siglec-7 compreende gangliosídeos dissiálicos alfa2,6-ligados internamente ramiíificados, tais como DSGb5. Em uma realização, o ligante de Siglec-9 é um ligante que compreende ou está presente em mucina, tal como MUC1. Em uma realização, o ligante de Siglec-9 é um ligante sialoglicano que contém ácido siálico e sulfato.

[0045] Em um aspecto, um anticorpo liga-se a um determinante comum presente sobre um domínio extracelular de primeiro e segundo Siglec relacionado a CD33 humano. Em um aspecto de qualquer realização do presente, um anticorpo liga-se a um determinante presente em Siglec-9, mas não em Siglec-7. Em um aspecto de qualquer realização do presente, um anticorpo liga-se a um determinante comum presente em Siglec-7 e Siglec-9. Opcionalmente, o determinante ligado por um anticorpo não está presente em um ou mais Siglecs diferentes, tais como um ou mais (ou todos) dentre Siglecs- 3, 5, 6, 8, 10, 11 e 12.

[0046] Em qualquer uma das realizações do presente, o anticorpo liga-se a um domínio extracelular do Siglec. Em algumas das realizações do presente, particularmente quando o anticorpo bloquear a interação entre Siglec e um de seus ligantes de ácido siálico, o anticorpo pode ligar-se ao menos parcialmente no domínio de ligação de ácido siálico do Siglec ou perto dele. Em outras realizações do presente, particularmente quando o anticorpo não bloquear a interação entre Siglec e um de seus ligantes de ácido siálico, o anticorpo pode ligar-se fora do domínio de ligação de ácido siálico do Siglec.

[0047] Em qualquer uma das realizações do presente, mediante ligação a Siglec sobre um linfócito humano (por exemplo, célula NK primária), o anticorpo monoclional possui a capacidade de reconstituir a lise de uma célula humana alvo que possui um ligante de ácido siálico do Siglec sobre a superfície da célula alvo, quando a mencionada célula alvo entrar em contato com o mencionado linfócito.

[0048] Em qualquer uma das realizações do presente, o anticorpo possui KD (por exemplo, para ligação monovalente, conforme determinado de acordo com os métodos descritos nos Exemplos do presente) de menos de 10 8 M, preferencialmente menos de 10º M, para ligação a um polipeptídeo Siglec (por exemplo, Siglec-7 humano e/ou Siglec-9 humano). Como se acredita que os locais de ligação de Siglec-7 e 9 são geralmente mascarados na superfície celular devido a interações cis com ácido siálico com baixa afinidade em abundante expressão, podem ocorrer interações trans com anticorpos que expressam afinidade mais alta que os ligantes que concorrem com cis. Em uma realização, o anticorpo anti-Siglec neutralizante é capaz de deslocar a ligação de um ligante de sialosida a Siglec (por exemplo, Siglec-7 e/ou Siglec-9).

[0049] A presente invenção também fornece um anticorpo ou fragmento de anticorpo humano ou humanizado ou um de seus derivados, que possui quaisquer das propriedades acima, isoladamente ou em qualquer combinação apropriada.

[0050] São fornecidos em um aspecto anticorpos monoclonais que concorrem pela ligação a um epítopo sobre Siglec-9 ligado por mAb-A, B, C, D, E e/ou F (por exemplo, que concorre pela ligação a um epítopo sobre um polipeptídeo Siglec-9 com um anticorpo que contém as CDRs de cadeia leve e pesada ou regiões variáveis de qualquer um dentre mAb-A, B, C, D, E e/ou F).

[0051] São fornecidos, em um aspecto, anticorpos monoclonais que concorrem pela ligação a um epítopo sobre Siglec-7 e/ou Siglec-9 ligado por mAbs1, 2, 3, 4, 5 e/ou 6 (por exemplo, que concorrem pela ligação a um epítopo sobre um polipeptídeo Siglec-7 e/ou Siglec-9 com um anticorpo que contém as CDRs de cadeia leve e pesada ou regiões variáveis de qualquer um dentre mAbs1, 2, 3, 4, 50u6).

[0052] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-Siglec (por exemplo, qualquer um dos anticorpos anti-Siglec do presente), caracterizado por ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-7 que possui mutação no resíduo N82, P83, A84, R85, A86 e/ou V87 (por exemplo, a mutação M9 descrita na Tabela 3). Em um aspecto, os anticorpos anti-Siglec-7 possuem ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-7 que possui mutação no resíduo N81, D100, H102 e/ou T103 (por exemplo, a mutação descrita na Tabela 3). Em um aspecto, os anticorpos anti-Siglec-7 possuem ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-7 que possui mutação no resíduo W88, E89, E90 e R92 (por exemplo, a mutação M11 descrita na Tabela 3). As posições de resíduos para mutações referem-se ao polipeptídeo Siglec-7 de SEQ ID Nº 1. Opcionalmente, o anticorpo não perde a ligação para um ou mais polipeptídeos Siglec-7 mutantes diferentes da Tabela 3, tais como um ou mais mutantes M6, M8, M15 ou M16 (ou todos).

[0053] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-Siglec (por exemplo, qualquer um dos anticorpos anti-Siglec do presente), caracterizado por ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui mutação no resíduo N78, P79, A80, R81, A82 e/ou V83 (por exemplo, a mutação A9 descrita na Tabela 3). Em um aspecto, os anticorpos anti-Siglec-9 possuem ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui mutação no resíduo N77, D96, H98 e/ou T99 (por exemplo, a mutação M10 descrita na Tabela 3). Em um aspecto, os anticorpos anti-Siglec-9 possuem ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui mutação no resíduo W84, E85, E86 e/ou R88 (por exemplo, a mutação M11 descrita na Tabela 3). As posições de resíduos para mutações referem-se ao polipeptídeo Siglec-9 de SEQ ID Nº 2. Opcionalmente, o anticorpo não perde a ligação para um ou mais polipeptídeos Siglec-9 mutantes diferentes da Tabela 3, tais como um ou mais mutantes M6,

M8, M15 ou M16 (ou todos). Em um aspecto, os anticorpos anti-Siglec-9 possuem ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as mutações de M9, a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as mutações de M10 e a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as mutações de M11; opcionalmente, os anticorpos anti-Siglec-9 possuem adicionalmente ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as mutações de M7 ou M8, em que as mutações M9, M10, M11, M7 e M8 são descritas na Tabela 3.

[0054] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-Siglec (por exemplo, qualquer um dos anticorpos anti-Siglec do presente), caracterizado por ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui mutação no resíduo S47, H48, G49, W50, 151, Y52, P53 e/ou G54 (por exemplo, as mutações de MG6 descritas na Tabela 3). As posições de resíduos para mutações referem-se ao polipeptídeo Siglec-9 de SEQ ID Nº 2. Opcionalmente, o anticorpo não perde a ligação para um ou mais polipeptídeos Siglec-9 mutantes diferentes da Tabela 3, tais como mutantes 9, 10 e/ou 11 ou um ou mais mutantes M7 ou M8 (ou todos).

[0055] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-Siglec (por exemplo, qualquer um dos anticorpos anti-Siglec do presente), caracterizado por ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui mutação no resíduo P55, H58, E122, G124, S125 e/ou K127 (por exemplo, as mutações de 7 descritas na Tabela 3). As posições de resíduos para mutações referem-se ao polipeptídeo Siglec-9 de SEQ ID Nº 2. Opcionalmente, o anticorpo não perde a ligação para um ou mais polipeptídeos Siglec-9 mutantes diferentes da Tabela 3, tais como os mutantes 9, 10 e/ou 11.

[0056] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-Siglec (por exemplo, qualquer um dos anticorpos anti-Siglec do presente), caracterizado por ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui mutação no resíduo R120, W128 e/ou N129 (por exemplo, as mutações de M14 descritas na Tabela

3). As posições de resíduos para mutações referem-se ao polipeptídeo Siglec-9 de SEQ ID Nº 2.

[0057] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-Siglec (por exemplo, qualquer um dos anticorpos anti-Siglec do presente), caracterizado por ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui mutação no resíduo S27, R116, H133 e/ou 134 (por exemplo, as mutações de M15 descritas na Tabela 3). As posições de resíduos para mutações referem-se ao polipeptídeo Siglec-9 de SEQ ID Nº 2.

[0058] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-Siglec (por exemplo, qualquer um dos anticorpos anti-Siglec do presente), caracterizado por ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui mutação no resíduo K131 e/ou H132 (por exemplo, as mutações de M16 descritas na Tabela 3). As posições de resíduos para mutações referem-se ao polipeptídeo Siglec-9 de SEQ ID Nº 2. Opcionalmente, o anticorpo não perde a ligação para um ou mais polipeptídeos Siglec-9 mutantes diferentes da Tabela 3, tais como mutantes M9, M10 e/ou M11 ou um ou mais mutantes M8 ou M15 (ou todos).

[0059] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-Siglec (por exemplo, qualquer um dos anticorpos anti-Siglec do presente), caracterizado por ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui mutação no resíduo R63, A66, N67, T68, D69, Q70 e/ou D71 (por exemplo, a mutação M8 descrita na Tabela 3). As posições de resíduos para mutações referem-se ao polipeptídeo Siglec-9 de SEQ ID Nº 2. Opcionalmente, o anticorpo possui adicionalmente ligação reduzida para um ou mais polipeptídeos Siglec-9 mutantes diferentes da Tabela 3, tais como mutantes M9, M10 e/ou M11 ou um ou mais mutantes M14, M15 ou M16 (ou todos).

[0060] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-Siglec (por exemplo, qualquer um dos anticorpos anti-Siglec do presente), caracterizado por ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutantes M6 e M7 (conforme descrito na Tabela 3, com referência à sequência de aminoácidos de Siglec-9 de SEQ ID Nº 2). Em um aspecto, um anticorpo anti-Siglec possui ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutante M6 e a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos do mutante M7 (conforme descrito na Tabela 3, com referência à sequência de aminoácidos de Siglec-9 de SEQ ID Nº 2).

[0061] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-Siglec (por exemplo, qualquer um dos anticorpos anti-Siglec do presente), caracterizado por ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutantes M9, M10 e M11 (conforme descrito na Tabela 3, com referência à sequência de aminoácidos de Siglec-9 de SEQ ID Nº 2). Em um aspecto, um anticorpo anti-Siglec possui ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutante M9, e a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos do mutante M10 e a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutante M11 (conforme descrito na Tabela 3, com referência à sequência de aminoácidos de Siglec-9 de SEQ ID Nº 2).

[0062] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-Siglec (por exemplo, qualquer um dos anticorpos anti-Siglec do presente), caracterizado por ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutantes M7, M9, M10 e M11 (conforme descrito na Tabela 3, com referência à sequência de aminoácidos de Siglec-9 de SEQ ID Nº 2). Em um aspecto, um anticorpo anti-Siglec possui ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutante M7, a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutante M9, a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutante M10 e a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutante 11 (conforme descrito na Tabela 3, com referência à sequência de aminoácidos de Siglec-9 de SEQ ID Nº 2).

[0063] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-Siglec (por exemplo, qualquer um dos anticorpos anti-Siglec do presente), caracterizado por ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutantes M8, M9, M10 e M11 (conforme descrito na Tabela 3, com referência à sequência de aminoácidos de Siglec-9 de SEQ ID Nº 2). Em um aspecto, um anticorpo anti-Siglec possui ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutante M8, a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutante M9, a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutante M10 e a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutante 11 (conforme descrito na Tabela 3, com referência à sequência de aminoácidos de Siglec-9 de SEQ ID Nº 2).

[0064] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-Siglec (por exemplo, qualquer um dos anticorpos anti-Siglec do presente), caracterizado por ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutantes M8 e M16 (conforme descrito na Tabela 3, com referência à sequência de aminoácidos de Siglec-9 de SEQ ID Nº 2). Em um aspecto, um anticorpo anti-Siglec possui ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutante M8 e a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutante M16 (conforme descrito na Tabela 3, com referência à sequência de aminoácidos de Siglec-9 de SEQ ID Nº 2).

[0065] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-Siglec (por exemplo, qualquer um dos anticorpos anti-Siglec do presente), caracterizado por ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutantes M8, M15 e M16 (conforme descrito na Tabela 3, com referência à sequência de aminoácidos de Siglec-9 de SEQ ID Nº 2). Em um aspecto, um anticorpo anti-Siglec possui ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutante M8, a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutante M15 e a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutante M16 (conforme descrito na Tabela 3, com referência à sequência de aminoácidos de Siglec-9 de SEQ ID Nº 2).

[0066] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-Siglec (por exemplo, qualquer um dos anticorpos anti-Siglec do presente), caracterizado por ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutantes M8, M14, M15 e M16 (conforme descrito na Tabela 3, com referência à sequência de aminoácidos de Siglec-9 de SEQ ID Nº 2). Em um aspecto, um anticorpo anti-Siglec possui ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos do mutante MB8, a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutante M14, a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutante M15 e a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutante 16 (conforme descrito na Tabela 3, com referência à sequência de aminoácidos de Siglec-9 de SEQ ID Nº 2).

[0067] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-Siglec (por exemplo, qualquer um dos anticorpos anti-Siglec do presente), caracterizado por ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutantes M14 e M16 (conforme descrito na Tabela 3, com referência à sequência de aminoácidos de Siglec-9 de SEQ ID Nº 2). Em um aspecto, um anticorpo anti-Siglec possui ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutante M14 e a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos de mutante M16 (conforme descrito na Tabela 3, com referência à sequência de aminoácidos de Siglec-9 de SEQ ID Nº 2).

[0068] Em qualquer realização do presente, ligação a um polipeptídeo Siglec-9 que possui as substituições de aminoácidos pode ser especificada como sendo determinada quando um anticorpo é testado em configuração na qual a ligação a Siglec é monovalente, opcionalmente em que o anticorpo é testado como fragmento de Fab', tal como um fragmento de Fab' que compreende VH e VL do anticorpo e fragmento de Fab' que compreende VH e VL em que VH e VL compreendem a CDR1, 2 e 3 de VM e VL correspondente do anticorpo.

[0069] Em uma realização, é fornecido um composto de ligação de antígenos que compreende a CDR1, 2 e 3 de cadeia leve e pesada ou que liga o mesmo epítopo e/ou concorre pela ligação a um polipeptídeo Siglec-7 e/ou Siglec-9 com um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste de: a. um anticorpo monoclonal que compreende (i) cadeia pesada que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 3 e (ii) cadeia leve que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 4; b. um anticorpo monoclonal que compreende (i) cadeia pesada que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 5 e (ii) cadeia leve que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 6; Cc. um anticorpo monoclonal que compreende (i) cadeia pesada que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 7 e (ii) cadeia leve que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 8; d. um anticorpo monoclonal que compreende (i) cadeia pesada que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 9 e (ii) cadeia leve que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 10;

e. um anticorpo monoclonal que compreende (i) cadeia pesada que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 11 e (ii) cadeia leve que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 12;

f. um anticorpo monoclonal que compreende (i) cadeia pesada que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 13 e (ii) cadeia leve que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 14;

g. um anticorpo monoclonal que compreende (i) cadeia pesada que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 15 e (ii) cadeia leve que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 16;

h. um anticorpo monoclonal que compreende (i) cadeia pesada que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 17 e (ii) cadeia leve que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 18;

Í. um anticorpo monoclonal que compreende (i) cadeia pesada que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 19 e (ii) cadeia leve que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 20;

j: um anticorpo monoclonal que compreende (i) cadeia pesada que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 21 e (ii) cadeia leve que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 22;

k. um anticorpo monoclonal que compreende (i) cadeia pesada que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 23 e (ii) cadeia leve que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia leve de SEQID Nº 24; e l. um anticorpo monoclonal que compreende (i) cadeia pesada que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID Nº 25 e (ii) cadeia leve que compreende CDR 1, 2 e 3 da região variável de cadeia leve de SEQ ID Nº 26.

[0070] Em um aspecto de qualquer uma das realizações da presente invenção, o anticorpo que liga um polipeptídeo Siglec-9 pode possuir uma cadeia pesada que contém uma, duas ou três CDRs da cadeia pesada de um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste de anticorpo MALA, B, C, D, Ee F; e uma cadeia leve que contém uma, duas ou três CDRs da cadeia leve do anticorpo correspondente selecionado a partir do grupo que consiste de anticorpo MALA, B, C, DE eF.

[0071] Em um aspecto, é fornecido um domínio de ligação de antígenos ou anticorpo que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano, que compreende: CDR1 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos SYWMH (SEQ ID Nº 75); CDR2 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos EINPSNGHTNYNEKFES (SEQ ID Nº 78); CDR3 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos GVESYDFDDALDY (SEQ ID Nº 80); CDR1 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos RASQDINNYLN (SEQ ID Nº 83); CDR2 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos YTSRLHS (SEQ ID Nº 57); CDR3 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos QQGNTLPFT (SEQ ID Nº 86); e sequências de cadeia principal de cadeia leve e pesada humana.

[0072] Em um aspecto é fornecido um domínio de ligação de antígenos ou anticorpo que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano, que compreende: CDR1 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos SYWMH (SEQ ID Nº 75) ou SYWIH (SEQ ID Nº 198); CDR2 de cadeia pesada que compreenle a sequência de aminoácidos EINPSNGHTNYNEKFKT (SEQ ID Nº 90) ou EINPSNGHTNYAEKFKT (SEQ ID Nº 199); CDR3 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos GVETYDFDDAMDY (SEQ ID Nº 92); CDR1 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos RASQDINNYLN (SEQ ID Nº 83) ou QASQDINNYLN (SEQ ID Nº 200); CDR2 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos FTSRLHS (SEQ ID Nº 95); CDR3 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos QQGDTFPFT (SEQ ID Nº 96); e sequências de cadeia principal de cadeia leve e pesada humana.

[0073] Em um aspecto é fornecido um domínio de ligação de antígenos ou anticorpo que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano, que compreende: CDR1 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos NYEMN (SEQ ID Nº 98); CDR2 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos WINTYTGESTYADDFK (SEQ ID Nº 101); CDR3 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos DDYGRSYGFAY (SEQ ID Nº 103); CDR1 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos RASESVDSYGNSFMH (SEQ ID Nº 106); CDR2 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos LASKLES (SEQ ID Nº 109); CDR3 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos HQNNEDPPWT (SEQ ID Nº 110); e sequências de cadeia principal de cadeia leve e pesada humana.

[0074] Em um aspecto, é fornecido um domínio de ligação de antígenos ou anticorpo que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano, que compreende: CDR1 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos DYSMH (SEQ ID Nº 112); CDR2 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos WIITETGEPTYADDFRG (SEQ ID Nº 115); CDR3 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos DFDGY (SEQ ID Nº 117); CDR1 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos RASENIYSYLA (SEQ ID Nº 119); CDR2 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos NAKTLTE (SEQ ID Nº 122); CDR3 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos QHHYGFPWT (SEQ ID Nº 123); e sequências de cadeia principal de cadeia leve e pesada humana.

[0075] Em um aspecto, é fornecido um domínio de ligação de antígenos ou anticorpo que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano, que compreende: CDR1 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos TFGMH (SEQ ID Nº 125); CDR2 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos YISSGSNAIYYADTVKG (SEQ ID Nº 128); CDR3 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos PGYGAWFAY (SEQ ID Nº 130); CDR1 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos RASSSVSSAYLH (SEQ ID Nº 133); CDR2 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID Nº 136; CDR3 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos QQYSAYPYT (SEQ ID Nº 137); e sequências de cadeia principal de cadeia leve e pesada humana.

[0076] Em um aspecto, é fornecido um domínio de ligação de antígenos ou anticorpo que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano, que compreende: CDR1 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos DYSMH (SEQ ID Nº 112); CDR2 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos VISTYNGNTNYNQKFKG (SEQ ID Nº 139); CDR3 de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos RGYYGSSSWFGY (SEQ ID Nº 141); CDR1 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos KASQNVGTDVA (SEQ ID Nº 144); CDR?2 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos SASYRYS (SEQ ID Nº 147; CDR3 de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos QQYNSFPYT (SEQ ID Nº 148) e sequências de cadeia principal de cadeia leve e pesada humana.

[0077] Em um aspecto de qualquer uma das realizações da presente invenção, o anticorpo que liga um polipeptídeo Siglec-7 e Siglec-9 pode possuir cadeia leve e/ou pesada que contém uma, duas ou três CDRs da cadeia leve e/ou pesada correspondente de um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste de anticorpo mAbs-1,2,3,4,5e6.

[0078] Em um aspecto, é fornecido um domínio de ligação de antígenos ou anticorpo que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano, que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende uma região de cadeia principal de cadeia pesada humana (FR1, FR2 e/ou FR3) derivada de um gene IGHV1-69 (ou, opcionalmente, IGHV1-46) humano e CDR1, 2 e 3 de cadeia pesada de um anticorpo MALA; e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende uma região de cadeia principal de cadeia leve humana (FR1, FR2 e/ou FR3) derivada de um gene IGKV1-33 humano e CDR1, 2 e 3 de cadeia leve de um anticorpo MALA. Opcionalmente, as CDRs são definidas pela numeração de Kabat. Em uma realização, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 15 ou qualquer um dentre SEQ ID Nº 170-173 e/ou a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 16, 174, 175 ou 176. Em uma realização, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos do domínio variável de MAbA HO, H1, H2 ou H3 (ou uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade com ela) e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos do domínio variável de mAPA LO, L1 ou L2 (ou uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) de identidade com ela).

[0079] Em um aspecto, é fornecido um domínio de ligação de antígenos ou anticorpo que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano, que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende uma região de cadeia principal de cadeia pesada humana (FR1, FR2 e/ou FR3) derivada de um gene IGHV1-69 (ou, opcionalmente, IGHV1-46) humano e CDR1, 2 e 3 de cadeia pesada de um anticorpo mMAbB; e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende uma região de cadeia principal de cadeia leve humana (FR1, FR2 e/ou FR3) derivada de um gene IGKV1-33 humano e CDR1, 2 e 3 de cadeia leve de um anticorpo mAbB. Opcionalmente, as CDRs são definidas pela numeração de Kabat. Em uma realização, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 17, 177, 178, 179, 180, 181 ou 182 e/ou a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 18, 183, 184 ou 185. Em uma realização, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos do domínio variável de MAbLB HO, H1, H2, H3, H4 ou H5 (ou uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade com ela) e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbB LO, L1 ou L2 (ou uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) de identidade com ela).

[0080] Em um aspecto, é fornecido um domínio de ligação de antígenos ou anticorpo que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano, que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende uma região de cadeia principal de cadeia pesada humana (FR1, FR2 e/ou FR3) derivada de um gene IGHV7-4-1 humano e CDR1, 2 e 3 de cadeia pesada de um anticorpo mMAbC; e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende uma região de cadeia principal de cadeia leve humana (FR1, FR2 e/ou FR3) derivada de um gene IGKV7-3 humano e CDR1, 2 e 3 de cadeia leve de um anticorpo mAbC. Opcionalmente, as CDRs são definidas pela numeração de Kabat. Em uma realização, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 20, 192, 193, 194 ou 195 e/ou a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 20, 196 ou 197. Em uma realização, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos do domínio variável de mALB HO, H1, H2 ou H3 (ou uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade com ela) e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbB LO ou L1 (ou uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) de identidade com ela).

[0081] Em um aspecto, é fornecido um domínio de ligação de antígenos ou anticorpo que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano, que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende uma região de cadeia principal de cadeia pesada humana (FR1, FR2 e FR3) derivada de um gene IGHV7-4-1 (por exemplo, 7-4-1*02) humano (e, opcionalmente, FR4 derivado de um gene IGHJ6 (por exemplo, IGHJ6*01)) e CDR1, 2 e 3 de cadeia pesada de um anticorpo mAbD; e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende uma região de cadeia principal de cadeia leve humana (FR1, FR2 e FR3) derivada de um gene IGKV1-39 (por exemplo, 1-39*01) humano e CDR1, 2 e 3 de cadeia leve de um anticorpo mMAbD. Opcionalmente, as CDRs são definidas pela numeração de Kabat. Em uma realização, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 21, 186, 187 ou 188 e/ou a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 22, 189, 190 ou 191. Em uma realização, a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos do domínio variável de mMAbD HO, H1 ou H2 (ou uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) de identidade com ela) e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbB LO, L1 ou L2 (ou uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) de identidade com ela).

[0082] Em um aspecto, é fornecido um domínio de ligação de antígenos que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano e é capaz de neutralizar a atividade inibidora de um polipeptídeo Siglec-9 expresso por uma célula NK humana, em que o domínio de ligação de antígenos compreende VH que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de mMAbA HO, H1, H2 ou H3 exibido em SEQ ID Nº 170, 171, 172 e 173, respectivamente, e VL que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos do domínio MALA LO, L1 ou L2 exibido em SEQ ID Nº 174, 175e 176, respectivamente.

[0083] Em um aspecto, é fornecido um domínio de ligação de antígenos que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano e é capaz de neutralizar a atividade inibidora de um polipeptídeo Siglec-9 expresso por uma célula NK humana, em que o domínio de ligação de antígenos compreende VH que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbB HO, H1, H2, H3, H4 ou H5 exibido em SEQ ID Nº 177, 178, 179, 180, 181 e 182, respectivamente, e VL que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbLB LO, L1 ou L2 exibida em SEQ ID Nº 183, 184 e 185, respectivamente.

[0084] Em um aspecto, é fornecido um domínio de ligação de antígenos que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano e é capaz de neutralizar a atividade inibidora de um polipeptídeo Siglec-9 expresso por uma célula NK humana, em que o domínio de ligação de antígenos compreende VH que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de mMAbD H0, H13 ou H2 exibido em SEQ ID Nº 186, 187 e 188, respectivamente, e VL que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de mALD LO, L1 ou L2 exibida em SEQ ID Nº 189, 190 e 191, respectivamente.

[0085] Em um aspecto, é fornecido um domínio de ligação de antígenos ou proteína que o compreende (por exemplo, um anticorpo, fragmento de anticorpo, anticorpo biespecífico, proteína de fita simples ou multimérica, ou proteína Fc) que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano, em que o domínio de ligação de antígeno ou anticorpo compreende uma combinação de VH e VL selecionada a partir do grupo que consiste de:

a. VH que compreende CDR1, 2 e 3 do domínio VH que contém a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº 15e FR1, 2 e 3 de um segmento genético IGHV1-69 (ou, opcionalmente, IGHV1-46) humano e VL que compreende CDR1, 2 e 3 do domínio VL que contém a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº 16 e FR1, 2 e 3 de um segmento genético IGKV1-33 humano; b. VH que compreende CDR1, 2 e 3 do domínio VH que contém a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº 17 e FR1, 2€ 3 de um segmento genético IGHV1-69 (ou, opcionalmente, IGHV1-46) humano e VL que compreende CDR1, 2 e 3 do domínio VL que contém a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº 18 e FR1, 2 e 3 de um segmento genético IGKV1-33 humano; Cc. VH que compreende CDR1, 2 e 3 do domínio VH que contém a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº 19 e FR1, 2 e 3 de um segmento genético IGHV7-4-1 humano e VL que compreende CDR1,2e3 do domínio VL que contém a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº e FR1, 2 e 3 de um segmento genético IGKV7-3 humano; e d. VH que compreende CDR1, 2 e 3 do domínio VH que contém a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº 21 e FR1, 2e 3 de um segmento genético IGHV7-4-1 humano (opcionalmente, em combinação com segmento genético IGHJ6) e VL que compreende CDR1, 2 e 3 do domínio VL que contém a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº 22 e FR1,2 e 3 de um segmento genético IGKV1-39 humano.

[0086] Em qualquer aspecto, um anticorpo ou domínio de ligação de antígenos pode compreender VH e VL, em que cada um dentre VH e VL compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica ao VH e VL correspondente de qualquer um dos anticorpos: MALA HOLO, MALA HOL1, MALA HOL2, mALA H1LO, mAbLA H1L1,

MAbA H1L2 mAbA H2LO0, MALA H2L1, MALA H2L2, mALA H3LO, mALA H3L1 ou mAbA H3L2.

[0087] Em qualquer aspecto, um anticorpo ou domínio de ligação de antígenos pode compreender VH e VL, em que cada um dentre VH e VL compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica ao VH e VL correspondente de qualquer um dos anticorpos: MAbB HOLO, mALB HOL1, mALB HOL2, mALB H1LO, mALB H1L1, mMAbB H1L2, mAbB H2LO, mALB H2L1, mALB H2L2, mAbB H3LO, mMAbLB H3L1, mMAbB H3L2, mMAbB H4LO, mAbB H4L1, mALB H4L2, mAbB H5LO, mALB H5L1 ou mAbB H5L2.

[0088] Em qualquer aspecto, um anticorpo ou domínio de ligação de antígenos pode compreender VH e VL, em que cada um dentre VH e VL compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica ao VH e VL correspondente de qualquer um dos anticorpos: MAbC HOLO, mAbC HOL1, MAbC H1LO, MAbC H1L1, mAbC H2L0, MAbC H2L1, mAbC H3LO ou mAbC H3L1.

[0089] Em qualquer aspecto, um anticorpo ou domínio de ligação de antígenos pode compreender VH e VL, em que cada um dentre VH e VL compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica ao VH e VL correspondente de qualquer um dos anticorpos: MAbD HOLO, mAbD HOL1, mAbD HOL2, mAbD H1LO, mAbD H1L1, mMAbD H1L2, mAbD H2L0, MALD H2L1 ou mAbLD H2L2.

[0090] As sequências de VH e VL correspondentes desses anticorpos são relacionadas na Tabela C e na parte B do Exemplo 2.

[0091] Em uma realização, MAPA VH pode compreender uma substituição de aminoácidos no resíduo 26 (FR1 de Kabat), 27 (FR1 de Kabat), 74 (FR3 de Kabat) e/ou 98 (FR3 de Kabat) de SEQ ID Nº 15 (ou na posição correspondente de acordo com a numeração de Kabat).

[0092] Em uma realização, MAPA VH compreende tirosina na posição Kabat 26 (por exemplo, substituição G26Y) e/ou fenilalanina na posição 27 (por exemplo, substituição G27F). Em uma realização, MALA VH compreende arginina na posição Kabat 74 (por exemplo, substituição E74R). Em uma realização, MAPA VH compreende asparagina na posição Kabat 98 (por exemplo, substituição R98N).

[0093] Em uma realização, MAPA VL pode compreender uma substituição de aminoácidos no resíduo Kabat 44 (FR2 de Kabat) e/ou 71 (FR3 de Kabat). Em uma realização, MAPA VL compreende isoleucina na posição Kabat 44 (por exemplo, substituição K44/)). Em uma realização, MALA VL compreende tirosina na posição Kabat 71 (por exemplo, substituição D71Y).

[0094] EM uma realização, mMAPB VH compreende uma substituição em cadeia principal em 1, 2, 3 ou 4 dos resíduos de Kabat 26, 27, e/ou 74. Em uma realização, MmAbB VH compreende uma substituição em CDR em 1, 2 ou 3 dentre os resíduos de Kabat 34, 61 e/ou 66 (ou na posição correspondente de acordo com a numeração de Kabat). Em uma realização, mMAbB VH compreende valina na posição Kabat 26 e/ou tirosina na posição 27 (FR1 de Kabat). Em uma realização, mMmAPB VH compreende treonina na posição Kabat 30 (FR1 de Kabat). Em uma realização, mALDB VH compreende lisina na posição Kabat 74 (FR3 de Kabat). Em uma realização, mAbB VH compreende isoleucina na posição Kabat 34 (CDR1 de Kabat) (por exemplo, substituição M341). Em uma realização, MAPB VH compreende alanina na posição Kabat 61 (CDR2 de Kabat) (por exemplo, substituição N61A). Em uma realização, MALDB VH compreende glicina na posição Kabat 66 (CDR2 de Kabat) (por exemplo, substituição T66G).

[0095] Em uma realização, mAbB VL pode compreender uma substituição de aminoácidos no resíduo Kabat 24 (CDR1 de Kabat) e/ou 71 (FR3 de Kabat). Em uma realização, mMAPbB VL compreende glutamina na posição Kabat 24 (por exemplo, substituição R24Q). Em uma realização, mAbB VL compreende tirosina na posição Kabat 71 (por exemplo, substituição F71Y).

[0096] EM uma realização, MADC VH compreende uma substituição de aminoácidos no resíduo Kabat 39 (FR2 de Kabat), 91 (FR3 de Kabat) e/ou 93 (FR3 de Kabat). Em uma realização, MADC VH compreende ácido glutâmico na posição Kabat 39 (por exemplo, substituição Q39E). Em uma realização, MADC VH compreende fenilalanina na posição Kabat 91 (por exemplo, substituição Y91F). Em uma realização, MADC VH compreende valina na posição Kabat 93 (por exemplo, substituição A93V).

[0097] EM uma realização, MADC VL compreende uma substituição de aminoácidos no resíduo Kabat 68 (FR3 de Kabat). Em uma realização, MAbC VL compreende arginina na posição Kabat 68 (por exemplo, substituição G69R).

[0098] EM uma realização, MALD VH compreende uma substituição de aminoácidos no resíduo Kabat 46 (FR2 de Kabat) e/ou 95 (FR3 de Kabat). Em uma realização, MALD VH compreende lisina na posição Kabat 46 (por exemplo, substituição E46K). Em uma realização, MALD VH compreende fenilalanina na posição Kabat 95 (por exemplo, substituição Y95F).

[0099] EM uma realização, MAPD VL compreende uma substituição de aminoácidos no resíduo Kabat 46 (FR2 de Kabat) e/ou 63 (FR3 de Kabat). Em uma realização, MALD VL compreende fenilalanina na posição Kabat 46 (por exemplo, substituição L46F). Em uma realização, mAbD VL compreende arginina na posição Kabat 63 (por exemplo, substituição S63R).

[00100] Em um aspecto de qualquer uma das realizações da presente invenção, a ligação a Siglec pode ser especificada como sendo ligada a Siglec celular, em que o Siglec é expresso na superfície de uma célula, tal como Siglec celular nativo ou modificado, Siglec expresso por células hospedeiras recombinantes, Siglec expresso por célula NK, célula T CD8 etc.

[00101] Em qualquer realização, o anticorpo pode ser especificado como sendo um fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmento de anticorpo que compreende 1, 2 ou 3 CDRs VH e/ou VL, fragmento de anticorpo que compreende domínio VH e/ou VL ou fragmento de anticorpo que compreende região hipervariável ou domínio de ligação de anticorpo) ou proteína que compreende esse fragmento de anticorpo. A presente invenção também fornece um ácido nucleico que codifica o anticorpo ou fragmento de anticorpo humano ou humanizado que possui qualquer uma das propriedades acima, um vetor que compreende esse ácido nucleico, uma célula que compreende esse vetor e um método de produção de anticorpos anti-Siglec humanos, que compreende o cultivo dessa célula sob condições apropriadas para expressão do anticorpo anti-Siglec ou fragmento de anticorpo (ou proteína que o compreende). A presente invenção também se refere a composições, tais como kits e composições farmaceuticamente aceitáveis, que compreendem essas proteínas, ácidos nucleicos, vetores e/ou células e tipicamente um ou mais ingredientes adicionais que podem ser ingredientes ativos ou ingredientes inativos que promovem a formulação, fornecimento, estabilidade ou outras características da composição (por exemplo, várias portadoras). A presente invenção refere-se ainda a diversos métodos novos e úteis que elaboram e utilizam esses anticorpos, ácidos nucleicos, vetores, células, organismos e/ou composições, por exemplo, na modulação de atividades biológicas mediadas por Siglec, por exemplo, no tratamento de doenças relacionadas, notadamente cânceres e doenças infecciosas.

[00102] A presente invenção também fornece um método in vitro de modulação da atividade de linfócitos que expressam Siglec-7 e/ou Siglec-9, opcionalmente células NK e/ou células T CD8+, em que o método compreende a colocação de linfócitos (por exemplo, células NK primárias) que expressam na sua superfície Siglec-7 e/ou Siglec-9 em contato com um anticorpo que neutraliza a atividade inibidora de Siglec-7 e Siglec-9.

[00103] A presente invenção também fornece um método de potencialização e/ou modulação da atividade de linfócitos (por exemplo, células NK e células T CD8+) em pacientes dele necessitados, tal como um método de potencialização da atividade de células NK por meio da modulação de células NK CD56*"" (o principal subconjunto citotóxico) e, opcionalmente, células NK CD56Gtrihante adicionais (a maior parte das células NK em nódulos linfáticos e amídalas e que, mediante ativação, reagem principalmente com a produção de citoquinas), em que esse método compreende a administração ao paciente de quantidade eficaz de qualquer uma das composições acima. Em uma realização, o paciente é um paciente que sofre de câncer. O paciente pode, por exemplo, sofrer de câncer hematopoiético, tal como leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, mieloma múltiplo ou linfoma não de Hodgkin. Alternativamente, o paciente pode sofrer, por exemplo, de tumor sólido, tal como câncer colorretal, câncer renal, câncer do ovário, câncer do pulmão, câncer de mama ou melanoma maligno. Em outra realização, o paciente é um paciente que sofre de doença infecciosa.

[00104] Estes aspectos são descritos mais completamente no relatório descritivo da presente invenção e aspectos, características e vantagens adicionais serão evidentes a partir dele.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00105] A Figura 1 exibe a ligação de anticorpos anti-Siglec a células NK. MFI Siglec: média da intensidade de fluorescência. Uma fração significativa (cerca de 44%) de células NK expressou Siglec-7 e Siglec-9, o que sugere que uma grande proporção de células NK pode ser inibida por cada um desses receptores (ou ambos), em função dos ligantes de glicano presentes, por exemplo, sobre células de tumores.

[00106] A Figura 2 exibe resultados representativos de citometria de fluxo para exemplos de anticorpos que se ligam a Siglec-7, mas não Siglec-9 ou Siglec de cynomolgus (painel direito), que se ligam a cada um dentre Siglec-7, Siglec-9 e Siglec de cynomolgus (painel intermediário) e que se ligam a Siglec-9, mas não Siglec-7 ou Siglec de cynomolgus (painel esquerdo).

[00107] A Figura 3 exibe titulação por meio de ligação por citometria de fluxo de anticorpos mMAPbA, mAbC e mAbD a moDC (painel esquerdo) e moDC tratado com neuramidase (painel direito), acompanhada pelos seus valores ECs5o correspondentes. A ECro foi altamente aprimorada (10 vezes) após tratamento com neuraminidase, o que sugere que Siglec-9 expresso sobre moDCs foi acionado em interação cis com seus ligantes de ácido siálico antes do tratamento com neuraminidase. O nível de fase estável, entretanto, não é modificado, o que sugere que os anticorpos podem ligar todas as conformações de Siglec-9 (ligado e não ligado) sobre a superfície celular e inibem interações cis e sinalização em monoDCs, bem como em outros tipos celulares (por exemplo, monócitos e macrófagos M1 e M2).

[00108] A Figura 4 exibe indução dependente de dosagem de aumento da citotoxicidade de Siglec-9* YTS entre anticorpos reativos a Siglec-7 e 9 (Figura 4B) e entre os anticorpos monoespecífico Siglec-9 (sem ligação a Siglec-7) (Figura 4A).

[00109] A Figura 5 exibe o amento da citotoxicidade de células NK primárias mediada por anticorpo MALA, mAbC, mAbLD, mAbLE e MAbF em dois doadores humanos diferentes (doadores D1 (painel esquerdo) e D?2 (painel direito)) em um teste de liberação de *ºCr clássico, utilizando células NK primárias (como células NK novas purificadas de doadores) e células de câncer colorretal HT29.

[00110] A Figura 6 exibe aumento do percentual de células

NK positivas para Siglec-9 que expressam CD137 mediado por diversos anticorpos anti-Siglec-9 e anti-Siglec-7/9 mAbA, mAbB, mAbF, mAb6 e mAb4 em um doador humano, na presença de células de tumores HT29. Os anticorpos anti-Siglec-9 restauraram totalmente a citotoxicidade de células NK humanas primárias que expressam Siglec-9 até o nível observado em células NK humanas primárias negativas para Siglec-9 do mesmo doador.

[00111] A Figura 7 demonstra que os anticorpos MALA e mMAb1 induzem aumento das células NK CD137+ positivas para Siglec-9 (%) (painel intermediário), mas não células NK CD137+ negativas para Siglec-9 (%) (painel direito). O percentual de NK que expressa CD137 na ausência de anticorpos é exibido no painel esquerdo.

[00112] A Figura 8 exibe ligação de proteína Siglec-9-Fc a células de Ramos na presença de anticorpos (painel superior). Cada um dos mAbs anti-Siglec-9 mAbA, mAbB, mAbC e mAbD inibiu a ligação de proteína Siglec-9-Fc às células de Ramos, enquanto mMAbE exibiu inibição parcial e mMAbF não inibiu a ligação. A ligação de proteína Siglec-9-Fc a células K562 na presença de anticorpos é exibida no painel inferior. Cada um dos mAbs anti- Siglec-9 mAbA, mAbB, mAbC e mAbD inibiu a ligação de proteína Siglec-9-Fc às células de Ramos, enquanto mAbE e mAbF exibiram inibição parcial.

[00113] As Figuras 9 e 10 exibem o teste de bloqueio da interação entre Siglec-7 e 9 e ligantes sialilados por anticorpos anti-Siglec-7/9 utilizando testes ELISA. A Figura 9 demonstra que mAbs 1, 2,4, 5e 6 bloquearam a interação de Siglec-7 com Sia2, ao contrário de mAb3. A Figura demonstra que todos os mAbs bloqueiam a interação de Siglec-9 com Sia2, enquanto mMAb1, mAb2 e mAb3 exibiram baixa capacidade de inibição da interação de Siglec-9 com Sia1 e, portanto, não bloquearam substancialmente a interação de Sia1.

[00114] As Figuras 11-14 exibem a proteína Siglec-9 humana. A Figura 11A exibe a estrutura do domínio similar a lg conjunto V N- terminal Siglec-9, com os resíduos substituídos em mutante Siglec-9 M9, M10 e M11 exibidos em sombreamento escuro; a Figura 11B exibe resíduos substituídos em mutantes Siglec-9 M7, M9, M10 e M11; e a Figura 11C exibe resíduos substituídos em mutantes de Siglec-9 M8, M9, M10 e M11. A Figura 12 exibe a estrutura do domínio similar a Ig conjunto V N-terminal de Siglec-9, com os resíduos substituídos em mutante de Siglec-9 M6 e M7 exibidos em tom escuro. A Figura 13A exibe a estrutura do domínio similar a Ig conjunto V N-terminal de Siglec-9, com os resíduos substituídos em mutante de Siglec-9 M16 exibidos em tom escuro. A Figura 13B exibe os resíduos substituídos em mutantes de Siglec-9 M14 e M16. A Figura 14A exibe os resíduos substituídos em mutante de Siglec-9 M8 exibidos em sombreamento escuro. A Figura 14B exibe os resíduos substituídos em mutantes de Siglec-9 M8, M14, M15 e M16. Em cada uma das Figuras 11-14, o local de ligação de ligante de ácido siálico é exibido em tom claro.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00115] Definições:

[00116] Da forma utilizada na presente invenção, “um” ou “uma” pode indicar um(a) ou mais. Da forma utilizada nas reivindicações, quando utilizadas em conjunto com a expressão “que compreende”, as palavras “um” ou “uma” podem indicar um(a) ou mais de um(a). Da forma utilizada no presente, “outro” pode indicar pelo menos um segundo ou mais.

[00117] “Que compreende”, quando utilizado, pode ser opcionalmente substituído por “que consiste essencialmente de" ou por “que consiste de”.

[00118] Siglec-7 humano (exibido no número de acesso Genbank NP 055200.1, cuja descrição completa é incorporada ao presente como referência) é um membro da família de Siglec relativa a CD33 (Angata e

Varki, Glycobiology 10 (4), 431-438 (2000)). Siglec-7 humano compreende 467 aminoácidos, que possuem a sequência de aminoácidos a seguir:

MLLLLLLPLL WGRERVEGQK SNRKDYSLTM QOSSVTVQEGM CVHVRCSFSY PVDSQTDSDP VHGYWFRAGN DISWKAPVAT NNPAWAVQEE TRDRFHLLGD PQTKNCTLSI RDARMSDAGR YFFRMEKGNI KWNYKYDOQLS VNVTALTHRP NILIPGTLES GCFQNLTCSV PWACEQGTPP MISWMGTSVS PLHPSTTRSS VLTLIPQPQH HGTSLTCQVT LPGAGVTTNR TIQLNVSYPP QNLTVTVFOG EGTASTALGN SSSLSVLEGQ SLRLVCAVDS NPPARLSWTW RSLTLYPSQP SNPLVLELQV HLGDEGEFTC RAQNSLGSQH VSLNLSLQOQE YTGKMRPVSG VLLGAVGGAG ATALVFLSFC VIFIVVRSCR KKSARPAADV GDIGMKDANT IRGSASQGNL

TESWADDNPR HHGLAAHSSG EEREIQYAPL SFHKGEPQDL SGQEATNNEY SEIKIPK (SEQ ID Nº 1).

[00119] Siglec-9 humano (exibido no número de acesso Genbank NPO55256.1, cuja descrição completa é incorporada ao presente como referência) é um membro da família de Siglec relativa a CD33 (Angata e Varki, J. Biol. Chem. 275 (29), 22127-22135 (2000)). Siglec-9 humano compreende 463 aminoácidos, que possuem a sequência de aminoácidos a seguir:

MLLLLLPLLW GRERAEGQTS KLLTMQSSVT VQEGLCVHVP CSFSYPSHGW IYPGPVVHGY WFREGANTDO DAPVATNNPA RAVWEETRDR FHLLGDPHTK NCTLSIRDAR RSDAGRYFFR MEKGSIKWNY KHHRLSVNVT ALTHRPNILI PGTLESGCPQ NLTCSVPWAC EQGTPPMISW IGTSVSPLDP STTRSSVLTL IPQPQDHGTS LTCQVTFPGA SVTTNKTVHL NVSYPPQNLT MTVFQGDGTV STVLGNGSSL SLPEGOSLRL VCAVDAVDSN PPARLSLSWR GLTLCPSQPS NPGVLELPWV HLRDAAEFTC RAQNPLGSQQ VYLNVSLOSK ATSGVTQGVV GGAGATALVF LSFCVIFVVV RSCRKKSARP AAGVGDTGIE DANAVRGSAS QGPLTEPWAE

DSPPDQPPPA SARSSVGEGE LOYASLSFQM VKPWDSRGQE ATDTEYSEIK IHR (SEQ ID Nº 2).

[00120] No contexto da presente invenção, “neutralizar a inibição mediada por Siglec da citotoxicidade de células NK”, “neutralizar a inibição mediada por Siglec da citotoxicidade de células T" ou “neutralizar a atividade inibidora de Siglec" indicam um processo no qual Siglec (por exemplo, Siglec-7 e Siglec-9) tem inibida sua capacidade de prejudicar processos intracelulares, gerando reações de linfócitos, tais como liberação de citoquinas e reações citotóxicas. Isso pode ser medido, por exemplo, em um teste de citotoxicidade com base em células T ou NK padrão, no qual é medida a capacidade de um composto terapêutico de estimular a morte de células positivas para ligante ácido siálico por linfócitos positivos para Siglec. Em uma realização, preparações de anticorpos causam aumento de pelo menos 10% da citotoxicidade de um linfócito restrito por Siglec, opcionalmente aumento de pelo menos 40% ou 50% da citotoxicidade de linfócitos ou, opcionalmente, aumento de pelo menos 70% da citotoxicidade de NK, com referência aos testes de citotoxicidade descritos. Em uma realização, preparações de anticorpos causam aumento de pelo menos 10% da liberação de citoquina por um linfócito restrito por Siglec, opcionalmente aumento de pelo menos 40% ou 50% da liberação de citoquinas ou, opcionalmente, aumento de pelo menos 70% da liberação de citoquinas, com referência aos testes de citotoxicidade descritos. Em uma realização, uma preparação de anticorpos causa aumento de pelo menos 10% da expressão da superfície celular de um marcador da citotoxicidade (por exemplo, CD107 e/ou CD137) por linfócitos restritos por Siglec, opcionalmente aumento de pelo menos 40% ou 50% ou, opcionalmente, aumento de pelo menos de 70% da expressão da superfície celular de um marcador da citotoxicidade (por exemplo, CD107 e/ou CD137).

[00121] A capacidade de um anticorpo anti-Siglec de “bloquear” a ligação de uma molécula de Siglec a um ligante de ácido siálico indica que o anticorpo, em um teste que utiliza moléculas de ácido siálico e Siglec associadas à superfície celular ou solúveis, pode reduzir de forma detectável a ligação de uma molécula de Siglec a uma molécula de ácido siálico em forma dependente de dosagem, em que a molécula de Siglec liga-se de forma detectável à molécula de ácido siálico na ausência do anticorpo.

[00122] Sempre que, no presente relatório descritivo, mencionar-se “tratamento de câncer" ou similar com referência a agentes de ligação anti-Siglec (por exemplo, anticorpo), indica-se: (a) método de tratamento de câncer, em que o mencionado método compreende a etapa de administração (para pelo menos um tratamento) de agente de ligação anti- Siglec (preferencialmente em material veículo farmaceuticamente aceitável) a um indivíduo, mamífero, especialmente ser humano, necessitado desse tratamento, em dose que permita o tratamento de câncer (quantidade terapeuticamente eficaz), preferencialmente em dose (quantidade) especificada no presente; (b) uso de um agente de ligação anti-Siglec para o tratamento de câncer ou um agente de ligação anti-Siglec, para uso no mencionado tratamento (especialmente em seres humanos); (c) uso de agente de ligação anti-Siglec para fabricação de preparações farmacêuticas para o tratamento de câncer, método de uso de agentes de ligação anti-Siglec para fabricação de preparações farmacêuticas para o tratamento de câncer, que compreende a mistura de um agente de ligação anti-Siglec com veículo farmaceuticamente aceitável ou preparação farmacêutica que compreende dose eficaz de agente de ligação anti-Siglec que é apropriada para o tratamento de câncer; ou (d) qualquer combinação de (a), (b) e (c), de acordo com o objeto patenteável nos países em que o presente pedido for depositado.

[00123] Da forma utilizada no presente, a expressão “domínio de ligação de antígenos” designa um domínio que compreende uma estrutura tridimensional capaz de ligar-se de forma imunoespecífica a um epítopo. Em uma realização, portanto, o mencionado domínio pode compreender uma região hipervariável, opcionalmente um domínio VH e/ou VL de uma cadeia de anticorpos, opcionalmente pelo menos um domínio VH. Em outra realização, o domínio de ligação pode compreender pelo menos uma região de determinação da complementaridade (CDR) de uma cadeia de anticorpos. Em outra realização, o domínio de ligação pode compreender um domínio de polipeptídeo de uma construção não de imunoglobulina.

[00124] Os termos “anticorpo” ou “imunoglobulina”, utilizados de forma intercambiável no presente, incluem anticorpos completos e qualquer fragmento de ligação de antígenos ou suas cadeias isoladas. Um anticorpo típico compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida por uma região variável de cadeia leve (V.) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida por um domínio, CL. Um exemplo de unidade estrutural de imunoglobulina (anticorpo) compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeos, em que cada par possui uma cadeia “leve” (cerca de 25 kDa) e uma cadeia “pesada” (cerca de 50-70 kDa). O terminal N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos que é principalmente responsável pelo reconhecimento de antígenos. As expressões cadeia leve variável (V.) e cadeia pesada variável (VH) designam essas cadeias leve e pesada, respectivamente. Os domínios constantes de cadeia pesada correspondentes às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados “alfa”, “delta”, “épsilon”, “gama” e “mv”, respectivamente. Vários destes são adicionalmente divididos em subclasses ou isótipos, tais como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e similares. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. IgGs são exemplos de classes de anticorpos empregados no presente, pois são os anticorpos mais comuns na situação fisiológica e são mais facilmente preparados em ambiente de laboratório. Opcionalmente, o anticorpo é anticorpo monoclional. Exemplos específicos de anticorpos são anticorpos humanizados, quiméricos, humanos ou apropriados de outra forma para seres humanos. “Anticorpos” também inclui qualquer fragmento ou derivado de qualquer um dos anticorpos descritos no presente.

[00125] Anticorpo anti-Siglec com “reação cruzada” é um anticorpo que liga mais de uma molécula de Siglec com especificidade e/ou afinidade. Anticorpos monoclonais podem, por exemplo, sofrer reação cruzada com Siglec-7 e Siglec-9.

[00126] A expressão “liga-se especificamente a” indica que um anticorpo pode ligar-se preferencialmente em um teste de ligação competitiva ao parceiro de ligação, tal como Siglec-7 e Siglec-9, conforme determinado utilizando-se formas recombinantes das proteínas, seus epítopos ou proteínas nativas presentes sobre a superfície de células alvo isoladas. Testes de ligação competitiva e outros métodos de determinação de ligação específica são adicionalmente descritos abaixo e são bem conhecidos na técnica.

[00127] Quando se afirmar que um anticorpo “concorre com” um anticorpo monoclonal específico, indica-se que o anticorpo concorre com o anticorpo monoclonal em um teste de ligação utilizando moléculas Siglec recombinantes ou moléculas Siglec expressas na superfície. Caso um anticorpo de teste reduza a ligação de um anticorpo de referência a um polipeptídeo Siglec ou célula que expressa Siglec em um teste de ligação, por exemplo, afirma-se que o anticorpo “concorre”, respectivamente, com o anticorpo de referência.

[00128] O termo “afinidade”, da forma utilizada no presente, indica a força da ligação de um anticorpo a um epítopo. A afinidade de um anticorpo é fornecida pela constante de dissociação Kd, definida como [Ab] x [Ag] / [Ab-Ag], em que [Ab-Ag] é a concentração molar do complexo de anticorpo e antígeno, [Ab] é a concentração molar do anticorpo não ligado e [Ag] é a concentração molar do anticorpo não ligado. A constante de afinidade Ka é definida por 1/Kd. Métodos de determinação da afinidade de mAbs podem ser encontrados em Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova lorque, 1988), Coligan et al, eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. e Wiley Interscience, Nova lorque (1992, 1993) e Muller, Meth. Enzymol. 92: 589-601 (1983) e essas referências são integralmente incorporadas ao presente como referência. Um método padrão bem conhecido na técnica para determinar a afinidade de mAbs é o uso de seleção por ressonância de plasma da superfície (SPR) (tal como por meio de análise com um dispositivo analítico SPR

BIAcoreO).

[00129] Dentro do contexto do presente, “determinante” designa um local de interação ou ligação sobre um polipeptídeo.

[00130] O termo “epítopo” designa um determinante antigênico e é a área ou região sobre um antígeno à qual se liga um anticorpo. Um epítopo de proteína pode compreender resíduos de aminoácidos envolvidos diretamente na ligação, bem como resíduos de aminoácidos que são efetivamente bloqueados pelo peptídeo ou anticorpo de ligação de antígenos específico, ou seja, resíduos de aminoácidos dentro da “pegada” do anticorpo. É a forma mais simples ou a menor área estrutural em uma molécula de antígeno de complexo que pode combinar-se, por exemplo, com um anticorpo ou receptor. Os epítopos podem ser lineares ou estruturais/de conformação. A expressão “epítopo linear” é definida como um epítopo composto de resíduos de aminoácidos que são contíguos sobre a sequência linear de aminoácidos (estrutura primária). A expressão “epítopo estrutural ou de conformação” é definida como um epítopo composto de resíduos de aminoácidos que não são todos contíguos e, portanto, representam partes separadas da sequência linear de aminoácidos que são colocados em proximidade entre si por meio de dobra da molécula (estruturas secundárias, terciárias e/ou quaternárias). O epítopo de conformação é dependente da estrutura tridimensional. A expressão “de conformação” é, portanto, frequentemente utilizada de forma intercambiável com “estrutural”.

[00131] O termo “esgotar” ou “esgotamento”, com relação a células que expressam Siglec (por exemplo, linfócitos que expressam Siglec-7 ou Siglec-9) indica um processo, método ou composto que resulta na morte, eliminação, lise ou indução dessa morte, eliminação ou lise, de forma a prejudicar a quantidade dessas células que expressam Siglec presentes em amostras ou em pacientes. “Não esgotador”, com referência a um processo,

método ou composto, indica que o processo, método ou composto não é esgotador.

[00132] O termo “agente” é utilizado no presente para indicar um composto químico, mistura de compostos químicos, macromolécula biológica ou extrato feito de materiais biológicos. A expressão “agente terapêutico” indica um agente que possui atividade biológica.

[00133] Para os propósitos do presente, anticorpo “humano” ou “humanizado” indica um anticorpo no qual a região de cadeia principal constante e variável de uma ou mais imunoglobulinas humanas é fundida com a região de ligação, tal como CDR, de imunoglobulina animal. Esses anticorpos são projetados para manter a especificidade de ligação do anticorpo não humano do qual são derivadas as regiões de ligação, mas para evitar reação imunológica contra o anticorpo não humano. Esses anticorpos podem ser obtidos a partir de camundongos transgênicos ou outros animais que tenham sido “elaborados” para produzir anticorpos humanos específicos em resposta a desafio antigênico (vide, por exemplo, Green et al (1994), Nature Genet. 7: 13; Lonberg et al (1994), Nature 368: 856; Taylor et al (1994), Int. Immun. 6: 579, cujos ensinamentos completos são incorporados ao presente como referência). Anticorpos totalmente humanos podem também ser construídos por meio de métodos de transfecção genética ou cromossômica, bem como tecnologia de exibição de fagos, todos os quais são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, McCafferty et al (1990), Nature 348: 552-553). Anticorpos humanos podem também ser gerados por células B ativadas in vitro (vide, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas nº 5.56/7.610 e 5.229.275, que são integralmente incorporadas como referência).

[00134] “Anticorpo quimérico” é uma molécula de anticorpo na qual (a) a região constante ou uma de suas partes é alterada, substituída ou trocada, de forma que o local de ligação de antígenos (região variável) seja ligado a uma região constante com classe, função efetora e/ou espécie diferente ou alterada ou uma molécula totalmente diferente que confere novas propriedades ao anticorpo quimérico, tal como uma enzima, toxina, hormônio, fator de crescimento, droga etc.; ou (b) a região variável, ou uma de suas partes, é alterada, substituída ou modificada por uma região variável que possui especificidade de antígeno diferente ou alterada.

[00135] A expressão “região hipervariável”, quando utilizada no presente, indica os resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antígenos. A região hipervariável geralmente compreende resíduos de aminoácidos de uma “região de determinação da complementaridade” ou “CDR” (por exemplo, resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95- 102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al, 1991) e/ou os resíduos de um “circuito hipervariável" (por exemplo, resíduos 26-32 (L1), 50- 52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 1987; 196: 901-917) ou um sistema similar para determinar aminoácidos essenciais responsáveis pela ligação de antígenos. Tipicamente, a numeração de resíduos de aminoácidos nessa região é realizada por meio do método descrito em Kabat et al, acima. Expressões como “posição de Kabat”, “numeração de resíduos de domínio variável como em Kabat” e “de acordo com Kabat” no presente indicam este sistema de numeração para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve. Utilizando o sistema de numeração de Kabat, a sequência de aminoácidos linear real de um peptídeo pode conter mais ou menos aminoácidos correspondentes à redução ou inserção em FR ou CDR do domínio variável. Domínio variável de cadeia pesada pode incluir, por exemplo, um único inserto de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de CDR H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b, 82c etc. de acordo com Kabat) após o resíduo de FR de cadeia pesada 82. A numeração de resíduos de Kabat pode ser determinada para um dado anticorpo por meio de alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com sequência numerada de Kabat “padrão”.

[00136] Resíduos de “cadeia principal” ou “FR”, da forma utilizada no presente, indicam a região de um domínio variável de anticorpo exclusiva das regiões definidas como CDRs. Cada cadeia principal de domínio variável de anticorpo pode ser adicionalmente subdividida nas regiões contíguas separadas pelas CDRs (FR1, FR2, FR3 e FR4).

[00137] As expressões “domínio Fc”, “porção Fc" e "região Fc" designam um fragmento C-terminal de uma cadeia pesada de anticorpo, por exemplo, cerca do aminoácido (aa) 230 até cerca de aa 450 de cadeia pesada y (gama) humana ou sua sequência correspondente em outros tipos de cadeias pesadas de anticorpos (por exemplo, a, 5, e e 4 para anticorpos humanos) ou um de seus alótipos de ocorrência natural. A menos que especificado em contrário, a numeração de aminoácidos de Kabat comumente aceita para imunoglobulinas é utilizada ao longo de todo o presente relatório descritivo (vide Kabat et al (1991), Sequences of Protein of Immunological Interest, 5º ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda MD).

[00138] As expressões “isolado”, “purificado” ou “biologicamente puro” designam material que é substancial ou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanham conforme encontrado no seu estado nativo. A pureza e a homogeneidade são tipicamente determinadas utilizando-se métodos de química analítica, tais como eletroforese de gel de poliacrilamida ou cromatografia de líquidos de alto desempenho. Uma proteína que é a espécie predominante presente em uma preparação é substancialmente purificada.

[00139] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são utilizados de forma intercambiável no presente para designar um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são imitação química artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como polímeros de aminoácidos de ocorrência natural e polímeros de aminoácidos não de ocorrência natural.

[00140] O termo “recombinante”, quando utilizado com referência, por exemplo, a uma célula, ácido nucleico, proteína ou vetor, indica que a célula, ácido nucleico, proteína ou vetor foi modificada pela introdução de uma proteína ou ácido nucleico heterólogo ou pela alteração de uma proteína ou ácido nucleico nativo, ou que a célula é derivada de uma célula modificada desta forma. Células recombinantes, por exemplo, expressam, portanto, genes que não são encontrados dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que, de outra forma, são expressos de forma anormal, subexpressos ou não são expressos.

[00141] Dentro do contexto do presente, o termo anticorpo que “liga” um polipeptídeo ou epítopo designa um anticorpo que liga o mencionado determinante com afinidade e/ou especificidade.

[00142] O termo “identidade” ou “idêntico”, quando utilizado em relação entre as sequências de dois ou mais polipeptídeos, designa o grau de relação de sequências entre polipeptídeos, conforme determinado pela quantidade de coincidências entre conjuntos de dois ou mais resíduos de aminoácidos. “Identidade” mede o percentual de coincidências idênticas entre a menor dentre duas ou mais sequências com alinhamentos de intervalos (se houver) abordados por um modelo matemático ou programa de computador específico (ou seja, “algoritmos”). A identidade de polipeptídeos relacionados pode ser facilmente calculada por meio de métodos conhecidos. Esses métodos incluem, mas sem limitações, os descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nova lorque, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W,., ed, Academic Press, Nova lorque, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M. e Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nova Jérsei, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nova lorque, 1991; e Carillo et al, SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988).

[00143] Métodos de determinação da identidade são projetados para fornecer a maior coincidência entre as sequências testadas. Métodos de determinação da identidade são descritos em programas de computador disponíveis ao público. Métodos de programas de computador para determinar a identidade entre duas sequências incluem o pacote de programas GCG, que inclui GAP (Devereux et al, Nucl. Acid Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). O programa BLASTX é disponível ao público por meio do National Center for Biotechnology Information (NCBI) e outras fontes (BLAST Manual, Altschul et al, NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al, acima). O conhecido algoritmo de Smith Waterman pode também ser utilizado para determinar a identidade.

PRODUÇÃO DE ANTICORPOS:

[00144] Os agentes anti-Siglec úteis para o tratamento de doenças (por exemplo, câncer e doenças infecciosas) ligam uma parte extracelular da proteína Siglec-9 humana (e, opcionalmente, ligam adicionalmente a proteína Siglec-7 humana, com ou sem ligação de Siglec-12 adicional) e reduz a atividade inibidora do Siglec humano expresso sobre a superfície de uma célula imune positiva para Siglec. Em uma realização, o agente inibe a capacidade de uma molécula de ácido siálico de causar sinalização inibidora por Siglec em neutrófilos, células dendríticas, macrófagos, macrófago M2, célula NK e/ou célula T CD8+.

[00145] Em uma realização, o agente anti-Siglec descrito no presente pode ser utilizado para aumentar a citotoxicidade de células NK e/ou neutrófilos em seres humanos ou de doadores humanos em direção a uma célula alvo (por exemplo, célula de câncer) que contém ligantes de Siglec. Células NK e neutrófilos são granulócitos especializados que reconhecem e matam diretamente micro-organismos e células de câncer. Demonstra-se que ácido siálico expresso na superfície de células de tumores reduz a citotoxicidade de células NK para células de tumores. Os anticorpos podem ser utilizados para aumentar a citotoxicidade de células NK, por exemplo, para restaurar o nível de citotoxicidade para substancialmente a observada em células NK ou neutrófilos que não expressam, na sua superfície, o Siglec específico.

[00146] Ácidos siálicos são também altamente expressos em células dendríticas e descreveu-se que eles modulam diversas funções DC, incluindo capacidade de reação a estímulo de TLR. O bloqueio da síntese de ácido siálico reduz o limite de ativação de moDCs para estímulo de TLR e exclusão de Siglec-E aumentou as reações de células dendríticas a diversos ligantes de TLR microbianos. Siglec-9 é o membro ortólogo humano mais próximo de Siglec-E em camundongos, o bloqueio de anticorpos anti-Siglec-9 pode ampliar a ativação de células dendríticas e modular interações de DC-T. A modificação de antígenos com ácidos siálicos regula a geração de células T reguladoras (Treg) específicas de antígenos e evita a formação de células T CD4+ e CD8+ efetoras por meio de células dendríticas. A capacidade fagocítica de células dendríticas pode ser também aprimorada por deficiência de ácido a2,6-siálico.

[00147] Siglec-7 e 9 são ambos expressos em macrófagos tipo M1 e M2 e descreveu-se que knockdown de Siglec-9 modula diversos marcadores da expressão na superfície (por exemplo, CCR7 e CD200R), o que sugere modulação das funções de macrófagos por Siglec-9. De fato, diversos mutantes de Siglec-9 (mutação no domínio ITIM) foram transfectados em linhagem de células de macrófagos e demonstrou-se que Siglec-9 aumenta a produção da citoquina anti-inflamatória IL-10. A ligação de Siglec-9 com um ligante solúvel pode também induzir macrófagos a induzir fenótipo similar a macrófago associado a tumor, com maior expressão do ligante de ponto de verificação PD-L1.

[00148] Em uma realização, o agente concorre com uma molécula de ácido siálico na ligação a Siglec, ou seja, o agente bloqueia a interação entre Siglec e um de seus ligantes de ácido siálico.

[00149] Em um aspecto da presente invenção, o agente é um anticorpo selecionado a partir de um anticorpo com comprimento total, fragmento de anticorpo e uma molécula derivada de anticorpo sintético ou semissintético.

[00150] Em um aspecto da presente invenção, o agente é um anticorpo selecionado a partir de um anticorpo totalmente humano, anticorpo humanizado e anticorpo quimérico.

[00151] Em um aspecto da presente invenção, o agente é um fragmento de anticorpo selecionado a partir de anticorpo IgA, IgD, IgG, IgE e IgM.

[00152] Em um aspecto da presente invenção, o agente é um fragmento de anticorpo que compreende um domínio constante selecionado a partir de I9G1, IgG2, IgG3 e IgG4.

[00153] Em um aspecto da presente invenção, o agente é um fragmento de anticorpo selecionado a partir de um fragmento de Fab, fragmento de Fab', fragmento de Fab'-SH, fragmento de F(ab)2, fragmento de F(ab')2, fragmento de Fv, lg de cadeia pesada (Ig de camelo ou lhama), fragmento de VHn, FV de domínio simples e fragmento de anticorpo de fita simples.

[00154] Em um aspecto da presente invenção, o agente é uma molécula derivada de anticorpo sintético ou semissintético selecionada a partir de scFv, dsFv, minicorpo, diacorpo, triacorpo, corpo capa e IgNAR; e anticorpo multiespeciífico.

[00155] A presente invenção refere-se, portanto, a anticorpos e domínios de ligação de antígenos (e polipeptídeos que compreendem os acima) que se ligam a Siglec. Em um aspecto, o anticorpo ou domínio de ligação de antígenos liga-se a Siglec-7 e/ou 9 com afinidade de ligação (por exemplo, KD) pelo menos 100 vezes menor que Siglec humano adicional, tal como Siglec-3, 5, 6, 8, 10, 11 e/ou 12. Em um aspecto, o anticorpo ou domínio de ligação de antígenos liga-se a Siglec-9, mas não a Siglec-7; em uma realização, o anticorpo liga-se a um polipeptídeo Siglec-9 humano com afinidade de ligação (por exemplo, KD) pelo menos 100 vezes menor que polipeptídeo Siglec-7 humano. Em outro aspecto, o anticorpo liga-se a um polipeptídeo Siglec-9 humano e a polipeptídeo Siglec-7 humano com afinidade de ligação (por exemplo, KD) que difere em não mais de 1 log entre si e as afinidades de ligação para o mencionado Siglec-7 e Siglec-9 são pelo menos 100 vezes menores que Siglec humano adicional, tal como Siglec-3, 5, 6, 8, 10, 11 e/ou 12. Pode-se determinar a afinidade, por exemplo, por meio de Ressonância de Plasma de Superfície, para ligação a polipeptídeos Siglec recombinantes.

[00156] Em um aspecto da presente invenção, o anticorpo encontra-se em forma purificada ou pelo menos parcialmente purificada. Em um aspecto da presente invenção, o anticorpo encontra-se em forma essencialmente isolada.

[00157] Os anticorpos podem ser produzidos por meio de uma série de métodos conhecidos na técnica. Tipicamente, eles são produzidos por meio de imunização de animais não humanos, preferencialmente camundongos, com um imunogene que compreende um polipeptídeo Siglec, preferencialmente polipeptídeo Siglec humano. O polipeptídeo Siglec pode compreender a sequência com comprimento total de polipeptídeo Siglec-9 e/ou Siglec-7 humano ou um de seus fragmentos ou derivados, tipicamente um fragmento imunogênico, ou seja, uma parte do polipeptídeo que compreende um epítopo exposto sobre a superfície de células que expressam um polipeptídeo Siglec. Esses fragmentos contêm tipicamente pelo menos cerca de sete aminoácidos consecutivos da sequência de polipeptídeos madura e, de preferência ainda maior, pelo menos cerca de dez de seus aminoácidos consecutivos. Os fragmentos tipicamente são essencialmente derivados do domínio extracelular do receptor. Em uma realização, o imunogene compreende um polipeptídeo Siglec humano do tipo selvagem em uma membrana de lipídios, tipicamente na superfície de uma célula. Em realização específica, o imunogene compreende células intactas, particularmente células humanas intactas, opcionalmente tratadas ou lisadas. Em outra realização, o polipeptídeo é um polipeptídeo Siglec recombinante.

[00158] A etapa de imunização de mamíferos não humanos com um antígeno pode ser conduzida de qualquer forma bem conhecida na técnica para estimular a produção de anticorpos em camundongos (vide, por exemplo, E. Harlow e D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988), cuja descrição completa é incorporada ao presente como referência) O imunogene é suspenso ou dissolvido em tampão, opcionalmente com um adjuvante, tal como adjuvante de Freund completo ou incompleto. Métodos de determinação da quantidade de imunogene, tipos de tampões e quantidades de adjuvante são bem conhecidos pelos técnicos no assunto e não são limitados de nenhuma forma. Esses parâmetros podem ser diferentes para diferentes imunogenes, mas são facilmente elucidados.

[00159] De forma similar, o local e a frequência de imunização suficientes para estimular a produção de anticorpos também são bem conhecidos na técnica. Em protocolos de imunização típicos, os animais não humanos recebem injeção intraperitoneal com antígeno no dia 1 e novamente cerca de uma semana mais tarde. Isso é seguido por injeções adicionais do antígeno perto do dia 20, opcionalmente com um adjuvante tal como adjuvante de Freund incompleto. As injeções adicionais são realizadas por via intravenosa e podem ser repetidas por vários dias consecutivos. Isso é seguido por uma injeção impulsionadora no dia 40, por via intravenosa ou intraperitoneal, tipicamente sem adjuvante. Este protocolo resulta na produção de células B produtoras de anticorpos específicos de antígenos após cerca de 40 dias. Outros protocolos podem também ser utilizados, desde que resultem na produção de células B que expressam anticorpos dirigidos ao antígeno utilizado na imunização.

[00160] Em realização alternativa, linfócitos de mamíferos não humanos não imunizados são isolados, cultivados in vitro e expostos em seguida ao imunogene em cultivo celular. Os linfócitos são colhidos em seguida e é conduzida a etapa de fusão descrita abaixo.

[00161] Para anticorpos monocionais, a etapa seguinte é o isolamento de esplenócitos do mamífero não humano imunizado e fusão subsequente desses esplenócitos com células imortalizadas, a fim de formar um hibridoma produtor de anticorpos. O isolamento de esplenócitos a partir de mamíferos não humanos é bem conhecido na técnica e envolve tipicamente a remoção do baço de mamíferos não humanos anestesiados, seu corte em pequenos pedaços e compressão dos esplenócitos da cápsula esplênica através de uma tela de nylon de um coador celular para um tampão apropriado, de forma a produzir uma suspensão de células isoladas. As células são lavadas, centrifugadas e novamente suspensas em um tampão que lise quaisquer glóbulos vermelhos do sangue. A solução é novamente centrifugada e os linfócitos remanescentes na pelota são finalmente suspensos novamente em tampão novo.

[00162] Após isolamento e presença em suspensão de células isoladas, os linfócitos podem ser fundidos a uma linhagem celular imortal. Esta é tipicamente uma linhagem de células de mieloma de camundongos, embora várias outras linhagens celulares imortais úteis para a criação de hibridomas sejam conhecidas na técnica. Linhagens de mieloma murino incluem, mas sem limitações, as derivadas de tumores de camundongos MOPC-21 e MPC-11 disponíveis por meio do Centro de Distribuição de Células do Instituto Salk, San Diego, Estados Unidos, e células X63 Ag8653 e SP-2 disponíveis por meio da Coleção Norte-Americana de Cultivos de Tipos, Rockville, Maryland, Estados Unidos. A fusão é realizada utilizando-se polietileno glicol ou similares. Os hibridomas resultantes são cultivados em seguida em meios de cultivo que contêm uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma parentais não fundidas. Caso as células de mieloma parentais não contenham a enzima hipoxantino guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), por exemplo, o meio de cultivo para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que evitam o crescimento de células com deficiência de HGPRT.

[00163] Hibridomas são tipicamente cultivados sobre uma camada alimentadora de macrófagos. Os macrófagos são preferencialmente de ninhadas do mamífero não humano utilizado para isolar esplenócitos e tipicamente recebem primer de adjuvante de Freund incompleto ou similar vários dias antes da colocação dos hibridomas em placas. Métodos de fusão são descritos em Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986), cujo relatório descritivo é incorporado ao presente como referência.

[00164] As células são mantidas em crescimento nos meios de seleção por tempo suficiente para a formação de colônias e produção de anticorpos. Isso normalmente ocorre entre cerca de 7 e cerca de 14 dias.

[00165] As colônias de hibridomas são testadas em seguida para determinar a produção de anticorpos que se ligam especificamente a produtos genéticos de polipeptídeos Siglec. O teste é tipicamente um teste do tipo ELISA colorimétrico, embora possa ser empregado qualquer teste que possa ser adaptado às cavidades nas quais os hibridomas estão crescendo. Outros testes incluem radioimunotestes ou seleção celular ativada por fluorescência. As cavidades positivas para a produção de anticorpos desejada são examinadas para determinar se uma ou mais colônias distintas estão presentes. Caso mais de uma colônia esteja presente, as células podem ser novamente clonadas e cultivadas para garantir que uma única célula tenha gerado a colônia produtora do anticorpo desejado. Tipicamente, os anticorpos serão também testados para determinar a capacidade de ligação a polipeptídeos Siglec, tais como células que expressam Siglec.

[00166] Hibridomas que são confirmados para produzir anticorpos monoclonais podem ser cultivados em quantidades maiores em meio apropriado, tal como DMEM ou RPMI-1640. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo na forma de tumores de ascite em animais.

[00167] Após crescimento suficiente para produzir o anticorpo monoclonal desejado, os meios de crescimento que contêm anticorpo monoclonal (ou o fluido de ascite) são separados das células e o anticorpo monoclonal neles presente é purificado. Atinge-se tipicamente purificação por meio de eletroforese de gel, diálise, cromatografia utilizando proteína A ou proteína G-Sepharose ou anti-lg de camundongo ligado a um suporte sólido tal como esferas de Sepharose ou agarose (todos descritos, por exemplo, em Antibody Purification Handbook, Biosciences, publicação nº 18-1037-46, Edição AC, cuja descrição é incorporada ao presente como referência). O anticorpo ligado sofre tipicamente eluição de colunas de proteína A/proteína G, utilizando tampões de baixo pH (tampões de acetato ou glicina com pH 3,0 ou menos) com neutralização imediata de frações que contêm anticorpos. Essas frações são reunidas, sofrem diálise e são concentradas conforme o necessário.

[00168] Cavidades positivas com uma única colônia aparente são tipicamente clonadas novamente e novamente testadas para garantir que um único anticorpo monoclonal seja detectado e produzido.

[00169] Anticorpos podem também ser produzidos por meio de seleção de bibliotecas combinatórias de imunoglobulinas, conforme descrito, por exemplo, em Ward et al, Nature, 341 (1989), pág. 544, cuja descrição é integralmente incorporada ao presente como referência).

[00170] Anticorpos podem ser titulados sobre Siglecs para determinar a concentração necessária para atingir ligação máxima a um polipeptídeo Siglec. “EC50”, com relação à ligação a um polipeptídeo Siglec (ou célula que o expressa), designa a concentração eficiente de anticorpo anti- Siglec que produz 50% da sua reação máxima ou efeito com relação à ligação a um polipeptídeo Siglec (ou célula que o expressa).

[00171] Após a identificação de anticorpos que são capazes de ligar Siglec e/ou possuem outras propriedades desejadas, eles também serão tipicamente determinados utilizando métodos padrão que incluem os descritos no presente, pela sua capacidade de ligação a outros polipeptídeos, incluindo outros polipeptídeos Siglec e/ou polipeptídeos não relacionados. Idealmente, os anticorpos ligam-se apenas com afinidade substancial a Siglec, tal como Siglec-7 humano e/ou Siglec-9 humano, e não se ligam em nível significativo a polipeptídeos não relacionados, especialmente polipeptídeos diferentes de Siglecs relativos a CD33 ou Siglecs diferentes dos Siglecs desejados (por exemplo, Siglec-7 e/ou Siglec-9). Apreciar-se-á, entretanto, que, desde que a afinidade para Siglec seja substancialmente maior (por exemplo, 5x, 10x, 50X, 100Xx, 500x, 1000x, 10.000x ou mais) que para outros Siglecs e/ou outros polipeptídeos não relacionados, os anticorpos são apropriados para uso nos métodos de acordo com o presente.

[00172] Os anticorpos anti-Siglec podem ser preparados como anticorpos não esgotadores, de forma que sejam reduzidos ou substancialmente não apresentem ligação específica a receptores de Fcy humanos. Esses anticorpos podem compreender regiões constantes de diversas cadeias pesadas que conhecidamente não se ligam ou possuem baixa afinidade de ligação a receptores de Fcy. Um desses exemplos é uma região constante de IgG4 humano. Alternativamente, fragmentos de anticorpos que não compreendem regiões constantes, tais como fragmentos de Fab ou F(ab')2, podem ser utilizados para evitar a ligação de receptores de Fc. Pode- se determinar a ligação de receptor de Fc de acordo com métodos conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, ligação de teste de um anticorpo a proteína receptora de Fc em teste BIACORE. Além disso, pode-se utilizar qualquer isótipo de anticorpo no qual a parte de Fc é modificada para minimizar ou eliminar a ligação a receptores de Fc (vide, por exemplo, WO 03/101485, cujo relatório descritivo é incorporado ao presente como referência). Testes como os testes baseados em células para determinar a ligação de receptor de Fc são bem conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em WO 03/101485.

[00173] O DNA que codifica um anticorpo que liga um epítopo presente sobre polipeptídeos Siglec é isolado a partir de hibridoma e colocado em um vetor de expressão apropriado para transfecção para um hospedeiro apropriado. O hospedeiro é utilizado em seguida para produção recombinante do anticorpo ou suas variantes, tais como versão humanizada daquele anticorpo monocional, fragmentos ativos do anticorpo, anticorpos quiméricos que compreendem a parte de reconhecimento de antígenos do anticorpo ou versões que compreendem uma porção detectável.

[00174] O DNA codificador de anticorpos monoclonais pode ser facilmente isolado e sequenciado utilizando-se procedimentos convencionais (empregando-se, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de ligar-se especificamente a genes codificadores das cadeias leve e pesada de anticorpos murinos). Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são transfectados em seguida para células hospedeiras, tais como células de E. coli, células COS de símios, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Conforme descrito em outros pontos do presente relatório descritivo, essas sequências de DNA podem ser modificadas para qualquer um dentre um grande número de propósitos, tal como para humanização de anticorpos, produção de fragmentos ou derivados, ou para modificar a sequência do anticorpo, por exemplo, no local de ligação de antígenos, a fim de otimizar a especificidade de ligação do anticorpo. Expressão recombinante em bactérias de DNA que codificam o anticorpo é bem conhecida na técnica (vide, por exemplo, Skerra et al, Curr. Opinion in Immunol., 5, pág. 256 (1993); e Plúckthun, /Immunol. 130, pág. 151 (1992).

[00175] No contexto da presente invenção, “determinante comum” designa um determinante ou epítopo que é compartilhado por diversos produtos genéticos dos receptores Siglec inibidores humanos, notadamente dos Siglecs relativos a CD33. Anticorpos podem ligar um determinante comum compartilhado por pelo menos Siglec-7 e Siglec-9. Em uma realização, o determinante comum pode estar opcionalmente ausente em um ou mais, ou em todos os Siglecs relativos a CD33, particularmente Siglecs-3, 5, 6, 8, 10, 11 e 12. Em uma realização, o determinante comum é ausente em Siglecs-3, 5, 6, 8,10, 11 e 12.

[00176] A identificação de um ou mais anticorpos que se ligam a polipeptídeos Siglec (por exemplo, Siglec-7 e/ou Siglec-9, particularmente de forma substancial ou essencialmente o mesmo epítopo do anticorpo monoclonal mAbsA, B, C, D, E ou F (específico de Siglec-9) ou mAbs1, 2, 3, 4, 5 ou 6 (específico de Siglec-7/9), pode ser facilmente determinado utilizando-se qualquer um dentre uma série de testes de seleção imunológica nos quais pode ser determinada a competição de anticorpos. Muitos desses testes são praticados rotineiramente e bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana nº 5.660.827, que é incorporada ao presente como referência) Compreender-se-á que a determinação real do epítopo ao qual se liga um anticorpo descrito no presente não é necessária, de nenhuma forma, para identificar um anticorpo que se liga ao mesmo ou substancialmente ao mesmo epítopo do anticorpo monocional descrito no presente.

[00177] Quando os anticorpos de teste a serem examinados forem obtidos de animais fonte diferentes, por exemplo, ou forem mesmo de isótipo lg diferente, pode ser empregado um teste de competição simples no qual os anticorpos de controle (por exemplo, mAbA, B, C, D, E ou F, ou mAb1, 2, 3, 4, 5 ou 6) e de teste são misturados (ou previamente adsorvidos) e aplicados a uma amostra que contém polipeptídeos Siglec. Protocolos com base em Western Blot e no uso de análise BIACORE são apropriados para uso nesses estudos de competição.

[00178] Em certas realizações, os anticorpos controle (por exemplo, mAbA, B, C, D, E ou F, ou mAb1, 2, 3, 4, 5 ou 6) são previamente misturados com quantidades variáveis dos anticorpos de teste (por exemplo, cerca de 1:10 ou cerca de 1:100) por um período de tempo antes da aplicação à amostra de antígeno Siglec. Em outras realizações, o controle e quantidades variáveis de anticorpos de teste podem ser simplesmente misturados durante a exposição à amostra de antígeno Siglec. Desde que se possa diferenciar anticorpos livres de ligados (utilizando-se, por exemplo, métodos de lavagem ou separação para eliminar anticorpos não ligados) e MALA, B, C, D, E, F, 1,2, 3, 4, 5 ou 6 dos anticorpos de teste (utilizando-se, por exemplo, anticorpos secundários específicos de espécies ou específicos de isótipos ou por meio de marcação específica de mAbA, B, C, D, E, F, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 com marca detectável), pode-se determinar se os anticorpos de teste reduzem a ligação de MAbA, B, C, D, E, F, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 aos antígenos, o que indica que o anticorpo de teste concorre pela ligação e/ou reconhece um local de ligação comum em um Siglec como mMAb1, mAbLA, B, C, D, E, F, 1,2, 3,4, 50U 6. À ligação dos anticorpos controle (marcados) na ausência de anticorpo totalmente irrelevante pode servir de alto valor controle. O baixo valor controle pode ser obtido por meio de incubação dos anticorpos marcados (mAbA, B, C, D, E, F, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) com anticorpos não marcados exatamente do mesmo tipo (mMAbA, B, C, D, E, F, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6), em que ocorrerá competição que reduzirá a ligação dos anticorpos marcados. Em um teste, redução significativa da capacidade de reação de anticorpos marcados na presença de anticorpo de teste indica anticorpo de teste que reconhece substancialmente a mesma região em um Siglec e que apresenta “reação cruzada” ou concorre com o anticorpo marcado (MAPA, B, C, D, E, F, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6). Qualquer anticorpo de teste que reduz a ligação de MALA, B, C, D, E, F, 1, 2, 3,4, 50u 6 a antígenos Siglec em pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos cerca de 60% ou, de maior preferência, pelo menos cerca de 80% ou 90% (por exemplo, cerca de 65-100%), em qualquer razão de mAbA, B, C, D, E, F, 1,2, 3,4, 50u 6:anticorpo de teste de cerca de 1:10 a cerca de 1:100, é considerado anticorpo que concorre com mAbA, B, C, D, E, F, 1, 2, 3, 4, 5o0u 6 correspondente. Preferencialmente, esse anticorpo de teste reduzirá a ligação do mAbA, B, C, D, E, F, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 correspondente ao antígeno de Siglec em pelo menos cerca de 90% (por exemplo, cerca de 95%).

[00179] A competição pode ser também determinada, por exemplo, por meio de um teste de citometria de fluxo. Nesse teste, células que possuem um ou mais dados polipeptídeos Siglec podem ser incubadas em primeiro lugar com mAbA, B, C, D, E, F, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, por exemplo, e, em seguida, com o anticorpo de teste marcado com fluorocromo ou biotina. Afirma- se que o anticorpo concorre com mADbA, B, C, D, E, F, 1,2, 3,4, 5o0u 6 se a ligação obtida mediante incubação prévia com quantidade de saturação de MAbA, B, C, D, E, F, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 é de cerca de 80%, preferencialmente cerca de 50%, cerca de 40% ou menos (por exemplo, cerca de 30%, 20% ou 10%) da ligação (conforme medido por meio de fluorescência) obtida pelo anticorpo sem incubação prévia com o MALA, B, C, D, E, F, 1, 2, 3,4, 50u 6 correspondente. Alternativamente, afirma-se que o anticorpo concorre com MAbA, B, C, D, E, F, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 se a ligação obtida com um anticorpo MAbA, B, C, D, E, F, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 marcado correspondente (por fluorocromo ou biotina) sobre células previamente incubadas com quantidade saturadora de anticorpo de teste for de cerca de 80%, preferencialmente cerca de 50%, cerca de 40% ou menos (por exemplo, cerca de 30%, 20% ou 10%) da ligação obtida sem incubação prévia com o anticorpo de teste.

[00180] Pode-se também empregar um teste de competição simples no qual um anticorpo de teste é previamente adsorvido e aplicado sob concentração de saturação a uma superfície sobre a qual um antígeno Siglec é imobilizado.

A superfície no teste de competição simples é preferencialmente um chip BIACORE (ou outro meio apropriado para análise de ressonância de plasma da superfície). O anticorpo controle (por exemplo, mAbA, B, C, D, E, F, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) é então colocado em contato com a superfície em concentração de saturação de Siglec e é medida a ligação de superfície e Siglec do anticorpo controle.

Essa ligação do anticorpo controle é comparada com a ligação do anticorpo controle à superfície que contém Siglec na ausência de anticorpo de teste.

Em um teste, redução significativa da ligação da superfície que contém Siglec pelo anticorpo controle na presença de anticorpo de teste indica que o anticorpo de teste concorre pela ligação e, portanto, pode reconhecer a mesma região em um Siglec do anticorpo controle, de forma que o anticorpo de teste apresente “reação cruzada” com o anticorpo controle.

Qualquer anticorpo de teste que reduza a ligação de anticorpo controle (tal como mAbA, B, C, D, E, F, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) a um antígeno Siglec em pelo menos cerca de 30% ou mais, preferencialmente cerca de 40%, pode ser considerado anticorpo que concorre pela ligação a Siglec como controle (por exemplo, mALA, B, C, D, E, F, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 correspondente). Preferencialmente, esse anticorpo de teste reduzirá a ligação do anticorpo controle (por exemplo, mAbA, B, C, D, E, F, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) ao antígeno Siglec em pelo menos cerca de 50% (por exemplo, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70% ou mais). Apreciar-se-á que a ordem de anticorpos controle e de teste pode ser invertida: ou seja, o anticorpo controle pode ser ligado em primeiro lugar à superfície e o anticorpo de teste é colocado em contato com a superfície em seguida, em um teste de competição.

Preferencialmente, o anticorpo que possui afinidade mais alta para o antígeno

Siglec é ligado em primeiro lugar à superfície, pois se esperará que a redução da ligação observada para o segundo anticorpo (considerando que os anticorpos apresentem reação cruzada) será de maior magnitude. Exemplos adicionais desses testes são fornecidos, por exemplo, em Saunal (1995), J. Immunol. Methods 183: 33-41, cuja descrição é incorporada ao presente como referência.

[00181] A determinação se um anticorpo liga-se dentro de uma região de epítopo pode ser conduzida de formas conhecidas pelos técnicos no assunto. Como exemplo desses métodos de mapeamento/caracterização, pode-se determinar uma região de epítopo para um anticorpo anti-Siglec pela “pegada” do epítopo, utilizando-se modificação química das aminas/carboxilas expostas na proteína Siglec. Um exemplo específico desse método de pegada é o uso de HXMS (substituição de hidrogênio-deutério detectada por meio de espectrometria de massa), em que ocorre a substituição de hidrogênio-deutério de prótons de amida de proteína ligante e receptora, ligação e retrossubstituição, os grupos amida da cadeia principal que participam da ligação de proteínas são protegidos contra retrossubstituição e, portanto, permanecerão deuterados. Regiões relevantes podem ser identificadas neste ponto por meio de proteólise péptica, rápida separação por cromatografia de líquidos de alto desempenho de micro-orifícios e/ou espectrometria de massa de ionização por eletropulverização. Vide, por exemplo, Ehring, H., Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2), págs. 252-259 (1999), Engen, J. R. e Smith, D. L. (2001), Anal. Chem. 73, 256A-265A. Outro exemplo de método de identificação de epítopos apropriado é o mapeamento de epítopos por ressonância magnética nuclear (NMR), em que são tipicamente comparadas a posição dos sinais em espectros NMR bidimensionais do antígeno livre e do antígeno em complexo com o peptídeo de ligação de antígenos, tal como anticorpo. O antígeno é tipicamente marcado isotopicamente de forma seletiva com 15N, de forma que apenas sinais correspondentes ao antígeno e nenhum sinal do peptídeo de ligação de antígenos sejam observados no espectro de NMR. Sinais de antígenos originários de aminoácidos envolvidos na interação com o peptídeo de ligação de antígenos tipicamente alterarão posições no espectro do complexo em comparação com o espectro do antígeno livre e os aminoácidos envolvidos na ligação podem ser identificados desta forma. Vide, por exemplo, Ernst Schering Res. Found. Workshop, 2004; (44): 149-67; Huang et al, Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1), págs. 61-67 (1998); e Saito e Patterson, Methods, junho de 1996; 9 (3): 516-24.

[00182] Pode-se também realizar mapeamento/caracterização — de epítopos utilizando-se métodos de espectrometria de massa. Vide, por exemplo, Downard, J. Mass Spectrom., abril de 2000; 35 (4): 493-503 e Kiselar e Downard, Anal. Chem. 1º de maio de 1999; 71 (9): 1792-1801. Métodos de digestão da protease podem também ser úteis no contexto de mapeamento e identificação de epítopos. Sequências/regiõêes — relevantes/determinantes — antigênicas= podem ser determinadas por meio de digestão de protease, utilizando-se, por exemplo, tripsina em razão de cerca de 1:50 para Siglec ou digestão o/n sob pH 7-8, seguida por análise de espectrometria de massa (MS) para identificação de peptídeos. Os peptídeos protegidos contra divisão de tripsina pelo ligante anti- Siglec podem ser identificados em seguida por meio de comparação de amostras submetidas à digestão por tripsina e amostras incubadas com anticorpos e submetidas em seguida à digestão, por exemplo, por tripsina (de forma a revelar a pegada para o ligante). Outras enzimas como quimotripsina, pepsina etc. podem ser também ou alternativamente utilizadas em métodos de caracterização de epítopos similares. Além disso, digestão enzimática pode fornecer um método rápido de análise se uma sequência determinante antigênica potencial encontrar-se dentro de uma região do polipeptídeo Siglec que não tem a superfície exposta e, consequentemente, muito provavelmente não é relevante em termos de imunogenicidade/antigenicidade.

[00183] Mutagênese dirigida a local é outro método útil de elucidação de epítopos de ligação. Em “varredura de alanina”, por exemplo, cada resíduo dentro de um segmento de proteína é substituído por um resíduo de alanina e as consequências da afinidade de ligação são medidas. Caso a mutação gere redução significativa da afinidade de ligação, ela é mais provavelmente envolvida na ligação. Anticorpos monoclonais específicos para epítopos estruturais (ou seja, anticorpos que não ligam a proteína desdobrada) podem ser utilizados para verificar que a substituição de alanina não influencia a dobra geral da proteína. Vide, por exemplo, Clackson e Wells, Science 1995; 267: 383—386; e Wells, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 1-6.

[00184] Pode-se também utilizar microscopia eletrônica para “pegadas” de epítopos. Wang et al, Nature 1992; 355: 275-278, por exemplo, utilizaram aplicação coordenada de microscopia crioeletrônica, reconstrução de imagens tridimensionais e cristalografia de raio X para determinar a pegada física de um fragmento de Fab sobre a superfície de capsídeo de vírus mosaico do feijão fradinho nativo.

[00185] Outras formas de teste “livre de marcas” para avaliação de epítopos incluem ressonância de plasma da superfície (SPR, BIACORE) e espectroscopia de interferência refletométrica (RifS). Vide, por exemplo, Fágerstam et al, Journal of Molecular Recognition 1990; 3: 208-14; Nice et al, J. Chromatogr. 1993; 646: 159—168; Leipert et al, Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37: 3308—3311; Króger et al, Biosensors and Bioelectronics 2002; 17: 937-944.

[00186] Dever-se-á também observar que um anticorpo que liga o mesmo ou substancialmente o mesmo epítopo que um anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser identificado em um ou mais dentre os exemplos de testes de competição descritos no presente.

[00187] Testes de bloqueio cruzado podem ser também utilizados para avaliar se um anticorpo de teste afeta a ligação do ligante de ácido siálico natural ou não natural para Siglec humano (por exemplo, Siglec-7 e/ou Siglec-9). Para determinar se uma preparação de anticorpo anti-Siglec humanizado reduz ou bloqueia as interações de Siglec-7 com ácido siálico, pode ser realizado o teste a seguir: faixa de dosagem de Fab Siglec-9 anti- humano é coincubada por 30 minutos à temperatura ambiente com Siglec-Fc humano (por exemplo, Siglec-7 Fc e/ou Siglec-9 Fc) em dose fixa e adiciona-se em seguida ligante de ácido siálico que expressa linhagens celulares por uma hora. Após lavagem das células por duas vezes em tampão de manchas, anticorpos secundários de fragmentos Fc anti-lgG de camundongo de cabra acoplado a PE diluídos em tampão de manchas são adicionados às células e placas são incubadas por 30 minutos adicionais a 4 ºC. As células são lavadas por duas vezes e analisadas em um citômetro de fluxo Accury C6 equipado com um leitor de placas HTFC. Na ausência de anticorpos de teste, Siglec-Fc liga-se às células. Na presença de preparação de anticorpos previamente incubada com Siglec-Fc (por exemplo, Siglec-7 Fc e/ou Siglec-9 Fc) que bloqueia a ligação de Siglec a ácido siálico, existe ligação reduzida de Siglec- Fc às células. Apreciar-se-á, entretanto, que a reconstituição da atividade lítica de células NK para células alvo que expressam ligante ácido siálico pode ser determinada diretamente, sem necessidade de determinar o bloqueio da interação Siglec-ligante ácido siálico.

[00188] Opcionalmente, anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser especificados como sendo anticorpos diferentes de qualquer um ou mais dos anticorpos E 10-286 (BD Biosciences Corp.), QA79 descrito na Patente Europeia nº 1238282B1 (Moretta et al, Universita degli

Studi di Genova), Z176 indicado em Falco et al (1999), J. Exp. Med. 190: 793- 801 ou derivados do acima, por exemplo, que compreendem a região de ligação de antígenos ou CDRs de cadeia leve e/ou pesada, no todo ou em parte. Opcionalmente, anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser especificados como sendo anticorpos diferentes de um ou mais dentre os anticorpos 3A11, 1H9 e 2B4 descritos no pedido PCT nº POCT/EP2015/070550, depositado em 9 de setembro de 2015 (Innate Pharma). Em outras realizações, os anticorpos mencionados acima podem, dependendo da natureza do anticorpo, ser modificados de forma a possuir as características dos anticorpos de acordo com a presente invenção.

[00189] São fornecidos anticorpos que ligam o domínio extracelular, tal como o domínio conjunto V N-terminal ou o domínio 1 ou 2 do tipo C2 similar a lg de Siglec-9 humano, tais como anticorpos que ligam os epítopos exibidos nos Exemplos do presente.

[00190] Em um aspecto, os anticorpos ligam substancialmente o mesmo epítopo do anticorpo mAb1, 2, 3,4, 5,6, A, B, C, D, E ou F. Em uma realização, os anticorpos ligam-se a um epítopo de Siglec-9 e/ou Siglec-7 que se sobrepõe ao menos parcialmente ou inclui pelo menos um resíduo no epítopo ligado pelo anticorpo mAb1, 2, 3, 4, 5,6, A, B, C, D/ E ou F. Os resíduos ligados pelo anticorpo podem ser especificados como presentes sobre a superfície do polipeptídeo Siglec-9 e/ou Siglec-7, tal como em polipeptídeo Siglec-9 ou Siglec-7 expresso sobre a superfície de uma célula. Os resíduos de aminoácidos sobre Siglec-9 e/ou Siglec-7 ligados pelo anticorpo podem ser selecionados, por exemplo, a partir do grupo que consiste dos resíduos relacionados na Tabela 3.

[00191] A ligação de anticorpo anti-Siglec a células transfectadas com mutantes Siglec-9 pode ser medida e comparada com a capacidade de anticorpo anti-Siglec de ligar peptídeo Siglec-9 do tipo selvagem

(por exemplo, SEQ ID Nº 2). Para anticorpos que ligam adicionalmente Siglec- 7, a ligação de anticorpos anti-Siglec pode ser conduzida, alternativa ou adicionalmente, utilizando-se células transfectadas com mutantes Siglec-7 (por exemplo, da Tabela 3) e comparada com a capacidade de anticorpo anti-Siglec de ligar polipeptídeo Siglec-7 do tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID Nº 1). Redução da ligação entre anticorpo anti-Siglec e polipeptídeo Siglec-9 e/ou Siglec-7 mutante (por exemplo, Siglec-9 ou Siglec-7 mutante da Tabela 3) indica que existe redução da afinidade de ligação (por exemplo, conforme medido por meio de métodos conhecidos, tais como teste FACS de células que expressam um mutante específico, ou por meio de teste Biacore& (SPR) de ligação a polipeptídeos mutantes) e/ou redução da capacidade de ligação total do anticorpo anti-Siglec (por exemplo, conforme evidenciado por redução de Bmax em plotagem da concentração de anticorpos anti-Siglec em comparação com a concentração de polipeptídeos). Redução significativa da ligação indica que o resíduo que sofreu mutação é diretamente envolvido na ligação ao anticorpo anti-Siglec ou encontra-se em boa proximidade da proteína de ligação quando o anticorpo anti-Siglec for ligado a Siglec-9.

[00192] Em algumas realizações, redução significativa da ligação indica que a capacidade e/ou afinidade de ligação entre um anticorpo anti-Siglec e um polipeptídeo Siglec-9 mutante é reduzida em mais de 40%, mais de 50%, mais de 55%, mais de 60%, mais de 65%, mais de 70%, mais de 75%, mais de 80%, mais de 85%, mais de 90% ou mais de 95% com relação à ligação entre o anticorpo e polipeptídeo Siglec-9 do tipo selvagem. Em certas realizações, a ligação é reduzida abaixo de limites detectáveis. Em algumas realizações, redução significativa da ligação é evidenciada quando a ligação de anticorpo anti-Siglec a um polipeptídeo Siglec-9 mutante for de menos de 50% (por exemplo, menos de 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% ou 10%) da ligação observada entre o anticorpo anti-Siglec e um polipeptídeo Siglec-9 do tipo selvagem.

[00193] Em algumas realizações, são fornecidos anticorpos anti-Siglec que exibem ligação significativamente menor para um polipeptídeo Siglec-9 e/ou Siglec-7 mutante no qual um resíduo em um segmento que compreende um resíduo de aminoácido ligado por anticorpo mMAb1, 2,3, A, B, C, D, E ou F é substituído por um aminoácido diferente. Em uma realização, o mutante é um mutante selecionado a partir de mutantes M6, M7, M8, M9, M10, M11, M14, M15 e M16 da Tabela 3, em comparação com a ligação a um polipeptídeo Siglec do tipo selvagem (por exemplo, o polipeptídeo Siglec-9 de SEQ ID Nº 2). Em uma realização, o mutante é um mutante selecionado a partir de mutantes M6, M7, M8, M9, M10, M11, M14, M15 e M16 da Tabela 3, em comparação com a ligação a um polipeptídeo Siglec-7 do tipo selvagem (por exemplo, o polipeptídeo de SEQ ID Nº 1).

[00194] Em uma realização, anticorpos anti-Siglec, quando testados como fragmentos de Fab', exibem ligação significativamente menor para cada um dos polipeptídeos Siglec-9 mutantes M7 e M6 da Tabela 3, em comparação com o polipeptídeo Siglec-9 do tipo selvagem de SEQ ID Nº 2.

[00195] Em uma realização, anticorpos anti-Siglec, quando testados como fragmentos de Fab', exibem ligação significativamente menor para cada um dos polipeptídeos Siglec-9 mutantes M7, M9, M10 e M11 da Tabela 3, em comparação com a ligação ao polipeptídeo Siglec-9 do tipo selvagem de SEQ ID Nº 2.

[00196] Em uma realização, anticorpos anti-Siglec, quando testados como fragmentos de Fab', exibem ligação significativamente menor para cada um dos polipeptídeos Siglec-9 mutantes M8, M9, M10 e M11 da Tabela 3, em comparação com a ligação ao polipeptídeo Siglec-9 do tipo selvagem de SEQ ID Nº 2.

[00197] Em uma realização, anticorpos anti-Siglec, quando testados como fragmentos de Fab', exibem ligação significativamente menor para cada um dos polipeptídeos Siglec-9 mutantes M16 e M14 da Tabela 3, em comparação com a ligação a um polipeptídeo Siglec-9 do tipo selvagem de SEQ ID Nº 2.

[00198] Em uma realização, anticorpos anti-Siglec, quando testados como fragmento de Fab', exibem ligação significativamente menor para cada um dos polipeptídeos Siglec-9 mutantes M16 e M8 da Tabela 3, em comparação com a ligação a um polipeptídeo Siglec-9 do tipo selvagem de SEQ ID Nº 2.

[00199] Em uma realização, anticorpos anti-Siglec, quando testados como fragmentos de Fab', exibem ligação significativamente menor para cada um dos polipeptídeos Siglec-9 mutantes M16, M15 e M8 da Tabela 3, em comparação com a ligação a um polipeptídeo Siglec-9 do tipo selvagem de SEQ ID Nº 2.

[00200] Em uma realização, anticorpos anti-Siglec, quando testados como fragmentos de Fab', exibem ligação significativamente menor para cada um dos polipeptídeos Siglec-9 mutantes M16, M15, M14 e M8 da Tabela 3, em comparação com a ligação a um polipeptídeo Siglec-9 do tipo selvagem de SEQ ID Nº 2.

[00201] Em um aspecto, os anticorpos anti-Siglec ligam um epítopo sobre Siglec-9 humano que compreende um, dois, três, quatro, cinco ou seis dos resíduos selecionados a partir do grupo que consiste de N78, P79, A80, R81, A82 e/ou V83 (com referência a SEQ ID Nº 2).

[00202] Em um aspecto, os anticorpos anti-Siglec ligam um epítopo sobre Siglec-9 humano que compreende um, dois, três ou quatro dos resíduos selecionados a partir do grupo que consiste de N77, D96, H98 e/ou T99 (com referência a SEQ ID Nº 2).

[00203] Em um aspecto, os anticorpos anti-Siglec ligam um epítopo sobre Siglec-9 humano que compreende um, dois, três ou quatro dos resíduos selecionados a partir do grupo que consiste de W84, E85, E86 e/ou R88 (com referência a SEQ ID Nº 2).

[00204] Em um aspecto, os anticorpos anti-Siglec ligam um epítopo sobre Siglec-9 humano que compreende um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou oito dos resíduos selecionados a partir do grupo que consiste de S47, H48, G49, W50, 151, Y52, P53 e/ou G54 (com referência a SEQ ID Nº 2).

[00205] Em um aspecto, os anticorpos anti-Siglec ligam um epítopo sobre Siglec-9 humano que compreende um ou os dois resíduos K131 e/ou H132 (com referência a SEQ ID Nº 2).

[00206] Em um aspecto, os anticorpos anti-Siglec ligam um epítopo sobre Siglec-9 humano que compreende um ou os dois resíduos R120, W128 e/ou N129A (com referência a SEQ ID Nº 2).

[00207] Em um aspecto, os anticorpos anti-Siglec ligam um epítopo sobre Siglec-9 humano que compreende um ou os dois resíduos S27, R116, H133 e/ou R134 (com referência a SEQ ID Nº 2).

[00208] Em um aspecto, os anticorpos anti-Siglec ligam um epítopo sobre Siglec-9 humano que compreende um, dois, três, quatro, cinco, seis ou sete dos resíduos selecionados a partir do grupo que consiste de R63, AG66, N67, T68, D69, Q70 e/ou D71 (com referência a SEQID Nº 2).

[00209] Em um aspecto, os anticorpos anti-Siglec ligam um epítopo sobre Siglec-9 humano que compreende um, dois, três, quatro, cinco ou seis dos resíduos selecionados a partir do grupo que consiste de P55, H58, E122, G124, S125 e/ou K127 (com referência a SEQ ID Nº 2).

[00210] Em um aspecto, os anticorpos anti-Siglec ligam um epítopo sobre Siglec-7 humano que compreende um, dois, três, quatro, cinco ou seis dos resíduos selecionados a partir do grupo que consiste de N82, P83, A84, R85, A86 e/ou V87 (com referência a SEQ ID Nº 1).

[00211] Em um aspecto, os anticorpos anti-Siglec ligam um epítopo sobre Siglec-7 humano que compreende um, dois, três ou quatro dos resíduos selecionados a partir do grupo que consiste de N81, D100, H102 e/ou T103 (com referência a SEQ ID Nº 1).

[00212] Em um aspecto, os anticorpos anti-Siglec ligam um epítopo sobre Siglec-7 humano que compreende um, dois, três ou quatro dos resíduos selecionados a partir do grupo que consiste de W88, E89, E90 e R92 (com referência a SEQ ID Nº 1).

[00213] Após obter-se um composto de ligação de antígenos que possui a ligação desejada para Siglecs, pode-se determinar sua capacidade de inibição de Siglec (por exemplo, Siglec-7 e/ou Siglec-9). Caso um anticorpo anti-Siglec reduza ou bloqueie, por exemplo, a ativação de Siglec induzida por um ligante ácido siálico (por exemplo, presente em uma célula), ele pode aumentar a citotoxicidade de linfócitos restritos por Siglec. Isso pode ser avaliado por um teste de citotoxicidade típico, cujos exemplos são descritos abaixo.

[00214] A capacidade de anticorpos de reduzir a sinalização mediada por Siglec pode ser testada em um teste de citotoxicidade in vitro por quatro horas padrão, utilizando-se, por exemplo, células NK que expressam Siglec-7 ou Siglec-9 e células alvo que expressam um ligante ácido siálico do Siglec correspondente. Essas células NK não matam eficientemente alvos que expressam o ligante ácido siálico porque Siglec-7 ou 9 reconhece o ligante ácido siálico, gerando o início e a propagação de sinalização inibidora que evita a citólise mediada por linfócitos. Esse teste pode ser conduzido de acordo com os métodos dos Exemplos do presente; vide, por exemplo, o Exemplo 8, que utiliza células NK primárias como células NK novas purificadas de doadores, incubadas por uma noite a 37 ºC antes do uso. Esse teste de citotoxicidade in vitro pode ser conduzido por meio de métodos padrão bem conhecidos na técnica, conforme descrito, por exemplo, em Coligan et al, eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. e Wiley Interscience, Nova lorque (1992, 1993). As células alvo são marcadas com Cr antes da adição de células NK e, em seguida, estima-se a morte como proporcional à liberação de Cr das células para o meio, como resultado da morte. A adição de anticorpos que evitam a ligação de Siglec-7 e/ou 9 ao ligante ácido siálico resulta na prevenção do início e propagação de sinalização inibidora por meio de Siglec. A adição desses agentes resulta, portanto, em aumentos da morte mediada por linfócitos das células alvo. Esta etapa identifica, portanto, agentes que evitam sinalização negativa induzida por Siglec-7 ou 9, por exemplo, por meio do bloqueio da ligação de ligantes. Em um teste de citotoxicidade de liberação de 5º*Cr específico, células efetoras NK que expressam Siglec-7 ou 9 podem matar células alvo negativas para ligantes ácidos siálicos (por exemplo, células tratadas com sialidase), mas não tão bem células controle que expressam ligantes ácidos siálicos. Células efetoras NK matam com menos eficiência, portanto, células positivas para ligantes ácido siálico devido à sinalização inibidora induzida por ácido siálico por meio do Siglec específico. Quando células NK forem previamente incubadas com anticorpos anti-Siglec de bloqueio nesse teste de citotoxicidade de liberação de 5 Cr, células que expressam ligantes ácido siálico são mortas com mais eficiência, de forma dependente da concentração de anticorpos. O teste pode ser conduzido separadamente para cada Siglec, tal como Siglec-7 e Siglec-9.

[00215] A atividade inibidora (ou seja, potencial de aumento da citotoxicidade) de um anticorpo pode ser também determinada em qualquer uma dentre uma série de outras formas, tais como pelo seu efeito sobre cálcio livre intracelular, conforme descrito, por exemplo, em Sivori et al, J. Exp. Med. 1997; 186: 1129-1136, cuja descrição é incorporada ao presente como referência, ou pelo efeito sobre marcadores da ativação da citotoxicidade de células NK, tais como a expressão de marcador da desgranulação CD107 ou CD137. A atividade de células NK, T ou NKT pode também ser determinada utilizando-se quaisquer testes da citotoxicidade com base celular, tais como medindo-se qualquer outro parâmetro para determinar a capacidade do anticorpo de estimular células NK para matar células alvo tais como células P815 e K562 ou células de tumores apropriadas, conforme descrito em Sivori et al, J. Exp. Med. 1997; 186: 1129-1136; Vitale et al, J. Exp. Med. 1998; 187: 2065-2072; Pessino et al, J. Exp. Med. 1998; 188: 953-960; Neri et al, Clin. Diag. Lab. Immun. 2001; 8: 1131-1135; Pende et al, J. Exp. Med. 1999; 190: 1505-1516, cujas descrições completas são incorporadas ao presente como referência.

[00216] Em uma realização, preparações de anticorpos causam aumento de pelo menos 10% da citotoxicidade de linfócitos restritos por Siglec, preferencialmente aumento de pelo menos 40% ou 50% da citotoxicidade de NK ou, de maior preferência, aumento de pelo menos 70% da citotoxicidade de NK.

[00217] A atividade de linfócitos citotóxicos pode também ser abordada utilizando-se um teste de liberação de citoquinas, em que as células NK são incubadas com o anticorpo para estimular a produção de citoquinas das células NK (por exemplo, produção de IFN-y e TNF-a). Em um exemplo de protocolo, a produção de IFN-y a partir de PBMC é determinada por meio de manchas intracitoplasmáticas e da superfície celular e análise por meio de citometria de fluxo após quatro dias em cultivo. Resumidamente, adiciona-se Brefeldin A (Sigma Aldrich) em concentração final de 5 ug/ml pelas últimas quatro horas de cultivo. As células são incubadas em seguida com mAb anti-CD3 e anti-CD56 antes da permeabilização (IntraPrep&O; Beckman Coulter) e manchas com PE-anti-|IFN-y ou PE-IgG1 (Pharmingen). A produção de GM- CSF e IFN-y a partir de células NK ativadas policlonais é medida em sobrenadantes utilizando-se ELISA (GM-CSF: DuoSet Elisa, RE&D Systems, Mineápolis MN, IFN-y: conjunto OptEIA, Pharmingen).

[00218] Fragmentos e derivados de anticorpos (que são englobados pelo termo “anticorpo” ou “anticorpos”, da forma utilizada no presente pedido, a menos que indicado em contrário ou claramente contradito pelo contexto) podem ser produzidos por meio de métodos conhecidos na técnica. “Fragmentos” compreendem uma parte do anticorpo intacto, geralmente o local de ligação de antígenos ou região variável. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos de Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 e Fv; diacorpos; qualquer fragmento de anticorpo que seja um polipeptídeo que possui estrutura primária que consiste de uma sequência ininterrupta de resíduos de aminoácidos contíguos (indicada no presente “fragmento de anticorpo de fita simples” ou “polipeptídeo de fita simples”), incluindo, sem limitações, (1) moléculas Fv de fita simples, (2) polipeptídeos de fita simples que contêm apenas um domínio variável de cadeia leve ou um de seus fragmentos que contém as três CDRs do domínio variável de cadeia leve, sem uma porção de cadeia pesada associada e (3) polipeptídeos de fita simples que contêm apenas uma região variável de cadeia pesada ou um de seus fragmentos que contém as três CDRs da região variável de cadeia pesada, sem uma porção de cadeia leve associada; e anticorpos multiespecíficos (tais como biespecíficos) formados a partir de fragmentos de anticorpos. São incluídos, entre outros, um nanocorpo, anticorpo de domínio, anticorpo de domínio simples ou “dAb”.

[00219] Em certas realizações, o DNA de um hibridoma produtor de anticorpo pode ser modificado antes da inserção em um vetor de expressão, por exemplo, substituindo-se a sequência de codificação para domínios constantes de cadeia leve e pesada humana no lugar das sequências não humanas homólogas (por exemplo, Morrison et al, PNAS pág. 6851

(1984)), ou por meio de ligação covalente à sequência de codificação de imunoglobulina da sequência de codificação para um polipeptídeo não de imunoglobulina, no todo ou em parte. Desta forma, são preparados anticorpos “quiméricos” ou “híbridos” que possuem a especificidade de ligação do anticorpo original. Tipicamente, esses polipeptídeos não de imunoglobulina são substituídos pelos domínios constantes de um anticorpo.

[00220] Opcionalmente, o anticorpo é humanizado. Formas “humanizadas" de anticorpos são imunoglobulinas quiméricas específicas, cadeias de imunoglobulina ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab”, F(ab')2 ou outras subsequências de ligação de antígenos de anticorpos) que contêm sequência mínima derivada da imunoglobulina murina. Em sua maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais resíduos de uma região de determinação da complementaridade (CDR) do paciente são substituídos por resíduos de uma CDR do anticorpo original (anticorpo doador), mantendo-se ao mesmo tempo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas do anticorpo original.

[00221] Em alguns casos, resíduos de cadeia principal Fv da imunoglobulina humana podem ser substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem nas sequências de cadeia principal ou CDR importadas. Essas modificações são realizadas para refinar e otimizar ainda mais o desempenho do anticorpo. De forma geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às do anticorpo original e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado idealmente também compreenderá pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, vide Jones et al, Nature, 321 pág. 522 (1986); Reichmann et al, Nature, 332, pág. 323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, pág. 593 (1992); Verhoeyen et al, Science, 239, pág. 1534; e Patente Norte-Americana nº

4.816.567, cujas descrições completas são incorporadas ao presente como referência). Métodos de humanização dos anticorpos são bem conhecidos na técnica.

[00222] A seleção de domínios variáveis humanos, leve e pesado, a serem utilizados na produção dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. Segundo o chamado método de “melhor adequação”, a sequência do domínio variável de um anticorpo é selecionada contra toda a biblioteca de sequências de domínios variáveis humanos conhecidas. A sequência humana mais próxima de camundongo é então aceita como cadeia principal humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al, J. Immunol. 151, pág. 2296 (1993); Chothia e Lesk, J. Mol. 196, 1987, pág. 901). Outro método utiliza uma cadeia principal específica da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeia leve ou pesada. A mesma cadeia principal pode ser utilizada para diversos anticorpos humanizados diferentes (Carter et al, PNAS 89, pág. 4285 (1992); Presta et al, J. Immunol., 151, pág. 2623 (1993)).

[00223] É adicionalmente importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para receptores de Siglec e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método, anticorpos humanizados são preparados por meio de um processo de análise das sequências parentais e diversos produtos humanizados conceituais, utilizando modelos tridimensionais das sequências parental e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensionais são comumente disponíveis e familiares para os técnicos no assunto. São disponíveis programas de computador que ilusttam e exibem estruturas tridimensionais prováveis de possíveis sequências de imunoglobulina selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da possível sequência de imunoglobulina, ou seja, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da possível imunoglobulina de ligar o seu antígeno. Desta forma, os resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir das sequências importada e de consenso, de forma que seja atingida a característica desejada do anticorpo, tal como maior afinidade para o(s) antígeno(s) alvo. Geralmente, os resíduos de CDR são direta e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação de antígenos.

[00224] Outro método de preparação de anticorpos monoclonais “humanizados” é o uso de XenoMouse (Abgenix, Fremont CA) como o camundongo utilizado para imunização. XenoMouse é um hospedeiro murino segundo o qual teve seus genes de imunoglobulina substituídos por genes de imunoglobulina humana funcionais. Os anticorpos produzidos por esse camundongo ou em hibridomas preparados a partir das células B desse camundongo, portanto, já são humanizados. O XenoMouse é descrito na Patente Norte-Americana nº 6.162.963, que é incorporada integralmente ao presente como referência.

[00225] Anticorpos humanos podem também ser produzidos de acordo com diversas outras técnicas, tais como o uso, para imunização, de outros animais transgênicos que tenham sido elaborados para expressar um repertório de anticorpos humanos (Jakobovitz et al, Nature 362 (1993) 255), ou por meio de seleção de repertórios de anticorpos utilizando-se métodos de exibição de fagos. Essas técnicas são conhecidas pelos técnicos no assunto e podem ser implementadas a partir de anticorpos monocionais, conforme descrito no presente pedido de patente.

[00226] Em uma realização, os anticorpos anti-Siglec podem ser preparados de forma que não possuam ligação específica substancial a receptores de Fcy humanos, tais como qualquer um ou mais dentre CD16A, CD16B, CD32A, CD32B e/ou CD64). Esses anticorpos podem compreender regiões constantes de diversas cadeias pesadas que conhecidamente não possuem ou possuem baixa ligação a receptores de Fcy. Alternativamente, fragmentos de anticorpos que não compreendem (ou compreendem partes de) regiões constantes, tais como fragmentos de F(ab')2, podem ser utilizados para evitar a ligação de receptores de Fc. Pode-se determinar a ligação de receptores de Fc de acordo com métodos conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, ligação de teste de um anticorpo a proteína receptora de Fc em teste BIACORE. Além disso, geralmente, pode-se utilizar qualquer isótipo de IgG de anticorpo no qual a parte de Fc é modificada (por exemplo, por meio da introdução de 1, 2, 3, 4, 5 ou mais substituições de aminoácidos) para minimizar ou eliminar a ligação a receptores de Fc (vide, por exemplo, WO 03/101485, cujo relatório descritivo é incorporado ao presente como referência). Testes como os testes baseados em células para determinar a ligação de receptores de Fc são bem conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em WO 03/101485.

[00227] Em uma realização, o anticorpo pode compreender uma ou mais mutações específicas na região Fc que resultam em anticorpos “silenciosos para Fc" que possuem interação mínima com células efetoras. Funções efetoras silenciadas podem ser obtidas por meio de mutação na região Fc dos anticorpos e foram descritas na técnica: mutação N297A, as mutações LALA (Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20 (6): 685-691); e D265A (Baudino et al, 2008, J. Immunol. 181: 6664-69); vide também Heusser et al, WO 2012/065950, cujas descrições são incorporadas ao presente como referência. Em uma realização, um anticorpo compreende uma,

duas, três ou mais substituições de aminoácidos na região de articulação. Em uma realização, o anticorpo é IgG1 ou IgG2 e compreende uma, duas ou três substituições nos resíduos 233-236, opcionalmente 233-238 (numeração de EU). Em uma realização, o anticorpo é I9gG4 e compreende uma, duas ou três substituições nos resíduos 327, 330 e/ou 331 (numeração de EU). Exemplos de anticorpos I9gG1 de Fc silenciosos são o mutante LALA que compreende mutação L234A e L235A na sequência de aminoácidos Fc de IgG1. Outro exemplo de mutação silenciosa para Fc é mutação no resíduo D265 ou em D265 e P329, por exemplo, conforme utilizado em anticorpo IgG1 como mutação DAPA (D265A, P329A) (US 6.737.056). Outro anticorpo IgG1 silencioso compreende uma mutação no resíduo N297 (por exemplo, mutação N297A, N297S), que resulta em anticorpos aglicosilados/não glicosilados. Outras mutações silenciosas incluem: substituições nos resíduos L234 e G237 (L234A/G237A); substituições nos resíduos S228, L235 e R409 (S228P/L235E/R409K,T,M,L); substituições nos resíduos H268, V309, A330 e A3S31 (H268Q/V309L/AS30S/A331S); substituições nos resíduos C220, C226, C229 e P238 (C220S/C226S/C229S/P238S); substituições nos resíduos C226, C229, E233, L234 e L235 (C226S/C2298S/E233P/L234V/L235A); substituições nos resíduos K322, L235 e L235 (K322A/L234A/L235A); substituições nos resíduos L234, L235 e P331 (L234F/L235E/P331S); substituições nos resíduos 234, 235 e 297; substituições nos resíduos E318, K320 e K322 (L235E/E3S18A/K320A/K322A); substituições nos resíduos (V234A, G237A, P238S); substituições nos resíduos 243 e 264; substituições nos resíduos 297 e 299; e substituições tais como os resíduos 233, 234, 235, 237 e 238 definidos pelo sistema de numeração EU compreendem uma sequência selecionada a partir de PAAAP, PAAAS e SAAAS (vide WO 2011/066501).

[00228] Em uma realização, o anticorpo pode compreender uma ou mais mutações específicas na região Fc que resultam em aumento da estabilidade de um anticorpo de acordo com a presente invenção, por exemplo, que compreende diversos resíduos de aminoácidos aromáticos e/ou que possui alta hidrofobicidade.

Esse anticorpo pode compreender, por exemplo, um domínio Fc com origem em IgG1 humano e compreende uma mutação no(s) resíduo(s) de Kabat 234, 235, 237, 330 e/ou 331. Um exemplo desse domínio Fc compreende substituições nos resíduos de Kabat L234, L235 e P331 (por exemplo, L234A/L235E/P331S ou L234F/L235E/P331S). Outro exemplo desse domínio Fc compreende substituições nos resíduos de Kabat L234, L235, G237 e P331 (por exemplo, L234A/L235E/G237A/P331S). Outro exemplo desse domínio Fc compreende substituições nos resíduos de Kabat L234, L235, G237, A330 e P331 (por exemplo, L234A/L235E/G237A/AS30S/P331S). Em uma realização, o anticorpo compreende um domínio Fc, opcionalmente de isótipo de I9G1 humano, que compreende: substituição L234X1, substituição L235X>? e substituição P331X3, em que X1 é qualquer resíduo de aminoácido diferente de leucina, X2 é qualquer resíduo de aminoácido diferente de leucina e X; é qualquer resíduo de aminoácido diferente de prolina; opcionalmente, em que X1 é alanina ou fenilalanina ou uma de suas substituições conservadoras; opcionalmente, em que X> é ácido glutâmico ou uma de suas substituições conservadoras; opcionalmente, em que X; é serina ou uma de suas substituições conservadoras.

Em outra realização, o anticorpo compreende um domínio Fc, opcionalmente de isótipo de IgG1 humano, que compreende: substituição L234X1, substituição L235X>2, substituição G237Xa e substituição P331X,a, em que X: é qualquer resíduo de aminoácido diferente de leucina, X? é qualquer resíduo de aminoácido diferente de leucina, X3 é qualquer resíduo de aminoácido diferente de glicihna e X« é qualquer resíduo de aminoácido diferente de prolina; opcionalmente, em que X1 é alanina ou fenilalanina ou uma de suas substituições conservadoras; opcionalmente, em que X> é ácido glutâmico ou uma de suas substituições conservadoras; opcionalmente, X; é alanina ou uma de suas substituições conservadoras; e, opcionalmente, X« é serina ou uma de suas substituições conservadoras. Em outra realização, o anticorpo compreende um domínio Fc, opcionalmente de isótipo IG1 humano, que compreende: substituição L234X1, substituição L235X2, substituição G237Xa, substituição G330X: e substituição P331Xs, em que X1: é qualquer resíduo de aminoácido diferente de leucina, X2 é qualquer resíduo de aminoácido diferente de leucina, X3 é qualquer resíduo de aminoácido diferente de glicina, Xa« é qualquer resíduo de aminoácido diferente e alanina e Xs é qualquer resíduo de aminoácido diferente de prolina; opcionalmente, em que X1 é alanina ou fenilalanina ou uma de suas substituições conservadoras; opcionalmente, em que X> é ácido glutâmico ou uma de suas substituições conservadoras; opcionalmente, X; é alanina ou uma de suas substituições conservadoras; opcionalmente, X« é serina ou uma de suas substituições conservadoras; e, opcionalmente, Xs é serina ou uma de suas substituições conservadoras. Na notação abreviada utilizada no presente, o formato é: resíduo do tipo selvagem: posição no polipeptídeo: resíduo mutante, em que as posições de resíduos são indicadas de acordo com a numeração EU de acordo com Kabat.

[00229] Em uma realização, um anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos abaixo ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, 95% ou 99% idêntica, mas que retém os resíduos de aminoácidos nas posições de Kabat 234, 235 e 331 (sublinhados):

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLOQOSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTATYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPP CPAPEAEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKA KGQAQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD

KSRWQAQQGNVFSCSVMHEALHNHYTAKSLSLSPGK (SEQ ID Nº 166).

[00230] Em uma realização, um anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos abaixo ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, 95% ou 99% idêntica, mas que retém os resíduos de aminoácidos nas posições de Kabat 234, 235 e 331 (sublinhados):

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTATYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPP CPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI

AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQOQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID Nº 167).

[00231] Em uma realização, um anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos abaixo ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, 95% ou 99% idêntica, mas que retém os resíduos de aminoácidos nas posições de Kabat 234, 235, 237, 330 e 331 (sublinhados):

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLOQOSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPP CPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI

AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID Nº 168).

[00232] Em uma realização, um anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos abaixo ou uma sequência de aminoácidos pelo menos 90%, 95% ou 99% idêntica, mas que retém os resíduos de aminoácidos nas posições de Kabat 234, 235, 237 e 331 (sublinhados):

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQOSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTATYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPP CPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI

AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQOQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID Nº 169).

[00233] Anticorpos silenciosos para Fc resultam em pouca ou nenhuma atividade de ADCC, o que significa que um anticorpo silencioso para Fc exibe atividade de ADCC que é de menos de 50% de lise celular específica. Preferencialmente, anticorpos substancialmente não possuem atividade de ADCC; o anticorpo silencioso para Fc, por exemplo, exibe atividade de ADCC (lise celular específica) que é de menos de 5% ou menos de 1%. Anticorpos silenciosos para Fc podem também resultar em falta de retícula mediada por FcyR de Siglec-9 e/ou Siglec-7 na superfície celular (por exemplo, de uma célula NK, célula T, monócito, célula dendrítica ou macrófago).

[00234] Em uma realização, o anticorpo possui uma substituição em uma região constante de cadeia pesada em qualquer um, dois, três, quatro, cinco ou mais resíduos selecionados a partir do grupo que consiste de: 220, 226, 229, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 243, 264, 268, 297, 298, 299, 309, 310, 318, 320, 322, 327, 330, 331 e 409 (a numeração de resíduos na região constante de cadeia pesada é de acordo com a numeração de UE de acordo com Kabat). Em uma realização, o anticorpo compreende substituição nos resíduos 234, 235 e 322. Em uma realização, o anticorpo possui substituição nos resíduos 234, 235 e 331. Em uma realização, o anticorpo possui substituição nos resíduos 234, 235, 237 e 331. Em uma realização, o anticorpo possui substituição nos resíduos 234, 235, 237, 330 e

331. Em uma realização, o domínio Fc é do subtipo IgG1 humano. Resíduos de aminoácidos são indicados de acordo com numeração EU de acordo com Kabat.

SEQUÊNCIAS DE CDR DE ANTICORPOS:

[00235] A sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve e pesada de anticorpos mAb1, 2, 3,4, 5,6, A BC, DEeFé exibida na Tabela B. Em realização específica, é fornecido um anticorpo que liga essencialmente o mesmo epítopo ou determinante como anticorpos monoclonais mAb1, 2, 3, 4, 5, 6, A, B, C, D, E ou F; opcionalmente, o anticorpo compreende a região hipervariável de anticorpo mAb1, 2, 3,4,5,6, A, B, C, D, E ou F. Em qualquer uma das realizações do presente, o anticorpo mMAb1,2,3, 4, 5, 6, A, B/ C, D, E ou F pode ser caracterizado pelas sequências de aminoácidos e/ou sequências de ácidos nucleicos que o codificam. Em uma realização, o anticorpo monoclonal compreende VH e/ou VL ou a porção Fab ou F(ab'): de mAb1, 2, 3, 4, 5, 6, A, B, C, D, E ou F. É também fornecido um anticorpo monoclonal que compreende a região variável de cadeia pesada de mAb1. Segundo uma realização, o anticorpo monoclonal compreende as três CDRs da região variável de cadeia pesada de mAb1,2,3,4,5,6,A, BC, D E ou F. É também fornecido um anticorpo monoclonal que compreende adicionalmente a região variável de cadeia leve do MAb1,2,3,4,5,6, A, B, C, D, E ou F, ou uma, duas ou três das CDRs da região variável de cadeia leve do mAb1, 2, 3, 4, 5, 6, A, B/ C, D, E ou F correspondente. Opcionalmente, qualquer uma ou mais das mencionadas CDRs de cadeia leve ou pesada pode conter uma, duas, três, quatro, cinco ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições, inserções ou exclusões). É opcionalmente fornecido um anticorpo no qual qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve e/ou pesada que compreende, no todo ou em parte, uma região de ligação de antígenos de anticorpo mMAb1 é fundida a uma região constante de imunoglobulina do tipo IgG humano, opcionalmente uma região constante humana, opcionalmente um isótipo I9G1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humano, que compreende ainda opcionalmente uma substituição de aminoácidos para reduzir a função efetora (ligação a receptores de Fcy humanos).

[00236] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo que compreende: uma região HCDR1 de mAb1 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-1 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR2 de mAb1 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-1 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR3 de mAb1 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-1 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR1 de mAb1 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-1 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR2 de mAb1 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-1 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e uma região LCDR3 de mAb1 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-1 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser excluídos ou substituídos por um aminoácido diferente.

TABELA A-1

DE e emana SG] runs — ESG] ssunes. [ame [fome] | xo [=] nm | mer [a faramam|ar | iorocm [se fienaea

DE e emana ] runs — ESG] ssuenes. ae Ts [sam | | ss [a mem mer Ts [own [|O 6 Tso mera

[00237] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo, em que o anticorpo compreende: uma região HCDR1 de mAb3 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-3 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR2 de mAb3 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-3 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR3 de mAb3 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-3 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR1 de mAb3 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-3 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR2 de mAb3 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-3 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e uma região LCDR3 de mAb3 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-3 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser excluídos ou substituídos por um aminoácido diferente.

[00238] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo, em que o anticorpo compreende: uma região HCDR1 de mAb4 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-4 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR2 de mAb4 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-4 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR3 de mAb4 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-4 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR1 de mAb4 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-4 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR2 de mAb4 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-4 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e uma região LCDR3 de mAb4 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-4 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser excluídos ou substituídos por um aminoácido diferente. TABELA A-4 [RR HCDRZ HEDRs Definição de CDR Sequência Sequência Sequência SYDMS | 50 [HIGSGGGNIYYPDTVKG| 52 | LIFTTGFYGMDY | | cnotia [48] crarssy | | secs | | Mer [49] crarssyo |51] —Gsecen LCDR1 LCDR2 LCDR3 Definição de CDR Sequência Sequência Sequência |mAb4| Kabat | 55 [RASQDISSYLN| 58 | YTSRLHS QQGNALPWT | | cnota [56] sapissy | | —yrs == 6o| GnALPW [ver 157 | aorssy is se | aocnatPnT |

[00239] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo, em que o anticorpo compreende: uma região HCDR1 de mAb5 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-5 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR2 de mAb5 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-5 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR3 de mAb5 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-5 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR1 de mAb5 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-5 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR2 de mAb5 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-5 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e uma região LCDR3 de mAb5 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-5 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser excluídos ou substituídos por um aminoácido diferente. TABELA A-5 [HR | HoR | AR Definição de CDR Sequência Sequência Sequência DYNMN — | 64 INIDPYYGATSYNQRFKG| 66 | GDSLFAY | | enota [6 | eysessor | | Prve [6 | psFa | [mer Te | evsrsom [66] rea — [68 |ARGDSLFAY| LCDR1 LCDR2 LCDR3 Definição de CDR Sequência Sequência Sequência |mabs| Kabat | 69 IKASQNVGTNVA| 72 | SASSRYS QQYITYPYT | | enota |70| sonvvemrn | | sas 7) vmPpy [CLver Tr [DT owe TA sas Tr aovmen]

[00240] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo, em que o anticorpo compreende: uma região HCDR1 de mAbLA que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-7 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR2 de mAbLA que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-7 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR3 de mAbPA que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-7 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR1 de mALA que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-7 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR2 de mAbLA que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-7 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e uma região LCDR3 de mAbA que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-7 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser excluídos ou substituídos por um aminoácido diferente.

TABELA A-7 [OHBR [| HoR | ROR | Definição

[00241] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo, em que o anticorpo compreende: região HCDR1 de mAbB que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-8 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; opcionalmente, em que o HCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos SYWIH (SEQ ID Nº 198); uma região HCDR2 de mAbB que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-8 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6,7,8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; opcionalmente, em que o HCDR2 compreende uma sequência de aminoácidos EINPSNGHTNYAEKFKT (SEQ ID Nº 199); uma região HCDR3 de mAbB que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-8 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; regiãd LCDRI1 de mALB que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-8 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; opcionalmente, em que a LCDR1 compreende uma sequência de aminoácidos QASQDINNYLN (SEQ ID Nº 200); uma região LCDR2 de mAbB que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-8 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6,7,8,

[00242] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo, em que o anticorpo compreende: uma região HCDR1 de mAbC que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-9 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR2 de mAbC que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-9 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR3 de mAbC que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-9 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR1 de mMAbC que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-9 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR2 de mAbC que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-9 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e uma região LCDR3 de mAbC que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-9 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser excluídos ou substituídos por um aminoácido diferente.

[00243] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo, em que o anticorpo compreende: uma região HCDR1 de mAbD que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-10 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR2 de mAPbD que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-10 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR3 de mAPbD que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-10 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR1 de mALD que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-10 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR2 de mALD que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-10 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e uma região LCDR3 de mALD que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-10 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser excluídos ou substituídos por um aminoácido diferente.

TABELA A-10 [HR | AR | HOR | Definição de

EEE ia E ia Ei |

KEECNECINNDOS [| enota Ti] senvsy | [ max 1 nvoFew | Ever TD ever TT NaK 133 fansverPw]

[00244] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo, em que o anticorpo compreende: uma região HCDR1 de mALE que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-11 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR2 de mAbLE que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-11 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR3 de MALE que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-11 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR1 de MALE que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-11 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR2 de mAbLE que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-11 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e uma região LCDR3 de mAbLE que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-11 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser excluídos ou substituídos por um aminoácido diferente. TABELA A-11 [OHBR | HOR | Hom Definição de CDR Sequência Sequência Sequência TFEMH — | 128 VISSGSNAIYYADTVKG|130 | PGYGAWFAY | | cnota [126] GFTASTE | | ——scsN [131] GYGAWFA | [met T127] emeSTAS T129] ssesna LCDR1 LCDR2 LCDR3 Definição de CDR Sequência Sequência Sequência RASSSVSSAYLH| 136 | STSNLAS QQYSAYPYT | | cnota [134] sssvssay | | ——sts [138 ysavPY | | mer [186] ssvssar | | st [137] oovsavavt |

[00245] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo, em que o anticorpo compreende: uma região HCDR1 de mAbF que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-12 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR2 de mAbF que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-12 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR3 de mAbF que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-12 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR1 de mALbF que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-12 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR2 de mAbF que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-12 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e uma região LCDR3 de mAbF que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A-12 ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, opcionalmente em que um ou mais desses aminoácidos podem ser excluídos ou substituídos por um aminoácido diferente. TABELA A-12 [orem | HCDR2 HCDRs Definição de CDR Sequência Sequência Sequência DYSMH — [139 VISTYNGNTNYNQKFKG|141 |RGYYGSSSWFGY | | enota [118] GyremoY | | neo — j12] eyvessswre LCDR1 LCDR2 LCDR3 Definição de CDR Sequência Sequência Sequência KASQNVGTDVA| 147 | SASYRYS QQYNSFPYT | | enota [145 sanvero | | sas ==ujlio] ynsFPY | [mer [16] onvero | | sas je] covnsFPYT |

[00246] Em outro aspecto de qualquer uma das realizações do presente, qualquer uma das sequências HCDR1, 2, 3 e LCDR1, 2 e 3 pode ser opcionalmente especificada como todas (ou cada uma independentemente) sendo as do sistema de numeração de Kabat (conforme indicado na Tabela A- 1 a A-12 para cada CDR), as do sistema de numeração de Chotia (conforme indicado na Tabela A-1 a A-12 para cada CDR), as do sistema de numeração IMGT (conforme indicado na Tabela A-1 a A-12 para cada CDR) ou qualquer outro sistema de numeração apropriado.

[00247] Em outro aspecto de qualquer uma das realizações do presente, qualquer uma das CDRs 1, 2 e 3 das cadeias leve e pesada de MADbA, mAbB, mAbC, mAbD, mAbE, mAbF, mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 ou mAb6 pode ser caracterizada por uma sequência com pelo menos 4, 5, 6,7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos e/ou contendo uma sequência de aminoácidos que compartilha pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade de sequências com a CDR específica ou o conjunto de CDRs relacionado no SEQ ID Nº correspondente.

[00248] Em qualquer um dos anticorpos de acordo com a presente invenção, por exemplo, mAbA, mAbB, mAbC, mAbD, mAbE, mAbF, MAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5 ou mAb6, a região variável especificada e as sequências de CDR podem compreender modificações de sequências, tais como uma substituição (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais modificações de sequências). Em uma realização, CDRs 1, 2 e/ou 3 das cadeias leve e pesada compreendem uma, duas, três ou mais substituições de aminoácidos, em que o resíduo substituído é um resíduo presente em uma sequência de origem humana. Em uma realização, a substituição é uma modificação conservadora. Modificação de sequências conservadora indica uma modificação de aminoácidos que não altera nem afeta significativamente as características de ligação do anticorpo que contém a sequência de aminoácidos. Essas modificações conservadoras incluem substituições, adições e exclusões de aminoácidos. Podem ser introduzidas modificações em anticorpos de acordo com a presente invenção por meio de métodos padrão conhecidos na técnica, tais como mutagênese dirigida a local e mutagênese mediada por PCR. Substituições de aminoácidos conservadoras incluem aquelas em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que possui cadeia lateral com propriedades físico-químicas similares. Sequências de CDR e região variável especificadas podem compreender uma, duas, três, quatro ou mais inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. Quando forem realizadas — substituições, substituições preferidas serão modificações conservadoras. Famílias de resíduos de aminoácidos que possuem cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (tais como lisina, arginina e histidina), cadeias laterais ácidas (tais como ácido aspártico e ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (tais como glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína e triptofano), cadeias laterais não polares (tais como alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina e metionina), cadeias laterais beta ramificadas (tais como treonina, valina e isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (tais como tirosina, fenilalanina, triptofano e histidina). Um ou mais resíduos de aminoácidos dentro das regiões CDR de anticorpos de acordo com a presente invenção podem, portanto, ser substituídos por outros resíduos de aminoácidos da mesma família de cadeia lateral e o anticorpo alterado pode ser testado para determinar a função retida (ou seja, as propriedades definidas no presente), utilizando-se os testes descritos no presente.

[00249] As sequências das CDRs, de acordo com os sistemas de definições IMGT, Kabat e Chothia, são resumidas nas Tabelas A-1 a A-12. As sequências das regiões variáveis dos anticorpos de acordo com a presente invenção são relacionadas na Tabela B abaixo. Em qualquer uma das realizações do presente, sequência VL ou VH pode ser especificada ou numerada de forma a compreender adicionalmente ou não um peptídeo de sinal ou qualquer uma de suas partes.

[00250] Em uma realização, os anticorpos de acordo com a presente invenção são fragmentos de anticorpos que retêm suas propriedades funcionais e/ou de ligação.

TABELAB [ | seomgNn | Sequência de Aminoácidos

DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITGGFAWNWIR mMAb1 VH 3 QFPGNTLEWMGYIGYGGSTSYNPSLNSRISITRDTSKNHF

FLQFNSVTTDDSATYYCARGDYLFAYWGQGTLVTVSA

DIVMTAOSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVNTAVAWYQQK mMAb1 VL 4 PGQOSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQ

AEDLAVYYCQAQQHYSTPRTFGGGTKLEIK

EVOLQESGPGLVKPSQOSLSLTCTVTGYSITGGFAWNWIR mAb2 VH 5 QFPGNTLEWMGYIGYGGSTSYNPSLNSRISITRDTSKNHF

FLQFNSVTTEDSATYYCARGDYLFAYWGQGTLVTVSA

DIVMTASHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVNTAVAWYQQK mAb2 VL PGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQ

AEDLAVYYCQQHYSTPRTFGGGTKLEIK

EVQOLLETGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITGGFAWNWIR mAb3 VH 7 QFPGNTLEWMGYIGYGGSTSYNPSLNSRISITRDTSKNHF

FLQFNSVTTEDSATYYCARGDYLFAYWGQGTLVTVSA

DILMTOSPASLSASVGETVSITCRASGNIHNYLAWYLQORQ mAb3 VL GKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGTGSGTQFSLKINSLQ

PEDFGSYYCQHFWSTPRTFGGGTKLEIK

DVOQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVR mAb4 VH QSPEKRLEWIAHIGSGGGNIYYPDTVKGRFTISRDNAKNT

LYLQMRSLKSEDTAMYYCARLIFTTGFYGMDYWGQGTSV TVSS

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISSYLNWYQQKP mMAb4 VL 10 DGTIKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLDQD

DIATYFCAQQGNALPWTFGGGTKLEIK

EIQLAQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFSDYNMNWVKQ mAb5 VH 11 SNGKSLEWIGNIDPYYGATSYNQRFKGKATLTVDKSSST

AYMQLKSLTSEDSAVYYCARGDSLFAYWGHGTLVTVSA

DIVMTASQEFMSTSLGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQ mAb5 VL 12 KPGQSPKALLYSASSRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISN

VOSEDLAEYFCQQYITYPYTFGGGTKLEIK

EIALAQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFSDYNMNWVKQ mAb6 VH 183 SNGKSLEWIGNIDPYYGATSYNQRFKGKATLTVDKSSST

AYMOQLKSLTSEDSAVYYCARGDSLFAYWGQGTLVTVSA

DIVMTASQEFMSTSLGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQ mMAb6 VL 14 KPGQOSPKALLYSASSRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTINN

MQSEDLAEYFCQQYITYPYTFGGGTKLEIK

QVOLQOQPGAELVKPGSPVKLSCKASYFTFTSYWMHWVR MAbA VH 15 QRPGQGLEWIGEINPSNGHTNYNEKFESKATLTVDRSSS

TAYMOQLSSLTSEDSAVFYCANGVESYDFDDALDYWGQG TSVTVSS

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDINNYLNWYQQKP MAbA VL 16 DGTIKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTINNLEQE

DIATYFCAQGNTLPFTFGGGTKLEIK

QVALAQPGAELVKPGASVKLSCKASVYTFTSYWMHWVK mMAbB VH 17 QRPGQGLEWIGEINPSNGHTNYNEKFKTKAKLTVDKSSS

TAYMOQLSSLTSEDSAVYFCANGVETYDFDDAMDYWGQOG

TSVTVSS mMADbB VL 18 DIQMTOQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDINNYLNWYQQKP

DGTVKLLIYFTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQ

[ | seomgNn | Sequência de Aminoácidos Po o EDIATYFCOQGDTFPFTFGGGTKLEIK

QIQALVASGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYEMNWVKE mAbC VH 19 APGKGLKWMGWINTYTGESTYADDFKGRFAFSLETSAST

VYLQINNLKDEDVATYFCVRDDYGRSYGFAYWGQGTLVT VSA

NIVLTAOSPASLTVSLGQORANISCRASESVDSYGNSFMHW mMAbC VL 20 YQAQKPGQPPKLLIYLASKLESGVPARFSGSGSRTDFTLTI

DPVETDDAATYYCHQNNEDPPWTFGGGTKLEIK

QIQALVASGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWVKQ mAbD VH 21 APGKGLKWMGWIITETGEPTYADDFRGRFAFSLETSANT

AYLOINNLKNEDTATYFCARDFDGYWGQGTTLTVSS

DILMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKR mMAbD VL 22 GKSPQFLVYNAKTLTEGVPSRFRGSGSGTQFSLKINSLQ

PEDFGTYYCQHHYGFPWTFGGGTKLEIK

DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSTFGMHWVR MAbE VH 23 QAPEKGLEWVAYISSGSNAIY YADTVKGRFTISRDNPKNT

LFLQOMTSLRSEDTAMYYCASPGYGAWFAYWGQGTLVTV SA

ENVLTOASPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSAYLHWYQQ MAbE VL 24 KSGASPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSV

EAEDAATYYCQQYSAYPYTFGGGTKLEIK

QVALAQSGPEVVRPGVSVKISCKGSGYTFTDYSMHWVK MAbF VH 25 QSHAKSLEWIGVISTYNGNTNYNQKFKGKATMTVDKSSS

TAYMELARLTSEDSAIYYCARRGYYGSSSWFGYWGQGT LVTVSA

DIVMTASQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTDVAWYQQ mAbF VL 26 KPGQSPEALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGADFTLTISNV

QSEDLAEYFCQQYNSFPYTFGGGTKLEIK

[00251] Exemplos de variantes humanizadas de mMAbLA incluem anticorpos que possuem as combinações de regiões variáveis de cadeia leve e pesada a seguir (conforme exibido na Tabela C e no Exemplo 2): MAbA HOLO, mALA HOL1, MALA HOL2, MALA H1LO, MALbA H1L1, mAbLA H1L2, MAbA H2LO, mADA H2L1, mADA H2L2, mADA H3LO, MALA H3L1 ou MALA H3L2.

[00252] Em qualquer aspecto, um anticorpo ou domínio de ligação de antígenos pode compreender VH e VL, em que cada um dentre VH e VL compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica ao VH e VL correspondente de qualquer um dos anticorpos; MAbA HOLO, mALA HOL1, MALA HOL2, mAbA H1LO, mALA H1L1, MAbA H1L2, MALA H2LO0, MALA H2L1, mALA H2L2, mALA H3LO, mALA H3L1 ou mAbA H3L2.

[00253] Exemplos de variantes humanizadas de mAbB incluem anticorpos que possuem as combinações de regiões variáveis de cadeia leve e pesada a seguir (conforme exibido na Tabela C e no Exemplo 2): MAbB HOLO, mAbB HOL1, mALB HOL2, mALB H1LO, mALB H1L1, mALB H1L?2, MAbB H2LO, mAbB H2L1, mALB H2L2, mAbLB H3LO, mALB H3L1, mALB H3L2, mMAbB H4LO, mALB H4L1, mAbB H4L2, mALB H5LO, mALbB H5L1 ou mALB H5L2.

[00254] Em qualquer aspecto, um anticorpo ou domínio de ligação de antígenos pode compreender VH e VL, em que cada um dentre VH e VL compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica ao VH e VL correspondente de qualquer um dos anticorpos; MAbB HOLO, mALB HOL1, mALB HOL2, mALB H1LO, mALB H1L1, mMAbB H1L2, mALB H2LO0, mALB H2L1, mALB H2L2, mAbB H3LO, mMAbLB H3L1, mMAbB H3L2, mMAbB H4LO, mALbB H4L1, mADB H4L2, mADB H5LO, mALB H5L1 ou mAbB H5L2.

[00255] Exemplos de variantes humanizadas de mAbC incluem anticorpos que possuem as combinações de regiões variáveis de cadeia leve e pesada a seguir (conforme exibido na Tabela C e no Exemplo 2): mMAbC HOLO, MAbC HOL1, MAbC H1ILO, MALC H1IL1, MALC H2LO, mMALbC H2L1, MAbC H3LO ou mAbC H3L1.

[00256] Em qualquer aspecto, um anticorpo ou domínio de ligação de antígenos pode compreender VH e VL, em que cada um dentre VH e VL compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica ao VH e VL correspondente de qualquer um dos anticorpos: MAbC HOLO, MAbC HOL1, MAbC H1LO, MAbC H1L1, mAbC H2L0, MAbC H2L1, mAbC H3LO ou mAbC H3L1.

[00257] Exemplos de variantes humanizadas de mALbD incluem anticorpos que possuem as combinações de regiões variáveis de cadeia leve e pesada a seguir (conforme exibido na Tabela C e no Exemplo 2): mAbD HOLO, mAbD HOL1, mAbD HOL2, mAPD H1LO, mAbD H1L1, mALD H1L2, mAPD H2L0, mAbD H2L1 ou mAbD H2L2.

[00258] Em qualquer aspecto, um anticorpo ou domínio de ligação de antígenos pode compreender VH e VL, em que cada um dentre VH e VL compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica ao VH e VL correspondente de qualquer um dos anticorpos: MAbD HOLO, mMAbD HOL1, mAbD HOL2, mAbD H1LO, mALD H1L1, mMAbD H1L2, mAbD H2L0, mAbD H2L1 ou mAbD H2L2.

[00259] Sequências de aminoácidos da região variável de cadeia leve e pesada de mAbDA, mALB e mAbD humanizados encontram-se relacionadas no presente na Tabela C, abaixo, e no Exemplo 2.

TABELA C

VAGEGION VLGEGIONI mAbB H3LO mAbB H3L1 mAbB H3L2

MADE HALO mADB FAL mADB HAL2 mAbB H5LO mAbB H5L1 mAbB H5L2 mADD HOL mADD HOL2 MAD H1LO MAD H1L1 mADD H1L2 mADD H2L1 mADD H2L2

MAC HOLO mAbC HOL1 MAC H1LO mAbE IL mAbC H2Lo mADC FaL1 MAC H3LO mAbC H3L1

[00260] Uma região variável de cadeia pesada de anticorpo MAbA, mAbB, mAbC ou mAbD pode compreender, para o anticorpo correspondente: uma região de cadeia principal FR1 de cadeia pesada humana; uma região HCDR1 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A ou uma sequência de pelo menos 4, 5,6,7,8,9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; região de cadeia principal FRQ de cadeia pesada humana; região HCDR2 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme definido na Tabela A ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região de cadeia principal FR3 de cadeia pesada humana; e uma região HCDR3 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme definido na Tabela A ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente. Opcionalmente, a região variável compreende adicionalmente uma região de cadeia principal FR4 de cadeia pesada humana.

[00261] Uma região variável de cadeia leve de anticorpo MAbA, mAbB, mAbC ou mALbD pode compreender, para o anticorpo correspondente: uma região de cadeia principal FR1 de cadeia leve humana; uma região LCDR1 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; região de cadeia principal FR2 de cadeia leve humana; região LCDR2 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme definido na Tabela A ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, em que um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região de cadeia principal FR3 de cadeia leve humana; e uma região LCDR3 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme descrito na Tabela A ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 de seus aminoácidos contíguos, em que um ou mais desses aminoácidos podem ser excluídos ou substituídos por um aminoácido diferente. Opcionalmente, a região variável compreende adicionalmente uma região de cadeia principal FR4 de cadeia leve humana.

[00262] Um exemplo de combinação de VH e VL inclui: VA que compreende CDR1, 2 e 3 de VH de SEQ ID Nº 15 e FR1, 2 e 3 de um segmento genético IGHV1-69 ou IGHV1-46 humano e VL que compreende

CDR1, 2 e 3 de VL de SEQ ID Nº 16 e FR1, 2 e 3 de um segmento genético IGKV1-33 humano. Em uma realização, o VH compreende uma substituição em cadeia principal em 1, 2, 3 ou 4 dos resíduos 26, 27, 74 e/ou 98 de SEQ ID Nº 15. Em uma realização, o VL compreende uma substituição em cadeia principal em 1, 2, 3 ou 4 dos resíduos 44 e/ou 71 de SEQ ID Nº 16.

[00263] Outro exemplo de combinação de VH e VL inclui: VH que compreende CDR1, 2 e 3 de VH de SEQ ID Nº 17 e FR1, 2e 3 de um segmento genético IGHV1-46 e/ou IGHV1-69 humano e VL que compreende CDR1, 2 e 3 do VL de SEQ ID Nº 18 e FR1, 2 e 3 de um segmento genético IGKV1-33 humano.

[00264] Outro exemplo de combinação de VH e VL inclui: VH que compreende CDR1, 2 e 3 de VH de SEQ ID Nº 21 e FR1, 2e 3 de um segmento genético IGHV7-4-1*02 humano (opcionalmente em conjunto com FR4 de um segmento genético IGHJ6*01 humano) e VL que compreende CDR1, 2 e 3 do VL de SEQ ID Nº 22 e FR1, 2 e 3 de um segmento genético IGKV1-39 humano (por exemplo, IGKV1-39*01). Em uma realização, as CDRs são determinadas de acordo com a numeração de Kabat. Em uma realização, o VH compreende uma substituição em cadeia principal em 1, 2, 3 ou 4 dos resíduos 26, 27, 30 e/ou 74 de SEQ ID Nº 17. Em uma realização, o VH compreende uma substituição de VH em CDR em 1, 2 ou 3 dos resíduos 34, 61 e/ou 66 de SEQ ID Nº 17, tais como uma substituição M34], substituição NS1A e/ou substituição T66G.

[00265] Em outro aspecto, exemplos de combinações de VH e VL para anticorpos MALA humanizados incluem: a. VH que compreende uma sequência de aminoácidos da (ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% idêntica à) sequência de aminoácidos do domínio variável de MALA HO, H1, H2 ou H3 e VL que compreende uma sequência de aminoácidos da (ou pelo menos 70%, 80%,

90%, 95% ou 98% idêntica à) sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbA LO; b. VH que compreende uma sequência de aminoácidos da (ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% idêntica à) sequência de aminoácidos do domínio variável de MALA HO, H1, H2 ou H3 e VL que compreende uma sequência de aminoácidos da (ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% idêntica à) sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbA L1; ou Cc. VH que compreende uma sequência de aminoácidos da (ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% idêntica à) sequência de aminoácidos do domínio variável de MALA HO, H1, H2 ou H3 e VL que compreende uma sequência de aminoácidos da (ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% idêntica à) sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbA L2.

[00266] Em outro aspecto, exemplos de combinações de VH e VL para anticorpos MALB humanizados incluem: a. VH que compreende uma sequência de aminoácidos da (ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% idêntica à) sequência de aminoácidos do domínio variável de MAbB HO, H1, H2, H3, H4 ou H5 e VL que compreende uma sequência de aminoácidos da (ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% idêntica à) sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbB LO; b. VH que compreende um aminoácido da (ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% idêntico à) sequência de aminoácidos do domínio variável de mALbB HO, H1, H2, H3, H4 ou H5 e VL que compreende uma sequência de aminoácidos da (ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% idêntica à) sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbB L1; ou Cc. VH que compreende uma sequência de aminoácidos da

(ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% idêntica à) sequência de aminoácidos do domínio variável de MAbB HO, H1, H2, H3, H4 ou H5 e VL que compreende uma sequência de aminoácidos da (ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% idêntica à) sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbB L2.

[00267] Em outro aspecto, exemplos de combinações de VH e VL para anticorpos MAbC humanizados incluem: a. VH que compreende uma sequência de aminoácidos da (ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% idêntica à) sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbC HO, H1, H2 ou H3 e VL que compreende uma sequência de aminoácidos da (ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% idêntica à) sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbC LO; ou b. VH que compreende um aminoácido da (ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% idêntica à) sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbC HO, H1, H2 ou H3 e VL que compreende uma sequência de aminoácidos da (ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% idêntica à) sequência de aminoácidos do domínio variável de MAbC L1.

[00268] Em outro aspecto, exemplos de combinações de VH e VL para anticorpos MALD humanizados incluem: a. VH que compreende uma sequência de aminoácidos da (ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% idêntica à) sequência de aminoácidos do domínio variável de mALD H0, H1 ou H2 e VL que compreende uma sequência de aminoácidos da (ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% idêntica à) sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbD LO; b. VH que compreende uma sequência de aminoácidos da (ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% idêntica à) sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbD H0, H1 ou H2 e VL que compreende uma sequência de aminoácidos da (ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% idêntica à) sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbD L1; ou Cc. VH que compreende uma sequência de aminoácidos da (ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% idêntica à) sequência de aminoácidos do domínio variável de mALD H0, H1 ou H2 e VL que compreende uma sequência de aminoácidos da (ou pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% idêntica à) sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbD L2.

FORMULAÇÕES DE ANTICORPOS:

[00269] Pode-se incorporar um anticorpo anti-Siglec em uma formulação farmacêutica que compreende em concentração de 1 mg/ml a 500 mg/ml, em que a mencionada formulação possui pH de 2,0 a 10,0. A formulação pode compreender adicionalmente um sistema tampão, conservante(s), agente(s) de tonicidade, agente(s) quelante(s), estabilizantes e tensoativos. Em uma realização, a formulação farmacêutica é uma formulação aquosa, ou seja, uma formulação que compreende água. Essa formulação é tipicamente uma solução ou suspensão. Em realização adicional, a formulação farmacêutica é uma solução aquosa. A expressão “formulação aquosa” é definida como formulação que compreende pelo menos 50% p/p de água. De forma similar, a expressão “solução aquosa” é definida como solução que compreende pelo menos 50% p/p de água e a expressão “suspensão aquosa” é definida como suspensão que compreende pelo menos 50% p/p de água.

[00270] Em outra realização, a formulação farmacêutica é uma formulação seca por congelamento, à qual o médico ou o paciente adiciona solventes e/ou diluentes antes do uso.

[00271] Em outra realização, a formulação farmacêutica é uma formulação seca (por exemplo, seca por congelamento ou seca por pulverização) pronta para uso sem dissolução anterior.

[00272] Em aspecto adicional, a formulação farmacêutica compreende uma solução aquosa desse anticorpo e um tampão, em que o anticorpo está presente em concentração de 1 mg/ml ou acima e a mencionada formulação possui pH de cerca de 2,0 a cerca de 10,0.

[00273] Em outra realização, o pH da formulação encontra- se na faixa selecionada a partir da lista que consiste de cerca de 2,0 a cerca de 10,0, cerca de 3,0 a cerca de 9,0, cerca de 4,0 a cerca de 8,5, cerca de 5,0 a cerca de 8,0 e cerca de 5,5 a cerca de 7,5.

[00274] Em realização adicional, o tampão é selecionado a partir do grupo que consiste de acetato de sódio, carbonato de sódio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, di-hidrogênio fosfato de sódio, hidrogênio fosfato dissódico, fosfato de sódio e tris(hidroximetil)aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico ou suas misturas. Cada um desses tampões específicos constitui uma realização alternativa da presente invenção.

[00275] Em realização adicional, a formulação compreende adicionalmente um conservante farmaceuticamente aceitável. Em realização adicional, a formulação compreende adicionalmente um agente isotônico. Em realização adicional, a formulação também compreende um agente quelante. Em realização adicional da presente invenção, a formulação compreende adicionalmente um estabilizante. Em realização adicional, a formulação compreende adicionalmente um tensoativo. Por conveniência, faz-se referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19º edição, 1995.

[00276] É possível que outros ingredientes possam estar presentes na formulação farmacêutica de peptídeos de acordo com a presente invenção. Esses ingredientes adicionais podem incluir agentes umectantes,

emulsificantes, antioxidantes, agentes de volume, modificadores da tonicidade, agentes quelantes, íons metálicos, veículos oleaginosos, proteínas (por exemplo, albumina de soro humano, gelatina ou proteínas) e um zwitteríon (por exemplo, aminoácido tal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Naturalmente, esses ingredientes adicionais não deverão prejudicar a estabilidade geral da formulação farmacêutica de acordo com a presente invenção.

[00277] Composições farmacêuticas que contêm um anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser administradas a pacientes necessitados desse tratamento em diversos locais, tais como locais tópicos, por exemplo pele e locais das mucosas, em locais que evitam absorção, tais como administração em artérias, veias, no coração e em locais que envolvem absorção, tais como administração na pele, sob a pele, em músculos ou no abdômen. A administração de composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção pode ser realizada por meio de diversas vias de administração, tais como subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, lingual, sublingual, bucal, na boca, oral, no estômago e intestino, nasal, pulmonar, tal como por meio dos bronquiolos e alvéolos ou uma de suas combinações, epidérmica, dérmica, transdérmica, vaginal, retal, ocular, tal como por meio da conjuntiva, uretal e parenteral a pacientes necessitados desse tratamento.

[00278] Formulações de anticorpos apropriadas podem ser também determinadas por meio do exame de experiências com outros anticorpos monocionais terapêuticos já desenvolvidos. Demonstrou-se que diversos anticorpos monoclionais são eficientes em situações clínicas, tais como Rituxan (Rituximab), Herceptin (Trastuzumab) Xolair (Omalizumab), Bexxar (Tositumomab), Campath (Alemtuzumab), Zevalinn Oncolym e formulações similares, que podem ser utilizados com os anticorpos de acordo com a presente invenção. Anticorpos monoclonais podem ser fornecidos, por exemplo, em concentração de 10 mg/ml em ampolas descartáveis de 100 mg (10 ml) ou 500 mg (50 ml), formuladas para administração IV em 9,0 mg/ml de cloreto de sódio, 7,35 mg/ml de di-hidrato citrato de sódio, 0,7 mg/ml de polissorbato 80 e água estéril para injeção. O pH é ajustado em 6,5. Em outra realização, o anticorpo é fornecido em formulação que compreende cerca de mM de citrato de Na, cerca de 150 mM de NaCl, sob pH de cerca de 6,0.

[00279] Diagnóstico e tratamento de malignidades:

[00280] São também fornecidos métodos de tratamento de indivíduos, notadamente pacientes humanos, utilizando um anticorpo anti- Siglec conforme descrito no presente. Em uma realização, a presente invenção fornece o uso de um anticorpo conforme descrito no presente na preparação de uma composição farmacêutica para administração a pacientes humanos. Tipicamente, o paciente sofre ou encontra-se em risco de câncer ou doenças infecciosas, tais como doenças virais ou bacterianas.

[00281] Em um aspecto, por exemplo, a presente invenção fornece um método de potencialização da atividade da célula imune restrita por Siglec-7 e/ou 9, tais como linfócitos, em pacientes dele necessitados, que compreende a etapa de administração de neutralização de um anticorpo anti- Siglec-7 e/ou 9 para o mencionado paciente. O anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo anti-Siglec-7 e/ou 9 humano ou humanizado, que reduz ou evita ativação mediada por ácido siálico dos receptores Siglec-7 e/ou Siglec-

9. Em uma realização, o método dirigido ao aumento da atividade desses linfócitos em pacientes portadores de doenças nas quais o aumento da atividade de linfócitos (por exemplo, célula T CD8+ e/ou NK) é benéfico, que envolve, afeta ou é causado por células susceptíveis à lise por células T CD8+ ou NK, ou que é causado ou caracterizado por atividade de células T CD8+ ou NK insuficiente, tal como câncer ou doença infecciosa. Em um aspecto, por exemplo, a presente invenção fornece um método de ampliação da atividade (por exemplo, ativação celular, atividade ou imunidade antitumores, produção de citoquinas e proliferação) de células imunes restritas por Siglec-7 e/ou 9, tais como célula NK (por exemplo, célula CD56hrihante), célula T, monócito, célula dendrítica, macrófago (por exemplo, macrófago M2 ou imunossupressor) em pacientes dele necessitados, que compreende a etapa de administração de anticorpos anti-Siglec-7 e/ou 9 neutralizantes de acordo com a presente invenção ao mencionado paciente.

[00282] Em uma realização, os anticorpos de acordo com a presente invenção são utilizados no tratamento de tumores caracterizados pela expressão da enzima ST3GAL6 e/ou ST3GAL1 (ou, por exemplo, alto nível de atividade das enzimas ST3GAL6 e/ou ST3GAL1), opcionalmente sobre- expressão da enzima ST3GAL6 (em comparação com a expressão, por exemplo, em tecido saudável em indivíduos saudáveis).

[00283] Mais especificamente, os métodos e composições de acordo com o presente são utilizados para o tratamento de uma série de cânceres e outras doenças proliferativas. Como esses métodos operam aumentando a reação imunológica por meio do bloqueio de receptores inibidores sobre linfócitos, eles são aplicáveis a uma variedade de cânceres muito grande. Em uma realização, pacientes humanos tratados com anticorpo anti-Siglec de acordo com a presente invenção são portadores de câncer do fígado, câncer dos ossos, câncer pancreático, câncer da pele, câncer da cabeça ou do pescoço (por exemplo, HNSCC), câncer de mama, câncer do pulmão, câncer do pulmão não de células pequenas (NSCLC), câncer da próstata resistente à castração (CRPC), melanoma, câncer do útero, câncer do cólon, câncer retal, câncer da região anal, câncer do estômago, câncer dos testículos, câncer do útero, carcinoma dos tubos falopianos, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, linfoma não de Hodgkin, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores sólidos da infância, linfoma linfocítico, câncer da bexiga, câncer do rim ou ureter, carcinoma da pélvis renal, neoplasma do sistema nervoso central (SNC), linfoma do SNC primário, angiogênese de tumores, tumor do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, adenoma da pituitária, sarcoma de Kaposi, câncer epidermoide, câncer das células escamosas, cânceres induzidos pelo ambiente, incluindo os induzidos por amianto, malignidades hematológicas, incluindo, por exemplo, mieloma múltiplo, linfoma de células B, linfoma de Hodgkin/linfoma de células B mediastinais primário, linfomas não de Hodgkin, linfoma mieloide agudo, leucemia mielógena crônica, leucemia linfoide crônica, linfoma folicular, linfoma de células B grandes difuso, linfoma de Burkitt, linfoma de células grandes imunoblástico, linfoma linfoblástico B precursor, linfoma de células manto, leucemia linfoblástica aguda, micose fungoide, linfoma de células grandes anaplástico, linfoma de células T, linfoma linfoblástico T precursor e quaisquer combinações dos mencionados cânceres. A presente invenção também se aplica ao tratamento de cânceres metastáticos. Os pacientes podem ser testados ou selecionados para determinar um ou mais dos atributos clínicos descritos acima antes, durante ou depois do tratamento.

[00284] O tratamento com base em anticorpo anti-Siglec pode também ser utilizado para tratar ou evitar doenças infecciosas, preferencialmente incluindo quaisquer infecções causadas por infecções por vírus, bactérias, protozoários, mofos ou fungos. Esses organismos infecciosos virais incluem, mas sem limitações, hepatite do tipo A, hepatite do tipo B, hepatite do tipo C, gripe, varicela, adenovírus, herpes simplex do tipo | (HSV-1), herpes simplex do tipo 2 (HSV-2), peste bovina, rinovírus, ecovírus, rotavírus,

vírus sincitial respiratório, virus papiloma, citomegalovírus, equinovírus, arbovírus, huntavírus, vírus de Coxsackie, vírus da caxumba, vírus do sarampo, vírus da rubéola, vírus da pólio e vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 ou tipo 2 (HIV-1 ou HIV-2). As bactérias constituem outra classe preferida de organismos infecciosos, que incluem, mas sem limitações, os seguintes: Estafilococos; Estreptococos, incluindo S. pyogenes; Enterococos; Bacilos, incluindo Bacillus anthracis e Lactobacilos; Listeriaa Corynebacterium diphtheriae; Gardnerella, incluindo G. vaginalis;, Nocardia; Streptomyces; Thermoactinomyces vulgaris; Treponerna; Camplyobacter, Pseudomonas, incluindo P. aeruginosa; Legionella; Neisseria, incluindo N. gonorrhoeae e N. meningitides; Flavobacterium, incluindo F. meningosepticum e F. odoratum; Brucella; Bordetella, incluindo B. pertussis e B. bronchiseptica; Escherichia, incluindo E. coli, Klebsiella; Enterobacter, Serratia incluindo S. marcescense S. liquefaciens; Edwardsiella; Proteus, incluindo P. mirabilis e P. vulgaris; Estreptobacilos; Rickettsiaceae, incluindo R. fickettsfi, Chlamydia, incluindo C. psittaci e C. trachornatis, Micobactérias, incluindo M. tuberculosis, M. intracellulare, M. folluiturn, M. laprae, M. avium, M. bovis, M. africanum, M. kansasii, M. intracellulare e M. lepraernurium; e Nocardia. Protozoários podem incluir, mas sem limitações, leishmania, kokzidioa e trypanosoma. Parasitas incluem, mas sem limitações, chlamydia e rickettsia.

[00285] As composições de anticorpos podem ser utilizadas para o tratamento de indivíduos, independentemente do resíduo presente na posição 100 em Siglec-9 (referência a SEQ ID Nº 2) ou na posição 104 em Siglec-7 (referência a SEQ ID Nº 1) nos alelos expressos pelos indivíduos. Siglec-9 que possui lisina na posição 100 (por exemplo, SEQ ID Nº 2) representa cerca de 49% da população, enquanto Siglec-9 que possui ácido glutâmico na posição 100 (por exemplo, SEQ ID Nº 160) representa cerca de 36% da população. Em uma realização, as composições de anticorpos são utilizadas para tratar indivíduos que possuem lisina na posição 100 em Siglec-9 (referência a SEQ ID Nº 2) e indivíduos que possuem ácido glutâmico na posição 100 em Siglec-9. Em uma realização, o mesmo regime de administração é utilizado para tratar indivíduos cujas células (por exemplo, células NK, neutrófilos etc.) expressam lisina na posição 100 em Siglec-9 (referência a SEQ ID Nº 2) e indivíduos cujas células expressam ácido glutâmico na posição 100 em Siglec-9. Em uma realização, o regime de administração compreende o mesmo modo de administração, a mesma dosagem e a mesma frequência de administração, independentemente do alelo específico de MICA expresso em indivíduos.

[00286] As composições de anticorpos podem ser utilizadas como monoterapia ou tratamentos combinados com um ou mais agentes terapêuticos diferentes, incluindo agentes normalmente utilizados para o propósito terapêutico específico para o qual o anticorpo está sendo administrado. O agente terapêutico adicional será normalmente administrado em quantidades e regimes de tratamento tipicamente utilizados para aquele agente em monoterapia para a doença específica ou condição sendo tratada. Esses agentes terapêuticos incluem, mas sem limitações, agentes anticâncer e agentes quimioterapêuticos.

[00287] Em uma realização, os anticorpos neutralizantes anti-Siglec-9 e/ou 7 não possuem ligação a CD16 humano, mas potencializam a atividade de células efetoras que expressam CD16 (por exemplo, células T efetoras ou NK). Consequentemente, em uma realização, o segundo agente terapêutico ou adicional é um anticorpo ou outra proteína que contém domínio Fc capaz de induzir ADCC em direção a uma célula à qual é ligado, tal como por meio de CD16 expresso por uma célula NK. Tipicamente, esse anticorpo ou outra proteína compreenderá um domínio que se liga a um antígeno de interesse, tal como um antígeno presente sobre uma célula de tumor (antígeno de tumor) e um domínio Fc ou uma de suas partes e exibirá ligação ao antígeno por meio do domínio de ligação de antígenos e a receptores de Fcy (por exemplo, CD16) por meio do domínio Fc.

Em uma realização, a sua atividade de ADCC será mediada, ao menos em parte, por CD16. Em uma realização, o agente terapêutico adicional é um anticorpo que possui domínio Fc humano nativo ou modificado, tal como domínio Fc de um anticorpo I9G1 ou IgG3 humano.

A expressão “citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos” ou “ADCC” é um termo bem compreendido na técnica e designa reação mediada por células na qual células citotóxicas não específicas que expressam receptores de Fc (FcRs) reconhecem anticorpo ligado sobre célula alvo e, em seguida, causam lise da célula alvo.

Células citotóxicas não específicas que mediam ADCC incluem células matadoras naturais (NK), macrófagos, monócitos, neutrófilos e eosinófilos.

A expressão “anticorpo indutor de ADCC” designa um anticorpo que demonstra ADCC conforme medido por meio de teste(s) conhecido(s) pelos técnicos no assunto.

Essa atividade é tipicamente caracterizada pela ligação da região Fc com vários FcRs.

Sem limitações a nenhum mecanismo específico, os técnicos no assunto reconhecerão que a capacidade de um anticorpo de demonstrar ADCC pode dever-se, por exemplo, à sua subclasse (tal como IgG1 ou IgG3), por meio de mutações introduzidas na região Fc ou em virtude de modificações dos padrões de carboidratos na região Fc do anticorpo.

Exemplos de anticorpos que induzem ADCC incluem rituximab (para o tratamento de linfomas, CLL, trastuzumab (para o tratamento de câncer de mama), alentuzumab (para o tratamento de leucemia linfocítica crônica) e cetuximab (para o tratamento de câncer colorretal e carcinoma de células escamosas da cabeça e do pescoço). Exemplos de anticorpos amplificados por ADCC incluem, mas sem limitações: GA-101 (anti-CD20 hipofocusilado), margetuximab (anti-HER2 aprimorado com Fc), mepolizumab, MEDI-551 (anti-CD19 elaborado com Fc), obinutuzumab

(anti-CD20 glicoelaborado/hipofucosilado), ocaratuzumab (anti-CD20 elaborado com Fc) e XmAbO 5574/MOR2080 (anti-CD19 elaborado com Fc).

[00288] Em uma realização, os anticorpos neutralizantes anti-Siglec-9 e/ou 7 aumentam a eficácia de agentes que neutralizam a atividade inibidora de PD-1 humano, por exemplo, que inibem a interação entre PD-1 e PD-L1, notadamente em indivíduos que reagem mal (ou não são sensíveis) a tratamento com agente que neutraliza a atividade inibidora de PD- 1 humano. Os anticorpos neutralizantes anti-Siglec-9 e/ou 7 podem ser úteis para potencializar a atividade de células efetoras que expressam PD-1 (por exemplo, células T efetoras ou NK, tais como células NK que expressam Siglec-9). Consequentemente, em uma realização, o segundo agente terapêutico ou adicional é um anticorpo ou outro agente que neutraliza a atividade inibidora de PD-1 humano.

[00289] Morte Programada 1 (PD-1) (também denominada “Morte Celular Programada 1”) é um membro inibidor da família de receptores CD28. A sequência PD-1 humana completa pode ser encontrada sob número de Acesso GenBank U64863. A inibição ou neutralização da atividade inibidora de PD-1 pode envolver o uso de um agente polipeptídeo (por exemplo, anticorpo, polipeptídeo fundido a um domínio Fc, imunoadesina etc.) que evita a sinalização de PD-1 induzida por PD-L1. Existem atualmente seis agentes que bloqueiam o processo de PD-1/PD-L1 que são comercializados ou encontram-se em avaliação clínica Um agente é BMS-936558 (Nivolumab/ONO-4538, Bristol-Myers Squibb; anteriormente MDX-1106). Nivolumab (nome comercial Opdivo6&) é um mAb anti-PD-L1 IgG4 totalmente humano aprovado pela FDA que inibe a ligação do ligante PD-L1 a PD-1 e CD80 e é descrito como anticorpo 5C4 em WO 2006/121168, cujo relatório descritivo é incorporado ao presente como referência. Para pacientes com melanoma, o OR mais significativo foi observado em dose de 3 mg/kg,

enquanto, para outros tipos de câncer, foi de 10 mg/kg. Nivolumab é geralmente dosado a 10 mg/kg a cada três semanas até a progressão do câncer. As expressões “reduz a atividade inibidora de PD-1 humano”, “neutraliza PD-1" ou “neutraliza a atividade inibidora de PD-1 humano” designam um processo no qual PD-1 é inibido na sua capacidade de transdução de sinal resultante da interação de PD-1 com um ou mais dos seus parceiros de ligação, tais como PD-L1 ou PD-L2. Agentes que neutralizam a atividade inibidora de PD-1 reduzem, bloqueiam, inibem, eliminam ou interferem com a transdução de sinal resultante da interação de PD-1 com um ou mais dos seus parceiros de ligação, tais como PD-L1 e PD-L2. Esse agente pode, portanto, reduzir o sinal coestimulante negativo mediado por ou por meio de proteínas da superfície celular expressas sobre linfócitos T, de forma a ampliar as funções efetoras de células T, tais como proliferação, produção de citoquinas e/ou citotoxicidade.

[00290] MK-3475 (mAb anti-PD1 de IgG4 humano da Merck), também denominado lambrolizumab ou pembrolizumab (nome comercial KeytrudaGO), foi aprovado pela FDA para o tratamento de melanoma e está sendo testado em outros cânceres. Pembrolizumab foi testado a 2 mg/kg ou 10 mg/kg a cada duas ou três semanas até a progressão da doença. Construções de DNA codificam as regiões variáveis da cadeia leve e pesada dos anticorpos humanizados h409. Todas foram depositadas junto ao Depositário de Patentes da Coleção Norte-Americana de Cultivos de Tipos (10801, University Blvd., Manassas VA). O plasmídeo que contém o DNA que codifica a cadeia pesada de h409A-l 1 foi depositado em 9 de junho de 2008 e identificado como 081469 SPD-H e o plasmídeo que contém o DNA que codifica a cadeia leve de h409AI 1 foi depositado em 9 de junho de 2008 e identificado como 0801470 SPD-L-I 1. MK-3475, também conhecido como Merck 3745 ou SCH-900475, também é descrito em WO 2009/114335.

[00291] MPDL3280A/RG7446 (anti-PD-L1 da Roche/Genentech) é um mAb anti-PD-L1 humano que contém domínio Fc elaborado projetado para otimizar a eficácia e a segurança minimizando a ligação de FcyR e consequente citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Doses de <1, 10, 15 e 25 mg/kg de MPDL3280A foram administradas a cada três semanas por até um ano. No teste de fase 3, MPDL3280A é administrado a 1200 mg por meio de infusão intravenosa a cada três semanas em NSCLC.

[00292] AMP-224 (Amplimrmune e GSK é uma imunoadesina que compreende um domínio extracelular de PD-L2 fundido a um domínio Fc. Outros exemplos de agentes que neutralizam PD-1 podem incluir um anticorpo que liga PD-L2 (anticorpo anti-PD-L2) e bloqueia a interação entre PD-1 e PD-L2.

[00293] Pidlizumab (CT-011; CureTech) (mAb anti-PD1 de IgG1 humanizado da CureTech/Teva), Pidlizumab (CT-011; CureTech) (vide, por exemplo, WO 2009/101611) é outro exemplo; o agente foi testado em trinta pacientes com FL reincidente sensível a rituximab tratados com 3 mg/kg de CT- 011 intravenoso a cada quatro semanas por quatro infusões em combinação com rituximab dosado a 375 mg/m? semanalmente por quatro semanas, a partir de duas semanas após a primeira infusão de CT-011.

[00294] Anticorpos PD-1 conhecidos adicionais e outros inibidores de PD-1 incluem AMP-224 (proteína de fusão B7-DC/IgG1 licenciada para GSK), AMP-514 descrito em WO 2012/145493, anticorpo MEDI-4736 (anti-PD-L1 desenvolvido pela AstraZzeneca/Medimmune) descrito em WO 2011/066389 e US 2013/034559, anticorpo YWZ243.55.S70 (anti-PD-L1) descrito em WO 2010/077634, MDX-1105, também conhecido como BMS- 936559, é um anticorpo anti-PD-L1 desenvolvido pela Bristol-Myers Squibb descrito em WO 2007/005874 e anticorpos e inibidores descritos em WO

2006/121168, WO 2009/014708, WO 2009/114335 e WO 2013/019906, cujos relatórios descritivos são incorporados ao presente como referência. Exemplos adicionais de anticorpos anti-PD1 são descritos em WO 2015/085847 (Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co. Ltd.), tais como anticorpos que possuem domínio variável de cadeia leve CDR1, 2 e 3 de SEQ ID Nº 6, SEQ ID Nº 7 e/ou SEQ ID Nº 8, respectivamente, e um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo CDR1, 2 e 3 de SEQ ID Nº 3, SEQ ID Nº 4 ou SEQ ID Nº 5, respectivamente, em que as referências de SEQ ID Nº são a numeração de acordo com WO 2015/085847, cujo relatório descritivo é incorporado ao presente como referência. Anticorpos que concorrem com quaisquer desses anticorpos pela ligação a PD-1 ou PD-L1 também podem ser utilizados.

[00295] Um exemplo de anticorpo antiPD1 é pembrolizumab (vide, por exemplo, WO 2009/114335, cujo relatório descritivo é incorporado ao presente como referência). O anticorpo anti-PD-1 pode ser o anticorpo h409AI 1 em WO 2008/156712, que compreende regiões variáveis de cadeia pesada codificadas pelo DNA depositado na ATCC como 081469 SPD- H e regiões variáveis de cadeia leve codificadas pelo DNA depositado na ATCC as0801470 SPD-L-| 1. Em outras realizações, o anticorpo compreende as CDRs de cadeia leve e pesada ou regiões variáveis de pembrolizumab. Consequentemente, em uma realização, o anticorpo compreende os domínios CDR1, CDR2 e CDR3 do VH de pembrolizumab codificado pelo DNA depositado na ATCC como 081469 SPD-H e os domínios CDR1I, CDR2 e CDR3 do VL de pembrolizumab codificado pelo DNA depositado na ATCC como 0801470 SPD-L- 1.

[00296] Em algumas realizações, o agente neutralizador de PD-1 é um mAb anti-PD-L1 que inibe a ligação de PD-L1 a PD-1. Em algumas realizações, o agente neutralizador de PD-1 é um mAb anti-PD1 que inibe a ligação de PD-1 a PD-L1. Em algumas realizações, o agente neutralizador de

PD-1 é imunoadesina (por exemplo, imunoadesina que compreende uma parte de ligação de PD-1 ou extracelular de PD-L1 ou PD-L2 fundida a uma região constante (por exemplo, região Fc de sequência de imunoglobulina)).

[00297] Nos métodos de tratamento, o anticorpo anti-Siglec e o segundo agente terapêutico podem ser administrados separadamente, em conjunto, sequencialmente ou em coquetel. Em algumas realizações, o composto de ligação de antígenos é administrado antes da administração do segundo agente terapêutico. O anticorpo anti-Siglec pode ser administrado, por exemplo, cerca de O a 30 dias antes da administração do segundo agente terapêutico. Em algumas realizações, o composto de ligação de Siglec é administrado em cerca de 30 minutos a cerca de 2 semanas, cerca de 30 minutos a cerca de uma semana, cerca de uma hora a cerca de 2 horas, cerca de 2 horas a cerca de 4 horas, cerca de 4 horas a cerca de 6 horas, cerca de 6 horas a cerca de 8 horas, cerca de 8 horas a um dia ou cerca de 1 a 5 dias antes da administração do segundo agente terapêutico. Em algumas realizações, um anticorpo anti-Siglec-9 é administrado simultaneamente com a administração dos agentes terapêuticos. Em algumas realizações, um anticorpo anti-Siglec-9 é administrado após a administração do segundo agente terapêutico. O anticorpo anti-Siglec pode ser administrado, por exemplo, cerca de O a 30 dias após a administração do segundo agente terapêutico. Em algumas realizações, o anticorpo anti-Siglec é administrado em cerca de 30 minutos a cerca de 2 semanas, cerca de 30 minutos a cerca de uma semana, cerca de uma hora a cerca de 2 horas, cerca de 2 horas a cerca de 4 horas, cerca de 4 horas a cerca de 6 horas, cerca de 6 horas a cerca de 8 horas, cerca de 8 horas a um dia ou cerca de 1 a 5 dias após a administração do segundo agente terapêutico.

[00298] Em outros aspectos, são fornecidos métodos de identificação de células T e/ou células NK Siglec-7+ e/ou Siglec-9+, tais como células T CD8, células NK CD56*rihante é células NK CD56", Pode-se utilizar a determinação da coexpressão de Siglec-7 e/ou Siglec-9 em células T e/ou células NK em métodos de diagnóstico ou prognóstico. Amostras biológicas podem ser obtidas, por exemplo, de indivíduos (por exemplo, de amostra de sangue, tecido de câncer ou adjacente a câncer obtido de paciente com câncer) e analisadas para determinar a presença de células T e/ou NK Siglec-7 e/ou Siglec-9+. A expressão de Siglec-9 nessas células pode, por exemplo, ser utilizada para identificar indivíduos portadores de células T e/ou NK, tais como células T e/ou NK que se infiltram em tumores e são inibidas por polipeptídeos Siglec-9. A expressão de Siglec-7 e Siglec-9 nessas células pode ser utilizada, por exemplo, para identificar indivíduos portadores de células T e/ou NK, tais como células T e/ou NK que se infittam em tumores e são inibidas por polipeptídeos Siglec-7 e Siglec-9. O método pode ser útil, por exemplo, como prognóstico da reação a tratamento com um agente que neutralize Siglec-7 e/ou Siglec-9. A expressão de Siglec-9 (e, opcionalmente, Siglec-7 adicional) nessas células pode indicar indivíduos apropriados para tratamento com anticorpos de acordo com a presente invenção.

[00299] Em certos aspectos opcionais, podem ser identificados pacientes para tratamento com anticorpo anti-Siglec-7 e/ou 9 por meio de determinação da presença em amostras de tumores (por exemplo, tecidos de tumores e/ou tecidos adjacentes a tumores) de ligantes naturais para Siglec-7 e/ou Siglec-9. Em uma realização de qualquer um dos usos terapêuticos ou métodos de prevenção ou tratamento de câncer de acordo com o presente, o tratamento ou prevenção de câncer em indivíduos compreende: a. determinação se células malignas (por exemplo, células de tumores) no indivíduo portador de câncer expressam ligantes de Siglec-7 e/ou ligantes de Siglec-9; e b. mediante determinação de que ligantes de Siglec-7 e/ou ligantes de Siglec-9 são expressos significativamente (por exemplo, sobre a sua superfície) por células malignas (por exemplo, células de tumores), administração ao indivíduo de um anticorpo anti-Siglec-7 e/ou 9 correspondente, tal como um anticorpo de acordo com qualquer aspecto da presente invenção.

[00300] Em uma realização, a determinação de que uma amostra biológica (por exemplo, uma amostra que compreende células de tumores, tecido de tumor e/ou tecido adjacente a tumor) expressa proeminentemente ligantes de Siglec-7 e/ou ligantes de Siglec-9 indica que o indivíduo é portador de câncer que pode ser tratado e/ou pode receber benefício de um anticorpo que inibe, respectivamente, um polipeptídeo Siglec-7 e/ou Siglec-9.

[00301] Em uma realização, a expressão significativa de ligantes de Siglec-7 e/ou ligantes de Siglec-9 indica que o(s) mencionado(s) ligante(s) é(são) expresso(s) em quantidade substancial de células de tumores retiradas de um dado indivíduo. Embora sem restrições a um valor percentual exato, em alguns exemplos, pode-se afirmar que o ligante é “significativamente expresso” se estiver presente em pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou mais das células de tumores retiradas de um paciente (em uma amostra).

[00302] Em uma realização de qualquer um dos métodos, a determinação se células malignas (por exemplo, células de tumores) no indivíduo portador de câncer expressam ligantes de Siglec-7 e/ou Siglec-9 compreende a determinação do nível de expressão de ligantes de Siglec-7 e/ou ligantes de Siglec-9 em células malignas em uma amostra biológica e comparação do nível com nível de referência (por exemplo, valor, mancha forte ou fraca na superfície celular etc.). O nível de referência pode, por exemplo, corresponder a um indivíduo saudável, indivíduo que obtém pouco ou nenhum benefício clínico do tratamento com anticorpo anti-Siglec ou indivíduo que obtém benefício clínico substancial do tratamento com um anticorpo anti-Siglec. A determinação de que uma amostra biológica expressa ligantes de Siglec-7 e/ou ligantes de Siglec-9 em nível mais alto (por exemplo, valor alto, forte mancha na superfície, nível que corresponde ao de um indivíduo que obtém benefício clínico substancial de tratamento com um anticorpo anti-Siglec, nível que é mais alto que o correspondente a um indivíduo que obtém pouco ou nenhum benefício clínico do tratamento com um anticorpo anti-Siglec etc.) indica que o indivíduo possui câncer que pode ser tratado com anticorpo anti- Siglec.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 SUBCONJUNTO DE CÉLULAS NK HUMANAS QUE COEXPRESSA SIGLEC-7 E SIGLEC-9:

[00303] Dentre os Siglecs relativos a CD33, Siglec-7 (CD328) e Siglec-9 (CD329) compartilham a propriedade de ligação a ácidos siálicos, incluindo glicanos sobre-expressos por células de câncer, e acredita- se que eles funcionem como receptores inibidores nas células imunes nas quais são expressos. Para pesquisar a expressão de Siglecs sobre linfócitos, a distribuição de Siglec-7 e Siglec-9 foi estudada em células NK humanas.

[00304] A expressão de Siglec-7 e Siglec-9 em células NK foi determinada por meio de citometria de fluxo em células NK novas purificadas de doadores humanos. A população de NK foi determinada como células CD3- CD56+ (anti-CD3 Pacific blue — BD Pharmingen nº 558124; anti- CDB56-PE-Vio770 — Milteny nº 130 100 676). Foram utilizados anticorpo anti- Siglec-7 (clone 194211 — IgG1 APC — R&D Systems nº FAB11381A), anticorpo anti-Siglec-9 (clone 191240 — IgG2A PE - R&D Systems nº FAB1139P) e controles de isótipos APC IgG1 e APC IgG2A. Células NK foram incubadas por minutos com 50 ul de mistura Ab de manchas, lavadas por duas vezes com tampão de manchas e a fluorescência foi revelada com Canto || (HTS).

[00305] Os resultados são exibidos na Figura 1. É exibido um resultado representativo. MFI: média da intensidade de fluorescência. Uma fração significativa (cerca de 44%) de células NK expressou Siglec-7 e Siglec- 9, o que sugere que uma grande proporção de células NK pode ser inibida por cada um desses receptores (ou ambos), em função dos ligantes de glicano presentes, por exemplo, sobre células de tumores.

EXEMPLO 2 GERAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-SIGLEC:

[00306] Parte A — geração de anticorpos em camundongos.

[00307] Para obter anticorpos Siglec-7 e Siglec-9 humanos, camundongos Balb/c foram imunizados com uma proteína recombinante de domínio extracelular Fc Siglec-7 humana e Fc Siglec-9 humana. Foram realizadas duas imunizações diferentes.

[00308] Em primeira imunização com proteínas Fc Siglec-7 e Fc Siglec-9, camundongos receberam duas injeções de uma emulsão de 30 ug de cada proteína e Adjuvante de Freund Completo, por via intraperitoneal. Os camundongos receberam em seguida amplificação com 7,5 ug de cada proteína, por via intravenosa. Foram realizadas duas fusões diferentes (fusão 1 e 2). Células do baço imunes foram fundidas três dias após o enriquecimento com células B imortalizadas X63.Ag8.653 e cultivadas na presença de células do baço irradiadas. Hibridomas foram colocados em placas em meio que contém metilcelulose semissólido e clones em crescimento foram retirados utilizando-se um aparelho Clonepix 2 (Molecular Devices).

[00309] Conduziu-se segunda imunização, novamente com proteínas Fc Siglec-7 e Fc Siglec-9. Os camundongos receberam três injeções de uma emulsão de 30 ug de cada proteína e Adjuvante de Freund Completo, por via intraperitoneal. Os camundongos receberam em seguida amplificação com 5 ug de cada proteína, por via intravenosa. Foram realizadas três fusões diferentes (fusão 3, 4 e 5). Células do baço imunes foram fundidas três dias após o enriquecimento com células B imortalizadas X63.Ag8.653 e cultivadas na presença de células do baço irradiadas. Hibridomas foram colocados em placas em meio em P96. Proteínas Fc Siglec-7 e Fc Siglec-9 utilizadas nesta imunização (e nos Exemplos a seguir) foram produzidas em células CHO. À proteína Fc Siglec-7 continha a sequência de aminoácidos a seguir:

QKSNRKDYSLTMOSSVTVQEGMCVHVRCSFSYPVDSQTDSDPVHGYWFRA GNDISWKAPVATNNPAWAVQEETRDRFHLLGDPQTKNCTLSIRDARMSDAG RYFFRMEKGNIKWNYKYDQLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCFQNLTCSVPW ACEQGTPPMISWMGTSVSPLHPSTTRSSVLTLIPQPQHHGTSLTCQVTLPGA GVTTNRTIQLNVSYPPQNLTVTVFQGEGTASTALGNSSSLSVLEGOQSLRLVCA VDSNPPARLSWTWRSLTLYPSQPSNPLVLELQVHLGDEGEFTCRAQNSLGS QHVSLNLSLAOQEYTGKMRPVSGVLLGAVGGGGSSPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN

YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID Nº 164).

[00310] A proteína Fc Siglec-9 continha a sequência de aminoácidos a seguir:

QTSKLLTMOSSVTVQEGLCVHVPCSFSYPSHGWIYPGPVYVHGYWFREGANT DQDAPVATNNPARAVWEETRDRFHLLGDPHTKNCTLSIRDARRSDAGRYFFR MEKGSIKWNYKHHRLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCPQNLTCSVPWACEQ GTPPMISWIGTSVSPLDPSTTRSSVLTLIPQPQDHGTSLTCQVTFPGASVTTNK TVHLNVSYPPQNLTMTVFQGDGTVSTVLGNGSSLSLPEGQSLRLVCAVDAVD SNPPARLSLSWRGLTLCPSQPSNPGVLELPWVHLRDAAEFTCRAQNPLGSQ QVYLNVSLOSKATSGVTAGGGGSSPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY

TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID Nº 165).

[00311] Seleção primária: o sobrenadante (SN) de clones em crescimento das duas imunizações foi testado em um teste primário por meio de citometria de fluxo utilizando linhagens de células CHO que expressam huSiglec-7, huSiglec-9 e cynoSiglec. CHO que expressa HuSiglec-7 e cynoSiglec foi manchada com 0,5 uM e 0,05 uM de CFSE, respectivamente. Para seleção de citometria de fluxo, todas as células foram misturadas igualmente e a presença de anticorpos de reação em sobrenadantes foi revelada por anticorpo policlonal (pAb) anticamundongos de cabra marcado com Alexa Flúor 647.

[00312] Resultados: 20, 19 e mais de 80 anticorpos foram selecionados nas fusões correspondentes que se ligam a Siglec-7 e/ou Siglec- 9 e/ou Siglec-cyno na fusão 1, 2 e 3/4/5, respectivamente. Diferentes anticorpos anti-Siglec-7, Siglec-9 e Siglec-Cyno reativos e anticorpos anti- Siglec-9 (que não ligaram Siglec-7) das três fusões diferentes foram clonados e produzidos como anticorpos IgG1 humanos quiméricos com uma mutação N297Q de cadeia pesada (numeração EU de Kabat) que resulta em falta de glicosilação N-ligada e ligação reduzida a receptores de Fcy.

[00313] A Figura 2 exibe resultados representativos de citometria de fluxo para exemplos de anticorpos que se ligam a Siglec-7, mas não Siglec-9 ou Siglec de cynomolgus (painel direito), que se ligam a cada um dentre Siglec-7, Siglec-9 e Siglec de cynomolgus (painel intermediário) e que se ligam a Siglec-9, mas não Siglec-7 ou Siglec de cynomolgus (painel esquerdo).

TABELA 1

[00314] Sequências de Siglec:

EE ee Nome Sequência (AA) referência NCBI|

QKSNRKDYSLTMOSSVTVQEGMCVHV RCSFSYPVDSQTDSDPVHGYWFRAGN DISWKAPVATNNPAWAVQEETRDRFHL LGDPQTKNCTLSIRDARMSDAGRYFFR MEKGNIKWNYKYDQLSVNVTALTHRPN ILIPGTLESGCFQNLTCSVPWACEQGTP PMISWMGTSVSPLHPSTTRSSVLTLIPQ

PQHHGTSLTCQVTLPGAGVTTNRTIQL Siglec-7 NM 014385.3; | NVSYPPQNLTVTIVFQGEGTASTALGNS humano NP 055200.1 | SSLSVLEGOSLRLVCAVDSNPPARLSW

TWRSLTLYPSQPSNPLVLELQVHLGDE GEFTCRAQNSLGSQHVSLNLSLQQEYT GKMRPVSGVLLGAVGGAGATALVFLSF CVIFIVVRSCRKKSARPAADVGDIGMKD ANTIRGSASQGNLTESWADDNPRHHGL AAHSSGEEREIQYAPLSFHKGEPQDLS

GQEATNNEYSEIKIPK (SEQ ID Nº 150)

QTSKLLTMOSSVTVQEGLCVHVPCSFS YPSHGWIYPGPVVHGYWFREGANTDO

DAPVATNNPARAVWEETRDRFHLLGDP Siglec-9 NM 014441.2; | HTKNCTLSIRDARRSDAGRYFFRMEKG humano NP 055256.1 | SIKWNYKHHRLSVNVTALTHRPNILIPGT

LESGCPQNLTCSVPWACEQGTPPMIS WIGTSVSPLDPSTTRSSVLTLIPQPQDH GTSLTCQVTFPGASVTTNKTVHLNVSY

EE = Nome Sequência (AA) referência NCBI|

PPQNLTMTVFQGDGTVSTVLGNGSSLS LPEGOSLRLVCAVDAVDSNPPARLSLS WRGLTLCPSQPSNPGVLELPWVHLRD AAEFTCRAQNPLGSQQVYLNVSLASKA TSGVTAQGVVGGAGATALVFLSFCVIFVV VRSCRKKSARPAAGVGDTGIEDANAVR GSASQGPLTEPWAEDSPPDQPPPASA RSSVGEGELQYASLSFQMVKPWDSRG

QEATDTEYSEIKIHR (SEQ ID Nº 151)

DPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFF HPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISGDSP VATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRN NCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTK YSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEP

GHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSA Siglec-3 NM 001772.3;

APTSLGPRTTHSSVLITPRPQDHGTNLT humano NP 001763.3

CQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNP TTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGAIGGA GVTALLALCLCLIFFIVKTHRRKAARTAV GRNDTHPTTGSASPKHQKKSKLHGPTE

TSSCSGAAPTVEMDEELHYASLNFHGM NPSKDTSTEYSEVRTOQ (SEQ ID Nº 152) | EKPVYELQVQKSVTVQEGLCVLVPCSF Siglees NM 003830.3 | SI(PWRSWYSSPPLYVYWFRDGEIPYYA humano EVVATNNPDRRVKPETQGRFRLLGDVQ

EE ee Nome Sequência (AA) referência NCBI|

KKNCSLSIGDARMEDTGSYFFRVERGR DVKYSYQQNKLNLEVTALIEKPDIHFLEP LESGRPTRLSCSLPGSCEAGPPLTFSW TGNALSPLDPETTRSSELTLTPRPEDHG TNLTCQMKRQGAQVTTERTVQLNVSYA PQTITIFRNGIALEILQONTSYLPVLEGQAL RLLCDAPSNPPAHLSWFQGSPALNATPI SNTGILELRRVRSAEEGGFTCRAQHPL GFLQIFLNLSVYSLPQLLGPSCSWEAEG LHCRCSFRARPAPSLCWRLEEKPLEGN SSQGSFKVNSSSAGPWANSSLILHGGL SSDLKVSCKAWNIYGSQSGSVLLLAOGR SNLGTGVVPAALGGAGVMALLCICLCLI FFLIVKARRKQAAGRPEKMDDEDPIMG TITSGSRKKPWPDSPGDQASPPGDAPP

LEEQKELHYASLSFSEMKSREPKDQEA PSTTEYSEIKTSK (SEQ ID Nº 153)

QERRFQLEGPESLTVQEGLCVLVPCRL PTTLPASYYGYGYWFLEGADVPVATND

PDEEVQEETRGRFHLLWDPRRKNCSLS | IRDARRRDNAAYFFRLKSKWMKYGYTS Siglec6 NM 198845.4 | SKLSVRVMALTHRPNISIPGTLESGHPS humano NLTCSVPWVCEQGTPPIFSWMSAAPTS

LGPRTTOQSSVLTITPRPQDHSTNLTCQV TFPGAGVTMERTIQLNVSSFKILQNTSS LPVLEGQALRLLCDADGNPPAHLSWFQ

EE ee Nome Sequência (AA) referência NCBI|

GFPALNATPISNTGVLELPQVGSAEEGD FTCRAQHPLGSLQISLSLFVHWKPEGR AGGVLGAVWGASITTLVFLCVCFIFRVK TRRKKAAQPVQNTDDVNPVMVSGSRG HQHQFQTGIVSDHPAEAGPISEDEQEL

HYAVLHFHKVQPQEPKVTDTEYSEIKIH K (SEQ ID Nº 154)

MEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLC VHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFR AGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETOG RFQLLGDIWSNDCSLSIRDARKRDKGS YFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSV FVTALTHRPDILILGTLESGHSRNLTCSV PWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTA

RSSVLTLTPKPQDHGTSLTCQVTLPGT | GVTTTSTVRLDVSYPPWNLTMTVFQGD Sigleo6 NM 014442.2 | ATASTALGNGSSLSVLEGOQSLRLVCAV humano NSNPPARLSWTRGSLTLCPSRSSNPGL

LELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHI SLSLSLQONEGTGTSRPVSQVTLAAVGG AGATALAFLSFCIIFIVRSCRKKSARPAA GVGDTGMEDAKAIRGSASQGPLTESW KDGNPLKKPPPAVAPSSGEEGELHYAT

LSFHKVKPQDPQGQEATDSEYSEIKIHK RETAETQACLRNHNPSSKEVRG (SEQ ID Nº 155)

EE es Nome Sequência (AA) referência NCBI|

MDGRFWIRVQESVMVPEGLCISVPCSF SYPRQDWTGSTPAYGYWFKAVTETTK GAPVATNHOSREVEMSTRGRFQLTGD

PAKGNCSLVIRDAQMQDESQYFFRVER GSYVRYNFMNDGFFLKVTALTQKPDVY|

PETLEPGQPVTVICVFNWAFEECPPPSF SWTGAALSSQGTKPTTSHFSVLSFTPR PQDHNTDLTCHVDFSRKGVSVQRTVRL RVAYAPRDLVISISRDNTPALEPQPQGN VPYLEAQKGQFLRLLCAADSQPPATLS WVLONRVLSSSHPWGPRPLGLELPGV

KAGDSGRYTCRAENRLGSQQRALDLS Siglec-10 VQYPPENLRVMVSQANRTVLENLGNGT NM 033130.4 humano SLPVLEGOSLCLVCVTHSSPPARLSWT

QRGQVLSPSQPSDPGVLELPRVQVEHE GEFTCHARHPLGSQHVSLSLSVHYSPK LLGPSCSWEAEGLHCSCSSQASPAPSL RWWLGEELLEGNSSQDSFEVTPSSAG PWANSSLSLHGGLSSGLRLRCEAWNV HGAQSGSILQLPDKKGLISTAFSNGAFL GIGITALLFLCLALIIMKILPKRRTQTETPR PRFSRHSTILDYINVVPTAGPLAQKRNQ KATPNSPRTPLPPGAPSPESKKNQKKQ YQLPSFPEPKSSTQOAPESQESQEELHY

ATLNFPGVRPRPEARMPKGTQADYAEV KFQ (SEQ ID Nº 156)

EE es Nome Sequência (AA) referência NCBI|

NKDPSYSLQVARQVPVPEGLCVIVSCN LSYPRDGWDESTAAYGYWFKGRTSPK TGAPVATNNQSREVEMSTRDRFQLTG DPGKGSCSLVIRDAQREDEAWYFFRVE RGSRVRHSFLSNAFFLKVTALTKKPDVY IPETLEPGQPVTVICVFNWAFKKCPAPS FSWTGAALSPRRTRPSTSHFSVLSFTP SPQDHDTDLTCHVDFSRKGVSAQRTVR LRVAYAPKDLIISISHDONTSALELQGNVIY LEVQKGQFLRLLCAADSQPPATLSWVL QDRVLSSSHPWGPRTLGLELRGVRAG

DSGRYTCRAENRLGSQQQALDLSVQY Siglec-11 PPENLRVMVSQANRTVLENLGNGTSLP NM 052884.2 humano VLEGOSLRLVCVTHSSPPARLSWTRW

GQTVGPSQPSDPGVLELPPIQMEHEGE FTCHAQHPLGSQHVSLSLSVHYPPQLL GPSCSWEAEGLHCSCSSQASPAPSLR WWLGEELLEGNSSQGSFEVTPSSAGP WANSSLSLHGGLSSGLRLRCKAWNVH GAQSGSVFQLLPGKLEHGGGLGLGAAL GAGVAALLAFCSCLVVFRVKICRKEARK RAAAEQDVPSTLGPISQOGHQHECSAGS SQDHPPPGAATYTPGKGEEQELHYASL SFQGLRLWEPADQEAPSTTEYSEIKIHT

GQPLRGPGFGLQLEREMSGMVPK (SEQ ID Nº 157)

EE ee Nome Sequência (AA) referência NCBI|

KEQKDYLLTMQKSVTVQEGLCVSVLCS FSYPQNGWTASDPVHGYWFRAGDHVS RNIPVATNNPARAVQEETRDRFHLLGD PQNKDCTLSIRDTRESDAGTYVFCVER GNMKWNYKYDQLSVNVTASQDLLSRY RLEVPESVTVQEGLCVSVPCSVLYPHY NWTASSPVYGSWFKEGADIPWDIPVAT NTPSGKVQEDTHGRFLLLGDPQTNNCS LSIRDARKGDSGKYYFQVERGSRKWNY

IYDKLSVHVTALTHMPTFSIPGTLESGHP Human Siglec- RNLTCSVPWACEQGTPPTITWMGASVS NM 053003.3 12 SLDPTITRSSMLSLIPQPQDHGTSLTCQ

VTLPGAGVTMTRAVRLNISYPPQNLTMT VFQGDGTASTTLRNGSALSVLEGQSLH LVCAVDSNPPARLSWTWGSLTLSPSQOS SNLGVLELPRVHVKDEGEFTCRAQNPL GSQHISLSLSLQNEYTGKMRPISGVTLG AFGGAGATALVFLYFCIIFVVVRSCRKK SARPAVGVGDTGMEDANAVRGSASQG PLIESPADDSPPHHAPPALATPSPEEGE

IQYASLSFHKARPQYPQEQEAIGYEYSE INIPK (SEQ ID Nº 158)

QRNNQKNYPLTMQESVTVQQGLCVHV Siglec de XM 005590087. | LESFSYPWYGWISSDPVHGYWFRAGA Cynomolgus 1 HTDRDAPVATNNPARAVREDTRDRFHL

LGDPQTKNCTLSIRDARSSDAGTYFFRV

EE ee Nome Sequência (AA) referência NCBI|

ETGKTKWNYKYAPLSVHVTALTHRPNIL IPGTLESGCPRNLTCSVPWACEQGTAP MISWMGTSVSPLDPSTTRSSVLTLIPQP QDHGTSLTCQVTFPGASVTTNKTIHLNV SYPPQNLTMTVFQGNDTVSIVLGNGSS VSVPEGPSLRLVCAVDSNPPARLSLSW GGLTLCPSQPSNPGVLELPRVHLRDEE EFTCRAQNLLGSQQVSLNVSLQOSKATS

GLTQGAVGAGATALVFLSFCVIFVVVP (SEQ ID Nº 159)

QTSKLLTMOSSVTVQEGLCVHVPCSFS YPSHGWIYPGPVVHGYWFREGANTDO DAPVATNNPARAVWEETRDRFHLLGDP HTENCTLSIRDARRSDAGRYFFRMEKG SIKWNYKHHRLSVNVTALTHRPNILIPGT LESGCPQNLTCSVPWACEQGTPPMIS

WIGTSVSPLDPSTTRSSVLTLIPQPQDH Alelo de Siglec-

GTSLTCQVTFPGASVTTNKTVHLNVSY 9 K100E/A315E

PPQNLTMTVFQGDGTVSTVLGNGSSLS humano

LPEGOSLRLVCAVDAVDSNPPARLSLS WRGLTLCPSQPSNPGVLELPWVHLRD EAEFTCRAQNPLGSQQVYLNVSLOSKA TSGVTQGVVGGAGATALVFLSFCVIFVV VRSCRKKSARPAAGVGDTGIEDANAVR GSASQGPLTEPWAEDSPPDQPPPASA RSSVGEGELQYASLSFQMVKPWDSRG

Sequência de Nome Sequência (AA) referência NCBI| | TT TaeamoTEvSENHR SEA ID Nº 160)

MEWSWVFLFFLSVTTGVHSGKPIPNPL LGLDSTQTSKLLTMQOSSVTVQEGLCVH VPCSFSYPSHGWIYPGPVYVHGYWFRE

GANTDQDAPVATNNPARAVWEETRDR Domínio similar

FHLLGDPHTKNCTLSIRDARRSDAGRYF a Ig conjunto V

FRMEKGSIKWNYKHHRLSVNVTAATSG N-terminal de

VTAQGVVGGAGATALVFLSFCVIFVVVRS Siglec-9 humano

CRKKSARPAAGVGDTGIEDANAVRGSA SQGPLTEPWAEDSPPDQPPPASARSS

VGEGELQOYASLSFQMVKPWDSRGQEA TDTEYSEIKIHR (SEQ ID Nº 161)

MEWSWVFLFFLSVTTGVHSGKPIPNPL LGLDSTLTHRPNILIPGTLESGCPQNLTC SVPWACEQGTPPMISWIGTSVSPLDPS

TTRSSVLTLIPQPQDHGTSLTCQVTFPG Domínio 1 tipo

ASVTTNKTVHLNVSYPPQNLTMTVFOG C2 similar a Ig

DGTVATSGVTAQGVVGGAGATALVFLSF Siglec-9

CVIFVVVRSCRKKSARPAAGVGDTGIED humano

ANAVRGSASQGPLTEPWAEDSPPDQP

PPASARSSVGEGELQYASLSFQMVKP WDSRGQEATDTEYSEIKIHR (SEQ ID Nº 162) Domínio 2 tipo MEWSWVFLFFLSVTTGVHSGKPIPNPL C2 similar a Ig LGLDSTSTVLGNGSSLSLPEGQSLRLVC

JE ee Nome Sequência (AA) referência NCBI| de Siglec-9 AVDAVDSNPPARLSLSWRGLTLCPSQP humano SNPGVLELPWVHLRDAAEFTCRAQNPL

GSQQVYLNVSLASKATSGVTAGVYVYGG AGATALVFLSFCVIFVVVRSCRKKSARP AAGVGDTGIEDANAVRGSASQGPLTEP WAEDSPPDQPPPASARSSVGEGELQY

ASLSFQMVKPWDSRGQEATDTEYSEIKI HR (SEQ ID Nº 163)

[00315] Parte B — humanização de anticorpos anti-Siglec-9.

[00316] Os anticorpos MALA, mALB e mAbD que possuem as regiões variáveis correspondentes exibidas na Tabela B do presente foram modificados como anticorpos humanizados por meio de enxerto de região de determinação da complementaridade (CDR). Com base em estudos de modelamento 3D, foram projetadas regiões variáveis de cadeia leve e pesada diferentes que possuem a sequência de aminoácidos exibida abaixo e incluíram CDRs de MALA, mAbB ou mAbD modificadas correspondentes e cadeias principais humanas, produzidas na forma de anticorpos IgG1 humanos que possuem substituições para ligação de receptores de Fcy eliminados. Anticorpos são produzidos utilizando-se células CHO e testados para determinar a ligação a Siglec-9 humano.

ANTICORPO MABA:

[00317] Com base em estudos de modelamento 3D, foram projetadas diferentes regiões variáveis de cadeia leve e pesada que incluíram CDRs de mAbA e cadeias principais humanas, produzidas como anticorpos IgG1 humanos. Foram produzidas quatro cadeias pesadas diferentes (denominadas HO, H1, H2 e H3) e três cadeias leves diferentes (denominadas

LO, L1 e L2). As cadeias leve e pesada continham as substituições de aminoácidos específicas (exibidas em negrito abaixo; CDRs de Kabat sublinhadas).

[00318] MARbA: região variável de cadeia pesada “HO”,

QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYWMHWVRQAPGQGLEWMG

EINPSNGHTNYNEKFESRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGVES YDFDDALDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº 170)

[00319] MADbA: região variável de cadeia pesada “H1”,

QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYWMHWVRQAPGQGLEWMG

EINPSNGHTNYNEKFESRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCANGVES YDFDDALDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº 171)

[00320] MADbA: região variável de cadeia pesada “H2”.

QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASYFTFSSYWMHWVRQAPGQGLEWMGE

INPSNGHTNYNEKFESRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCANGVESY DFDDALDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº 172)

[00321] MAbA: região variável de cadeia pesada “H3”.

QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASYFTFSSYWMHWVRQAPGQGLEWMGE

INPSNGHTNYNEKFESRVTITADRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCANGVESY DFDDALDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº 173)

[00322] MAbA: região variável de cadeia leve “LO”.

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSR

LHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID Nº 174)

[00323] MAbA: região variável de cadeia leve “L1”.

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSR

LHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQAQGNTLPFTFGGGTKVEI K (SEQ ID Nº 175)

[00324] MAbA: região variável de cadeia leve “L2”.

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINNYLNWYQQKPGKAIKLLIYYTSRL

HSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCAQGNTLPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID Nº 176) ANTICORPO MABB:

[00325] Com base em estudos de modelamento 3D, foram projetadas diferentes regiões variáveis de cadeia leve e pesada que incluíram CDRs de mADbB e cadeias principais humanas, produzidas como anticorpos IgG1 humanos. Foram produzidas seis cadeias pesadas diferentes (denominadas HO, H1, H2, H3, H4 e H5) e três cadeias leves diferentes (denominadas LO, L1 e L2). Estas regiões variáveis incluíram, para a região variável de cadeia pesada: CDRs de cadeia pesada de mAbB (exibidas abaixo, sublinhadas), regiões 1, 2 e 3 de cadeia principal do gene IGHV1-69 humano. Região variável de cadeia leve: as CDRs de cadeia leve de mAbB (exibidas abaixo, sublinhadas), regiões 1, 2 e 3 de cadeia principal do gene IGHV1-33 humano. Foram então preparadas combinações de cadeias leve e pesada. As cadeias leve e pesada continham as substituições de aminoácidos específicas (exibidas em negrito abaixo; CDRs de Kabat sublinhadas).

[00326] MAbB: região variável de cadeia pesada “HO”.

QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYWMHWVRQAPGQGLEWMG

EINPSNGHTNYNEKFKTRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCANGVET YDFDDAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº 177)

[00327] MAbB: região variável de cadeia pesada “H1”.

QVQALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASVYTFSSYWMHWVRQAPGQGLEWMG

EINPSNGHTNYNEKFKTRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCANGVET YDFDDAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº 178)

[00328] MAbB: região variável de cadeia pesada “H2”,

QVQALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASVYTFSSYWMHWVRQAPGQGLEWMG EINPSNGHTNYNEKFKTRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCANGVET

YDFDDAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº 179)

[00329] MAbB: região variável de cadeia pesada “H3”,

QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASVYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWMGEI

NPSNGHTNYAEKFKTRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCANGVETYD FDDAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº 180)

[00330] MAbB: região variável de cadeia pesada “H4”,

QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASVYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWMGEI

NPSNGHTNYAEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCANGVETY DFDDAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº 181)

[00331] MAbB: região variável de cadeia pesada “H5”.

QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASVYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWMGEI

NPSNGHTNYNEKFKTRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCANGVETYD FDDAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº 182)

[00332] MAbB: região variável de cadeia leve “LO”.

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDINNYLNWYQQKPGKAPKLLIYFTSR

LHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCAQQGDTFPFTFGGGTKVEI K (SEQ ID Nº 183)

[00333] MAbB: região variável de cadeia leve “L1”.

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINNYLNWYQQKPGKAPKLLIYFTSRL

HSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCAQGDTFPETFGGGTKVEIK (SEQ ID Nº 184)

[00334] MAbB: região variável de cadeia leve “L2”.

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDINNYLNWYQQKPGKAPKLLIYFTSR

LHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCAQAGDTFPFTFGGGTKVEI K (SEQ ID Nº 185) ANTICORPO MABC':

[00335] Com base em estudos de modelamento 3D, foram projetadas diferentes regiões variáveis de cadeia leve e pesada que incluíram

CDRs de mAbC e cadeias principais humanas, produzidas como anticorpos IgG1 humanos. Foram produzidas quatro cadeias pesadas diferentes (denominadas HO, H1, H2 e H3) e duas cadeias leves diferentes (denominadas LO e L1). Foram então preparadas combinações de cadeias leves e pesadas. As regiões variáveis incluíram, para a região variável de cadeia pesada: CDRs de cadeia pesada de mAbC (exibidas abaixo, sublinhadas), regiões 1, 2 e 3 de cadeia principal do gene IGHV7-4-1 humano. Região variável de cadeia leve: as CDRs de cadeia leve de mAbC (exibidas abaixo, sublinhadas), regiões 1, 2 e 3 de cadeia principal do gene IGKV7-3 humano. As cadeias leves e pesadas continham as substituições de aminoácidos específicas (exibidas em negrito abaixo; CDRs de Kabat sublinhadas).

[00336] MAbC: região variável de cadeia pesada “HO”.

QVALVASGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYEMNWVRQAPGQGLEWMG

WINTYTGESTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDDYG RSYGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID Nº 192)

[00337] MAbC: região variável de cadeia pesada “H1”.

QVALVASGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYEMNWVREAPGQGLEWMGW

INTYTGESTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDDYGR SYGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID Nº 193)

[00338] MAbC: região variável de cadeia pesada “H2”.

QVALVASGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYEMNWVREAPGQGLEWMGW

INTYTGESTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCVRDDYGR SYGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID Nº 194)

[00339] MAbC: região variável de cadeia pesada “H3”.

QVALVASGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYEMNWVREAPGQGLEWMGW

INTYTGESTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCVRDDYGRS YGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID Nº 195)

[00340] MAbC: região variável de cadeia leve “LO”.

DIVLTASPASLAVSPGQRATITCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIY

LASKLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCHQNNEDPPWTFGG GTKVEIK (SEQ ID Nº 196)

[00341] MAbC: região variável de cadeia leve “L1”.

DIVLTASPASLAVSPGQRATITCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIY

LASKLESGVPARFSGSGSRTDFTLTINPVEANDTANYYCHQNNEDPPWTFGG GTKVEIK (SEQ ID Nº 197) ANTICORPO MABD:

[00342] Com base em estudos de modelamento 3D, foram projetadas diferentes regiões variáveis de cadeia leve e pesada que incluíram CDRs de mAbLD e cadeias principais humanas, produzidas como anticorpos IgG1 humanos. Foram produzidas três cadeias pesadas diferentes (denominadas HO, H1 e H2) e três cadeias leves diferentes (denominadas LO, L1 e L2). Foram então preparadas combinações de cadeias leves e pesadas. As regiões variáveis incluíram, para a região variável de cadeia pesada: as CDRs de cadeia pesada de MAbD (exibidas abaixo, sublinhadas), regiões 1, 2 e 3 de cadeia principal do gene IGHV7-4-1*02 humano e região 4 de cadeia principal do gene IGHJ6*01 humano. Região variável de cadeia leve: as CDRs de cadeia leve de mAbD (exibidas abaixo, sublinhadas), regiões 1, 2 e 3 de cadeia principal do gene IGKV1-39*01 humano. As cadeias leves e pesadas continham as substituições de aminoácidos específicas (exibidas em negrito abaixo; CDRs de Kabat sublinhadas).

[00343] MAbD: região variável de cadeia pesada “HO”.

QVALVASGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHWVRQAPGQGLEWMG

WIITETGEPTYADDFRGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDFDGY WGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº 186)

[00344] MAbD: região variável de cadeia pesada “H1”.

QVALVASGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHWVRQAPGQGLKWMG WIITETGEPTYADDFRGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDFDGY

WGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº 187)

[00345] MAbD: região variável de cadeia pesada “H2”.

QVALVASGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHWVRQAPGQGLKWMG

WIITETGEPTYADDFRGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARDFDGY WGQGTTVTVSS (SEQ ID Nº 188)

[00346] MAbD: região variável de cadeia leve “LO”.

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLIYNAKTL

TEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLAPEDFATYYCQHHYGFPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID Nº 189)

[00347] MAbD: região variável de cadeia leve “L1”.

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKFLIYNAKTL

TEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLAPEDFATYYCQHHYGFPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID Nº 190)

[00348] MAbD: região variável de cadeia leve “L2”.

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKFLIYNAKTL

TEGVPSRFRGSGSGTDFTLTISSLAQPEDFATYYCQHHYGFPWTFGGGTKVEI K(SEQ ID Nº 191) EXEMPLO 3 LIGAÇÃO A SIGLECS RELATIVOS A CD33:

[00349] Siglecs relativos a CD33 que compartilham similaridade de sequências com Siglec-7 e 9 são geralmente divididos em dois grupos, um primeiro subconjunto composto de Siglec-1, 2, 4 e 15 e o grupo relativo a CD33 de Siglecs que inclui Siglec-3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 e 16. Como outros Siglecs relativos a CD33 possuem funções biológicas diferentes e/ou não se acredita que sejam envolvidos em acompanhamento de tumores, os anticorpos foram adicionalmente selecionados para determinar se é possível obter anticorpos Siglec-7/9 reativos que não se ligam a outros Siglecs relativos a CD33.

[00350] Foram geradas células que expressam Siglec-3, 5, 6, 8, 10, 11 e 12 e um subconjunto representativo dos anticorpos Siglec-7/9 reativos foi testado por meio de citometria de fluxo para ligação às células. Sequências de aminoácidos e referências Genbank para diferentes Siglecs utilizados no presente são exibidos na Tabela 1 acima.

[00351] Resumidamente, foram utilizadas linhagens de células CHO que expressam HuSiglec (que expressaram um dos Siglecs). Para seleção por citometria de fluxo, os anticorpos foram incubados por uma hora com cada linhagem de células CHO que expressam HuSiglec (linhagem de células CHO HuSiglec-3, linhagem de células CHO HusSiglec-5, linhagem de células CHO HuSiglec-6, linhagem de células CHO HusSiglec-8, linhagem de células CHO HuSiglec-10, linhagem de células CHO HuSiglec-11 e linhagem de células CHO HuSiglec-12), lavados por duas vezes em tampão de manchas, revelados por anticorpo policlonal anticamundongos de cabra (pAb) marcado com PE, lavado por duas vezes com tampão de manchas e manchas foram obtidas em um citômetro HTFC e analisadas utilizando o software FlowJo.

[00352] Os resultados demonstraram que nenhum dos anticorpos anti-Siglec-9 mAbA, mAbB, mAbC, mAbD, mAbE e mAbF ligou-se a nenhum dos Siglecs-3, 5, 6, 7, 8, 10, 11 ou 12.

[00353] Os resultados demonstraram que alguns anticorpos Siglec-7/9 reativos podem ser capazes de também ligar-se a Siglec-12 ou Siglec-6 além de Siglec-7 e 9. mAb1, mAb2 e mAb3 ligaram-se a Siglec-12 além de Siglec-7 e 9, enquanto MAb3, mAb4, mAb5 e mAb6 não se ligaram a Siglec-12. Nenhum dos exemplos de anticorpos mMAb1, mAb2, mAb3, mAbA, MAb5 ou mAb6 ligou-se a nenhum dos Siglecs-3, 5, 6, 8, 10 ou 11.

EXEMPLO 4 TITULAÇÃO DE ANTICORPOS PARA LIGAÇÃO A SIGLECS:

[00354] A ligação de anticorpos sobre Siglec-7 humano,

Siglec-9 humano e Siglec-9 de cynomolgus foi testada por meio de experimentos de titulação por meio de citometria de fluxo sobre células CHO transfectadas com Siglec-7 humano e Siglec-9 humano e Siglec-9 de cynomolgus. As células foram incubadas por uma hora em Tampão de Manchas (SB) com anticorpos primários a 20 ug/ml e uma série de diluição de 1:5. Elas foram manchadas por três vezes com SB, incubadas em seguida por minutos com PE anti-lgG humano F(ab')2 de cabra (Fc) (Beckman Coulter nº IMOS5510) e lavadas por duas vezes com SB. A fluorescência foi revelada com citômetro HTFC Intellicyt.

[00355] Concluiu-se que seis anticorpos exibidos abaixo das cinco fusões nas duas imunizações possuem afinidade de ligação comparável para Siglec-7 humano e Siglec-9 humano conforme expresso por células e, adicionalmente, para Siglec de cynomolgus. Os valores ECs5o (pg/ml) para ligação para cada anticorpo são exibidos abaixo.

[O] [e [ne ] ns [16 [16 [1a] EXEMPLO 5 AFINIDADE DE LIGAÇÃO DE SIGLEC-9 POR MEIO DE RESSONÂNCIA DE PLASMA DE SUPERFÍCIE (SPR): REAGENTES E PROCEDIMENTO GERAL DE BIACOREO T100:

[00356] Foram realizadas medições de SPR em um aparelho Biacore& T200 (Biacore& GE Healthcare) a 25 “C. Em todos os experimentos Biacore&, HBS-EP+ (BiacoreG GE Healthcare) e 10 mM de NaOH serviram de tampão de condução e tampão de regeneração, respectivamente. Sensogramas foram analisados com software de avaliação Biacore& T200. Proteínas multiméricas Siglec-9 e 7 humanas foram clonadas,

produzidas e purificadas na Innate Pharma. IMOBILIZAÇÃO DE PROTEÍNA A:

[00357] Proteínas foram covalentemente imobilizadas em grupos carboxila na camada de dextrano em um Chip Sensor CM5. A superfície do chip foi ativada com EDC/NHS cloridrato de (N-etil-N'-(3- dimetilaminopropil) carbodiamida e N-hidroxissuccinimida (BiacoreG, GE Healthcare). As proteínas foram diluídas a 10 ugiml em tampão de acoplamento (10 mM de acetato, pH 4,2 e 5,0) e injetadas até atingir-se o nível de imobilização apropriado (ou seja, 600 a 2000 RU). A desativação dos grupos ativados remanescentes foi realizada utilizando-se 100 mM de etanolamina sob pH 8 (Biacore&, GE Healthcare).

ESTUDO DE AFINIDADE:

[00358] O estudo de afinidade foi conduzido de acordo com um protocolo cinético padrão recomendado pelo fabricante (assistente cinético BiacoreG GE Healthcare). Diluições em série de fragmentos de Fab de anticorpo anti-Siglec-9 e 7/9 que variam de 600 nM a 0,975 nM foram sequencialmente injetadas sobre as proteínas Fc Siglec-7 e Fc Siglec-9 imobilizadas e mantidas em dissociação por dez minutos antes da regeneração. Os conjuntos de sensogramas completos foram instalados utilizando-se o modelo de ligação cinética 1:1. Afinidades monovalentes e constantes de velocidade de associação e dissociação cinética são exibidas na Tabela 2 abaixo.

TABELA 2 fere rendem QNT

ER ra e OQ EXEMPLO 6 TITULAÇÃO SOBRE CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DE MONÓCITOS: GERAÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DE MONÓCITOS (MODCS):

[00359] Células dendríticas derivadas de monócitos foram geradas a partir de células mononucleares do sangue periférico. PBMCs foram isoladas de camadas leucoplaquetárias, obtidas de doadores saudáveis. Monócitos foram purificados utilizando-se o Kit de Isolamento de Monócitos |! (Miltenyi Biotec) e foram diferenciados em moDC por um total de seis dias em meio RPMI (GIBCO) suplementado com 10% de FBS desativado (GIBCO), Glutamina (GIBCO), MEM NEAA (GIBCO), piruvato de sódio (GIBCO), IL-4 (20 ng/ml) (Peprotech) e GM-CSF (400 ng/ml) (Miltenyi Biotec). Células foram cultivadas em um incubador de CO2 umedecido a 37 ºC e as citoquinas foram renovadas no dia 4.

[00360] moDC foram dessialiladas por duas horas com 25 mU de neuraminidase (Roche Diagnostics). A dessialilação foi controlada antes e depois do tratamento com neuraminidase: células moDCs foram incubadas por uma hora em Tampão de Manchas (SB) com Fc Siglec-7 de camundongo (IPH) e proteína recombinante Fc Siglec-9 de camundongo (IPH) a 10 ua/ml, lavadas por duas vezes com SB, incubadas por 30 minutos com PE anti-lgG de camundongo F(ab')2 de cabra (Fc) (Jackson ImmunoResearch), lavadas por duas vezes com SB e a fluorescência foi revelada com Canto Il (HTS).

TITULAÇÕES:

[00361] A ligação sobre moDCs e moDCs tratadas com neuraminidase foi testada em um experimento de titulação por meio de citometria de fluxo. As células foram incubadas por uma hora em Tampão de Manchas (SB) com anticorpos primários a 10 ug/ml e uma série de diluição de 1:10. Elas foram lavadas por duas vezes com SB, incubadas em seguida por minutos com PE anti-lgG humano F(ab)?º de cabra (Fc) (Jackson ImmunoResearch) e lavadas por duas vezes com SB. A fluorescência foi revelada com citômetro HTFC Intellicyt.

RESULTADOS:

[00362] A ECso foi altamente aprimorada (10 vezes) após tratamento com neuraminidase, o que sugere que Siglec-9 expresso sobre moDCs foi acionado em interação cis com seus ligantes de ácido siálico antes do tratamento com neuraminidase. O nível de fase estável, entretanto, não é modificado, o que sugere que os anticorpos com alta afinidade podem ligar todas as conformações de Siglec-9 (ligado e não ligado) sobre a superfície celular e inibe interações cis e sinalização em monoDCs, bem como em outros tipos celulares (por exemplo, células NK, células T CD8, monócitos e macrófagos M1 e M2). Os resultados são exibidos na Figura 3 para anticorpos MAbA, mAbC e mAbD representativos em moDC (painel esquerdo) e moDC tratada com neuramidase (painel direito), acompanhados pelos seus valores ECrso correspondentes.

EXEMPLO 7

AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE ANTICORPOS DE NEUTRALIZAR A ATIVIDADE DE SIGLEC EM CÉLULAS NK:

[00363] Anticorpos anti-Siglec-7/9 testados na primeira e na segunda imunização foram testados para bloqueio da atividade de Siglec em um teste de ativação de células NK utilizando células NK primárias (células NK novas purificadas de doadores humanos, incubadas por uma noite a 37 ºC antes do uso) O aumento da expressão de CD137 em 24 horas é correlacionada à ativação de diversos linfócitos que incluem células NK (Kohrt et al (2011), Blood 117 (8): 2423-2432). O efeito de anticorpo anti-Siglec-7/9 e dessialilação de células alvo sobre a ativação de células NK foi determinado por meio de análise da expressão de CD137 sobre células NK por meio de citometria de fluxo. Cada um dos mAbs anti-Siglec-7/9 mAb1, mAb2, mAb3, MAb4, mAb5 e mAb6 induziu aumento da expressão de CD137 após 24 horas.

[00364] Os efeitos de anticorpos anti-Siglec-7/9 foram estudados em seguida por meio de testes de citotoxicidade (Cr5') com linhagem de células efetoras YTS Siglec-9* (a linhagem de células NK humanas YTS transfectada com Siglec-9 humano) como efetora e linhagem de células de Ramos como alvo. Este teste mede a citotoxicidade da linhagem de células YTS Siglec-9* por meio de quantificação direta da lise de células alvo carregadas com Cr. Resumidamente, as células alvo são marcadas em primeiro lugar com isótopo Cr radioativo e coincubadas em seguida por quatro horas a 37 ºC com células efetoras. Durante esse período, células alvo que são sensíveis a células YTS são lisadas liberando-se 5ºCr no meio. O Cr no sobrenadante recuperado é medido por meio de contagem de cintilação de líquidos. Os resultados obtidos permitem a avaliação do percentual de lise de células alvo por células NK. O teste foi conduzido em placas com 96 cavidades em U em RPMI completo, 200 ul final/cavidade, com razão E:T 5/1. Anticorpos anti-Siglec-7/9 e isótipo controle foram adicionados a 10 ug/ml e uma série de diluição de 1:10.

[00365] Cada um dos mAbs anti-Siglec-7/9 mAb1, mAb?2, MAb3, mAb4, mAb5 e mAb6 induziu aumento da citotoxicidade de Siglec-9* YTS em forma dependente de dosagem. Como controle, este efeito não foi observado sobre linhagem celular de YTS do tipo selvagem (sem expressão de

Siglec-9). De forma similar, cada um dos mAbs anti-Siglec-9 MALA, mAbB, MAbC, mAbD, mAbE e mAbF induz aumento da citotoxicidade de Siglec-9* YTS em forma dependente de dosagem. A Figura 4 exibe indução dependente de dosagem de aumento da citotoxicidade de Siglec-9* YTS entre anticorpos reativos a Siglec-7 e 9 (Figura 4B) e entre os anticorpos monoespecíficos Siglec-9 (sem ligação a Siglec-7) (Figura 4A).

EXEMPLO 8 ESTUDO DETALHADO DA NEUTRALIZAÇÃO DE SIGLEC-9 EM CÉLULAS NK HUMANAS PRIMÁRIAS (BAIXA EXPRESSÃO DE SIGLEC-9):

[00366] Consideramos a possibilidade de que a incapacidade dos anticorpos anteriores de neutralizar Siglec-9 em células NK poderá estar relacionada a diferenças da expressão de Siglec-9 em células NK primárias em comparação, por exemplo, com neutrófilos e outras células que expressam níveis muito mais altos de Siglec-9 na sua superfície e Siglec-7 expresso em diferentes subconjuntos de células NK. A fim de investigar se poderão ser obtidos anticorpos que neutralizem Siglec-9 em células NK, estudamos e selecionamos anticorpos em células NK primárias a partir de uma série de doadores humanos, fechados sobre Siglec-9 por meio de citometria de fluxo. O efeito de anticorpos anti-Siglec-9 foi estudado por meio de citotoxicidade, determinando-se a lise de células de tumor em um teste de liberação de Cr clássico e por testes de ativação, determinando-se a expressão na superfície de CD137 sobre células NK. Em cada caso, células NK primárias (na forma de células NK novas purificadas de doadores) foram utilizadas como células efetoras e linhagem de células de câncer colorretal HT29 foi utilizada como alvo.

PARTE 1: TESTE DE CITOTOXICIDADE — CÉLULAS DE TUMORES HT29 x NK PURIFICADAS EM DOIS DOADORES HUMANOS.

[00367] O teste de citotoxicidade mediu a citotoxicidade de células NK por meio de quantificação direta da lise de células alvo carregadas com Cr. Resumidamente, as células alvo foram marcadas em primeiro lugar com isótopo S'Cr radioativo e coincubadas em seguida por quatro horas a 37 ºC com células efetoras. Durante esse período, células alvo que são sensíveis a células NK foram lisadas liberando-se S*'Cr no meio. O Cr no sobrenadante recuperado foi medido por meio de contagem de cintilação de líquidos. Os resultados obtidos permitem a avaliação do percentual de lise de células alvo por células NK. O teste foi conduzido em placas com 96 cavidades em U em RPMI completo, 200 ul final/cavidade, com razão E:T 8/1. Anticorpos anti- Siglec-9 e isótipo controle foram adicionados a 10 uo/ml.

[00368] Cada um dos anticorpos anti-Siglec-9 mAbA, mAbB, MAbC, mAbD, mAbLE e mAbF e os anticorpos anti-Siglec-7/9 mAb1, mAb2, MAb3, mAb4, mAb5 e mAb6 induziu aumento da citotoxicidade de células NK. A Figura 5 é uma figura representativa que exibe o aumento da citotoxicidade de células NK primárias mediada pelo anticorpo MALbA, mAbC, mAbD, mAbLE e MAbF em dois doadores humanos diferentes (doadores D1 (painel esquerdo) e D?2 (painel direito)). PARTE 2: TESTE DE ATIVAÇÃO (CD137) — COMPARAÇÃO DE MAB, NK PURIFICADO X HT29, EM UM ÚNICO DOADOR HUMANO:

[00369] O efeito dos anticorpos anti-Siglec-7/9 e anti-Siglec- 9 sobre a ativação de células NK foi determinado por meio de análise da expressão de CD137 sobre células NK positivas para Siglec-9 por meio de citometria de fluxo. Células efetoras foram células NK primárias (células NK novas purificadas de doadores, incubação por uma noite a 37 ºC antes do uso) e células alvo (linhagem celular HT29) foram misturadas em razão 1:1. O teste CD137 foi conduzido em placas com 96 cavidades em U em RPMI completo, 200 yu! final/cavidade. Anticorpos foram previamente incubados por 30 minutos a 37 ºC com células efetoras e, em seguida, células alvo foram coincubadas por uma noite a 37 ºC. As etapas seguintes foram: 3 min de centrifugação a 500 g; lavagem por duas vezes com Tampão de Manchas (SB); adição de 50 ul de mistura Ab de manchas (anti-CD3 Pacific blue — BD Pharmingen; anti-CD56- PE-Vio770 (Miltenyi); anti-CD137-APC (Miltenyi), anti-Siglec-9 K8-PE (Biolegend); 30 min de incubação a 4 ºC; lavagem por duas vezes com SB; pelota novamente suspensa com SB; e fluorescência revelada com Canto || (HTS).

[00370] Os controles negativos foram células NK x HT29 isoladamente e na presença de isótipo controle. A Figura 6 é uma figura representativa que exibe aumento do percentual de células NK positivas para Siglec-9 que expressam CD137 mediado por diversos anticorpos anti-Siglec-9 e anti-Siglec-7/9 mAbA, mAbB, mAbF, mAb6 e mAb4 em um doador humano. Como controle, o percentual de células NK negativas para Siglec-9 que expressam CD137 não foi afetado por esses anticorpos. Como se pode observar na figura, os anticorpos anti-Siglec-9 restauraram totalmente a citotoxicidade de células NK humanas primárias que expressam Siglec-9 até o nível observado em células NK humanas primárias negativas para Siglec-9 do mesmo doador.

PARTE 3: TESTE DE ATIVAÇÃO (CD137) — NK PURIFICADA x HT29, MABA E MAB1 EM SEIS DOADORES HUMANOS.

[00371] Experimentos — foram reproduzidos com seis doadores, utilizando um anti-Siglec-9 (mMAbA) e um anti-Siglec-7/9 (mMAb1). Na ausência de anticorpos (a configuração “média”), o percentual de NK que expressa CD137 variou entre os doadores de 6% a 27% (vide a Figura 7, painel esquerdo). Os dados foram normalizados para que fossem alteração relativa em comparação com o valor médio controle de cada experimento: ((X - Xmédio))/Xmédio) (%). Conforme exibido na Figura 7, MALA e mAb1 induziram aumento do percentual de NK CD137+ Siglec-9+ (Figura 7, painel central) e não do percentual de NK CD137+ Siglec-9- (Figura 7, painel direito). EXEMPLO 9 TITULAÇÃO SOBRE CÉLULAS NK PRIMÁRIAS:

[00372] A ligação de anticorpos sobre células NK humanas purificadas novas foi testada por meio de experimento de titulação por citometria de fluxo. As células foram incubadas por uma hora em Tampão de Manchas (SB) com anticorpos primários a 10 ug/ml e uma série de diluição de 1:10. Elas foram lavadas por três vezes com SB e incubadas em seguida por 30 minutos com PE anti-lgG humano F(ab')? de cabra (Fc) (Jackson ImmunoResearch). Manchas foram obtidas em BD FACS Canto || e analisadas utilizando-se o software FlowJo. Os valores ECs5o são exibidos na tabela abaixo em pg/ml (calculados utilizando-se enquadramento logístico com quatro parâmetros).

o [| esse ms TO [me TO es EXEMPLO 10 BLOQUEIO DA LIGAÇÃO DE SIGLEC A LIGANTES DE ÁCIDO SIlÁLICO: PARTE À — BLOQUEIO DA LIGAÇÃO DE SIGLEC-9 A CÉLULAS DE TUMORES QUE EXPRESSAM ÁCIDO SIÁLICO POR MEIO DE CITOMETRIA DE FLUXO:

[00373] Faixa de dosagem de Fab de Siglec-9 anti-humano foi coincubada por 30 minutos à temperatura ambiente com a proteína recombinante de fusão Siglec-9 Fc humano em dose fixa e adicionada em seguida sobre diversas linhagens celulares que expressam ácido siálico K562 E6 (linhagem celular K562 (células de leucemia mielógena crônica (CML) humana; referência ATOCCO CCL-2430) transfectada com HLA-E humano) e Ramos por uma hora. Após lavagem das células por duas vezes em tampão de manchas, anticorpos secundários de fragmentos Fc anti-lgG de camundongos de cabra acoplado a PE (Jackson ImmunoResearch) diluídos em tampão de manchas foram adicionados às células e as placas foram incubadas por 30 minutos adicionais a 4 ºC. As células foram lavadas por duas vezes e analisadas em um citômetro de fluxo Accury C6 equipado com um leitor de placas HTFC. A fluorescência média contra a razão entre Fab e proteína recombinante de fusão Siglec-9 Fc.

[00374] Os resultados são exibidos na Figura 8. No painel superior, é exibida a ligação de proteína Siglec-9-Fc a células de Ramos na presença de anticorpos. Cada um dentre os mAbs anti-Siglec-9 MALA, mAbB, mMAbC e mAbD inibiu a ligação de proteína Siglec-9-Fc às células de Ramos, enquanto mAbLE exibiu capacidade parcial de inibição da ligação da proteína Siglec-9-Fc às células de Ramos e mAbF não inibiu significativamente a ligação de proteína Siglec-9-Fc às células de Ramos. Na Figura 8, painel inferior, é exibida a ligação de proteína Siglec-9-Fc a células K562 na presença de anticorpos. Cada um dentre os mAbs anti-Siglec-9 MALA, mAbB, mALbC e mMAbD inibiu a ligação de proteína Siglec-9-Fc às células de Ramos, enquanto MAbE e mAbF exibiram capacidade parcial de inibição da ligação de proteína Siglec-9-Fc às células K562 e somente em concentrações significativamente mais altas de anticorpo. Concluindo, os anticorpos mMALbA, mAbB, mAbLbC e mMAbD bloqueiam totalmente a ligação de Siglec-9 aos seus ligantes de ácido siálico em células de tumor, enquanto o bloqueio de MALE depende da linhagem celular que expressa ácido siálico e MAbF não bloqueia a ligação.

[00375] Experimentos foram repetidos com anticorpos humanizados que possuem as CDRs de cadeia leve e pesada de mAbA ou mMAbD. Cada um dentre os anticorpos MAPA e mAbD humanizados relacionados no presente na Tabela C (que possuem combinações de VH e VL do Exemplo 2) demonstrou inibição da ligação de proteína Siglec-9 Fc às células de Ramos comparáveis às do anticorpo MALA ou mAbD parental correspondente.

PARTE B — BLOQUEIO DA LIGAÇÃO DE SIGLEC-7 E 9 A LIGANTES SIALILADOS POR MEIO DE TESTES ELISA:

[00376] Ácidos siálicos são monossacarídeos carboxilados com nove carbonos sobre proteínas glicosiladas e lipídios formados. Diversas enzimas, incluindo sialiltransferases (que catalisam sua biossíntese) e sialidases, também denominadas neuraminidases (que catalisam sua divisão), regulam sua ocorrência no sistema de mamíferos. Em câncer, o perfil de ácido siálico alterado desempenha papel dominante ampliando o crescimento de tumores, metástase e evitando a vigilância imunológica, gerando sobrevivência das células de câncer (Bork et al, J. Pharm. Sci. outubro de 2009; 98 (10): 3499-508). Maior sialilação, em conjunto com sialilação reguladora do perfil de enzimas alterada, foi relatada em diversos cânceres. A enzima ST3GAL6 é sobre-expressa em diversos pacientes e linhagens de células de mieloma e é associada in vitro à expressão de ácido siálico ligado por a-2,3 sobre a superfície de diversas células de mieloma. /n vivo, kKhockdown de ST3GAL6 é associado à redução do abrigo e enxerto de diversas células de mieloma para o local da medula óssea, em conjunto com redução da carga tumoral e sobrevivência prolongada (Glavey et al, Blood, 11 de setembro de 2014; 124 (11): 1765-76). Alta expressão de enzima ST3GAL1 em glioma é associada a graus de tumores mais altos da classificação molecular mesenquimal (Chong et al, Natl. Cancer Inst, 7 de novembro de 2015; 108 (2). Metilação de promotores aberrante desempenha papel na modulação de diversas sialil transferases na expressão em câncer (Vojta et al, Biochim. Biophys. Acta, 12 de janeiro de 2016). Em câncer da bexiga, metilação de promotor ST6GAL1 aberrante induz perda de expressão de ST6Gal1 (Antony et al, BMC Cancer, 2 de dezembro de 2014; 14: 901).

[00377] Siglec-7 e Siglec-9 ligam-se a diversas ligações de ácido siálico. Biblioteca de sialosida impressa sobre ligantes de sialosida identificados por chips comuns a diversos Siglec e um ligante Siglec-7 seletivo (Rillahan et al, ACS Chem. Biol., 19 de julho de 2013; 8 (7): 1417-22). Em vista do possível reconhecimento diferencial de sialosidas por Siglec-7 e Siglec-9, direcionamento a Siglec-7 e 9 em células imunes poderá permitir o direcionamento de diversos tipos de câncer, considerando as diversas sialil transferases e ácido siálico.

[00378] O bloqueio da interação entre Siglec-7 e 9 e ligantes sialilados por anticorpos anti-Siglec-7/9 foi testado em testes ELISA. Proteínas Siglec foram proteínas recombinantes Fc humanas Siglec-7 e Fc humanas Siglec-9 e os ligantes foram polímeros biotinilados com trissacarídeos sialilados (NeuS5Aca2-3Galb1-4GIcNAcb-PAA-biotina Glycotech nº 01-077 denominado “Sia1” e 6'-siali-lactose-PAA-biotina Glycotech nº 01-039 (denominado “Sia2”). Resumidamente, Proteína A foi revestida sobre placas ELISA por uma noite a 4 ºC. Após três lavagens e saturação, Siglec-7 Fc e Siglec-9 Fc foram adicionados a 0,8 ug/cavidade à temperatura ambiente por 1h30. Após três lavagens, mAbs foram adicionados a 20 ug/ml e uma série de diluição 1:5. Após três lavagens, polímeros sialilados biotinilados foram adicionados por três horas à temperatura ambiente. Após três lavagens, adicionou-se Estreptavidina-Peroxidase (Beckman) a 1:1000. Por fim, a ligação de polímeros sialilados sobre proteínas Siglec-7 e 9 foi revelada por meio da adição de TMB

(Interchim) à temperatura ambiente no escuro e a reação foi suspensa pela adição de H2SO2a. A absorção foi lida a 450 nm.

[00379] Os resultados são exibidos nas Figuras 9 e 10. mAbs 1, 2, 4, 5 e 6 bloqueiam a interação de Siglec-7 com Sia2, ao contrário de mAb3 (Figura 9). Todos os mAbs bloquearam a interação de Siglec-9 com Sia2 (Figura 10), mas mAb1, mAb2 e mAb3 exibiram baixa capacidade de inibição da interação de Siglec-9 com Sia1l (Figura 10) e, portanto, não bloquearam substancialmente a interação de Sia1. MAb5 e mAb6 bloquearam a interação de Siglec-9 com Sia1 e mAb4 apresentou capacidade intermediária de bloqueio da interação de Siglec-9 com Sia1. O efeito de bloqueio sobre Siglec-9 depende do tipo de ácido siálico. De forma geral, observou-se inibição mais completa com os anticorpos anti-Siglec-9 mAbA, mAbB, mAbC e mAbD, que atingiram inibição substancialmente completa da interação de Siglec-9 com ácidos siálicos.

EXEMPLO 11 TITULAÇÃO DE ANTICORPOS HUMANIZADOS SOBRE CÉLULAS QUE EXPRESSAM SIGLEC:

[00380] A ligação de anticorpos humanizados foi testada em células CHO transfectadas com Siglec-9 humano, em experimento de titulação por meio de citometria de fluxo. As células foram incubadas por 90 minutos a 37 ºC em Tampão de Manchas (SB) com anticorpos primários a 10 ug/ml e uma série de diluição de 1:10. Elas foram lavadas por três vezes com SB e incubadas em seguida por 30 minutos com PE anti-lgG humano F(ab')? de cabra (Fc). Os valores EC5o (pg/ml) para células que expressam Siglec-9 são exibidos abaixo.

Co Jo een —

[| ECso médio em CHO Siglec-9 (pg/ml) (n=2) mMAb.A HoL2 3,4E-02 mMAb.A H1LO 4,5E-02 mMAb.A H1L1 3,3E-02 mMAb.A H1iL2 3,7E-02 MAb.A H2LO 3,4E-02 MAb.A H2L1 2,9E-02 mMAb.A H2L2 3,2E-02 mMAb.A H3LO 1,2E-01 MAb.A H3L1 4,4E-02 mMAb.A H3L2 7,4E-02 mMAb.D WT 3,6E-02 mAb.D HoLO 1,9E-02 mAb.D HOL1 1,0E-02 mAb.D HoL2 2,0E-02 mAb.D H1LO 1,9E-02 mAb.D H1L1 1,5E-02 mAb.D H1L2 1,9E-02 mAb.D H2L0 3,0E-02 mAb.D H2L1 1,6E-02 EXEMPLO 12

AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE ANTICORPOS HUMANIZADOS DE NEUTRALIZAR A ATIVIDADE DE SIGLEC EM CÉLULAS NK:

[00381] O teste de citotoxicidade mede a citotoxicidade de células NK por meio de quantificação direta da lise de células alvo K562 carregadas com Cr. Resumidamente, as células alvo são marcadas em primeiro lugar com isótopo Cr radioativo e coincubadas em seguida por quatro horas a 37 ºC com células efetoras (linhagem de células NK que sofreu transdução para expressar Siglec-9 (Siglec-9* de KHYG-1)). Durante esse período, células alvo que são sensíveis a células NK são lisadas liberando-se

S1Cr no meio. O Cr no sobrenadante recuperado é medido por meio de contagem de cintilação de líquidos. Os resultados obtidos permitem a avaliação do percentual de lise de células alvo por células NK. O teste foi conduzido em placas com 96 cavidades em U em RPMI completo, 200 ul final/cavidade, com razão E:T 8/1. Anticorpos humanizados que possuem as CDRs de cadeia leve e pesada de mAb.A ou anticorpos humanizados que possuem as CDRs de cadeia leve e pesada de mAb.D foram adicionados a 10 pg/ml.

[00382] Cada um dos anticorpos humanizados da Tabela 2 (combinações de VH e VL) produzidos no Exemplo 2 testado induziu aumento da citotoxicidade de NK de forma dependente de dosagem.

EXEMPLO 13 EPÍTOPOS DE ANTICORPOS ANTI-SIGLEC UTILIZANDO MUTANTES PONTUAIS:

[00383] A fim de definir os epítopos de anticorpos anti- Siglec-9, o domínio de ligação de nossos anticorpos foi identificado em primeiro lugar por meio da expressão de cada domínio Siglec-9 isolado (domínio similar a Ig conjunto V, domínio 1 do tipo C2 similar a Ig e domínio 2 do tipo C2 similar a lg) com a marca V5 em células HEK293T e teste de ligação dos anticorpos a cada proteína.

[00384] Mutantes Siglec-9 foram projetados e definidos por substituições de aminoácidos expostos na superfície molecular sobre a superfície do domínio similar a lg conjunto V N-terminal. A estrutura de Siglec-9 ainda não foi resolvida e, entre as estruturas de Siglec disponíveis, Siglec-7 é o membro mais próximo (mais de 80% de identidade com a sequência de aminoácidos de Siglec-9). Consequentemente, utilizamos a estrutura de Siglec- 7 para projetar mutantes de Siglec-9. O líder de peptídeo Siglec-9 nativo do polipeptídeo de SEQ ID Nº 2 foi substituído por uma sequência líder substituta e marca V5 (exibida nas proteínas de domínio Siglec-9 domínio similar a Ig conjunto V, domínio 1 tipo C2 similar a lg e domínio 2 tipo C2 similar a lg na

Tabela 1), seguida pela sequência de aminoácidos Siglec-9 da Tabela 1, à qual foram incorporadas substituições de aminoácidos relacionadas na Tabela 3. As proteínas foram expressas na linhagem celular HEK293T.

[00385] Todas as figuras (Figuras 11-14) correspondem ao domínio similar a lg conjunto V N-terminal da estrutura Siglec-7 107V, descrita por Alphey et al (2003), acima. As figuras exibem em sombreamento claro a área de ligação de ligantes, incluindo arginina 124, que é um resíduo fundamental conservado em todos os Siglecs para interação com o grupo carboxila sobre o açúcar de ácido siálico terminal, e os resíduos vizinhos W132, K131, K135 e N133, que são conservados entre Siglec-7 e Siglec-9 e também são descritos como essenciais para ligação de ácido siálico. W132 fornece interação hidrofóbica com a porção glicerol de ácido siálico. As mutações de aminoácidos alvo na Tabela 3 são resíduos presentes em Siglec- 7e9e são exibidas utilizando numeração de SEQ ID Nº 1 para Siglec-7 ou SEQ ID Nº 2 para Siglec-9 (resíduo em Siglec-9 do tipo selvagem/posição de resíduo/resíduo em mutante).

TABELA3 fue fsasoroso nes snereÇos — REISSE TST | fo forame — sao | [e essas — mess |

GERAÇÃO DE MUTANTES:

[00386] Mutantes de Siglec-9 foram gerados por meio de PCR. As sequências amplificadas foram conduzidas sobre gel de agarose e purificadas utilizando-se o Kit de Extração de Gel de Limpeza de PCR Macherey Nagel. Os produtos de PCR purificados gerados para cada mutante foram ligados em seguida a um vetor de expressão, com o sistema ClonTech InFusionO. Os vetores que contêm as sequências que sofreram mutação foram preparados na forma de Miniprep e sequenciados. Após o sequenciamento, os vetores que contêm as sequências que sofreram mutação foram preparados na forma de MidiprepO utilizando o Sistema Midiprep de Plasmídeos Promega PureYieldO. Células HEK293T foram cultivadas em meio DMEM (Invitrogen), transfectadas com vetores utilizando Lipofectamina& 2000 da Invitrogen e incubadas a 37 ºC em um incubador de CO? a 37 “C por 24 ou 48 horas antes do teste da expressão de transgenes.

ANÁLISE DE CITOMETRIA DE FLUXO DE LIGAÇÃO ANTI-SIGLEC-9 ÀS CÉLULAS TRANSFECTADAS HEK293T:

[00387] Os anticorpos mMAb4, mAb5 e mAb6 ligaram-se ao domínio 1 tipo C2 similar a lg, enquanto MALbA, mAbB, mAbC, mAbD, mAbE, MAbF, mAb1, mAb2 e mAb3 ligaram-se ao domínio similar a lg conjunto V N- terminal. Os anticorpos de ligação de domínio similar a Ig conjunto V foram testados para determinar a sua ligação a cada um dos mutantes 1-16 por meio de citometria de fluxo. Realizou-se primeiro experimento para determinar anticorpos que perdem a sua ligação para um ou mais mutantes em uma concentração. Para confirmar perda de ligação, realizou-se titulação de anticorpos sobre anticorpos para os quais a ligação aparentemente é afetada pelas mutações Siglec-9. Anticorpos foram testados adicionalmente em seguida como fragmentos de Fab', pois fragmentos de Fab' são mais sensíveis à perda de ligação, de forma a fornecer maiores detalhes sobre o local de ligação. Os resultados são exibidos na Tabela 4 abaixo (“+” indica ausência de redução de ligação, “+/-" indica ligação reduzida, “” indica perda total da ligação e “ND” indica não realizado).

[00388] Nenhum anticorpo perdeu a ligação ao mutante M2 que inclui uma subestação no resíduo K100 (com referência a Siglec-9 de SEQ ID Nº 2) ou K104 (com referência a Siglec-7 de SEQ ID Nº 1) que varia na população; desta forma, os anticorpos ligar-se-ão ao alelo Siglec-9 exibido na Tabela 1 (SEQ ID Nº 160).

[00389] Os anticorpos específicos anti-Siglec-7 e 9 mAb1, mMAb2 e mAb3 e todos os anticorpos específicos de Siglec-9 mAbE e mAbF perderam a ligação aos mutantes M9, M10 e M11 de Siglec-9, mas não a nenhum outro mutante. O mutante 9 contém substituições de aminoácidos nos resíduos N78, P79, A8O0, R81, A82 e V83 (referência a Siglec-9), o que indica que um ou mais, ou todos os resíduos do mutante são importantes para o epítopo central desses anticorpos. O mutante 10 contém substituições de aminoácidos nos resíduos N77, D96, H98 e T99, o que indica que um ou mais, ou todos os resíduos do mutante são importantes para o epítopo central desses anticorpos. O mutante 11 contém substituições de aminoácidos nos resíduos W84, E85, E86 e R88, o que indica que um ou mais, ou todos os resíduos do mutante são importantes para o epítopo central desses anticorpos. mAb1, quando no formato F(ab), apresentou adicionalmente redução da ligação ao mutante 7, que contém substituições de aminoácidos nos resíduos P55, H58, E122, G124, S125 e K127, o que indica que um ou mais, ou todos os resíduos do mutante são importantes para o epítopo desse anticorpo. MADE e mAbF, quando no formato Fab', apresentaram adicionalmente ligação reduzida ao mutante 8; o mutante 8 contém substituições de aminoácidos nos resíduos R63, A66, N67, T68, D69, Q70 e D71 (referência a Siglec-9), o que indica que um ou mais, ou todos os resíduos do mutante são importantes para o epítopo desses anticorpos. Conforme exibido na Figura 11A, os resíduos substituídos em M9, M10 e M11 são encontrados ao lado do domínio similar a Ig conjunto V N-terminal (sombreamento escuro), longe da face que contém os locais de ligação de ácido siálico (sombreamento claro) e, conforme exibido na Figura 11B, M7 é encontrado ao lado do local de ligação de ácido siálico (sombreamento médio). Conforme exibido na Figura 11C, os resíduos substituídos em M9, M10 e M11 são encontrados ao lado do domínio similar a lg conjunto V N-terminal (sombreamento escuro), longe da face que contém os locais de ligação de ácido siálico (sombreamento claro) e M8 é encontrado no domínio de circuito C-C' que define a especificidade de ligante siálico de Siglecs (vide, por exemplo, Alphey et al, 2003, J. Biol. Chem. 278 (5): 3372- 3377), nem a M15 de M16, que cobrem, em parte, uma região de ligação de ligantes. O anticorpo mAb1 pode, portanto, atingir alta potência de bloqueio de Siglec-9, sem ligação ao circuito C-C', enquanto MALE e mAbF podem ligar-se, ao menos parcialmente, no domínio de circuito C-C',

[00390] O anticorpo específico anti-Siglec-9 mAbD perdeu a ligação ao mutante M6 e apresentou ligação reduzida ao mutante M7, mas não a nenhum outro mutante. O mutante 6 contém substituições de aminoácidos nos resíduos S47, H48, G49, W50, 151, Y52, P53 e G54 (referência a Siglec-9), o que indica que um ou mais, ou todos os resíduos do mutante são importantes para o epítopo central do anticorpo. MALD, quando no formato Fab', perdeu adicionalmente a ligação ao mutante 7, o que indica que um ou mais, ou todos os resíduos do mutante são importantes para o epítopo do anticorpo. Conforme exibido na Figura 12, os resíduos substituídos em M6 (sombreamento escuro) são encontrados sobre o topo da face de domínio similar a lg conjunto V N- terminal que contém os locais de ligação de ácido siálico, mas fora do local de ligação de ligantes (sombreamento claro). M7 contém resíduos que podem sobrepor-se parcialmente na região de ligação de ligantes (em sombreamento claro). M7 incluiu substituições de aminoácidos nos resíduos P55, H58, E122, G124, S125 e K127 (referência a Siglec-9). Os anticorpos não perderam ligação a M8, que possui mutações no domínio de circuito C-C' ou a M15 de M16, que cobrem, em parte, uma região de ligação de ligantes.

[00391] Os anticorpos específicos anti-Siglec-9 MALA e mMAb perderam a ligação ao mutante M16 de Siglec-9, mas não a nenhum outro mutante. O mutante 16 contém substituições de aminoácidos nos resíduos K131 e H136 (referência a Siglec-9), o que indica que um ou mais, ou todos os resíduos do mutante são importantes para o epítopo central desses anticorpos. MAbA e mAbB, quando no formato Fab', perderam adicionalmente ligação ao mutante 14, que contém substituições de aminoácidos nos resíduos R120, W128 e N129A, o que indica que um ou mais, ou todos os resíduos do mutante são importantes para o epítopo desses anticorpos. É interessante notar que, embora M14 e M16 estejam próximos ou dentro de um local de contato de ligante ácido siálico de Siglec-9 (vide a Figura 13A para M16 e a Figura 13B para M14 e M16), os anticorpos não perderam ligação a M8 (mutante de domínio de circuito C-C'), nem a M15. Os anticorpos atingem, portanto, alta potência no bloqueio de Siglec-9 e, adicionalmente, dentro de uma região de contato de ácido siálico, sem ligar-se ao circuito C-C”.

[00392] O anticorpo mAbC, por outro lado, perdeu a ligação ao mutante M8 de Siglec-9 (ou seja, dentro do circuito C-C') e redução da ligação a M15 e M16, mas sem perder totalmente a ligação a M15 ou M16, mas mMAbC não perdeu ou possui ligação reduzida a M6, M7 ou M8, nem a M9, M10 ou M11 (nem a nenhum outro mutante). O mutante 8 contém substituições de aminoácidos nos resíduos R63, A66, N67, T68, D69, Q70 e D71 (referência a Siglec-9), o que indica que um ou mais, ou todos os resíduos do mutante são importantes para o epítopo desses anticorpos.

MAbC, quando em formato Fab', perdeu ligação ao mutante 16 (que possui substituições de aminoácidos nos resíduos K131 e H136) e apresentou redução da ligação ao mutante 14 (que possui substituições de aminoácidos nos resíduos R120, W128 e N129) e mutante 15 (que possui substituições de aminoácidos nos resíduos H133, R134, R116 e S27), o que indica que um ou mais, ou todos os resíduos desses mutantes são importantes para o epítopo do anticorpo.

Os resíduos que sofreram mutação em M8 são exibidos na Figura 14A.

Os resíduos que sofreram mutação em M8, M14, M15 e M16 são exibidos na Figura 14B.

O anticorpo liga-se, portanto, a resíduos na região de contato de ácido siálico, incluindo no domínio de circuito C-C' que define a especificidade de ácido siálico de Siglecs.

TABELA 4

[| | [mn |ma | ms | ms | me | nm | me | mo mio MI ma mis ms] ; |

| Fio) | + ND nD]NnD|ND|+ | + no nojno|

| Feb) | + | nDjND | NnDjND| + | + | nojlnojno| :

| Ftab) [ND no | nono no]. MEM No no]

| Feb) | + |nDjND|no| ESINIINEISSENES

|

| Fab) [ND] + ND] + ++ MENo no no | no | wo | [F Janticorpo| + [+ [+ [+ [+ [+ |+|

[sn re 36 Tous Te [o [vs Tvs Toro [was [was ]os [owns] [| | Fab [ND] + nDj+ |+|)

[00393] Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patente e patentes, mencionadas no presente são incorporadas ao presente por meio de referência integral e até o mesmo ponto como se cada referência fosse específica e individualmente indicada como incorporada por referência e descrita integralmente no presente (até a extensão máxima permitida por lei), independentemente de qualquer incorporação fornecida separadamente de documentos específicos realizada em outros pontos do presente.

[00394] O uso dos termos “um”, “uma”, “o/a” e referências similares no contexto de descrição da presente invenção deve ser interpretado como cobrindo singular e plural, a menos que indicado em contrário no presente ou em clara contradição pelo contexto.

[00395] A menos que indicado em contrário, todos os valores exatos fornecidos no presente são representativos de valores aproximados correspondentes (por exemplo, todos os exemplos de valores exatos fornecidos com relação a um fator ou medição específica podem ser considerados como também fornecendo medição aproximada correspondente, modificada por “cerca de”, quando apropriado).

[00396] A descrição no presente de qualquer aspecto ou realização do presente, utilizando expressões como “que compreende”, “que possui”, “que inclui” ou “que contém”, com referência a um ou mais elementos, destina-se a fornecer apoio para um aspecto ou realização similar da presente invenção que “consiste de”, “consiste essencialmente de” ou “compreende substancialmente” aquele(s) elemento(s) específico(s), a menos que indicado em contrário ou em clara contradição pelo contexto (por exemplo, uma composição descrita no presente como compreendendo um elemento específico deverá ser compreendida como também descrevendo uma composição que consiste daquele elemento, a menos que indicado em contrário ou em clara contradição pelo contexto).

[00397] O uso de todo e qualquer exemplo ou expressão de exemplo (por exemplo, “tal como”) fornecido no presente destina-se meramente a melhor ilustrar a presente invenção e não impõe limitação sobre o escopo da presente invenção, a menos que reivindicado em contrário. Nenhuma expressão do presente relatório descritivo deverá ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da presente invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES 1 ANTICORPO que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano e é capaz de neutralizar a atividade inibidora de um polipeptídeo Siglec-9 expresso por uma célula NK humana, em que o anticorpo é caracterizado por ligação reduzida, como fragmento de Fab', a um polipeptídeo Siglec-9 que contém mutação nos resíduos K131 e H132 e a um polipeptídeo Siglec-9 que contém mutação nos resíduos R120, W128 e N129; em comparação com a ligação a um polipeptídeo Siglec-9 do tipo selvagem de SEQ ID Nº 2, em que resíduos de aminoácidos são indicados com referência ao polipeptídeo Siglec-9 de SEQ ID Nº 2.
2. ANTICORPO de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo é caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende CDR1, 2 e 3 do domínio VH que possui a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº 15 e FR1, 2 e 3 de um segmento genético IGHV1-69 humano (ou, opcionalmente, IGHV1-46) e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende CDR1, 2 e 3 do domínio VL que possui a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº 16 e FR1, 2 e 3 de um segmento genético IGKV1-33 humano.
3. ANTICORPO de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, em que o anticorpo é caracterizado por compreender VH que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de mMAbA HO, H1, H2 ou H3 exibida em SEQ ID Nº 170, 171, 172 e 173, respectivamente, e VL que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de MAbDA LO, L1 ou L2 exibida em SEQ ID Nº 174, 175 e 176, respectivamente.
4. ANTICORPO de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo é caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende CDR1, 2 e 3 do domínio VH que possui a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº 17 e FR1, 2 e 3 de um segmento genético IGHV169 humano (ou, opcionalmente, IGHV1-46) e um domínio variável de cadeia leve (VL) que compreende CDR1, 2 e 3 do domínio VL que possui a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº 18 e FR1, 2 e 3 de um segmento genético IGKV1-33 humano.
5. ANTICORPO de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 4, em que o anticorpo é caracterizado por compreender VH que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbB Ho, H1, H2, H3, H4 ou H5 exibida em SEQ ID Nº 177, 178, 179, 180, 181 e 182, respectivamente, e VL que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbLB LO, L1 ou L2 exibida em SEQ ID Nº 183, 184 e 185, respectivamente.
6. ANTICORPO que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano e é capaz de neutralizar a atividade inibidora de um polipeptídeo Siglec-9 expresso por uma célula NK humana, em que o anticorpo é caracterizado pela ligação reduzida, como fragmento de Fab', a: polipeptídeo Siglec-9 que possui mutação nos resíduos P55, H58, E122, G124, S125 e K127; polipeptídeo Siglec-9 que possui mutação nos resíduos N78, P79, A80, R81, A82 e V83; polipeptídeo Siglec-9 que possui mutação nos resíduos N77, D96, H98 e T99; e polipeptídeo Siglec-9 que possui mutação nos resíduos W84, E85, E86 e R88; em comparação com ligação a um polipeptídeo Siglec-9 do tipo selvagem de SEQ ID Nº 2, em que resíduos de aminoácidos são indicados com referência ao polipeptídeo Siglec-9 de SEQ ID Nº 2.
7. ANTICORPO que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano e é capaz de neutralizar a atividade inibidora de um polipeptídeo Siglec-9 expresso por uma célula NK humana, em que o anticorpo é caracterizado pela ligação reduzida, como fragmento de Fab', a: polipeptídeo Siglec-9 que possui mutação nos resíduos R63, AG6, N67, T68, D69, Q70 e D71; polipeptídeo Siglec-9 que possui mutação nos resíduos N78, P79, A8O, R81, A82 e V83; polipeptídeo Siglec-9 que possui mutação nos resíduos N77, D96, H98 e T99; e polipeptídeo Siglec-9 que possui mutação nos resíduos W84, E85, E86 e R88; em comparação com ligação a um polipeptídeo Siglec-9 do tipo selvagem de SEQ ID Nº 2, em que resíduos de aminoácidos são indicados com referência ao polipeptídeo Siglec-9 de SEQ ID Nº 2.
8. ANTICORPO que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano e é capaz de neutralizar a atividade inibidora de um polipeptídeo Siglec-9 expresso por uma célula NK humana, em que o anticorpo é caracterizado por ligação reduzida, como fragmento de Fab, a um polipeptídeo Siglec-9 que contém mutação nos resíduos S47, H48, G49, W50, 151, Y52, PBS3 e GSM e a um polipeptídeo Siglec-9 que contém mutação nos resíduos P55, H58, E122, G124, S125 e K127; em comparação com a ligação a um polipeptídeo Siglec-9 do tipo selvagem de SEQ ID Nº 2, em que resíduos de aminoácidos são indicados com referência ao polipeptídeo Siglec-9 de SEQ ID Nº 2.
9. ANTICORPO de acordo com a reivindicação 8, em que o anticorpo é caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende CDR1, 2 e 3 do domínio VH que possui a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº 21 e FR1, 2 e 3 de um segmento genético IGHV7-4-1 humano (opcionalmente, em combinação com um segmento genético IGHJ6) e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende CDR1, 2 e 3 do domínio VL que possui a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº 22 e FR1, 2 e 3 de um segmento genético IGKV1-39 humano.
10. — ANTICORPO de acordo com a reivindicação 9, em que o anticorpo é caracterizado por compreender VH que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de MALD Ho, H1 ou H2 exibida em SEQ ID Nº 186, 187 e 188, respectivamente, e VL que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbD LO, L1 ou L2 exibida em SEQ ID Nº 189, 190 e 191, respectivamente.
11. — ANTICORPO que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano e é capaz de neutralizar a atividade inibidora de um polipeptídeo Siglec-9 expresso por uma célula NK humana, em que o anticorpo é caracterizado por ligação reduzida, como fragmento de Fab', a um polipeptídeo Siglec-9 que contém mutação nos resíduos K131 e H132 e a um polipeptídeo Siglec-9 que contém mutação nos resíduos R63, AG6, N67, T68, D69, Q70 e D71; em comparação com a ligação a um polipeptídeo Siglec-9 do tipo selvagem de SEQ ID Nº 2, em que resíduos de aminoácidos são indicados com referência ao polipeptídeo Siglec-9 de SEQ ID Nº 2.
12. — ANTICORPO de acordo com a reivindicação 11, em que o anticorpo é adicionalmente caracterizado por ligação reduzida, como fragmento de F(ab), a um polipeptídeo Siglec-9 que possui mutação nos resíduos S27, R116, H133 e R134; em comparação com ligação a um polipeptídeo Siglec-9 do tipo selvagem de SEQ ID Nº 2, em que resíduos de aminoácidos são indicados com referência ao polipeptídeo Siglec-9 de SEQ ID Nº 2.
13. — ANTICORPO de acordo com qualquer das reivindicações 11 ou 12, em que o anticorpo é adicionalmente caracterizado por ligação reduzida, como fragmento de Fab, a um polipeptídeo Siglec-9 que possui mutação nos resíduos R120, W128 e N129; em comparação com ligação a um polipeptídeo Siglec-9 do tipo selvagem de SEQ ID Nº 2, em que resíduos de aminoácidos são indicados com referência ao polipeptídeo Siglec-9 de SEQ ID Nº 2.
14. — ANTICORPO de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 13, em que o anticorpo é caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende CDR1, 2 e 3 do domínio VH que possui a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº 196 FR1,2e3 de um segmento genético IGHV7-4-1 humano e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende CDR1, 2 e 3 do domínio VL que possui a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº 20 e FR1, 2 e 3 de um segmento genético IGKV7-3 humano.
15. — ANTICORPO de acordo com qualquer das reivindicações a 14, em que o anticorpo é caracterizado por compreender VH que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer um dos domínios variáveis de MALbC HO, H1, H2 ou H3 exibida em SEQ ID Nº 192, 193, 194 e 195, respectivamente, e VL que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbC LO ou L1 exibida em SEQ ID Nº 196 e 197, respectivamente.
16. “AGENTE que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano e é capaz de neutralizar a atividade inibidora de um polipeptídeo Siglec-9 expresso por uma célula NK humana, em que o agente é caracterizado por compreender um domínio de ligação de antígenos que compreende uma combinação de região variável de cadeia pesada (VH) e região variável de cadeia leve (VL) selecionada a partir do grupo que consiste de: - VH que compreende CDR1, 2 e 3 do domínio VH que contém a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº 15e FR1, 2e 3 de um segmento genético IGHV1-69 humano (ou, opcionalmente, IGHV1-46) e VL que compreende CDR1, 2 e 3 do domínio VL que contém a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº 16 e FR1, 2 e 3 de um segmento genético IGKV1-33 humano; - VH que compreende CDR1, 2 e 3 do domínio VH que contém a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº 17 e FR1, 2e€ 3 de um segmento genético IGHV1-69 humano (ou, opcionalmente, IGHV1-46) e VL que compreende CDR1, 2 e 3 do domínio VL que contém a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº 18 e FR1, 2 e 3 de um segmento genético IGKV1-33 humano; - VH que compreende CDR1, 2 e 3 do domínio VH que contém a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº 19 e FR1, 2 e 3 de um segmento genético IGHV7-4-1 humano e VL que compreende CDR1,2e3 do domínio VL que contém a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº e FR1, 2 e 3 de um segmento genético IGKV7-3 humano; e - VH que compreende CDR1, 2 e 3 do domínio VH que contém a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº 21 e FR1, 2€ 3 de um segmento genético IGHV7-4-1 humano (opcionalmente, em combinação com segmento genético IGHJ6) e VL que compreende CDR1, 2 e 3 do domínio VL que contém a sequência de aminoácidos exibida em SEQ ID Nº 22 e FR1,2 e 3 de um segmento genético IGKV1-39 humano.
17. “AGENTE que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano e é capaz de neutralizar a atividade inibidora de um polipeptídeo Siglec-9 expresso por uma célula NK humana, em que o agente é caracterizado por compreender um domínio de ligação de antígenos que compreende um VH que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de MALA HO, H1, H2 ou H3 exibida em SEQ ID Nº 170, 171, 172 e 173, respectivamente, e VL que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%,

90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de MALA LO, L1 ou L2 exibida em SEQ ID Nº 174, 175 e 176, respectivamente.
18. — AGENTE que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano e é capaz de neutralizar a atividade inibidora de um polipeptídeo Siglec-9 expresso por uma célula NK humana, em que o agente é caracterizado por compreender um domínio de ligação de antígenos que compreende um VH que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de mMADB HO, H1, H2, H3, H4 ou H5 exibida em SEQ ID Nº 177, 178, 179, 180, 181 e 182, respectivamente, e VL que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbDB LO, L1 ou L2 exibida em SEQ ID Nº 183, 184 e 185, respectivamente.
19. . AGENTE que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano e é capaz de neutralizar a atividade inibidora de um polipeptídeo Siglec-9 expresso por uma célula NK humana, em que o agente é caracterizado por compreender um domínio de ligação de antígenos que compreende um VH que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbC HO, H1, H2 ou H3 exibida em SEQ ID Nº 192, 193, 194 e 195, respectivamente, e VL que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de MAbC LO ou L1 exibida em SEQ ID Nº 196 e 197, respectivamente.
20. “AGENTE que liga um polipeptídeo Siglec-9 humano e é capaz de neutralizar a atividade inibidora de um polipeptídeo Siglec-9 expresso por uma célula NK humana, em que o agente é caracterizado por compreender um domínio de ligação de antígenos que compreende um VH que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de mAbD HO, H1 ou H2 exibida em SEQ ID Nº 186, 187 e 188, respectivamente, e VL que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% (ou 100%) idêntica à sequência de aminoácidos do domínio variável de mMAbD LO, L1 ou L2 exibida em SEQ ID Nº 189, 190 e 191, respectivamente.
21. AGENTE ou anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o agente ou anticorpo é caracterizado por ser um anticorpo humano ou humanizado.
22. AGENTE ou anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o agente ou anticorpo é caracterizado por ser um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo capaz de ligação bivalente a polipeptídeos Siglec-9.
23. AGENTE ou anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o agente ou anticorpo é caracterizado por aumentar e/ou restaurar a citotoxicidade de células NK em um teste de citotoxicidade de liberação de S'CR in vitro por quatro horas padrão no qual as células NK que expressam Siglec-9 são purificadas a partir de doadores humanos e incubadas com células alvo que expressam um ligante de ácido siálico de Siglec-9.
24. AGENTE ou anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o anticorpo é caracterizado por ser capaz de neutralizar a atividade inibidora de polipeptídeo Siglec-9 expresso por moDC humano que possui, na sua superfície, polipeptídeos Siglec-9 que são dedicados a interações cis com ácidos siálicos.
25. AGENTE ou anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o anticorpo é caracterizado por não possuir a capacidade de ligar-se ao receptor de Fcy humano CD16.
26. AGENTE ou anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o anticorpo é caracterizado por não possuir a capacidade de ligar-se a CD16A, CD16B, CD32A, CD32B e CD64 humano.
27. AGENTE ou anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o anticorpo é caracterizado por não bloquear substancialmente a interação entre um polipeptídeo Siglec-9 humano e um de seus ligantes de ácido siálico.
28. AGENTE ou anticorpo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo ligante ácido siálico compreender Neu5Aca2-3Galb1- 4GIcNAcb.
29. AGENTE ou anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 28, em que o anticorpo é caracterizado por bloquear substancialmente a interação entre um polipeptídeo Siglec-9 humano e um de seus ligantes de ácido siálico.
30. — AGENTE ou anticorpo de acordo com a reivindicação 29, em que o anticorpo (a) é caracterizado por bloquear substancialmente a interação entre um polipeptídeo Siglec-9 humano e Neu5Aca2-3Galb1- 4GICNAcb e (b) bloqueia substancialmente a interação entre um polipeptídeo Siglec-9 humano e 6'-sialil-lactose.
31. AGENTE ou anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o anticorpo ou agente é caracterizado por causar aumento da citotoxicidade e/ou em um marcador associado à citotoxicidade em uma célula NK que expressa Siglec purificada a partir de um doador humano, quando a célula NK é colocada em contato com uma célula humana alvo que possui ligante do Siglec sobre a superfície de células alvo.
32. AGENTE ou anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o anticorpo ou agente é caracterizado por ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui mutação no resíduo

K131 e/ou H132, em comparação com ligação a um polipeptídeo Siglec-9 do tipo selvagem de SEQ ID Nº 2, em que resíduos de aminoácidos são indicados com referência ao polipeptídeo Siglec-9 de SEQ ID Nº 2.
33. —Anticorpo ou agente de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o anticorpo ou agente é caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve e pesada de qualquer um dentre: mAbA HOLO, mALDA HOL1, MALA HOL2, mALDA H1LO, mALA H1L1, MAbA H1L2, mAbA H2L0, mALA H2L1, MALA H2L2, mAbA H3LO, MALA H3L1 ou mAbA H3L2.
34. — ANTICORPO ou agente de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 32, em que o anticorpo ou agente é caracterizado por compreender uma combinação de região variável de cadeia leve e pesada de qualquer um dentre: mAbB HOLO, mAbB HOL1, mAbB HOL2, mALB H1LO, mMAbB H1L1, mALB H1L2, mAbB H2L0, mAbB H2L1, mALbB H2L2, mAbB H3LO, mAbB H3L1, mALB H3L2, mAbB H4LO, mMALB H4L1, mAbB H4L2, mAbLB H5LO, mMAbB H5L1 ou mAbLB H5L2.
35. — ANTICORPO ou agente de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 32, em que o anticorpo ou agente é caracterizado por ligação reduzida a um polipeptídeo Siglec-9 que possui mutação no resíduo S47, H48, G49, W50, 151, Y52, P53 e/ou G54, em comparação com ligação a um polipeptídeo Siglec-9 do tipo selvagem de SEQ ID Nº 2, em que resíduos de aminoácidos são indicados com referência ao polipeptídeo Siglec-9 de SEQ ID Nº 2.
36. — ANTICORPO ou agente de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 32 ou 35, em que o anticorpo ou agente é caracterizado por compreender uma região variável de cadeia leve e pesada de qualquer um dentre mAbD HOLO, mAbD HOL1, mAbD HOL2, mAbD H1LO, mAbD H1L1, mMAbD H1L2, mAbD H2L0, mAbD H2L1 ou mAbD H2L2.
37. — ANTICORPO ou agente de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o anticorpo ou agente é caracterizado por ser um anticorpo que possui domínio Fc que é modificado para reduzir a ligação entre o domínio Fc e um receptor de Fcy.
38. — ANTICORPO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 36, em que o mencionado anticorpo ou agente é caracterizado por ser um fragmento de anticorpo, opcionalmente um fragmento selecionado a partir de Fab, Fab, Fab-SH, F(ab')2, Fv, diacorpo, fragmento de anticorpo de fita simples ou anticorpo multiespecífico que compreende diversos fragmentos de anticorpos diferentes.
39. — ANTICORPO ou agente de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o mencionado anticorpo é caracterizado por ser conjugado ou ligado covalentemente a uma porção detectável.
40. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada por compreender um anticorpo ou agente conforme definido em qualquer das reivindicações anteriores e um veículo farmaceuticamente aceitável.
41. KIT caracterizado por compreender o anticorpo ou agente conforme definido em qualquer das reivindicações anteriores, que compreende ainda opcionalmente um anticorpo secundário marcado que reconhece especificamente o anticorpo conforme definido em qualquer das reivindicações anteriores.
42. — ÁCIDO NUCLEICO caracterizado por codificar cadeia leve e/ou pesada de um domínio de ligação de antígeno ou anticorpo conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 39.
43. “CÉLULA HOSPEDEIRA recombinante caracterizada por produzir o domínio de ligação de antígeno ou anticorpo conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 39.
44. MÉTODO DE TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE

DOENÇAS em pacientes dele necessitados, em que o método é caracterizado por compreender a administração ao mencionado paciente de quantidade eficaz de um anticorpo conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 38 ou composição conforme definido na reivindicação 40.
45. — MÉTODO de acordo com a reivindicação 44, em que a mencionada doença é câncer, opcionalmente câncer que é caracterizado pela expressão de enzimas ST3GAL1 e/ou ST3GALG6.
46. MÉTODO DE MODULAÇÃO DE CÉLULAS NK CD56*%m e/ou células NK CD56trihante e/ou células T CD8+ em pacientes, em que o método é caracterizado por compreender a administração ao mencionado paciente de quantidade eficaz de um anticorpo conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 38 ou composição conforme definido na reivindicação

40.
47. MÉTODO IN VITRO DE MODULAÇÃO da atividade de células derivadas de monócitos e/ou linfócitos, opcionalmente células NK CD56*"”, células NK CD56trihante e/ou células T CD8+, em que o método é caracterizado por compreender a colocação de células derivadas de onócitos e/ou linfócitos que expressam Siglec-7 e/ou Siglec-9 em contato com um anticorpo conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 38 ou uma composição conforme definido na reivindicação 40.
48. MÉTODO IN VITRO DE DETERMINAÇÃO da atividade de células NK de pacientes portadores de doenças, em que o método é caracterizado por compreender a obtenção de amostras biológicas de pacientes que compreendem células NK, colocação das mencionadas células em contato com um anticorpo conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 39 e determinação se o anticorpo modula a atividade das células NK.
49. MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE LINFÓCITOS,

opcionalmente células NK CD56*", células NK CD56hrihante e/ou células T CD8+, em que o método é caracterizado por compreender a obtenção de amostras biológicas de pacientes que compreendem células, colocação das mencionadas células em contato com um anticorpo conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 23 e determinação se o anticorpo se liga às células.
50. — MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 47 a 49, caracterizado pela célula que estão presentes em uma amostra biológica obtida de paciente portador de doença, opcionalmente câncer.
51. MÉTODO DE SELEÇÃO DE PACIENTES portadores de câncer que reagem a tratamento com um anticorpo ou agente conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 38 ou composição conforme definido na reivindicação 40, em que o método é caracterizado por compreender a determinação se células de câncer no mencionado paciente expressam um ligante de Siglec-7 ou Siglec-9, opcionalmente em que células de câncer expressam níveis elevados de um ligante Siglec-7 ou Siglec-9, a expressão de ligante(s) de ácido siálico de Siglec-7 ou Siglec-9 ou níveis elevados de ligante(s) de ácido siálico de Siglec-7 ou Siglec-9, que indicam paciente reagente.
52. — MÉTODO de seleção de pacientes portadores de câncer que reagem a tratamento com um anticorpo ou agente conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 38 ou composição conforme definido na reivindicação 40, em que o método é caracterizado por compreender a determinação se células de câncer no mencionado paciente expressam enzimas ST3GAL1 e/ou ST3GAL6 (ou a atividade enzimática de ST3GAL1 e/ou ST3GAL6), a expressão de enzimas ST3GAL1 e/ou ST3GAL6 ou níveis elevados de enzimas ST3GAL1 e/ou ST3GALG6 (ou atividade enzimática de ST3GAL1 e/ou ST3GAL6), que indicam paciente reagente.
53. — MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 50 a 52, caracterizado por compreender adicionalmente a administração a pacientes reagentes de anticorpos conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 38 ou de uma composição conforme definido na reivindicação 40.