KR20120128151A - Cd20에 대한 인간 모노클로날 항체 - Google Patents
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Abstract
인간 CD20에 결합하고 이를 억제하는 단리된 인간 모노클로날 항체, 및 관련 항체-기재 조성물 및 분자가 개시된다. 인간 항체는 트랜스펙토마 또는 비인간 트랜스제닉 동물, 예를 들어 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환을 거침으로써 다양한 이소타입의 인간 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 트랜스제닉 마우스에 의해 생산될 수 있다. 또한, 인간 항체를 포함하는 제약 조성물, 인간 항체를 생산하는 비인간 트랜스제닉 동물 및 하이브리도마, 및 인간 항체를 사용하는 치료 및 진단 방법이 개시된다.
Description
본 출원은 "CD20에 대한 인간 모노클로날 항체"라는 제목하에 2002년 10월 17일에 출원된 미국 임시 특허출원 제60/419163호, 및 2003년 4월 2일에 출원된 미국 임시 특허출원 제60/460028호에 대해 우선권을 주장하고, 이들은 모두 전체로서 본원에 참고자료로 삽입된다.
CD20 분자 (인간 B-림프구-한정 분화 항원 또는 Bp35라고도 불림)는 전-B (pre-B) 및 성숙 B 림프구 상에 위치하는, 약 35 kD 분자량을 갖는 소수성 막횡단 단백질이다 (Valentine et al . (1989) J. Biol . Chem . 264(19):11282-11287; 및 Einfield et al . (1988) EMBO J 7(3):711-717). CD20은 말초 혈액 또는 림프 기관의 B 세포 중 90% 이상의 표면 상에서 발견되고, 전-B (pre-B) 세포 초기 발달 동안 발현되며 혈장 세포 분화까지 지속된다. CD20은 정상 B 세포 뿐만 아니라 악성 B 세포 상에도 존재한다. 특히, CD20은 90% 이상의 비호지킨 림프종 (NHL) B 세포 상에서 발현되지만 (Anderson et al . (1984) Blood 63(6):1424-1433), 조혈 줄기 세포, 전구-B (pro-B) 세포, 정상 혈장 세포, 또는 기타 정상 조직 상에서는 발견되지 않는다 (Tedder et al . (1985) J. Immunol . 135(2):973-979).
CD20 단백질의 85 아미노산 카르복실-말단 영역은 세포질 내에 위치하고 있다. 이 영역의 길이는 각각 3, 3, 28, 15 및 16 아미노산의 상대적으로 짧은 세포내 영역을 갖고 있는 다른 B 세포-특이적 표면 구조, 예를 들어 IgM, IgD 및 IgG 중쇄, 또는 조직적합 항원 클래스 IIα 또는 β 사슬의 길이와 대조를 이룬다 (Komaromy et al . (1983) NAR 11:6775-6785). 마지막 61 카르복실-말단 아미노산 중 21개는 산성 잔기인 반면 단 2개만 염기성이어서, 이 영역이 강한 알짜 음성 전하를 가짐을 암시하고 있다. GenBank 등록번호는 NP_690605이다.
CD20은 B 세포의 활성화 및 분화 과정에서 초기 단계(들)의 조절에 관련될 수 있고 (Tedder et al . (1986) Eur . J. Immunol . 16:881-887), 칼슘 이온 채널로서 기능할 수 있는 것으로 생각된다 (Tedder et al . (1990) J. Cell . Biochem . 14D:195).
B 세포의 증식 및(또는) 분화를 촉진하는데 있어서 실제 CD20의 기능에 대해서는 명확하지 않지만, 암 및 자가면역 질환과 관련된 B 세포를 조절하거나 죽이는 항체 매개 치료에 대해 중요한 표적을 제공한다. 특히 종양 세포, 예를 들어 NHL 상에서 CD20의 발현은 구체적으로 표적 CD20-양성 신생물성 세포에 대한 치료제를 목적으로 하는 항체 매개 치료에 대한 중요한 표적이 된다. 현재까지 얻은 결과들로서 CD20이 면역 요법에 대한 유용한 표적으로서 확립되었지만, 이는 또한 현재 입수할 수 있는 쥐 및 키메릭 항체가 이상적인 치료제가 아니라는 것도 보여주고 있다.
따라서, CD20을 발현하는 세포와 관련된 일련의 질병을 예방 및(또는) 치료하는데 효과적인, CD20에 대한 개선된 치료용 항체가 필요하다.
본 발명은 CD20을 발현하는 세포와 관련된 일련의 질병을 예방 및(또는) 치료하는데 효과적인, CD20에 대한 개선된 치료용 항체를 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 종양-관련 질병, 및 자가면역 질환을 비롯한 면역 질환을 포함하는, CD20을 발현하는 세포와 관련된 질병을 치료 및(또는) 예방하기 위한 개선된 항체 치료제를 제공한다. 본 발명에 포함되는 항체는 완전한 인간 항체이므로, 환자에게 잠재적으로 면역원성일 가능성이 낮다는 점에서 개선된 것이다.
본원에 예시된 본 발명의 인간 항체는 다양한 메커니즘으로 CD20을 발현하는 B 세포의 사멸을 매개한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 만성 B-림프구성 백혈병 (B-CLL) 세포와 같은 세포에서 보체 의존성 세포독성 (CDC), 예를 들면 약 20% 이상의 CDC 매개 용해, 바람직하게는 약 30% 이상의 CDC 매개 용해, 보다 바람직하게는 40-50% 이상의 CDC 매개 용해를 유도한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 CD20을 발현하는 세포의 아폽토시스를 유도한다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 CD20을 발현하는 세포의 호모타입 부착을 유도한다. 또한, 본 발명의 인간 항체는 인간 이펙터 세포 (예를 들어 단핵구, 단핵 세포, NK 세포 및 PMN)의 존재하에 CD20을 발현하는 세포의 항체 의존성 세포매개 세포독성 (ADCC)을 유도할 수 있다. 또한, 본 발명의 인간 항체는 마크로파지의 존재하에 CD20을 발현하는 세포의 식세포작용 (phagocytosis)을 유도할 수 있다. 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 상기 메커니즘 중 하나 이상에 의해 작용할 수 있다. 본 발명의 인간 항체가 사멸시킬 수 있는 세포는, 예를 들어 CD20을 발현하는 B 세포, 예컨대 종양성 B 세포 및 면역 질환과 관련된 B 세포를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 특정 실시태양에서, 인간 항체는 림프종, 예를 들어 B 세포 비호지킨 림프종의 치료시 B 림프구 사멸을 매개하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 인간 항체는 IgG1 (예를 들어, IgG1,κ), IgG3 (예를 들어, IgG3,κ) 및 IgG4 (예를 들어, IgG4,κ) 항체를 포함한다. 그러나, IgG2, IgM, IgA1, IgA2, 분비성 IgA, IgD 및 IgE를 포함하는 기타 항체 이소타입 (isotype) 또한 본 발명에 포함된다. 항체는 전체 항체, 또는 예를 들어 Fab, F(ab')2, Fv, 단일 사슬 Fv 단편 또는 이중특이적 항체를 포함하는 그의 항원-결합 단편일 수 있다. 또한, 항원-결합 단편은 (i) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합된 결합 도메인 폴리펩티드 (예를 들어, 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역), (ii) 힌지 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역, 및 (iii) CH2 불변 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역을 포함하는 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질을 포함한다. 상기 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질은 US 2003/0118592 및 US 2003/0133939에 추가로 개시되어 있다.
본 발명의 특정 인간 항체는 가변 영역에 서열 번호 1, 5 또는 9, 및 서열 번호 3, 7 또는 11 각각의 뉴클레오티드 서열, 및 그의 보존적 서열 변형체를 포함하는 인간 중쇄 및 인간 카파 경쇄 핵산에 의해 코딩되는, 11B8, 2F2 및 7D8로 지칭되는 것들을 포함한다. 다른 실시태양에서, 인간 항체는 서열 번호 2, 6 또는 10, 및 서열 번호 4, 8 또는 12 각각의 아미노산 서열, 및 그의 보존적 서열 변형체를 포함하는 인간 중쇄 및 인간 카파 경쇄 가변 영역을 갖는 것을 특징으로 한다.
또 다른 실시태양에서, 인간 항체는 각각 서열 번호 2 및 서열 번호 4; 각각 서열 번호 6 및 서열 번호 8; 또는 각각 서열 번호 10 및 서열 번호 12의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성, 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 인간 중쇄 및 인간 카파 경쇄 가변 영역을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 특정 인간 항체는 인간 중쇄 및 경쇄 CDR1 영역, 인간 중쇄 및 경쇄 CDR2 영역, 및 인간 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역을 갖는 CDR 도메인을 포함하는 항체를 포함하고, 여기서
(a) CDR1, CDR2 및 CDR3 인간 중쇄 영역은 도 53, 55 또는 57 (서열 번호 13-15, 19-21 및 25-27)에 나타낸 아미노산 서열 CDR1, CDR2 및 CDR3로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 및 그의 보존적 서열 변형체를 포함하고,
(b) CDR1, CDR2 및 CDR3 인간 경쇄 영역은 도 53, 55 또는 57 (서열 번호 16-18, 22-24 및 28-30)에 나타낸 아미노산 서열 CDR1, CDR2 및 CDR3로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 그의 보존적 서열 변형체를 포함한다.
약 1-10 nM 이하의 해리 평형 상수 (KD)로 CD20으로부터 해리되는 항체도 본 발명에 포함된다. 상기 항체는 또한, 관련된 세포-표면 항원과 교차-반응하지 않아서 그 기능을 억제하지 않는 것들을 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항-CD20 항체는 이하의 성질 중 하나 이상으로 특징화될 수 있다:
a) 인간 CD20에 대한 특이성;
b) 본원 실시예 5 (도 9)에 개시된 결합 실험으로 측정했을 때, 약 10 nM 이하, 바람직하게는 약 5 nM 이하, 보다 바람직하게는 약 1-3 nM 이하의 CD20에 대한 결합 친화도 (KD);
c) 본원 실시예 5 (도 9)에 개시된 해리 속도 실험으로 측정했을 때, 약 10-4 sec-1 이하, 바람직하게는 약 10-5 sec-1 이하, 보다 바람직하게는 약 10-6 sec-1 이하의 CD20으로부터의 해리 속도 상수 (kd);
d) CD55/59 음성 또는 CD55/59 양성 세포 상에서 높은 수준의 CDC를 매개하는 능력;
e) CD20에 대한 결합으로 지질 래프트 (raft) 내로 이동하는 능력;
f) CD20를 발현하는 세포의 성장을 억제하는 능력;
g) CD20을 발현하는 세포의 아폽토시스를 유도하는 능력;
h) CD20을 발현하는 세포의 호모타입 부착을 유도하는 능력;
i) 이펙터 세포의 존재하에 CD20을 발현하는 세포의 ADCC를 유도하는 능력;
j) CD20을 발현하는 종양 세포를 갖는 대상의 생존을 연장시키는 능력;
k) CD20을 발현하는 세포를 고갈시키는 능력; 및(또는)
1) 낮은 수준의 CD20을 발현하는 세포 (CD20low 세포)를 고갈시키는 능력.
본 발명의 인간 항-CD20 항체는 유도체화되거나 기타 결합 특이적 부위에 연결되거나, 혹은 그와 함께 발현될 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명은 CD20에 대한 제1 결합 특이적 부위를 하나 이상 (예를 들어, 인간 항-CD20 항체 또는 그의 모방체), 및 인간 이펙터 세포에 대한 제2 결합 특이적 부위, 예를 들어 Fc 수용체 (예를 들어, 인간 Fcγ 수용체, 예컨대 FcγRI, 또는 인간 Fcα 수용체) 또는 T 세포 수용체, 예를 들어 CD3에 대한 결합 특이적 부위를 포함하는 이중특이적 (bispecific) 또는 다중특이적 (multispecific) 분자를 제공한다.
따라서, 본 발명은 인간 CD20과 Fc 수용체 또는 T 세포 수용체, 예를 들어 CD3에 모두 결합하는 이중특이적 및 다중 특이적 분자를 포함한다. Fc 수용체는 예를 들어 인간 IgG 수용체, 예를 들면 Fc-감마 수용체 (FcγR), 예를 들어 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)이다. 기타 Fc 수용체, 예를 들어 인간 IgA 수용체 (예를 들어, FcαRI)도 표적화될 수 있다. Fc 수용체는 바람직하게는 이펙터 세포, 예를 들어 단핵구, 마크로파지, 또는 활성화된 단핵 세포의 표면 상에 위치한다. 바람직한 실시태양에서, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 수용체의 면역글로불린 Fc (예를 들어, IgG 또는 IgA) 결합 부위와 구별되는 부위에서 Fc 수용체에 결합한다. 따라서, 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자의 결합은 면역글로불린의 생리학적 농도에 의해 방해받지 않는다.
또 다른 면에서, 본 발명의 인간 항-CD20 항체는 유도체화하거나, 다른 기능성 분자, 예를 들어 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, Fab' 단편)에 연결시키거나 이와 함께 발현된다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 하나 이상의 다른 분자 구성물질, 예를 들어 다른 항체에 (예를 들어, 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 제조하기 위해), 세포독소, 세포 리간드 또는 항원에 (예를 들어, 면역독소와 같은 면역콘쥬게이트를 제조하기 위해) 기능적으로 연결될 수 있다 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유결합 또는 다른 방식으로). 본 발명의 항체는 기타 치료적 잔기, 예를 들면 방사성 동위원소, 소분자 항암제, 항염증제 또는 면역억제제에 연결될 수 있다. 따라서, 본 발명은 매우 다양한 항체 콘쥬게이트, 이중특이적 및 다중특이적 분자, 및 융합 단백질을 포함하고, 이들은 모두 CD20 발현 세포에 결합하며 다른 분자들을 이러한 세포에 표적화하는데 사용될 수 있다.
또 다른 면에서, 본 발명은 본 발명의 인간 모노클로날 항체 중 하나 또는 그의 조합과 함게 제제화된 제약학상 허용되는 담체를 포함하는 조성물, 예를 들어 제약 및 진단 조성물/키트를 제공한다. 특정 실시태양에서, 조성물은 상이한 에피토프에 결합하거나 상이한 기능적 특징들, 예를 들어 CDC 유도 및 아폽토시스 유도를 갖는 항체의 조합을 포함한다.
본 발명의 인간 항체, 면역콘쥬게이트, 이중특이적 및 다중특이적 분자, 및 조성물은 세포 성장이 억제되고(되거나) 세포가 죽게 되는 유효량의 항체, 면역콘쥬게이트, 이중특이적/다중특이적 분자 또는 조성물과 세포를 접촉시킴으로써, CD20을 발현하는 세포의 성장을 억제하고(하거나) CD20을 발현하는 세포를 죽이기 위한 다양한 방법에 사용될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 이 방법은 이펙터 세포의 존재하에 예를 들어 CDC, 아폽토시스, ADCC, 식세포작용에 의해, 또는 상기 메커니즘 중 둘 이상의 조합에 의해 CD20을 발현하는 세포를 죽이는 것을 포함한다. 세포는 바람직하게는 CD20를 발현하지는 않지만 예를 들어, 구조적으로 관련된 세포-표면 항원을 발현할 수 있는 세포를 죽이거나 세포의 활성을 억제하지 않고 (즉, 관련되지만 기능적으로는 구별되는 세포 표면 항원과의 교차-반응없이) 죽거나 억제된다. 본 발명의 인간 항체를 사용하여 억제하거나 죽일 수 있는 CD20을 발현하는 세포는 예를 들어, 종양성 B 세포를 포함한다.
따라서, 본 발명의 인간 항체는 CD20을 발현하는 세포와 관련된 다양한 질병을 앓고 있는 환자에게 항체를 투여하여 상기 질병을 치료하고(하거나) 예방하는데 사용될 수 있다. 치료 (예를 들어, 개선)하거나 예방할 수 있는 예시적인 질병은 종양성 질병 및 면역 질환, 예를 들어 자가면역 질환을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 치료하고(하거나) 예방할 수 있는 종양성 질병은 예를 들어 B 세포 림프종, 예를 들어 전구체 B 세포 림프아구성 백혈병/림프종 및 성숙 B 세포 종양을 비롯한 NHL, 예를 들어 B 세포 만성 림프구성 백혈병 (CLL)/소림프구성 림프종 (SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 외투 세포 (mantle cell) 림프종 (MCL), 낮은 악성도, 중등-악성도 및 높은-악성도의 FL을 포함하는 여포성 림프종 (FL), 피부 여포 중심 림프종, 변연대 B 세포 림프종 (MALT 타입, 결절 및 비장 타입), 모세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 혈장 세포 골수종, 이식후 림프세포증식성 질환, 왈덴스트룀 (Waldenstroem) 마크로글로불린혈증, 및 퇴행성 대세포 림프종 (ALCL)을 포함한다. CD20을 발현하는 B 세포가 관련되고 치료하고(하거나) 예방할 수 있는 면역 질환은 예를 들어 건선, 건선성 관절염, 피부염, 전신성 경피증 및 경화증, 염증성 장질환 (IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 호흡곤란 증후군, 수막염, 뇌염, 포도막염, 사구체 신염, 습진, 천식, 죽상경화증, 백혈구 부착 결핍증, 다발성 경화증, 레이노 증후군, 쉐그렌 증후군, 청소년 발병 당뇨병, 레이터병, 베체트병, 면역 복합체 신염, IgA 신장병증, IgM 다발성 신경병증, 면역-매개 혈소판 감소증, 예를 들어 급성 특발성 혈소판 감소성 자반병 및 만성 특발성 혈소판 감소성 자반병, 용혈성 빈혈, 중증 근무력증, 루푸스 신염, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염 (RA), 아토피성 피부염, 천포창, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 베게너 육아종증, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 감염성 단핵구증, HIV, 및 허피스 바이러스 관련 질병을 포함한다. 추가적인 예로서 중증 급성 호흡곤란 증후군 및 맥락망막염이 있다. 또한 추가적인 예로서, B-세포의 엡스타인-바 바이러스 (EBV)와 같은 바이러스에 의한 감염으로 야기되는 질병 및 질환이 있다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 항체가 투여되는 대상은 화학치료제, 방사선, 또는 Fc 수용체, 예를 들어 Fcα 수용체 또는 Fcγ 수용체의 발현 또는 활성을 조절, 예를 들어 증강시키거나 억제하는 사이토카인과 같은 약제로 추가적으로 치료된다. 치료 동안 투여하기 위한 통상적인 사이토카인은 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 인터페론-γ (IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 (TNF)를 포함한다. 통상적인 치료제는 특히 항-신생물제, 예를 들어 독소루비신, 시스플라틴, 블레오마이신, 카누스틴, 클로람부실 및 시클로포스파미드를 포함한다.
또 다른 면에서, 본 발명은 샘플 또는 개체에서 CD20의 존재를 시험관내 또는 생체내에서 검출하기 위한 방법, 예를 들어 CD20-관련 질병을 바람직하게는 초기 단계에서 진단하기 위한 방법을 제공한다. 이는 또한, 질병 및 치료의 효과를 모니터링하고, 투여할 항체의 용량을 결정하고 조정하는데 유용할 수 있다. 생체내 방법은 영상화 기술, 예를 들어 PET (양전자 방출 단층촬영술) 또는 SPECT (단일 광자 방출 전산화 단층촬영술)를 사용하여 수행할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 이는 항체와 CD20 간에 복합체를 형성케 하는 조건하에서 시험할 샘플을 임의로 대조군 샘플과 함께 본 발명의 인간 모노클로날 항체과 접촉시켜 수행할 수 있다. 그리고, 복합체 형성을 검출한다 (예를 들어, FACS 분석법 또는 웨스턴 블롯팅을 사용하여). 시험 샘플과 함께 대조군 샘플을 사용할 경우 복합체는 두 샘플 모두에서 검출하고, 복합체 형성에 있어서 샘플 간의 통계학적으로 유의한 임의의 차이가 시험 샘플 내에서 CD20의 존재에 대한 지표가 된다.
또 다른 면에서, 본 발명은 CD20에 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현하는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스를 제공한다. 특정 실시태양에서, 트랜스제닉 비인간 동물은 본 발명의 항체 전체 또는 일부를 코딩하는 인간 중쇄 트랜스진 (transgene) 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 마우스이다. 트랜스제닉 비인간 동물은 CD20 항원의 정제되거나 농축된 조제물 및(또는) CD20을 발현하는 세포로 면역화할 수 있다. 바람직하게는, 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스는 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환 (isotype switching)을 거침으로써, CD20에 대한 다양한 이소타입의 인간 모노클로날 항체 (예를 들어 IgG, IgA 및(또는) IgM)를 생산할 수 있다. 이소타입 전환은 예를 들어, 고전적 또는 비-고전적 이소타입 전환에 의해 일어날 수 있다.
따라서, 또 다른 면에서 본 발명은 인간 항-CD20 항체를 발현하는 상기 기술한 바와 같은 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 단리된 B 세포를 제공한다. 이어서, 단리된 B-세포를 불멸화된 세포에 융합시켜 불멸화하여, 인간 항-CD20 항체의 공급원 (예를 들어, 하이브리도마)를 제공할 수 있다. 상기 하이브리도마 (즉, 인간 항-CD20 항체를 생성하는)도 본 발명의 영역에 포함된다.
본원에 예시된 본 발명의 인간 항체는, 항체를 발현하는 하이브리도마로부터 직접 수득할 수 있거나 숙주 세포 (예를 들어 CHO 세포, NS/0 세포 또는 림프구 세포)에 클로닝되어 재조합적으로 발현될 수 있다. 숙주 세포에 대한 추가의 예로서 미생물, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli), 및 진균류, 예를 들어 효모가 있다. 별법으로, 항체는 트랜스제닉 비-인간 동물 또는 식물 내에서 재조합적으로 제조될 수 있다. 따라서, 다른 면에서 본 발명은 인간 CD20에 결합하는 인간 모노클로날 항체의 제조 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 이 방법은 이미 기술한 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스 (예를 들어, 항-CD20 항체의 전부 또는 일부를 코딩하는 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는)를, 인간 CD20 항원의 정제되거나 농축된 조제물 및(또는) 인간 CD20를 발현하는 세포로 면역화하는 것을 포함한다. 그 다음, 동물의 B 세포 (예를 들어, 비장 B 세포)를 수득하고 골수종 세포와 융합하여, CD20에 대한 인간 모노클로날 항체를 분비하는 불멸의 하이브리도마 세포를 제조한다.
또 다른 면에서, 본 발명은 인간 항-CD20 항체 (예를 들어, 그의 가변 영역)를 코딩하는 핵산 분자, 및 본 발명의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 상기 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산하는 방법도 본 발명에 포함된다. 본 발명에 의해 제공되는 특정 핵산은 각각 인간 항-CD20 항체 2F2, 7D8 및 11B8의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 서열 번호 1, 5 또는 9, 및 서열 번호 3, 7 또는 11의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 기타 특징 및 장점은 이하의 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 CD20을 발현하는 세포와 관련된 다양한 질환을 치료 및 진단하기 위한 개선된 항체-기재 치료법을 제공한다. 본 발명의 치료법은 CD20 상에 표출된 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체를 사용한다. 본 발명에 포함되는 단리된 인간 모노클로날 항체는 IgA, IgG1-4, IgE, IgM 및 IgD 항체를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 항체는 IgG1 항체, 보다 바람직하게는 IgG1,κ 또는 IgG1,γ 이소타입이다. 다른 실시태양에서, 항체는 IgG3 항체, 보다 바람직하게는 IgG3,κ 또는 IgG3,γ 이소타입이다. 또 다른 실시태양에서, 항체는 IgG4 항체, 보다 바람직하게는 IgG4,κ 또는 IgG4,γ 이소타입이다. 또 다른 실시태양에서, 항체는 IgA1 또는 IgA2 항체이다.
또 다른 실시태양에서, 항체는 IgM 항체이다.
하나의 실시태양에서, 인간 항체는 비인간 트랜스제닉 동물, 예를 들어 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환을 거침으로써 CD20에 대한 다양한 이소타입의 인간 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 트랜스제닉 마우스에서 제조된다. 따라서, 본 발명의 측면은 항체, 항체 단편, 및 그의 제약 조성물 뿐만 아니라 비인간 트랜스제닉 동물, B 세포, 숙주 세포 트랜스펙토마, 및 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 포함한다. 상기 트랜스제닉 동물은 또한, US 2003/0017534에 개시된 바와 같이 폴리클로날 항체를 생산하는 트랜스제닉 토끼일 수 있다. 따라서, 본 발명은 CD20에 특이적으로 결합하는 인간 폴리클로날 항체도 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 (i) 위치 172에 아미노산 잔기 프롤린을 포함하지 않거나 필요로 하지 않고; (ii) 위치 170에 아미노산 잔기 알라닌 또는 위치 172에 아미노산 잔기 프롤린을 포함하지 않거나 필요로 하지 않고; (iii) 위치 163에 아미노산 잔기 아스파라긴 및 위치 166에 아미노산 잔기 아스파라긴을 포함하지 않거나 필요로 하지 않고; (iv) 위치 172에 아미노산 잔기 프롤린을 포함하지 않거나 필요로 하지 않지만, 위치 163에 아미노산 잔기 아스파라긴 및 위치 166에 아미노산 잔기 아스파라긴을 포함하거나 필요로 하고; 또는 (v) 위치 170에 아미노산 잔기 알라닌 또는 위치 172에 아미노산 잔기 프롤린을 포함하지 않거나 필요로 하지 않지만, 위치 163에 아미노산 잔기 아스파라긴 및 위치 166에 아미노산 잔기 아스파라긴을 포함하거나 필요로 하는, CD20 상의 에피토프에 결합하는 폴리클로날 항체에 관한 것이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 이하의 특징들 중 하나 이상을 갖는 인간 폴리클로날 항체에 관한 것이다: (i) 인간 CD20과 적어도 동일한 친화도로 돌연변이 P172S CD20 (위치 172의 프롤린이 세린으로 돌연변이됨)에 결합하고; (ii) 인간 CD20과 적어도 동일한 친화도로 돌연변이 AxP (위치 170의 알라닌이 세린으로 돌연변이되고, 위치 172의 프롤린이 세린으로 돌연변이됨)에 결합하고; (iii) 10 ㎍/ml의 항체 농도에서 인간 CD20에 비해 돌연변이 N166D (위치 166의 아스파라긴이 아스파르트산으로 돌연변이됨)에 대한 결합이 50% 이상 감소하고(하거나); (iv) 10 ㎍/ml의 항체 농도에서 인간 CD20에 비해 돌연변이 N163D (위치 163의 아스파라긴이 아스파르트산으로 돌연변이됨)에 대한 결합이 50% 이상 감소함.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 인간 CD20의 작은 제1 세포외 루프의 에피토프에 결합하는 인간 폴리클로날 항체에 관한 것이다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 CD20 상의 불연속 에피토프에 결합하는 인간 폴리클로날 항체도 포함한다. 추가의 실시태양에서, 본 발명은 작은 제1 세포외 루프의 일부 및 제2 세포외 루프의 일부를 갖는 CD20 상의 불연속 에피토프에 결합하는 인간 폴리클로날 항체에 관한 것이다. 또한 추가의 실시태양에서, 본 발명은 작은 제1 세포외 루프의 잔기 AGIYAP 및 제2 세포외 루프의 잔기 MESLNFIRAHTPYI를 갖는 CD20 상의 불연속 에피토프에 결합하는 인간 폴리클로날 항체에 관한 것이다.
CD20을 발현하는 세포를 검출하기 위해 본 발명의 항체를 사용하는 방법은 본 발명에 포함된다. CD20에 의해 유도된 활성, 예를 들어 증식 및(또는) 분화 활성을 차단 또는 억제하기 위해 본 발명의 항체를 사용하는 방법도 제공되며, 이 방법은 CD20과 관련된 질환, 예를 들어 종양성 질병 (예를 들어, B 세포 림프종) 및 자가면역 질환 (예를 들어 RA, 크론병 및 베게너 육아종증)의 치료에 유용하다.
본 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있도로 하기 위해, 특정 용어들은 먼저 정의한다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전체에 걸쳐 기술한다.
"CD20" 및 "CD20 항원"이라는 용어는 본원에서 상호교환되어 사용되며, 세포가 자연적으로 발현하거나 CD20 유전자로 트랜스펙션된 세포 상에 발현되는 인간 CD20의 임의의 변이체, 이소형 및 종 상동체를 포함한다. 본 발명의 항체의 CD20 항원에 대한 결합은, CD20을 불활성화시킴으로써 CD20을 발현하는 세포 (예를 들어, 종양 세포)의 사멸을 매개한다. CD20을 발현하는 세포의 사멸은 이하의 메커니즘 중 하나 이상에 의해 일어날 수 있다:
CD20을 발현하는 세포의 보체 의존성 세포독성 (CDC);
CD20을 발현하는 세포의 아폽토시스;
CD20을 발현하는 세포의 이펙터 세포 식세포작용; 또는
CD20을 발현하는 세포의 이펙터 세포 항체 의존성 세포매개 세포독성 (ADCC).
CD20의 동의어로서는 B-림프구 항원 CD20, B-림프구 표면 항원 B1, Leu-16, Bp35, BM5 및 LF5가 포함되는 것으로 당 분야에서 인식되어 있다.
본원에 사용된 "성장을 억제" (예를 들어, 세포를 지칭)라는 용어는 항-CD20 항체와 접촉했을 때의 세포 성장이 항-CD20 항체와 접촉하지 않은 동일한 세포의 성장에 비해 측정가능한 정도로 감소한 것, 예를 들어 세포 배양시 성장이 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% 이상 또는 100% 억제됨을 포괄하기 위한 것이다. 이러한 세포 성장의 감소는 다양한 메커니즘, 예를 들어 이펙터 세포 식세포작용, ADCC, CDC 및(또는) 아폽토시스에 의해 발생할 수 있다.
"래프트"라는 용어는 세포 원형질막의 외엽 (outer leaflet) 영역에 위치하는 스핑고지질- 및 콜레스테롤-풍부 막 마이크로도메인을 지칭한다. 특정 단백질이 상기 도메인 내에서 회합하는 능력은 단백질의 기능에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, CD20 분자는 본 발명의 인간 항체에 결합된 후 지질 래프트 내로 이동 (translocation)하여, 원형질막에 고밀도의 CD20 항원-항체 복합체를 형성한다. 이러한 고밀도의 CD20 항원-항체 복합체는 CDC 동안 보체 시스템을 효과적으로 활성화시킬 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "항체"라는 용어는 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부위") 또는 단일 사슬을 포함한다. "항체"는 디술파이드 결합에 의해 상호결합된 두 개 이상의 중쇄 (H) 및 두 개 이상의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질, 또는 그의 항원 결합 부위를 지칭한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본 명세서에서는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본 명세서에서는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 더 나누어질 수 있는데, 상기 초가변 영역 사이에는 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보존성이 보다 높은 영역이 존재한다. 각 VH 및 VL은 아미노-말단부터 카르복시-말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분 (c1q)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자와 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 항체의 "항원-결합 부위" (또는 단순히 "항체 일부")라는 용어는, 항원 (예를 들어, CD20)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 하나 이상의 항체 단편을 말한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음은 입증된 바 있다. 항체의 "항원-결합 부위" 란 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 (monovalent) Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술파이드 브릿지에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward et al ., (1989) Nature 341:544-546); (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); 및 (vii) 임의로 합성 링커에 의해 결합될 수 있는 둘 이상의 단리된 CDR의 조합이 있다. 또한, Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH이 별개의 유전자에 의해 코딩된다 하더라도, 재조합법을 사용하여 VL 및 VH 영역이 페어링 (pairing)되어 1가 분자를 형성한 단일 단백질 사슬로 만드는 합성 링커로 이들 두 도메인을 연결시킬 수 있다 (상기 1가 분자는 단일쇄 Fv (scFv)로 공지되어 있음; 예를 들어 Bird et al ., (1998) Science 242:423-426; 및 Huston et al ., (1998) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 85:5879-5883) 참조). 이러한 단일쇄 항체는 항체의 "항원-결합 부위"란 용어에도 포함되는 것이다. 추가적인 예로는 (i) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합된 결합 도메인 폴리펩티드, (ii) 힌지 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역, 및 (iii) CH2 불변 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역을 포함하는 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질이 있다. 결합 도메인 폴리펩티드는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역일 수 있다. 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질은 또한, US 2003/0118592 및 US 2003/0133939에 개시되어 있다. 이러한 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 이용하여 얻고, 유용한 단편은 온전한 (intact) 항체의 경우와 동일한 방식으로 스크리닝한다.
"에피토프"라는 용어는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위 (determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징 뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는다는 점에서 구별된다.
본원에 사용된 "불연속 에피토프"라는 용어는, 단백질의 1차 서열에서 둘 이상의 분리된 영역으로부터 형성된 단백질 항원 상의 입체적 에피토프를 의미한다.
"이중특이적 분자"라는 용어는 두 가지의 상이한 결합 특이성을 갖는 임의의 물질, 예를 들어 단백질, 펩티드, 단백질 또는 펩티드 복합체를 포함하기 위한 것이다. 예컨대, 분자는 (a) 세포 표면 항원 및 (b) 이펙터 세포 표면 상의 Fc 수용체에 결합하거나 그와 상호작용할 수 있다. "다중특이적 분자" 또는 "이종특이적 분자"라는 용어는 둘 이상의 상이한 결합 특이성을 갖는 임의의 물질, 예를 들어 단백질, 펩티드, 단백질 결합체 또는 펩티드 복합체를 포함하기 위한 것이다. 예컨대, 분자는 (a) 세포 표면 항원, (b) 이펙터 세포 표면 상의 Fc 수용체, 및 (c) 하나 이상의 다른 성분과 결합하거나 상호작용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 CD20과 같은 세포 표면 항원, 및 이펙터 세포 상의 Fc 수용체와 같은 기타 표적에 대한 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적 및 기타 다중특이적 분자를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
"이중특이적 항체"라는 용어는 디아보디 (diabody)도 포함한다. 디아보디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬 상에 발현되는 2가의 이중특이적 항체이지만, 동일한 사슬 상의 상기 두 도메인을 페어링시키기에는 너무 짧은 링커를 사용하고 있기 때문에, 상기 도메인을 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 페어링되도록 하여 두 개의 항원-결합 부위를 형성된다 (예를 들어, 문헌 [Holliger, P., et al . (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al . (1994) Structure 2:1121-1123] 참조).
"인간 항체 유도체"라는 용어는 임의의 변형된 형태의 항체, 예를 들어 항체와 다른 물질 또는 항체의 콘쥬게이트를 지칭한다.
본원에 사용된 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열을 사용하여, 예를 들어 인간 면역글로불린 유전자를 갖는 트랜스제닉 마우스를 면역화하거나 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 스크리닝하여 시스템으로부터 항체를 수득했다면, 특정 생식계 서열 (germline sequence)"로부터 유래"된 것이며, 여기서 선택된 인간 항체는 아미노산 서열에 있어서 생식계 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 심지어 보다 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일하다. 통상적으로, 특정 인간 생식계 서열로부터 유래된 인간 항체는 생식계 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 10개 이하, 보다 바람직하게는 5개 이하, 또는 보다 더 바람직하게는 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다.
본원에 사용된 "헤테로항체 (heteroantibody)"라는 용어는 둘 이상의 항체, 그로부터의 유도체, 또는 항원-결합 영역들이 서로 연결된 것 (이들 중 둘 이상이 상이한 특이성을 가짐)을 말한다. 이들 상이한 특이성은 이펙터 세포 상의 Fc 수용체에 대한 결합 특이성, 및 표적 세포, 예컨대 종양세포 상의 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성을 포함한다.
본원에 사용된 "인간 항체"라는 용어는, 인간 생식계 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하기 위한 것이다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발이나 생체내 체세포 돌연변이유발에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 "인간 항체"라는 용어는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 생식계로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식되어 있는 항체는 포함되지 않는다.
본원에 사용된 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"이란 용어는, 단일 분자 조성물의 항체 분자로 된 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 보인다. 따라서, "인간 모노클로날 항체"라는 용어는, 인간 생식계 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 말한다. 하나의 실시태양에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화된 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 얻어진 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본원에 사용된 "재조합 인간 항체"라는 용어는 재조합법에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예를 들어 (a) 인간 면역글로불린 유전자에 대한 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 동물 (예를 들어, 마우스), 또는 그로부터 제조된 하이브리도마 (하기 단락 I에서 추가로 기술함)로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 기타 DNA 서열에 대한 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 포함하는 기타 임의의 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식계 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나 특정 실시태양에서, 이러한 재조합 인간 항체를 시험관내에서 돌연변이시킬 수 있으므로 (또는 인간 Ig 서열로 형질전환된 동물이 사용된 경우에는, 생체내에서 체세포 돌연변이를 유발할 수 있으므로), 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식계의 VH 및 VL 서열로부터 유래하고 이와 관련되어 있지만 생체내 인간 항체 생식계 레파토리내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있다.
본원에 사용된 "트랜스펙토마"라는 용어는, 항체를 발현하는 재조합 진핵 숙주 세포, 예를 들어 CHO 세포, NS/0 세포, HEK293 세포, 식물 세포, 또는 효모 세포를 비롯한 진균류를 포함한다.
본원에 사용된 "이종 항체 (heterologous antibody)"라는 용어는, 이러한 항체를 생산하는 트랜스제닉 비인간 유기체와 관련되어 정의된다. 이 용어는 트랜스제닉 비인간 동물로 구성된 개체에서는 발견되지 않고 일반적으로 트랜스제닉 비인간 동물 이외의 종으로부터 발견되는 것에 상응하는 아미노산 서열을 갖거나 이를 코딩하는 핵산 서열을 갖는 항체를 말한다.
본원에 사용된 "헤테로하이브리드 항체"라는 용어는, 상이한 유기체로부터 유래된 경쇄 및 중쇄를 갖는 항체를 말한다. 예를 들어, 쥐의 경쇄와 연결된 인간 중쇄를 갖는 항체는 헤테로하이브리드 항체이다. 헤테로하이브리드 항체는 예를 들어, 전술한 키메릭 항체 및 인간화 항체를 포함한다.
본원에 사용된 "단리된 항체"라는 용어는, 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, CD20에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 실질적으로 CD20 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 없다). 그러나, 인간 CD20의 에피토프, 이소형 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 관련 항원, 예를 들어, 다른 종 (예를 들어, CD20 종 상동체)에 대해 교차 반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및(또는) 화학 물질이 실질적으로 없을 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 상이한 특이성을 갖는 "단리된" 모노클로날 항체의 조합은 잘 정의된 조성물 중에 배합된다.
본원에 사용된 "특이적 결합"이라는 용어는, 소정의 항원에 대한 항체 결합을 지칭한다. 통상적으로, 항체는 약 1 x 10-7 M 이하의 KD에 상응하는 친화도로 결합하고, 소정의 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 비특이적 항원 (예를 들어 BSA, 카세인)에 대한 그의 결합 친화도보다는 100배 이상 낮은 KD에 상응하는 친화도로 소정의 항원에 결합한다. "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대해 특이적인 항체"라는 구절은, 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"라는 용어와 상호교환되어 사용된다.
본원에 사용된 "kd" (sec-1)라는 용어는, 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 나타내기 위한 것이다. 상기 수치는 또한, koff 값으로도 지칭된다.
본원에 사용된 "ka" (M-1 x sec-1)라는 용어는, 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도 상수를 나타내기 위한 것이다.
본원에 사용된 "KD" (M)라는 용어는, 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 나타내기 위한 것이다.
본원에 사용된 "KA" (M-1)라는 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 평형 상수를 나타내기 위한 것이고, ka를 kd로 나누어 얻어진다.
본원에 사용된 "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 (예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 나타낸다.
본원에 사용된 "이소타입 전환"은, 항체의 클래스 또는 이소타입이 하나의 Ig 클래스에서 다른 Ig 클래스로 변화하는 현상을 지칭한다.
본원에 사용된 "전환되지 않은 이소타입"은 이소타입 전환이 일어나지 않은 경우 생산되는 중쇄의 이소타입 클래스를 말하는데, 전환되지 않은 이소타입을 코딩하는 CH 유전자는 통상 기능적으로 재배열된 VDJ 유전자의 바로 하류 (downstream)에 위치한 첫번째 CH 유전자이다. 이소타입 전환은 고전적인 이소타입 전환 또는 비고전적인 이소타입 전환으로 분류된다. 고전적인 이소타입 전환은 트랜스진내의 전환 서열 영역을 하나 이상 포함하는 재조합 현상에 의해 일어난다. 비고전적 이소타입 전환은 예를 들어, 인간 σμ와 인간 Σμ (δ-관련 결실) 간의 상동 재조합에 의해 일어날 수 있다. 특히, 트랜스진 간의 재조합 및(또는) 염색체 간의 재조합과 같은 별도의 비고전적 전환 메커니즘이 일어나 이소타입 전환을 수행할 수도 있다.
본원에 사용된 "전환 서열"이라는 용어는, 전환 재조합을 담당하는 DNA 서열을 말한다. 전형적인 μ 전환 영역인 "전환 공여자 (donor)" 서열은 전환 재조합 동안 결실되는 제작물 (construct) 영역의 5' (즉, 상류)일 것이다. "전환 수용자" 영역은 결실될 제작물 영역과 대체 불변 영역 (예컨대 γ, ε 등)의 사이에 있을 것이다. 재조합이 항상 일어나는 특정 부위는 없으므로, 일반적으로 구조물로부터 최종 유전자 서열을 예측할 수 없을 것이다.
본원에 사용된 "글리코실화 패턴"은 단백질, 보다 구체적으로는 면역글로불린 (항체) 단백질에 공유 결합된 탄수화물 유닛의 패턴으로 정의된다. 이종 항체의 글리코실화 패턴이 트랜스진의 CH 유전자가 유래되는 종보다 비인간 트랜스제닉 동물 종의 글리코실화 패턴과 더 유사하다는 것을 당업자가 인식할 경우, 이종 항체의 글리코실화 패턴은 비인간 트랜스제닉 동물 종에 의해 생산되는 항체 상에서 자연적으로 생성된 글리코실화 패턴과 실질적으로 유사하다는 것을 특징으로 할 수 있다.
본원에 사용된 한 대상체에게 적용되는 "자연-발생"이란 용어는, 상기 대상체를 자연계에서 발견할 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들어, 자연계의 공급원으로부터 단리할 수 있고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체 (바이러스를 포함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 자연 발생적인 서열이다.
본원에 사용된 "재배열된"이라는 용어는, V 단편이 본질적으로 완전한 VH 또는 VL 도메인 각각을 코딩하는 D-J 또는 J 단편에 구조적으로 바로 인접하여 위치해 있는 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 좌위의 배열을 말한다. 재배열된 면역글로불린 (항체) 유전자 좌위는 생식계 DNA와 비교하여 확인할 수 있고, 재배열된 좌위에는 1종 이상의 재조합 7량체/9량체 상동성 요소가 있을 것이다.
V 단편에 대해 본원에 사용된 "재배열되지 않은" 또는 "생식계 배열"이란 용어는, V 단편이 재조합되지 않아 D 또는 J 단편에 바로 인접하는 배열을 말한다.
본원에 사용된 "핵산 분자"라는 용어는, DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하기 위한 것이다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.
CD20에 결합하는 항체 전체 또는 항체 일부 (예를 들어 VH, VL, CDR3)를 코딩하는 핵산에 대한 본원에 사용된 "단리된 핵산 분자"라는 용어는, 온전한 항체 또는 항체 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 CD20 이외의 항원에 결합하는 항체 전체 또는 항체 일부를 코딩하는 다른 뉴클레오티드 서열 (이 다른 서열은 인간 게놈 DNA에서 상기 핵산을 자연적으로 플랭킹할 수 있다)이 실질적으로 없는 핵산 분자를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 인간 항-CD20 항체는 2F2, 7D8 또는 11B8의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열, 및 각각 서열 번호 1, 5 또는 9, 및 서열 번호 3, 7 또는 11의 서열을 갖는 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 가변 영역을 포함한다.
본원에서 개시하고 청구하고 있는 서열 번호 1-30의 서열은 "보존적 서열 변형체", 즉 아미노산 서열을 비롯하여 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 항체의 결합 특징에 현저한 영향 또는 변화를 주지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변형체를 포함한다. 상기 보존적 서열 변형체는 뉴클레오티드 및 아미노산의 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 당 분야에 공지된 표준 기술, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발 (mutagenesis) 및 PCR-매개 돌연변이유발로 서열 번호 1-30에 도입할 수 있다. 보존적 아미노산의 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환된 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 당 분야에 정의되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (예를 들어 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄 (예를 들어 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 인간 항-CD20 항체에서 예측된 비본질적인 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀리의 다른 아미노산 잔기로 치환된다.
본 발명은 또한, 서열 번호 1-30의 아미노산 서열의 "유도체" 및 그의 보존적 서열 변형체를 포함하는데, 여기서 하나 이상의 아미노산 잔기는 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특성에 현저하게 영향 또는 변화를 주지 않으면서 예를 들어, 아실화 또는 글리코실화에 의해 유도체화된다.
또한, 본 발명은 항체의 기능적 또는 약동학적 성질을 변화시키기 위해 Fc 영역에 변화를 준 항체를 포함한다. 이러한 변화는 c1q 결합 및 CDC, 또는 FcγR 결합 및 ADCC의 감소 또는 증가를 야기할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 불변 영역의 위치 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322의 아미노산 잔기 중 하나 이상을 치환하여, 항원에 대한 결합 능력은 보유하면서 비변형 항체에 비해 이펙터 기능에 변화를 야기할 수 있다 (US 5,624,821 및 US 5,648,260 참조).
또한, 항체의 생체내 반감기는 Ig 불변 도메인 또는 Ig-유사 불변 도메인의 재이용 (salvage) 수용체 에피토프를 온전한 CH2 도메인 또는 온전한 Ig Fc 영역을 포함하지 않도록 변형시켜 개선할 수 있다 (US 6,121,022 및 US 6,194,551 참조). 더욱이, 생체내 반감기는 Fc 영역 내에 돌연변이를 만들어, 예컨대 위치 252의 류신을 트레오닌으로 치환하거나, 위치 254의 세린을 트레오닌으로 치환하거나, 위치 256의 페닐알라닌을 트레오닌으로 치환하여 증가시킬 수 있다 (US 6,277,375 참조).
또한, 항체의 이펙터 기능을 변화시키도록 항체의 글리코실화 패턴을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 항체를 정상적으로는 Fc 영역의 위치 297 Asn에 결합되는 프룩토스 유닛을 부가하지 않는 트랜스펙토마 내에서 발현하여 FcγRIII에 대한 Fc 영역의 친화도를 증강시킬 수 있는데, 이는 NK 세포의 존재하에 항체 ADCC의 증가를 야기할 것이다 (문헌 [Shield et al ., (2002) JBC, 277:26733] 참조). 또한, 갈락토실화를 변화시켜 CDC를 변형시킬 수 있다.
별법으로 다른 실시태양에서, 항-CD20 항체 코딩 서열의 전체 또는 일부에 걸쳐 포화 돌연변이유발과 같은 방법으로 무작위적으로 돌연변이를 도입할 수 있고, 이로써 생성된 변형된 항-CD20 항체를 결합 활성에 대해 스크리닝할 수 있다.
따라서, 본원에 개시한 (중쇄 및 경쇄 가변 영역) 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 항체 및(또는) 본원에 개시한 (중쇄 및 경쇄 가변 영역) 아미노산 서열 (즉, 서열 번호 1-30)을 포함하는 항체는, 보존적으로 변형된 유사 서열을 포함하거나 그에 의해 코딩된 실질적으로 유사한 항체를 포함한다. 본원에 서열 번호 1-30으로서 개시한 부분적 (즉, 중쇄 및 경쇄 가변 영역) 서열에 기초하여 그러한 실질적으로 유사한 항체를 어떻게 제조할 수 있는지에 대해서는, 아래에서 더 논의한다.
핵산의 경우, "실질적인 상동성"이라는 용어는 적당한 뉴클레오티드가 삽입 또는 결실되어 있는 두 개의 핵산, 또는 그의 지정된 서열이 최적으로 정렬되어 비교될 때 뉴클레오티드의 약 80% 이상, 통상적으로는 약 90 내지 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 98 내지 99.5% 이상 동일함을 의미한다. 다르게는, 실질적인 상동성은 단편이 선택적인 혼성화 조건하에서 상기 단편 가닥의 상보체와 혼성화할 때 존재한다.
뉴클레오티드 및 아미노산 서열의 경우, "상동성"이란 용어는 적당한 삽입 또는 결실이 있는 두 개의 핵산 또는 아미노산 서열을 최적으로 정렬하고 비교했을 때, 두 개의 핵산 또는 아미노산 서열 간의 동일성의 정도를 나타낸다. 다르게는, 실질적인 상동성은 DNA 단편이 선택적 혼성화 조건하에서 상기 가닥의 상보체에 혼성화될 때 존재한다.
두 서열 간의 동일성 %는 갭 (gap)의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 서열로 나눈, 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 상동성 = 동일한 위치의 #/ 위치의 총 # x 100). 서열의 비교 및 두 서열 간의 동일성 %의 결정은, 하기 비제한적인 실시예에 기재된 바와 같이 수학적인 알고리즘을 이용하여 달성할 수 있다.
두 뉴클레오티드 서열 간의 동일성 %는 NWSgapdna CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 가중치, 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, GCG 소프트웨어 팩키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 중의 GAP 프로그램으로 측정할 수 있다. 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 동일성 %는 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하여, ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 포함된 E. 마이어스 및 W. 밀러의 알고리즘 (E. Meyers and W. Miller, Comput . Appl . Biosci ., 4:11-17 (1988))으로 측정할 수도 있다. 또한, 두 아미노산 서열 간의 동일성 %는 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치, 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, GCG 소프트웨어 팩키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 중의 GAP 프로그램 내에 포함된 니들만 및 웬치 (Needleman and Wunsch, J Mol . Biol . 48:444-453 (1970)) 알고리즘으로 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 및 단백질 서열을 "질의 서열 (query sequence)"로 사용하여 공용 데이터베이스를 검색함으로써, 예컨대 관련 서열을 동정할 수 있다. 이러한 검색은 문헌 [Altschul, et al . (1990) J. Mol . Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다. NBLAST 프로그램으로 BLAST 뉴클레오티드 검색을 수행하여 (점수 = 100, 단어길이 = 12), 본 발명의 핵산 분자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. XBLAST 프로그램으로 BLAST 단백질 검색을 수행하여 (점수 = 50, 단어길이 = 3), 본 발명의 단백질 분자와 상동성이 있는 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교 목적의 갭 허용 정렬 (gapped alignment)을 얻기 위해, Gapped BLAST를 문헌 [Altschul et al ., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우, 각 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. http://www.ncbi.nlm.ni h.gov 참조.
핵산은 부분 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 세포 전체 또는 세포 용해물에 존재할 수 있다. 핵산은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동, 및 당업계에 잘 공지되어 있는 다른 기술을 비롯한 표준 기술로 다른 세포 성분 또는 다른 오염물질, 예컨대 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제된 경우 "단리된" 또는 "실질적으로 순수한 형태가 된" 것이다. 문헌 [F. Ausubel, et al ., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)] 참조.
cDNA, 게놈 또는 그의 혼합물로부터의 본 발명의 핵산 조성물은 종종 천연 서열로 존재하지만 (변형된 제한효소 부위 등은 제외), 표준 기술에 따라 돌연변이되어 유전자 서열을 제공할 수 있다. 코딩 서열의 경우, 이들 돌연변이로 원하는 아미노산 서열에 영향을 줄 수 있다. 특히, 천연 V, D, J, 불변 서열, 전환 서열, 및 본원에 기재된 상기 다른 서열과 실질적으로 상동성이 있거나 이들로부터 유도된 DNA 서열도 고려된다 (여기서, "유도된"이란 한 서열이 또 다른 서열과 동일하거나 그로부터 변형된 것임을 의미함).
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 위치할 때 "작동 가능하게 연결되어" 있다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 주다면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는 것이다. 조절 서열의 전사에 대해서, 작동 가능하게 연결되어 있다는 것은 연결된 DNA 서열이 인접해 있고 필요한 경우, 두 개의 단백질 코딩 영역이 인접하여 리딩 프레임으로 연결되어 있다는 것을 의미한다. 전환 서열의 경우, 작동 가능하게 연결되어 있다는 것은 서열이 전환 재조합을 수행할 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 "벡터"라는 용어는, 그에 연결된 또 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터 중 한 유형은 "플라스미드"인데, 이는 추가의 DNA 단편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 형태의 벡터는 바이러스 벡터인데, 이 벡터에서 추가 DNA 단편은 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있다. 특정 벡터는 그 벡터가 도입되는 숙주 세포 내에서 자가 복제할 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피좀형 포유류 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피좀형 포유류 벡터)는 숙주 세포내로의 도입시 숙주 세포의 게놈내로 삽입되어 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 더욱이, 특정 벡터는 그에 작동 가능하게 연결된 유전자를 발현시킬 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 단순히 "발현 벡터")로 지칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 사용되는 발현 벡터는 흔히 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 흔히 사용되는 벡터의 형태이므로 상호교환적으로 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명은 동일한 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터 (예컨대, 복제 불능 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "재조합 숙주 세포" (또는 단순히 "숙주 세포")라는 용어는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 말한다. 이러한 용어는 특정 대상의 세포, 뿐만 아니라 그 세포의 자손세포도 지칭하는 것으로 이해해야 한다. 돌연변이 또는 환경적인 영향으로 인해 후대 세포에서 일부 변형이 일어날 수 있기 때문에 사실상 이러한 자손세포는 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에 사용된 "숙주 세포"란 용어의 범위에 여전히 포함된다. 재조합 숙주 세포는 예를 들어 트랜스펙토마, 예컨대 CHO 세포, NS/0 세포, 및 림프구성 세포를 포함한다.
본원에 사용된 "대상"이라는 용어는, 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. "비인간 동물"이라는 용어는 모든 척추동물, 예를 들어 포유류 및 비-포유류, 예를 들어 비인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
"트랜스제닉, 비인간 동물"이라는 용어는, 하나 이상의 인간 중쇄 및(또는) 경쇄 트랜스진 또는 트랜스크로모좀 (동물의 자연 게놈 DNA 내에 삽입되었거나 삽입되지 않은)을 포함하는 게놈을 갖고, 완전한 인간 항체를 발현할 수 있는 비인간 동물을 지칭한다. 예를 들어, 트랜스제닉 마우스는 인간 경쇄 트랜스진, 및 인간 중쇄 트랜스진 또는 인간 중쇄 트랜스크로모좀을 가지므로, 이 마우스는 CD20 항원 및(또는) CD20을 발현하는 세포로 면역화했을 때 인간 항-CD20 항체를 생산할 수 있다. 인간 중쇄 트랜스진은 트랜스제닉, 예를 들어 HCo7 또는 HCo12 마우스와 같은 HuMAb 마우스의 경우처럼 마우스의 염색체 DNA에 삽입될 수 있고, 또는 인간 중쇄 트랜스진은 WO 02/43478에 기술된 바와 같이 트랜스크로모조멀 (예를 들어, KM) 마우스의 경우처럼 염색체외적으로 유지될 수 있다. 이러한 트랜스제닉 및 트랜스크로모조멀 마우스는 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환을 거침으로써, CD20에 대한 다양한 이소타입의 인간 모노클로날 항체 (예를 들어 IgG, IgA 및(또는) IgE)를 생산할 수 있다.
본 발명의 다양한 면은 이하 소단락에 보다 상세하게 기술된다.
I.
CD20
에 대한 인간 항체의 생산
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 통상적인 모노클로날 항체 생산기술, 예를 들어 표준 체세포 혼성화 기술 (Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975))을 비롯한 다양한 기술로 생산될 수 있다. 체세포 혼성화 방법이 바람직하다고 하더라도, 원칙적으로 모노클로날 항체를 생산하는 다른 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스 또는 종양 유전자 (oncogene) 형질전환, 또는 인간 항체 유전자 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 기술을 사용할 수 있다.
인간 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 제조하는 데 바람직한 동물 시스템은 쥐 시스템이다. 마우스에서 하이브리도마의 제조는 매우 잘-확립된 방법이다. 융합용 면역화 비장 세포를 단리하기 위한 면역화 프로토콜 및 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 쥐 골수종 세포) 및 융합 방법도 공지되어 있다.
바람직한 실시양태에서, CD20에 대한 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템보다는 인간 면역 시스템의 일부를 수반하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 마우스를 이용하여 생성시킬 수 있다. 이 트랜스제닉 및 트랜스크로모조멀 마우스는 본원에서 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 각각 지칭하는 마우스를 포함하며, 총체적으로 "트랜스제닉 마우스"라 지칭한다.
HuMAb 마우스는 내인성 μ 및 κ 사슬 좌위를 불활성화시키는 표적 돌연변이와 함께, 정렬되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니좌위를 포함한다 (Lonberg, N. et al . (1994) Nature 368 (6474):856-859). 따라서, 상기 마우스는 면역화에 반응하여 마우스 IgM 또는 κ 발현의 감소를 나타내고, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진에는 클래스 전환 및 체세포 돌연변이가 일어나 고친화도 인간 IgGκ 모노클로날 항체가 생성된다 (Lonberg, N. et al . (1994) 상기 문헌 참조; reviewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern . Rev . Immunol . Vol. 13:65-93, and Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann . N. Y. Acad . Sci 764:536-546). HuMAb 마우스의 제조는 문헌 [Taylor, L. et al . (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al . (1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al . (1993) Proc . Natl . Acad . Sci USA 90:3720-3724; Lonberg et al ., (1994) Nature 368 (6474):856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. et al . (1994) International Immunology 6:579-591; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern . Rev . Immunol. Vol. 13:65-93; Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann . N. Y. Acad . Sci 764:536-546; Fishwild, D. et al . (1996) Nature Biotechnology 14:845-851]에 자세히 기재되어 있다. 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,789,650호, 제5,877,397호, 제5,661,016호, 제5,814,318호, 제5,874,299호 및 제5,770,429호 (모두 Lonberg 및 Kay); 및 미국 특허 제5,545,807호 (Surani et al.); WO 98/24884, WO 94/25585; WO 93/1227; WO 92/22645; WO 92/03918 및 WO 01/09187도 참조.
KM 마우스는 인간 중쇄 트랜스크로모좀 및 인간 카파 경쇄 트랜스진을 포함한다. 또한, 내인성 마우스 중쇄 및 경쇄 유전자는 KM 마우스에서는 파괴되어, 마우스의 면역화시 마우스 면역글로불린 보다는 인간 면역글로불린이 생산된다. KM 마우스의 제작 및 인간 면역글로불린을 제조하기 위한 그의 이용은 WO 02/43478에 상세하게 기술되어 있다.
면역화
CD20에 대한 완전한 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위해, 예를 들어 문헌 [Lonberg, N. et al . (1994) 상기 문헌 참조; Fishwild, et al . (1996), 상기 문헌 참조] 및 WO 98/24884에 기재된 바와 같이, 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 마우스 (예를 들어 HCo12, HCo7 또는 KM 마우스)를 농축된 CD20 항원 및(또는) CD20을 발현하는 세포의 조제물로 면역화시킬 수 있다. 별법으로, 마우스는 인간 CD20을 코딩하는 DNA로 면역화될 수 있다. 바람직하게는, 첫 주입시 마우스는 6-16주령일 것이다. 예를 들어, CD20 항원의 농축된 조제물 (5-50 ㎍)을 사용하여 HuMAb 마우스를 복강내로 면역화시킬 수 있다. 정제 또는 농축된 CD20 항원 조제물을 사용한 면역화가 항체를 생성시키지 않을 경우, 마우스를 CD20을 발현하는 세포, 예를 들어 세포주로 면역화하여 면역 반응을 촉진할 수도 있다.
다양한 항원을 사용한 중복 실험한 결과, 초기에 HuMAb 트랜스제닉 마우스를 프로인트 완전 면역보강제 (complete Freund's adjuvant) 중의 CD20 발현 세포로 복강내 (IP) 또는 피하 (SC) 면역화한 후, PBS 중의 CD20 발현 세포로 매주 IP 면역화 (총 10회까지)하는 경우, 상기 HuMAb 트랜스제닉 마우스가 가장 잘 반응한다는 것을 보인 바 있다. 면역 반응은 안와후 출혈에 의해 얻어지는 혈장 샘플을 사용한 면역화 프로토콜의 경로에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 혈장을 FACS 분석 (하기 기술하는 바와 같이)으로 스크리닝할 수 있고, 항-CD20 인간 면역글로불린의 역가가 충분한 마우스를 융합에 사용할 수 있다. 마우스를 희생시켜 비장을 적출하기 3일 전에 마우스를 CD20 발현 세포로 정맥내 부스팅시킬 수 있다.
CD20
에 대한 인간
모노클로날
항체를 생산하는
하이브리도마의
생성
인간 CD20에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스로부터 비장 세포 및 림프절 세포를 단리하고 적절한 불멸화된 세포주, 예를 들어 마우스 골수종 세포주와 융합시킬 수 있다. 그 다음, 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산에 대하여 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터 얻은 비장 림프구의 단일 세포 현탁액은 50% PEG (w/v)로 SP2/0-Ag8.653 비분비 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1580)와 융합시킬 수 있다. 웰 당 약 1 x 105으로 세포를 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트에 플레이팅한 후, 통상의 시약 이외에 10% 태아 클론 혈청, 5-10% 오리겐 하이브리도마 클로닝 인자 (IGEN) 및 1X HAT (시그마)를 함유하는 선별 배지에서 2주 동안 인큐베이션한다. 약 2주 후, HAT를 HT로 바꾼 배지에서 세포를 배양한다. 이어서, ELISA로 각각의 웰을 인간 카파-경쇄 포함 항체에 대해, 그리고 CD20 발현 세포를 사용하는 FACS 분석으로 CD20 특이성에 대해 스크리닝할 수 있다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 통상 10-14일 후 배지를 관찰한다. 항체 분비 하이브리도마를 다시 플레이팅하여 다시 스크리닝하고, 인간 IgG, 항-CD20 모노클로날 항체에 대해 여전히 양성이면 한계 희석법으로 2회 이상 서브클로닝할 수 있다. 그 다음, 안정한 서브클론을 시험관내에서 배양하여 조직 배양 배지 내에서 항체를 생산하여 특징 규명에 사용하였다.
CD20
에 대한 인간
모노클로날
항체를 생산하는
트랜스펙토마의
생성
본 발명의 인간 항체는 예를 들어, 당 분야에 공지된 재조합 DNA 기술 및 유전자 트랜스펙션 방법 (Morrison, S. (1985) Science 229:1202)의 조합을 사용하여, 숙주 세포 트랜스펙토마에서도 생산될 수 있다.
예를 들어, 하나의 실시태양에서 관심 대상인 유전자(들), 예컨대 인간 항체 유전자는 발현 벡터, 예를 들어 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338 841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템 또는 당 분야에 공지된 다른 발현 시스템에 사용되는 것과 같은 진핵세포 발현 플라스미드에 라이게이션될 수 있다. 클로닝된 항체 유전자를 갖는 정제된 플라스미드는 진핵 숙주 세포, 예를 들어 CHO 세포, NS/0 세포 또는 HEK293 세포, 또는 별법으로 식물 유래 세포, 진균류 또는 효모 세포와 같은 다른 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 유전자들을 도입하기 위해 사용되는 방법은 당 분야에 개시되어 있는 방법들, 예를 들어 일렉트로포레이션 (electroporation), 리포펙틴, 리포펙타민 등일 수 있다. 이러한 항체 유전자를 숙주 세포 내로 도입한 후, 항체를 발현하는 세포를 확인하여 선택할 수 있다. 이러한 세포가 트랜스펙토마이며, 이는 발현 수준을 증폭시키고 항체를 생산하도록 스케일업할 수 있다. 재조합 항체는 상기 배양 상청액 및(또는) 세포로부터 단리 및 정제될 수 있다.
CD20
에 대한 인간
모노클로날
항체를 생산하기 위한 추가의 재조합법
별법으로 단일 사슬 Fv 항체를 생산하기 위해, 클로닝된 항체 유전자는 원핵 세포, 예를 들어 대장균 (E. coli)과 같은 미생물, 조류, 및 곤충 세포를 비롯한 다른 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 또한, 항체 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 양의 젖 및 토끼에서, 암탉의 알에서, 또는 트랜스제닉 식물에서 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Verma, R., et al . (1998) Antibody engineering: Comparison of bacterial, yeast, insect and mammalian expression systems. J. immunol. Meth. 216:165-181; Pollock, et al . (1999). Transgenic milk as a method for the production of recombinant antibodies. J. immunol . Meth . 231:147-157; 및 Fischer, R., et al. (1999). Molecular farming of recombinant antibodies in plants. Biol . Chem . 380:825-839] 참조.
온전한 항체를 발현하기 위한 부분 항체 서열의 사용
항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR)에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, 각각의 항체 간에 CDR 내의 아미노산 서열은 CDR 이외의 서열보다 훨씬 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용의 원인이 되므로, 상이한 성질을 갖는 상이한 항체로부터 프레임워크 서열 상에 이식된 특정 자연 발생 항체의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 제작함으로써, 특정 자연 발생 항체의 성질을 모방하는 재조합 항체를 발현시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al . (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; and Queen, C. et al . (1989) Proc . Natl . Acad. Sci .. U.S.A. 86:10029-10033] 참조). 상기 프레임워크 서열은 생식계 항체 유전자 서열을 포함하는 공용 DNA 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 이러한 생식계 서열은 B 세포의 성숙 동안 V(D)J 연결 (joining)에 의해 형성되는 완전히 조립된 가변 유전자를 포함하지 않을 것이므로, 성숙 항체 유전자 서열과는 다를 것이다. 생식계 유전자 서열은 각각의 균등한 가변 영역에 걸쳐 고친화도 2차 레파토리 항체의 서열과도 상이할 것이다. 예를 들어, 체세포 돌연변이는 프레임워크 영역 1의 아미노 말단 부분 및 프레임워크 영역 4의 카르복시-말단 부분에서는 상대적으로 드물다. 또한, 다수의 체세포 돌연변이는 항체의 결합 성질을 현저하게 변화시키지 않는다. 이 때문에, 원래의 항체의 결합 성질과 유사한 결합 성질을 갖는 온전한 재조합 항체를 재생성하기 위해서는 특정 항체의 전체 DNA 서열을 수득할 필요가 있다 (WO 99/45962 참조). CDR 영역에 스패닝되어 있는 부분적인 중쇄 및 경쇄 서열은 통상적으로 이러한 목적에 부합된다. 부분적인 서열은 어느 생식계 가변 및 결합 유전자 단편이 재조합된 항체 가변 유전자에 기여하는지를 결정하는데 사용된다. 그리고, 생식계 서열은 가변 영역의 결손 부분을 채우는데 사용된다. 중쇄 및 경쇄 리더 서열은 단백질 성숙 동안 절단되고, 최종 항체의 성질에 기여하지 않는다. 결손 서열을 첨가하기 위해, 클로닝된 cDNA 서열은 라이게이션 또는 PCR 증폭으로 합성 올리고뉴클레오티드와 결합될 수 있다. 별법으로, 전체 가변 영역은 짧은 중첩되는 올리고뉴클레오티드 세트로서 합성되고 PCR 증폭으로 조합되어, 완전한 합성 가변 영역 클론을 생성할 수 있다. 이러한 방법은 특정 제한효소 부위 또는 특정 코돈의 제거 또는 삽입과 같은 일정한 장점을 갖는다.
하이브리도마로부터의 중쇄 및 경쇄 전사체의 뉴클레오티드 서열은, 중첩되는 합성 올리고뉴클레오티드 세트를 설계하여 천연 서열과 동일한 아미노산 코딩능을 갖는 합성 V 서열을 생성하는데 사용된다. 합성 중쇄 및 카파 사슬 서열은 올리고뉴클레오티드 합성 및 PCR 증폭을 용이하게 하기 위한 반복 뉴클레오티드 염기 스트링 (string)의 단절; 코작의 법칙 (Kozak's rules)에 따른 최적 번역 개시 부위의 삽입 (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870); 및 번역 개시 부위 상류에서 HindIII 부위의 엔지니어링과 같은 3가지의 방식에 의해 천연 서열과 달라질 수 있다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역 모두의 경우, 최적화된 코딩 가닥 및 상응하는 비-코딩 가닥 서열은 상응하는 비-코딩 올리고뉴클레오티드의 대략 중앙점에서 30-50 뉴클레오티드로 절단된다. 따라서, 각 사슬에 대해 올리고뉴클레오티드는 150-400 뉴클레오티드 단편에 걸친 중첩되는 이중 가닥 세트로 조립될 수 있다. 그리고, 풀 (pool)은 150-400 뉴클레오티드의 PCR 증폭 산물을 생성하기 위한 주형으로 사용된다. 통상적으로, 단일 가변 영역 올리고뉴클레오티드 세트는 2가지의 중첩 PCR 산물을 생성하기 위해 별도로 증폭되는 2개의 풀로 나누어진다. 그 다음, 이러한 중첩 산물은 PCR 증폭과 조합되어 완전한 가변 영역을 형성한다. 또한, 발현 벡터 제작물 내로 용이하게 클로닝될 수 있는 단편을 생성하기 위해 PCR 증폭시 중쇄 또는 경쇄 불변 영역 (카파 경쇄의 BbsI 부위, 또는 감마 중쇄인 경우 AgeI 부위를 포함)의 중첩 단편을 포함시키는 것이 바람직할 수 있다.
그 다음, 재구성된 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 클로닝된 프로모터, 리더 서열, 번역 개시, 불변 영역, 3' 비번역, 폴리아데닐화 및 전사 종결 서열과 조합되어 발현 벡터 제작물을 형성한다. 중쇄 및 경쇄 발현 제작물은 단일 벡터와 조합되거나, 숙주 세포 내로 공동-트랜스펙션, 연속 트랜스펙션 또는 개별적으로 트랜스펙션될 수 있고, 그 다음 융합되어 양 사슬을 모두 발현하는 숙주 세포를 형성한다.
인간 IgGκ에 대한 발현 벡터의 제작에 사용하기 위한 플라스미드는 이하 기술한다. 플라스미드는 PCR 증폭된 V 중쇄 및 V 카파 경쇄 cDNA 서열이 완전한 중쇄 및 경쇄 미니유전자를 재구성하는데 사용될 수 있도록 하기 위해 제작된다. 이러한 플라스미드는 완전한 인간, 또는 키메릭 IgG1,κ 또는 IgG4,κ 항체를 발현하는데 사용될 수 있다. 유사한 플라스미드는 다른 중쇄 이소타입의 발현을 위해, 또는 람다 경쇄를 포함하는 항체의 발현을 위해 제작될 수 있다.
따라서 본 발명의 다른 면에서, 본 발명의 인간 항-CD20 항체, 예를 들어 11B8, 2F2 또는 7D8의 구조적 특징은, CD20에 대한 결합과 같은 본 발명의 항체의 하나 이상의 기능적 성질을 보유하는 구조적으로 관련된 인간 항-CD20 항체를 생성하는데 사용된다. 보다 구체적으로 2F2, 7D8 또는 11B8의 하나 이상의 CDR 영역은 공지된 인간 프레임워크 영역 및 CDR과 재조합적으로 조합되어, 재조합적으로 엔지니어링된 본 발명의 추가적인 인간 항-CD20 항체를 생성할 수 있다.
따라서 다른 실시태양에서, 본 발명은
(1) 인간 중쇄 프레임워크 영역 및 인간 중쇄 CDR을 포함하며, 여기서 인간 중쇄 CDR 중 하나 이상은 도 53, 55 또는 57 (또는 서열 번호 13-15, 19-21 또는 25-27의 상응하는 아미노산 잔기)에 나타낸 CDR의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; (2) 인간 경쇄 프레임워크 영역 및 인간 경쇄 CDR을 포함하며, 여기서 인간 경쇄 CDR 중 하나 이상은 도 53, 55 또는 57 (또는 서열 번호 16-18, 22-24 또는 28-30의 상응하는 아미노산 잔기)에 나타낸 CDR의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는,
CD20에 대한 결합능을 보유하는 항-CD20 항체의 제조 방법을 제공한다.
항체가 CD20에 결합하는 능력은 표준 결합 검정법, 예를 들어 실시예에 기술한 것들 (예를 들어, FACS 분석)을 사용하여 측정할 수 있다.
항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 도메인이 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화도에 특히 중요한 역할을 한다는 것은 당 분야에 잘 알려져 있으므로, 상기 기술한 바와 같이 제조된 본 발명의 재조합 항체는 바람직하게는 2F2, 7D8 또는 11B8의 중쇄 및 경쇄 CDR3를 포함한다. 또한, 항체는 2F2, 7D8 또는 11B8의 CDR2를 포함할 수 있다. 또한, 항체는 2F2, 7D8 또는 11B8의 CDR1을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, (1) 인간 중쇄 프레임워크 영역, 인간 중쇄 CDR1 영역, 인간 중쇄 CDR2 영역 및 인간 중쇄 CDR3 영역을 포함하며, 여기서 인간 중쇄 CDR3 영역은 도 53, 55 또는 57 (또는 서열 번호 15, 21 또는 27에 나타낸 상응하는 아미노산 잔기)에 나타낸 2F2, 7D8 또는 11B8의 CDR3이고; (2) 인간 경쇄 프레임워크 영역, 인간 경쇄 CDR1 영역, 인간 경쇄 CDR2 영역 및 인간 경쇄 CDR3 영역을 포함하며, 여기서 인간 경쇄 CDR3 영역은 도 53, 55 또는 57 (또는 서열 번호 18, 24 또는 30에 나타낸 상응하는 아미노산 잔기)에 나타낸 2F2, 7D8 또는 11B8의 CDR3인, CD20에 결합하는 항-CD20 항체를 제공한다. 항체는 2F2, 7D8 또는 11B8의 중쇄 CDR2 및(또는) 경쇄 CDR2를 추가로 포함할 수 있다. 항체는 2F2, 7D8 또는 11B8의 중쇄 CDR1 및(또는) 경쇄 CDR1을 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 기술한 조작된 항체의 CDR1, 2 및(또는) 3은 본원에 기술된 2F2, 7D8 또는 11B8과 정확하게 일치하는 아미노산 서열(들)을 포함한다. 그러나, 당업자들은 CD20에 효과적으로 결합하는 항체의 능력을 여전히 보유하면서 2F2, 7D8 또는 11B8의 정확한 CDR 서열로부터의 일부 변화 (예를 들어, 보존적 치환)가 가능함을 인식할 것이다. 따라서 다른 실시태양에서, 조작된 항체는 예를 들어 2F2, 7D8 또는 11B8의 CDR 중 하나 이상과 90%, 95%, 98% 또는 99.5% 동일한 하나 이상의 CDR로 구성될 수 있다.
CD20에 대한 단순한 결합 이외에, 상기 기술한 것과 같은 엔지니어링된 항체는 본 발명의 항체의 다른 기능적 성질, 예를 들어:
(1) CD20으로부터의 낮은 해리 속도;
(2) CD20에 대한 고친화도 결합;
(3) CD20 상의 특유의 에피토프에 대한 결합, 및(또는) CD20에 대한 특정 배향으로의 결합, 및(또는) CD20의 특정 형태에 대한 결합;
(4) CD55/59 음성 또는 CD55/59 양성 세포 상에서 높은 수준의 CDC 매개;
(5) CD20에 대한 결합시 지질 래프트 내로의 이동;
(6) CD20을 발현하는 세포 성장의 억제;
(7) CD20을 발현하는 세포의 아폽토시스 유도;
(8) CD20을 발현하는 세포의 호모타입 부착 유도;
(9) CD20을 발현하는 종양 세포를 갖는 대상의 생존 연장;
(10) 적절한 이펙터 세포와 혼합된 경우 CD20 표적의 ADCC 매개;
(11) CD20을 발현하는 세포를 고갈시키는 능력; 및(또는)
(12) 낮은 수준의 CD20을 발현하는 세포 (CD20low 세포)를 고갈시키는 능력
의 보유에 대해 선택될 수 있다.
CD20
에 대한 인간
모노클로날
항체의 결합 특징 규명
인간 항-CD20 항체를 정제하기 위해, 선별된 하이브리도마를 2리터의 스피너-플라스크에서 성장시켜 모노클로날 항체를 정제할 수 있다. 상청액은 여과하고 농축한 후 단백질 A-세파로스 (IgG1 이소타입 항체에 대해)(파마시아, 뉴저지주 피스카타웨이), 또는 IgG3 이소타입 항체의 경우 항-인간 IgG 코팅된 세파로스 또는 단백질 G-세파로스를 사용한 친화도 크로마토그래피할 수 있다. 용출된 IgG를 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피로 검사하여 순도를 확인할 수 있다. 완충액을 PBS로 교체할 수 있고, 흡광 계수 1.43을 사용한 OD280으로 농도를 측정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하여 -80℃에 저장할 수 있다.
선별된 인간 항-CD20 모노클로날 항체가 고유의 에피토프에 결합하는지 알아보기 위해, 부위-지정 또는 다수-부위 지정 돌연변이유발을 사용할 수 있다.
정제된 항체의 이소타입을 결정하기 위해, 이소타입 ELISA를 수행할 수 있다. 마이크로타이터 플레이트의 웰을 10 ㎍/ml의 항-인간 Ig로 4℃에서 밤새 코팅할 수 있다. 5%의 BSA로 블로킹한 후, 상기 플레이트를 10 ㎍/ml의 모노클로날 항체 또는 정제된 이소타입 대조군과 상온에서 2시간 동안 반응시킨다. 이어서, 웰을 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 또는 인간 IgM-특이적 알칼리성 포스파타제-콘쥬게이트된 프로브와 반응시킬 수 있다. 세척 후, pNPP 기질 (1 mg/ml)로 현상하고 405-650의 OD에서 분석한다.
면역화된 마우스의 혈청에서 항-CD20 항체의 존재, 또는 CD20를 발현하는 생 세포에 대한 모노클로날 항체의 결합을 입증하기 위해, 유세포 분류법을 사용할 수 있다. 요약하면, CD20을 발현하는 세포주 (표준 성장 조건하에서 성장)를 0.1%의 BSA 및 0.02%의 아지드화 나트륨을 함유하는 PBS 중의 다양한 농도의 모노클로날 항체와 혼합하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 세척 후, 세포를 1차 항체 염색에서와 동일한 조건하에서 플루오레신-표지된 항-인간 IgG 항체와 반응시킨다. 단일 생 세포를 게이팅 (gating)하기 위해 광산란 및 측산란성을 이용하는 FACS 장치로 샘플을 분석할 수 있다. 형광 현미경을 사용하는 다른 검정법을 유세포 분류법 검정법에 (부가적으로 또는 그 대신) 사용할 수 있다. 세포는 상기한 바와 같이 정확히 염색하여 형광 현미경으로 검사할 수 있다. 이 방법은 개별 세포의 가시화를 가능케 하지만, 항원의 밀도에 따라 감소된 민감성을 나타낼 수 있다.
웨스턴 블롯팅으로 항-CD20 인간 IgG의 CD20 항원과의 반응성에 대해 더 시험할 수 있다. 요약하면, CD20을 발현하는 세포의 세포 추출물을 준비하여 소듐 도데실 술페이트 (SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동할 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막으로 옮겨 20% 마우스 혈청으로 블로킹하고, 시험할 모노클로날 항체로 프로빙한다. 인간 IgG 결합은 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타제를 사용하여 검출하고 BCIP/NBT 기질 정제 (시그마 케미칼 캄파니, 미주리주 세인트 루이스)로 현상할 수 있다.
CD20
에 대한 인간
모노클로날
항체의 식세포작용 및 세포 사멸 활성
CD20에 대한 특이적인 결합 이외에, CD20을 발현하는 세포의 식세포작용 및 사멸을 매개하는 능력에 대해 인간 모노클로날 항-CD20 항체를 시험할 수 있다. 모노클로날 항체 활성의 시험관내 시험은 생체내 모델에서 시험하기 전의 초기 스크리닝을 제공할 것이다. 요약하면, 건강한 공여자의 다형핵 세포 (PMN), NK 세포, 단핵구 또는 다른 이펙터세포는 피콜 하이파크 (Ficoll Hypaque) 밀도 원심분리 후 오염 적혈구를 용해시켜 정제할 수 있다. 세척된 PMN은 10%의 열-불활성화 소태아 혈청이 보충된 RPMI에 현탁시켜, 종양 세포에 대해 다양한 비율의 이펙터 세포 (-이펙터 세포: 종양 세포)로 CD20을 발현하는 51Cr 표지된 세포와 혼합할 수 있다. 그 다음, 정제된 인간 항-CD20 IgG를 다양한 농도로 첨가할 수 있다. 관련없는 인간 IgG를 음성 대조군으로 사용할 수 있다. 분석은 사용되는 이펙터 세포 타입에 따라 37℃에서 4 내지 20시간 동안 수행할 수 있다. 배양 상청액으로 방출되는 51Cr을 측정함으로써 샘플을 세포 용해에 대해 분석할 수 있다. 항-CD20 모노클로날 항체는 세포 용해가 다수의 모노클로날 항체에 의해 상승되는지를 알아보기 위해 서로 배합된 상태로 시험할 수도 있다.
CD20에 결합하는 인간 모노클로날 항체를 생체내 모델 (예컨대, 마우스)에서 시험하여 CD20-발현 종양 세포의 성장을 조절하는데 있어서 상기 항체의 효능을 알아볼 수도 있다. 이들 항체는 예컨대, 하기 기준을 기초로 하여 선별될 수 있고, 하기 기준들은 상호 배타적인 것은 아니다:
1. CD20을 발현하는 살아있는 세포에의 결합;
2. CD20으로부터의 낮은 해리 속도;
3. CD20에 대한 고친화도 결합;
4. CD20 상의 특유의 에피토프와의 결합; 및(또는) CD20에 대한 특정 배향으로의 결합, 및(또는) CD20의 특정 형태에 대한 결합;
5. CD20을 발현하는 세포의 옵소닌화;
6. 인간 이펙터 세포의 존재 하에 CD20을 발현하는 세포의 성장 억제, 식세포작용 및(또는) 사멸의 매개;
7. CD55/CD59 음성 또는 양성 세포 상에서 CDC를 유도하는 능력;
8. 호모타입 부착을 유도하는 능력;
9. CD20에 대한 결합시 지질 래프트로의 이동을 유도하는 능력;
10. 아폽토시스를 유도하는 능력;
11. CD20을 발현하는 세포 상에서 ADCC를 유도하는 능력;
12. CD20을 발현하는 세포를 고갈시키는 능력; 및(또는)
13. 낮은 수준의 CD20을 발현하는 세포 (CD20low 세포)를 고갈시키는 능력.
본 발명의 바람직한 인간 모노클로날 항체는 이들 기준 중 하나 이상을 총족시킨다.
인간 모노클로날 항-CD20 항체는 다양한 공지의 기술을 사용하여 CDC 매개능에 대해 시험할 수 있다. 예를 들어, 건강한 대상의 혈액으로부터 보체에 대한 혈청을 얻을 수 있고, 이를 원심분리하여 수확할 수 있다. 다양한 mAb의 CDC 활성을 측정하기 위해, 상이한 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 51Cr 방출을 측정하거나 프로피듐 요오다이드 (PI) 배제 검정법을 사용하여 막 투과성의 상승을 평가할 수 있다. 요약하면, 표적 세포를 세척하고 1 x 106/ml로 RPMI-1% BSA에 재현탁한다. 다양한 농도의 mAb를 세포에 첨가하여 실온에서 10-15분 동안 결합시킬 수 있다. 그 다음, 혈청을 20% (v/v)의 최종 농도로 첨가하여 세포를 37℃에서 45분 동안 인큐베이션시킬 수 있다. 각 샘플로부터의 모든 세포는 FACS 튜브 내의 PI 용액에 첨가될 수 있다. 그 다음, 혼합물을 FACScalibur 유세포 분석기를 사용하여 유세포 분류법으로 즉시 평가하고, CellQuest 프로 소프트웨어 (BD 바이오사이언시즈, 캘리포니아주 마운틴뷰)를 사용하여 분석했다.
아폽토시스를 개시할 수 있는 능력을 시험하기 위해, 인간 모노클로날 항-CD20 항체를 예를 들어, CD20 양성 종양 세포, 예컨대 Daudi와 37℃에서 약 20시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 세포를 수확하여 어넥신 (Annexin)-V-FITC 결합 완충액 (BD 바이오사이언시즈)으로 세척하고, 4℃ 암실에서 15분 동안 어넥신 V-FITC (BD 바이오사이언시즈)로 표지했다. 각 샘플로부터의 모든 세포를 FACS 튜브 내의 PI 용액 (PBS 중의 10 ㎍/ml)에 첨가하여, 유세포 분류법으로 즉시 평가할 수 있다 (상기와 같이).
본 발명의 특정 실시태양에서, 인간 모노클로날 항체들은 조합으로, 예를 들어 둘 이상의 항-CD20 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물로서 사용된다. 예를 들어, 상이하지만 상보적인 활성을 갖는 인간 항-CD20 모노클로날 항체는 단일 요법 내에서 조합되어 목적하는 치료 또는 진단 진단 효과를 달성할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 조성물은 아폽토시스를 유도하는 다른 인간 항-CD20 모노클로날 항체와 조합된, CDC를 매개하는 항-CD20 인간 모노클로날 항체를 포함한다. 다른 실시태양에서, 조성물은 CD20을 발현하는 세포의 성장을 억제하는 다른 인간 항-CD20 모노클로날 항체와 조합된, 이펙터 세포 존재하에 표적 세포의 매우 효과적인 사멸을 매개하는 항-CD20 인간 모노클로날 항체를 포함한다.
II . 인간 모노클로날 항- CD20 항체를 생성하는 트랜스제닉 비인간 동물의 제조
또 다른 면에서, 본 발명은 CD20에 특이적으로 결합하는 인간 항체를 발현할 수 있는 트랜스제닉 및 트랜스크로모조멀 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 마우스를 제공한다. 특정 실시태양에서, 본 발명은 마우스가 CD20을 발현하는 세포로 면역화되었을 때 인간 항-CD20 항체를 생산하도록 인간 중쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 마우스를 제공한다. 인간 중쇄 트랜스진은 본원에 상세하게 기술하고 예시한 트랜스제닉, 예를 들어 HuMAb 마우스의 경우처럼, 마우스의 염색체 DNA에 삽입될 수 있다. 별법으로, 인간 중쇄 트랜스진은 WO 02/43478에 기술된 트랜스크로모조멀 (예를 들어, KM) 마우스의 경우와 같이, 염색체외적으로 유지될 수 있다. 상기 트랜스제닉 및 트랜스크로모조멀 동물은 V-D-J/V-J 재조합 및 이소타입 전환을 거침으로써, CD20에 대해 다양한 이소타입의 인간 모노클로날 항체 (예를 들어 IgG, IgA 및(또는) IgE)를 생산할 수 있다. 이종 항체 레파토리를 사용한 외래 항원 자극에 대해 반응하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 비인간 동물을 설계하기 위해서는, 트랜스제닉 동물 내에 포함된 이종 면역글로불린 트랜스진이 B-세포 발달 경로를 통해 정확하게 기능하는 것이 필요하다. 이는 예를 들어, 이종 중쇄 트랜스진의 이소타입 전환을 포함한다. 따라서, 트랜스진은 이소타입 전환이 유도될 수 있고 (1) 높은 수준의 세포-유형 특이적 발현, (2) 기능적 유전자 재배열, (3) 대립유전자 배제의 활성화 및 대립유전자 배제에 대한 반응, (4) 충분한 1차 레파토리의 발현, (5) 신호 전달, (6) 체세포 과다변이, 및 (7) 면역 반응 동안 트랜스진 항체 좌위의 우성화 중 하나 이상의 특징을 나타내도록 제작된다.
상기 기준 모두를 충족시킬 필요는 없다. 예를 들어, 트랜스제닉 동물의 내인성 면역글로불린 좌위가 기능적으로 손상된 실시태양의 경우, 트랜스진은 대립유전자 배제를 활성화할 필요가 없다. 또한, 트랜스진이 기능적으로 재배열된 중쇄 및(또는) 경쇄 면역글로불린 유전자를 포함하는 실시태양의 경우, 기능적 유전자 재배열의 두번째 기준은 적어도 트랜스진이 이미 재배열된 경우에는 필요치 않다. 분자 면역학의 배경 기술에 대하여는, 문헌 [Fundamental Immunology, 2nd edition (1989), Paul William E., ed. Raven Press, N. Y.]을 참조한다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 데 사용되는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 비인간 동물은, 트랜스제닉 동물의 생식계에서 재배열된 이종 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스진, 재배열되지 않은 이종 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스진, 또는 이들의 조합을 포함한다. 각각의 중쇄 트랜스진은 하나 이상의 CH 유전자를 포함한다. 또한, 중쇄 트랜스진은 트랜스제닉 동물의 B-세포에서 다수의 CH 유전자를 코딩하는 이종 트랜스진의 이소타입 전환을 뒷받침할 수 있는 기능성 이소타입 전환 서열을 포함할 수 있다. 이러한 전환 서열은 트랜스진 CH 유전자의 공급원 역할을 하는 종 유래의 생식계 면역글로불린 좌위에서 자연적으로 발생하는 것이거나, 또는 트랜스진 제작물을 수용하게 될 종 (트랜스제닉 동물)에서 나타나는 것들로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 트랜스제닉 마우스 생산에 사용되는 인간 트랜스진 제작물은 이 제작물이 마우스 중쇄 좌위에서 자연적으로 발생하는 것과 유사한 전환 서열을 포함하는 경우, 아마도 마우스 전환 서열은 마우스 전환 리컴비나제 효소 시스템과 함께 작동되도록 최적화되어 있는 반면, 인간 전환 서열의 경우에는 그렇지 못할 것이기 때문에, 보다 높은 빈도로 이소타입 전환 현상이 일어날 수 있다. 전환 서열은 통상적인 클로닝 방법에 의해 단리 및 클로닝되거나, 면역글로불린 전환 영역 서열에 대한 공개된 서열 정보를 기초로 설계된 합성 올리고뉴클레오티드를 중첩시켜 드 노보 (de novo)로 합성될 수 있다 [Mills et al ., Nucl . Acids Res. 15:7305-7316 (1991); Sideras et al ., Intl . Immunol . 1:631-642 (1989)]. 상기 트랜스제닉 동물 각각의 경우, 기능적으로 재배열된 이종 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 트랜스진은 트랜스제닉 동물의 B 세포내에 상당한 비율 (10% 이상)로 발견된다.
본 발명의 트랜스제닉 비인간 동물을 생성하는데 사용되는 트랜스진은 하나 이상의 가변 유전자 단편, 하나의 다양성 (diversity) 유전자 단편, 하나의 연결(joining) 유전자 단편 및 하나 이상의 불변 영역 유전자 단편을 코딩하는 DNA를 포함하는 중쇄 트랜스진을 포함한다. 면역글로불린 경쇄 트랜스진은 하나 이상의 가변 유전자 단편, 하나의 연결 유전자 단편, 및 하나 이상의 불변 영역 유전자 단편을 코딩하는 DNA를 포함한다. 경쇄 및 중쇄 유전자 단편을 코딩하는 유전자 단편은 트랜스제닉 비인간 동물로 구성되지 않은 종으로부터 얻은, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 단편을 코딩하는 DNA로부터 유래하거나 이 DNA와 상응한다는 점에서, 트랜스제닉 동물에 대하여 이종성이다. 본 발명의 한 측면에서, 트랜스진은 개별 유전자 단편이 재배열되지 않도록, 즉 기능성 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 코딩하도록 재배열되지 않게끔 제작한다. 재배열되지 않은 이러한 트랜스진은 V, D 및 J 유전자 단편의 재조합 (기능적 재배열)을 뒷받침하며, 바람직하게는 CD20 항원에 노출되는 경우 트랜스제닉 동물에서 생성된 재배열된 면역글로불린 중쇄내의 D 영역 유전자 단편의 전부 또는 일부의 혼입을 뒷받침한다.
다른 실시태양에서, 트랜스진은 재배열되지 않은 "미니좌위"를 포함한다. 이러한 트랜스진은 통상적으로 C, D 및 J 단편뿐만 아니라 V 유전자 단편 하위군의 실질적인 부분을 포함한다. 이와 같은 트랜스진 구조물에서 다양한 조절 영역, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 클래스 전환 영역, RNA 프로세싱에 대한 스플라이스 공여자 및 스플라이스-수용자 서열, 및 재조합 신호 등은 이종 DNA로부터 유래된 상응하는 서열을 포함한다. 이러한 조절 서열은 본 발명에 사용된 비인간 동물과 동일하거나 관련된 종 유래의 트랜스진내에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 인간 면역글로불린 유전자 단편은 트랜스제닉 마우스에서 사용되는 설치류 면역글로불린 인핸서 서열을 갖는 트랜스진내에서 조합될 수 있다. 별법으로, 합성 조절 서열은 트랜스진에 도입될 수 있는데, 이 경우 상기 합성 조절 서열과 포유류의 게놈에서 천연적인 것으로 알려진 기능적 DNA 서열 사이에 상동성이 없다. 합성 조절 서열은 예를 들어, 스플라이스-수용자 부위 또는 프로모터/인핸서 모티프의 허용되는 서열을 특정화하는 것과 같은 컨센서스 (consensus) 규칙에 따라 설계된다. 예를 들어, 미니좌위는 천연 생식계 Ig 좌위에 비해 비필수적인 DNA 부분 (예를 들어, 개입 (intervening) 서열; 인트론 또는 그의 일부)의 내부 (즉, 그 부위의 말단부는 아님) 결실을 하나 이상 갖는 게놈 면역글로불린 좌위의 일부를 포함한다.
바람직한 트랜스제닉 및 트랜스크로모조멀 비인간 동물, 예를 들어 마우스는 부피를 고려했을 때 인간의 면역글로불린과 생산과 이상적 및 실질적으로 유사한, 현저한 레파토리를 포함하는 면역글로불린 생산을 보일 것이다.
레파토리는 이상적으로는 부피를 고려했을 때 인간에게 나타난 것과 비슷하고, 일반적으로는 그의 약 10% 이상일 것이며, 바람직하게는 25 내지 50 % 이상의 다양성 (diversity)를 가질 것이다. 일반적으로 마우스 게놈내에 도입되고 연결 영역에서의 V(-D-)J 유전자 단편 재배열 무작위 뉴클레오티드 부가에 의해 생성된 부가적인 다양성에 의한 상이한 V, J 및 D 영역의 수에 따라, 약 1,000 가지 이상의 상이한 면역글로불린 (이상적으로는 IgG), 바람직하게는 104 내지 106 가지 이상의 상이한 면역글로불린이 생산될 것이다. 통상적으로, 이러한 면역글로불린은 소정의 항원에 대하여 약 10-7 M 미만, 예를 들어 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만, 심지어 보다 낮은 친화도 (KD)를 나타낼 것이다.
트랜스제닉 및 트랜스크로모조멀 비인간 동물, 예를 들어 마우스를 상기 기재된 바와 같이 예를 들어, CD20을 발현하는 세포로 면역화할 수 있다. 별법으로, 트랜스제닉 동물을 인간 CD20을 코딩하는 DNA로 면역화할 수 있다. 그러면, 동물은 전환 재조합 (시스-전환)을 통해 클래스-전환을 거쳐 CD20에 반응성인 면역글로불린을 발현하는 B 세포를 생산할 것이다. 면역글로불린은 인간 항체 ("인간 서열 항체"라고도 불림)일 수 있으며, 여기서 그의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 체세포 돌연변이 및 V 영역 재조합 연결에 의해 유도되는 서열, 뿐만 아니라 생식계-코딩된 서열을 포함할 수 있는 인간 트랜스진 서열에 의해 코딩되며, 이러한 인간 항체는 체세포 돌연변이 및 상이한 V-J 및 V-D-J 재조합 연결의 결과로서 다른 비-생식계 서열이 존재할 수 있을지라도, 인간 VL 및 JL 또는 VH, DH 및 JH 유전자 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 것으로 언급될 수 있다. 각 항체 사슬의 가변 영역은 통상적으로 인간 생식계 V, J, 및 중쇄의 경우에는 D 유전자 단편과 80% 이상 유사하고, 종종 트랜스진 상에 존재하는 인간 생식계 서열과 85% 이상 유사하며, 흔히 트랜스진 상에 존재하는 인간 생식계 서열과 90 또는 95% 이상 유사하다. 그러나, 비-생식계 서열은 체세포 돌연변이 및 VJ 및 VDJ 연결에 의해 도입되기 때문에, 인간 서열 항체는 흔히 마우스 생식계 내의 인간 트랜스진(들) 내에서 발견되는 인간 V, D 또는 J 유전자 단편에 의해 코딩되지 않는 일부 가변 영역 서열을 가질 것이다. 통상적으로, 이러한 비-생식계 서열 (또는 각각의 뉴클레오티드 위치)은 CDR 내 또는 그 근처, 또는 체세포 돌연변이가 밀집되어 있는 것으로 알려진 영역내에 밀집되어 있을 것이다.
본 발명의 다른 면은, 본원에 기술된 것과 같은 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 비인간 동물로부터 유래된 B 세포를 포함한다. B 세포는 높은 친화도 (예를 들어, 10-7 M 미만의 해리 평형 상수 (KD))로 인간 CD20에 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현하는 하이브리도마를 생성하는데 사용될 수 있다. 따라서, 다른 실시태양에서 본 발명은 방사능-활성 표지된 모노클로날 항체를 사용하는 CD20 발현 세포의 스캐차드 분석, 또는 FACS 분석을 사용한 1/2-최대 결합 농도의 측정으로 결정했을 때 10-7 M 미만, 예를 들어 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만, 또는 심지어 그보다 낮은 친화도 (KD)를 갖는 인간 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다.
여기서 모노클로날 항체는 (1) 인간 VL 유전자 단편 및 인간 JL 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역, 및 (2) 인간 CL 유전자 단편에 의해 코딩되는 경쇄 불변 영역으로 이루어진 인간 경쇄; 및
(1) 인간 VH 유전자 단편, D 영역, 및 인간 JH 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 (2) 인간 CH 유전자 단편에 의해 코딩되는 불변 영역으로 이루어진 인간 중쇄를 포함한다.
CD20에 대한 고친화도 인간 모노클로날 항체의 생성은 삽입된 인간 면역글로불린 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비인간 동물의 인간 가변 영역 유전자 단편의 레파토리를 확장하는 방법에 의해 용이해지며, 이 방법은 상기 삽입된 인간 면역글로불린 트랜스진에는 존재하지 않는 V 영역 유전자 단편을 포함하는 V 유전자 트랜스진을 게놈내에 도입하는 것을 포함한다. 흔히, V 영역 트랜스진은 인간 게놈에서 자연적으로 발생하거나 재조합법에 의해 별도로 함께 스플라이싱될 수 있기 때문에, 손상된 (out-of-order) V 유전자 단편을 포함할 수 있거나 V 유전자 단편이 생략되어 있을 수 있는 인간 VH 또는 VL (Vκ) 유전자 단편 어레이의 일부를 포함하는 효모 인공 염색체이다. 종종 5개 이상의 기능성 V 유전자 단편이 YAC 상에 포함된다. 이 방법의 변형법에서, V 레파토리 확장법으로 생산되는 트랜스제닉 동물을 만들 수 있으며, 이 동물은 V 영역 트랜스진상에 존재하는 V 영역 유전자 단편에 의해 코딩되는 가변 영역 서열, 및 인간 Ig 트랜스진 상에 코딩되어 있는 C 영역을 포함하는 면역글로불린 사슬을 발현한다. V 레파토리 확장법으로 5개 이상의 다른 V 유전자를 갖는 트랜스제닉 동물을 생성할 수 있으며, 약 24개 이상의 V 유전자를 포함하는 동물도 만들 수 있다. 일부 V 유전자 단편은 비-기능적일 수 있으며 (예를 들어, 슈도진 (pseudogene) 등), 이러한 단편은 보유될 수 있거나 또는 원한다면 당업자에게 공지된 재조합법으로 선별적으로 결실될 수 있다.
일단 J 및 C 유전자 단편을 포함하는 인간 Ig 트랜스진에는 실질적으로 존재하지 않는 확장된 V 단편 레파토리를 갖는 기능적 YAC을 포함하도록 마우스 생식계를 조작하면, 유전형질 (trait)은 확장된 V 단편 레파토리를 갖는 기능적 YAC이 다른 인간 Ig 트랜스진을 갖는 비인간 동물 생식계내에서 증식하는 백그라운드 (background)를 비롯한 기타 유전적 백그라운드 내로 전파되고 번식될 수 있다. 확장된 V 단편 레파토리를 갖는 다수의 기능적 YAC은, 생식계에 도입되어 인간 Ig 트랜스진 (또는 다수의 인간 Ig 트랜스진)과 함께 작용할 수 있다. 본원에서는 YAC 트랜스진으로 불리지만, 게놈내로 삽입되는 경우 이러한 트랜스진에는 효모에서의 자가 복제에 필요한 서열과 같은 효모 서열이 실질적으로는 결실되어 있을 수 있으며, 이러한 서열은 효모에서의 복제가 더 이상 필요하지 않게 된 다음 (즉, 마우스 ES 세포 또는 마우스 전수정란 (prozygote)으로의 도입에 앞서) 유전자 조작 (예를 들어, 제한효소 분해 및 펄스-필드 (pulsed-field) 겔 전기영동, 또는 다른 적합한 방법)에 의해 임의로 제거될 수 있다. 인간 서열 면역글로불린의 발현 형질을 전파시키는 방법은 인간 Ig 트랜스진(들), 및 임의로 확장된 V 단편 레파토리를 갖는 기능적 YAC을 갖는 트랜스제닉 동물을 사육하는 것을 포함한다. VH 및 VL 유전자 단편은 둘 다 YAC 상에 존재할 수 있다. 이 트랜스제닉 동물을 인간 Ig 트랜스진 및(또는) 인간의 다른 림프구 단백질을 코딩하는 트랜스진을 비롯한 인간의 다른 트랜스진을 보유하는 백그라운드를 포함하여 당업자에 의해 요구되는 특정 백그라운드에서 증식시킬 수 있다. 본 발명은 또한 확장된 V 영역 레파토리 YAC 트랜스진을 갖는 트랜스제닉 마우스에 의해 생산되는 고친화도 인간 서열 면역글로불린을 제공한다. 상기에는 본 발명의 트랜스제닉 동물의 바람직한 실시양태에 대하여 기술되어 있지만, 하기의 3가지 카테고리로 분류된 다른 실시태양도 본 발명에서 고려된다.
I. 재배열되지 않은 중쇄 및 재배열된 경쇄 면역글로불린 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 동물,
II. 재배열되지 않은 중쇄 및 재배열되지 않은 경쇄 면역글로불린 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 동물; 및
III. 재배열된 중쇄 및 재배열되지 않은 경쇄 면역글로불린 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 동물.
이러한 트랜스제닉 동물 카테고리 중에서, 바람직한 우선 순서는 II > I > III (여기서, 내인성 경쇄 유전자 (또는 적어도 K 유전자)는 상동 재조합 (또는 다른 방법)에 의해 녹아웃됨) 및 I > II > III (여기서, 내인성 경쇄 유전자는 녹아웃되지 않았으며 대립유전자 배제에 의해 우성화되어야 함)이다.
III
.
CD20
에 결합하는
이중특이적
/다중특이적 분자
본 발명의 또 다른 실시태양에서, CD20에 대한 인간 모노클로날 항체를 유도체화시키거나 다른 기능성 분자, 예를 들어 다른 펩티드 또는 단백질 (예컨대, Fab' 단편)에 연결하여 다수의 결합 부위 또는 표적 에피토프와 결합하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 하나 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결 (예를 들어 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유결합 또는 다른 방식으로)시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 CD20에 대한 하나 이상의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 및 다중특이적 분자를 포함한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 제2 표적 에피토프는 Fc 수용체, 예를 들어 인간 FcγRI (CD64) 또는 인간 Fcα 수용체 (CD89), 또는 T 세포 수용체, 예를 들어 CD3이다. 따라서, 본 발명은 FcγR, FcαR 또는 FcεR 발현 이펙터 세포 (예를 들어 단핵구, 마크로파지 또는 다형핵 세포 (PMN)), 및 CD20을 발현하는 표적 세포 둘 다에 결합할 수 있는 이중특이적 및 다중특이적 분자를 포함한다. 이러한 이중특이적 및 다중특이적 분자는 CD20 발현 세포를 이펙터 세포에 표적화하며, 본 발명의 인간 모노클로날 항체처럼 Fc 수용체-매개 이펙터 세포의 활성, 예를 들어 CD20 발현 세포의 식세포작용, 항체 의존성 세포매개 세포독성 (ADCC), 사이토카인 방출 또는 수퍼옥사이드 음이온 생성을 유발할 수 있다.
본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 항-Fc 결합 특이성 또는 항-CD20 결합 특이성 이외에도 제3의 결합 특이적 부위를 추가로 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 제3의 결합 특이적 부위는 항-상승인자 (EF) 부위, 예를 들어 세포독성 활성에 관여하는 표면 단백질에 결합함으로써 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있는 분자이다. "항-상승인자 (EF) 부위"는 소정의 분자, 예를 들어 항원 또는 수용체와 결합함으로써 Fc 수용체 또는 표적세포 항원에 대한 결합 결정부위의 효과를 상승시키는 항체, 기능성 항체 단편 또는 리간드일 수 있다. "항-상승인자 부위"는 Fc 수용체 또는 표적세포 항원과 결합할 수 있다. 별법으로, 항-상승인자 부위는 제1 및 제2 결합 특이적 부위가 결합하는 물질과는 다른 물질에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항-상승 인자 부위는 세포독성 T-세포에 결합할 수 있다 (예를 들어, 표적세포에 대한 면역 반응의 증가를 일으키는 CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 또는 다른 면역 세포를 통해).
하나의 실시태양에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 결합 특이적 부위로서 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일 사슬 Fv를 비롯하여 하나 이상의 항체를 포함한다. 항체는 미국 특허 제4,946,778호 (Ladner 등)에 기재된 것과 같은 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 Fv나 단일 사슬 구조물과 같은 그의 임의의 최소 단편일 수도 있다. 항체는 또한, US 2003/0118592 및 US 2003/0133939에 개시된 바와 같이 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질일 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 이펙터 세포의 표면 상에 존재하는 FcγR 또는 FcαR에 대한 결합 특이적 부위, 및 표적 세포 항원, 예를 들어 CD20에 대한 제2의 결합 특이적 부위를 포함한다.
하나의 실시태양에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이적 부위는 인간 모노클로날 항체에 의해 제공되고, 이 항체의 결합은 인간 면역글로불린 G (IgG)에 의해 차단되지 않는다. 본원에 사용된 "IgG 수용체"라는 용어는 1번 염색체상에 위치하는 8개의 γ-사슬 유전자들 중 임의의 것을 의미한다. 이 유전자들은 3가지 Fcγ 수용체 클래스, 즉 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)로 분류되는 총 12가지의 막횡단 또는 가용성 수용체 이소형을 코딩한다. 바람직한 한 실시태양에서, Fcγ 수용체는 인간의 고친화도 FcγRI이다.
이와 같은 바람직한 모노클로날 항체의 생산 및 특징 규명은 WO88/00052호 (Fanger 등) 및 미국 특허 제4,954,617호에 기재되어 있다. 이들 항체는 수용체의 Fcγ 결합 부위와는 다른 부위에서 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII의 에피토프에 결합하므로, 이들의 결합은 생리학적 수준의 IgG에 의해서 실질적으로 차단되지 않는다. 본 발명에 유용한 특정 항-FcγRI 항체는 mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 및 mAb 197이다. 기타 실시태양에서, 항-Fcγ수용체 항체는 모노클로날 항체 22의 인간화 형태이다 (H22). H22 항체의 생산 및 특징 규명은 문헌 [Graziano R. F. et al . (1995) J. Immunol 155 (10):4996-5002] 및 WO94/10332에 기재되어 있다. H22 항체 생산 세포주는 1992년 11월 4일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)에 HA022CL1이란 명칭으로 기탁되어 기탁번호 CRL 11177을 배정받았다.
또 다른 바람직한 실시태양에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성은 인간 IgA 수용체, 예를 들어 Fc-알파 수용체 (FcαRI (CD89))에 결합하는 항체에 의해 제공되고, 이 항체의 결합은 인간 이뮤노글로불린 A (IgA)에 의해 차단되지 않는 것이 바람직하다. "IgA 수용체"란 용어는 19번 염색체 상에 위치하는 하나의 α-유전자의 유전자 산물 (FcαRI)을 포함하는 의미이다. 이 유전자는 55 내지 110 kDa 크기의 얼터네이티브 (alternative) 스플라이싱된 여러 가지의 막횡단 이소형을 코딩하는 것으로 알려져 있다. FcαRI (CD89)는 단핵구/마크로파지, 호산구 및 호중구 과립구에서는 항시적으로 발현되지만, 비-이펙터 세포 집단에서는 발현되지 않는다. FcαRI는 IgA1 및 IgA2 둘 다에 대하여 중간 친화도를 갖는데, 이는 G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 사이토카인에 노출되는 경우에 증가한다 (Morton, H. C. et al . (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440). IgA 리간드 결합 도메인의 외부 FcαRI과 결합하는, A3, A59, A62 및 A77로 동정된 4가지의 FcαRI-특이적 모노클로날 항체는 문헌 [Monteiro, R. C. et al ., 1992, J. Immunol . 148:1764]에 기재되어 있다.
FcαRI 및 FcγRI는 (1) 주로 면역 이펙터 세포, 예컨대 단핵구, PMN, 마크로파지 및 수상 세포 상에서 발현되고; (2) 높은 수준으로 발현되고 (예를 들어, 세포 당 5,000-100,000); (3) 세포독성 활성 (예를 들어 ADCC, 식세포작용)의 매개자이고; (4) 그들에 표적화되는 자가-항원을 비롯한 항원의 상승된 항원 제시를 매개하기 때문에 본 발명에 사용하기에 바람직한 유발 수용체이다.
다른 실시태양에서, 이중특이적 분자는 한 항체는 CDC를 유도함으로써 주로 작용하고 다른 항체는 아폽토시스를 유도함으로써 주로 작용하는 것과 같이, 상보적인 기능적 활성을 갖는 본 발명에 따른 2가지의 인간 모노클로날 항체, 예를 들어, 11B8와 조합된 2F2가 포함된다.
기타 실시태양에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 표적 세포 항원, 예를 들어 CD20을 인식하여 그에 결합하는 결합 특이적 부위를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 결합 특이적 부위는 본 발명의 인간 모노클로날 항체에 의해 제공된다.
본 명세서에 사용된 "이펙터 세포 특이적 항체"는 이펙터 세포의 Fc 수용체에 결합하는 항체 또는 기능성 항체 단편을 지칭한다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 항체는 내인성 면역글로불린에 의해 결합되지 않은 부위에서 이펙터 세포의 Fc 수용체에 결합한다.
본원에 사용된 "이펙터 세포"라는 용어는, 면역 반응의 인식 및 활성화 단계와 대립되는 면역 반응의 이펙터 단계에 관여하는 면역 세포를 의미한다. 예시적인 면역 세포에는 골수 또는 림프 기원의 세포, 예를 들어 림프구 (예컨대, 세포독성 T 세포 (CTL)를 비롯한 B 세포 및 T 세포), 살세포 (killer cell), 자연 살세포, 마크로파지, 단핵구, 호산구, 호중구, 다형핵 세포, 과립구, 비만 (mast) 세포 및 호염구가 포함된다. 일부 이펙터 세포는 특정 Fc 수용체를 발현하며 특정 면역 기능을 수행한다. 바람직한 실시양태에서, 이펙터 세포는 항체-의존성 세포독성 (ADCC)을 유도할 수 있는데, 예를 들어 호중구는 ADCC를 유도할 수 있다. 예를 들어, FcR을 발현시키는 단핵구, 마크로파지는 표적 세포를 특이적으로 사멸시키거나, 항원을 면역계의 다른 성분에 제시하거나, 항원을 제시하는 세포에 결합하는 것에 관여한다. 기타 실시태양에서, 이펙터 세포는 표적 항원, 표적 세포 또는 미생물을 식세포작용할 수 있다. 이펙터 세포 상의 특정 FcR의 발현은 사이토카인과 같은 체액성 인자에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, FcγRI의 발현은 인터페론 감마 (IFN-γ)에 의해 상향조절되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 상승된 발현은 표적에 대한 FcγRI-보유 세포의 세포독성 활성을 증가시킨다. 이펙터 세포는 표적 항원 또는 표적 세포를 식세포작용하거나 용해시킬 수 있다.
"표적 세포"는 대상 (예를 들어, 인간 또는 동물)에서 본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 모노클로날 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 분자)에 의해 표적화될 수 있는 바람직하지 않은 임의의 세포를 의미한다. 바람직한 실시태양에서, 표적 세포는 CD20을 과다발현하는 세포이다. CD20을 발현하는 세포는 통상적으로, B 세포 및 B 세포 종양을 포함한다.
인간 모노클로날 항체가 바람직하지만, 본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체로는 쥐, 키메릭 및 인간화 모노클로날 항체가 있다. 이러한 쥐, 키메릭 및 인간화 모노클로날 항체는 당 분야에 공지된 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 화학적 기술 (예를 들어, 문헌 [D. M. Kranz et al . (1981) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:5807] 참조), "폴리도마 (polydoma)" 기술 (미국 특허 제4,474,893호 (Reading) 참조), 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
특히, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 당업계에 공지되어 있으며 본 명세서에 기재된 실시예에 기재되어 있는 방법을 이용하여 성분 결합 특이적 부위, 예를 들어 항-FcR 및 항-CD20 결합 특이적 부위를 콘쥬게이션하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 및 다중특이적 분자의 각 결합 특이적 부위를 별도로 생성시킨 다음 서로 콘쥬게이션시킬 수 있다. 결합 특이적 부위가 단백질 또는 펩티드인 경우, 다양한 커플링 또는 가교결합제를 사용하여 공유결합적으로 콘쥬게이션시킬 수 있다. 가교결합제의 예로는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 들 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Karpovsky et al . (1984) J. Exp . Med . 160:1686; Liu, MA et al . (1985) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82:8648] 참조). 다른 방법으로는 문헌 [Paulus, Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132); Brennan et al . (Science (1985) 229:81-83), 및 Glennie et al. (J. Immunol . (1987) 139:2367-2375)]에 기재된 것들이 포함된다. 바람직한 콘쥬게이션 시약은 피어스 케미칼 사 (Pierce Chemical Co., 일리노이주 락포드)로부터 입수할 수 있는 SATA 및 술포-SMCC이다.
결합 특이적 부위가 항체인 경우, 이들은 2개의 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술프히드릴 결합을 통해 콘쥬게이션시킬 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에서는, 콘쥬게이션 전에 힌지 영역을 홀수, 바람직하게는 1개의 술프히드릴 잔기를 포함하도록 변형시킨다.
별법으로, 두 결합 특이적 부위가 동일한 벡터 내에서 코딩되고, 동일한 숙주 세포 내에서 발현되어 조립되도록 할 수 있다. 이 방법은 이중특이적 및 다중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자, 예를 들어 이중특이적 분자는 단일 사슬 분자, 예를 들어 단일 사슬 이중특이적 항체, 하나의 단일 사슬 항체 및 결합 결정부위를 포함하는 단일 사슬 이중특이적 분자, 또는 2개의 결합 결정부위를 포함하는 단일 사슬 이중특이적 분자일 수 있다. 또한, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 단일 사슬 분자이거나 2개 이상의 단일 사슬 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어, 미국 특허제5,260,203호; 미국 특허 제5,455,030호; 미국 특허 제4,881,175호; 미국 특허 제5,132,405호; 미국 특허 제5,091,513호; 미국 특허 제5,476,786호; 미국 특허 제5,013,653호; 미국 특허 제5,258,498호; 및 미국 특허 제5,482,858호에 기재되어 있다.
이중특이적 및 다중특이적 분자의 특이적 표적과의 결합은 효소-결합된 면역흡착 검정법 (ELISA), 방사선 면역검정법 (RIA), FACS 분석, 생검 (예를 들어, 생장 억제), 또는 웨스턴 블롯 검정법에 의해 확인할 수 있다. 이러한 각각의 검정법은 일반적으로 관심 대상인 복합체에 대해 특이적인 표지된 시약 (예를 들어, 항체)을 사용하여 관심 대상인 특정 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들어, FcR-항체 복합체는 예컨대, 항체-FcR 복합체를 인식하여 특이적으로 결합하는 효소-결합 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출할 수 있다. 별법으로, 복합체는 임의의 다양한 다른 면역검정법을 이용하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 항체를 방사성 물질로 표지하고 방사선 면역검정법 (RIA)에 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay 기술s, The Endocrine Society, March, 1986] 참조). 방사성 동위원소는 γ카운터 또는 섬광계수기를 사용하거나, 오토라디오그래피의 사용과 같은 방법에 의해 검출할 수 있다.
IV
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면역콘쥬게이트
다른 측면에서, 본 발명은 치료 잔기, 예를 들어 세포독소, 약물 (예를 들어, 면역억제제) 또는 방사성 동위원소에 콘쥬게이트된 인간 항-CD20 모노클로날 항체임을 특징으로 한다. 상기 콘쥬게이트를 본원에서는 "면역콘쥬게이트"로 지칭한다. 하나 이상의 세포독소를 포함하는 면역콘쥬게이트를 "면역독소"라고 지칭한다. 세포독소 또는 세포독성제에는 세포에 해로운 (예를 들어, 세포를 사멸시키는) 임의의 물질이 포함된다. 이들의 예로는 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 마이토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미토잔트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 푸로마이신, 및 이들의 유사체 또는 상동체를 들 수 있다.
본 발명의 면역콘쥬게이트를 형성하는데 적합한 치료제로는 항-대사물질 (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토푸린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예를 들어, 메클로르에타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 마이토마이신 C 및 시스-디클로로디아민 플래티늄(II) (DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린 (예를 들어, 다우노루비신 (종전에는 다우노마이신이라 함) 및 독소루비신), 항생제류 (예를 들어, 닥티노마이신 (종전에는 악티노마이신이라 함), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항-유사분열제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 바람직한 실시태양에서, 치료제는 세포독성제 또는 방사성독성제이다. 다른 실시태양에서, 치료제는 면역억제제이다. 또 다른 실시태양에서, 치료제는 GM-CSF이다. 바람직한 실시태양에서, 치료제는 독소루비신, 시스플라틴, 블레오마이신, 술페이트, 카르무스틴, 클로람부실, 시클로포스파미드 또는 리신 A이다.
또한, 본 발명의 항체를 방사성 동위원소, 예를 들어 요오드-131, 이트륨-90 또는 인듐-111에 콘쥬게이션시켜 CD20-관련 질환, 예를 들어 암을 치료하기 위한 세포독성 방사성 약제를 제조할 수 있다. 본 발명의 항체 콘쥬게이트를 사용하여 주어진 생물학적 반응을 변화시킬 수 있으며, 약물 잔기가 통상의 화학 치료제에 한정되는 것으로 생각해서는 안된다. 예를 들어, 약물 잔기는 바람직한 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질로는 예를 들어 효소적으로 활성인 독소 또는 그의 활성 단편, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예를 들어 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ; 또는 생물학적 반응 변경제, 예를 들어 림포카인, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF"), 또는 기타 성장 인자가 포함될 수 있다.
이러한 치료 잔기를 항체에 연결시키는 기술은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Arnon et al ., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al . (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapy Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al ., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)] 참조.
추가의 실시태양에서, 본 발명에 따른 인간 모노클로날 항체는 항체를 방사성 동위원소에 콘쥬게이션시키는 링커-킬레이터, 예를 들어 티욱세탄에 결합된다.
V. 제약 조성물
다른 측면으로, 본 발명은 본 발명의 인간 모노클로날 항체 중 하나 또는 그의 조합을 포함하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물을 제공한다. 이 제약 조성물은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995]에 기술된 바와 같이 통상적인 기술에 따라, 제약학상 허용되는 담체 또는 희석제, 및 기타 임의의 보강제 및 부형제와 제제화될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 조성물은 상이한 메커니즘으로 작용하는 다수 (예를 들어, 둘 이상)의 단리된 본 발명의 인간 항체의 조합을 포함하는데, 예를 들면 CDC를 유도함으로써 주로 작용하는 하나의 항체를 아폽토시스를 유도함으로써 주로 작용하는 다른 항체와 함께 포함한다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 병행 요법에, 즉 다른 약제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 병행 요법은 하나 이상의 항염증제 또는 하나 이상의 면역억제제와 함께 본 발명 조성물을 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 치료제는 하나 이상의 항염증제, 예를 들어 스테로이드제 또는 NSAID (비스테로이드성 항염증제)를 포함한다. 바람직한 약물은 예를 들어, 아스피린 및 기타 살리실레이트, Cox-2 억제제, 예를 들어 로페콕시브 (바이옥스) 및 셀레콕시브 (세레브렉스), NSAID, 예를 들어 이부프로펜 (모트린, 아드빌), 페노프로펜 (날폰), 나프록센 (나프로신), 술린닥 (클리노릴), 디클로페낙 (볼타렌), 피록시캄 (펠덴), 케토프로펜 (오루디스), 디플루니살 (돌로비드), 나부메톤 (렐라펜), 에토돌락 (로딘), 옥사프로진 (데이프로), 및 인도메타신 (인도신)을 포함한다.
다른 실시태양에서, 상기 치료제는 하나 이상의 DMARD, 예를 들어 메토트렉세이트 (류마트렉스), 히드록시클로로퀸 (플라퀘닐), 술파살라진 (아술피딘), 피리미딘 합성 억제제, 예를 들어 레플루노미드 (아라바), IL-1 수용체 차단제, 예를 들어 아나킨라 (키네레트), 및 TNF-α 차단제, 예를 들어 에타네르셉트 (엔브렐), 인플릭시마브 (레미케디드) 및 아달리무마브를 포함한다.
다른 실시태양에서, 상기 치료제는 하나 이상의 면역억제제, 예를 들어 사이클로스포린 (산디뮨, 네오랄) 및 아자티오프린 (이뮤랄)을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 치료제는 하나 이상의 화학치료제, 예를 들면 독소루비신 (아드리아마이신), 시스플라틴 (플라티놀), 블레오마이신 (블레녹산), 카르무스틴 (글리아델), 시클로포스파미드 (시톡산, 프로사이톡스, 네오살), 및 클로람부실 (류케란)을 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 클로람부실 및 프레드니솔론; 시클로포스파미드 및 프레드니솔론; 시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손; 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 독소루비신 및 프레드니손; 플루다라빈 및 안트라사이클린과 함께; 또는 예를 들어, 비호지킨 림프종에 대해 공지된 바와 같이 (Making sense of Diagnosis, Treatment, and Options, Lorraine Johnston, 1999, O'Reilly and Associates, Inc.), NHL에 대한 기타 통상의 복합-약물 요법과 함께 투여될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 인간 항체는 방사능치료 및(또는) 자가 말초 줄기 세포 또는 골수 이식과 함께 투여될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 인간 항체는 항-CD25 항체, 항-CD19 항체, 항-CD21 항체, 항-CD22 항체, 항-CD37 항체, 항-CD38 항체, 항-IL6R 항체, 항-IL8 항체, 항-IL15 항체, 항-IL15R 항체, 항-CD4 항체, 항-CD11a 항체 (예를 들어, 에팔리주마브), 항-알파-4/베타-1 인테그린 (VLA4) 항체 (예를 들어, 나탈리주마브), 및 CTLA4-Ig로부터 선택된 하나 이상의 항체와 함께 투여될 수 있다.
특정 실시태양에서, 인간 모노클로날 항체는 예를 들어 이식편-대-숙주 질환 환자의 수포성 천포창의 치료를 위해 항-CD25 항체와 함께 투여될 수 있다.
다른 특정 실시태양에서, 인간 모노클로날 항체는 악성 질병을 치료하기 위해 항-CD19 항체, 항-CD21 항체, 항-CD22 항체, 항-CD37 항체 및 항-CD38 항체로부터 선택된 하나 이상의 항체와 함께 투여될 수 있다.
또한 다른 실시태양에서, 인간 항체는 염증성 질병을 치료하기 위해 항-IL6R 항체, 항-IL8 항체, 항-IL15 항체, 항-IL15R 항체, 항-CD4 항체, 항-CD 11a 항체 (예를 들어, 에팔리주마브), 항-알파-4/베타-1 인테그린 (VLA4) 항체 (예를 들어, 나탈리주마브) 및 CTLA4-Ig로부터 선택된 하나 이상의 항체와 함께 투여된다.
또한 추가의 실시태양에서, 인간 항체는 보체 활성화를 증강시키기 위해 항-C3b(i) 항체와 함께 투여될 수 있다.
본원에 사용된 "제약학상 허용되는 담체"는 생리학적으로 적합한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항-박테리아제 및 항-진균제, 등장성 약제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자를 산의 작용, 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 자연 조건으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅할 수 있다.
"제약학상 허용되는 염"은 모화합물의 바람직한 생물학적 활성을 보유하면서 임의의 바람직하지 않은 독성학적 효과를 부여하지 않는 염을 의미한다 (예를 들어, 문헌 [Berge, S. M., et al . (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 이러한 염의 예로는 산 부가염 및 염기 부가염이 포함된다. 산 부가염으로는 비독성 무기산, 예를 들어 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 및 포스포러스 등으로부터 유도된 것들 뿐만 아니라, 비독성 유기산, 예를 들어 지방족 모노- 및 디-카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유도된 것들이 포함된다. 염기 부가염으로는 알칼리 토금속, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유도된 것들 뿐만 아니라, 비독성 유기 아민, 예를 들어 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민 및 프로카인 등으로부터 유도된 것들이 포함된다.
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여할 수 있다. 당업자라면 투여 경로 및(또는) 방식이 원하는 결과에 따라 달라질 것임을 잘 알 것이다. 활성 화합물은 급속한 방출에 대하여 화합물을 보호하는 담체와 함께, 예를 들어 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 비롯한 조절 방출형 제제로 제조될 수 있다. 생분해성 및 생체적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가 무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 이러한 제제를 제조하는 방법들은 통상적으로 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978] 참조.
본 발명의 화합물을 특정 투여 경로로 투여하기 위해, 화합물의 불활성화를 방지하는 물질로 화합물을 코팅하거나, 이러한 물질과 화합물을 동시 투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 화합물을 적절한 담체, 예를 들어 리포좀 또는 희석제 중에 넣어 대상에게 투여할 수 있다. 제약학상 허용되는 희석제로는 염수 및 수성 완충액이 포함된다. 리포좀은 수중유중수 (water-in-oil-in-water) CGF 에멀젼 뿐만 아니라 통상의 리포좀을 포함한다 (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).
제약학상 허용되는 담체는 무균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 조제를 위한 무균 수용액 또는 분산액, 및 무균분말을 포함한다. 제약학상 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 시약의 용도는 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 시약이 활성 화합물과 상용불가능하지 않은 한, 상기 매질 또는 시약을 본 발명의 제약 조성물에 사용하는 것도 고려된다. 보충 활성 화합물 또한 조성물에 포함될 수 있다.
치료 조성물은 통상적으로 무균성이어야 하며, 제조 및 저장 조건하에 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 대해 적합한 다른 규칙적인 구조물로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어 레시틴과 같은 코팅을 이용하고, 분산액의 경우 필수적인 입지 크기를 유지하며, 계면활성제를 사용함으로써 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 많은 경우, 조성물 중에 등장성 물질, 예를 들어 슈가, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시켜 주사용 조성물의 흡수를 지연시킬 수 있다.
적절한 용매 중에 소정량의 활성 화합물을 상기 언급한 성분들 중 하나 또는 이들의 배합물과 함께 혼입시킨 다음 멸균 미세여과하여, 무균 주사용 용액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 염기성 분산 매질 및 상기 언급한 것들로부터 필요한 다른 성분을 포함하는 무균 비히클에 활성 화합물을 혼입시켜 분산액을 제조한다. 무균 주사용 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분, 및 미리 멸균-여과한 그의 용액으로부터의 임의의 추가적인 바람직한 성분의 분말을 생성하는 진공건조법 및 동결건조법 (동결건조)이다.
투여 요법을 조절하여 최적의 바람직한 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공한다. 예를 들어, 치료 상황의 요건에 따라 지시된 바와 같이, 단일 볼루스를 투여하거나, 여러 번으로 나누어 시간이 지남에 따라 투여하거나, 또는 투여량을 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수 있다. 투여를 용이하게 하고 투여량을 일정하게 하기 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태 (dosage unit form)로 제제화하는 것이 특히 이롭다. 본원에서 사용된 투여 단위 형태는 치료될 대상에 대하여 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 필요한 제약 담체와 함께 바람직한 치료 효과를 나타내도록 계산된 미리 정해진 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 세부사항은 (a) 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성하고자 하는 특정한 치료 효과, 및 (b) 개체에서의 감응성 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 기술에 있어서 당 분야에서의 고유한 제한에 의해 지시되며, 이들에 직접적으로 의존한다.
제약학상 허용되는 항산화제의 예로는 (1) 수용성 항산화제, 예를 들어 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소듐 비술페이트, 소듐 메타비술파이트 및 소듐 술파이트 등; (2) 유용성 항산화제, 예를 들어 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트 및 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예를 들어 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등이 포함된다.
치료 조성물의 경우, 본 발명의 제제로는 경구, 비강, 국소 (구강 및 설하 포함), 직장, 질내 및(또는) 비경구 투여에 적합한 것들이 포함된다. 제제는 단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있으며, 제약 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다. 단일 투여 제형을 제조하기 위해 담체 물질과 배합할 수 있는 활성 성분의 양은, 치료되는 대상 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여 제형을 제조하기 위해 담체 물질과 배합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로, 치료 효과를 나타내는 조성물의 양이다. 일반적으로, 100%로 했을 때 이 양은 약 0.01% 내지 약 99%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 1% 내지 약 30%의 활성 성분 범위이다.
또한, 질내 투여에 적합한 본 발명의 제제로는 당업계에 적절한 것으로 알려진 담체를 포함하는 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 분무 제제가 포함된다. 본 발명의 조성물의 국소 또는 경피 투여용 제형으로는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제가 포함된다. 무균 조건하에 활성 화합물을 제약학상 허용되는 담체, 및 필요에 따라 임의의 보존제, 완충제 또는 추진제와 함께 혼합할 수 있다.
본원에 사용된 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여된"이라는 구절은 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 일반적으로는 주사를 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수강내, 경막외 및 흉강내 주사 및 주입을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적절한 혼합물, 식물성유, 예를 들어 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트가 포함된다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용하고, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지하며, 계면활성제를 사용함으로써 적절한 유동성을 유지할 수 있다.
이러한 조성물은 보강제, 예를 들어 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 포함할 수도 있다. 상기 멸균 방법, 및 다양한 항-박테리아제 및 항-진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올 및 페놀 소르브산 등을 포함시키는 방법 둘 다에 의해 미생물 존재를 방지할 수 있다. 등장성 시약, 예를 들어 슈가 및 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시켜 주사용 약제 제형의 흡수를 지연시킬 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 피하 주사에 의해 결정형으로 투여될 수 있다 (Yang et al. (2003) PNAS , 100(12):6934-6939) 참조.
본 발명의 화합물을 인간 및 동물에게 약제로 투여하는 경우, 화합물을 단독으로 투여하거나, 제약학상 허용되는 담체를 함께 예를 들어 활성 성분 0.01 내지 99.5% (보다 바람직하게는, 0.1 내지 90%)를 포함하는 제약 조성물로서 투여할 수 있다.
선택된 투여 경로와 무관하게, 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물 및(또는) 본 발명의 제약 조성물은, 당업자에게 공지된 통상의 방법에 의해 제약학상 허용되는 투여 형태로 제제화한다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여 수준을 변화시켜, 대상에게 비독성이면서 특정 환자에게서 목적하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양, 조성 및 투여 방식을 결정할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시기, 사용된 특정 화합물의 배출 속도, 치료 지속 기간, 기타 약물, 사용된 특정 조성물과 함께 사용되는 화합물 및(또는) 물질, 치료될 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전체적인 건강 및 기존의 병력, 및 의료분야에 잘 알려진 인자 등을 비롯하여 다양한 약동학적 인자에 따라 달라질 것이다.
당업계의 통상의 기술을 가진 의사 또는 수의사라면 필요한 제약 조성물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 제약 조성물 중에 사용되는 본 발명의 화합물의 투여량을, 목적하는 치료 효과를 달성하기위해 요구되는 양보다 더 낮은 수준에서 출발하여, 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적합한 일일 투여량은 치료 효과를 나타내는 데 효과적인 가장 낮은 투여량에 해당하는 화합물의 양일 것이다. 이러한 효과적인 투여량은 일반적으로 상기 설명한 인자에 따라 좌우될 것이다. 투여는 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하, 바람직하게는 표적 부위 근처에 투여하는 것이 바람직하다. 필요에 따라, 치료 조성물의 효과적인 일일 투여량을 임의로 단위 투여 형태로 하루 동안 2회, 3회, 4회, 5회, 6회에 걸쳐 투여하거나, 적절한 간격으로 보다 여러 회에 걸쳐 분할 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물을 단독으로 투여할 수 있지만, 화합물을 제약 제제 (조성물) 형태로 투여하는 것이 바람직하다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 인간 모노클로날 항체는 10 내지 500 mg/m2, 예를 들어 200 내지 400 mg/m2의 매주 용량 (weekly dosage)으로 주입될 수 있다. 이러한 투여는 예를 들어 1 내지 8회, 예컨대 3 내지 5회로 반복될 수 있다. 투여는 2 내지 24시간, 예를 들어 2 내지 12시간의 주기에 걸쳐 지속적 주입으로 수행될 수 있다.
다른 실시태양에서, 인간 모노클로날 항체는 독성 부작용을 감소시키기 위해 장기간, 예를 들어 24시간 이상의 기간에 걸쳐 느린 지속적 주입으로 투여될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 인간 모노클로날 항체는 250 mg 내지 2000 mg, 예를 들어 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg 또는 2000 mg의 매주 용량으로 8회 이하, 예를 들어 4 내지 6회 동안 투여된다. 투여는 2 내지 24시간, 예를 들어 2 내지 12시간의 기간에 걸친 지속적 주입으로 수행될 수 있다. 이러한 요법은 필요하다면 1회 이상, 예를 들어 6개월 또는 12개월 후에 반복될 수 있다. 용량은 항-CD20 항체를 표적으로 하는 항-이디오타입 항체를 사용하여 생물학적 샘플에 항체를 투여했을 때 순환하는 모노클로날 항-CD20 항체의 양을 측정함으로써, 결정 또는 조정할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 인간 모노클로날 항체는 유지 요법 (maintenance therapy)으로 , 예를 들어 6개월 이상의 기간 동안 1주 1회 투여된다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명에 따른 인간 모노클로날 항체는 CD20에 대한 인간 모노클로날 항체를 1회 주입한 후, 방사성 동위원소에 콘쥬게이트된 CD20에 대한 인간 모노클로날 항체를 주입하는 것을 포함하는 요법으로 투여될 수 있다. 이 요법은 예를 들어, 7 내지 9일 후 반복될 수 있다.
치료 조성물을 당업계에 공지된 의료 디바이스 (device)와 함께 투여할 수 있다. 예를 들어 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 치료 조성물을 바늘없는 피하 주사 디바이스, 예를 들어 미국 특허 제5,399,163호; 동 제5,383,851호; 동 제5,312,335호; 동 제5,064,413호; 동 제4,941,880호; 동 제4,790,824호; 또는 동 제4,596,556호에 개시된 디바이스로 투여할 수 있다. 본 발명에 유용한 잘 알려진 임플란트 및 모듈의 예로는 미국 특허 제4,487,603호 (조절된 속도로 약물을 분배하는 이식가능한 미세-주입 펌프를 개시함); 동 제4,486,194호 (피부를 통해 약물을 투여하는 치료 디바이스를 개시함); 동 제4,447,233호 (정확한 주입 속도로 약물을 전달하는 약물 주입 펌프를 개시함); 동 제4,447,224호 (약물을 지속적으로 전달하기 위한 가변 유량의 이식가능한 주입 장치를 개시함); 동 제4,439,196호 (멀티-챔버 구획을 갖는 삼투성 약물 전달 시스템을 개시함); 및 동 제4,475,196호 (삼투성 약물 전달 시스템을 개시함)를 들 수 있다. 다수의 다른 임플란트, 전달 시스템 및 모듈은 당업자에게 공지되어 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 생체내에서 적절히 분포되도록 제제화할 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 고도로 친수성인 화합물을 배제한다. 본 발명의 치료 화합물이 확실히 BBB를 통과하도록 하기 위해 (필요하다면), 이들 화합물을 예를 들어 리포좀내에 제제화할 수 있다. 리포좀의 제조 방법에 대하여는 예를 들어, 미국 특허 제4,522,811호; 동 제5,374,548호; 및 동 제5,399,331호를 참조한다. 리포좀은 특정 세포 또는 기관내로 선택적으로 운반되는 하나 이상의 잔기를 포함할 수 있으므로, 표적화된 약물 전달을 향상시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [V. V. Ranade (1989) J Clin . Pharmacol . 29:685] 참조). 표적화 잔기의 예로서 폴레이트 또는 바이오틴 (예를 들어, 미국 특허 제5,416,016호 (Low 등) 참조); 만노시드 (Umezawa et al ., (1988) Biochem . Biophys. Res . Commun. 153:1038); 항체 (P. G. Bloeman et al . (1995) FEBS Lett . 357:140; M. Owais et al . (1995) Antimicrob . Agents Chemother. 39:180); 계면활성제 단백질 A 수용체 (Briscoe et al . (1995) Am . J Physiol . 1233:134) (그의 여러 종은 본 발명의 제제뿐만 아니라 본 발명의 분자 성분을 포함할 수 있음); p120 (Schreier et al . (1994) J. Biol . Chem . 269:9090)이 포함된다. 또한, 문헌 [K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett . 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273] 참조. 본 발명의 하나의 실시태양에서 본 발명의 치료 화합물을 리포좀내에 제제화하고, 보다 바람직한 실시태양에서는 리포좀이 표적화 잔기를 포함한다. 가장 바람직한 실시태양에서, 리포좀내 치료 화합물을 볼루스 주사로 종양 부위, 또는 염증이나 감염 부위 근처로 전달한다. 조성물은 주사 투여가 용이할 정도로 유동성이어야 한다. 조성물은 제조 및 저장 조건하에 안정해야 하며, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보호해야 한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 태반을 통해 전달되는 것을 예방 또는 감소시키기 위해 제제화될 수 있다. 이는 당 분야에 공지된 방법, 예를 들어 항체의 페길레이션 (PEGylation) 또는 F(ab)2' 단편을 사용함으로써 달성될 수 있다. 또한, 문헌 [Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation. J Immunol Methods. 152:177-190; 및 Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann Allergy Asthma Immunol 74:279-283]을 참고할 수 있다. 이는 특히, 항체가 재발성 자연 유산을 치료 또는 예방하는데 유용한 경우 적합하다.
종양 치료에 대한 "치료적 유효량"은 완전하거나 부분적일 수 있는 객관적인 종양 반응으로 측정될 수 있다. 완전한 반응 (CR)은 질병의 임상적, 방사선학적 또는 기타 증거로서 정의된다. 부분적인 반응 (PR)은 종양 덩어리 크기가 50% 이상 감소하는 것이다. 진행에 대한 중간 시간이 객관적인 종양 반응의 지속을 특징화하는 척도이다.
종양 치료에 대한 "치료적 유효량"은 질병의 진행을 안정화시키는 능력으로도 측정할 수 있다. 화합물의 암을 억제하는 능력은 인간 종양에서의 효과를 예측하기 위한 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 별법으로, 조성물의 이러한 성질은 당 분야의 숙련자에게 공지된 시험관내 검정법으로 화합물이 세포 성장 또는 아폽토시스를 억제하는 능력을 검사함으로써 평가할 수 있다. 치료 화합물의 치료적 유효량은 종양 크기를 감소시키거나, 아니면 대상에서의 증상을 개선시킬 수 있다. 당업자는 대상의 크기, 대상에게서 증상의 심도 및 특정 조성물 이나 선택된 투여 경로와 같은 인자에 기초하여, 유효량을 결정할 수 있을 것이다.
류마티스 관절염에 대한 "치료적 유효량"은 바람직하게는, 환자에게 ACR20 예비적 개선 정의 (Preliminary Definition of Improvement), 보다 바람직하게는 ACR50 예비적 개선 정의, 더욱 더 바람직하게는 ARC70 예비적 개선 정의를 야기할 것이다.
ACR20 예비적 개선 정의는 압통 관절 카운트 (Tender Joint Count, TCJ) 및 부종 관절 카운트 (Swollen Joint Count, SWJ)의 ≥20%의 개선; 및 환자 통증 평가 (Patient Pain Assessment, VAS), 환자의 전반적 평가 (Patient Global assessment, VAS), 의사의 전반적 평가 (Physician Global Assessment, VAS), 환자의 자가-평가 장애 (Patent Self-Assessed Disability, HAQ), 급성기 반응물질 (Acute Phase Reactant, CRP 또는 ESR)의 5가지 평가 항목 중 3가지에서 ≥20% 개선으로 정의된다.
ACR50 및 ACR70은 각각 ≥50% 및 ≥70% 개선과 같은 방식으로 정의된다. 보다 자세한 사항은 문헌 [Felson et al ., in American College of Rheumatology Preliminary Definition of Improvement in Rheumatoid Arthritis; Arthritis Rheumatism (1995) 38:727-735]을 참조한다.
조성물은 무균상태이어야 하며, 주사기로 조성물을 전달할 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 물 이외에 담체는 등장성 완충 염수 용액, 에탄올, 폴리올 (예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제를 사용하고, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지하며, 계면활성제를 사용함으로써, 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 많은 경우 등장성 시약, 예를 들어 슈가, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직하다. 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물에 포함시켜 주사용 조성물이 장기간에 걸쳐 흡수되도록 할 수 있다.
활성 화합물이 적합하게는 상기와 같이 보호되는 경우, 화합물은 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체와 함께 경구로 투여될 수 있다.
VI
. 본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 인간 항체 (면역콘쥬게이트, 이중특이적/다중특이적, 조성물 및 기타 유도체를 비롯한)는, CD20을 발현하는 세포와 관련된 질환의 진단 및 치료와 관련된 다수의 시험관내, 생체내 진단 및 치료 유용성을 갖는다. 예를 들어, 항체는 예컨대 시험관내 또는 생체외에서 배양 중의 세포, 또는 예컨대 인간 대상의 생체내에 투여하여 다양한 질환을 치료, 예방 또는 진단할 수 있다. 본원에 사용된 "대상"이라는 용어는, CD20에 대한 인간 항체에 반응하는 인간 및 비인간 동물을 포함하는 의미이다. 바람직한 대상은 B 세포 (정상 또는 악성)의 억제 또는 조절로 치료 또는 개선될 수 있는 질환을 갖는 인간 환자를 포함한다.
예를 들어 하나의 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 종양성 질환, 예를 들어 B 세포 림프종, 예를 들어 NHL을 비롯한 CD20을 발현하는 종양 세포의 존재를 특징으로 하는 질환이 있는 대상을 치료하는데 사용될 수 있다. 치료하고(하거나) 예방할 수 있는 종양성 질병의 예로서 B 세포 림프종, 예를 들어 전구체 B 세포 림프아구성 백혈병/림프종 및 성숙 B 세포 종양을 비롯한 NHL, 예를 들어 B 세포 만성 림프구성 백혈병 (CLL)/소림프구성 림프종 (SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 외투 세포 림프종 (MCL), 낮은 악성도, 중등-악성도 및 높은-악성도의 FL을 포함하는 여포성 림프종 (FL), 피부 여포 중심 림프종, 변연대 B 세포 림프종 (MALT 타입, 결절 및 비장 타입), 모세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 형질세포종, 혈장 세포 골수종, 이식후 림프세포증식성 질환, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증, 및 퇴행성 대세포 림프종 (ALCL)이 포함된다.
B 세포 비호지킨 림프종에 대한 추가의 예로는 림프종성 육아종증, 1차 삼출성 림프종, 혈관내 거대 B 세포 림프종, 종격 거대 B 세포 림프종, 중쇄 질병 (γ, μ 및 α 질환을 포함), 면역억제제로의 치료에 의해 유도된 림프종, 예를 들어 사이클로스로핀-유도성 림프종, 및 메토트렉세이트-유도성 림프종이 포함된다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 호지킨 림프종을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
CD20 발현 B 세포가 관련되고 치료되고(되거나) 예방할 수 있는 면역 질환에는 자가면역 질환, 예를 들어 건선, 건선성 관절염, 피부염, 전신성 경피증 및 경화증, 염증성 장질환 (IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 호흡곤란 증후군, 수막염, 뇌염, 포도막염, 사구체 신염, 습진, 천식, 죽상경화증, 백혈구 부착 결핍증, 다발성 경화증, 레이노 증후군, 쉐그렌 증후군, 청소년 발병 당뇨병, 레이터병, 베체트병, 면역 복합체 신염, IgA 신장병증, IgM 다발성 신경병증, 면역-매개 혈소판 감소증, 예를 들어 급성 특발성 혈소판 감소성 자반병 및 만성 특발성 혈소판 감소성 자반병, 용혈성 빈혈, 중증 근무력증, 루푸스 신염, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염 (RA), 아토피성 피부염, 천포창, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 베게너 육아종증, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 감염성 단핵구증, HIV, 및 허피스 바이러스 관련 질병이 포함된다. 추가적인 예로서 중증 급성 호흡곤란 증후군 및 맥락망막염이 있다. 또한 기타 질병 및 질환은 B-세포의 엡스타인-바 바이러스 (EBV)와 같은 바이러스에 의한 감염으로 야기되는 것들을 포함한다.
자가항체 및(또는) 과도한 B 림프구 활성이 두드러지며, 치료되고(되거나) 예방할 수 있는 염증성, 면역 및(또는) 자가면역 질환의 추가적인 예로서, 다음과 같은 것들이 포함된다:
혈관 및 기타 혈관 질환, 예를 들어 현미경적 다발성 맥관염, 척-스트라우스 증후군, 및 기타 ANCA-관련 혈관, 결정성 다발성 동맥염, 원발성 저온글로불린증 맥관염, 피부 백혈구 파괴성 맥관염, 카와사키 (Kawasaki)병, 다까야스 (Takayasu) 동맥염, 거대 세포 관절염, 헤노흐-숀라인 (Henoch-Schonlein) 자반증, 1차 또는 단리된 대뇌 혈관염, 결절성 홍반, 폐쇄성 혈전혈관염, 혈전성 혈소판감소성 자반증 (용혈성 요독 증후군을 포함), 및 2차 혈관; 피부 백혈구 파괴성 맥관염 (예를 들어, 2차 내지 B형 간염, C형 간염, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증, B-세포 종양, 류마티스 관절염, 쉐그렌 증후군 또는 전신성 홍반성 루푸스)를 포함; 추가의 예로서 홍반 결절성, 알레르기성 맥관염, 지방층염, 베버-크리스티안 (Weber-Christian)병, 과글로불린혈증 자반증, 및 버거씨병;
피부 질환, 예를 들어 접촉성 피부염, 선형 IgA 피부병, 백반증, 괴저성 농피증, 후천성 수포성 표피박리증, 심상성 천포창 (반흔성 천포창 및 수포성 천포창을 포함), 원형 탈모증 (범발성 탈모증 및 전두 탈모증을 포함), 포진성 피부염, 다형 홍반, 및 만성 자가면역 두드러기 (혈관 신경성 부종 및 두드러기성 맥관염);
면역-매개 혈구 감소증, 예를 들어 자가면역 호중구 감소증 및 적혈구계 무형성증;
결합 조직 질환, 예를 들어 CNS 루푸스, 원판상 홍반성 루푸스, CREST 증후군, 혼합 결합 조직 질병, 다발성 근염/피부근염, 봉입체 근염, 2차 아밀로이드증, 저온 글로불린혈증 타입 I 및 타입 II, 섬유성 근육통, 인지질 항체 증후군, 2차 혈우병, 재발성 다연골염, 사르코이드증, 근육강직 증후군, 및 류마티스열; 추가의 예는 호산구성 근막염;
관절염, 예를 들어 강직성 척추염, 청소년형 만성 관절염, 성인 스틸병, 및 SAPHO 증후군; 추가의 예는 천장골염, 반응성 관절염, 스틸병 및 통풍;
혈액 질환, 예를 들어 재생불량성 빈혈, 1차 용혈성 빈혈 (한랭 어글루티닌 증후군), 용혈성 빈혈 2차 내지 CLL 또는 전신성 홍반성 루푸스; POEMS 증후군, 악성 빈혈 및 왈뎀스트룀 자반증 고글로불린혈증; 추가의 예는 과립구 결핍증, 자가면역 호중구 감소증, 프랭클린병, 셀리그만 (Seligmann)병, μ-사슬 질병, 부신생물성 증후군 2차 태지 흉선종 및 림프종, 및 인자 VIII 억제제 형성;
내분비질환, 예를 들어 다발성 내분비장애, 및 애디슨병; 추가의 예는 자가면역 저혈당증, 자가면역 갑상선 기능저하증, 자가면역 인슐린 증후군, 드 퀘르뱅 (de Quervain) 갑상선염, 및 인슐린 수용체 항체-매개 인슐린 내성;
간-위장관 질환, 예를 들어 셀리아크병, 휘플스병, 1차 담낭성 간경변, 만성 활동성 간염, 및 1차 경화성 담관염; 추가의 예는 자가면역 위염;
신장병증, 예를 들어 급속 진행성 사구체 신염, 연쇄상구균 감염후 신염, 굳파스튜어 (Goodpasture) 증후군, 막성 사구체 신염, 및 저온 글로불린혈증성 신염; 추가의 예는 미세변화 질병;
신경계 질환, 예를 들어 자가면역 신장병증, 다발성 단신경염, 램버트-이튼 근무력 증후군, 시든햄 무도병, 척수 배면근 위축, 및 귈랭-바레 (Guillain-Barre) 증후군; 추가의 예는 척수병증/열대 경직성 대부전마비, 중증 근무력증, 급성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 및 만성 염증성 탈수초성 신경병증;
심장 및 폐질환, 예를 들어 섬유성 폐포염, 폐쇄성 세기관지염, 알레르기성 아스퍼질루스증, 낭포성 섬유증, 뢰플러 (Loeffler) 증후군, 심근염, 및 심막염; 추가의 예는 과민성 폐렴, 및 부신생물성 증후군 2차 내지 폐암;
알레르기성 질환, 예를 들어 기관지 천식 및 고-IgE 증후군; 추가의 예는 일과성 흑내장;
안과 질환, 예를 들어 특발성 맥락망막염;
감염성 질병, 예를 들어 파보바이러스 B 감염 (수족 (hands-and-socks) 증후군); 및
산부인과 질환, 예를 들어 재발성 유산, 재발성 태아 손실, 및 자궁내 성장 지체; 추가의 예는 부신생물성 증후군 2차 내지 부인과암;
남성 생식기 질환, 예를 들어 부신생물성 증후군 2차 내지 고환암; 및
이식-유래 질환, 예를 들어 동종이식 및 이종이식 거부반응, 및 이식편-대-숙주 질병.
하나의 실시태양에서, 질병은 궤양성 대장염, 크론병, 청소년 발병 당뇨병, 다발성 경화증, 면역-매개 혈소판 감소증, 예를 들어 급성 특발성 혈소판 감소성 자반병 및 만성 특발성 혈소판 감소성 자반병, 용혈성 빈혈 (자가면역 용혈성 빈혈을 포함), 중증 근무력증, 전신성 경화증 및 심상성 천포창으로부터 선택된 염증성, 면역 및(또는) 자가면역 질환이다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 항체는 CD20의 수준, 또는 세포막 표면 상에 CD20을 함유하는 세포의 수준을 검출하는데 사용될 수 있고, 이 수준은 특정 질병 증상과 연계될 수 있다. 별법으로, 항체는 CD20 발현 세포의 기능을 감소시키거나 이와 상호작용하여, 질병의 중요한 매개자로서 상기 세포들에 영향을 주는데 사용될 수 있다. 이는 샘플 및 대조군 샘플을 항체와 CD20 간에 복합체가 형성되도록 하는 조건하에서 항-CD20 항체와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 항체와 CD20 간에 형성된 임의의 복합체는 샘플 및 대조군에서 검출되고 비교된다.
본 발명의 인간 항체는 먼저 치료 또는 진단 용도와 관련된 결합 활성에 대해 시험관내에서 시험할 수 있다. 예를 들어, 항체를 하기 실시예에 기술하는 유세포 분류 검정법을 사용하여 시험할 수 있다. 또한, CD20을 발현하는 세포의 성장 억제 및(또는) 사멸을 비롯한 하나 이상의 이펙터-매개 이펙터 세포 활성을 유발하는 항체 활성을 검정할 수 있다. 예를 들어, CDC 및(또는) 아폽토시스를 유발하는 항체의 능력을 검정할 수 있다. CDC, 호모타입 부착, 분자 군집 형성 또는 아폽토시스에 대한 검정법의 프로토콜 이하 실시예에서 기술한다.
본 발명의 인간 항체는 다양한 CD20-관련 질병의 치료 및 진단에도 추가적인 용도를 갖는다. 예를 들어, 인간 항체는 CD20을 발현하는 세포의 성장 및(또는) 분화의 억제; CD20을 발현하는 세포의 사멸; 인간 이펙터 세포의 존재하에 CD20을 발현하는 세포의 식세포작용 또는 ADCC 매개; 보체 존재하에 CD20을 발현하는 세포의 CDC 매개; CD20을 발현하는 세포의 아폽토시스 매개; 호모타입 부착 유도; 및(또는) CD20에 대한 결합시 지질 래프트 내로의 이동과 같은 생물학적 활성 중 하나 이상을 생체내 또는 시험관내에서 유발시키는데 사용될 수 있다.
특정 실시태양에서, 인간 항체는 다양한 CD20-관련 질병을 치료, 예방 또는 진단하기 위해 생체내에서 사용된다. CD20-관련 질병은 예를 들어 특히 B 세포 림프종, 예를 들어 NHL, 및 면역 질환, 예를 들어 자가면역 질환, 예를 들어 상기 기술한 것들을 포함한다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 CD20 함유 종양 세포를 고갈시키기 때문에 NHL을 치료 또는 예방하는데 사용된다.
비호지킨 림프종은 B 세포 림프종의 일종이다. 림프종, 예를 들어 B 세포 림프종은 림프구 (혈액 세포)가 악성이 될 경우 발생하는 일군의 관련 암이다. 림프구의 정상적인 기능은 신체를 침입자인 병균, 바이러스, 진균류, 심지어 암으로부터 보호하는 것이다. 림프구에는 다수의 서브타입 및 성숙 단계가 있으므로, 다양한 종류의 림프종이 존재한다. 정상적인 세포와 마찬가지로, 악성 림프구는 신체의 여러 부분으로 이동할 수 있다. 통상적으로, 림프종 세포는 림프계 (골수, 림프절, 비장 및 혈액)에서 종양을 형성한다. 그러나, 이러한 세포들은 다른 장기로 이동할 수 있다. 특정 형태의 림프종은 정상 형태의 세포가 위치하는 장소에서 성장하는 경항이 있을 것이다. 예를 들어, 여포성 NHL 종양은 흔히 림프절에서 발생한다.
CD20은 통상적으로 NHL과 관련된 신생물성 (즉, 종양성) B 세포 상에서 상승된 수준으로 발현된다. 따라서, 본 발명의 CD20 결합 항체는 NHL을 야기하는 CD20 함유 종양 세포를 고갈시키는데 사용될 수 있고, 따라서 이러한 질병을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 인간 항체 (예를 들어, 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)는 CD20의 다른 효과들을 차단 또는 억제하는 데에도 사용될 수 있다. 예를 들어, CD20은 B 림프구 상에서 발현되며 이 세포의 증식 및(또는) 분화에 관여하는 것으로 알려져 있다. B 림프구는 면역조절자로서 기능하므로, CD20은 자가면역 질환과 관련된 B 림프구를 표적으로 하는, 예를 들어 B 림프구를 불활성화 또는 사멸시키는 항체 매개 치료에 있어서 중요한 표적이다. 이러한 자가면역 질환은 예를 들어, 상기 열거한 질병들을 포함한다.
본 발명의 항체 조성물 (예를 들어, 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역콘쥬게이트)을 생체내 및 시험관내 투여하기에 적합한 경로는, 당업계에 잘 알려져 있으며 당업자가 선택할 수 있다. 예를 들어, 항체 조성물은 주사 (예를 들어, 정맥내 또는 피하)로 투여될 수 있다. 사용된 분자의 적합한 용량은 대상의 연령 및 체중, 및 항체 조성물의 농도 및(또는) 제제화에 따라 좌우될 것이다. 또한, 종양 부하 (load)를 측정하여 적합한 용량을 계산하는데 사용할 수 있다.
이미 기술한 바와 같이, 본 발명의 인간 항-CD20 항체는 하나 이상의 기타 치료제, 예를 들어 세포독성제, 방사성독성제 또는 면역억제제와 함께 투여될 수 있다. 항체는 약제 (면역복합체로서)에 연결될 수 있거나, 시약과 별도로 투여될 수 있다. 후자의 경우 (별도 투여), 항체는 시약을 투여하기 전, 후 또는 동시에 투여할 수 있으며, 또는 기타 공지된 치료법, 예를 들어 항암 치료, 예를 들어 방사선 치료와 함께 투여될 수 있다. 상기 치료제는 특히 항-신생물제, 예를 들어 독소루비신, 시스플라틴, 블레오마이신, 카르무스틴, 클로람부실 및 시클로포스파미드를 포함한다. 본 발명의 인간 항-CD20 항체의 화학치료제와의 공동-투여로, 상이한 메커니즘으로 작용하여 인간 종양 세포에 대해 세포독성 효과를 나타내는 2가지의 항암제가 제공된다. 이러한 공동-투여는 약물에 대한 내성 발생 또는 종양 세포를 항체에 대해 비반응성으로 만드는 종양 세포의 항원성 변화로 인한 문제점들을 해결할 수 있다.
표적-특이적 이펙터 세포, 예를 들어 본 발명의 조성물 (예를 들어 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)에 연결된 이펙터 세포는 치료제로서도 사용될 수 있다. 표적화하기 위한 이펙터 세포는 인간 백혈구, 예를 들어 마크로파지, 호중구 또는 단핵구일 수 있다. 기타 세포는 호산구, 자연 살세포 및 기타 IgG- 또는 IgA-수용체 함유 세포를 포함한다. 필요하다면, 치료되는 대상으로부터 이펙터 세포를 수득할 수 있다. 표적-특이적 이펙터 세포는, 생리학상 허용되는 용액 중의 세포 현탁액으로 투여될 수 있다. 투여되는 세포의 수는 108 내지 109 차수일 수 있지만, 치료 목적에 따라 변화할 것이다. 통상적으로, 그 양은 표적 세포, 예를 들어 CD20을 발현하는 종양 세포에서의 국소화를 달성하고, 예를 들어 식세포작용으로 세포를 사멸시키기에 충분할 것이다. 투여 경로도 달라질 수 있다.
표적-특이적 이펙터 세포로의 치료는 표적화된 세포를 제거하기 위한 기타 기술과 함께 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 (예를 들어 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자) 및(또는) 상기 조성물을 갖춘 이펙터 세포를 사용하는 항-종양 치료는 화학요법과 함께 사용될 수 있다. 또한, 조합 면역 요법은 종양 세포 제거를 위해 2가지의 상이한 세포독성 이펙터 집단을 사용할 수 있다. 예를 들어, 항-Fc-γRI 또는 항-CD3에 연결된 항-CD20 항체를 IgG- 또는 IgA-수용체 특이적인 결합제와 함께 사용할 수 있다.
본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 세포 표면 상의 수용체를 캡핑하고 제거하는 등에 의해, 이펙터 세포 상의 FcγR 또는 FcαR 수준을 조절하는데에도 사용될 수 있다. 항-Fc 수용체의 혼합물은 이러한 목적을 위해서도 사용될 수 있다.
보체 결합 부위, 예를 들어 보체에 결합하는 IgG1, -2 또는 -3, 또는 IgM의 일부를 갖는 본 발명의 조성물 (예를 들어 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역콘쥬게이트)은, 보체의 존재하에서도 사용될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 표적 세포를 포함하는 세포 집단을 본 발명의 결합제 및 적절한 이펙터 세포로 생체외 처리하는 경우, 보체 또는 보체를 함유하는 혈청을 첨가하여 보충할 수 있다. 본 발명의 결합제로 코팅된 표적 세포의 식세포작용은 보체 단백질의 결합으로 개선될 수 있다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 조성물 (예를 들어 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)로 코팅된 표적 세포는, 보체에 의해서도 용해될 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 보체를 활성화하지 않는다.
본 발명의 조성물 (예를 들어 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역콘쥬게이트)은 보체와 함께 투여될 수도 있다. 따라서, 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자, 및 혈청 또는 보체를 포함하는 조성물은 본 발명의 영역에 포함된다. 이러한 조성물은 보체가 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자에 가까이 인접하여 위치한다는 점에서 유리하다. 별법으로, 본 발명의 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자, 및 보체 또는 혈청은 개별적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물의 표적 세포에 대한 결합은 CD20 항원-항체 복합체를 세포막의 지질 래프트 내로 이동시킨다. 이러한 이동은 CDC를 효과적으로 활성화하고(하거나) 증강시킬 수 있는 고밀도의 항원-항체 복합체를 형성시킨다.
본 발명의 항체 조성물 (예를 들어, 인간 항체 및 면역콘쥬게이트) 및 사용 지시서를 포함하는 키트도 본 발명의 영역에 포함된다. 키트는 하나 이상의 추가적인 시약, 예를 들어 면역억제제, 세포독성제 또는 방사성독성제, 또는 하나 이상의 추가적인 본 발명의 인간 항체 (예를 들어, 상보적 활성을 갖는 인간 항체)를 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체 조성물로 치료되는 환자에게 인간 항체의 치료 효과를 증강 또는 강화시키는 다른 치료제, 예를 들어 세포독성제 또는 방사성독성제를 추가적으로 본 발명의 인간 항체의 투여 전, 투여와 동시에, 또는 투여후 투여할 수 있다.
기타 실시태양에서 예를 들어, 대상을 사이토카인으로 치료하여 Fcγ 또는 Fcα 수용체의 발현 또는 활성을 조절, 예를 들어 증강 또는 억제하는 약제로 대상을 추가적으로 치료할 수 있다. 다중특이적 분자로의 치료 동안 투여하기에 바람직한 사이토카인은 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 인터페론-γ (IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 (TNF)를 포함한다.
또한, FcγR 또는 CD20을 발현하는 세포를 표적화, 예를 들어 상기 세포를 표지하기 위해 본 발명의 조성물 (예를 들어 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)을 사용할 수 있다. 이러한 용도의 경우, 결합제를 검출될 수 있는 분자에 연결할 수 있다. 따라서, 본 발명은 Fc 수용체, 예를 들어 FcγR, 또는 CD20을 발현하는 세포를 생체외 또는 시험관내에서 국소화하는 방법을 제공한다. 검출가능한 표지는 예를 들어 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자일 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 항체 또는 그의 일부와 CD20 간에 복합체를 형성케 하는 조건하에 샘플 및 대조군 샘플을 CD20에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플에서 CD20 항원의 존재를 검출하거나 CD20 항원의 양을 측정하는 방법을 제공한다. 이어서 복합체의 형성을 검출하는데, 이 때 대조군 샘플과 비교하여 샘플간의 복합체 형성에 있어서의 차이는 샘플 중에 CD20 항원이 존재함을 나타낸다.
기타 실시태양에서, 본 발명은 대상에게 상기 기술한 인간 항체를 투여함으로써, 대상에게서 CD20을 발현하는 세포와 관련된 질환, 예를 들어 비호지킨 림프종 또는 류마티스 관절염을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 상기 항체 및 그의 유도체는 특정 질환과 관련된 CD20 유도 활성, 예를 들어 증식 및(또는) 분화를 억제하는데 사용된다. 항체를 CD20과 접촉시킴으로써 (예를 들어, 항체를 대상에게 투여함으로써) 상기 활성을 유도하는 CD20의 능력이 억제되고, 따라서 관련 질환이 치료된다.
따라서 다른 실시태양에서, 본 발명은 CD20 발현 세포가 관련된 종양성 질환, 예를 들어 NHL을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 본 발명의 항체 조성물을 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 양으로 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 항체 조성물은 단독으로, 또는 항체 조성물과 함께 또는 상승적으로 작용하여 CD20 발현 세포와 관련된 질병을 치료 또는 예방하는 다른 치료제, 예를 들어 세포독성제 또는 방사성독성제와 함께 투여될 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 비호지킨 림프종에 대한 치료 방법을 제공한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 인간 CD20 발현 세포와 관련된 자가면역 질환, 예를 들어 상기 열거한 질병을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 본 발명의 항체 조성물을 질환을 치료 또는 예방하기에 효과적인 양으로 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 항체 조성물은 단독으로, 또는 항체 조성물과 함께 또는 상승적으로 작용하여 CD20을 발현하는 세포와 관련된 질병을 치료 또는 예방하는 작용을 하는 다른 치료제, 예를 들어 면역억제제와 함께 투여될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 생체내 또는 시험관내에서 CD20-발현 세포의 존재를 검출하거나, 그의 양을 정량하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) 검출가능한 마커에 콘쥬게이트된 본 발명의 조성물 (예를 들어, 다중특이적 또는 이중특이적 분자)을 대상에게 투여하는 것, 및 (ii) 상기 검출가능한 마커를 검출하는 수단에 대상을 노출시켜 CD20-발현 세포를 포함하는 영역을 확인하는 것을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 면역콘쥬게이트는 화합물 (예를 들어 치료제, 표지, 세포독소, 방사성독소, 면역억제제 등)을 항체에 연결시킴으로써, 표면 상에 발현된 CD20을 갖는 세포에 상기 화합물을 표적화하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 CD20을 발현하는 세포, 예를 들어 리드-스턴버스 (Reed-Sternberg) 세포를 생체외 또는 시험관내에서 국소화시키는 방법도 제공한다 (예를 들어, 탐지가능한 표지, 예컨대 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자). 별법으로, 면역콘쥬게이트는 세포독성제 또는 방사성독성제를 CD20에 표적화함으로써, 표면 상에 발현된 CD20을 갖는 세포를 사멸시키는데 사용될 수 있다.
본 발명에 의해, CD20을 발현하는 세포와 관련된 일련의 질병을 예방 및(또는) 치료하는데 효과적인, CD20에 대한 개선된 치료용 항체를 제공할 수 있다.
도 1은 인간 모노클로날 항체 2F2 및 11B8의 재조합 생산에 사용된 pCONγ1f/가변-중쇄 벡터를 나타낸다.
도 2는 2F2 및 11B8의 재조합 생산에 사용된 pCONκ/가변-경쇄 벡터를 나타낸다.
도 3은 2F2 및 11B8의 재조합 생산에 사용된 이중-유전자 클로닝 벡터 (pCONγ1f/κ2F2)를 나타낸다.
도 4는 유세포 분류법 (flow cytometry)을 사용하여 인간 모노클로날 항체 2F2, 7D8 및 11B8의 Raji, Daudi, CD20 트랜스펙션된 NS/0 세포, 및 부모 NS/0 세포에 대한 결합을 비교하는 그래프이다.
도 5a 및 5b는 유세포 분류법을 사용하여 3명의 인간 공여자로부터 2F2의 PBMC에 대한 결합을 보여준다.
도 6은 125I-표지된 2F2 및 125I-표지된 11B8의 Ramos-EHRB 세포에 대한 결합 친화도를 비교하는 그래프이다.
도 7a 및 7b는 125I-표지된 리툭시맵 (rituximab, 키메릭 항-CD20 항체, IDEC) 및 125I-표지된 B1 (B1이라는 용어는 131I-표지된 쥐 항-인간 CD20 항체인 표지되지 않은 형태의 벡살 (Bexxar)™ (쿨터 (Coulter))에 상응함)에 비해, 125I-표지된 2F2 및 125I-표지된 11B8의 Ramos-EHRB 세포 (a) 및 Daudi 세포 (b)에 대한 결합을 보여준다.
도 8은 125I-표지된 11B8T, 125I-표지된 2F2, 125I-표지된 리툭시맵 (RIT) 및 125I-표지된 B1의 해리 속도를 비교하는 그래프이다.
도 9는 Ramos-EHRB 세포에서 2F2, 11B8T 및 리툭시맵의 F(ab')2 단편의 해리 속도를 보여준다.
도 1Oa 및 1Ob는 유세포 분류법을 사용하여 상이한 시점에서, Daudi 세포 (a) 및 SU-DHL-4 세포 (b)의 2F2T, 11B8T, 7D8, 리툭시맵 및 이소타입 대조군 항체 (HuMab-KLH)에 의한 CDC를 보여준다 (기능적 오프-속도).
도 11a-e는 유세포 분류법을 사용하여 상이한 세포주에서 2F2 및 리툭시맵에 의해 유도되는 CDC의 동역학을 보여준다.
도 12a-d는 유세포 분류법을 사용하여 2가지의 상이한 항체 농도에서 보체 (정상 인간 혈청 (NHS)) 농도에 대한 함수로 나타낸, 상이한 세포주에서 2F2 및 리툭시맵에 의해 유도되는 CDC를 보여준다.
도 13a-d는 유세포 분류법을 사용하여 상이한 세포주에서 2F2 및 리툭시맵에 의한 CDC의 농도-의존적 유도를 보여준다.
도 14a 및 14b는 Daudi 세포 (a) 및 Raji 세포 (b)에서 2F2, 2F2T, 11B8T, B1 및 리툭시맵에 의한 CDC의 농도-의존적 유도를 보여준다.
도 15a 및 15b는 인간 모노클로날 항체 2F2, 7D8 및 11B8, 및 리툭시맵에 의한 Daudi 세포 (낮은 수준의 CD55/59를 발현하는 세포)의 CDC를 비교하는 그래프이고; (a) 혈청 첨가 전에 세척되지 않은 세포의 용해 % 및 (b) 혈청 첨가 전에 세척된 세포의 용해 %를 보여준다.
도 16a 및 16b는 인간 모노클로날 항체 2F2, 7D8 및 11B8, 및 리툭시맵에 의한 Raji 세포 (높은 수준의 CD55/59를 발현하는 세포)의 CDC를 비교하는 그래프이고; (a) 항-CD55 및 항-CD59 항체로 블로킹하지 않은 세포의 용해 %, 및 (b) 항-CD55 및 항-CD59 항체로 블로킹한 세포의 용해 %를 보여준다.
도 17a-c는 Raji 세포에서 2F2 및 리툭시맵으로 유도된 CDC에서 CD55 및 CD59의 역할을 보여준다. (a)는 항-CD55 항체를 첨가한 경우 용해된 세포의 백분율을 보여주고, (b)는 항-CD59 항체를 첨가한 경우 용해된 세포의 백분율, 및 (c) 항-CD55 항체 및 항-CD59 항체를 모두 첨가한 경우 용해된 세포의 백분율을 보여준다.
도 18a-d는 유세포 분류법으로 측정했을 때, 상이한 세포주에서 2F2 및 리툭시맵에 의한 보체 인자 C1q의 결합을 보여준다.
도 19a-d는 유세포 분류법으로 측정했을 때, 상이한 세포주에서 2F2 및 리툭시맵에 의한 보체 인자 단편 C4c의 침착을 보여준다.
도 20은 PMN, MNC, 혈장 또는 전혈의 존재하에 2F2, 리툭시맵 및 11B8T에 의한 ARE-77 세포의 용해를 보여준다.
도 21은 PMN, MNC, 혈장 또는 전혈의 존재하에 2F2, 리툭시맵 및 11B8T에 의한 B-CLL 세포의 용해를 보여준다.
도 22는 PMN, MNC, 혈장 또는 전혈의 존재하에 2F2, 리툭시맵 및 11B8T에 의한 HCL (모세포 백혈병) 세포의 용해를 보여준다.
도 23은 PMN, MNC, 혈장 또는 전혈의 존재하에 2F2 및 리툭시맵에 의한 B-ALL 세포의 용해를 보여준다.
도 24는 PMN, MNC, 혈장 또는 전혈의 존재하에 2F2, 리툭시맵 및 11B8T에 의한 여포성 림프종 (FL) 세포의 용해를 보여준다.
도 25는 PMN, MNC, 혈장 또는 전혈의 존재하에 2F2, 리툭시맵 및 11B8T에 의한 외투 세포 림프종 세포의 용해를 보여준다.
도 26은 전혈의 존재하에 2F2 및 리툭시맵에 의한 ARH-77 세포의 농도 의존적 용해를 보여준다.
도 27은 2F2T, 11B8T 및 리툭시맵에 의한 ARH-77 세포의 MNC-매개 용해를 보여준다.
도 28은 2F2T, 11B8T 및 리툭시맵에 의한 Raji 세포의 MNC-매개 용해를 보여준다.
도 29a, b 및 c는 FRET 분석 및 트리톤-X 불용성 검정법을 사용하여 2F2, 7D8 또는 11B8과의 인큐베이션시, CD20의 지질 래프트에서의 군집 형성을 보여주는 그래프이다.
도 30은 FRET 분석을 사용하여 2F2, 리툭시맵 또는 11B8T와의 인큐베이션시 CD20의 지질 래프트에서의 군집 형성 (clustering)을 보여주는 그래프이다.
도 31은 트리톤 X-100 (TX)으로 처리하고 2F2, 리툭시맵 또는 11B8T과 인큐베이션한 후, 불용성 래프트 분획에 잔류하는 CD20의 비율을 보여준다.
도 32는 Daudi 세포를 2F2, 리툭시맵 또는 11B8T로 자극했을 때 래프트 및 비-래프트 막 분획 간에 CD20의 분포를 보여준다.
도 33a-g는 유세포 분류법을 사용하여 2F2, 7D8 및 11B8에 의한 Daudi 세포의 아폽토시스를 보여준다.
도 34는 유세포 분류법을 사용하여 2F2, 11B8T, 리툭시맵 또는 B1에 의한 Raji 세포의 아폽토시스 유도를 보여준다.
도 35a는 유세포 분류법을 사용하여 2F2T, 11B8T, 리툭시맵 또는 B1에 의한 Daudi 세포의 아폽토시스 유도를 보여준다.
도 35b는 유세포 분류법을 사용하여 인간 모노클로날 항체 2F2T, 11B8T, 리툭시맵 및 B1에 의한 Daudi 세포의 초기 단계 및 말기 단계 아폽토시스를 보여준다.
도 36a-e는 광학 현미경을 사용하여 2F2, 7D8 및 11B8에 의한 Ramos-EHRB 세포의 호모타입 부착을 보여준다.
도 37은 광학 현미경을 사용하여 2F2, 리툭시맵 및 B1에 의한 Daudi 세포의 호모타입 부착을 보여준다.
도 38은 Daudi 세포를 주사하고 2F2 또는 7D8로 처리한 SCID 마우스의 생존율 %를 보여주는 그래프이다.
도 39는 Tanoue 세포를 주사하고 2F2, 리툭시맵 또는 B1으로 처리한 SCID 마우스의 생존율 %를 보여준다.
도 40은 Daudi 세포를 주사하고 상이한 농도의 2F2 또는 리툭시맵으로 처리한 SCID 마우스의 생존율 %를 보여준다.
도 41은 Daudi 세포를 주사하고 11B8T 또는 B1으로 처리한 SCID 마우스의 생존율 %를 보여준다.
도 42는 39일째에 (10 ㎍의 B1, 리툭시맵, 11B8T, 2F2T 또는 huIgG1으로 처리한 지 31일 후) SCID 마우스의 종양 세포에 대한 생물학적 발광 영상을 보여준다. 생물학적 발광은 마우스 몸체의 흑백 영상 상에 중첩되어 적색으로 나타냈다 (마우스에서 어두운 영역)(광 강도 > 5분 당 50 광자).
도 43은 8일째에 10 ㎍의 B1, 리툭시맵, 11B8T, 2F2T 또는 huIgG1을 투여한 지 25일, 32일, 39일 및 46일 후, 몸체 표면 상의 광 신호를 통합하여 정량화한 각 마우스의 종양 질량을 보여준다.
도 44a-c는 4 x 1.25 mg/kg (a), 4 x 6.25 mg/kg (b), 또는 4 x 12.50 mg/kg (c)의 상이한 용량으로 2F2 또는 리툭시맵을 정맥내 투여한 후, 시노몰구스 원숭이의 말초 혈액 CD20+ 세포의 유세포 분류 분석을 보여준다.
도 45a-c는 4 x 1.25 mk/kg (a), 4 x 6.25 mg/kg (b), 또는 4 x 12.50 mg/kg (c)의 상이한 용량으로 2F2 또는 리툭시맵을 정맥내 투여한 후, 시노몰구스 원숭이의 말초 혈액 CD21+ 세포의 유세포 분류 분석을 보여준다.
도 46a-c는 4 x 1.25 mk/kg (a), 4 x 6.25 mg/kg (b), 또는 4 x 12.50 mg/kg (c)의 상이한 용량으로 2F2 또는 리툭시맵을 정맥내 투여한 후, 시노몰구스 원숭이의 림프절 CD20+ 세포의 유세포 분류 분석을 보여준다.
도 47a-c는 4 x 1.25 mg/kg (a), 4 x 6.25 mg/kg (b), 또는 4 x 12.50 mg/kg (c)의 상이한 용량으로 2F2 또는 리툭시맵을 정맥내 투여한 후, 시노몰구스 원숭이의 말초 혈액 CD20lowCD23+CD40high 발현 세포의 유세포 분류 분석을 보여준다.
도 48a-e는 리툭시맵 (a), 2F2 (b), 11B8 (c), B1 (d), 또는 이소타입 대조군 항체 (e)의 야생형 (WT) CD20, 돌연변이 CD20 (AxP), 또는 WT CD20 및 돌연변이 CD20 (AxP)를 모두 발현하는 CHO 세포에 대한 결합을 보여준다 (유세포 분류법으로 측정).
도 49a-f는 2F2, 11B8T, B1 또는 리툭시맵의 돌연변이 P172S 대 WT CD20에 대한 결합 백분율 (a), 2F2T, 11B8T, B1, CAT (CAT 13.6E12, 마우스 모노클로날 IgG2A 항-CD20 항체, 디아텍 닷 컴(Diatec.Com)), 대조군 이소타입 항체 (KLH) 또는 리툭시맵의 돌연변이 CD20 (AxP) 대 WT CD20에 대한 결합 백분율 (b), 2F2, 11B8T, B1 또는 리툭시맵의 돌연변이 N166D 대 WT CD20에 대한 결합 백분율 (c), 2F2T, CAT 또는 리툭시맵의 돌연변이 N166D 대 WT CD20에 대한 결합 백분율 (d), 2F2T, 2F2, 11B8T, B1 또는 리툭시맵의 돌연변이 N163D 대 WT CD20에 대한 결합 백분율 (e), 및 2F2T, CAT 또는 리툭시맵의 돌연변이 N163D 대 WT CD20에 대한 결합 백분율 (f)을 보여준다.
도 50은 2F2에 대해 생성된 3가지의 항-이디오타입 항체, 항-2F2 sab 1.1, 항-2F2 sab 1.2 및 항-2F2 sab 1.3에 대한 2F2T, 7D8 및 이소타입 대조군 항체의 결합을 보여준다 (ELISA로 측정).
도 51은 11B8T가 11B8T에 대해 생성된 항-이디오타입 항체, 항-11B8T sab 2.2, 항-11B8T sab 2.3, 항-11B8T sab 2.4, 항-11B8T sab 2.5 및 항-11B8T sab 2.6에는 결합하지만, 항-이디오타입 항-2F2 항체에는 결합하지 않음을 보여준다 (ELISA로 측정).
도 52a-c는 2F2에 대해 생성된 3가지의 항-이디오타입 항체, 항-2F2 sab 1.1 (a), 항-2F2 sab 1.2 (b) 및 항-2F2 sab 1.3 (c)에 대한 2F2T의 용량-의존적 결합을 보여준다 (ELISA로 측정).
도 53은 인간 모노클로날 항체 2F2의 중쇄 V 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 2) 및 경쇄 (카파) V 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 4)을 보여준다 (CDR 영역 명시).
도 54는 인간 모노클로날 항체 2F2의 중쇄 V 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 1) 및 경쇄 (카파) V 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 3)을 보여준다.
도 55는 인간 모노클로날 항체 7D8의 중쇄 V 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 6) 및 경쇄 (카파) V 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 8)을 보여준다 (CDR 영역 명시).
도 56은 인간 모노클로날 항체 7D8의 중쇄 V 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 5) 및 경쇄 (카파) V 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 7)을 보여준다.
도 57은 인간 모노클로날 항체 11B8의 중쇄 V 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 10) 및 경쇄 (카파) V 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 12)을 보여준다 (CDR 영역 명시).
도 58은 인간 모노클로날 항체 11B8의 중쇄 V 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 9) 및 경쇄 (카파) V 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 11)을 보여준다.
도 2는 2F2 및 11B8의 재조합 생산에 사용된 pCONκ/가변-경쇄 벡터를 나타낸다.
도 3은 2F2 및 11B8의 재조합 생산에 사용된 이중-유전자 클로닝 벡터 (pCONγ1f/κ2F2)를 나타낸다.
도 4는 유세포 분류법 (flow cytometry)을 사용하여 인간 모노클로날 항체 2F2, 7D8 및 11B8의 Raji, Daudi, CD20 트랜스펙션된 NS/0 세포, 및 부모 NS/0 세포에 대한 결합을 비교하는 그래프이다.
도 5a 및 5b는 유세포 분류법을 사용하여 3명의 인간 공여자로부터 2F2의 PBMC에 대한 결합을 보여준다.
도 6은 125I-표지된 2F2 및 125I-표지된 11B8의 Ramos-EHRB 세포에 대한 결합 친화도를 비교하는 그래프이다.
도 7a 및 7b는 125I-표지된 리툭시맵 (rituximab, 키메릭 항-CD20 항체, IDEC) 및 125I-표지된 B1 (B1이라는 용어는 131I-표지된 쥐 항-인간 CD20 항체인 표지되지 않은 형태의 벡살 (Bexxar)™ (쿨터 (Coulter))에 상응함)에 비해, 125I-표지된 2F2 및 125I-표지된 11B8의 Ramos-EHRB 세포 (a) 및 Daudi 세포 (b)에 대한 결합을 보여준다.
도 8은 125I-표지된 11B8T, 125I-표지된 2F2, 125I-표지된 리툭시맵 (RIT) 및 125I-표지된 B1의 해리 속도를 비교하는 그래프이다.
도 9는 Ramos-EHRB 세포에서 2F2, 11B8T 및 리툭시맵의 F(ab')2 단편의 해리 속도를 보여준다.
도 1Oa 및 1Ob는 유세포 분류법을 사용하여 상이한 시점에서, Daudi 세포 (a) 및 SU-DHL-4 세포 (b)의 2F2T, 11B8T, 7D8, 리툭시맵 및 이소타입 대조군 항체 (HuMab-KLH)에 의한 CDC를 보여준다 (기능적 오프-속도).
도 11a-e는 유세포 분류법을 사용하여 상이한 세포주에서 2F2 및 리툭시맵에 의해 유도되는 CDC의 동역학을 보여준다.
도 12a-d는 유세포 분류법을 사용하여 2가지의 상이한 항체 농도에서 보체 (정상 인간 혈청 (NHS)) 농도에 대한 함수로 나타낸, 상이한 세포주에서 2F2 및 리툭시맵에 의해 유도되는 CDC를 보여준다.
도 13a-d는 유세포 분류법을 사용하여 상이한 세포주에서 2F2 및 리툭시맵에 의한 CDC의 농도-의존적 유도를 보여준다.
도 14a 및 14b는 Daudi 세포 (a) 및 Raji 세포 (b)에서 2F2, 2F2T, 11B8T, B1 및 리툭시맵에 의한 CDC의 농도-의존적 유도를 보여준다.
도 15a 및 15b는 인간 모노클로날 항체 2F2, 7D8 및 11B8, 및 리툭시맵에 의한 Daudi 세포 (낮은 수준의 CD55/59를 발현하는 세포)의 CDC를 비교하는 그래프이고; (a) 혈청 첨가 전에 세척되지 않은 세포의 용해 % 및 (b) 혈청 첨가 전에 세척된 세포의 용해 %를 보여준다.
도 16a 및 16b는 인간 모노클로날 항체 2F2, 7D8 및 11B8, 및 리툭시맵에 의한 Raji 세포 (높은 수준의 CD55/59를 발현하는 세포)의 CDC를 비교하는 그래프이고; (a) 항-CD55 및 항-CD59 항체로 블로킹하지 않은 세포의 용해 %, 및 (b) 항-CD55 및 항-CD59 항체로 블로킹한 세포의 용해 %를 보여준다.
도 17a-c는 Raji 세포에서 2F2 및 리툭시맵으로 유도된 CDC에서 CD55 및 CD59의 역할을 보여준다. (a)는 항-CD55 항체를 첨가한 경우 용해된 세포의 백분율을 보여주고, (b)는 항-CD59 항체를 첨가한 경우 용해된 세포의 백분율, 및 (c) 항-CD55 항체 및 항-CD59 항체를 모두 첨가한 경우 용해된 세포의 백분율을 보여준다.
도 18a-d는 유세포 분류법으로 측정했을 때, 상이한 세포주에서 2F2 및 리툭시맵에 의한 보체 인자 C1q의 결합을 보여준다.
도 19a-d는 유세포 분류법으로 측정했을 때, 상이한 세포주에서 2F2 및 리툭시맵에 의한 보체 인자 단편 C4c의 침착을 보여준다.
도 20은 PMN, MNC, 혈장 또는 전혈의 존재하에 2F2, 리툭시맵 및 11B8T에 의한 ARE-77 세포의 용해를 보여준다.
도 21은 PMN, MNC, 혈장 또는 전혈의 존재하에 2F2, 리툭시맵 및 11B8T에 의한 B-CLL 세포의 용해를 보여준다.
도 22는 PMN, MNC, 혈장 또는 전혈의 존재하에 2F2, 리툭시맵 및 11B8T에 의한 HCL (모세포 백혈병) 세포의 용해를 보여준다.
도 23은 PMN, MNC, 혈장 또는 전혈의 존재하에 2F2 및 리툭시맵에 의한 B-ALL 세포의 용해를 보여준다.
도 24는 PMN, MNC, 혈장 또는 전혈의 존재하에 2F2, 리툭시맵 및 11B8T에 의한 여포성 림프종 (FL) 세포의 용해를 보여준다.
도 25는 PMN, MNC, 혈장 또는 전혈의 존재하에 2F2, 리툭시맵 및 11B8T에 의한 외투 세포 림프종 세포의 용해를 보여준다.
도 26은 전혈의 존재하에 2F2 및 리툭시맵에 의한 ARH-77 세포의 농도 의존적 용해를 보여준다.
도 27은 2F2T, 11B8T 및 리툭시맵에 의한 ARH-77 세포의 MNC-매개 용해를 보여준다.
도 28은 2F2T, 11B8T 및 리툭시맵에 의한 Raji 세포의 MNC-매개 용해를 보여준다.
도 29a, b 및 c는 FRET 분석 및 트리톤-X 불용성 검정법을 사용하여 2F2, 7D8 또는 11B8과의 인큐베이션시, CD20의 지질 래프트에서의 군집 형성을 보여주는 그래프이다.
도 30은 FRET 분석을 사용하여 2F2, 리툭시맵 또는 11B8T와의 인큐베이션시 CD20의 지질 래프트에서의 군집 형성 (clustering)을 보여주는 그래프이다.
도 31은 트리톤 X-100 (TX)으로 처리하고 2F2, 리툭시맵 또는 11B8T과 인큐베이션한 후, 불용성 래프트 분획에 잔류하는 CD20의 비율을 보여준다.
도 32는 Daudi 세포를 2F2, 리툭시맵 또는 11B8T로 자극했을 때 래프트 및 비-래프트 막 분획 간에 CD20의 분포를 보여준다.
도 33a-g는 유세포 분류법을 사용하여 2F2, 7D8 및 11B8에 의한 Daudi 세포의 아폽토시스를 보여준다.
도 34는 유세포 분류법을 사용하여 2F2, 11B8T, 리툭시맵 또는 B1에 의한 Raji 세포의 아폽토시스 유도를 보여준다.
도 35a는 유세포 분류법을 사용하여 2F2T, 11B8T, 리툭시맵 또는 B1에 의한 Daudi 세포의 아폽토시스 유도를 보여준다.
도 35b는 유세포 분류법을 사용하여 인간 모노클로날 항체 2F2T, 11B8T, 리툭시맵 및 B1에 의한 Daudi 세포의 초기 단계 및 말기 단계 아폽토시스를 보여준다.
도 36a-e는 광학 현미경을 사용하여 2F2, 7D8 및 11B8에 의한 Ramos-EHRB 세포의 호모타입 부착을 보여준다.
도 37은 광학 현미경을 사용하여 2F2, 리툭시맵 및 B1에 의한 Daudi 세포의 호모타입 부착을 보여준다.
도 38은 Daudi 세포를 주사하고 2F2 또는 7D8로 처리한 SCID 마우스의 생존율 %를 보여주는 그래프이다.
도 39는 Tanoue 세포를 주사하고 2F2, 리툭시맵 또는 B1으로 처리한 SCID 마우스의 생존율 %를 보여준다.
도 40은 Daudi 세포를 주사하고 상이한 농도의 2F2 또는 리툭시맵으로 처리한 SCID 마우스의 생존율 %를 보여준다.
도 41은 Daudi 세포를 주사하고 11B8T 또는 B1으로 처리한 SCID 마우스의 생존율 %를 보여준다.
도 42는 39일째에 (10 ㎍의 B1, 리툭시맵, 11B8T, 2F2T 또는 huIgG1으로 처리한 지 31일 후) SCID 마우스의 종양 세포에 대한 생물학적 발광 영상을 보여준다. 생물학적 발광은 마우스 몸체의 흑백 영상 상에 중첩되어 적색으로 나타냈다 (마우스에서 어두운 영역)(광 강도 > 5분 당 50 광자).
도 43은 8일째에 10 ㎍의 B1, 리툭시맵, 11B8T, 2F2T 또는 huIgG1을 투여한 지 25일, 32일, 39일 및 46일 후, 몸체 표면 상의 광 신호를 통합하여 정량화한 각 마우스의 종양 질량을 보여준다.
도 44a-c는 4 x 1.25 mg/kg (a), 4 x 6.25 mg/kg (b), 또는 4 x 12.50 mg/kg (c)의 상이한 용량으로 2F2 또는 리툭시맵을 정맥내 투여한 후, 시노몰구스 원숭이의 말초 혈액 CD20+ 세포의 유세포 분류 분석을 보여준다.
도 45a-c는 4 x 1.25 mk/kg (a), 4 x 6.25 mg/kg (b), 또는 4 x 12.50 mg/kg (c)의 상이한 용량으로 2F2 또는 리툭시맵을 정맥내 투여한 후, 시노몰구스 원숭이의 말초 혈액 CD21+ 세포의 유세포 분류 분석을 보여준다.
도 46a-c는 4 x 1.25 mk/kg (a), 4 x 6.25 mg/kg (b), 또는 4 x 12.50 mg/kg (c)의 상이한 용량으로 2F2 또는 리툭시맵을 정맥내 투여한 후, 시노몰구스 원숭이의 림프절 CD20+ 세포의 유세포 분류 분석을 보여준다.
도 47a-c는 4 x 1.25 mg/kg (a), 4 x 6.25 mg/kg (b), 또는 4 x 12.50 mg/kg (c)의 상이한 용량으로 2F2 또는 리툭시맵을 정맥내 투여한 후, 시노몰구스 원숭이의 말초 혈액 CD20lowCD23+CD40high 발현 세포의 유세포 분류 분석을 보여준다.
도 48a-e는 리툭시맵 (a), 2F2 (b), 11B8 (c), B1 (d), 또는 이소타입 대조군 항체 (e)의 야생형 (WT) CD20, 돌연변이 CD20 (AxP), 또는 WT CD20 및 돌연변이 CD20 (AxP)를 모두 발현하는 CHO 세포에 대한 결합을 보여준다 (유세포 분류법으로 측정).
도 49a-f는 2F2, 11B8T, B1 또는 리툭시맵의 돌연변이 P172S 대 WT CD20에 대한 결합 백분율 (a), 2F2T, 11B8T, B1, CAT (CAT 13.6E12, 마우스 모노클로날 IgG2A 항-CD20 항체, 디아텍 닷 컴(Diatec.Com)), 대조군 이소타입 항체 (KLH) 또는 리툭시맵의 돌연변이 CD20 (AxP) 대 WT CD20에 대한 결합 백분율 (b), 2F2, 11B8T, B1 또는 리툭시맵의 돌연변이 N166D 대 WT CD20에 대한 결합 백분율 (c), 2F2T, CAT 또는 리툭시맵의 돌연변이 N166D 대 WT CD20에 대한 결합 백분율 (d), 2F2T, 2F2, 11B8T, B1 또는 리툭시맵의 돌연변이 N163D 대 WT CD20에 대한 결합 백분율 (e), 및 2F2T, CAT 또는 리툭시맵의 돌연변이 N163D 대 WT CD20에 대한 결합 백분율 (f)을 보여준다.
도 50은 2F2에 대해 생성된 3가지의 항-이디오타입 항체, 항-2F2 sab 1.1, 항-2F2 sab 1.2 및 항-2F2 sab 1.3에 대한 2F2T, 7D8 및 이소타입 대조군 항체의 결합을 보여준다 (ELISA로 측정).
도 51은 11B8T가 11B8T에 대해 생성된 항-이디오타입 항체, 항-11B8T sab 2.2, 항-11B8T sab 2.3, 항-11B8T sab 2.4, 항-11B8T sab 2.5 및 항-11B8T sab 2.6에는 결합하지만, 항-이디오타입 항-2F2 항체에는 결합하지 않음을 보여준다 (ELISA로 측정).
도 52a-c는 2F2에 대해 생성된 3가지의 항-이디오타입 항체, 항-2F2 sab 1.1 (a), 항-2F2 sab 1.2 (b) 및 항-2F2 sab 1.3 (c)에 대한 2F2T의 용량-의존적 결합을 보여준다 (ELISA로 측정).
도 53은 인간 모노클로날 항체 2F2의 중쇄 V 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 2) 및 경쇄 (카파) V 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 4)을 보여준다 (CDR 영역 명시).
도 54는 인간 모노클로날 항체 2F2의 중쇄 V 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 1) 및 경쇄 (카파) V 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 3)을 보여준다.
도 55는 인간 모노클로날 항체 7D8의 중쇄 V 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 6) 및 경쇄 (카파) V 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 8)을 보여준다 (CDR 영역 명시).
도 56은 인간 모노클로날 항체 7D8의 중쇄 V 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 5) 및 경쇄 (카파) V 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 7)을 보여준다.
도 57은 인간 모노클로날 항체 11B8의 중쇄 V 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 10) 및 경쇄 (카파) V 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 12)을 보여준다 (CDR 영역 명시).
도 58은 인간 모노클로날 항체 11B8의 중쇄 V 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 9) 및 경쇄 (카파) V 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 11)을 보여준다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 이는 본 발명을 한정하기 위한 것으로 생각해서는 안된다.
실시예에
사용된 B-세포주
세포주 | 기원 | 수득원 |
Daudi | 네그로이드 (Negroid) 버킷 림프종 | ECACC (85011437) |
ARH-77 | IgG 혈장 세포 백혈병 | DSMZ (ACC 512) |
DOHH | 난치성 면역아세포 B 세포 림프종 | DSMZ (ACC 47) |
Raji | 네그로이드 버킷 림프종 | ECACC (85011429) |
SU-DHL-4 | B-NHL, 미만성 조직구 림프종 | DSMZ (ACC 495) |
Ramos-EHRB | 버킷 림프종 | ECACC (85030804) |
Tanoue | 인간 B-세포 백혈병 | DSMZ (ACC 399) |
Daudi, ARH-77, DOHH, Raji, Ramos-EHRB 및 Tanoue B-세포주는 10%의 태아 소 혈청 (FCS) (옵티멈 C241, 위센트 사, 캐나다 세인트 브루노), 2 mM L-글루타민, 100 IU/ml의 페니실린, 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신, 및 1 mM의 피루브산 나트륨 (모두 기브코 BRL, 라이프 테크놀로지스, 스코틀랜드 패이즐리)을 보충한 RPMI 1640 배양 배지 내에서 배양했다.
SU-DHL-4 B-세포주는 동일한 배지이지만 피루브산 나트륨 없이 배양했다.
배양은 가습한 5% CO2 인큐베이터에서 37℃로 유지했고, 80-90% 컨플루언스 (confluence)가 되었을 때 분리하여 수확했다. 1주일에 2번 배지를 새로 공급했다. 이 때, 세포를 분리하고 1-1.5 x 106 세포/ml로 시딩하여 생존성 및 최적의 성장을 유지하도록 했다.
실시예
1
CD20
에 대한 인간 항체의 생산
HCo7 및 KM 마우스: 인간 항체 유전자를 발현하는 HCo7 및 KM 마우스를 사용하여 CD20에 대한 완전한 인간 모노클로날 항체를 제조했다. KM 마우스주에서, 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자는 문헌 [Chen et al . (1993) EMBO J 12:811-820]에 기술된 바와 같이 동형접합적으로 파괴되어 있고, 내인성 마우스 중쇄 유전자는 PCT 공개 WO 01/09187의 실시예 1에 기술된 바와 같이 동형접합적으로 파괴되어 있다. 이 마우스주는 문헌 [Fishwild et al . (1996) Nature Biotechnology 14:845-851]에 기술된 바와 같이, 인간 카파 경쇄 트랜스진, KCo5를 가지고 있다. 또한, 이 마우스주는 WO 02/43478에 기술된 바와 같이 14번 염색체 단편 hCF (SC20)로 구성된 인간 중쇄 트랜스크로모좀을 가지고 있다.
HCo7 마우스는 그의 내인성 경쇄 (카파) 유전자에 JKD 파괴를 (문헌 [Chen et al. (1993) EMBO J. 12:821-830]에 기술된 바와 같이), 그의 내인성 중쇄 유전자에 CMD 파괴를 (WO 01/14424의 실시예 1에 기술된 바와 같이), KCo5 인간 카파 경쇄 트랜스진 (문헌 [Fishwild et al . (1996) Nature Biotechnology 14:845-851]에 기술된 바와 같이), 및 HCo7 인간 중쇄 트랜스진 (US 5,770,429에 기술된 바와 같이)을 가지고 있다.
HCo7 및 KM 마우스 면역화: HCo7 및 KM 마우스를 인간 CD20 트랜스펙션된 NS/0 세포로 면역화했다. 첫번째 면역화에서, 마우스 당 150 ㎕ PBS 중의 1 x 107개의 세포를 프로인트 완전 면역보강제와 1:1로 혼합하여 복강내 (i.p.)로 주사했다. 면역보강제 없이 유사한 양의 세포를 사용하여 후속적인 i.p. 면역화를 수행했다. 융합 2-3일 전에 PBS에 현탁한 0.5 x 107개의 세포로 마우스를 정맥내 부스팅했다.
마우스 혈청 중에 인간 CD20에 대한 항체의 존재는, 인간 CD20 트랜스펙션된 NS/0 세포, 뿐만 아니라 CD20 음성 부모 NS/0 세포를 사용하여 FACS 분석에 의한 유세포 분류법으로 모니터링했다.
CD2O 에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 생성: HCo7 및 KM 마우스로부터 마우스 비장 세포를 단리하고, 표준 프로토콜에 기초하여 PEG으로 마우스 골수종 세포주와 융합시켰다. 그 다음, 생성된 하이브리도마를 ELISA로 인간 IgG,κ 생산에 대해, 그리고 FACS 분석으로 인간 CD20 트랜스펙션된 NS/0 및 SKBR3 세포를 사용하여 CD20 특이성에 대해 스크리닝했다. 면역화된 마우스로부터 얻은 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을 50% PEG (시그마)로 SP2/0 비분비 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1581) 수의 1/4과 융합시켰다. 약 1 x 105/웰의 세포를 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트에 플레이팅한 후, 약 10% 태아 소 혈청, 10% P388D1 (ATCC, CRL TIB-63) 조건화 배지, DMEM (메디아테크, CRL 10013, 높은 글루코스, L-글루타민 및 피루브산 나트륨) 중의 3-5% 오리겐 (IGEN), 및 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-머캅토에탄올, 50 mg/ml 젠타마이신 및 1 x HAT (시그마, CRL P-7185)를 함유하는 선택적 배지에서 약 2주 배양했다. 1-2주 후, HAT를 HT로 바꾼 배지에서 세포를 배양했다. 그리고, 각 웰을 유세포 분류법으로 인간 항-CD20 모노클로날 IgG 항체에 대해 스크리닝했다. 일단 광범위한 하이브리도마 생장이 일어나면, 배지를 통상 10-14일 후 관찰했다. 항체 분비 하이브리도마를 다시 플레이팅하고, 다시 스크리닝하여, 인간 IgG, 항-CD20 모노클로날 항체에 대해 여전히 양성이면 한계 희석법으로 서브클로닝했다. 그 다음으로, 안정한 서브클론을 시험관내에서 배양하고 조직 배양 배지 중에 소량의 항체를 생산하여 특징 규명에 사용하였다. 각 하이브리도마로부터 모세포 (FACS로)의 반응성을 보유하고 있는 하나의 클론을 선택했다. 각 클론에 대해 5-10개의 바이알 세포 뱅크를 제조하여 액체 질소에 보관했다.
CD20 /1차 스크린에 결합하는 인간 모노클로날 항체의 선별: 항체의 이소타입을 결정하기 위해 이소타입 ELISA를 수행했다. 마이크로타이터 플레이트의 웰을 4℃에서 밤새 PBS 중의 1 ㎍/ml의 마우스 항-인간 카파 경쇄 (50 ㎕/웰)로 인큐베이션하여 코팅했다. 5% 닭 혈청으로 블로킹한 후, 플레이트를 상청액과 반응시키고, 이소타입 대조군을 정제했다. 그 다음, 플레이트를 상온에서 1-2시간 동안 인큐베이션했다. 이어서, 웰을 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4-특이적 호스라디쉬 퍼옥시다제-콘쥬게이트된 프로브와 반응시켰다. 플레이트를 상기 기술한 바와 같이 현상 및 분석했다.
4개의 하이브리도마 세포주를 제조하고, 그 중 3개는 KM 마우스와 융합시키고 1개는 HCo7 마우스와 융합시켜, 이하의 항체를 발현시켰다:
2F2: 뉴클레오티드 서열: 서열 번호 1 및 3, 및 아미노산 서열: 서열 번호 2 및 4를 갖는 인간 모노클로날 IgG1,κ 항체.
4C9: 2F2와 완전히 동일한 아미노산 서열: 서열 번호 2 및 4를 갖는 인간 모노클로날 IgG1,κ 항체.
7D8: 뉴클레오티드 서열: 서열 번호 5 및 7, 및 아미노산 서열: 서열 번호 6 및 8을 갖는 인간 모노클로날 IgG1,κ 항체.
11B8: 뉴클레오티드 서열: 서열 번호 9 및 11, 및 아미노산 서열: 서열 번호 10 및 12를 갖는 인간 모노클로날 IgG3,κ 항체.
"2F2"라는 용어는 하이브리도마 클론 2F2로부터 유래된 항체 및 하이브리도마 클론 4C9로부터 유래된 동일한 항체를 모두 지칭하기 위해 사용했다.
본 발명의 항체는 이들이 유래된 트랜스제닉 또는 트랜스크로모조멀 비인간 동물에서 결정된 것과 다른 이소타입으로 전환될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 11B8 인간 모노클로날 IgG3,κ 항체는 완전히 동일한 VH 및 VL 서열을 갖는 인간 모노클로날 IgG1,κ 이소타입으로 전환될 수 있다. 다른 실시태양에서, 2F2 IgG1,κ 항체 또는 7D8 IgG1,κ 항체는 완전히 동일한 VH 및 VL 서열을 갖는 인간 모노클로날 IgG2, IgG4, IgA1, IgA2 또는 IgE 이소타입으로 전환될 수 있다.
실시예
2
CD20
에 대한 인간 항체의 항체 시퀀싱
V
L
및
V
H
영역의 시퀀싱
RNA 제조: 제조자의 프로토콜에 따라 RNeasy 키트 (퀴아젠, 네덜란드 웨스트부르크, 류스덴)를 사용하여, 모든 HuMAb CD20 하이브리도마 세포주 (2F2, 7D8 및 11B8)의 세포 5 x 106개로부터 전체 RNA를 제조했다.
2F2 및 7 D8 의 cDNA 제조: 제조자의 프로토콜에 따라 SMART RACE cDNA 증폭 키트 (클론테크)를 사용하여, 1 ㎍의 전체 RNA로부터 RNA의 5'-RACE-Ready 상보적 DNA (cDNA)를 제조했다.
어드밴티지 HF 2 PCR 키트 (클론테크, BD) 및 이하의 프라이머를 사용하여, VH 및 VL 영역을 증폭했다:
11B8의 cDNA 제조: 제조자의 프로토콜 (2000, 버전 3)에 따라 완충액을 갖춘 AMV 리버스 트랜스크립타제 (로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 만하임), 올리고 d(T)15 (프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨), dNTP (로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 만하임) 및 RNAsin (프로메가)을 사용하여, 3 ㎍의 총 RNA로부터 11B8 세포의 RNA의 상보적 DNA (cDNA)를 제조했다.
클로닝을 위해 V H 및 V L 영역을 증폭하는데 사용된 PCR 프라이머:
사용된 프라이머 쌍:
여기서, K = T 또는 G, S = C 또는 G, R = A 또는 G, Y = C 또는 T, W = A 또는 T.
2F2 및 7 D8 을 클로닝하기 위해 V H 및 V L 영역을 증폭하는데 사용된 PCR 조건: T1 사이클러 (바이오메트라, 웨스트부르크) 상에서 HF 중합효소 믹스 (클론테크)로 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행했다.
11B8을 클로닝하기 위해 V H 및 V L 영역을 증폭하는데 사용된 PCR 조건: T1 사이클러 (바이오메트라, 네덜란드 웨스트부르크 류스덴) 상에서 앰플리택 (AmpliTaq) 중합효소 (퍼킨 엘머)로 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행했다.
pGEMT -벡터 시스템 II 에서 V H 및 V L 의 클로닝 (2F2, 7 D8 및 11B8): PCR 산물을 아가로스 겔 상에서 분석한 후, 생성물을 QIAEX II 겔 추출 키트 (퀴아젠, 네덜란드 웨스트부르크 류스덴)로 정제했다. 각 VH 및 VL 영역의 독립적으로 증폭된 2가지의 PCR 산물을 제조자의 프로토콜 (1999, 버전 6)에 따라 pGEMT-벡터 시스템 II (프로메가)에 클로닝했다.
E. coli JM109를 형질전환시킨 후, 각각의 콜로니를 T7 및 SP6 프라이머, 55℃에서 30 어닐링 사이클을 사용하여 콜로니 PCR로 스크리닝했다. 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트 (퀴아젠)을 사용하여, 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 정제했다. VH 및 VL 영역을 추가로 분석하기 위해, Nco1/Not1 (NE 바이오랩, 네덜란드 웨스트부르크, 류스덴) 분해를 수행하고 아가로스 겔 상에서 분석했다.
시퀀싱 (2F2, 7 D8 및 11B8): V-영역을 pGEMT-벡터 시스템 II에 클로닝한 후 시퀀싱했다. 시퀀싱은 베이스클리어 (Baseclear, 네덜란드, 라이덴)에서 수행했다. 서열은 Vbase의 생식계 V-유전자 서열과 정렬하여 분석했다 (www.mrc- cpe . cam . ac . uk / imt - doc / public / intro . htm).http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-ok.php?menu=901.
수득한 서열은 도 53-58에 나타냈다.
실시예
3
GS
-
NS
/O 세포주에서 2F2 및 11B8의 재조합 생산
2F2T: 단편을 GS 불변 영역 벡터 pCONγ1f 및 PCONκ (론자 (Lonza))에 클로닝하기 위해 최적의 코작 (Kozak) 서열 및 적합한 제한효소 부위를 포함하는 프라이머를 사용하여, 2F2 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 표준 클로닝 벡터, pGem-5Zf (프로메가)로부터 PCR로 증폭했다.
증폭 후, 단편을 정제하고 클로닝하기 위해 제한효소로 분해하여 2개의 벡터에 라이게이션했다. 중쇄 가변 단편을 Hind III 및 Bsi WI로 분해하여, Hind III 및 Bsi WI로 분해한 pCONγ1f 벡터로 라이게이션하고 알칼리성 포스파타제로 탈인산화했다. 경쇄 가변 단편을 Hind III 및 Apa I으로 분해하여, Hind III 및 Apa I으로 분해한 PCONκ 벡터로 라이게이션하고 알칼리성 포스파타제로 탈인산화했다. pCONγ1f/가변-중쇄 및 PCONκ/가변-경쇄 벡터는 도 1 및 2에 각각 나타냈다. 형질전환된 E. coli 콜로니를 콜로니 PCR로 검사하고, 각각의 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) 제작물의 2개의 양성 콜로니를 플라스미드 단리를 위해 생장시켰다. 상기 4개의 클론의 단리된 플라스미드를 시퀀싱하여 서열을 확인했다. HC 클론 모두, 그리고 LC 클론 중 하나는 올바른 서열을 갖는 것으로 밝혀졌다.
2개의 HC 및 1개의 LC 제작물을 조합해 2가지의 LC-HC 조합을 만들고, CHO-K1 세포에 일시적으로 코트랜스펙션시켜 적절한 2F2 항체 생산을 위해 제작물을 검사했다. 상기 발현 실험에서 모든 조합에 대해 정상적인 생산 수준에 도달했고, 이중-유전자 벡터를 제작하기 위해 HC 및 LC 구조물에 대해 1 클론을 선택했다.
중쇄 벡터, pCONγ1f/가변-중쇄로부터의 완전한 발현 카세트를 경쇄 벡터, pCONκ/가변-경쇄로 라이게이션시켜, 표준 클로닝 방법으로 HC 및 LC 제작물을 이중-유전자 클로닝 벡터내에서 조합하고 pCONγ1f/κ2F2로 명명했다. pCONγ1f/κ2F2 벡터는 도 3에 나타냈다.
이 제작물을 CHO-K1 세포에 다시 일시적으로 트랜스펙션하여 기능적으로 시험한 결과, 정상적인 발현 수준을 보였다.
pCONγ1f/κ2F2 플라스미드의 가변 영역을 시퀀싱하여 정확한 서열을 재확인했다.
발현에 필수적인 영역의 외부를 절단하는 독특한 제한효소, Pvu I으로 pCONγ1f/κ2F2를 분해하여, 안정한 트랜스펙션을 위한 선형 플라스미드를 제조했다. 아가로스 겔 전기영동으로 완전히 선형화되었음을 확인하고, DNA를 정제하여 사용하기 전까지 -20℃에 보관했다.
상기 선형 DNA 플라스미드를 일렉트로포레이션으로 NS/0 숙주 세포에 6회 트랜스펙션했다. 트랜스펙션 후, 세포를 96-웰 플레이트에 분배하여 배양했다. 선택적 배지 (10%의 투석한 태아 소 혈청 (dFCS) 및 10 μM의 GS-억제제 L-메티오닌 술폭시민을 함유하지만, 글루타민은 결여됨)를 첨가하고, 플레이트를 모니터링하여 트랜스펙션되지 않은 세포가 죽었을 때 트랜스펙션된 세포의 초점 (foci)을 남기는지 측정했다. GS 벡터 시스템과 관련된 보다 상세한 내용은 WO 87/04462를 참조한다. 트랜스펙션된 플레이트를 약 3주 동안 인큐베이션하여 콜로니가 형성되도록 했다. 생성된 콜로니를 현미경으로 검사하여 콜로니가 분석하기에 적합한 크기인지 (웰 바닥의 60% 이상을 덮는 크기), 그리고 각 웰에 단 1개의 콜로니만 존재하는지 확인했다. IgG,κ-ELISA로 436 트랜스펙션체로부터의 세포 상청액을 조립된 항체에 대해 스크리닝했다. 이 데이터를 이용하여, 증식을 위해 111 트랜스펙션체를 선별하고 정적 배양 (static culture)에서 추가로 평가했다. 선별된 세포주의 배양을 확장시켜 저혈청 함유 배지 (소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하고 1% dFCS를 첨가)에 적응시키고, 정적 배양에서 생산성을 추가로 평가했다 (ELISA 및 컨플루언스 백분율 측정). 순위가 가장 높은 65 세포주를 증식을 위해 선별했다. 저혈청-함유 배지 (BSA를 함유하고 1% dFCS를 첨가) 중의 배치 진탕 플라스크 현탁 배양에서 선별된 세포주의 생산성을 예비적으로 평가했다. 수확 항체 농도 (ELISA로) 및 허용되는 성장 특징에 기초하여, 30 세포주를 선별하여 배치 진탕 플라스크 현탁 배양을 사용하여 무혈청 배지 중에서 추가로 평가했다. 가장 높은 항체 농도를 보인 10 세포주를 무혈청 배지 중의 공급-배치 (fed-batch) 진탕 플라스크 현탁 배양에서 추가로 2회 분석했다. 수확시 생성물 농도를 잘 알려진 표준 방법에 따라 단백질 A 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 측정했다. 모든 세포주는 단백질 A HPLC로 측정했을 때 671-1333 mg/L 범위의 우수한 수율로 2F2 항체를 생산했다 (2F2T로 표시함).
11B8T: 다음과 같이 트랜스펙션 과정을 약간 변형하여, 유사한 방식으로 11B8의 재조합 생산을 위한 GS-NS/O 세포주를 확립했다 (11B8T로 표시함).
선형 DNA 플라스미드를 일렉트로포레이션으로 NS/0 숙주 세포에 4회 트랜스펙션했다. 결과 콜로니를 현미경으로 검사하여 콜로니가 분석하기에 적합한 크기인지 (웰 바닥의 60% 이상을 덮는 크기), 각 웰에 단 1개의 콜로니만 존재하는지를 확인한 후, 596 트랜스펙션체로부터의 세포 상청액을 IgG,κ-ELISA로 조립된 항체에 대해 스크리닝했다. 이 데이터를 이용하여, 증식을 위해 100 트랜스펙션체를 선별하고 정적 배양에서 추가로 평가했다. 선별된 세포주의 배양을 확장시켜 저혈청 함유 배지 (소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하고 1% dFCS를 첨가)에 적응시키고, 정적 배양에서 생산성을 추가로 평가했다 (ELISA 및 컨플루언스 백분율 측정). 순위가 가장 높은 60 세포주를 증식을 위해 선별했고, 생산성 데이터를 얻을 수 없는 추가의 13 세포주도 증식시켰다. 저혈청-함유 배지 (BSA를 함유하고 1% dFCS를 첨가) 중의 배치 진탕 플라스크 현탁 배양에서 선별된 세포주의 생산성을 예비적으로 평가했다. 수확 항체 농도 (ELISA로) 및 허용되는 성장 특징을 기초로 10 세포주를 선별하여, 저혈청-함유 배지 (BSA를 함유하고 1% dFCS를 첨가) 중의 공급-배치 진탕 플라스크 현탁 배양에서 추가로 2회 분석했다. 수확시 생성물 농도를 잘 알려진 표준 방법에 따라 단백질 A 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 측정했다. 이에 기초하여, 세포주 중 하나를 폐기했다. 그 나머지 9 세포주는 단백질 A HPLC로 측정했을 때 354-771 mg/L 범위의 우수한 수율로 모두 11B8 항체를 생산했다 ("11B8T"로 표시함).
실시예
4
하이브리도마
-유래 2F2와
트랜스펙토마
-유래 재조합 2F2T의 비교
겔 전기영동 (SDS-PAGE 및 자연 (native) 아가로스 겔 전기영동)을 사용한 결과, 2F2 및 2F2T는 크기가 동일하며 전기전 하전에 있어서만 약간 다른 것으로 나타났다.
또한, 2F2 및 2F2T는 FACScalibur™ (벡톤 딕킨슨, 미국 캘리포니아주 산디에고)를 사용하여 유세포 분류법으로 측정했을 때, CD20-트랜스펙션된 NS/O 세포 및 Raji 세포에 유사한 친화도로 결합했다. 트랜스펙션되지 않은 NS/0 세포에는 결합이 관찰되지 않아, 2F2 및 2F2T의 특이성을 입증해주고 있다. 또한, 2F2 및 2F2T는 농도-의존적 방식으로 ARH-77 세포 (IgG 혈장 세포 백혈병), Daudi 세포, DOHH 세포 (여포성 중심모세포성/중심용해성 림프종으로부터 진행된 난치성 면역아세포 B 세포 림프종, DSMZ, 독일 브라운슈베이크) 및 Raji 세포에서 동일한 정도로 CDC를 유도했고, 유세포 분류법 (FACScalibur)으로 세포 용해를 측정했다 (PI-양성 세포의 수). 두번째 실험에서는, 2F2 및 2F2T의 농도를 일정하게 유지하면서 상이한 농도로 혈청을 첨가했다. 2F2 및 2F2T 간에 현저한 차이는 관찰되지 않았다.
최종적으로, 세포-관련 CD20에 결합된 2F2 및 2F2T는 보체 인자 C1q에 동일한 정도로 강하게 결합했다. C1q의 결합을 검출하기 위해 플루오레신-콘쥬게이트된 항-C1q 폴리클로날 항체를 사용하여 Daudi 세포, DOHH 세포 및 Raji 세포에서 실험을 수행했다.
실시예
5
CD20
에 대한 인간 항체의 결합 특성
상이한 세포주에 대한 결합: NS/0, 인간 CD20으로 트랜스펙션된 NS/O, Daudi 및 Raji 세포를 4℃에서 30분 동안 인간 항체 2F2, 7D8 및 11B8를 함유하는 배양 상청액과 인큐베이션한 후, FITC-콘쥬게이트된 항-인간 IgG Ab와 인큐베이션했다. FACScalibur 유세포 분석기를 사용하여 유세포 분류법으로 결합을 평가했다. 형광 강도를 음성 대조군 이소타입 매치된 샘플과 비교했다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 3개의 항체 모두 인간 CD20으로 트랜스펙션된 NS/0 세포에 결합한 반면, 트랜스펙션되지 않은 부모 NS/0 세포에서는 결합이 관찰되지 않았다. 또한, 3개의 항체 모두 2가지의 상이한 버킷 림프종 B 세포주 (Raji 및 Daudi)에 결합하여 2F2, 7D8 및 11B8이 CD20에 특이적임을 보여주고 있다. 7D8 또는 11B8을 함유하는 상청액을 비포화 조건하에서 시험한 결과, 2F2에 비해 보다 낮은 평균 형광 강도가 관찰되었다.
유세포 분류법으로 측정한 2F2의 EC 50 수치: 인간 B 세포 상에 발현된 CD20에 대한 2F2의 명백한 친화도를 측정하기 위해, 3명의 인간 공여자로부터 단리된 PBMC를 이용하고 CD3-음성 세포를 게이팅 (gating)하여 2F2의 결합 곡선을 구했다. 단리된 PBMC를 일련의 농도 범위의 FITC 표지된 2F2와 1시간 동안 인큐베이션하고, FACS 상에서 분석하여 평균 형광 강도 (MFI)를 측정했다. MFI 수치는 도 5a 및 5b에 항체 농도에 대한 함수로서 나타냈다. 그래프 패드 프리즘 (Graph Pad Prism) 3.02를 사용하여 비선형 회귀로 EC50 수치를 계산했다. 인간에서 2F2의 EC50 수치는 3명의 공여자 모두에서 평균 (±평균 표준오차 (s.e.m.)) 287 ± 112.7 ng/ml (1.9 ± 0.1 nM)로서 유사했다.
CD20 발현 세포에 대한 125 I- 표지된 mAb 의 결합: 요오도비즈 (Iodobeads, 피어스 케미칼 캄파니, 일리노이주 락포드)를 사용하여 mAb를 요오드화했다. 125I-표지된 mAb를 계열 희석하여, 아지드화 나트륨 및 2-디옥시글루코스의 존재하에 Ramos-EHRB 세포 (37℃에서 2시간 동안)와 인큐베이션하여 세포내이입 (endocytosis)을 예방했다. 이어서, 세포에 결합된 125I 표지된 mAb 및 유리 상태의 125I 표지된 mAb를 프탈레이트 오일 혼합물을 통해 14,000 x g에서 2분 동안 원심분리로 분리하여, 결합 평형을 교란시키지 않으면서 신속하게 분리했다. 그 다음, 결합된 항체와 함께 펠렛화된 세포를 감마 계수기 (왈락 UK 사, 영국 밀톤 케인즈)로 카운팅했다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 2F2 및 11B8는 유사한 KD (또는 유사한 포화점)를 나타내, 두 항체 모두 유사한 친화도로 결합함을 보여준다. 그러나, 11B8은 2F2보다 낮은 수준에서 포화되어, 상이한 형태의 CD20을 인식한다는 것을 암시하고 있다. 또한, 이는 유사한 수준의 결합 포화 (세포 당 약 2-3 x 105의 항체 분자)에서 나타난 바와 같이, 유사한 수의 2F2 및 리툭시맵 항체 분자가 Ramos-EHRB 세포 및 Daudi 세포 상의 CD20에 결합함을 입증하고 있는 추가의 실험과도 일치한다. 이와 대조적으로, 11B8 및 B1은 이의 절반 수준에서 포화되었고 약 1-2 x 105의 항체 분자만이 Ramos-EHRB 세포 (도 7a) 및 Daudi 세포 (도 7b)에 결합했다.
요오드화된 항체가 Fc-수용체를 통해 결합할 가능성을 배제하기 위해, 항-CD20 F(ab')2 단편을 사용하여 결합 곡선을 확인했다. 역시, 유사한 수의 2F2 및 리툭시맵-F(ab')2 단편이 Ramos-EHRB 및 Daudi 세포 모두에 결합했다. 또한 이 실험에서도, Ramos-EHRB 세포 및 Daudi 세포에 결합한 2F2 또는 리툭시맵 항체 분자의 수는 세포에 결합된 11B8 및 B1 분자수의 약 2배에서 포화되었다.
해리 속도: mAb의 해리 속도를 측정하기 위해, Ramos-EHRB 세포 (아지드/2DOG의 존재하에 최종 부피 1 ml)를 37℃에서 2시간 동안 2 ㎍/ml의 125I mAb와 인큐베이션하여 최대의 결합을 달성했다. 소형원심분리기에서 원심분리한 후 (2000 rpm에서 2분 동안), 상청액을 제거하고 펠렛을 신속하게 1 ml의 배지에 재현탁하여, 37℃에서 15 ml 코니칼 튜브 내의 9 ml 배지로 즉시 옮겼다. 그 이후 2시간에 걸쳐 다양한 시점에서 0.4 ml의 샘플을 제거하고 프탈레이트 오일 상에서 분리하여, 세포 표면 상에 잔류하고 있는 방사능표지된 mAb의 수준을 측정했다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 2F2 및 11B8 모두 리툭시맵 또는 B1보다 현저하게 느리게 CD20으로부터 해리되었다.
항- CD20 F( ab ) 2 단편의 해리 속도: Ramos-EHBR 세포를 2F2, 11B8 및 리툭시맵의 125I-표지된 F(ab)2 단편 2 ㎍/ml로 각각 포화시켰다. Ramos-EHBR 세포를 세척하고 고농도의 표지되지 않은 항체의 존재하에 인큐베이션했다. Ramos-EHRB 세포에 대한 최대 (초기) 결합을 100%로 정했다. 로딩 후 3시간에 걸쳐 여러 시점에서 0.4 ml의 샘플을 제거하고 프탈레이트 오일 상에서 분리하여, 세포 표면 상에 잔류하고 있는 방사능 표지된 mAb의 수준을 측정했다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 2F2 및 11B8은 리툭시맵보다 CD20의 표면으로부터 훨씬 더 느리게 해리되었다. 90분에서, 약 50%의 F(ab)2 리툭시맵 분자가 세포에 결합한 반면, 3시간 후에는 F(ab)2 2F2 분자의 절반이 해리되었다. 2F2, 11B8T 및 리툭시맵에 대한 kd (koff) 수치는 다음과 같이 계산했다:
F(ab)2 2F2: kd = ln 2/t1 /2 (sec) = ln 2/10800 (sec) = 6.4 x 10-5 sec-1
F(ab)2 11B8T: kd = ln 2/t1 /2 (sec) = ln 2/9000 (sec) = 7.7 x 10-5 sec-1
F(ab)2 리툭시맵: kd = ln 2/t1 /2 (sec) = ln 2/5400 (sec) = 1.3 x 10-4 see-1
항- CD20 mAb 의 기능적 오프 속도: 리툭시맵에 비해 느린 2F2 해리 속도의 영향을 기능적 CDC 검정법으로 평가했다. 이를 위해, Daudi 또는 SU-DHL4 세포를 10 ㎍/ml의 항-CD20 mAb 또는 이소타입 대조군 항체와 미리 인큐베이션하고, 세척하여 상이한 시점에 대해 배지 중에서 인큐베이션했다. 검정법 개시 후의 상기 시점에서, 샘플을 보체 (정상 인간 혈청 20 vol/vol%)와 인큐베이션한 다음, 37℃에서 45분 동안 더 인큐베이션했다. 그 후, PI (프로피듐 요오다이드) 염색법을 사용하여 FACS 상에서 세포 용해를 측정했다. 용해된 세포 % (PI-양성 세포)는 도 10a (Daudi 세포) 또는 도 10b (SU-DHL4 세포)에 인큐베이션 시간에 대한 함수로서 나타냈다. 2F2는 양 세포주에서 모두 높은 CDC를 유도했고, 6시간 후 90% 이하의 세포가 여전히 용해되어 있어, 세포의 CD20 포화가 대부분 세포의 보체-매개 용해를 유도하도록 충분히 높게 유지됨을 보여주고 있다. 상기 해리 속도 연구와 대조적으로, 그리고 이와 일치하도록 리툭시맵은 세포로부터 신속하게 해리되었고, 6시간의 인큐베이션 기간 이후 특이적인 용해를 유도하지 못했다. 11B8을 대조군으로 사용했고 11B8은 CDC를 유도하지 않았다.
실시예
6
CD20
에 대한 인간 항체의
CDC
혈청 제조: 건강한 지원자로부터 혈액을 채취해 오토셉 겔 및 응고 활성화제 진공 채혈관 (BD 바이오사이언시즈, 뉴저지주 루터포드)에 넣고, 실온에서 30-60분 동안 둔 다음 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여, 보체 용해를 위한 혈청을 제조했다. 혈청을 수집하여 -80℃에 보관했다.
유세포 분류법: 유세포 분류법을 위해, 셀퀘스트 프로 소프트웨어 (BD 바이오사이언시즈, 캘리포니아주 마운틴뷰)를 구비한 FACScalibur 유세포 분석기를 사용했다. 포워드 사이드워드 산란 (FCS) 역치의 조정으로 배제한 세포 찌꺼기의 분석을 위해 5000회 이상의 결과를 수집했다.
CDC 동역학: 첫번째 실험 세트 (n=3)에서, 인간 혈청을 첨가하기 전에 10분 동안 10 ㎍/ml의 2F2, 리툭시맵 및 IgG 대조군 항체를 각각 첨가하여 5가지의 상이한 B-세포주, 즉 Daudi, SU-DHL-4, Raji, DOHH 및 ARH-77의 CDC 동역학을 측정했다. CDC 유도 후 여러 시간 간격으로 (1시간 이하) 세포를 PI 용액에 현탁하여, 세포 용해 (PI-양성 세포의 수)를 유세포 분류법으로 측정했다. 결과는 도 11a (ARH-77 세포), 11b (Daudi 세포), 11c (Raji 세포), 11d (DOHH) 및 11e (SU-DHL-4)에 나타냈다. 도시한 바와 같이, 항체 첨가는 5분 내에 세포 용해를 유도했다. 흥미로운 점은, 2F2를 첨가하면 5가지 B-세포주 모두에서 80% 이상의 현저한 세포 용해가 야기되었다는 점이다. 리툭시맵은 SU-DHL-4 및 Daudi 세포주에서만 80%이상의 세포 용해를 야기한 반면, DOHH 세포주의 세포 용해는 ~50%였고, ARH-77 및 Raji 세포주에서는 20% 미만이었다. IgG 대조군 항체로는 용해가 관찰되지 않았다 (도 11b에서만 데이터를 도시함).
CDC 혈청 역가측정: 별도의 실험 세트 (n=5)에서, 0.5 ㎍/ml 및 5 ㎍/ml의 2가지 상이한 항체 농도에서 NHS (정상 인간 혈청)의 역가를 측정했다. 일정한 농도 범위의 NHS를 첨가하기 전에, 세포를 10분 동안 2F2 또는 리툭시맵으로 미리 인큐베이션했다. CDC 유도 45분 후, 세포를 PI 용액에 재현탁했다. 세포 용해 (PI-양성 세포의 수)를 유세포 분류법으로 측정했다. 도 12A-D는 용해된 (PI-양성) 세포의 백분율을 NHS 농도의 함수로 나타내고 있다. 도 12A는 Daudi 세포의 세포 용해, 도 12b는 ARH-77 세포의 세포 용해, 도 12c는 DOHH 세포의 세포 용해, 그리고 도 12d는 Raji 세포의 세포 용해를 보여주고 있다. NHS 농도가 증가하면 세포 용해가 증가되는 것이 관찰되었다. 2F2 첨가시 가장 높은 NHS 농도 및 항체 농도에서 Daudi 세포의 최대 용해가 야기되었다. 리툭시맵은 가장 높은 NHS 농도에서 약 50%의 Daudi 세포의 용해를 유도했다.
ARH-77 세포에서, 가장 높은 농도의 NHS 및 2F2만이 약 75%의 세포 용해를 일으켰다. 이보다 낮은 항체 농도는 ARH-77 세포의 용해를 유도하기에는 부족했다. 리툭시맵은 이 실험에서는 ARH-77 세포의 세포 용해를 야기할 수 없었다.
2F2는 높은 농도 및 낮은 농도에서 모두 DOHH 세포의 NHS-농도 의존적 세포 용해를 유도할 수 있었던 반면, 리툭시맵은 이러한 조건하에서는 용해를 야기할 수 없었다.
최종적으로, 2F2는 Raji 세포의 NHS-농도-의존적 용해를 야기했고, 이는 5 ㎍/ml mAb를 사용한 경우에만 명백했다. 리툭시맵으로는 용해가 관찰되지 않았다.
상기 실험에서, 이소타입 대조군 항체로는 용해가 관찰되지 않았다 (데이터는 도시하지 않음).
CDC 항체 역가측정: 항-CD20 항체가 낮은 농도에서 CDC를 유도하는 능력을 측정하기 위해, 실험을 수행하고 항체의 역가를 측정했다 (n=6). 다양한 세포주를 NHS를 첨가하기 전에 10분 동안, 일정한 농도 범위의 2F2 및 리툭시맵과 각각 미리 인큐베이션했다. 37℃에서 45분 동안 인큐베이션한 후 (최대 용해가 일어남) 세포를 PI 용액에 재현탁하고, 유세포 분류법으로 세포 용해 (PI-양성 세포의 수)를 측정했다. 도 13a (Daudi 세포), 13b (DOHH 세포), 13c (ARH-77 세포), 및 13d (Raji 세포)는 용해된 (PI-양성) 세포의 백분율을 항체 농도의 함수로 보여주고 있다. 2F2와 리툭시맵 모두 세포 용해에 농도-의존적 증가를 유도했다. 2F2는 2 ㎍/ml 첨가시 80% 이상의 Daudi 세포 용해를 유도한 반면, 리툭시맵으로는 10 ㎍/ml를 첨가한 후에도 이 수준에 도달하지 않았다. 또한, 2F2는 0.4 ㎍/ml에서 80% 이상의 DOHH 세포 용해를 유도한 반면, 리툭시맵으로는 이 농도에서 최소한의 용해만 관찰되었다. 리툭시맵에 의한 DOHH 세포의 용해 (총 세포의 ~30%를 분석)는 10 ㎍/ml에서 최대에 도달했다. 2F2에 의한 ARH-77 및 Raji 세포의 용해 유도는 낮았지만, 10 ㎍/ml의 항체 농도에서는 여전히 ~70% 용해를 달성했다. 가장 높은 농도에서, 리툭시맵은 ~23%의 ARH-77 세포에서만, 그리고 ~6%의 Raji 세포에서만 용해를 유도했다.
유사한 실험에서, Daudi 및 Raji 세포주의 CDC를 유도하는 능력에 대해 2F2, MT, 11B8T 및 리툭시맵을 조사했다 (도 14a 및 14b 참조). 또한, 이 실험에서 (트랜스펙토마-유래) 2F2T로는 10 ㎍/ml에서 80% 이상의 Daudi 세포 용해가 관찰된 반면, 리툭시맵은 심지어 10 ㎍/ml에서도 단 60% 용해에만 도달했다 (도 14a 참조). Daudi 세포의 2F2T로의 용해는 하이브리도마-유래 2F2로의 용해와 동일했다.
Raji 세포의 용해는 보다 어려웠지만, 역시 2F2와 2F2T 모두 유사한 정도로 Raji 세포의 용해를 유도했다 (도 14b). 리툭시맵은 Raji 세포의 CDC를 유도할 수 없었는데, 이는 도 13d에 나타낸 실험과 동일하다.
도 14a 및 14b에서 알 수 있는 바와 같이, Daudi나 Raji 세포 모두 11B8T에 의한 CDC에 영향을 받지 않았다. B1은 Daudi 세포의 용해를 유도했지만 적은 정도일 뿐이었고, Raji 세포의 용해를 유도할 수 없었다.
Daudi 세포에서 항- CD20 의 CDC 활성: 각 항체의 CDC 활성을 측정하기 위해, 프로피듐 요오다이드 (PI)-염색된 세포의 FACS 분석으로 막 투과성의 상승을 평가했다. 요약하자면, Daudi 세포를 세척하고 RPMI/1% BSA에 1 x 106 세포/ml로 재현탁했다. 다양한 농도의 인간 모노클로날 항체를 Daudi 세포에 첨가하고, 실온에서 10-15분 동안 세포 상의 CD20에 결합하도록 하였다. 그 후, 보체원으로서 혈청을 20% (v/v)의 최종 농도로 첨가하고 혼합물을 37℃에서 45분 동안 인큐베이션했다. 그리고, 세포를 분석 전까지 4℃에 보관했다. 그 다음, 각 샘플 (150 ㎕)을 FACS 튜브 내의 PI 용액 (PBS 중의 10 ㎍/ml) 10 ㎕에 첨가했다. 혼합물을 유세포 분류법으로 즉시 평가했다. 도 15a에 나타낸 바와 같이, 2F2 및 7D8은 리툭시맵에 비해 우수한 CDC 활성을 보였다.
두번째 실험에서, 상기 기술한 바와 같이 세포를 인간 모노클로날 항체로 표지한 다음, 세척하고 인간 혈청을 첨가하기 전에 37℃에서 45분 동안 PBS에서 인큐베이션했다. 이로써 혈청 첨가시 세포에 결합한 항체만이 세포 용해를 위한 보체를 활성화시킬 있게 된다. 도 15b에 나타낸 바와 같이, 2F2 및 7D8에 비해 리툭시맵에 대해서는 CDC 활성이 감소한 것으로 나타났는데, 이는 인간 항체 (2F2 및 7D8)가 혈청 첨가 전 세포의 세척에 의해 영향을 받지 않음을 의미한다.
Raji 세포에서 항- CD20 의 CDC 활성: CD55 및 CD59의 표면 발현이 상대적으로 높아 보체 공격에 대해 저항성이 보다 높은 Raji 세포를 사용하여 CDC 활성을 평가했다. 인간 항체를 Raji 세포에 첨가하고 15분 동안 결합시켰다. 인간 혈청 (20%)을 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 45분 동안 인큐베이션했다. 도 16a에 나타낸 바와 같이, 리툭시맵은 Raji 세포의 CDC를 매개하는데 효과가 없었던 반면, 2F2 또는 7D8으로 옵소닌화한 Raji 세포에서는 현저한 수준의 세포 용해가 일어났다. 따라서, 2F2 및 7D8은 CD55/59 양성 표적 세포를 용해하는 특유의 능력을 갖는다.
별도의 실험에서, Raji 세포를 포화 농도의 항-CD55 mAb (최종 농도 5 ㎍/ml) 및 항-CD59 mAb (최종 농도 5 ㎍/ml)와 미리 인큐베이션하여, 상기 보체 방어 분자의 영향을 차단했다. 이어서, 상기와 같이 37℃에서 45분 동안 인간 항-CD20 항체를 혈청 (20%)과 함께 첨가했다. 도 16b에 나타낸 바와 같이, CD55 및 CD59 분자의 차단으로 Raji 세포가 인간 항체 2F2 또는 7D8에 의해 거의 100% 용해된 반면, 리툭시맵을 사용한 경우에는 세포 용해가 25%만 증가했다.
보체 억제제 I의 역할 - 표면 분자의 발현: CD55 및 CD59와 같은 보체 억제제는 리툭시맵-유도성 CDC에 대한 감수성에 중요한 역할을 하는 것 같으므로, B-세포주 상에서 상기 분자의 발현을 조사하면서 측정하기 위한 실험을 수행했다 (Raji, Daudi, DOHH, ARH-77 및 SU-DHL-4).
세포를 FITC-콘쥬게이트된 항-CD55, 항-CD59 및 항-CD20 항체로 염색하고 유세포 분류법으로 분자 발현을 분석했다. 결과는 하기 표 1에 나타냈다.
발현 | CD20 | CD55 | CD59 |
ARH-77 | ++ | ++++ | ++ |
Raji | + | ++ | +++ |
DOHH | ++ | +++ | ++ |
SU-DHL-4 | +++ | + | ++ |
Daudi | ++ | + | + |
보체 억제제 II 의 역할 - CD55 및 CD59 의 차단: 항-CD20-유도성 CDC에서 CD55 및 CD59의 역할을 추가로 연구하기 위해, CDC 유도 전에 두 보체 억제제 분자를 모두 특이적 항체로 차단했다 (n=3). Raji 세포는 2F2 단독으로는 부분적인 용해만이 유도되므로 사용했다. Raji 세포 (1 x 105 세포/50 ㎕)를 항-CD55 (5 ㎍/ml) 또는 항-CD59 (5 ㎍/ml) 항체와 함께 일정한 농도 범위의 2F2 및 리툭시맵과 10분 동안 미리 인큐베이션한 후, 수집한 NHS (20%)를 첨가했다. CDC 유도 45분 후, 세포를 PI 용액에 재현탁했다. 세포 용해 (PI-양성 세포의 수)를 유세포 분류법으로 측정했다. 도 17a-c는 용해된 (PI-양성) 세포의 백분율을 항체 농도의 함수로 나타내고 있고, 세 개의 실험에 대한 예시인 하나의 실험을 보여주고 있다. 도 17a는 Raji 세포의 항-CD55 항체와의 인큐베이션, 도 17b은 Raji 세포의 항-CD59 항체와의 인큐베이션, 그리고 도 17c은 Raji 세포의 항-CD55 및 항-CD59 항체와의 인큐베이션을 보여주고 있다.
도 17a에서 알 수 있는 바와 같이, 항-CD55 항체의 첨가가 2F2 또는 리툭시맵-유도성 CDC에 영향을 미치지는 않았다. 항-CD59 항체의 첨가는 2F2 및 리툭시맵 모두에 대한 세포의 감수성을 ~30% 증가시켰다 (도 17b). 항-CD55 및 항-CD59를 모두 첨가했을 때 세포의 항-CD20-유도성 용해가 ~30% 추가로 향상되었다 (도 17c).
유세포 분류법 I로 측정한 보체 인자의 역할 - C1q 결합: 항-CD20 항체 (2F2 및 리툭시맵) 및 이소타입 대조군 항체를 다양한 B-세포주에 첨가했다. 10분의 인큐베이션 후, NHS (1 vol/vol%)를 첨가했다. 37℃에서 10분 동안 추가로 인큐베이션하고 세포를 세척한 후, 상청액을 버리고 세포 펠렛을 FITC-콘쥬게이트된 항-C1q 항체와 인큐베이션했다. 데이터는 C1q로 염색한 세포의 평균 형광 강도를 보여주고 있고, 도 18a (Daudi), 도 18b (ARH-77), 도 18c (DOHH), 및 18d (Raji)에 나타냈다 (n=6). 결과는 연구한 B-세포주에 관계없이 2F2에 의한 C1q 결합의 항체 농도-의존적 증가를 보여주고 있다. 또한, 시험한 모든 세포주에서 2F2에 의한 C1q 결합은 모두 항상 리툭시맵에 의한 결합보다 높았다. 이소타입 대조군 항체에서는 평균 형광의 증가가 관찰되지 않았다 (데이터는 도시하지 않음).
유세포 분류법 II 로 측정한 보체 인자의 역할 - 고전적인 경로에 의한 보체 활성화: 항체-코팅된 세포에 대한 C4c의 고착은 고전적인 경로를 통한 보체 활성화의 활성화 지표가 된다. 항-CD20 항체 (2F2 및 리툭시맵) 및 이소타입 대조군 항체를 다양한 B-세포주에 첨가했다. 37℃에서 10분 인큐베이션한 후, NHS (1 vol/vol%)를 첨가했다. 세포를 추가로 인큐베이션 및 세척한 후, 상청액을 버리고 세포 펠렛을 FITC-콘쥬게이트된 항-C4c 항체와 인큐베이션했다. 데이터는 C4c로 염색한 세포의 평균 형광 강도를 보여주고 있고, 도 19a (Daudi), 19b (ARH-77), 19c (DOHH) 및 19d (Raji)에 나타냈다 (n=6). 모든 시험한 B-세포주에서 보체 인자 C4c의 2F2에 대한 고착화가 입증되었고 (n=3), ~1 ㎍/ml의 항체에서 최대에 도달했다. 시험한 세포주에 관계없이 2F2 결합 후 C4c의 고착화는 리툭시맵 이후보다 훨씬 높았다. 이소타입 대조군 항체에서는 평균 형광의 증가가 관찰되지 않았다 (데이터는 도시하지 않음).
열-불활성화된 혈청에서 CDC: 세포 (Daudi 세포, ARH-77 세포 또는 Raji 세포)와 항체 (리툭시맵, 2F2, 2F2T, 11B8 및 이소타입 대조군 항체 HuMab-KLH IgG1)를 일정한 농도 범위의 항-CD20 항체 중에서 10분 동안 미리 인큐베이션한 후, NHS (활성 또는 30분에서 57℃ 수조에서 열-불활성화)를 첨가했다. CDC를 유도한지 45분 후, 세포를 PI 용액에 재현탁했다. 세포 용해 (PI-양성 세포의 수)를 유세포 분류법으로 측정했다. 사용한 세포주 및 CD20-항체에 관계없이 열-불활성화된 혈청의 존재하에서는 세포의 용해가 관찰되지 않았고, 열-불활성화된 혈청의 존재하에 CDC는 관찰되지 않았다.
실시예
7
CD20
에 대한 인간 항체의
ADCC
ADCC
검정법 I
인간 호중구의 농축: 헤파린 처리한 전혈로부터 다형핵 세포 (호중구, PMN)를 농축했다. 혈액을 RPMI 1640으로 2회 희석하여 피콜 (Ficoll, 림프구 분리 배지 1077 g/ml, 710 g, RT, 20분; 바이오휘타커 (BioWhittaker), cat. 17-829E, lot no. 0148 32) 상에 층상화하고, 2000 rpm에서 20분 동안 원심분리했다. 단핵 세포 층을 제거하고, 빙냉 NH4C1 용액 (155 mM NH4Cl, 10 mM NaHCO3, 0.1 mM EDTA, pH 7.4)을 사용하여 호중구를 함유하는 펠렛 내의 적혈구를 저장 용해했다. 잔류하는 호중구를 2회 세척하고, 10% FCS (RPMI-10)를 보충한 RPMI 1640에 재현탁했다.
인간 말초 혈액 단핵 세포의 농축: 인간 혈액을 RPMI 1640으로 2회 희석하여 혈액 세포를 피콜 (Ficoll, 림프구 분리 배지 1077 g/ml, 710 g, RT, 20분; 바이오휘타커 (캠브렉스 바이오 사이언스 베르비에 (Cambrex Bio Science Verviers), 벨기에, 베르비에), cat. 17-829E, lot no. 0148 32) 상에 층상화했다. 말초 혈액 단핵 세포 (MNC)를 간기로부터 수집하여 세척하여 10% FCS, 2 mM L-글루타민, 5 U/ml 페니실린, 50 ㎍/ml 스트렙토마이신 (모두 바이오휘타커로부터 입수)을 보충한 RPMI 1640 배양 배지에 재현탁하고, 여기에 25 mM의 HEPES (바이오휘타커)를 첨가했다.
ADCC 셋업: 표적 B-세포 (새로 단리한 B-세포 또는 B-세포주로부터)를 20 μCi 51Cr (아머샴 바이오사이언시즈, 스웨덴 웁살라)로 2시간 동안 표지했다. RPMI-10으로 광범위하게 세척한 후, 세포를 1 x 105 세포/ml로 맞추었다. 전혈 또는 단리된 이펙터 세포 (50 ㎕; MNC, PMN) 또는 혈장(50 ㎕), 감작 항체 (50 ㎕), 및 RPMI-10 (50 ㎕)을 둥근 바닥 마이크로타이터 플레이트 (그라이너 바이오-원 게엠베하 (Greiner Bio-One GmbH), 독일 프릭켄하우젠)에 첨가했다. 표적 세포 (50 ㎕)를 최종 부피 200 ㎕로 첨가하여 검정을 개시했다. 단리된 이펙터 세포에 대해, 40:1의 이펙터 대 표적 (E:T) 비율을 사용했다. 전혈에 대해, 40:1의 추정된 이펙터 대 표적 비율에 상응하는 33 vol/vol%의 양을 사용했다. 인큐베이션 후 (3시간, 37℃) 원심분리로 검정을 중지하고, 섬광 계수기에서 51Cr 방출을 분 당 카운트 (counts per minute, cpm)로 3회 측정했다. 세포독성의 백분율을 하기 식으로 계산했다.
% 특이적 용해 = (실험 cpm - 기초 cpm)/(최대 cpm - 기초 cpm) x 100
여기서, 최대 51Cr 방출은 과염소산을 표적 세포에 첨가하여 (3% 최종 농도) 측정했고, 기초 방출은 감작 항체 및 이펙터 세포의 부재하에 측정했다.
통계학: 일원 분산분석 (one-way ANOVA) 후 투키의 다중 비교 사후 검증법 (Tukey's multi comparison post-hoc test)으로 데이터를 분석했다. 그래프 패드 프리즘 (윈도우에 대해 버전 3.02, 그래프 패드 소프트웨어, 캘리포니아주 산디에고)을 사용하여 분석을 수행했다.
ARH -77 세포의 용해: 첫번째 실험 실험 세트에서, ARH-77 세포를 표적 세포로 사용했다 (도 20). 2F2 (n=3), 리툭시맵 (n=3) 또는 11B8T (n=1)의 첨가로 약 50%의 ARH-77 세포의 MNC-매개 용해가 일어났다. 호중구의 존재하에서는 특이적인 용해가 관찰되지 않았다. 혈장의 첨가 (보체의 역할을 평가하기 위해)는 2F2와의 인큐베이션 후에 ARH-77 세포의 용해를 유도했지만, 리툭시맵 (p<0.05, 2F2 대 항체없이, ANOVA) 또는 11B8T와의 인큐베이션 후에는 그렇지 않았다. 전혈의 존재하에서는, 2F2와의 인큐베이션 후에 ARH-77 세포의 용해가 증가했지만 (p<0.05, 2F2 대 리툭시맵, 및 2F2 대 항체없이, ANOVA), 리툭시맵과의 인큐베이션 후에는 그렇지 않았다. 리툭시맵에 의해 유도된 특이적인 용해는 사실상 전혈의 존재하에 매우 낮았다. 11B8T는 전혈의 존재하에 약 25% (n=1)의 세포 용해를 유도했다. 항체의 부재하에, 10-15%의 비-특이적 용해가 관찰되었다.
B- CLL 세포의 용해: 두번째 실험 세트에서, B-CLL 환자 (n=12)로부터 얻은 만성 B-림프구성 백혈병 (B-CLL) 세포를 5라운드 서브클로닝한 다음, 실험에서 표적 세포로 사용했다 (도 21). 항체의 부재하에, 특이적인 용해가 관찰되지 않았지만 2F2, 11B8T 또는 리툭시맵 (10 ㎍/ml)의 첨가는 MNC-매개 특이적 용해를 10-20% (p<0.001, ANOVA) 증가시켰다. 표적 세포의 혈장 및 2F2와의 인큐베이션은 B-CLL 세포의 특이적인 용해를 유도한 반면, 11B8T 또는 리툭시맵으로는 특이적인 용해가 관찰되지 않았다 (p<0.001, ANOVA). 또한, 2F2는 전혈에서의 인큐베이션 후 B-CLL 세포의 특이적인 용해를 매개했다. 11B8T (p<0.01, ANOVA) 또는 리툭시맵 (p<0.001, ANOVA)으로는 전혈에 의한 B-CLL 세포의 특이적인 용해가 관찰되지 않았다. 호중구의 존재하에서는 특이적인 용해가 관찰되지 않았다.
리툭시맵은 시험한 종양 세포의 효과적인 ADCC를 매개할 수 있었지만 CDC는 매개할 수 없었으므로, 2F2에 의한 전혈-유도성 B-세포 용해는 보체를 통해 매개되는 것 같다.
모세포 백혈병 ( HCL ) 세포의 용해: 세번째 실험 세트에서, 혈장 또는 전혈의 존재하에 2F2, 11B8T 및 리툭시맵에 의한 HCL 세포의 ADCC에 의한 용해를 측정했다. 데이터는 도 22에 나타냈다. 호중구는 사용한 mAb에 관계없이 ADCC를 매개할 수 없었던 반면, 11B8T는 2F2 (p<0.001, ANOVA) 또는 리툭시맵 (p<0.05, ANOVA)보다 효과적으로 HCL 세포의 MNC-매개 용해를 유도할 수 있었다. 2F2 및 리툭시맵은 HCL 세포의 MNC-매개 용해를 유도할 수 없었다. 세포의 혈장-매개 용해는 리툭시맵 (p<0.05, ANOVA), 11B8T (p<0.01, ANOVA) 또는 항체 부재시 (p<0.001, ANOVA)에 비해, 2F2에 의해 현저히 증강되었다. 전혈의 존재하에 항-CD20에 의해 유도된 용해를 연구했을 때, 2F2는 세포의 완전한 용해를 유도했고 리툭시맵 (p<0.01, ANOVA), 11B8T 또는 첨가된 항체가 없을 때 (p<0.001, ANOVA)보다 우수했다.
B- ALL 세포의 용해: 2명의 환자로부터 얻은 세포를 사용하여, 2F2 및 리툭시맵이 ADCC 또는 보체에 의해 B-ALL 세포의 용해를 유도하는 능력을 조사했다 (도 23). 이전의 실험에서 관찰되었던 바와 같이, 2F2 및 리툭시맵은 유사한 정도로 B-ALL 세포의 MNC-매개 ADCC를 유도했다. 그러나 역시, 2F2는 B-ALL 세포의 혈장- 및 전혈-매개 용해를 유도할 수 있었던 반면, 리툭시맵은 그렇지 않았다.
여포성 림프종 세포의 용해: 여포성 림프종 세포 (n=2)의 용해를 조사했을 때에는 상이한 결과가 나타났다 (도 24). 2F2으로는 보다 적은 세포의 PMN-매개 용해가 관찰되었고, 2F2와 리툭시맵 모두 MNC-매개 ADCC를 유도할 수 없었다. 11B8T는 여전히 약 20%로 MNC-매개 용해를 유도할 수 있었다. 리툭시맵이 상대적으로 높은 혈장-매개 용해를 유도했지만, 2F2에 의해서 완전한 혈장-매개 용해가 관찰되었다. 또한 전혈에서는, 2F2에 의해 완전한 용해가 관찰된 반면, 리툭시맵으로는 70%의 용해가 관찰되었다. 11B8T에 의해서는 최소의 혈장- 또는 전혈-매개 용해가 관찰되었다.
1차 외투 세포 림프종 세포의 용해: 외투 세포 림프종 세포의 특이적인 용해는 유도하기가 매우 어려웠다 (n=1, 도 25). PMN 또는 MNC 및 CD20 mAb를 첨가한 후에는 2F2, 11B8T 또는 리툭시맵에 의해 최소한의 용해가 관찰되거나 용해가 관찰되지 않았다. 그러나, 2F2는 여전히 혈장 또는 전혈에 의한 용해를 약 40% 유도할 수 있었던 반면, 리툭시맵으로는 10-20%의 세포만이 용해되었다. 11B8T는 1차 외투 세포 림프종 세포의 용해를 유도할 수 없었다.
전혈에서 ARH -77 세포의 항체 농도-의존적 용해: 추가의 실험 (n=4)에서, 전혈의 존재하에 ARH-77 세포의 ADCC 유도시 농도-의존성을 분석했다. 도 26에서 알 수 있는 바와 같이, 2F2의 역가측정은 ARH-77 세포의 특이적인 용해의 백분율에서 농도-의존적 증가를 유도했다 (p<0.05: 치료-효과, 이원 분산분석 (two-way ANOVA)). 리툭시맵으로는 ARH-77 세포의 특이적인 용해가 관찰되지 않았다.
ADCC
검정법
II
51 Cr - 표지된 표적 세포의 제조: ARH-77 세포 및 Raji 세포를 RPMI++ 내에 수집하고 (3 x 106 세포), 스핀 다운하여 (1500 rpm; 5분) 140 ㎕의 51Cr (크로뮴-51; CJS11-1mCi, 배치 12; 140 ㎕은 약 100 μCi임)에 재현탁하고 인큐베이션했다 (37℃ 수조; 1시간). 세포를 세척한 후 (1500 rpm, 5분, PBS 중에서, 3x), 세포를 RPMI++에 재현탁하고 트리판 블루 배제로 카운팅했다. 세포를 2 x 104 세포/ml의 농도로 만들었다.
이펙터 세포의 제조: 제조업자의 지시에 따라, 피콜 (바이오휘타커; 림프구 분리 배지, cat 17-829E)로 40 ml의 헤파린 혈액으로부터 말초 혈액 단핵 세포 (MNC)를 새로이 단리했다. 세포를 RPMI++에 재현탁한 후, 세포를 트리판 블루 배제로 카운팅하고 1 x 106 세포/ml의 농도로 조정했다.
ADCC 셋업: 50 ㎕의 RPMI++를 96 웰 플레이트에 피펫팅하고 50 ㎕의 51Cr-표지된 표적 세포를 첨가했다. 그 후 50 ㎕의 항체를 첨가하고, RPMI++에서 희석했다 (최종 농도 10, 1, 0.1, 0.01 ㎍/ml). 세포를 인큐베이션하고 (RT, 10분), 50 ㎕의 이펙터 세포를 첨가하여 이펙터 대 표적의 비율을 50:1로 하였다 (최대 용해를 측정하기 위해, 이펙터 세포 대신 5%의 트리톤-X-100 50 ㎕를 첨가했다). 세포를 스핀다운하고 (500 rpm, 5분) 인큐베이션했다 (37℃, 5% CO2, 4시간). 세포를 스핀다운한 후 (1500 rpm, 5분), 100 ㎕의 상청액을 수확하여 마이크로닉 (micronic) 튜브에 넣고 감마 계수기로 카운팅했다. 특이적인 용해 백분율은 다음과 같이 계산했다.
% 특이적인 용해 = (샘플 cpm - 표적 세포만의 cpm)/(최대 용해 cpm - 표적 세포만의 cpm) x 100
통계학: 일원 분산분석 후 투키의 다중 비교 사후 검증법으로 데이터를 분석했다. 그래프 패드 프리즘 (윈도우에 대해 버전 3.02, 그래프 패드 소프트웨어, 캘리포니아주 산디에고)을 사용하여 분석을 수행했다.
ARH -77 및 Raji 세포의 항체 농도-의존적 용해: 리툭시맵에 비해 ARH-77 및 Raji 세포 (n=3)의 ADCC 유도 능력에 대해 2F2T 및 11B8T를 시험했다.
이펙터 세포로서 MNC를 사용하여, ARH-77 세포의 ADCC에서 CD20 mAb와의 용량-효과 관계를 관찰했다 (도 27). 2F2T와 11B8T 모두 10 ㎍/ml의 mAb에서 최대 (50%)인 ARH-77 세포의 특이적인 용해를 유도했다. 리툭시맵은 표적 세포의 25% 용해만을 유도했다. 이소타입 대조군 항체 (HuMab-KLH)의 첨가는 ADCC를 유도하지 않았다. MNC 첨가 없이는 특이적인 용해가 관찰되지 않았다 (데이터는 도시하지 않음).
Raji 세포를 표적 세포으로 사용한 경우, ARH-77 세포에서와 유사한 결과가 나타났다 (도 28). 2F2T는 낮은 농도에서 11B8T보다 더 효능이 있는 것이 보임에도 불구하고, 2F2T와 11B8T 모두 Raji 세포의 MNC-매개 용해를 유도했다. 2F2T 및 11B8T으로 달성된 최대 용해는 약 35%였다. 20%의 표적 세포만이 리툭시맵에 대해 감수성임에도 불구하고, 리툭시맵은 Raji 세포의 MNC-매개 용해를 유도했다. 이소타입 대조군 항체 (HuMab-KLH)의 첨가는 ADCC를 유도하지 않았다. MNC 첨가 없이는 특이적인 용해가 관찰되지 않았다 (데이터는 도시하지 않음).
실시예
8
FRET
및
트리톤
-X 불용성 분석
형광 공명 에너지 전달 ( FRET )을 위한 Cy3 - 및 Cy5 - 콘쥬게이트된 mAb 의 제조: 제조자의 지시서에 기술된 바와 같이, 모노클로날 항체를 Cy3 및 Cy5의 이관능성 NHS-에스테르 유도체에 직접 콘쥬게이션시켰다 (아머샴 바이오사이언시즈 UK Ltd). 요약하면, mAb를 0.1 M 탄산염/중탄산염 완충액 (pH 9)에 대해 투석했다. 그 후, 염료를 H20에 용해하여 1 mg의 mAb에 즉시 첨가하고 실온에서 45분 동안 암실에서 인큐베이션했다. PBS로 평형화한 PD10-세파덱스 G25 컬럼에 의한 겔 크로마토그래피로, 표지된 mAb를 콘쥬게이션되지 않은 염료로부터 분리했다. Cy3에 대해 ε552 = 150/MM/cm, Cy5에 대해 ε650 = 250/mM/cm, 그리고 단백질에 대해 ε280 = 170/mM/cm에서, 커플링의 몰 비율을 분광광도법으로 측정했고, 5- 내지 8-배 과량 염료:단백질의 범위였다.
FRET 분석: Daudi 세포를 PBS/0.1% BSA에 5 x 106 세포/ml로 재현탁하고 동일몰의 공여자 (Cy3)-콘쥬게이트된, 그리고 수용자 (Cy5)-콘쥬게이트된 mAb를 합해 세포 현탁액에 첨가했다 (최종 농도 10 ㎍/ml). 세포를 4℃ 또는 37℃에서 30분 동안 암실에서 인큐베이션했다. 20-배 몰 과량의 콘쥬게이션되지 않은 mAb와 미리 인큐베이션한 후 각 실험에 공여자- 및 수용자-콘쥬게이트된 mAb로 표지된 세포를 포함시키고, 동일몰의 표지되지 않은 mAb의 존재하에 공여자- 또는 수용자-콘쥬게이트된 mAb로 표지된 세포를 포함시켰다. 표지된 항원과의 결합을 평가하기 위해, FACScalibur (BD 바이오사이언시즈)를 사용하여 유세포 분석 FRET 측정을 수행했다. 585 nm (FL2) 및 650 mn (FL3)(양자 모두 488 nm에서 여기됨)에서의 형광 강도, 및 661 nm (FL4)(635 nm에서 여기됨)에서의 형광 강도를 검출하여 하기 식에 따라 FRET을 계산하는데 사용했고, 여기서 A는 수용자 (Cy5)이고 D는 공여자 (Cy3)이다. 얻어진 모든 수치는 이하의 식으로 자가형광에 대해 보정했다.
FRET = FL3(D,A)-FL2(D,A)/a-FL4(D,A)/b
(여기서, a = FL2(D)/FL3(D), b = FL4(A)/FL3(A))
단일-표지된 세포로부터 수집한 데이터를 사용하여 보정 파라미터를 구했고, 측각 광산란을 사용하여 찌꺼기 및 죽은 세포를 게이팅 아웃 (gating out)시켰다. 이중 표지된 세포 상의 공여자와 수용자 mAb 유도체 간의 FRET은 488 nm에서 수용자 감작된 방출로 환산하여 표현했다. 보다 큰 FRET 수치는 공여자- 및 수용자 표지된 항체 간의 물리적 연관성에서 보다 가깝거나, 보다 높은 밀도의 수용자-표지된 mAb가 공여자-표지된 mAb의 근처에 존재함을 의미한다.
트리톤 X-100 ( TX ) 불용성에 의한 래프트 관련 항원의 평가: 래프트 마이크로도메인에서 항원의 존재에 대한 신속한 평가로서 이전에 기술된 바와 같이, 저온에서 트리톤 X-100 (TX) 불용성에 기초한 유세포 분류법을 사용했다. 간략하게 말하자면, Daudi 세포를 RPMI/1% BSA로 세척하고 2.5 x 106/ml로 재현탁했다. 이어서, 세포 (100 ㎕)를 37℃에서 15분 동안 10 ㎍/ml의 FITC 콘쥬게이트된 mAb와 인큐베이션하고, 차가운 PBS/1% BSA/20 mM 아지드화 나트륨 (PBS-BS)으로 세척하여 샘플을 절반으로 나누었다. 검정법의 나머지 과정에 걸쳐 모든 샘플을 얼음에 보관했다. 1/2은 얼음 상에 유지하여 100% 표면 항원 수준을 계산했지만, 다른 것은 얼음 상에서 15분 동안 0.5% TX로 처리하여 불용성 래프트 분획에 잔류하고 있는 항원의 비율을 측정했다. 그 다음, 세포를 검정법의 나머지 과정 전체에 걸여 4℃에서 유지하고, PBS-BS에서 1회 세척하여 PBS-BS에 재현탁하고 유세포 분류법으로 평가했다. 표적 항원의 래프트와의 회합의 본질적인 수준을 결정하기 위해, 세포를 먼저 얼음 상에서 15분 동안 0.5% TX로 처리하고 PBS-BS에서 세척한 후, FITC-표지된 mAb와 결합시켰다.
도 29a, 29b 및 29c에 나타낸 바와 같이, 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 분석은 2F2 또는 7D8와의 인큐베이션시 CD20의 군집 형성을 보여주고 있다. 11B8와의 인큐베이션 시에는 이러한 군집 형성이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 TX 치료 데이터와도 일치하고 (도 29c 참조)(즉, 11B8과 달리 2F2 및 7D8은 결합 후 세포의 불용성 분획으로 유지된다), 2F2 및 7D8이 결합시 CD20을 B 세포막의 지질 래프트 구획 내로 이동시킨다는 개념을 뒷받침하고 있다.
도 30 (FRET 수치 및 일원 분산분석 후 투키의 다중 비교 사후 검증법을 사용한 3가지의 실험의 평균 표준오차)에 나타낸 바와 같이, FRET 분석은 리툭시맵 및 2F2의 군집 형성을 보여주고 있는 반면, 11B8T로는 군집 형성이 관찰되지 않았다. 이러한 데이터는 도 31 (n=2)에 나타낸 바와 같이 0.5% TX로의 처리 후 FITC-표지된 mAb의 결합으로 얻은 데이터와 일치한다.
지질 래프트 분획의 제조 및 웨스턴 블롯팅: CD20의 지질 래프트와의 결합을 시험하기 위한 다른 방법은, 옵티프렙 (Optiprep, 시그마)을 수크로스 대신 사용한 것을 제외하고는 문헌 [Deans, J.P., et al ., J. Biol . Chem ., 1998. 273(1):pp 344-348]에 개시된 수크로스 구배 분획법을 사용하여 래프트와 비-래프트 막 분획 간에 CD20의 분포를 연구하는 것이다. CD20에 대한 모노클로날 항체 (10 ㎍/ml)을 37℃에서 20분 동안 Daudi 세포 (1 x 107)와 결합시켰다. 이러한 인큐베이션 후 세포를 펠렛화하고, PBS로 2회 세척하여 빙냉 용해 완충액 (MES-완충 식염수 (25 mM MES, pH 6.5, 150 mM NaCl, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 5 ㎍/ml 아프로티닌, 5 ㎍/ml 류펩틴, 10 mM EDTA) 중의 1.0% TX)에서 용해시켰다. 세포 펠렛을 완전히 재현탁하고 얼음 상에서 20분 동안 인큐베이션했다. 그 후, 용해물을 60%의 차가운 옵티프렙 (시그마) 400 ㎕와 혼합했다. 각각 용해 완충액 중의 35%, 30%, 25%, 20%, 0%의 옵티프렙의 600 ㎕ 단계에 샘플을 부가했다. 4℃에서 18시간 동안 40.000 rpm에서 구배를 회전시켰다. 최상부로부터 6개의 분획을 수집하여 4-15% SDS-PAGE 겔 상에서 분리하고, 니트로셀룰로스 막 상으로 전달하여 1차 항체 (마우스 항-CD20 다혈청 (polysera); 세로텍, 영국)와 인큐베이션한 후, HRP-콘쥬게이트된 2차 항체 (토끼 항 마우스-HRP; 미국 메인주, 바 하버, 잭슨)와 인큐베이션했다. 블롯을 수퍼시그날 웨스트 듀라 연장 기간 기질 (Supersignal West Dura extended duration substrate, 미국 메사추세츠주, 우번, 피어스)을 사용하여 시각화했다.
결과는 도 32에 나타냈다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이, CD20 분자는 고밀도 분획 5 (미처리된 세포)에만 국한되어 나타났다. 리툭시맵으로 처리한 세포는 보다 저밀도인 막 분획 2 및 3에 현저한 비율로 CD20 분포가 뚜렷하게 이동하는 것을 보여주고 있는데, 이는 막 래프트가 침강될 것으로 예상되는 분획과 일치한다. 2F2로 처리한 세포도 이러한 분획 2 및 3으로의 이동을 보였다. 반면, 20분 동안 11B8T로 처리한 세포는 분획 5의 CD20 분자로 처리하지 않은 세포와 유사한 분포를 보였다. 결론적으로, 2F2 및 리툭시맵에 대한 결합은 CD20 분자의 저밀도 막 분획으로의 이동을 유도하지만, 11B8T에 대한 결합은 그렇지 않다.
실시예
9
CD20
에 대한 인간 항체에 의한 버킷 세포주의
아폽토시스
아폽토시스: 1 ml의 조직 배양 배지 중의 Daudi 세포, 0.5 x 106를 1 또는 10 ㎍/ml의 mAb 또는 대조군 항체와 함께 24-웰 편평 바닥 플레이트에 넣고 37℃에서 인큐베이션했다. 20시간 후, 세포를 수집하여 어넥신-V-FITC 결합 완충액 (BD 바이오사이언시즈)으로 세척하고, 4℃에서 15분 동안 암실에서 어넥신 V-FITC (BD 바이오사이언시즈)로 표지했다. 세포를 분석하기 전까지 4℃로 유지했다. 각 샘플 (150 ㎕)을 FACS 튜브 내의 PI 용액 (PBS 중의 10 ㎍/ml) 10 ㎕에 첨가했다. 셀퀘스트 프로 소프트웨어 (BD 바이오사이언시즈, 캘리포니아주 마운틴뷰)를 구비한 FACScalibur 유세포 분석기를 사용하여 혼합물을 유세포 분류법으로 즉시 평가했다. 10,000회 이상 수집하여 분석했다.
Daudi 세포에서의 아폽토시스 유도: Daudi 세포를 CD20에 대한 인간 항체 (1 ㎍/ml)의 존재하에 20시간 동안 인큐베이션했다 (2차 가교 항체의 첨가없이). 아폽토시스 유도는 유세포 분류법을 사용하여 어넥신V/PI 염색법으로 평가가했다.
도 33a-g에 나타낸 바와 같이, 11B8은 아폽토시스를 유도하는 명백한 증거를 보였다 (항-IgM 항체에 의해 유도되는 것과 유사). 2F2 및 7D8는 Daudi 세포의 아폽토시스를 유도하지 않았다. 아폽토시스-유도 마우스 항-CD20 항체, AT80은 대조군으로 사용했다.
Raji 세포에서의 아폽토시스 유도: Raji 세포의 아폽토시스 유도를 일정한 농도 범위의 CD20 mAb로 시험했다. 도 34는 어넥신-V-양성 세포의 백분율을 보여주고 있다. 도 34로부터 알 수 있는 바와 같이, 양성 대조군 마우스 항-인간 CD20-mAb, B1은 10 ㎍/ml mAb에서 Raji 세포의 아폽토시스를 최대 약 70%로 농도-의존적 증가시켰다. 또한, 11B8은 아폽토시스의 강력한 유도자로서 10 ㎍/ml mAb에서 Raji 세포 중 최대 53.4%에서 아폽토시스를 야기했다. 반면, 2F2 및 리툭시맵은 세포의 아폽토시스 유도에 매우 불량해서 대조군 수준에 비해 아폽토시스 수준을 약간 상승시켰다.
Daudi 세포에서의 아폽토시스 유도: 1.0 ㎍/ml의 CD20 mAb (도 35a 및 35b)를 첨가한 후, Daudi 세포를 표적 세포로 사용했을 때 동일한 결과를 얻었다. 도 35a의 데이터는 총 어넥신-V 양성 세포를 나타내고, 도 35b의 데이터 (X-축은 어넥신-V, Y-축은 PI임)는 초기 아폽토시스 (어넥신-V 양성 및 PI 음성) 및 후기 아폽토시스 (어넥신-V 양성 및 PI 양성)에서 Daudi 세포의 백분율을 나타낸다. 또한, B1 (65.9%)과 11B8T (56.3%)는 1.0 ㎍/ml의 농도로 사용했을 때 강력한 아폽토시스 유도자였다 (도 36). 2F2T의 첨가로 낮은 수준의 Daudi 세포 (17%) 아폽토시스가 야기되었다. 리툭시맵을 첨가하여 약 29%의 Daudi 세포 아폽토시스가 야기되었다. 이소타입 대조군 항체 HuMab-KLH의 첨가는 Daudi 세포의 아폽토시스를 야기하지 않았다 (6%).
실시예
10 세포의
CD20
에 대한 인간 항체와의
호모타입
부착
호모타입 응집은 아폽토시스 유도와 관련된다. 따라서, 항-CD20 mAb가 B 세포의 호모타입 응집을 유도하는 능력을 조사했다.
Ramos - EHRB 세포의 호모타입 응집: 항-CD20 항체 11B8, 2F2 또는 7D8 (가교없이)의 존재하에 Ramos-EHRB 세포 (1 ml의 조직 배양 배지 중의 0.5 x 106)를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 호모타입 부착의 유도를 광학 현미경으로 평가했다 (상기 기술한 바와 같이).
도 36a-e에 나타낸 바와 같이, 11B8는 Ramos-EHRB 세포의 현저한 응집을 야기했다 (쥐 항-CD20 항체, AT80에 의한 응집과 유사). 2F2 및 7D8은 Ramos 세포의 호모타입 응집을 유도하지 않았다.
Daudi 세포의 호모타입 응집: Daudi 세포를 1 또는 10 ㎍/ml의 항-CD20 mAb 또는 대조군 항체와 24-웰 편평 바닥 플레이트에 넣고, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션했다. 호모타입 응집의 정도를 광학 현미경으로 측정했다. 도 37에서 알 수 있는 바와 같이, 2F2는 1.0 ㎍/ml (그리고 10 ㎍/ml, 데이터는 도시하지 않음)에서 Daudi 세포의 호모타입 응집을 거의 유도하지 않았다. 리툭시맵은 약간의 Daudi 세포의 호모타입 응집을 유도했다. 반면, B1 항체는 강력한 호모타입 응집 유도자였다.
실시예
11
CD20
에 대한 인간 항체를 사용하는 면역 요법
Daudi 세포를 투여한 SCID 마우스의 고용량 (100 ㎍)의 2F2 및 7 D8 로의 치료: SCID 마우스를 할란 UK 사 (Harlan UK Ltd., 영국 블랙손, 옥손)로부터 입수하여 사육하고 무균 조건하에서 유지했다. 12-16주령의 코호트 SCID 마우스의 꼬리 정맥에 Daudi 세포 (2.5 x 106)를 정맥내 주사하고, 7일 후 100 ㎍의 2F2 또는 7D8을 동일한 경로로 주사했다. 사지 마비가 나타나면 동물 윤리 위원회의 지침에 따라 동물을 희생시켰다. 도 38에 나타낸 바와 같이, 2F2 또는 7D8로 치료한 후 마우스의 생존율이 연장되었다.
Tanoue 세포를 투여한 SCID 마우스의 고용량 (100 ㎍)의 2F2 및 리툭시맵으로의 치료: 12-16주령의 코호트 SCID 마우스 (할란 UK 사, 영국 블랙손, 옥손)의 꼬리 정맥에 Tanoue 세포 (200 ㎕ PBS 중의 2.5 x 106)를 정맥내 주사하고, 7일 후 100 ㎍ (200 ㎕ PBS 중의)의 항-CD20 mAb를 동일한 경로로 주사했다. 이 실험에서, 2F2를 리툭시맵 및 B1과 비교했다. 후지 마비가 나타나면 동물을 희생시켰다. 결과는 도 39에 나타냈다. 39일 째에 첫번째 2마리의 대조군 마우스가 죽었고, 이 군 내에서 죽는 것은 54일째에 완료되었다. 2F2 치료 후의 이 시간 간격에서는 단 1마리의 마우스만이 죽었고, 이 군에서는 다른 마우스에 대한 생존율이 현저하게 증가했다. 종양 세포 주사후 81일째에는 1마리의 마우스가 죽었고, 나머지 마우스 (총 수의 60%)는 종양 투여 후 100일째에 실험 종결 후에도 생존했다. 반면, 리툭시맵은 5마리 마우스 중 2마리에 대해서만 생존율을 증가시켰고 (투여 후 66 및 83일째에 죽음), 실험 종결까지 생존한 마우스는 없었다. B1-군에서 SCID 마우스의 생존율은 2F2 군에서의 생존과 유사했고, 48일 째에 2마리의 마우스가 죽었으며 76일째에는 1마리의 마우스가 죽었다. 이 군에서는 실험을 종결했을 때 40%가 살아남았다.
Daudi 세포를 투여한 SCID 마우스에 대한 2F2 및 리툭시맵 치료의 선량-반응: 종양형성에 대한 보호에 있어서 2F2의 효능을 리툭시맵과 비교 평가하기 위해, Daudi 종양 세포를 투여한 SCID 마우스의 치료시 용량 적정을 수행했다. Daudi 세포는 Tanoue 세포보다 더 많은 CD20을 발현하며, 시험관내 사멸에 보다 민감하다. 10개 군의 SCID 마우스 (군 당 4마리) 및 1개 대조군 (5마리의 SCID 마우스)에게 0일 째에 2.5 x 106의 Daudi 세포 (200 ㎕ PBS 중의)를 정맥내 주사한 다음, 7일째에 20, 5, 2, 0.5 또는 0.1 ㎍ (200 ㎕ PBS 중의)의 리툭시맵, 2F2 또는 PBS (대조군)로 정맥내 치료했다. 후지 마비가 나타났을 때 동물을 희생시켰다. 결과는 도 40에 나타냈다.
대조군에서는, 26-29일의 시간 간격 내에 모든 마우스가 죽었다. 그러나, 2F2에서는 명백한 용량-효과 관계가 관찰되었다 (도 40, 위쪽 그래프). 반면, 0.1 ㎍ 및 0.5 ㎍의 2F2 용량으로는 효과가 관찰되지 않았고, 2 ㎍의 2F2는 41일째까지 생존율을 실질적으로 연장시켰으며, 5 ㎍의 2F2는 47일째까지 생존율을 연장시켰으고, 20 ㎍의 2F2는 심지어 50일째까지 생존율을 연장시켰다.
이와 대조적으로, 리툭시맵은 20 ㎍의 가장 높은 농도에서 시험했을 때조차도 생존율을 약간만 증가시켜, 보다 낮은 시험 농도에서는 용량-효과 관계가 관찰되지 않았다 (도 40, 아래쪽 그래프).
Daudi 종양을 갖는 SCID 마우스의 11B8T 및 B1에 의한 치료: 200 ㎕ PBS 중의 Daudi 세포 (2.5 x 106)를 12-16주령의 코호트 SCID 마우스의 꼬리 정맥에 정맥내 주사하고, 7일 후 200 ㎕ PBS 중의 100 ㎍의 11B8 또는 B1을 동일한 경로로 주사했다. 후지 마비가 나타나면 동물을 희생시켰다. PBS로 처리한 대조군 마우스에서는, 35-53일의 시간 간격 내에 모든 마우스가 죽었다 (도 41). 11B8T 치료는 마우스를 강력하게 보호하여, 종양 주사후 72일 내지 98일 사이에 마우스가 죽었다. B1-치료군에서 대부분의 마우스는 98일까지 생존했고, 실험 종료, 즉 100일째까지는 40%의 마우스가 생존했다.
실시예 12 SCID 마우스를 사용한 Daudi - luc 이종이식 모델에서 항- CD20 항체의 평가
인간 B-세포 종양 세포의 파종성 성장을 외부 광학 영상화하여, 마우스 모델에서 항-CD20 항체의 치료 효능을 평가했다. 이 모델에서, 종양 세포는 반딧불이 루시퍼라제와 트랜스펙션했다. 마우스에게 루시퍼린 (분자 프로브, 네덜란드 라이덴)을 투여하고, 고민감성 CCD 카메라를 사용하여 생물학적 발광 영상화로 표지된 세포를 생체내에서 검출할 수 있다. 문헌 [Wetterwald et al . (2002) American Journal of Patholoy , 160(3):1143-1153] 참조.
Daudi 세포를 진 테라피 시스템즈 (캘리포니아주 산디에고)의 gWIZ 루시퍼라제로 트랜스펙션하고 10%의 FCS, Pen/Strep, 피루브산 나트륨 및 1 ug/ml의 푸로마이신 (시그마)을 갖는 RPMI에 배양했다. 발광측정기에서 루시퍼라제 발현에 대해 (RLU/1 x 105 세포로 표현), 그리고 FACS로 CD20 발현에 대해 세포를 분석했다. 2.5 x 106개의 루시퍼라제-트랜스펙션된 Daudi 세포/마우스를 SCID 마우스에게 정맥내 주사했다. 주사한지 8일 후 2F2T, 11B8T, 리툭시맵, B1 또는 이소타입 대조군 항체 (huIgG1)(치료군 당 6마리의 마우스)의 단일 용량 (10 ㎍)으로 마우스를 처리했다. 영상화를 위해 케타민/자일라진/아트로핀의 혼합물을 마우스에게 복강내 주사하여 마취시켰다. 합성 D-루시퍼린 (나트륨염, 분자 프로브)을 25 mg/ml의 용량으로 복강내 투여했다. 이어서, 마우스를 광 타이트 박스 (light tight box)에 넣고 3분 후, 벌스어레이 (VersArray) 1300B 액체 질소 냉각 CCD 검출기 (로퍼 사이언티픽)를 사용하여 영상화를 시작했다. 5분의 노출 기간에 걸쳐 루시퍼라제로부터 방출된 광자를 카운팅했다. 참고를 위해 발광하 흑백 영상을 제작었다. 데이터 수집 및 영상 분석을 위해 메타뷔 (MetaVue) 소프트웨어 (오리버설 이미징 코포레이션)를 사용했다. 그래프패드 프리즘 버전 3.02 (그래프패드 소프트웨어 인크)를 사용하는 뉴만-큘스 (Newman-Keuls) 사후 검사로 분산도를 일원 분석하여, 실험군 간의 편차에 대한 통계학적 중요도를 결정했다.
흑색 측으로부터의 영상화는 1주일 간격으로 수행했다. 치료 8일째에 광 방출은 꼬리의 주사 부위에서만 검출되었다. 14일째에 이소타입 대조군 (huIgG1)의 모든 마우스에서, 그리고 리툭시맵 군의 마우스 1마리에서 원격 부위 종양 형성이 검출되었다. 그 이후의 주에서는 광 방출이 점진적으로 증가했다. 도 42는 39일째 (치료한지 31일 후)에 제작한 모든 마우스의 영상을 보여주고, 여기서 생물학적 발광은 마우스 몸체의 흑백 영상 상에 중첩하여 적색으로 나타냈다 (마우스에서 어두운 영역)(광 강도 > 5분 당 50 광자). 25일, 32일, 39일 및 46일째에 각 마우스의 종양 질량을 몸체 표면 상의 광 신호를 통합하여 정량했다 (도 43 참조). 이소타입 대조군에서 가장 빠른 종양 성장을 관찰했다. 리툭시맵으로 치료한 경우 종양 성장이 현저히 억제되었다. 그러나, 2F2T, 11B8T 및 B1에 의한 종양 성장 억제가 보다 더 현저하게 효능이 있었다 (현저성의 수준에 대해서는 하기 표 2 참조).
실시예
13
시노몰구스
원숭이에서의
예비 실험 및 약동학적 연구
본 실험은 연속 4일 동안 1일 1회 시노몰구스 원숭이 (약 2살; 체중 범위 2.1-2.6 kg)에게 정맥내 주입 투여 (복재 정맥을 통한) 후, 2F2의 약동학적 패턴 및 약리학적 효과를 측정하는 것을 목표로 한다. 본 연구에서는 또한, 그의 등가 가능성을 측정하기 위해 리툭시맵의 약리학적 효과를 비교했다. 이를 위해, 6마리의 수컷 및 6마리의 암컷 시노몰구스 원숭이를 6개의 용량군으로 나누고, 연속 4일 동안 10 ml/kg의 일정한 용량 부피로 1.25, 6.25 및 12.5 mg/kg/일 용량 수준의 2F2 또는 리툭시맵을 투여하여, 총 5, 25 및 50 mg/kg을 각각 투여했다. 최종 용량 투여를 완료하고, 130일 동안의 투여후 관찰 기간 (post dose observation period) 동안 동물을 유지시켰다. 본 연구 동안 사용한 방법 및 과정은 영국 보건부에서 정하고 있는 OECD 우수한 실험실 기준에 관한 원칙 (OECD Principles of Good Laboratory Practice)에 따랐다. 모든 동물은 규칙적인 간격으로 비건강 (ill health) 또는 치료에 대한 반응의 신호에 대해 관찰했으며 신체 검사를 실시했다. 본 연구 동안 혈액학, 응고, 임상 화학 및 뇨분석에 대한 실험실적 조사를 수행했다. 투여 및 투여후 관찰 기간 전체에 걸쳐 유세포 분류법 분석을 위해 혈액 샘플 및 림프절 생체 조직을 얻었다 (표재성 림프절로부터). CD3, CD4, CD8, CD20 및 CD21의 세포 표현형을 유세포 분류법으로 분석했다. 투여후 관찰 기간이 종료되면 동물을 희생시키고 자세하게 부검했다.
2F2 또는 리툭시맵으로의 치료와 관련되는 것으로 생각되는 임상적 부작용 또는 임의의 결과들은 없었다. 도 44 및 45는 치료한 동물 각각의 말초 혈액에서 CD20 및 CD21 발현 세포의 유세포 분류법 분석을 보여주고 있다. 도 46은 림프절의 CD20 발현 세포에 대한 유세포 분류법 분석을 보여주고 있다. 이와 함께, 연구 동안 분석한 두 가지의 표현형은 모두 6.25 mg/kg/일 (총 25 mg/kg) 및 12.5 mg/kg/일 (총 50 mg/kg)의 2F2 및 리툭시맵 투여 후 강력하면서 효과적인 B 세포 제거를 보였다. 또한, 데이터에 따르면 2F2 처리한 동물의 림프절 및 말초 혈액의 CD20 발현 세포는 25 mg/kg 및 50 mg/kg을 투여한 지 약 75일 후에, 즉 리툭시맵으로 처리한 동물에 비해 현저하게 늦게 재집단화가 시작되는 것으로 나타났다.
또한, 도 47a-c는 말초 혈액 중에서 CD20lowCD23+CD40high 발현 세포 아집단의 유세포 분류 분석을 보여주고 있다 (Y. Vugmeyster et al. (2003) Cytometry 52A:101-109).
연속 4일 동안 1일 1회 정맥내 주입 투여로 1.25 mg/kg (도 47a), 6.25 mg/kg (도 47b) 및 12.5 mg/kg (도 47c) 용량 수준에서 2F2 또는 리툭시맵을 처리한 원숭이로부터 수득한 말초 혈액 세포를, 실온에서 10분 동안 항-인간 CD20 FITC 쥐 모노클로날 항체 (코울터)와 인큐베이션했다. 그 후, PBS와 함께 카운트 비드를 첨가하고 세포를 2회 세척한 다음 (300 g로 10분 동안), 유세포 분석기 (벡크만 코울터)에서 CD20lowCD23+CD40high 대 CD20highCD23+CD40low 발현 세포 아집단을 즉시 분석했다. 나타낸 CD20lowCD23+CD40high 세포의 결과는 ㎕ 당 세포로 나타냈다. 도 47에서 알 수 있는 바와 같이, 2F2는 리툭시맵에 비해 CD20lowCD23+CD40high 발현 세포의 완전하면서 보다 장기적인 제거를 유도할 수 있었다.
실시예
14 부위-지정 돌연변이유발에 의한
에피토프
맵핑
돌연변이유발 접근법을 사용한 에피토프 맵핑 연구에서, 제2 세포외 루프의 위치 170의 알라닌 (A170) 및 위치 172의 프롤린 (P172)이 공지된 항-CD20 항체에 의한 인간 CD20의 인식에 중요한 것으로 나타났다. 딘 및 그의 동료들의 연구 (Deans and colleagues, M. J. Polyak, et al ., Blood, (2002) 99(9): pp 3256-3262; M.J. Polyak, et al ., J. Immunol ., (1998) 161(7): pp 3242-3248)에서는, A170 및 P172를 상응하는 쥐 CD20 잔기 S170 및 S172로 변화시킴으로써 시험한 모든 항-CD20 mAb의 결합이 억제되었다. 그러나, 리툭시맵과 같은 대부분 항체는 S170 및 S172가 인간 A170xP172 서열로 돌연변이된 쥐 CD20을 인식하기 때문에 AxP 에피토프의 인식에 있어서 일부 이종성이 인지되었지만, 일부 다른 것들은 AxP 서열의 N-말단에 바로 인접한 추가의 돌연변이를 필요로 한다. A170xP172 모티프가 본 발명에 따른 항체의 결합에도 중요한지 여부를 확인하기 위해 부위-지정 돌연변이유발로 AxP 서열을 SxS로 돌연변이시키고 (AxP 돌연변이 = A170S, P172S), 세포를 AxP 돌연변이 및 야생형 (WT) CD20 DNA로 트랜스펙션시켜 항-CD20 mAb의 결합 특성을 비교했다.
추가의 돌연변이체를 제조했는데, 부위-지정 돌연변이유발에 의한 P172S (위치 172의 프롤린을 세린으로 돌연변이), N166D (위치 166의 아스파라긴을 아스파르트산으로 돌연변이), 및 N163D (위치 163의 아스파라긴을 아스파르트산으로 돌연변이)로 돌연변이된 아미노산 잔기가 본 발명의 항체 결합에 중요한지 여부를 평가했다.
이를 검사하기 위해, 제한효소 부위 및 최적의 발현을 위한 이상적인 코작 서열을 도입하는 적합한 프라이머를 사용하여 CD20 코딩 서열을 증폭함으로써 CD20 발현 벡터를 제작했다. 증폭된 단편을 분해하여 발현 벡터 pEE13.4에 라이게이션했다. E. coli를 형질전환한 후 삽입체에 대해 콜로니를 스크리닝하고, 정확한 서열을 확인하기 위한 시퀀싱을 위해 2개의 클론을 선별했다. 제작물은 pEE13.4CD20HS로 명명했다.
AxP 돌연변이를 도입하고 인간 CD20의 세포외 루프 영역에 20개의 마우스 돌연변이를 도입하기 위해, 돌연변이유발을 수행했다. 제한효소 분해 및 시퀀싱으로 돌연변이유발을 검사했다. 구조물을 CHO 세포 (AxP 돌연변이에 대해) 또는 HEK293F 세포에 일시적으로 트랜스펙션하고, 트랜스펙션한지 24 또는 48시간 후에 유세포 분류법으로 분석했다.
올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머: 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하고 이소젠 (Isogen) BV (마르쎈 (Maarssen), 네덜란드)로 정량했다. 프라이머를 100 pmol/㎕의 농도로 물에 용해하여 필요할 때까지 -20℃로 보관했다. PCR 및 시퀀싱프라이머는 표 3에 요약했다.
핵산의 광학 밀도 결정: 제조자의 지시서에 따라 울트로스펙 (Ultrospec) 2100 프로 클래식 (아머샴 바이오사이언시즈, 스웨덴 웁살라)으로 광학 밀도를 측정했다. DNA 농도를 OD260nm (여기서, 1 OD260nm 유닛 = 50 ㎍/ml임) 분석으로 측정했다. 기준 용액은 핵산을 용해하는에 사용한 용액과 동일했다.
E. coli 배양으로부터 플라스미드 DNA 의 단리: 퀴아젠 (네덜란드 류스덴, 웨스트부르크 BV)의 키트를 제조자의 지지서에 따라 사용하여, 플라스미드 DNA를 E. coli 배양으로부터 단리했다. '벌크' 플라스미드 제조를 위해서는, 하이-스피드 플라스미드 맥시 키트 또는 하이-스피드 플라스미드 미디 키트를 사용했다 (퀴아젠). 소규모의 플라스미드 제조 (즉, 2 ml의 E. coli 배양액)를 위해서는, 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트 (퀴아젠)을 사용했고, 50 ㎕의 TE (트리스-HCl 10 mM pH 8.0, EDTA 1 mM)에 DNA를 용리했다.
PCR 증폭: Pfu-터보 핫스타트 DNA 중합효소 (스트라타진, 네덜란드 암스텔담)에 대한 제조자의 지시서에 따라, PCR 반응을 수행했다. 각 20 ㎕의 반응물은 1 x PCR 반응 완충액, 200 μM의 혼합 dNTP, 각각 6.7 pmol의 포워드 및 리버스 프라이머, 약 1 ng의 주형 DNA 및 1 유닛의 Pfu-터보 핫스타트 DNA 중합효소를 포함했다. T-구배 써모사이클러 96 (T-gradient Thermocycler 96, 바이오메트라 게엠베하, 독일 괴팅겐) 상에서 30 사이클 프로그램 - +95℃에서 2분 동안, 이어서 +95℃에서 30초, 어닐링: 45-65℃에서 30초의 구배 및 신장: +72℃에서 2분 동안의 30 사이클, 이어서 72℃에서 10분 동안의 최종 신장 단계, 이후 4℃에서 보관 - 으로 PCR 반응을 수행했다. 완료된 반응물은 아가로스 겔 전기영동으로 분석했다.
아가로스 겔 전기영동: 샘브룩의 문헌 [Molecular Cloning Laboratory Manual, 3rd edition]에 따라, 50 ml의 겔로 1 x 트리스/아세트산/EDTA (TAE) 완충액에서 아가로스 겔 전기영동을 수행했다. 겔에 함유되는 에티디움 브로마이드를 UV 광으로 관찰하여 DNA를 시각화했다. 겔 영상은 CCD 카메라 및 영상 분석 시스템 (진지놈 (GeneGnome); 영국 캠브리지 신젠 (Syngene))으로 기록했다.
제한효소 절단: 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (메사추세츠주 베벌리)로부터 제한효소를 공급받았고, 제조자의 권장사항에 따라 사용했다. 통상적으로, 100 ng을 적절한 완충액 중의 효소(들) 5 유닛으로 최종 부피 10 ㎕에서 분해했다. 적절하다면 반응 부피를 스케일업했다. 제조자가 권장하는 온도에서 최소 60분 동안 반응물을 인큐베이션했다.
서로 일치하지 않는 완충액 또는 온도가 요구되는 제한효소로 단편을 이중 절단해야할 필요가 있는 경우에는, 각 효소에 대해 유리한 조건을 순차적으로 제공하도록 연속적으로 절단을 수행했다.
알칼리성 포스파타제 처리: 새우 알칼리성 포스파타제 (USB, 오하이오주 클리블랜드)를 제조업자의 권장사항에 따라 사용했다. 알칼리성 포스파타제는 DNA 단편 말단에서 5'-포스페이트기를 제거함으로써 자가-라이게이션을 방지한다. 이는 특히 DNA 단편이 자가-라이게이션되어 복제-가능한 벡터가 될 수 있는 경우 적합하다. 효소는 대부분의 제한효소 완충액에서 활성이며 적절하다면 첨가했다. 분해 후, 70℃에서 15분 동안 온도를 높여 효소를 불활성화하였다.
PCR 및 제한효소 반응 생성물의 정제: 미니-일루트 PCR 정제 키트 (퀴아젠이 공급)를 제조자의 지시서에 따라 사용하여 정제를 수행했다. 요약하면, DNA 샘플을 5 부피의 결합 완충액 I (퀴아젠)에 희석하고 에펜돌프 원심분리 튜브 내의 미니-일루트 컬럼 상에 로딩했다. 이 조립체를 벤치-탑 미세원심분리에서 원심분리했다. 컬럼을 완충액 II (퀴아젠)로 2회 세척했다 (완충액 첨가 후 조립체를 원심분리하고, 통과한 액을 버렸다). 완충액 첨가 없이 컬럼을 원심분리로 건조시켰다. 용리 완충액을 컬럼에 첨가하여 DNA를 용리하고, 원심분리로 용리액을 수집했다. 단리된 DNA를 UV 분광법으로 정량하고 품질을 아가로스 겔 전기영동으로 평가했다.
아가로스 겔로부터 DNA 단편의 단리: 적절한 경우 (즉, 다수의 단편이 존재하는 경우), 절단한 DNA 샘플을 겔 전기영동으로 분리하고 목적하는 단편을 겔로부터 잘라내어 제조자의 지시서에 따라 QIAEX II 겔 추출 키트 (퀴아젠)로 회수했다. 요약하면, DNA 밴드를 아가로스 겔에서 잘라내어 +55℃에서 적절한 완충액에 녹였다. QIAEX II 수지를 첨가하고 5분 동안 인큐베이션했다. QIAEX II 수지를 짧은 원심분리 단계 (1분, 14000 g, RT)로 펠렛화하여 500 ㎕의 세척 완충액 PE로 2회 세척했다. 최종 펠렛을 후드에서 건조시키고 DNA를 적절한 온도에서 적절한 부피의 TE로 용리했다 (DNA의 크기에 따라).
DNA 단편의 라이게이션: 제조자의 지시서에 따라 퀵 라이게이션 키트 (Quick Ligation Kit, 뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 라이게이션을 수행했다. 각각의 라이게이션에 대해, 벡터 DNA를 10 ㎕에서 DNA의 총량이 200 ng 미만이 되도록 약 3-배 몰 과량의 삽입체 DNA와 혼합하고, 부피를 적절하게 물로 조정했다. 여기에 10 ㎕의 2 x 퀵 라이게이션 완충액 및 1 ㎕의 퀵 T4 DNA 라이게이즈를 첨가하고, 라이게이션 혼합물을 실온에서 5-30분 동안 인큐베이션했다.
박테리아로의 DNA 형질전환: 제조자의 지시서에 따라 DNA 샘플을 사용하여 열-충격 방법으로 원 샷 (One Shot) DH5α-T1R 컴피턴트 (competent) E. coli 세포 (인비트로젠, 네덜란드 브레다)를 형질전환시켰다. 요약하면, 1-5 ㎕의 DNA 용액 (통상적으로 2 ㎕의 DNA 라이게이션 혼합물)을 형질전환-컴피턴트 박테리아 세포의 분취물에 첨가하고, 혼합물을 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션했다. 그 다음, 세포를 42℃의 수조로 옮겨 30초 동안 둔 다음 얼음 상에서 5분 동안 인큐베이션하여 열-충격을 주었다. 세포를 37℃에서 교반하면서 비선택적 배양 배지 (SOC)에 1시간 동안 인큐베이션하여 세포가 회복되도록 한 후, 적절한 선택적 시약 (50 ㎍/ml의 앰피실린)을 함유하는 아가 플레이트 상에 스프레딩했다. 플레이트를 +37℃에서 16-18시간 동안, 또는 박테리아 콜로니가 나타날 때까지 인큐베이션했다.
PCR 에 의한 박테리아 콜로니의 스크리닝: PCR 콜로니 스크리닝 기술을 사용하여, 목적 서열을 함유하는 벡터의 존재에 대해 박테리아 콜로니를 스크리닝했다. 0.5 부피의 핫스타트택 마스터 믹스 (HotStarTaq Master Mix, 퀴아젠), 4 pmol의 포워드 및 리버스 프라이머를 함유하는 20 ㎕의 PCR 반응 혼합물 및 물을 PCR 튜브에 첨가했다. 콜로니를 20 ㎕ 피펫 끝으로 살짝 건드려 시험관 중의 LB 2 ml를 1회 건드리고 (상응하는 플라스미드를 함유하는 박테리아를 생장시키기 위해), 20 ㎕의 PCR 혼합물에 재현탁했다. PCR을 T-구배 써모사이클러 96 (바이오메트라) 상에서 35 사이클 프로그램 - +95℃에서 15분 동안, 이어서 +94℃에서 30초, 어닐링: 55℃에서 30초 및 신장: +72℃에서 2분 동안의 30 사이클, 이어서 72℃에서 10분 동안의 최종 신장 단계, 이후 4℃에서 보관 - 으로 PCR 반응을 수행했다. 완료된 반응물은 아가로스 겔 전기영동으로 분석했다. 콜로니 PCR에 사용한 프라이머 쌍에 대한 상세한 사항은 표 3 참조.
DNA 시퀀싱: 플라스미드 DNA 샘플을 아고와 (AGOWA, 독일 베를린)에 보내 서열 분석했다. 서열을 벡터NTI 소프트웨어 패키지 (인포맥스, 미국 메릴랜드주 프레데릭)를 사용하여 분석했다.
돌연변이유발: 퀵체인지 (QuikChange)® XL 부위-지정 돌연변이유발 키트 (Cat 200517-5, Lot 1120630, 스트라타젠 유럽)를 제조자의 지시서에 따라 사용하여 돌연변이유발을 수행했다.
에탄올 침전으로 돌연변이유발 반응물을 농축하고, 원샷 DH5α-T1R 컴피턴트 E. coli 세포로 형질전환하거나 일렉트로텐-블루 (ElectroTen-Blue)® 일렉트로포레이션-컴피턴트 세포로 일렉트로포레이션했다. 콜로니 PCR로 콜로니를 체크하여 트랜스펙션 전에 제한효소 분해했다.
HEK293F 세포 트랜스펙션: 인비트로젠으로부터 HEK293F 세포를 입수하여 제조자의 지시서에 따라 293펙틴으로 트랜스펙션했다. 모든 단일 돌연변이 서열에 대해 HEK293F 세포를 사용했다.
CHO 세포 트랜스펙션: 약 95% 컴플루언스로 성장시킨 CHO 세포를 리포펙타민 2000 (M668-019, 인비트로젠, 네덜란드 브레다)을 사용하여 CD20 야생형, 돌연변이 cDNA 또는 두 구조물 모두의 조합으로 일시적으로 트랜스펙션했다. 이를 위해, 24 ㎍의 침전시킨 DNA를 AxP 100%: WT 0%; AxP 33.3%: WT 66.6%; AxP 66.6%: WT 33.3%;AxP 0% :WT 100% 비율의 500 ㎕ 옵티멤 (optimem)에 희석했다. 각각의 트랜스펙션에 대해, 24 ㎕의 리포펙타민을 500 ㎕ 옵티멤에 희석했다. 그 다음, 희석한 리포펙타민을 인큐베이션 (RT, 5분)하고, 희석한 DNA와 희석한 리포펙타민을 합했다. 용액을 부드럽게 혼합하고 인큐베이션한 후 (RT, 20분), 1000 ㎕의 DNA/리포펙타민을 CHO 세포에 첨가하고 완전히 혼합하여, 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션했다. CHO 세포를 트랜스펙션한 지 2일 후, 세포를 FACS 완충액 (0.1% BSA 및 0.002% NaN3를 보충한 PBS)으로 2회 세척했다. CHO 세포를 트립신/EDTA (기브코 BRL, 라이프 테크놀로지스, 스코틀랜드 패이즐리) 처리하여 배양 플레이트에서 떼어냈다.
항- CD20 항체 결합: HEK293F 세포 및 CHO 세포를 2 x 106/ml 농도로 PBS에 녹이고, 둥근 바닥 플레이트 (1 x 105/웰)에 첨가했다. 그 다음, 50 ㎕의 CD20 mAb를 웰 당 10, 5, 2.5 또는 0 ㎍의 계열 희석으로 첨가했다 (4℃, 30 min). FACS 완충액 (0.1% BSA 및 0.002% NaN3를 보충한 PBS)에서 세척한 후 세포를 유세포 분석기 (벡톤 디킨슨, 미국 캘리포니아 산디에고) 상에서 분석하고, 높은 유량에서 샘플 당 5,000회 측정했다.
도 48a-e에서 알 수 있는 바와 같이, 모든 항-CD20 mAb는 WT CD20을 발현하는 CHO 세포에 결합했다. 예상되는 바와 같이 리툭시맵은 AxP 돌연변이 (도 48a)에 결합하지 않았고, 이 돌연변이에 대한 B1을 결합은 불량했다 (도 48d). 반면, 2F2와 11B8는 모두 WT 및 AxP 돌연변이 CD20에 동일하게 잘 결합했다 (도 48b 및 도 48c). 표면 상의 WT CD20 양의 적정은 실제로 리툭시맵과 B1 결합을 적정하는 것이었다. 2F2와 11B8 모두 역시 돌연변이의 부재 또는 존재에 대해 민감했다.
본 연구에서 인간 CD20에 대한 2F2 및 11B8의 결합이 아미노산 위치 170 및 172에서의 돌연변이에 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. 따라서, 2F2와 11B8 모두 신규 CD20 에피토프를 인식하는 새로운 클래스의 CD20 mAb이다.
도 49a는 2F2, 11B8T, B1 또는 리툭시맵의 돌연변이 P172S 대 WT CD20에 대한 결합 백분율을 을 나타내고, 도 49b는 MT, 11B8T, B1, CAT (CAT 13.6E12, 마우스 모노클로날 IgG2A 항-CD20 항체, 디아텍 닷 컴), 대조군 이소타입 항체 (KLH), 또는 리툭시맵의 돌연변이 CD20 (AxP) 대 WT CD20에 대한 백분율 결합을 보여준다.
위치 166의 아스파라긴이 아스파르트산 2F2로 치환된 돌연변이 (CD20N166D)는 매우 낮은 결합을 보인 반면, 도 49c에서 보는 바와 같이 B1, 리툭시맵 및 11B8T는 결합할 수 있었다. 유사한 실험에서 CAT 13.6E12 및 리툭시맵은 CD20N166D에 결합할 수 있었던 반면, 도 49d에서 보는 바와 같이 2F2T는 매우 낮은 결합만을 보였다. 위치 163의 아스파라긴이 아스파르트산으로 치환된 돌연변이 (CD20N163D)에 대해서도 역시 리툭시맵, 11B8T 및 B1은 CD20N163D에 결합할 수 있었던 반면, 도 49E에서 보는 바와 같이 2F2 및 2F2T는 매우 낮은 결합만을 나타냈다. 유사한 실험에서 CAT 13.6E12 및 리툭시맵은 CD20N163D에 결합할 수 있었던 반면, 도 49f에서 보는 바와 같이 2F2T는 매우 낮은 결합만을 나타냈다.
이 실험들은 2F2 및 11B8이 상이한 에피토프에 결합한다는 것을 보여준다.
실시예
15
펩스캔
방법을 사용한
에피토프
맵핑
펩티드의 합성: 7-, 9- 및 15-mer 펩티드를 표준 방법에 따라 합성했다. 일부 경우에 15-mer 펩티드 레그 (leg)의 화학적 연결은 잠재적으로 불연속적인 에피토프 아미노산 서열의 동정에 도움이 된다. 공지된 방법 (H.M. Geysen et al . (1984) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81:3998; J.W. Slootstra et al. (1996) Mol . Divers. 1:87; 및 WO 01/60769)에 따라, 인간 CD20 분자에 대한 2F2 또는 11B8의 결합과 관련된 결합 부위 또는 에피토프일 수 있는 7-, 9- 및 15-mer 펩티드를 합성했다. 9- 및 15-mer를 루프로 합성하고 크레딧-카드 포맷 미니-펩스캔 카드 (credit-card format mini-pepscan cards, 455 펩티드 포맷/카드)로 스크리닝했다. 루프를 이룬 모든 펩티드에서, 다양한 위치의 아미노산을 시스테인 (예를 들어, 아세틸-XCXXXXXXXXXXXCX-미니카드)로 치환했다. 표준 Fmoc-화학을 사용하여 펩티드를 합성하고 TFA를 사용하여 스캐빈저로 탈보호했다. 이어서, 탈보호된 펩티드를 마이크로어레이 상에서 아세토니트릴 (1:1 (v/v))을 보충한 중탄산암모늄 (20 mM, pH 7.9) 중의 0.5 mM 1,3-비스(브로모메틸)벤젠 용액과 반응시켰다. 마이크로어레이를 용액으로 완전히 덮이도록 용액 중에서 30-60분 동안 약하게 진탕하였다. 최종적으로, 마이크로어레이를 과량의 밀리포어 H20로 완전히 세척하고 PBS (pH 7.2) 중에 1% 소듐 도데실술페이트, 0.1% β-머캅토에탄올을 함유하는 파괴-완충액에서 70℃, 30분 동안 초음파파쇄한 후, 밀리포어 H20에서 추가로 45분 동안 초음파파쇄했다. 이어서, 마이크로웰을 ELISA-검정 스크리닝을 위해 준비했다.
펩스캔 ELISA -검정법: 공유결합적으로 연결된 펩티드를 함유하는 455-웰 크레딧 카드-포맷 폴리에틸렌 카드를 혈청 (5% 말 혈청 (v/v) 및 5% 난알부민 (w/v)을 함유하는 차단 용액에 1:1000 희석)과 인큐베이션했다 (4℃, 밤새). 세척 후, 펩티드를 항-인간 항체 퍼옥시다제 (1:1000로 희석, 1시간, 25℃)와 인큐베이션하고, 세척한 후 퍼옥시다제 기질, 2,2'-아지노-디-3-에틸벤즈티아졸린 술포네이트 및 3%의 H202 2 ㎕/ml를 첨가했다. 1시간 후, 발색을 측정했다. ELISA의 발색을 CCD-카메라 및 영상 처리 시스템으로 정량했다. 셋업은 CCD-카메라 및 55 mm 렌즈 (소니 CCD 비디오 카메라 XC-77RR, 니콘 마이크로-닉 또는 55 mm f/2.8 렌즈), 카메라 어댑터 (소니 카메라 어댑터 DC-77RR) 및 영상 처리 소프트웨어 패키지 옵티마스, 버전 6.5 (미디어 사이버네틱스, 실버 스프링, 미국 메릴랜드주 20910)로 구성된다. 옵티마스는 펜티엄 II 컴퓨터 시스템 상에서 구동했다.
상이한 항체 농도에서 펩티드에 대한 흡광도 (OD 수치)는 하기 표 4 및 표 5에 나타냈다.
표 4로부터 명백한 바와 같이, 11B8은 10 ㎍/ml 및 100 ㎍/ml 모두에서 인간 CD20의 작은 제1 세포외 루프 AGIYAP에 결합했지만, 시험한 다른 항체들은 AGIYAP에 대해 주목할 만한 결합을 보이지 않았다.
또한, 11B8은 10 ㎍/ml 및 100 ㎍/ml 모두에서 인간 CD20의 제2 세포외 루프 MESLNFIRAHTPYI에 결합을 보인 반면, 시험한 다른 항체는 MESLNFIRAHTPYI에 대해 주목할 만한 결합을 보이지 않았다.
표 5로부터 명백한 바와 같이, 리툭시맵은 1 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml 모두에서 인간 CD20의 제2 세포외 루프의 EPANPSEK에 결합을 보인 반면, 시험한 다른 항체는 EPANPSEK에 대해 주목할 만한 결합을 보이지 않았다.
실시예
16 항-
이디오타입
항체
항- 이디오타입 항체의 생성: Balb/C 마우스를 2F2 또는 11B8T로 면역화하여 마우스 항-이디오타입 항체를 제조하고, 표준 기술을 사용한 NS1 골수종 세포와의 융합으로 상기 마우스의 비장으로부터 하이브리도마를 제조했다. 이하 항-이디오타입 항체를 제조했다: 항-2F2 sab 1.1, 항-2F2 sab 1.2, 항-2F2 sab 1.3, 항-11B8T sab 2.2, 항-11B8T sab 2.3, 항-11B8T sab 2.4, 항-11B8T sab 2.5, 및 항-11B8T sab 2.6. 이들을 2F2T, 7D8 및 11B8T에 대한 특이적인 결합에 대해 시험했다. ELISA 플레이트를 정제한 2F2T, 7D8 또는 11B8T (PBS에 1-2 ㎍/ml의 최종 농도로 희석, 37℃, 2시간)로 코팅했다. 플레이트를 0.05% 트윈-20 및 2%의 닭 혈청 (RT, 1시간)을 함유하는 PBS로 블로킹했다. 이어서, 플레이트를 항-이디오타입 항체 (최종 농도 1-10 ㎍/ml로 조정, RT, 2시간) 배양액으로부터의 상청액과 인큐베이션했다. 결합된 마우스 항-이디오타입 항체는 토끼-항-마우스 IgG-HRP 콘쥬게이트된 항체 (잭슨 이뮤노리서치)으로 검출했다.
도 50에서 나타난 바와 같이, 항-2F2 sab 1.1, 항-2F2 sab 1.2, 및 항-2F2 sab 1.3은 2F2T 및 7D8에 결합했지만, 11B8T 또는 관련없는 이소타입 대조군 인간 항체에는 결합하지 않았다. 2F2T 및 7D8은 VL 및 VH 서열에 있어서 상동성이 매우 높으므로, 항-2F2 이디오타입 항체의 7D8과의 반응이 예상된다.
도 51은 항-11B8T sab 2.2, 항-11B8T sab 2.3, 항-11B8T sab 2.4, 항-11B8T sab 2.5, 및 항-11B8T sab 2.6 모두가 유사한 정도로 11B8T에 결합함을 보여주고 있다.
면역진단 수단로서의 항- 이디오타입 항체: 2F2/7D8 및 11B8T 특이적 항-이디오타입 항체는, 실험실 또는 환자 샘플에서 CD20에 대한 인간 모노클로날 항체의 수준을 검출하고 정량화하기 위한 면역진단 수단으로서 사용될 수 있다. 이는 항-CD20 항체의 약동역학을 검사하고, 항-CD20 항체의 용량을 결정 및 조정하며, 환자에게서 질병 및 치료 효과를 모니터링하는데 유용할 수 있다. 이러한 검정법의 예로서, ELISA 플레이트를 4 ㎍/ml의 항-2F2 sab 1.1, 항-2F2 sab 1.2 또는 항-2F2 sab 1.3로 코팅했다. 플레이트를 0.05% 트윈-20 및 2%의 닭 혈청 (RT, 1시간)을 함유하는 PBS로 블로킹했다. 이어서, 플레이트를 계열 희석한 2F2T (10,000-9.77 ng/ml, RT, 2시간)와 인큐베이션했다. 결합된 2F2T를 마우스-항-인간 IgG HRP-콘쥬게이트된 항체로 검출했다. 도 52a-c에 나타낸 바와 같이, 2F2T의 용량 의존적 결합을 관찰했다.
균등물
당업자라면 통상의 실험만으로도 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 실시양태의 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기 청구범위에 의해 포함되는 것이다. 종속상에 개시된 실시태양의 임의의 조합 또한 본 발명의 영역에 포함되는 것이다.
참고문헌의 삽입
본원에 언급된 모든 특허, 출원중인 특허출원 및 기타 문헌들은 그 전체로서 참고자료로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Genmab, Inc. et al.
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<130> GMI-055PC
<150> US 60/419,163
<151> 2002-10-17
<150> US 60/460,028
<151> 2002-04-02
<160> 57
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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tcag 424
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
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Asn Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
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Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys
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Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met
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<213> Homo sapiens
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1 5
<210> 20
<211> 17
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<213> Homo sapiens
<400> 20
Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
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<213> Homo sapiens
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Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile Thr
1 5
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<213> Homo sapiens
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Ser Tyr His Ala Met His
1 5
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<213> Homo sapiens
<400> 26
Ile Ile Gly Thr Gly Gly Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
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<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Asp Tyr Tyr Gly Ala Gly Ser Phe Tyr Asp Gly Leu Tyr Gly Met Asp
1 5 10 15
Val
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<213> Homo sapiens
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Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
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gatgttgtga tgacacagtc 20
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gaaattgtgc tgactcagtc 20
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cccagcgcag cttctcttcc tcctgc 26
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cgggaagatg aagacagatg 20
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
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Tyr Cys Ala Arg
115
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
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100 105 110
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Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
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Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
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Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
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Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala
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Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 57
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
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Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
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Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
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Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
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Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser
100 105 110
Asn Trp Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
115 120 125
Claims (1)
- 인간 CD20에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 유효량을 CD20을 발현하는 세포와 접촉시켜 상기 세포의 성장을 억제하는 것을 포함하는, CD20을 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법.
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