RS59005B1 - Anti-cd38 plus kortikosteroidi plus nekortikosteroidni hemoterapeutik za tretiranje tumora - Google Patents

Anti-cd38 plus kortikosteroidi plus nekortikosteroidni hemoterapeutik za tretiranje tumora

Info

Publication number
RS59005B1
RS59005B1 RS20190880A RSP20190880A RS59005B1 RS 59005 B1 RS59005 B1 RS 59005B1 RS 20190880 A RS20190880 A RS 20190880A RS P20190880 A RSP20190880 A RS P20190880A RS 59005 B1 RS59005 B1 RS 59005B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
seq
corticosteroid
cells
chemotherapeutic agent
Prior art date
Application number
RS20190880A
Other languages
English (en)
Inventor
Jan Van De Winkel
Paul Parren
Yvo Graus
Judith Oprins
Michel De Weers
Martine Van Vugt
Ole Baadsgaard
Steen Lisby
Original Assignee
Genmab As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39156080&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS59005(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genmab As filed Critical Genmab As
Publication of RS59005B1 publication Critical patent/RS59005B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A61K31/573—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone substituted in position 21, e.g. cortisone, dexamethasone, prednisone or aldosterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/69—Boron compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na tretman kancera upotrebom kombinovane terapije koja obuhvata antitelo koje vezuje CD38, kortikosteroid i nekortikosteroidni hemoterapeutski agens.
STANJE TEHNIKE
[0002] Multipla mijeloma je malignitet B ćelija koji karkteriše latentna akumulacija u koštanoj srži sekretornih plazma ćelija sa niskim proliferativnim indeksom i produženim životnim vekom. Ovan bolest na kraju napada kosti i koštanu srž, rezultirajući u multiplim tumorima i lezijama u okviru celog skeletnog sistema.
[0003] Aproksimativno oko 1% svih kancera, i nešto više od 10% svih hematoloških maligniteta odnosi se na multiplu mijelomu (MM). Incidenca MM raste sa kod starije populacije, i srednje vrednost (medijana) godina za dijagnozu je oko 61 godina.
[0004] Trenutno dostupne terapije za multiplu mijelomu uključuju hemoterapiju, transplantaciju stem ćelija, Thalomid® (talidomid), Velcade® (bortezomib), Aredia® (pamidronat), i Zometa® (zoledronična kiselina). Trenutni protokoli za tretman koji uključuju kombinaciju hemoterapeutskih agenasa kao što su vinkristin, BCNU, melfalan, ciklofosfamid, adriamicin, i prednizon ili deksametazon, dovode do kompletne remisije u stopi od oko 5% i srednje vreme preživljavanja (medijana) je otprilike 34-36 meseci od vremena dijagnoze. Nedavni napredak upotrebom hemoterapije sa visokim dozama nakon čega sledi autologa transplantacija koštane srži ili mononukleara periferne krvi je povisila stopu kompletne remisije i trajanja remisije. Ipak ukupno preživlajvanje je samo malo prolongirano, i ne postoji dokaz da je dobijen lek. Ultimatno, svi MM pacijenta ulaze u relaps čak i pod terapijom održavanja samo sa interferonom-alfa (IFN-α) ili u kombinaciji sa steroidima.
[0005] Ako je pacijent kandidat ili mogući kandidat za autologu transplantaciju, indukciona terapija često uključuje nealkilirajuću hemoterapiju, u kojoj alkilirajući agens interferira sa žetvom tj sakupljanjem stem ćelija. Poželjna ražim je VAD, koji omogužava sledeže sakupljanje (Wu KL, Clin Lymphoma Myeloma 2005;6:96). Još jedan modalitet tretmana koji je testiran u postavci indukcije pre transplantacije, uključuje Talidomid koji je kombinovan sa deksametazonom (Cavo M Blood 2005;106:35).
[0006] Efikasnost dostupnih režima tretmana hemoterapijom za MM je limitirana niskom stopom proliferacije ćelija i razvojem višestruke rezistencije. Za više od 9/% MM pacijenata, bolest postaje hemorezistentna. Kao rezultat toga, traže se alternativni tretmani i režimi koji imaju za cilj adoptivnu imunoterapiju koja cilja površinske antigene na plazma ćelijama.
[0007] CD38 je primer antigena koji je eksprimiran na takvim malignim plazma ćelijama, i eksprimira se u različitim malignim hematološkim obolenjima, uključujući ali bez ograničenja na, multiplu mijelomu, hroničnu limfocitnu leukemiju B ćelija, akutnu limfocitnu leukemiju B ćelija, Valderstormovu makroglobulinemiju, primarnu sistemsku amilodozu, limfoma ćelije plašta (mantle cell), prolimfocitnu/mijelocitnu leukemiju, akutnu mijeloidu leukemiju, hroničnu mijeloidu leukemiju, folikularni limfom, leukemiju NK-ćelija, i leukemiju plazma ćelija. Ekspresija CD38 je opisana na epitelijalnim/endotelijalnim ćelijama različitog porekla, uključujući glandularne epiteijalne ćelije u prostati, ćelije Langerhartovih ostrvaca u pankreasu, duktalni epitel u žlezdama, uključujuži parotidnu žlezdu, bronhijlane epitelijalne ćelije, ćelije u testisima i jajnicima, i epitelu tumora kolorektalnog adenocarcinoma. Obolenje gde može biti uključan ekspresija CD38, uključuje ali bez ograničenja na bronho-epitelijalne karcinome u plućima, kancer dojke (koji se razvija od preoliferacije epitela koji oblaže duktuse i lobule grudi), tumore pankreasa koji nastaju od B-ćelija (insulinome), tumore koji nastaju od epitela creva (na pr. adenokarcinom i karcinom skvamoznih ćelija). U CNS, neuroblastome eksprimiraju CD38. Druge ovakve bolesti obuhvataju karcinom u žlezdi prostate, seminoma u testisima i kancer jajnika.
[0008] Normalno, CD38 se eksprimira u hemopoetskim ćelijama, i u tvrdim (solidnim) tkivima. U odnosu na hematopoetske ćelije, većina medularnih timocita su CD38+, mirujuće i cirkulišuće T- i B-ćelije su CD38, i aktivirane ćelije su CD38+. CD38 je takođe eksprimiran u otprilike 80% mirujućih NK ćelija i monocita, i u germinalnim centralnim limfoblastima limfnih čvorova, plazma B ćelijama i nekim intrafolikularnim ćelijama. CD38 se može eksprimirati takože i u dendričnim ćelijama. Značajni deo normalnih ćelija koštane srži, posebno prekursorskih ćelija eksprimira CD38. Kao dodatak limfoidnim prekursorskim ćelijama, CD38 se takođe eksprimira na enterocitima i na trombocitima.
[0009] U smislu tvrdog tkiva, CD38 se eksprimira u crevima od strane intra-epitelijalnih ćelija i limfocita lamina propria, od strane Purkinjijevih ćelija i neurofibrilarnih čvorova u mozgu, od strane epitelijalnih ćelija prostate, β-ćelija pankreasa, osteocita u kostima, retinalnih ćelija u oku, i sarkoleme u glatkim i poprečnoprugastim mišićima.
[0010] Funkcije koje se pripisuju CD38 uključuju obe i receptorsko posredovanje u adheziji i u signalnim događajima i (eksto-) enzimsku aktivnost. Kao ektoenzim, CD38 koristi NAD+ kao supstrat za formiranje ciklične ADP-riboze (cADPR) i ADPR, ali takođe i za formiranje nikotinamida i nikotinska kiselina-adenin dinukleotid fosfat (NAADP). I za cADPR i NAADPje pokazano da deluju kao sekundarni javljači (mesindžeri) za mobilizaciju Ca2+. Konverzijom NAD+ u cADPR, CD38 reguliše ekstracelularnu koncentraciju NAD+ i samim tim ćelijsko preživljvanje kroz modulaciju NAD-indukovane smrti ćelija (NCID). Dodatno u odnosu na signalizaciju via Ca2+, CD38 signalizacija se odigrava preko među-kominikacije sa antigenreceptor kompleksom na T i B ćelijama ili drugim tipovima receptorskih kompleksa, na pr., MHC molekulima, i na ovaj način učestvije u nekoliko ćelijskih dgovora, ali i u uključivanju i sekreciji IgG1.
[0011] Anti-CD38 antitela su opisana u literature, na primer u Lande R, et al., Cell Immunol.
220(1), 30-8 (2002), Ausiello CM, et al., Tissue Antigens.56(6), 539-47 (2000), and CotnerT, et al., Int J Immunopharmacol.3(3), 255-68 (1981) and in WO2005/103083 (Morphosys). CD38 ima mnogobrojne funkcije, koje mogu al ii ne moraju biti aktivirane od strane molekula koji se vezuju za CD38. Na primer, mišije anti-CD38 antitelo IB4 ima agonističke osobine u u odnosu na CD38. Za IB4 je pokazano da indukuje aktivaciju T ćelija što je pokazano kroz mobilizaciju Ca2+ u Jurkat ćelijama (Zubiaur M, et al., J Immunol. 159(1), 193-205 (1997), da indukuje značajnu proliferaciju pmononuklearnih ćelija periferalne krvi (PBMC), da indukuje oslobađanje značajnih nivoa IL-6 i da indukuje oslobađaje detektabilnih nivoa IFN-γ (Lande, Zubiaur Morra, Ansiello supra).
[0012] Jasno je da uprkos nedavnom napretku u otkrićima i razvoju anti-kancer agenasa, mnoge forme kancera koje uključuju tumore koji eksprimiraju CD38 još uvek imaju lošu prognozu. Zato postoji potreba za poboljšanim metodama za tretiranje ovakvih formi kancera.
[0013] Peipp et al, (2005), Blood, 106, strana 944A, apstraktt 3377 odnosi se na kompletno humano CD38 antitelo koje efikasno trugeruje ADCC i CDC ćelija raka multiple mijelome i leukemije plazma ćelija.
[0014] Weers et al, 1st Joint Meeting of the European National Societies of Immunology, Sept 2006, odnosi se na HuMax- CD38, novo humano CD38 monoklonalno antitelo koje efikasno posreduje u ubijanju ćelija raka multiple mijelome i leukemije plazma ćelija. WO 2005/103083 otkriva rekombinantne entigen-vezujuće regione i antitela i funkcionalne fragmente koji obuhvataju ovakve regione za vezivanje antigena koji su specifini za CD38.
[0015] WO 2005/044855 otkriva metode terapija za tretiranje multiple mijelome koja obuhvata administraciju terepeustki efektivne količine antagina anti-CD40 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
SADRŽAJ PRONALASKA
[0016] Objekat pronalaska je da obezbedi poboljšane metode za tretman CD28-eksprimirajućih tumora koje rezultiraju u povećanoj efikasnosti i/ili produženom preživlajvanju.
[0017] Ovaj pronalazak zato obezbeđuje: (1) Humano IgG1 izotip antitelo koje vezuje CD38 za upotrebu u tretmanima kancera naznačeno time da je antitelo za administraciju, ili da se administrira u kombinovanoj terapiji sa najmanje jednim kortikosteroidom, naznačeno time da najmanje jedan kortikosteroid obuhvata glukokortikoid, naznačeno time da pomenuti najmanje jednan
nekortikosteroidni hemoterapeutski agens, obuhvata (i) talidomid ili analog talidomida i/ili (ii) inhibitor proteozoma, i naznačeno time da pomenuto antitelo obuhvata varijabilne regione humanog lakog lanac i humanog teškog lanca, naznačeno time da varijabilni region lakog lanca obuhvata VLCDR1 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:13, VL CDR2 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:14 i VLCDR3 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:15, i varijabilni region teškog lanca koji obuhvata VHCDR1 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:18, VHCDR2 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:19 i VHCDR3 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:20.
(2) Antitelo za upotrebu na osnovu (1), naznačeno time da nakon pomenutog tretmana sledi autologna transplantacija perifernih stem ćelija ili koštane srži.
(3) Antitelo za upotrebu na osnovu (1) ili (2), naznačeno time da najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens dalje obuhvata citotoksični agens i/ili inhibitor angiogeneze.
(4) Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kojeg od (1)-(3), naznačeno time da najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens dalje obuhvata alkiklirajući agens.
(5) Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kojeg od (1)-(4), naznačeno time da najmanje jedan pomenuti nekortikosteroidni hemoterapeutski agens dalje obuhvata jedan ili više agenasa koji su odabrani iz grupe koja se sastoji od: melfalana, mehloretamina, tioepa, hlorambucila, karmustina, lomustina, ciklofosfamida, busulfana, dibromomanitola, streptozotocina, dakarbazina, prokarbazina, mitomicina C, cisplatine i drugih derivate platine.
(6) Antitelo za upotrebu na osnovu (5), naznačeno time da je pomenuti derivat platine karboplatina.
(7). Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kog od (1)-(6), naznačeno time da pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata analog talidomida koji je lenalidomid ili CC4047.
(8) Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kog od (1)-(7), naznačeno time da pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata inhibitor proteozoma koji je bortezomib.
(9) Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kog od (1)-(8), naznačeno time da pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens dalje obuhvata vinka alkaloid.
(10) Antitelo za upotrebu na osnovu (9), naznačeno time da je vinka alkaloid vinkristin.
(11) Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kog od (1)-(10), naznačeno time da pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens dalje obuhvata antraciklin.
(12) Antitelo za upotrebu na osnovu (11), naznačeno time da je antraciklin doksorubicin. (13) Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kog od (1)-(12), naznačeno time da pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata prednizon
(14) Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kog od (1)-(13), naznačeno time da:
(a) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata prednizon i pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeustski agens obuhvata talidomid; (b) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata prednizon i pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeustski agens obuhvata bortezomib; ili
(c) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata prednizon i pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeustski agens obuhvata bortezomib i dalje obuhvata melfalan.
(15) Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kog od (1)-(14), naznačeno time da pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata prednizon i pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeustski agens obuhvata melfalan i talidomid.
(16) Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kog od (1)-(15), naznačeno time da pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon.
(17) Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kog od (1)-(16), naznačeno time da:
(a) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon i pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeustski agens obuhvata talidomid i/ili lenalidomid;
(b) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon i pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeustski agens obuhvata CC4047;
(c) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon i pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeustski agens obuhvata bortezomib;
(d) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon i pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeustski agens obuhvata lenalidomid i dalje obuhvata bortezomib;
(e) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon i pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeustski agens obuhvata talidomid i dalje obuhvata bortezomib.
(18) Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kog od (1)-(17), naznačeno time da pomenuto antitelo je antitelo koje obuhvata VLregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:12, i VHregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:17. (19) Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kog od (1)-(18), naznačeno time da je pomenuti kancer multipli mijelom ili hronična limfocitna leukemija.
(20) Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kog od (1)-(19), naznačeno time da je pomenuti kancer rekurentan i refraktoran.
(21) Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kog od (1)-(20), naznačeno time da je pomenuta individua nije prethodno podvrgnuta anti-kancer tretmanima za isti kancer.
(22) Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kog od (1)-(20), naznačeno time da individual nije odgovorila na prethodnu anti-kancer terapiju za isti kancer
(23) Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kog od (1)-(22), naznačeno time da se antitelo, najmanje jedan kortikosteroid i najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeustski agens svi administriraju odvojeno.
(24) Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kog od (1)-(23), naznačeno time da:
(a) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon, pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeustski agens obuhvata bortezomib i antitelo obuhvata VLregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:12, i VHregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:17;
(b) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon, pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeustski agens obuhvata lenalidomid i antitelo obuhvata VLregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:12, i VHregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:17;
c) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon, pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeustski agens obuhvata lenalidomid i dalje obuhvata bortezomib i antitelo obuhvata VLregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:12, i VHregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:17;
d) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon, pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeustski agens obuhvata talidomid i dalje obuhvata bortezomib i antitelo obuhvata VLregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:12, i VHregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:17;
e) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon, pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeustski agens obuhvata CC4047 i antitelo obuhvata VLregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:12, i VHregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:17; ili
f) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata prednizon, pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeustski agens obuhvata bortezomib i dalje obuhvata melfalan i antitelo obuhvata VLregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:12, i VHregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:17.
(25) Upotreba humanog IgG1 izotip antitela koje vezuje CD38 u proizvodnji medikamenata za tretman kancera, naznačeno time da je medikament za administraciju, ili treba da se administrira u kombinovanoj terapiji sa sa najmanje jednim kortikosteroidom, naznačeno time da najmanje jedan kortikosteroid obuhvata glukokortikoid, i najmanje jednim nekortikosteroidnim hemoterapeutskim agensom naznačeno time da pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata (i) talidomid ili analog talidomida i/ili (ii) inhibitor proteozoma, i naznačeno time da pomenuto antitelo obuhvata varijabilne regione humanog lakog lanac i humanog teškog lanca, naznačeno time da varijabilni region lakog lanca obuhvata VLCDR1 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:13, VLCDR2 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:14 i VLCDR3 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:15, i varijabilni region teškog lanca koji obuhvata VHCDR1 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:18, VHCDR2 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:19 i VHCDR3 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:20.
[0018] Neagonistička antitela -005, -003 ili -024 koja se vezuju za CD38 su opisana ovde. Ova antitela su prethodno opisana u naknadno objavljenoj patentnoj aplikaciji PCT/DK2006/000166 (WO 2006099875) (Genmab).
KRATAK OPIS SLIKA
[0019] Slika 1A prikazuje vezivanje -003, -005 i izotip kontrolnog antitela HuMab-KLH za CD38-transfektovane CHO (CHO-CD38) ćelije, mereno protočnom citometrijom. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 4.
Slika 1B prikazuje vezivanje -024 i HuMab-KLH za CD38-transfektovane CHO (CHO-CD38) ćelije, mereno protočnom citometrijom. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 4.
Slika 2A prikazuje vezivanje -003, -005 i HuMab-KLH za Daudi ćelije, mereno protočnom citometrijom. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 4.
Slika 2B prikazuje vezivanje -024 i HuMab-KLH za Daudi ćelije, mereno protočnom citometrijom. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 4.
Slika 3 prikazuje vezivanje -003, -005, -024 i HuMab-KLH za ćelije multipla mijeloma. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 4.
Slika 4A prikazuje sposobnost -003 i -005 da indukuju lizu Daudi ćelija pomoću ADCC u poređenju sa rituksimabom i HuMab-KLH. Eksperimentalna postavka je opisana u primeru 5. Slika 4B prikazuje sposobnost -024 da indukuje lizu Daudi ćelija pomoću ADCC u poređenju sa HuMab-KLH. Eksperimentalna postavka je opisana u primeru 5.
Slika 5A prikazuje sposobnost -003, -005 i -024 da indukuju lizu svežih tumorskih ćelija multipla mijeloma pomoću ADCC u poređenju sa HuMab-KLH. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 5.
Slika 5B prikazuje sposobnost -003, -005 i -024 da indukuju lizu svežih tumorskih ćelija plazma ćelijske leukemije pomoću ADCC u poređenju sa HuMab-KLH. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 5.
Slika 6 prikazuje sposobnost -003 i -005 da indukuju lizu JK6L (ćelijska linija multipla mijeloma) pomoću ADCC u poređenju sa HuMab-KLH. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 5. Slika 7 prikazuje sposobnost -003 i -005 da indukuju lizu AMO-1 (ćelijska linija sa višestrukim mijelomom) pomoću ADCC u poređenju sa HuMab-KLH. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 5.
Slika 8 prikazuje CDC-posredovano liziranje Daudi-luc ćelija indukovanih sa -003 i -005 u poređenju sa HuMab-KLH. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 6.
Slika 9A prikazuje CDC-posredovanu lizu CHO-CD38 ćelija indukovanu sa -003 i -005 u poređenju sa HuMab-KLH. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 6.
Slika 9B prikazuje CDC-posredovanu lizu CHO-CD38 ćelija indukovanu sa -024 u poređenju sa HuMab-KLH. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 6.
Slika 10A prikazuje CDC-posredovanu lizu 3% refraktornih tumorskih ćelija u prisustvu -003, -005 i HuMab-KLH. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 6.
Slika 10B prikazuje CDC-posredovanu lizu 9% refraktornih tumorskih ćelija u prisustvu -003, -005 i HuMab-KLH. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 6.
Slika 10C prikazuje CDC-posredovanu lizu 30-40% tumorskih ćelija u prisustvu -003, -005 i HuMab-KLH. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 6.
Slika 10D prikazuje CDC-posredovanu lizu 70% tumorskih ćelija u prisustvu -003, -005 i HuMab-KLH. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 6.
Slika 10E prikazuje CDC-posredovanu lizu ćelija multipla mijelome u prisustvu -024 i HuMab-KLH. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 6.
Slika 11 prikazuje da se -003 i -005 unakrsno ne vezuju za CD38. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 7.
Slika 12A prikazuje imunohistološko bojenje makrofaga, limfocita i plazma B ćelija sa -003. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 10.
Slika 12B prikazuje imunohistološko bojenje bronhijalnog epitela sa -003. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 10.
Slika 12C prikazuje imunohistološko bojenje miocita sa -003. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 10.
Slika 12D prikazuje imunohistološko bojenje makaki limfoidnog tkiva sa -003. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 10.
Slika 13A prikazuje imunohistološko bojenje makrofaga, limfocita i plazma B ćelija sa -005. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 10.
Slika 13B prikazuje imunohistološko bojenje bronhijalnog epitela sa -005. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 10.
Slika 13C prikazuje imunohistološko bojenje miocita sa -005. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 10.
Slika 13D prikazuje imunohistološko bojenje makaki limfoidnog tkiva sa -005. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 10.
Slika 14A prikazuje imunohistološko bojenje endotelijuma jetre sa CD31. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 10.
Slika 14B prikazuje imunohistološko bojenje endotelijuma jetre sa vWF. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 10.
Slika 14C prikazuje imunohistološko bojenje endotelijuma jetre sa anti-KLH. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 10.
Slika 14D prikazuje imunohistološko bojenje endotelijuma jetre sa -003. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 10.
Slika 14E prikazuje imunohistološko bojenje endotelijuma jetre sa -005. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 10.
Slika 15A prikazuje unakrsnu reaktivnost -003 i -005 u poređenju sa HuMab-KLH na makaki limfocitima mereno protočnom citometrijom. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 11.
Slika 15B prikazuje unakrsnu reaktivnost -003 i -005 u poređenju sa HuMab-KLH na makaki monocitima, mereno protočnom citometrijom. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 11.
Slika 15C prikazuje unakrsnu reaktivnost -003 i -005 u poređenju sa HuMab-KLH na PBMC rezus majmuna, mereno protočnom citometrijom. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 11.
Slika 16A prikazuje internalizaciju -003, mereno EtBr-gašenjem (quenching). Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 12.
Slika 16B prikazuje internalizaciju od -005, mereno EtBr-gašenjem. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 12.
Slika 17A prikazuje inhibiciju rasta tumorskih ćelija izazvanu sa -003 i -005 u poređenju sa anti-CD20 monoklonskim antitelom (rituksimab) i HuMab-KLH u preventivnom setovanju (podešavanju) i mereno pomoću in vivo SCID luciferaze.
Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 13.
Slika 17B prikazuje inhibiciju rasta tumorskih ćelija izazvanu -003 i -005 u poređenju sa anti-CD20 monoklonskim antitelom (rituksimab) i HuMab-KLH u terapeutskom setovanju I mereno pomoću in vivo SCID luciferaze. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 13.
Slika 17C prikazuje inhibiciju rasta tumorskih ćelija izazvanu sa -003 i -005 u poređenju sa anti-CD20 monoklonskim antitelom (rituksimab) i HuMab-KLH u terapeutskom setovanju II mereno pomoću in vivo SCID luciferaze. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 13.
Slika 17D prikazuje inhibiciju rasta tumorskih ćelija sa -003 i -024 u poređenju sa HuMab-KLH u terapijskom setovanju III mereno pomoću in vivo SCID luciferaze. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 13.
Slika 18 prikazuje indukciju apoptoze sa -003 i -005 u poređenju sa anti-CD20 monoklonskim antitelom (rituksimab) i HuMab-KLH bez ili sa ukrštanjem. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 14.
Slika 19 prikazuje histološki rezultat za CD38-pozitivne ćelije u implantiranim RA-SCID mišjim ksenograftima 14. dana, nakon tretmana sa anti-KLH (HuMab-KLH) ili sa -005. Metode su opisane u Primeru 15.
Slika 20 prikazuje histološki rezultat za CD138-pozitivne ćelije u implantiranim RA-SCID mišjim ksenograftima 14. dana, nakon tretmana sa anti-KLH ili -005. Metode su opisane u Primeru 15.
Slika 21 prikazuje CD38 bojenje B ćelija u ksenograftima pre implantacije (A), ili posle tretmana sa anti-KLH (B), ili -005 (C). Metode su opisane u Primeru 15.
Slika 22 prikazuje CD138 bojenje B ćelija u ksenograftima pre implantacije (A), ili posle tretmana sa anti-KLH (B), ili -005 (C). Metode su opisane u Primeru 15.
Slika 23 prikazuje vezivanje -003 i -005 za divlji tip (wild type) i mutirani humani CD38, mereno pomoću ELISA-e. Slika 23A: Vezivanje -003 i -005 za T237A mutirani humani CD38. 23B: Vezivanje -003 i -005 za Q272R mutirani humani CD38. Slika 23C: Vezivanje -003 i -005 za S274F mutirani humani CD38. Metode su opisane u Primeru 17.
Slika 24 prikazuje efekat -003 i -005 u poređenju sa HuMab-KLH na proliferaciju (A), proizvodnju IL-6 (B) i proizvodnju IFN- (C) humanih PBMC. Metode su opisane u Primerima 18, 19 i 20, respektivno.
Slika 25 prikazuje enzimsku proizvodnju cGDPriboze u prisustvu različitih koncentracija -003 (B), -005 (C), -024 (D) ili anti-KLH (A). Metode su opisane u Primeru 23.
Slika 26 prikazuje poređenje između -003, -005 i Morphosys antitela TH-3079 u CDC CHO-CD38 ćelija (26A), CDC Daudi ćelija (26B) i ADCC Daudi ćelija (26C). Metode su opisane u Primeru 24.
Slika 27 prikazuje vezivanje -005 i izotip kontrolnog antitela HuMab-KLH za EBV transformisane B ćelije šimpanze, mereno protočnom citometrijom. Eksperimentalna postavka je opisana u Primeru 26.
Slika 28 prikazuje kapacitet -005, samog i u kombinaciji sa drugim jedinjenjima (deksametazon (Dek) i bortezomib (Bor)) da indukuje ćelijsku smrt ćelijske linije multipla mijelome UM6 in vitro.
Slika 29 prikazuje listu sekvenci iz pronalaska.
SEQ ID No:1 je nukleotidna sekvenca VLregiona antitela -003.
SEQ ID No:2 je aminokiselinska sekvenca VLregiona antitela -003.
SEQ ID No:3 je aminokiselinska sekvenca VLCDR1 antitela -003 koja obuhvata ak 24-34 SEQ ID No:2.
SEQ ID No:4 je aminokiselinska sekvenca VLCDR2 antitela -003 koja obuhvata ak 50-56 SEQ ID No:2.
SEQ ID No:5 je aminokiselinska sekvenca VLCDR3 antitela -003 koja obuhvata ak 89-97 SEQ ID No:2.
SEQ ID No:6 je nukleotidna sekvenca VHregiona antitela -003.
SEQ ID No:7 je aminokiselinska sekvenca VHregiona antitela -003.
SEQ ID No:8 je aminokiselinska sekvenca VHCDR1 antitela -003 koja obuhvata ak 31-35 SEQ ID No:7.
SEQ ID No:9 je aminokiselinska sekvenca VHCDR2 antitela -003 koja obuhvata ak 50-66 SEQ ID No:7.
SEQ ID No:10 je aminokiselinska sekvenca VHCDR3 antitela -003 koja obuhvata ak 99-109 SEQ ID No:7.
SEQ ID No:11 je nukleotidna sekvenca VLregiona antitela -005.
SEQ ID No:12 je aminokiselinska sekvenca VLregiona antitela -005.
SEQ ID No:13 je aminokiselinska sekvenca VLCDR1 antitela -005 koja obuhvata ak 24-34 SEQ ID No:12.
SEQ ID No:14 je aminokiselinska sekvenca VLCDR2 antitela -005 koja obuhvata ak 50-56 SEQ ID No:12.
SEQ ID No:15 je aminokiselinska sekvenca VLCDR3 antitela -005 koja obuhvata ak 89-97 SEQ ID No:12.
SEQ ID No:16 je nukleotidna sekvenca VHregiona antitela -005.
SEQ ID No:17 je aminokiselinska sekvenca VHregiona antitela y -005.
SEQ ID No:18 je aminokiselinska sekvenca VHCDR1 antitela -005 koja obuhvata ak 31-35 SEQ ID No:17.
SEQ ID No:19 je aminokiselinska sekvenca VHCDR2 antitela -005 koja obuhvata ak 50-66 SEQ ID No:17.
SEQ ID No:20 je aminokiselinska sekvenca VHCDR3 antitela -005 koja obuhvata ak 99-111 SEQ ID No:17.
SEQ ID No:21 je nukleotidna sekvenca VLregiona antitela -024.
SEQ ID No:22 je aminokiselinska sekvenca VLregiona antitela -024.
SEQ ID No:23 je aminokiselinska sekvenca VLCDR1 antitela -024 koja obuhvata ak 24-34 SEQ ID No:22.
SEQ ID No:24 je aminokiselinska sekvenca VLCDR2 antitela -024 koja obuhvata ak 50-56 SEQ ID No:22.
SEQ ID No:25 je aminokiselinska sekvenca VLCDR3 antitela -024 koja obuhvata ak 89-97 SEQ ID No:22.
SEQ ID No:26 je nukleotidna sekvenca VHregiona antitela -024.
SEQ ID No:27 je aminokiselinska sekvenca VHregion antitela -024.
SEQ ID No:28 je aminokiselinska sekvenca VHCDR1 antitela -024 koja obuhvata ak 31-35 SEQ ID No:27.
SEQ ID No:29 je aminokiselinska sekvenca VHCDR2 antitela -024 koja obuhvata ak 50-66 SEQ ID No:27.
SEQ ID No:30 je aminokiselinska sekvenca VHCDR3 antitela -024 koja obuhvata ak 99-111 SEQ ID No:27.
SEQ ID No:31 je sekvenca humanog CD38.
SEQ ID No:32 je sekvenca mutiranog humanog CD38, gde je treoninski ostatak u položaju 237 zamenjen sa alaninskim ostatkom.
SEQ ID No:33 je sekvenca mutiranog humanog CD38, gde je glutaminski ostatak u položaju 272 zamenjen sa argininskim ostatkom.
SEQ ID No:34 je sekvenca mutiranog humanog CD38, gde je serinski ostatak u položaju 274 has zamenjen sa fenilalaninskim ostatkom.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
DEFINICIJE
[0020] "Neagonističko antitelo koje se vezuje za CD38" ili "anti-CD38 antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na antitelo koje nakon vezivanja za CD38 ne indukuje značajnu proliferaciju mononuklearnih ćelija periferne krvi kada se poredi u odnosu na proliferaciju indukovanu kontrolnim antitelom izotipa ili samim medijumom (kao što je analizirano, na pr. kao što je ovde opisano u Primeru 18). U jednom izvođenju, anti-CD38 antitelo koje se koristi u pronalasku nije samo neagonist, već je i antagonist CD38.
[0021] Termini "CD38" i "CD38 antigen" se ovde koriste naizmenično i uključuju bilo koje varijante, izoforme i homologe humanog CD38, koji su prirodno eksprimirani od strane ćelija ili su eksprimirani na ćelijama transfektovanim
sa CD38 genom. Sinonimi CD38, kao što je poznato u tehnici, uključuju ADP ribozil ciklazu 1, cADPr hidrolazu 1, Cd38-rsl, cikličnu ADP-riboza hidrolazu 1, 1-19, NIM-R5 antigen.
[0022] Izraz "imunoglobulin" odnosi se na klasu strukturno srodnih glikoproteina koji se sastoje od dva para polipeptidnih lanaca, jednog para lakih (L) lanaca niske molekulske težine i jednog para teških (H) lanaca, sve četiri međusobno povezane disulfidnim vezama. Struktura imunoglobulina je dobro opisana. Vidi na primer Fundamental Immunology Ch.
7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)).Ukratko, svaki teški lanac tipično se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (skraćeno ovde kao VH) i konzerviranog regiona teškog lanca. Konzervirani region teškog lanca tipično se sastoji od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac tipično se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno kao VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca tipično se sastoji od jednog domena,CL. VHi VLregioni mogu biti dalje podeljeni na regione hipervarijabilnosti (ili hipervarijabilne regione koji mogu biti hipervarijabilni u sekvenci i/ili u obliku strukturno definisanih petlji), koji se takođe nazivaju regioni za određivanje komplementarnosti (CDR), isprepleteni sa regionima koji su konzerviraniji, okvirni (framework) regioni (FRs).
[0023] Svaki VHi VLje tipično sastavljen od tri CDR-a i četiri FR-a, raspoređena od aminoterminusa do karboksiterminusa sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (videti takođe Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)). Tipično, numerisanje aminokiselinskih ostataka u ovom regionu se izvodi metodom opisanom u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) (fraze kao što je numerisanje ostataka varijabilnog domena kao u Kabatu ili prema Kabatu ovde se odnose na ovaj sistem numerisanja varijabilnih domena teškog lanca ili varijabilnih domena lakog lanca). Koristeći ovaj sistem numerisanja, stvarna linearna aminokiselinska sekvenca peptida može da sadrži manje ili dodatne aminokiseline koje odgovaraju skraćivanju ili umetanju u FR ili CDR varijabilnom domenu. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može da uključi pojedinačni aminokiselinski insert (ostatak 52a prema Kabatu) posle ostatka 52 VHu CDR2 i umetnutih ostataka (na primer ostataka 82a, 82b, i 82c, itd. Prema Kabatu) posle ostatka 82 u FR teškom lancu. Kabat numerisanje ostataka može biti determinisano za dato antitelo poravnavanjem u homologim regionima sekvence antitela sa "standardnom" Kabat numerisanom sekvencom.
[0024] Termin "antitelo" (Ab) u kontekstu ovog pronalaska se odnosi na molekul imunoglobulina, fragment imunoglobulinskog molekula, ili derivat bilo kog od njih, koji ima sposobnost da se specifično veže za antigen u tipičnim fiziološkim uslovima za značajne periode vremena kao što je najmanje oko 30 minuta, najmanje oko 45 minuta, najmanje oko jedan sat, najmanje oko dva sata, najmanje oko četiri sata, najmanje oko 8 sati, najmanje oko 12 sati, oko 24 sata ili više, oko 48 sati ili više, oko 3, 4, 5, 6, 7 ili više dana, itd., ili bilo kojeg drugog relevantnog funkcionalno definisanog perioda (kao što je vreme dovoljno da izazove, promoviše, poboljša i/ili moduliše fiziološki odgovor povezan sa vezivanjem antitela na antigen).
[0025] Varijabilni regioni teških i lakih lanaca molekula imunoglobulina sadrže domen za vezivanje koji interaguje sa antigenom. Konzervirani regioni antitela (Abs) mogu da posreduju vezivanje imunoglobulina za tkiva domaćina ili faktore, uključujući različite ćelije imunog sistema (kao što su efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.
[0026] Anti-CD38 antitelo može biti bispecifično antitelo, dimerno telo (diabodies) ili sličan molekul (videti, na primer, PNAS USA 90 (14), 6444-8 (1993) za opis dimerno telo). Zaista, bispecifična antitela, dimerna tela i slično, obezbeđena ovim pronalaskom, mogu vezati bilo koji pogodni target pored dela CD38.
[0027] Kao što je gore naznačeno, termin antitelo ovde, osim ako nije drugačije navedeno ili u kontradiktornom kontekstu, uključuje fragmente antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za antigen. Pokazano je da se antigen-vezujuća funkcija antitela može izvesti fragmentima antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih terminom "antitelo" uključuju (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CLai CH1 domena; (ii) F (ab)2i F (ab')2fragmente, bivalentni fragmenti koji sadrže dva Fab fragmenta vezana disulfidnim mostom na spoju; (iii) Fd fragment koji se u osnovi sastoji od domena VHi CH1; (iv) Fv fragment koji se u osnovi sastoji od VLi VHdomena jednog kraka antitela, (v) dAb fragmenta (Vard et al., Nature 341, 544-546 (1989)), koji se u suštini sastoji od VHdomain; (vi) izolovanog regiona za određivanje komplementarnosti (CDR), i (vii) kombinacije dva ili više izolovanih CDR-a koji se opciono mogu spojiti sa sintetičkim linkerom. Dalje, iako su dva domena Fv fragmenta, VLi VH, kodirana za odvojene gene, oni se mogu spojiti, korišćenjem rekombinantne metode, pomoću sintetičkog linkera koji im omogućava da budu napravljeni kao jedan lanac proteina u kome se VLi VHregioni spajaju da formiraju monovalentne molekule (poznate kao jednolančana antitela ili jednolančani Fv (scFv), videti na primer Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) i Huston et al., PNAS USA 85, 5879 -5883 (1988). Takva jednolančana antitela su obuhvaćena terminom antitelo, ukoliko nije drugačije naznačeno ili jasno naznačeno kontekstom. Drugi oblici jednolančanih antitela, kao što su diantitela, uključeni su u termin antitelo. Iako su takvi fragmenti generalno uključeni u značenje antitela, oni su kolektivno i svaki nezavisno jedinstvene karakteristike ovog pronalaska, pokazujući različita biološka svojstva i korisnost. Ovi i drugi korisni fragmenti antitela su dalje razmatrani ovde.
[0028] Treba razumeti da termin antitelo takođe generalno uključuje poliklonska antitela, monoklonska antitela (mAbs), polipeptide slične antitelima, kao što su himerna antitela i humanizovana antitela, antiidiotipska (anti-Id) antitela na antitela i fragmente antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za antigen (antigen-vezujući fragmenti) dobijene bilo kojom poznatom tehnikom, kao što je enzimsko cepanje, sinteza peptida i rekombinantne tehnike. Antitelo kao napravljeno (generisano) može imati bilo koji izotip.
[0029] Termin "epitop" označava determinantu proteina sposobnu za specifično vezivanje za antitelo. Epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupacija molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naboja. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju po tome što se vezivanje za prvi, ali ne i za poslednji, gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača. Epitop može sadržati aminokiselinske ostatke koji su direktno uključeni u vezivanje (koji se takođe naziva imunodominantna komponenta epitopa) i druge aminokiselinske ostatke, koji nisu direktno uključeni u vezivanje kao što su aminokiselinski ostaci koji su efektivno blokirani specifično peptidom koji veže antigen (drugim rečima, aminokiselinski ostatak je unutar otiska, specifično peptida koji vezuje antigen).
[0030] Termin "bispecifični molekul" obuhvata bilo koje sredstvo, kao što je protein, peptid, ili protein ili peptidni kompleks, koji ima dve različite specifičnosti vezivanja. Na primer, molekul se može vezati za ili interagovati sa, (a) antigenom na ćelijskoj površini (b) Fc receptorom na površini efektorske ćelije. Termin "multispecifični molekul" treba da obuhvati bilo koji agens, na primer protein, peptid ili protein ili peptidni kompleks, koji ima više od dve različite specifičnosti vezivanja. Na primer, molekul se može vezati za ili interagovati sa, (a) antigenom na ćelijskoj površini, (b) Fc receptorom na površini efektorske ćelije, i (c) najmanje nekom drugom komponentom. Shodno tome, ovaj pronalazak obuhvata, ali nije ograničen na, bispecifične, trispecifične, tetraspecifične i druge multispecifične molekule koji su usmereni na CD38, i na druge antigene ili targete na površini ćelija, kao što su Fc receptori na efektorskim ćelijama.
[0031] Termin "bispecifična antitela" treba da obuhvati bilo koje anti-CD38 antitelo, koje je bispecifični molekul. Termin "bispecifična antitela" takođe uključuje dimerna tela (diabodies). Dimerna tela su bivalentna, bispecifična antitela u kojima su VHi VLdomeni eksprimirani na jednom polipeptidnom lancu, ali koristeći linker koji je prekratak da bi omogućio uparivanje između dva domena na istom lancu, na taj način primoravajući domene da se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i kreiranje dva mesta vezivanja antigena (videti na primer Holliger, P. et al., PNAS USA 90, 6444-6448 (1993), Poljak, R.J. et al., Structure 2, 1121-1123 (1994)).
[0032] Kako se ovde koristi, termin "efektorska ćelija" se odnosi na imunsku ćeliju koja je uključena u efektorsku fazu imunog odgovora, za razliku od kognitivnih i aktivacionih faza imunog odgovora. Primeri imunskih ćelija uključuju ćeliju mieloidnog ili limfoidnog porekla, na primer limfocite (kao što su B ćelije i T ćelije uključujući citolitičke T ćelije (CTL)), ćelije ubice, prirodne ćelije ubice, makrofage, monocite, eozinofile, neutronfile, polimorfonuklearne ćelije, granulocite, mastocite i bazofile. Neke efektorske ćelije eksprimiraju specifične Fc receptore i obavljaju specifične imunološke funkcije. U nekim realizacijama, efektorska ćelija je sposobna da indukuje ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), kao što je neutrofil sposoban da indukuje ADCC. Na primer, monociti, makrofagi, koji eksprimiraju FcR su uključeni u specifično ubijanje target ćelija i predstavljanje antigena drugim komponentama imunog sistema, ili vezivanje za ćelije koje predstavljaju antigene. U nekim realizacijama, efektorska ćelija može fagocitirati target antigen, target ćeliju ili mikroorganizam. Ekspresija određenog FcR na efektorskoj ćeliji može biti regulisana humoralnim faktorima kao što su citokini. Na primer, nađeno je da je ekspresija FcγRI pozitivno regulisana interferonom γ (IFN-γ) i/ili G-CSF. Ova pojačana ekspresija povećava citotoksičnu aktivnost ćelija koje nose FcyRI protiv targeta. Efektorska ćelija može fagocitirati ili lizirati target antigen ili target ćeliju.
[0033] Termin "humano antitelo", kako je ovde korišćen, obuhvata antitela sa varijabilnim i konzervisanim regionima izvedenim iz humanih sekvenci imunoglobulina germinativne linije. Humana antitela iz ovog pronalaska mogu uključivati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani humanim sekvencama imunoglobulina germinativne linije (na primer mutacije koje su uvedene slučajnom ili mesto specifično mutagenezom in vitro ili somatskom mutacijom in vivo). Međutim, pojam "humano antitelo", kako je ovde korišćeno, nije namenjeno da uključi antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativne linije drugih vrsta sisara, kao što je miš, usađene u okvire čitanja humane sekvence.
[0034] Kako se ovde koristi, humano antitelo je "izvedeno od" određene sekvence germinativne linije ako je antitelo dobijeno iz sistema koji koristi humane imunoglobulinske sekvence, na primer imunizacijom transgenog miša koji nosi gene humanog imunoglobulina ili skrininovanjem humanih imunoglobulinskih gena pri čemu je izabrano humano antitelo koje je najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, na primer najmanje 96%, kao najmanje 97%, na primer najmanje 98%, ili kao najmanje 99% identično u aminokiselinskoj sekvenci prema aminokiselinskoj sekvenci koju kodira genski segment germinativne linije VH ili VL varijabilnog regiona. Tipično, humano antitelo izvedeno iz sekvence genskog segmenta genske sekvence VHili VLspecifične humane germinativne linije neće pokazati više od 10 aminokiselinskih razlika, kao što je ne više od 5, na primer ne više od 4, 3, 2, ili 1 aminokiselinska razlika u odnosu na aminokiselinsku sekvencu kodiranu genom za imunoglobulin.
[0035] "Himerno" antitelo je antitelo koje sadrži jedan ili više regiona jednog antitela i jedan ili više regiona iz jednog ili više drugih antitela izvedenih iz drugih vrsta. Monovalentno himerno antitelo je dimer (HL)) formirano je od himerog H lanca povezanog preko disulfidnih mostova sa himernim L lancem. Dvovalentno himerno antitelo je tetramer (H2L2) formiran sa dva HL dimera povezana preko najmanje jednog disulfidnog mosta. Polivalentno himerno antitelo se takođe može proizvesti, na primer, upotrebom CHregiona koji oligomerizuje (na primer iz IgM H lanca, ili m lanca). Tipično, himerno antitelo se odnosi na antitelo u kome je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homolog sa odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim od određene vrste ili pripadanjem određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca(aca) identičan ili homolog odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim od drugih vrsta ili pripadajućoj drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmentima takvih antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost (videti na primer US 4,816,567 i Morrison et al., PNAS USA 81, 6851-6855 (1984)). Himerna antitela se proizvode rekombinantnim procesima dobro poznatim u tehnici (videti na primer Cabilly et al., PNAS USA 81, 3273-3277 (1984), Morrison et al., PNAS USA 81, 6851-6855 (1984), Boulianne et al., Nature 312, 643-646 (1984), EP125023, Neuberger et al., Nature 314, 268-270 (1985), EP171496, EP173494, WO86/01533, EP184187, Sahagan et al., J. Immunol. 137, 1066-1074 (1986), WO87/02671, Liu et al., PNAS USA 84, 3439-3443 (1987), Sun et al., PNAS USA 84, 214-218 (1987), Better et al., Science 240, 1041-1043 (1988) and Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)).
[0036] "Humanizovano" antitelo je antitelo koje je izvedeno od nehumanih vrsta, u kojima su određene aminokiseline stavljene u okviru okvir čitanja i konzervisani domeni teških i lakih lanaca mutirani tako da se izbegne ili ukine imuni odgovor kod ljudi. Humanizovani oblici nehumanih (na primer, mišjih) antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz nehumanog imunoglobulina. U najvećem delu, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitelo recipijenta) u kojima su ostaci iz hipervarijabilnog regiona primaoca zamenjeni ostacima iz hipervarijabilnog regiona nehumanoidne vrste (antitelo donora) kao što su miš, pacov, zec ili nehumani primati koji imaju željene karakteristike vezivanja antigena, kao što su specifičnost i afinitet. U nekim slučajevima, ostaci Fv okvirnog regiona (FR) humanog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim nehumanim ostacima. Dalje, humanizovana antitela mogu sadržati ostatke koji se ne nalaze u recipijent antitelu ili u donorskom antitelu. Ove modifikacije su napravljene da dodatno optimizuju performanse antitela. Generalno, humanizovano antitelo će u suštini sadržati sve najmanje jedan, i tipično dva, varijabilna domena, u kojima sve ili suštinski sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onima nehumanog imunoglobulina i svih ili skoro svih FR regiona iz humane imunoglobulinske sekvence. Humanizovano antitelo opciono takođe obuhvata najmanje deo konzervisanog regiona imunoglobulina (Fc), tipično humanog imunoglobulina. Za više detalja, videti Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986), Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988) and Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2, 593-596 (1992).
[0037] Termini "monoklonsko antitelo" ili "kompozicija monoklonskog antitela", kako se ovde koriste, odnose se na pripremu molekula antitela pojedinačnog molekularnog sastava. Kompozicija monoklonskog antitela ima pojedinačnu specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop. Prema tome, termin "humano monoklonsko antitelo" se odnosi na antitela koja pokazuju pojedinačnu specifičnost vezivanja koja imaju promenljive i konzervisane regione izvedene iz humanih sekvenci germinativne linije imunoglobulina. Humana monoklonska antitela mogu biti generisana hibridomom koji uključuje B ćelije dobijene iz transgene ili transhromozomalne nehumane životinje, kao što je transgeni miš, koji ima genom koji sadrži humani transgen za teški lanac i transgen lakog lanca, fuzionisan na imortalizovanu ćeliju. Skraćenica za monoklonsko antitelo može biti mAb.
[0038] Kako se ovde koristi, "specifično vezivanje" se odnosi na antitelo koje se vezuje za prethodno određeni antigen. Tipično, antitelo se vezuje sa afinitetom koji odgovara KDod oko 10<-7>M ili manje, kao što je oko 10<-8>M ili manje, kao što je oko 10<-9>M ili manje, oko 10<-10>M ili manje, ili oko 10<-11>M ili čak i manje kada je to određeno tehnologijom površinske plazmonske rezonance (SPR) u BIAcore 3000 instrumentu koristeći rekombinantni CD38 kao ligand i antitelo kao analit. Antitelo se može vezati za prethodno određeni antigen sa afinitetom koji odgovara KDkoji je najmanje deset puta manji, kao što je najmanje 100 puta niži, na primer najmanje 1000 puta niži, kao što je najmanje 10.000 puta niži, na primer najmanje 100.000 puta niži od njegovog afiniteta za vezivanje za nespecifični antigen (npr. BSA, kazein) osim predeterminisanog antigena ili blisko srodnog antigena. Količina sa kojom je afinitet niži zavisi od KDantitela, tako da kada je KDantitela veoma nisko (to jest, antitelo je visoko specifično), onda količina sa kojom je afinitet za antigen niži od afiniteta za nespecifični antigen može biti najmanje 10.000 puta.
[0039] Termin specifičnost ovde se odnosi na sposobnost CD38 vezujućeg peptida, kao što je anti-CD38 antitelo, da prepozna epitop unutar CD38, dok samo ima malu ili nikakvu detektabilnu reaktivnost sa drugim delovima CD38 (uključujući druge epitope koji su vezani od strane drugih anti-CD38 antitela). Specifičnost može biti relativno određena kompetitivnim esejima kao što je ovde opisano. Specifičnost se može odrediti bilo kojom od tehnika identifikacije/karakterizacije epitopa koje su ovde opisane ili njihovih ekvivalenata poznatih u struci.
[0040] Antitelo koje je specifično za određenu antigenu determinantu može, međutim, unakrsno reagovati sa drugim biomolekulima koji mogu biti prisutni u nekom biološkom kontekstu sa CD38. Tipičnije, anti-CD38 antitelo, može unakrsno reagovati sa homologima CD38 iz drugih vrsta. U jednom ili oba konteksta, tipično takva unakrsno reaktivna antitela su selektivna za humani CD38 u odnosu na relevantnu strukturu i/ili faktore okruženja (sredine).
[0041] Termin "selektivnost" ovde se odnosi na preferencijalno vezivanje anti-CD38 antitela, za određeni region, target ili peptid; tipično region ili epitop u CD38, za razliku od jedne ili više drugih bioloških molekula, struktura, ćelija, tkiva, itd. U jednom izvođenju, anti-CD38 antitelo koje se koristi u ovom pronalasku je selektivno za deo CD38 u kontekstu ćelija raka debelog creva (tj. anti-CD38 antitelo će se selektivno vezati za deo CD38 u odnosu na druge komponente ćelija raka debelog creva).
[0042] Termin "kd" (sec<-1>), kako je ovde korišćen, treba da se odnosi na konstantu brzine disocijacije određene
interakcije antitela i antigena. Navedena vrijednost se takođe naziva koffvrednost.
[0043] Termin "ka" (M<-1>x sec<-1>), kako je ovde korišćen, treba da se odnosi na konstantu brzine ravnoteže asocijacije određene interakcije antitela i antigena.
[0044] Termin "KD" (M), kako je ovde korišćen, treba da se odnosi na konstantu disocijacione ravnoteže određene interakcije antitela i antigena.
[0045] Termin "KA" (M<-1>), kako je ovde korišćen, treba da se odnosi na konstantu ravnoteže asocijacije određene interakcije antitela i antigena i dobija se deljenjem kasa kd.
[0046] Kako se ovde koristi, "izotip" se odnosi na klasu antitela (na primer, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ili IgM) koja je kodirana genima konzerviranog regiona teškog lanca.
[0047] "Target ćelija" (ciljna ćelija) označava svaku neželjenu ćeliju u pojedincu. U nekim realizacijama, target ćelija je ćelija koja eksprimira ili prekomerno eksprimira CD38. Ćelije koje eksprimiraju CD38 tipično uključuju hemopoetske ćelije, kao što su medularni timociti, aktivirane T i B ćelije, 80% NK ćelija u mirovanju i monociti, limfni sistemi limfnih čvorova, plazma B ćelije i neke intrafolikularne ćelije, dendritične ćelije, normalne ćelije koštane srži, određene ćelije prekursora, 50-80% krvnih ćelija iz pupčane vrpce, eritrociti i trombociti. CD38 se takođe može eksprimirati od strane nehemopoetskih ćelija, kao što su intraepitelne ćelije i lamina propria limfociti u crevima, Purkinjejevim ćelijama i neurofibrilarnim čvorovima u mozgu, epitelnim ćelijama u prostati, -ćelijama u pankreasu, osteoklastima u kostima, retinalnim ćelijama u oku i sarkolemi glatkih i poprečnoprugastih mišića. Kod malignih ćelija, CD38 se eksprimira u različitim malignim hematološkim oblicima bolesti, uključujući, ali ne ograničavajući se na multipla mijelom, primarnu ili sekundarnu leukemiju plazma ćelija, hroničnu limfocitnu leukemiju B-ćelija, akutnu limfocitnu leukemiju B-ćelija, Valdenstrom-ovu makroglobulinemiju, primarnu sistemsku amiloidozu, limfom mantle ćelija (ćelija plašta), prolimfocit/mielocitnu leukemiju, akutnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu mijeloidnu leukemiju, folikularni limfom i NK-ćelijsku leukemiju.
[0048] Kako se ovde koristi, termin "pojedinac" uključuje bilo čoveka ili nehumanu životinju. Termin "nehumana životinja" uključuje sve kičmenjake, na primer sisare i nesisare, kao što su nehumani primati, ovce, psi, krave, kokoši, vodozemci, gmizavci itd.
[0049] "Tretman" označava davanje efikasne količine terapeutski aktivnog jedinjenja iz ovog pronalaska sa ciljem olakšavanja, ublažavanja ili iskorenjivanja (lečenja) simptoma ili stanja bolesti
Aspekti i ostvarenja pronalaska
[0050] U prvom glavnom aspektu, pronalazak se odnosi na metodu za inhbiciju rasta i/ili proliferacije tumorskih ćelija koje eksprimiraju CD38 u individuama koje imaju potrebu za njom, metodu koja obuhvata administraciju pomenutoj individui:
i) neagonističkog antitela koje se vezuje za na pr., vezuje specifino za CD38,
ii) najmanje jednog kortikosteroida i
iii) najmanje jednog nekortikosteroidnog hemoterapeutskog agensa.
[0051] U daljem glavnom aspektu, pronalazak se odnosi na metodu za tretman kancera koji uključuje ćelije tumora koje eksprimiraju CD38 u individuama koje imaju potrebu za njom, metodu koja obuhvata administraciju pomenutoj individu:
i) neagonističkog antitela koje se vezuje za na pr., vezuje specifino za CD38,
ii) najmanje jednog kortikosteroida i
iii) najmanje jednog nekortikosteroidnog hemoterapeutskog agensa, nakon čega sledi autologa transplantacija periferalnih stem ćelija ili koštane srži.
[0052] Najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata talidomid (Thalomid®) ili analog talidomida, na pr. CC-5013 (lenalidomid, Revlimid™) ili CC4047 (Actimid™) i/ili obuhvata inhibitor proteozoma kao što je bortezomib (Velcade®).
[0053] Najmanje jedan kortikosteroid obuhvata glukokortikoid. U jednom ostvarenju, pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata prednizon ili deksametazon. U jednom ostvarenju, pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata citotoksični agens i/ili inhibitor angiogeneze. U daljim ostvarenjima, pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata alkilirajući agens.
[0054] U čak daljem ostvarenju, pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata jedan ili više agenasa odabranih iz grupe koja se sastoji od malfalana, mehloretamina, tioepa, hlorambucila, karmustina (BSNU), lomustina (CCNU), cyklofosfamida, busulfana, dibromomanitola, streptozotocina, dakarbazina (DTIC), prokarbazina, mitomicina C, cisplatine i drugih derivate platine kao što je karboplatina.
[0055] U čak još daljem ostvarenju, pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata vinka alkaloid, kao što je vinkristin ili antraciklin, kao doksorubicin.
[0056] U čak još daljem ostvarenju pronalaska, pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata prednizon i pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata melfalan.
[0057] U čak još daljem ostvarenju pronalaska, pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata prednizon i pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata talidomid.
[0058] U čak još daljem ostvarenju pronalaska, pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata prednizon i pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata melfalan i talidomid.
[0059] U čak još daljem ostvarenju pronalaska, pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon i pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata talidomid i/ili lenalidomid.
[0060] U čak još daljem ostvarenju pronalaska, pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon i pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata vinkristin i/ili doksorubicin.
[0061] U jednom ostvarenju, pomenutoneagonističko antitelo koje se vezuje za CD38 je monoklonalno antitelo.
[0062] U daljem ostvarenju pronalaska, pomenuto antitelo je antagonist CD38.
[0063] U daljem ostvarenju pronalaska, pomenuto antitelo je:
- antitelo koje ne indukuje značajno oslobađanje IL-6 od strane humanih monocita ili ćelija mononukleara periferne krvi što se određuje metodom koja je opisana u primeru 19 ove specifikacije i/ili
- antitelo koje ne indukuje detektabilno oslobađanje IFN-γ od strane humanih T ćelija ili ćelija mononukleara periferne krvi što se određuje metodom koja je opisana u primeru 20 ove specifikacije i/ili
- antitelo koje je internalizovano od strane CD38 eksprimirajućih ćelija; tako su internalizovane od strane CHO-CD38 ćelija u roku od 5 do 15 minuta na 37°C metodom koja je opisana u primeru 12 ove specifikacije i/ili
- antitelo koje indukuje ADCC; kao sa EC50 vrednošću ispod 15 ng/ml, kao ispod 10 ng/ml u Daudiluc ćelijama i sa EC50 vrednošću ispod 75 ng/ml, kao ispod 50 ng/ml, 30 ng/ml ili 10 ng/ml u MM ćelijama što se određuje metodom koja je opisana u primeru 5 ove specifikacije i/ili
- antitelo koje indukuje CDC u prisustvu komplementa; kao sa EC50 vrednošću ispod 5μ g/ml, kao ispod 1 μg/ml u daudi-luc ili CD38-CHO ćelijama što se određuje metodom koja je opisana u primeru 6 ove specifikacije i/ili
- antitelo koje inhibira sintezu cGDPR i/ili
- antitelo koje inhibira sintezu cADPR i/ili
- antitelo koje se vezuje za humani CD38 sa afinitetom (KD) ispod 10-8 M, kao što je opseg od 10-8 M do 10-11 M, na primer u opsegu od 7 x 10-9 M to 10-10 M, kao što se odrepuje površinskom plazmon rezonancom kao što je opisano u primeru 20 ove specifikacije i/ili - antitelo koje inhibira sintezu cGDPR za najmanje 25%, kao za najmanje 30% nakon 90 minuta pri koncentraciji od 3 μg/ml što se određuje spektroetrijskom metodom koja je opisana u primeru 24 ove specifikacije i/ili
- antitelo koje inhibira sintezu cADPR za najmanje 25%, kao za najmanje 30% nakon 90 minuta pri koncentraciji od of 3 μg/ml što se određuje HPLC metodom koja je opisana od strane Munshi et al., J. Biol. Chem.275, 21566-21571 (2000).
[0064] Neagonističko CD38 antitelo -003 je humano monoklonalno IgG1 antitelo koje ima VLregion koji se sastoji od sekvence SEQ ID No:2 i VHregion koji se sastoji od sekvence SEQ ID No:7.
[0065] U jednom ostvarenju, neagonističko CD38 antitelo koje se koristi u ovom pronalasku je antitelo-005. -005 je humano monoklonalno IgG1 antitelo koje ima VLregion koji se sastoji od sekvence SEQ ID No:12 i VHregion koji se sastoji od sekvence SEQ ID No:17.
.
[0066]neagonističko CD38 antitelo -024 je humano monoklonalno IgG1 antitelo koje ima VLregion koji se sastoji od sekvence SEQ ID No:22 i VHregion koji se sastoji od sekvence SEQ ID No:27.
[0067] Neagonističko CD38 antitelo -003 je antitelo koje se vezuje za humani CD38 koje je kodirano od strane nukleinskih kiselina lakog i teškog lanca koje obuhvataju nukleotidne sekvence u svojim varijabilnim regionima prikazane u SEQ ID No:1 and SEQ ID No:6
[0068] U jednom ostvarenju, neagonističko CD38 antitelo -005 koje se koristi u ovom pronalasku je antitelo koje se vezuje za humani CD38 koje je kodirano od strane nukleinskih kiselina lakog i teškog lanca koje obuhvataju nukleotidne sekvence u svojim varijabilnim regionima prikazane u EQ ID No:11 and SEQ ID No:16.
[0069] Neagonističko CD38 antitelo -024 je antitelo koje se vezuje za humani CD38 koje je kodirano od strane nukleinskih kiselina lakog i teškog lanca koje obuhvataju nukleotidne sekvence u svojim varijabilnim regionima prikazane u SEQ ID No:21 and SEQ ID No:26.
[0070] Neagonističko CD38 antitela su opisana u WO2005/103083 (Morphosys), posebno antitelo koje obuhvata jednu ili više sekvenci koje su prikazane na Slici 1b i/ili sekvence date na Slici 2B u WO 2005/103083.
[0071] Antitela interaguju sa ciljnim antigenima prevashodno preko aminokiselinskih ostataka koji su locirani u 6 regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) u okviru lakog i teškog lanca. Iz ovog razloga, aminokiselinske sekvence u okviru CDR su više raznolike između pojedinačnih antitela nego sekvence van CDR-ova. Pošto su sekvence CDR-ova odgovorne za većinu interakcija izmešu antitela i antigena, moguće je eksprimirati rekombinantna antitela koja podražavaju osobine specifičnih antitela koja se nalaze u prirodi putem konstrukcije ekspresionih vektora koji uključuju CDR sekvence iz specifičnih prirodnih antitela, a koje su ugrađene u okvirne sekvence poreklom iz različitih antitela sa različitim osbinama (videti na primer Riechmann, L. et al., Nature 332, 323-327 (1998), Jones, P. et al., Nature 321, 522-525 (1986) i Queen, C. et al., PNAS USA 86, 10029-10033 (1989)).
[0072] Pošto je poznato u nauci da CDR3 domeni teškog lanca antitela imaju posebno važnu ulogu u specfičnosti vezivanja i/ili afiniteta antitela za antigen (Ditzel HJ,et al., J Immunol.
157(2), 739-49 (1996), Barbas SM et al., J. Am. Chem. Soc.116, 2161-2162 (1994), i Barbas SM et al., Proc Natl Acad Sci USA 92(7), 2529-33 (1995), antitela koja se koriste u pronalasku obuhvataju CDR3-ove teškog i lakog lanca od -005.
[0073] Ovde je otkriveno antitelo koje obuhvata VHCDR3 koji ima skevencu prikazanu u SEQ ID No:10 ili antitelo koje kompetira za CD38 vezivanje sa pomenutim antitelom, na primer putem vezivanja istog epitope kao pomenuto antitelo.
[0074] Kompeticija se može odrediti upotrebom ELISA kao što je opisano u sekciji Primeri.
[0075] Kompeticija se takođe može odrediti upotrebom FACS kao što je opisano u sekciji Primeri.
[0076] Ovde je opisano antitelo koje obuhvata VLCDR3 koji ima skevencu prikazanu u SEQ ID No:5 i VHCDR3 koji ima skevencu prikazanu u SEQ ID No:10.
[0077] Ovde je opisano antitelo koje obuhvata varijabilne regione humanog lakog i teškog lanca, naznačeno time da varijablni region lakog lanca obuhvata VLCDR1 koji ima sekvencu prikazanu u SEQ ID No:3, VLCDR2 koji ima sekvencu prikazanu u SEQ ID No:4 i VLCDR3 koji ima sekvencu prikazanu u SEQ ID No:5, i varijablni region teškog lanca obuhvata VHCDR1 koji ima sekvencu prikazanu u SEQ ID No:8, VHCDR2 koji ima sekvencu prikazanu u SEQ ID No:9 i VHCDR3 koji ima sekvencu prikazanu u SEQ ID No:10.
[0078] Ovde je opisano antitelo koje obuhvata VLregion koji ima aminokiselinsku skevencu prikazanu u SEQ ID No:2 ili VLregion koji ima najmanje oko 90%, kao najmanje oko 95% identičnu aminokiselinsku skevencu sa sekvencom prikazanom u SEQ ID No:2.
[0079] Ovde je opisano antitelo koje obuhvata VHregion koji ima aminokiselinsku skevencu prikazanu u SEQ ID No:7 ili VHregion koji ima najmanje oko 90%, kao najmanje oko 95% identičnu aminokiselinsku skevencu sa sekvencom prikazanom u SEQ ID No:7 ili VHregion koji ima 1-5, kao na primer1-3 aminokiselinske zamene (substitucije), delecije ili adicije kada se uporedi sa sekvencom prikazanom u SEQ ID No:7.
[0080] U pronalsaku pomenuto antitelo je antitelo koje obuhvata VHCDR3 koje ima sekvencu prikazanu u SEQ ID No:20. Ovde je opisano antitelo koje komeptira za CD38 vezivanje sa pomenutim antitelom, na primer vezivanjem za isti epitope kao pomenuto antitelo.
[0081] Posebno, u pronalasku pomenuto antitelo je antitelo koje obuhavta VLCDR3 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:15 i VHCDR3 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:20.
[0082] Specifično, u pronalasaku pomenuto antitelo je antitelo koje obuhvata varijabilne regione humanog lakog i teškog lanca, naznačeno time da varijabilni region lakog lanca obuhvata VLCDR1 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:13, VLCDR2 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:14 i VLCDR3 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:15, i varijabilni region teškog lanca koji obuhvata VHCDR1 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:18, VHCDR2 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:19 i VHCDR3 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:20.
[0083] U jednom ostvarenju, pomenuto antitelo je antitelo koje obuhvata VLregion koji ima aminokiselinsku skevencu prikazanu u SEQ ID No:12 ili VLregion koji ima najmanje oko 90%, kao najmanje oko 95% identičnu aminokiselinsku sekvencu sa sekvencom prikazanom u SEQ ID No:12.
[0084] U drugom ostvarenju, pomenuto antitelo je antitelo koje obuhvata VHregion koji ima aminokiselinsku skevencu prikazanu u SEQ ID No:17 ili VHregion koji ima najmanje oko 90%, kao najmanje oko 95% identičnu aminokiselinsku skevencu sa sekvencom prikazanom u SEQ ID No:17 ili VHregion oji ima 1-5, kao 1-3 aminokiselinske substitucije (zamene), delecije ili adicije kada se uporedi sa sekvencom koja je prikazana u SEQ ID No:17.
[0085] Ovde je opisano antitelo koje obuhvata VHCDR3 koji ima aminokiselinsku skevencu prikazanu u SEQ ID No:30 ili antitelo koje kompetira za D38 vezivanje opomenutom antitelu na primer vezivanjem za isti epitope kao pomenuto antitelo.
[0086] Ovde je opisano antitelo koje obuhvata VLCDR3 koji ima aminokiselinsku skevencu prikazanu u SEQ ID No:25 i VHCDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID No:30.
[0087] Ovde je opisano antitelo koje obuhvata varijabilne regione humanog lakog i teškog lanca, naznačeno time da varijabilni region lakog lanca obuhvata VLCDR1 koji ima aminokiselinsku skevencu prikazanu u SEQ ID No:23, VLCDR2 koji ima aminokiselinsku skevencu prikazanu u SEQ ID No:24 i VLCDR3 koji ima aminokiselinsku skevencu prikazanu u SEQ ID No:25, i varijabilni region teškog lanca obuhvata VHCDR1 koji ima aminokiselinsku skevencu prikazanu u SEQ ID No:28, VHCDR2 koji ima aminokiselinsku skevencu prikazanu u SEQ ID No:29 i VHCDR3 koji ima aminokiselinsku skevencu prikazanu u SEQ ID No:30.
[0088] Ovde je opisano antitelo koje obuhvata VLregion koji ima aminokiselinsku skevencu prikazanu u SEQ ID No:22 ili VLregion koji ima najmanje oko 90%, kao najmanje oko 95% identičnu aminokiselinsku sekvencu sa sekvencom na osnovu SEQ ID No:22.
[0089] Ovde je opisano antitelo koje obuhvata VHregion koji ima aminokiselinsku skevencu prikazanu u SEQ ID No:27 ili VHregion koji ima najmanje oko 90%, kao najmanje oko 95% identičnu aminokiselinsku sekvencu sa sekvencom na osnovu SEQ ID No:27 ili VHregion koji ima 1-5, kao na primer 1-3 aminokiselinske zamene (substitucije), delecije ili adicije kada se uporedi sa sekvencom prikazanom u SEQ ID No:27.
[0090] U jednom ostvarenju pronalaska, pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata jedan ili više agenasa odabranih od grupe koja se sastoji od: melfalana, mehloretamina, tioepa, hlorambucila, karmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciklofosfamida, busulfana, dibromomanitola, streptozotocina, dakarbazina (DTIC), prokarbazina, mitomicina C, cisplatine i drugih derivate platine kao što je karboplatina, i pomenuto antitelo je humano monoklonalno IgG1 antitelo koje ima VLregion koji se sastoji od skevence SEQ ID No:12 i VHregion koji se satoji od skevence SEQ ID No:17.
[0091] U jednom ostvarenju pronalaska, pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata melfalan, i pomenuto antitelo je humano monoklonalno IgG1 antitelo koje ima VLregion koji se satoji od skevence SEQ ID No:12 i VHregion koji se sastoji od skevence SEQ ID No:17.
[0092] U drugom ostvarenju, pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata derivate glutaminske kiseline kao što je (Thalomid®) ili analog talidomida, na pr. CC-5013 (lenalidomid, Revlimid™) ili CC4047 (Actimid™), i pomenuto antitelo je humano monoklonalno IgG1 antitelo koje ima VLregion koji se sastoji od skevence SEQ ID No:12 i VHregion koji se satoji od skevence SEQ ID No:17.
[0093] U drugom ostvarenju, pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata (Thalomid®) ili analog talidomida, na pr. CC-5013 (lenalidomid, Revlimid™) ili CC4047 (Actimid™), i pomenuto antitelo je humano monoklonalno IgG1 antitelo koje ima VLregion koji se sastoji od skevence SEQ ID No:12 i VHregion koji se satoji od skevence SEQ ID No:17.
[0094] U drugom ostvarenju, pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata inhibitor proteozoma kao što je bortezomib (Velcade®), i pomenuto antitelo je humano monoklonalno IgG1 antitelo koje ima VLregion koji se sastoji od skevence SEQ ID No:12 i VHregion koji se satoji od skevence SEQ ID No:17.
[0095] U drugom ostvarenju, pomenuti najmanje jedan kotrikosteroid obuhvata deksametazon, pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata inhibitor proteozoma kao što je bortezomib (Velcade®), i pomenuto antitelo je humano monoklonalno IgG1 antitelo koje ima VLregion koji se sastoji od skevence SEQ ID No:12 i VHregion koji se satoji od skevence SEQ ID No:17.
[0096] U drugom ostvarenju, pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata vinka alkaloid, kao vinkristin, i pomenuto antitelo je humano monoklonalno IgG1 antitelo koje ima VLregion koji se sastoji od skevence SEQ ID No:12 i VHregion koji se satoji od skevence SEQ ID No:17.
[0097] U drugom ostvarenju, pomenuti najmanje jedan nekotrikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata antraciklin, kao doksorubicin, i pomenuto antitelo je humano monoklonalno IgG1 antitelo koje ima VLregion koji se sastoji od skevence SEQ ID No:12 i VHregion koji se satoji od skevence SEQ ID No:17.
[0098] U drugom ostvarenju, pomenuti najmanje jedan kotrikosteroid obuhvata prednizon, i pomenuto antitelo je humano monoklonalno IgG1 antitelo koje ima VLregion koji se sastoji od skevence SEQ ID No:12 i VHregion koji se satoji od skevence SEQ ID No:17.
[0099] U drugom ostvarenju, pomenuti najmanje jedan kotrikosteroid obuhvata prednizon, i pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata melfalan, i pomenuto antitelo je humano monoklonalno IgG1 antitelo koje ima VLregion koji se sastoji od skevence SEQ ID No:12 i VHregion koji se satoji od skevence SEQ ID No:17.
[0100] U drugom ostvarenju, pomenuti najmanje jedan kotrikosteroid obuhvata prednizon, i pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata talidomid, i pomenuto antitelo je humano monoklonalno IgG1 antitelo koje ima VLregion koji se sastoji od skevence SEQ ID No:12 i VHregion koji se satoji od skevence SEQ ID No:17.
[0101] U drugom ostvarenju, pomenuti najmanje jedan kotrikosteroid obuhvata prednizon, i pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata melfalan i talidomid, i pomenuto antitelo je humano monoklonalno IgG1 antitelo koje ima VLregion koji se sastoji od skevence SEQ ID No:12 i VHregion koji se satoji od skevence SEQ ID No:17.
[0102] U drugom ostvarenju, pomenuti najmanje jedan kotrikosteroid obuhvata deksametazon, i pomenuto antitelo je humano monoklonalno IgG1 antitelo koje ima VLregion koji se sastoji od skevence SEQ ID No:12 i VHregion koji se satoji od skevence SEQ ID No:17.
[0103] U drugom ostvarenju, pomenuti najmanje jedan kotrikosteroid obuhvata deksametazon, i pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata talidomid i/ili lenalidomid, i pomenuto antitelo je humano monoklonalno IgG1 antitelo koje ima VLregion koji se sastoji od skevence SEQ ID No:12 i VHregion koji se satoji od skevence SEQ ID No:17.
[0104] U drugom ostvarenju, pomenuti najmanje jedan kotrikosteroid obuhvata deksametazon, i pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata vinkristin i/ili doksorubicin, i pomenuto antitelo je humano monoklonalno IgG1 antitelo koje ima VLregion koji se sastoji od skevence SEQ ID No:12 i VHregion koji se satoji od skevence SEQ ID No:17.
[0105] Antitela pogodna za upotrebu u ovom pronalasku takođe uključuju varijante antitela iz primera. Funkcionalna varijanta VLili VHkoja se koristi u kontekstu CD38 antitela i dalje dozvoljava antitelu da zadrži najmanje značajan deo (najmanje oko50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili više) afiniteta/aviditeta i/ili specifičnosti/selektivnosti u odnosu na roditeljsko antitelo (ishodno) i u nekim slučajevima takvo antitelo može biti povezano sa većim afinitetom, selektivnošću, i/ili specifičnošću u odnosu na roditeljsko antitelo.
[0106] "Varijanta" anti-CD38 antitela je antitelo koje se razlikuje od roditeljskog antitela (tipično generisano imunizacijom) u jednoj ili više odgovarajućih izmena aminokiselinskih ostataka, koje su substitucije, delecije, insercije ili adicije terminalnih sekvenci, u VHi/ili VLsekvencama (pri tome treba obezbediti da je najmanje značajna količina karakteristika vezivanja epitope roditeljskog antitela zadržana, ukoliko nije i poboljšana ovakvim promenama).
[0107] Zato, na primer, u varijanti antitela jedan ili više aminokiselinskih ostataka može biti introdukovano ili ubačeno (insercija) u ili do jednog ili više hipervarijabilnih regiona roditeljskog antitela. Anti-CD38 varijanta antitela obuhvata bilo koji broj ubačenih aminokiselinskih ostataka, da je pri tome ponovo obezbeđeno zadržavanje najmanje značajne količine karakteristika vezivanja epitope roditeljskog antitela. Anti-CD38 varijanta antitela iz ovog pronalaska može na primer da obuhvati od oko 1-30 insertovanih (ubačenih) aminokiselinskih ostataka, na primer od oko 2-10, na primer od oko 2-5, ili kao na primer što je od oko 1-5 insertovanih (ubačenih) aminokiselinskih ostataka. Isto tako, anti-CD38 varijanta antitela iz ovog pronalaska može na primer da obuhvati od oko 1-30 deletiranih (izbačenih) aminokiselinskih ostataka, na primer od oko 1-10, kao na primer od oko 2-10, na primer od 25 ili kao na primer što je od oko 1-5 deletiranih (izbačenih) aminokiselinskih ostataka. Isto tako, anti-CD38 varijanta antitela iz ovog pronalaska može na primer da obuhvati od oko 1-30 zamenjenih (substituisanih) aminokiselinskih ostataka na primer od oko 1-10, kao na primer od oko 2-10, na primer od 2-5 ili kao na primer što je od oko 1-5 zamenjenih (substituisanih) aminokiselinskih ostataka. Isto tako, anti-CD38 varijanta antitela korisna za ovaj pronalazak može na primer da obuhvati od oko 1-30 adicija (dodavanje) aminokiselinskih ostataka na terminalnoj sekvenci na primer od oko 1-10, kao na primer od oko 2-10, na primer od 2-5 ili kao na primer što je od oko 1-5 adicija (dodavanje) aminokiselinskih ostataka na terminalnoj sekvenci. Varijanta antitela iz ovog pronalaska moće takođe obuhvatiti kombinaciju dve ili više takvih insercija, delecija, substitucija ili adicija aminokiselinskih ostataka na terminalnoj sekvenci, ali da pri tome varijanta poseduje najmanje značajan deo afiniteta, specifičnosti, i/ili selektivnosti roditeljskog antitela u odnosu na jedan ili više CD38 epitopa.
[0108] Ovde su opisana antitela koje obuhvataju VHCDR3 koji se sastoji u suštini od sekvence koja je najmanje oko 80%, kao najmanje oko 85%, na primer najmanje oko 90%, kao najmanje oko 95% identična sa amino kiselinskom sekvencom na osnovu bilo koje SEQ ID No:10 ili SEQ ID No:20 ili SEQ ID No:30, naznačeno time da antitelo ima najmanje značajan deo (najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili više) karakteristika vezivanja epitope antitela koje ima varijantu VHCDR3 sekvence od SEQ ID No:10 ili SEQ ID No:20 ili SEQ ID No:30, tako da antitelo ima VHsekvencu SEQ ID No:7 ili SEQ ID No:17 ili SEQ ID No:27, tako da antitelo ima VHsekvencu SEQ ID No:7 i VL sekvencu SEQ ID No:2, ili antitelo ima VHsekvencu SEQ ID No:17 i VLsekvencu SEQ ID No:12, ili antitelo ima VHsekvencu SEQ ID No:27 i VLsekvencu SEQ ID No:22.
[0109] Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identočnih pozicija koje dele te sekvence (n to jest %homologije = #identičnih pozicija/total # pozicija x 100), uzimajući u obzir broj prekida (gaps) i dužinu svakog prekida, koje treba da se unesuza optimalno poravnanje dve sekvence. Poređenje sekvenci i određivnje procenta identičnosti između sekveneci može se postići primenom matematičkih algoritama, kao što je opisano u nelimitirajućim primerima u tekstu koji sledi.
[0110] Procenat identičnosti između dve sekvence može se odrediti upotrebom GAP programa u GCG softverskom paketu (dostupno na http://www.gcg.com) korišćenjem NWSgapdna.CMP matriksa i gap težine 40, 50, 60, 70, or 80 i težine dužine 1, 2, 3, 4, 5, ili 6. Procenat identičnosti između dve nukleotidne ili aminokiselinske sekvence može se takođe odrediti korišćenjem algoritma Meyers i W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988)) koji je inkorporisan u ALIGN program (version 2.0), primenom PAM120 weight residue table (tabela težina ostatka), “gap length penalty” (penal dužine prekida) od 12 i a “gap penalty” (penal prekida) od 4. Dodatno, procenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence može se odrediti primenom Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970)) algorithma koji je inkorporiran u GAP program u GCG softveruskom paketu (dostupno na http://www.gcg.com) korišćenjem ili Blossum 62 matriksa ili PAM250 matriks, “gap weight” (težine prekida) 16, 14, 12, 10, 8, 6, or 4 i l”ength weight” (težine dužine) od 1, 2, 3, 4, 5, or 6.
[0111] Sekvenca CDR varijanti se može razlikovati od sekvence CDR-a sekvence roditeljskog antitela kroz uglavnom konzervativne substitucije (zamene); na primer najmanje oko 35%, oko 50% ili više, oko 60% ili više, oko 70% ili više, oko 75% ili više, oko 80% ili više, oko 85% ili više, oko 90% ili više, oko 95% ili više (e.g., oko 65-99%) substitucija u varijanti su zamene konzerviranim aminokiselinskim ostacima. U kontekstu ovog pronalaska, konzervativne substitucije se mogu definisati substitucijama u okviru klasa aminokiselina koje su reflektovane u jednoj ili više tabela (tri) koje slede:
Klase aminokiselinskih ostataka za konzervativne substitucije
Alternativne klase aminokiselinskih ostataka za konzervativne substitucije
Alternativne fizičke i funkcionalne klasifikacije aminokiselinskih ostataka
[0112] Još grupisanja u smislu konzervativnih substitucija uključuju: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, i asparagin-glutamin. Dodatne grupe aminokiselina mogu se formulisati primenom principa opisong u na primer Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties (2d Ed. 1993), W.H. Freeman and Company.
[0113] Tamo gde se prave insericje u hipervarijabilnom regionu kako bi se generisala varijanta antitela tipičan opseg hiprevarijabilnog regiona koji je u pitanju treba staviti u kontekst poznatog antitela. Na primer, za prvi hipervarijabilni region varijabilnog regiona lakog lanca, insercija se može uneti preko VLCDR1 sekvence roditeljskog antitela dok se zadržava suštinski slična i samim tima oćekivana odgovarajuća veličina koja na osnovu Kabat et al., supra, e.g., tipično ima sveukupno oko 9-20 (e.g., oko 10-17) ostataka. Slično, VLCDR2 tipično ima dužinu od oko 5-10 ostataka; VL CDR3 tipično ima dužinu od oko 7-20 ostataka; VHCDR1 tipično ima dužinu od oko 10-15 ostataka; VH CDR2 tipično ima dužinu od oko 15-20 ostataka; and VHCDR3 tipično ima dužinu od oko 6-30 ostataka (e.g., 3-25 ostataka). Insercije u VHregion su tipično napravljene u VHCDR3 i tipično blizu C-terminusa domena, kao na primer oko ostataka 97-102 roditeljskog VHCDR3 (na primer, uz , ili C terminalni kraj u sekvenci do, broja ostatka 100 roditeljskoe VHCDR3 sekvence) korpšćenjem poravnanja i određivanja broja pozicije kao što je opisano u Kabat. Varijante antitela sa ubačenim aminokiselinskim ostatkom (ostacima) u hipervarijabilni region mogu biti nasumično propremljene, pogotovu tamo gde je početni afinitet vezivanja roditeljskog antitela za ciljni antigen takav da nasumično proizvedene varijante antitela mogu odmah da se ptretaže (skrinuju). Na primer, “fage display” (izlaganje fagima je pogodna metoda za pretraživanje ovakvih nasumičnih varijanti).
[0114] Ovde su opisana antitela koja su okarakterisana u odnosu na njihovu sposobnost da kompetiraju (kompetitivno inhibiraju) ili među-kometiraju (na primer relativno delimično inhibiraju vezivanje epitope) sa antitelom koje ima VLsekvencu od SEQ ID No:2 i VHsekvencu od SEQ ID No:7 (kao antitelo -003), ili antitelom koje ima VLsekvencu od SEQ ID No:12 i VHsekvencu od SEQ ID No:17 (kao antitelo -005) ili antitelom koje ima VLsekvencu od SEQ ID No:22 i VHsekvencu od SEQ ID No:27, (kao antitelo -024), za vezivanje za CD38. Ovakvo antitelo može biti na primer, Fab fragment, dobijen iz antitela koje se vezuje za epitope identičan sa ili se preklapa sa epitopom vezanim sa antitelom koje ima VLsekvencu od SEQ ID No:2 i VHsekvencu od SEQ ID No:7, ili antitelom koje ima VLsekvencu od SEQ ID No:12 i VHsekvencu od SEQ ID No:17 ili antitelom koje ima VLsekvencu od SEQ ID No:22 i VHsekvencu od SEQ ID No:27. Kompeticija za vezivanje za CD38 ili deo CD38 od strane dva ili više antitela može se odrediti bilo kojom pogodnom tehnikom. U jednom ostvarenju kompeticija je određena na primer, kao to je opisano u primerima 7, 8, i 9.
[0115] Često je kompeticija označena značajno vežom relativnom inhibicijom nego oko %% ako se odredi ELISA testom i/ili FACS analizom. Može biti pođeljno da se podese viši limiti (trasholds) relativne inhibicije kao krireijum/determinant od onoga što je primereno nivo kompeticije u odrešenom kontekstu (na primer, gde se analiza kompeticije koristi za selekciju ili pretraćivanje tj skrining novih antitela dizajniranih sa namerom da imaju funkciju u blokiranju vezivanja drugog peptida ili molekula za CD38 ( na primer prirodni partneri u vezivanju CD38 kao što je CD31, koji se takođe naziva CD31 antigen, EndoCAM, GPIIA’, PECAM-1, trombicitni/endotelijalni ćelijski adhezioni molekuli ili prirodno anti-CD38 antitelo). Tako na primer, oguće je podesiti kriterjume za kompetitivnost naznačeno time da namanje oko 10% relativne inhibicije se detektuje namanje oko 15% relativne inhibicije se detektuje; ili namanje oko 20% relativne inhibicije se detektuje pre nego što se antitelo smatra da je dovoljno kompetitivno. U sluajevima gde epitopi koji pripadaju kompetirajućim antitelima su locirani blizu na antigen kompeticija se može označiti kao veća od oko 40% relativne inhbicije CD38 vezivanja (na primer najmanje oko 45% inhbicije, kao najmanje oko 50% inhbicije, na primer najmanje oko 55% inhbicije, kao najmanje oko 60% inhbicije, na primer najmanje oko 65% inhbicije, kao najmanje oko 70% inhbicije, na primer najmanje oko 75% inhbicije, kao najmanje oko 80% inhbicije, na primer najmanje oko 85% inhbicije, kao najmanje oko 90% inhbicije, na primer najmanje oko 95% inhbicije, ili viči nivo relativne inhibicije)
[0116] Ovde je opisano antitelo koje se specifično vezuje za CD38 epitop koji se takođe specifično vezuje za antitelo koje ima VLsekvencu SEQ ID No:2 i VHsekvencu SEQ ID No:7 (kao antitelo -003), ili antitelo koje ima VLsekvencu SEQ ID No:12 i VHsekvencu SEQ ID No:17 (kao antitelo -005) ili antitelo koje ima VLsekvencu SEQ ID No:22 i VHsekvencu SEQ ID No:27 (kao antitelo -024).
[0117] CD38 epitop vezan za antitelo koje ima VLsekvencu SEQ ID No:2 i VHsekvencu SEQ ID No:7 (kao antitelo -003), ili antitelo koje ima VLsekvencu SEQ ID No:12 i VHsekvencu SEQ ID No:17 (kao antitelo -005) ili antitelo koje ima VLsekvencu SEQ ID No:22 i VHsekvencu SEQ ID No:27 (kao antitelo -024) može biti identifikovano preko standardnog mapiranja i tehnika za karakterizaciju, dalja finija analiza kojom može biti identifikovano ukluučuje bilo koju pogodnu tehniku, i brojni primeri su poznati stručnjacima u nauci i oblasti. Ove tehnike takođe mogu biti upotrebljene za identifikaciju i/ili karakterizaciju epitope za anti-CD38 antitela generano. Kao jedan takav primer metode za identifikaciju i/ili karakterizaciju, je metda putem koje se epitop za anti-CD38 antitelo može biti odrediti epitope "foot-printing" metodom primenom hemijske modifikacije izloženih amina/karboksila u CD38 proteinu. Jedan specifičan primer takve "foot-printing" tehnike je upotreba HXMS (vodonik-deuterijum izmenjivanje koje detektute masena spektrometrija) naznačeno time da se dešavaju vodonik/deuterijum izmena protona proteina receptora i liganda, vezivanje, i povratna izmena, naznačeno time da amidne grupe okosnice koje učestvuju u proteinskom vezivanje su zaštićene od povratne razmene i samim tim ostaju sa deuterijumom. Relevantni regioni mogu biti identifikovani u ovom momentu pomoću peptične proteolize, separacijom brzom mikrobornom telnom hromatografijom visoke preformanse, i/ili electronsprej jonizujućom masenom spektrometrijom. Videti na primer, Ehring H, Analytical Biochemistry, 267(2) 252-259 (1999) i/ili Engen, J.R. and Smith, D.L. (2001) Anal. Chem.73, 256A- 265A. Još jedan primer pogodne tehnike identifikacije epotopa je nuklearna magnetna rezonanca za mapiranje epitope (NMR) gde se porede tipično pozicija signala za dvodimenzionalne NMR spektre slobodnog antigena i antigena u kompleksu sa antigen vezujućim peptidom, kao što je antitelo. Antigen je tipično elektivno obeležen sa izotopom u 15N tako da samo signali koji odgovaraju antigen se vide na NMR spektru a ne signali od antigen vezujućeg peptide. Antigen signali koji potiču od aminokiselina koje učestvujuu interakciji sa antigen vezujućim peptidom tipično že promeniti poziciju u spektrima kompleksa kada se uporede sa spektrima slobodnog antigena, i amino kisline koje učestvuju u vezivanju se onda mogu detektovati na taj način. Videti na primer, Ernst Schering Res Found Workshop. (44), 149-67 (2004), Huang et al., Journal of Molecular Biology 281(1), 61-67 (1998) i Saito and Patterson, Methods.9(3), 516-24 (1996).
[0118] Identifikacija i/ili karakterizacija apitopa može se uraditi primenom metoda masene spektrometrije. Videti an primer, Downward, J Mass Spectrom. 35(4), 493-503 (2000) and Kiselar and Downard, Anal Chem.71(9), 1792-801 (1999).
[0119] Tehnike digestije proteazom mogu takođe biti korisne u kontekstu mapiranja epitope i njegove identifikacije. Regioni/sekvence relevantni za entigenu determinant mogu se odrediti digestijom sa proteazom, na primer primenom tripsina u odnosu oko 1:50 za CD38 preko noći (O/N) sečanje na 37°C i pH 7-8, nakon čega sledi analiza masenom spektrometrijom (MS) za identfikaciju peptida. Peptidi koji su zštićeni od sečenja tripsinom od strane antitela mogu se zatim identifikovti poređenjem uzoraka koji su podvrgnuti digestiji tripsinom i uzoraka koji su inkubirani sa antitelom i zatim podvrgnuti sečenjem san a primer tripsinom (na taj način se otkrivaju otisci “foot print” za onoga koji se vezuje). Drugi enzimi kao himotripsin, pepsin, itd., mogu biti alternative za primenu u sličnoj metodi za karakterizaciju epitope. Antitelo koje daje značajno iste rezultate kao antitelo koje ima VLsekvecu ima VLsekvencu SEQ ID No:2 i VHsekvencu SEQ ID No:7 (kao antitelo -003), ili antitelo koje ima VLsekvencu SEQ ID No:12 i VHsekvencu SEQ ID No:17 (kao antitelo -005) ili antitelo koje ima VLsekvencu SEQ ID No:22 i VH sekvencu SEQ ID No:27 (kao antitelo -024) u ovim merenjima su predvišeni da budu antitela koja vezuju isti epitope kao antitelo koje ima VLsekvencu SEQ ID No:2 i VHsekvencu SEQ ID No:7 (kao antitelo -003), ili antitelo koje ima VLsekvencu SEQ ID No:12 i VHsekvencu SEQ ID No:17 (kao antitelo -005) ili antitelo koje ima VLsekvencu SEQ ID No:22 i VHsekvencu SEQ ID No:27 (kao antitelo -024). Videti na primer,Manca, Ann 1st Super Sanita.
27(1), 15-9 (1991) za diskusiju o sličnim tehnikama.
[0120] Druge metode koje potencijalno mogu pomoći u mapiranju epitope uključuju kristalografne tehnike, tehnike difrakcije X-zracima (kao tehnike za proučavanje X-zracima/sekvenci razvijene od strane Poljak i drugih tokom 1970s-1980s), i primenu “Multipin Peptide Synthesis Technology” (tehnologija multipne petidne sinteze). Metode koje se baziraju na komjuterskim analizama kao analiza sekvenci i analiza trodimenzionalnih struktura i doking se mogu takođe koristiti za identifikaciju antigenih determinanti. Na primer, epitop se može takođe odrediti molekularnim modelovanjem pomoću strukture CD38 sa dokingom structure Fab fragmenta pojedinačnog monoklonalnog tela. Ove i druge metode mapiranja su diskutovane u Epitope Mapping A Practical Approach (Westwood and Hay Eds.) 2001 Oxford University Press.
[0121] Antitelo koje se koristi u ovom pronalasku može imati bilo koji pogodan afinitet i/ili avidnost za epitope koji se sadrći u CD38. Afinitet se odnosi na jačinu vezivanjaantitela na takav epitope. Tipično afinitet se meri pomoću disocione konstanta Kd, koja je definisana kao [Ab] x [Ag] / [Ab-Ag] gde je [Ab-Ag]molarna koncentracija kompleksa antigen antitelo (ili antigen-antigen kompleksa), [Ab] je molarna koncentracija nevezanog antitela i [Ag] je molarna koncentracija nevezanog antigena. Afinitativna knstanta Ka je definisna kao 1/Kd. Pogdne metode za odreživanje specifičnosti i afiniteta putem kompetitivne inhibicije mogu se naći na primer u Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley InterScience N.Y., (1992, 1993) i Muller, Meth. Enzymol.92, 589-601 (1983).
[0122] Anti.CD38 antitela koja se koriste u ovom pronalasku mogu imati afinitet za epotop u CD38 u opsegu od oko 104 do oko 1010 M-1. Ovakvo antitelo može imati afinitet koji je najmanje visok za CD38 kao 003 i -005 i -024, i unekim ostvarenjima može imati afinitet koji je najmanje oko visok kao 003 i -005 i -024. Afinitet se može odrediti bilo kojom metodom koja je negde opisana ovde ili u ekvivalentu u nauci. Primer jedne metode koja se može primeniti za iodređivanje afiniteta obezbeđena je u Scatchard analysis od Munson & Pollard, Anal. Biochem.107, 220 (1980). Afinitet vezivanja se može takođe odrediti metodama ekvilibrijuma (na primer imunoabsorujući esej povezan sa enzimom (ELISA) ili radioimuno esejom (RIA)) ili kinetičkim analizama (na primer BIACORE™ analizom).
[0123] Tipično disociona konstanta za anti CD-38 antitela koja se koriste u ovom pronalasku je manja od oko 100 nm, manja od oko 50 nM, manja od oko 10 nM, oko 5 nM ili manje, oko 1 nM ili manje, oko 0.5 nM ili manje, oko 0.1 nM ili manje, oko 0.01 nM ili manje, ili oko 0.001 nM ili manje.
[0124] Ne-limitirajući primeri anti-CD38 antitela uključuju (a) kompletan funkcionalan molekul imunoglobulina koji obuhvata (i) dva himera teška lanca koji sadrže varijabilni region sa humanom B ćelijskom površinskom antigenskom specifičnošću i humani konstantni region, i (ii) dva identična cela (to jest ne-himerna) humana laka lanca; (b) kompletan funkcionalan molekul imunoglobulina koji obuhvata (i) dva identična himerna teška lanca koja obuhvataju varijabilni region kao što je navedeno i humani konstantni region, i (ii) dva identična kompletna (to jest ne-himerna) ne-humana laka lanca; (c) monovalentno antitelo to jest kompletan funkcionalan molekul imunoglobulina koji obuhvata (i) dva identična himerna teška lanca koja obuhvataju varijabilni region kao što je navedeno i humani konstantni region, i (ii) dva različita laka lanca od kojih samo jedan ima situ specifičnost kao varijabilni region is teškog lanca. Rezultujući molekul antitela se vezuje samo za jedan kraj njegov i zato nije sposobno da se divalentno vezuje. Kao još jedna ilustracija peptide povezani sa imunoglobulinom mogu biti takvi da uključuju sledeće: (a) ceo molekul imunoglobulina; (b) scFv; (c) monoklonalno antitelo; (d) humano antitelo; (e) himerno antitelo; (f) humanizovano antitelo; (g) Fab fragment; (h) Fab’ fragment; (i) F(ab’)2 fragment; (j) Fv molekul; i (k) disulfidom vezan Fv molekul.
[0125] U jednom ostvarenju antitelo koje sekoristi u ovom pronalasku je glikozilovano u eukariotskoj ćeliji. U drugom ostvarenju antitelo koje se koristi u ovom pronalasku dalje obuhvata helatoski linker za vezivanje radioizotopa. U daljem ostvarenju antitelo koje se koristi u ovom pronalasku je u suštinski izolovanoj formi.
[0126] Monoklonalnoantitelo antitelo se odnosi na kompoziciju koja obuhvata homogeno populaciju antitela koja ima uniformnu sktukturu i specifičnost. Tipično monoklonalno antitelo je dobijeno iza populacije suštinski homologih antitela to jest individualna antitela koja sačinjavaju populaciju su identična osim što postoji mogućnost prisiustva mutacija koje prirodn nastaju i mogu biti prisutne uminornim količinama. Monoklonalna antitela su visoko specifična i sbvako antitelo je tipično usmereno protiv jednog epttopa, što je nasuprot preparaciji poliklonalnog antitela koje tipično uključuje različita antitela koja su su usmerene protiv različitih epitope. To da je antitelo monoklonalno ne treba tumačiti kroz neophodnu proizvodnju antitela bilo kojom određenom metodom. Na primer, monoklonalna tela iz ovog pronalaska mogu biti proizvedena metodom hibridome koja je prvi put opisana od strane Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), ili mogu biti proizvedena putem metoda rekombinantne DNK. Monoklonlna antitela mogu takođe biti izolovana iz fagnih biblioteka antitela pomoću tehnike opisne u na primer, Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol.222, 581-597 (1991).
[0127] Monokolnalna antitela se mogu dobiti iz bilo kog pogodnog izvora. Tako, na primer, monoklonalna antitela se mogu dobiti iz hibridoma iz mišijih B ćelija slezine koje su dobijene iz miševa imunizovaniha sa antigenom od interesa, na pimer u formi ćelija koje eksprimiraju antigen na površini, ili nukleinske kiseline koja kodira antigen od interesa. Monoklonalna antitela se takođe mogu dobiti iz hibridoma koje su dobijene iz ćelija koje eksprimiraju antitelo u imEP imunizovanih ljudi ili ne-humanih sisara kao šrto su pacovi, psi. primate itd.
[0128] Alternativno, klonirani geni antitela mogu se ekprimirati u drugim ekspresionim sistemima, uključujući prokariotske ćelije, kao što su mikroorganizmi, kao E. coli, za proizvodnju pojedinačnog lanca Fv antitela, alge, kao i ćelije insketa. Dalje, antitela se mogu proizvesti u transgenim ne-humanim životinjama kao u mleku iz ovce i zečeva ili u jajima kokošaka ili u transgenim biljkama. Videti na primer, Verma, R., et al., J.Immunol.Meth.216, 165-181 (1998); Pollock, et al., J.Immunol.Meth.231, 147-157 (1999); and Fischer, R., et al., Biol.Chem.380, 825-839 (1999).
[0129] Humana monoklonalna antitela koja su usmerena protiv CD-38 mogu se generisati pomoću transgenih ili transhromozomalnih miševa koji nose delove humanog imunog sistema pre nego mipijeg sistema. Ovakvi transgeni i transhromozomalni miševi uključuju miševe koji seovde označavaju kao HuMAb miševi i KM miševi, i kolektivno su označeni kao “transgeni miševi”. Humano monokonalno antitelo koje je generisano u ovakvim miševima može imati skraćeno ime ka HuMab.
[0130] HuMAb miš sadrži minilokuse gena za humani immunoglobulin koji kodira nesređene humane sekvence teškog (m i γ) i κ lakog imunoglobulinskog lanca, zajedno sa ciljanim mutacijama koje inaktiviraju endogeni m i κ lokuse lanca (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). U skladu sa tim, miševi pokazuju redukovanu ekspresiju mipijeg IgM ili κ i kao odgovor na imunizaciju introdukovani humani transgeni teškog i lakog lanca podlešu promeni klase (class switch) i somatskoj mutaciji kako bi se generisala visoko afinitetna humana IgG,κ monoklonalna antitela Lonberg, N. et al. (1994), supra; revija u Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 1365-93 (1995) i Harding, F. i Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764536-546 (1995)). Priprema HuMAb u miševima je detaljno opisana u Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol.152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). See also US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 and WO 01/09187.
[0131] HCo7 miševi imaju JKD disrupciju u njihovim genima za endogene lake (kappa) lance (kao što je opisano u Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), CMD disrupciju u njihovim genima za endogene teške lance (kao što je opisano u primeru 1 u WO 01/14424), KCo5 transgen za humani kapa laki lanac (kao što je pisano u Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), i HCo7 transgen humanog teškog lanca (kao što je opisano u US 5,770,429).
[0132] HCo12 miševi imaju JKD disrupciju u njihovim genima za endogene lake (kappa) lance (kao što je opisano u Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), CMD disrupciju u njihovim genima za endogene teške lance (kao što je opisano u primeru 1 u WO 01/14424), KCo5 transgen za humani kapa laki lanac (kao što je pisano u Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), i HCo12 transgen humanog teškog lanca (kao što je opisano u primeru 2 u WO 01/14424). UKM mišijem soju, gen za mišiji endogeni kapa laki lanac je homozigotnono poremećen kao što je opisano u Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993) i gen za endogeni mišiji teški lanac je homozigotnono poremećen kao što je opisano u Primeru 1 u WO 01/09187. Ovaj mišiji soj nosi transgen humanog lakog lanca, KCo5 kao što je opisano u Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Mišiji soj takođe nosi humani transhromozom lakoglanca koji je sastvaljen od hCF fragmenta hormozoma 14 (SC20) kao što je opisano u WO 02/43478.
[0133] KM miš sadrži transhromozom humanog teškog lanca i transgen humanog lakog lanca. Endogeni mišiji geni za teški i laki lanac su takođe poremećeni u KM miševima tko da imunizacija miševa dovodi do proizvodnje humanih imunogobulina, a ne mišijih imunoglobulina. Konstrukcija KM miševa i njihova upotreba za podizanje tj sintezu imunoglobulina je opisana detaljno u WO 02/43478. Ćelije slezine iz ovih transgenih miševa može biti upotrebljen da generiše hibridome koji sekretuju humana monoklonalna antitela na osnovu poznatih tehnika.
[0134] Humana monoklonalna ili poliklonalna antitela, ili antitela koja potiču od drugih vrsta mogu se takođe generisati transgenetski kroz generisanje drugog ne-humanog sisara ili biljke koja je transgena za sekvence teškog i lakog lanca imunoglobulina od interesa i proizvodnju antitela u formi koja je dobijena od njega. U vezi sa transgenom proizvodnjom u sisarina, antitela se mogu proizvesti u, i dobiti iz mleka koza, krava, ili drugih sisara. Videti na primer US 5,827,690, US 5,756,687, US 5,750,172 and US 5,741,957.
[0135] Dalje, humana antitela koja se koriste u ovom pronalasku ili antitela iz drugih vrsta mogu se generisati putem tehnologija izlaganja (display-type technologies) uključujući bez ograničenja izlaganje fagima (phage display), izlaganje retrovirusima (retroviral display), i druge tehnike, upotrebom tehnika koje su poznate u nauci i rezultujući molekuli mogu biti podvrgnuti dodatim maturacijama (sazrevanjima) kao što je afinitativna maturacija, i takve tehnike su poznate u nauci (videti na primer instance Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991) (phage display), Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996) (izlaganje fagima), Hanes and Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997) (izlaganje ribozomima), Parmley and Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (izlaganje fagima), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hoogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992), and US 5,733,743). Ako se tehnika izlaganja koristi za proizvonju antitela koja nisu humana, ovakva antitela se mogu humanizovati na primer kao što je opisano ovde na drugim mestima.
[0136] Primeri kako se mogu napraviti humanizovana antitela mogu se pronaći u na primer US 6,054,297, US 5,886,152 and US 5,877,293. Takođe, upotreba Ig cDNA za konstrukciju himernih imunoglobulinskih gena poznata je u nauci (videti na primer Liu et al., PNAS USA 84, 3439 (1987) i J.Immunol.139, 3521 (1987).
[0137] Anti-CD38 antitela se mogu dobiti iz rekombinantnih biblioteka kombinatornih antitela, kao što je scFv “phage display” biblioteka koja se može napraviti sa humanom VLi VHcDNK koja je pripremljena iz iRNK dobijene iz humanih limfocita. Metode za pripremu i pregled tj skrining ovakvih biblioteka poznate su u nauci. Postoje mnogobrojni komercijalno dostupni kitovi za generisanje “phage display” biblioteka. Takođe postoje druge metode i reagensi koji se mogu koristiti za generisanje i skrining biblioteka izlošenih antitela (videt na primer, US 5,223,409, WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690, Fuchs et al., Bio/Technology 9,1370-1372 (1991), Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3, 81-85 (1992), Huse et al., Science 246,1275-1281 (1989), McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990), Griffiths et al., EMBO J 12, 725-734 (1993), Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889-896 (1992), Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991), Gram et al., PNAS USA 89, 3576-3580 (1992), Garrad et al., Bio/Technology 9, 1373-1377 (1991), Hoogenboom et al., Nuc Acid Res 19, 4133-4137 (1991) i Barbas et al., PNAS USA 88, 7978-7982 (1991)). Pogodne sekvnece nukleinskih kiselina za VLi VHmogu se selektovati upotrebom milo koje odgovarajuće metode. Na primer, nukleinske kiseline za VLi VHmogu se odabrati primenom metoda improntinga epitope opisane u WO93/06213. Biblioteke antitela, kao što su scFv biblioteke mogu se pripremiti i skrinovati poznatim i prigodnim metodama (sa humanism CD38 sadržućim peptidima kao antigenom (antigenima)), kao što su one opisane u na primer WO92/01047, McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990) and Griffiths et al., EMBO J 12, 725-734 (1993). Ovakve biblioteke antitela se mogu koristiti terapeutski kako bi se obezbedio dodatno sveobuhvatan imuni odgovor; kao alati u metodama skrininga za imunogene peptide, male molecule, druga anti-CD38 antitela (na primer putem kompetitivnih eseja) i slično; i/ili u dijagnostičkim metodama i kompozicijama (na primer imuoesejski čip koji obuhvata panel takvih antitela opcionalno u asocijaciji sa drugim antitelima može se pripremiti stndardnim tehnikama). Jednom kada se inicijalno humani VLi VHsegmenti odaberu, “mix and match” eksperimenti (pomešaj i upari) u kojima različiti parovi inicijalno selektovanih VLi VHsegmenata se skrinuju za vezivanje peptide koje sadrži CD38, mogu se izvesti tako da se odabere željena kombinacije VL/VHsegment para. Na primer, reaktivnost peptide može biti determinisana EPISA testom ili drugim pogodnim metodama analize epitope (videti na primer, Scott, J. K. and Smith, G. P. Science 249, 386-390 (1990), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Felici et al., J. Mol. Biol. 222, 301-310 (1991) i Kuwabara et al., Nature Biotechnology 15, 74-78 (1997) za diskusiju ovakvih tehnika i principa). Antitela mogu biti selektovana njihovim efinitetom za antigen i/ili njihovom kinetikom disocijacije (off-rate) od antigena (videti na primer, Hawkins et al., J. Mol. Biol.226, 889-896 (1992)).
[0138] Peptidi antitela sa visokim afinitetom kao što su humani jednolančani Fv (scFv) i Fab fragmenti antitela mogu se takođe izolovati iz takvih biblioteka upotrebom “panning” tehnike u kojoj entigen od interesa je mobilizovan na švrstu površinu, kao što su mikrotitar ploče ili kuglice (videti na primer Barbas and Burton, Trends. Biotechnol. 14, 230-234 (1996) and Aujame et al., Hum. Antibodies 8, 155-68 (1997). “Phage display” velikih naivnih biblioteka takođe omogućavaju da se izoluju antitela i to direktno bez imunizacije (videti na primer de Haard et al., J. Biol. Chem.274(26), 18218-18230 (1999)).
[0139] Antitela pogodna za upotrebu u ovom pronalasku mogu se odabrati na osnovu njihove sposobnosti da obezbede ili ne fiksaciju komplementa. Postoji veliki broj izotipova antitela koja su sposobna za fiksaciju komplementa i CDD, uključujući bez ograničenja sledeće: mišiji IgM, Mišiji IgG2a, mišiji IgM, mišiji IgG2a, mišiji IgG2b, mišiji IgG3, humani IgM, human IgG1, i humani IgG3. Ovi izotipovi koji ne uključuju, bez ograničenja, humani IgG2 i humani IgG4. Determinacija izotipa i druge metode za modofokaciju fiksacije komplementa i CDC funkcionalnih karakteristika antitela su poznate u nauci.
[0140] Anti-CD38 antitela koja se koriste u ovom pronlasku mogu se pripremiti rekombinantnom ekspresijomu bilo kom pogodnom tipu čelija ili životinja. Pogodne metode za proizvodnju antitela su poznate u nauci i uključuju one opisane u na primer, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988), Harlow and Lane: Using Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)), US 4,376,110 i Ausubel et al., eds., Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. i Wiley InterScience N.Y., (1987, 1992). Monoklonalna antitela se mogu dobiti primenom metode hibridome koja je prvi put opisana od strane Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), ili u drugim dobro poznatim naknadno razvijenim metodama (videti na primer, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Hibridoma ćelije se mogu koristiti za proivodnju anti-CD38 antitela iz ovog pronalaska. Ovakve hibridome se mogu formirati hemijskom fuzijom, električnom fuzijom ili bilo kojom pogodnom tehnikom, sa bilo kojoim pogodnim tipom ćelija mijeloma, heteromijeloma, foblastoidnnih ćelija, plazmocitoma ili drugih ekvivalentnih njihovih i bilo kojih pogodnih tipova ćelija koje skprimiraju antitelo. Transformisane B ćelije mogu se takođe koristiti za efikasnu proizvodnju antitela iz ovog pronalaska. Ovakve ćelije mogu se proizvesti standardnim tehnikama, kao što je transformacija sa Epstajn Bar virusom, ili transformacijom gena. (Videti na pr. "Continuously Proliferating Human Cell Lines Synthesizing Antibody of Predetermined Specificity," Zurawaki, V. R. et al., in Monoclonal Antibodies, ed. by Kennett R. H. et al., Plenum Press, N.Y.1980, pp 19-33.).
[0141] Rekombinantne ćelije koje obuhvataju egzogene nukleinske kiseline koje kodiraju anti CD-38 antitela mogu miti ptipremljene bilo kojom pogodnom tehnikom (na primer transfekcijom/transformacijom sa palzmidnim vektorom sa golom DNK, virusnim vektorom, invazivnim bakterijskim vektorom ili vektorom cele ćelije itd., koji obuhvataju sekvencu koja koidira antitelo (ili sekvence) koje se dostavljaju u ćeliju pomoću transfekcije pomognute kalcijum fosfatnom precipitacijom, targetovanja i transfekcije posredovane receptorom, “biolistic” dostave, elektroporacije, tarnsfekcije posredovane dekstrano, transformacije posredovane lipozomom, fuzije protoplasta, direktnog mikroinjektiranje itd., (videti na promer,., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2d Edition, 1989 and 3rd Edition, 2001) i F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987).
[0142] Ćelijske linije koje su dostupne kao domaćinske za ekspresiju rekombinantnih proteina su poznate u nauci i uključuju mnoge imortalizovane (besmrtne) ćelijske linije koje su dostupne od American Type Culture Collection (ATCC). Ove uključuju. Između ostalog, ćelije bubrega bebe hrčka ćelije jejnika kineskog hrčka (CHO), NSO, SP2 ćelije, HeLa ćelije, (BHK), ćelije bubrega majmuna (COS), humane hepatocelularne ćelije carcinoma (e.g., Hep G2), A549 ćelije, i mnogobrojne druće ćelijske linije. Druge ćelijske linije koje se mogu upotrebiti su insektske ćelijske linije kao Sf9 ćelije. Kada se nukleinske kiseline (ili vektori koji sadrće nukleinske kiseline) koje kodiraju protein, (kao anti-CD38 antitela) ubace u domaćinsku sisarsku ćeliju, protein se mogu proizvodti gajenjem domaćinskih ćelija uvremenskom period koji je dovoljan da dozvoli ekspresiju preoteina u domaćinskim ćelijama ili sekreciju proteina u medijum za gajenje u kojima rastu domaćinske ćelije. Antitela se mogu dobiti iz medijuma za gajenje promenom standardnih metoda purifikacije (prečišćavanja) proteina. Antitela se mogu dobiti iz lizata domaćinskih ćelija kada se direktno ekprimiraju bez sekretornog signala.
[0143] Kada se geni u rekombinantnim ekspresionim vektorima koji kodiraju anti -CD38 atitela unesu u sisarske domaćinske ćelije, antitela se proizvode u domaćinskim ćelijama u vremenskom periodu koji je dovoljan da dozvoli ekpresiju antitela o domaćinskim ćelijama ili sekreciju antitela u medijum za gajenje u kojima rastu domaćinske ćelije. Prečišavanje antitela iz ćelijskih kultura, lizata ćelija iz životinja (na primer ascites tečnost transgenih životinja koje proizvode anti-CD38 antitela) mogu se postići primenom bilo kog broja pogodnih tehnika poznatih u nauci uključujući na primer prećišćavanje na imunoafinitatovnoj koloni; sulfatnu precipitaciju; hromatofokusiranje, preparativni SDS-PAGE, i slino).
[0144] Humana monoklonalna antitela iz ovog pronalaska mogu se takođe prozivesti drugim mnogobrojnim tehnikama, uključujući konvencionalne metodologije za monoklonalna antitela, na primer standardne tehnike hibridizacije somatskih ćelija oisane od strane Kohler and Milstein, Nature 256, 495 (1975). Druge tehnike za proizvodnju onoklonalnih antitela mogu se takože koristiti, na primer izlaganje faga “phage display” tehnikama upotrebom biblioteka gena humanih antitela. U jednom ostvarenju anti-CD38 antitela iz ovog pronalaska su proizvedena primenom hibridoma generisanih u mišijem sistemu. Proizvodnja hibridoma u mišu je dobro poznata i uspostavljen aprocedura. Imunizacioni protokoli i tehnike za izolaciju imunizovanih ćelija slezine za fuziju su poznate u nauci. Fuzioni partneri (na primer mišije mijeloma ćelije) i fuzione procedure su takođe poznate.
[0145] Da bi se generisala potpuno humana monoklonalna antitela na CD38 transgeni ili transhromozomalni miševi koji sadrže humane gene za immunoglobuline (na primer HCo12, HCo7 ili KM miševi) mogu se imunizovati sa obogaćenim preparatom CD38 antigena i/ili ćelijama koje eksprimiraju CD38, kao što je opisano od strane by Lonberg et al., (1994), supra, Fishwild et al., (1996), supra, i WO 98/24884. Lternativno, miševi se mogu imunizovati sa DNK koja kodira humani CD38. Miševi mogu biti 6-16 nedelja starosti nakon prve infuzije. Na primer, obogaćena preparacija (5-50 mg) CD38 antigena mođe se koristiti za imunizaciju HuMAb miševa intraperitonealno. U slučaju da imunizacija u kojoj se koristi prečišćena ili obogaćena preparacija CD38 antigena ne rezultira u antitelima, miševi mogu takođe biti imunizovani sa ćelijama koje eksprimiraju CD38, na primer sa ćelijskim linijama, kako bi se promovisali imuni odgovori.
[0146] Kumulatovno iskustvo sa različitim antigenima je pokazala da HuMab transgeni miševi najbolje odgovaraju kada se inicijalno imunizuju intraperitonealno (i.p.) ili subkutanozno (s.c.) sa CD38 eksprimirajućim ćelijamau kompeltnom Frojndovom adjuvantu, nakon čega sledi svake nedelje i.p. imunizacije (do totalno 10) sa CD38 eksprimirajućim ćelijama u PBS. Imuni odgovor se moše nadgledati tokom perioda imunizacionog protokola sa uzorcima plazme koji su dobijeni retroorbitalnim iskrvavljenjima. Plazma se može skrinovati FACS analziom i miševi sa dovoljnim titrima anti-CD38 humanim imunoglobulinima mogu se koristiti za fuzije. Miževi mogu biti bustovani intravenozno sa CD38 eksprimirajućim ćelijama naprimer 4 i 3 dana pre žrtvovanja i ulanjanja slezine.
[0147] Za generisanje hibridoma koje prozivode humana monoklonalna antitela na humani CD38, ćelije slezine i ćelije limfnih čvorova iz imunizovanih miševa mogu se izolovati i fuzionisati sa odgovarajućom besmrtnom ćelijskom linijom, kao što je mišija ćelijska linija mijeloma. Rezultujiće hibridome mogu se skrinovati za proizvodnju antigen specifičnih antitela. Na primer, suspenzija jene ćelije limfocita slezine iz imunizovanih miševa može se fuzionisati sa SP2/0 neskeretujućim mišijim ćelijama mijelome (ATCC, CRL 1581) sa 50% PEG (w/v). Ćelije se mogu zasejati probližno 1 x 105 po bunarčiću u mikrotitar ploči sa ravnim dnom, nako čega sledi dvonedeljno inkubiranje u selektivnom medijumu koji pored uobičajenih reagenasa sadrži 10% fetalni serum za kloniranje, 5-10% “origen” hybridoma faktor za kloniranje (IGEN) i 1X HAT (Sigma). Nakon otprilike dve nedelje ćelije se mogu gajiti u medijumu u kome je HAT zamenjen sa HT. Individualni bunarčići se mogu skrinovati ELISA testom na humana anrtitela koja sadrže kappa-laki lanac i putem FACS analize uoptrebom CD38 ekspresionih ćelija za CD38 speccifičnost. Kada se postigne ekstenzivan rast hibridoma, medijum se može gledati najčešće nakon 10-14 dana. Hibridome koje sekretuju antitela mogu se presejavati, ponovo pregledavati, i ukoliko su i dalje pozitivne za humani IgG, anti-CD38 monoklonalna antitela se mogu subklonirati najmanje dva puta limitiraućim dilucijama. Stabilni subklonovi mogu se zatim gajiti in vitro kako bi se generisalo antitelo u medijumu za gajenje tkiva za dalju karakterizaciju.
[0148] Humana antitela iz ovog pronalaska mogu se takođe proizvesti u domaćinskim ćelijama transfektoma upotrebom an primer kombinacije tehnika rekombinantne DNK i mateoda transfekcije gena kao što je poznato u nauci, videti na primer, Morrison, S., Science 229, 1202 (1985).
[0149] Na primer da se ekprimiraju antitela ili njihovi fragmenti antitela, DNK koje kodiraju delimično ili kompletnu dužinu lakog i teškog lanca, mogu se dobiti standardnim tehnikama molekularne biologije (na primer PCR amplifikacijom, mutagenezom usmerenom na mesto) i mogu se ubaciti u ekspresione vektore tako da su geni operativno vezani za transkripcionie i translacone kontrolne sekvence. U ovom kontekstu “operativno povezane” znači da je gen za antitelo vezan (ligiran) u vektor tako da transkripcione i translacione kontrolne sekvence u okviru vektora služe svojoj namenjenoj funkciji regulacije transkripcije i translacije gena za antitelo. Ekspresioni vector i ekspresion ekontrolne skevence su odabrane da budu kompatibilne sa ekpresionim domaćinskim ćelijama koje se koriste. Gen za laki lanac antitela i gena za teški lanac antitela mogu biti ubačeni u odvojene vektore ili, što je i tipično, oba gena su insertovana (ubačena) u ekspresioni vektor standardnim metodama (na primer ligacijom komplementarnih restrikcionih mesta na fragmentima gena za antitelo i vektora, ili “blunt end” (ravni krajevi) ligacijom ako nema restrikcionih mesta). Varijabilni regioni lakog i teškog lanca antitela koji su ovde opisani mogu se koristiti za kreiranje gena za antitelo kompletne dužine za bilo koji izotip putem ubacivanja istih u ekpresione vektore koji već kodiraju konstantne regione lakog lanca i teškog lanca opisanog izotipa tako da je VHsegment operativno vezan za CH segment(e) u okviru vektora i VLsegment je operativno vezan za CL segment u okviru vektora. Dodatno ili alternativno, rekombinantni ekrpesioni vektor može da kodira signalni peptid koji olakšava sekreciju lanca antitela iz domaćinske ćelije. Gen za lanac antitela mođe biti kloniran u vector tako da je signalni peptid povezan “in-frame” (u okviru) sa amino terminusom gena za lanac antitela. Signalni peptid moće biti imunoglobulinski signalni peptid ili heterologni signalni peptid (na rpmer., signalni peptid od neimunoglobulinskog proteina).
[0150] Dodatno pored gena za lance antitela, rekombinantni ekspresioni vektori nose regulatorne sekvence koje omogućavaju i kontrolu ekspresije gena za lance antitela u domaćinskoj ćeliji. Dalje, rekombinatni ekspresioni vektori mogu nositi dodatne sekvence kao što su sekvence za regulaciju replikacije vektora u domaćinskoj ćeliji (na primer oridžin replikacije) i pogodne selektivne marker gene. Selektivni marker geni olakšavaju selekciju domaćinskih ćelija u koje je vektor ubačen (videti na primer US 4,399,216, US 4,634,665 and US 5,179,017). Na primer, tipični selektivni margker gen obezbeđuje rezistenciju na lekove, kao na G418, higromicin ili metotreksat, u domaćinskoj ćeliji u koju je vector ubačen. Primeri selektivnih marker gena uključuju gene za dihidofolat reduktazu (DHFR) (za upotrebu u dhfr-domaćinskim ćelijama sa selekcijom metatreksat/umnožavanje) i neo region (za G418 selekciju).
[0151] Za ekpresiju lahik i tepkih lanaca, ekspresioni vector(i) koji kodiraju teške i lake lance se transfektuju u domaćinsku ćeliju standardnim tehnikama. Domaćisnke ćelije mogu biti prokariotkse ili eukariotske, kao sisarske domaćinske ćelije. Na primer anigen vezujući fragmenti eksprimirani u prokariotskim ćelijama i antitela cele dućine mogu se eksprimirati u eukariotksim domaćinskim ćelijama.
[0152] U jednomostvarenju antitela se ekprimiraju u eukariotskim ćelijama, kao sisarskim domaćinskim ćelijama. Primeri sisarskih domaćinskih ćelija za ekspresiju rekombinantnih antitela iz ovog pronalaska uključuju CHO ćelije (uključujući dhfr-CHO ćelije, opisane od strane Urlaub and Chasin, PNAS USA 77, 4216-4220 (1980), korišćene sa DHFR selektivnim markeorm, na primer opisano u R. J. Kaufman and P. A. Sharp, Mol. Biol.
159, 601-621 (1982)), NS/0 mijeloma ćelije, COS ćelije, HEK293 ćelije i SP2.0 ćelije. Posebno za upotrebu NS/0 mijeloma ćelija drugi primer ekspresionog sistema je GS (glutamin sintetaza) system za ekspresiju gena otkriven u WO87/04462, WO89/01036 i EP338.
[0153] Geni antitela mogu biti eksprimirani u drugim ekspresionim sistemina uključujući prokariotske ćelije, kao što su mikroorganizmi, na primer E. coli za proizvodnju scFv antitela, alge kao i ćelije insekata. Dalje, antitela se mogu proizvesti u transgeni nehumanim životinjama kao u mleku ovce i zečeva ili jajima iz kokošaka ili drugim transgenim biljkama. Videti na primer Verma, R. et al., J.Immunol.Meth. 216, 165-181 (1998), Pollock et al., J.Immunol.Meth. 231, 147-157 (1999) i Fischer, R. et al., Biol.Chem.
380, 825-839 (1999).
Bispecifična i multispecifična antitela
[0154] U jednom ostvarenju antitelo koje se koristi može biti deritavizovano ili povezano za drugi funkcionlani molekul, na primer drugi peptid ili protein (kao Fab’ fragment) kako bi se generisao bispecifičan ili multispecifičan molekul koji se vezuje za više mesta za vezivanja ili ciljane epitope. NA primer, antitelo koje se koristi u ovom pronalsaku može biti funkcionalno povezano (na primer, hemijskim kuplovanjem, genetskom fuzijom, nekovalenstnom asocijacijom ili na drugi način) za jedan ili više vezujućih molekula, kao što je antitelo, peptid ili vezujući mimetik.
[0155] U skladu sa tim, antitelo može biti bispecifični ili multispecifični molekuli koji obuhavta najmanje jednuprvu specifičnost vezivanja za CD38 i drugu specifičnost vezivanja za sekundarni target epitop. U jednom ostvarenju ovog pronalaska drugi target epitope je Fc receptor, na primer humani FcyRI (CD64) ili humani Fcα receptor (CD89), ili T ćelijski receptor na primer CD3. U jednom ostvarenju, bispecifični ili multispecifični molekuli mogu biti sposobni da se vezuju za oba FcyR, FcαR or FcεR ekspersione efektorne ćelije (na primer monocyte, makrofage ili polimorfne nuklearne ćelije (PMNs)), i da targetiraju ćelije koje eksprimiraju CD38. Bispecifični i multispecifični molekuli targetuju CD38 eksprimirajuće ćelije na efektor ćelije i trigeruju Fc receptor-posredovane aktivnosti efektornih ćelija, kao što je fagocitoza CD38 eksprimirajućih ćelija, ćelijska citottoksičnost koja je zavisna od antitela (ADCC), oslobađanje citokina, ili generisanje superoksid anjona.
[0156] U jednom ostvarenju, bispecifične i multispecifični molekuli obuhvataju specifičnost vezivanja za makar još jedno antitelo, uključujući na primer, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, ili scFv. Dalje antitelo moće biti dimer lakog lanca i liteškog lanca, ili njihovi minimalni fragmenti kao Fv ili konstrukti pojedinačnog lanca kao što je opisano u Ladner et al., u US 4,946,778. Antitelo može biti vezujući domen imunoglobulinskog fuzionog proteina kao što jeotkriveno u US 2003/0118592 i US 2003/0133939.
[0157] U jednom ostvarenju, specifinost vezivanja za Fc receptor je obezbeđena od strane humanog antitela, vezivanje koje nije blokirano od strane humanog imunoglobulina G (IgG). Kao što se ovde koristi, izraz “igG receptor” se odnosi na bilo koji od osam gena za γ-lanac koji se nalaze na hromozomu 1. Ovi geni kodiraju ukupno dvanaest transmembranskih ili solubilnih receprorskih izoformi koje su grupisane u tri Fc* receptorske klase: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), i FcγRIII (CD16). U jednom ostvarenju Fcγ receptor je humani visokoafinitativni FcγRI. Proizvodnja i karakterizacija ovih monoklonalnih antitela su opisne u Fanger et al., in WO 88/00052 and in US 4,954,617. Ova antitela se vezuju za epitope na FcyRI, FcγRII or FcγRIII na mestuoje je različito od Fcγ vezujućeg mesta receptora i tako njihovo vezivanje nije značajno blokirano fiziološkim nivoima IgG. Specifična anti-FcyRI natitela korisna za ovsaj pronalazak su mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 i mAb 197. U drugim ostvarenjima anti-Fcy receptor antitela je humanizovana forma mAb 22 (H22). Proizvodnja i karakterizacija H22 antitela je opisana u Graziano, R.F. et al., J. Immunol.155(10), 4996-5002 (1995) and WO 94/10332. Ćelijske linije koje proizvode H22 antitelo su deponovane u American Type Culture Collection 4. novembra, 1992 pod dezignacijom HA022CL1 i imaju broj pristupa tj “accession No.” CRL 11177.
[0158] U jednom ostvarenju specifičnost vezivanja za Fc receptor se obezbeđuje od strane antitela koje se vezuje za humani IgA receptor, na primer, Fcα receptor (FcαI (CD89)), vezivanje u kome u jednom ostvarenju nije blokirano od strane humanog imunoglobulina A (IgA). Izraz “IgA” označava da uključuje genski product od jednog αgena (FcαRI) lociranog na hromozomu 19. Ovaj gen je poznat po tome da kodira nekoliko alternativno splajsovanih transmemebranskih izoformi od 55 do 110 kDa. FcαRI (CD89) je konstitutivno eksprimiran u monocitima/makrofagima, eozinofilnim i neutrofilnim granulocitima, ali ne u ne-efektornim ćelijskim populacijama. FcαRI ima srednji afinitet za oba i IgA1 i IgA2 koji se povećava nakon izlaganja citokinima kao što su G-CSF ili GM-CSF (Morton, H.C. et al., Critical Reviews in Immunology 16, 423-440 (1996)). Opisana su četiri FcαRI-specifićna monoklonalna antitela identifikovana kao A3, A59, A62 i A77 koji vezuju FcαRI van IgA domena za vezivanje liganda su (Monteiro, R.C. et al., J. Immunol.
148, 1764 (1992)).
[0159] FcαRI, FcγRI, FcγRII and FcγRIII, posebno FcγRII i FcγRIII, su primeri triger receptora za upotrebu u ovom pronalasku jer oni (1) se eksprimiraju primarno na imunskim efektrnim ćelijama na primer monocitima, PMN-ovima, makrofagima i dendritičnim ćelijama; (2) eksprimiraju se u visokim nivoima (na primer 5,000-100,000 po ćeliji); (3) su medijatori citotoksičnih aktivnosti (na primer, ADCC, fagocitoza); i (4) posreduju pojačanoj antigenoj prezentaciji antigena uključujući samo-antiegne koji su targetovani na njih.
[0160] Primeri bisoecifičnih antitela obuhvataju (i) dva antitela gde jedno ima specifičnost za CD38 a drugo specifičnost za drugi target i koji su zajedno konjugovani, (ii) pojedinačno antitelo koje ima jedan lanac specifičan za CD38 i drugi lanac specifićan za drugi molekul, i (iii) antitelo sa jednim lancem antitela koji je specifičan za CD38 i za drugi molekul. Tipično drugi target/grugi molekul je drugi molekul u odnosu na CD38. U jednom ostvarenju drugi molekul je kancerski antigen/antigen povezan sa tumorom kao što je karcionoembrionski antigen (CEA), antigen specifičan za prostatu (PSA), RAGE (bubrežni antigen), α-fetoprotein, CAMEL (CTL-prepoznajući antigen na melanomi), CT antigeni (kao MAGE- B5, -B6, -C2, -C3, i D; Mage-12; CT10; NY-ESO-1, SSX-2, GAGE, BAGE, MAGE, i SAGE), mucin antigeni (na primer, MUC1, mucin-CA125, itd.,) gangliozidovani antigeni, tirozinaza, gp75, C-myc, Mart1, MelanA, MUM-1, MUM-2, MUM-3, HLA-B7, i Ep-CAM. U jednom ostvarenju, drugi molekul je integrin povezan sa kencerom, kao α5β3 integrin. U jednom ostvarenju drugi molekul je angiogeni faktor ili drugi sa kancerom povezan hormone rasta, kao vaskularni endotelijalni hormone rasta (vegf9, hormone rasta fibroblasta (FGH), epidermalni hormone rasta (EGF), receptor epidermalnog hormona rasta (EGFR), angiogenin, i njihovi receptori, posebno receptori koji su povezani sa progresijom raka (na primer jedan od HER1-HER4 receptora). Drugi protein povezani sa progresijom kancera su ovde diskutovani i mogu takođe biti pogodni za drugi molekul. U jednom ostvarenju drugi molekul jr molrkul eksprimiran na površini ćelija multiple mijelome kao na primer CD138.
[0161] U jednom ostvarenju, bispecifično antitelo je dimerno telo (diabody).
[0162] Bispecifična i multispecifična antitela mogu se napraviti pimenom hemijskih tehnika (videti na primer D. M. Kranz et al., PNAS USA 78,5807 (1981)), “polydoma” tehnikama (videti US 4,474,893) ili tenikama rekombinantne DNK.
Konjugati
[0163] U jednom ostvarenju, CD38 antitelo je konjugovano sa terapeustkim ostatkom, kao citotoksinom, hemoterapeutskim lekom, imunosupresantom, ili radioizotopom. Ovakvi konjugati se označavaju kao “imunokonjugati”. Imunokonjugati koji uključuju jedan ili više citotoksina su označeni ka “imuno-toksini”.
[0164] Citotoksin ili citotoksični agens koji je štetan za (na primer ubija) ćelije. Za opis ovih klasa lekova koji su poznati u nauci, i njihove mehanizme delovanja videti Goodman et al., Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis Of Therapeutics, 8th Ed., Macmillan Publishing Co., 1990. Dodatne tehnike za pripremu imunotoksina antitela su obezbeđene u na primer Vitetta, Immunol. Today 14, 252 (1993) i US 5,194,594.
[0165] Pogodni terapeutski agensi za formiranje imunokonjugata uključiju taksol, citohalasin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, colhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukocortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, i puromicin, antimetabolite (kao metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, fludarabin, 5-fluorouracil, dekarbazin, hydroksiureu, asparaginazu, gemcitabin, kladribine), alkilirajuće agense (kao mehloretamin, thioep, clorambucil, melfalan, karmustine (BSNU), lomustin (CCNU), ciklfosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, dakarbazin (DTIC), prokarbazin, mitomicin C, cisplatinu i druge derivate platine, kao karboplatinu), antibiotike (kao daktinomicin (raniji naziv aktinomicin), bleomicin, daunorubicin (raniji naziv daunomicin), doksorubicin, idarubicin, mitramicin, kalihemicin, mitomicin, mitoksantron, plikamicin, antramicin (AMC)), toksin difterije i srodne molekule (kao lanac A difterije i njegove aktivne fragmente ili hibridne molekule), ricin toksin (kao ricin A ili deglikozilovan ricin A lanac toksin), kolera toksin, Šiga-slični toksin (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), LT toksin, C3 toksin, Šiga toksin, pertussis toksin, tetanus toksin, Bowman-Birk proteazni inhibitor soje, Pseudomonas egzotoksin, alorin, saporin, modecin, gelanin, abrin A lanac, modecin A lanac, alfa-sarcin, Aleurites fordii proteine, diantin proteine, Phytolacca americana proteine (PAPI, PAPII, i PAP-S), momordica charantia inhibitor, kurcin, krotin, sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, i enomicin toksini. Terapeutski agensi, koji se mogu administrirati u kombinaciji sa antitelom kao što je opisano bilo gde ovde, mogu takođe biti kandidati za terapeutske ostatke korisne za konjugaciju sa antitelom koje se koristi u ovom pronalsku. Na primer, ostci leka mogu biti protein ili polipeptid koji poseduju želejnu biološku aktivnost. Ovakvi protein mogu uključiti naprimer, anzimatski aktivni toksin, ili njegov aktivni fragment, kao abrin, ricin A, pseudomonas egzotoksin, ili toksin difterije; protein kao faktire nekroze tumora ili interferon-γ; ili modifikatire biološkog odgovora, kao na primer, limfokin, interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), interleukin-6 (IL-6), makrofagni granulocitni faktor stimulacije kolonija (MG-CSF), granulocitni faktor stimulacije kolonija G-CSF, ili druge faktore rasta i protein induktore apoptoze izolovane iz mithondrija.
[0166] Konjugati antitela, i takvi cititoksični ostataci mogu se napraviti upotrebom različitih agensima za kuplovanje bifunksionalnih proteina. Primeri ovakvih reagenasa uključuju SPDP, IT, bifunkcionalne derivate imidoestara kao dimetil adipimidat HCl, aktivne ester kao disukcinimidil suberat, aldehide kao glutaraldehid, bis-azido jedinjenja kao bis (p-azidobenzoil) heksanediamin, derivate bis-diazoniuma kao bis-(pdiazoniumbenzoil)-etilenedi- amin, diizocijanate kao tolilen 2,6-diizocijanat, and bisaktivn fluor jedinjenja kao 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen anti-mitotičke agense (na primer vinkristin, vinblastin, docetaksel, paklitaksel i vinorelbin).
[0167] U jednom ostvarenju anti-CD38 antitelo je konjugovano sa imunomodulatorom, kao na primer imunomodulatorskim citokinom, hormonom rasta stem ćelija, limfotoksinom (kao TNF kao TNF TNFα) ili hematopoetski faktor. Primeri ovakvih molekula koji mogu biti korisni kao konjugati uključuju IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, i IL-21, faktor stimulacije kolonija (kao granulocitni faktor stimulacije kolonija G-CSF) i glranulocirni makrofagni faktor stimulacije kolonija (GM-CSF), interferone (kao IFN α, IFN β, and IFN γ), hrmon rasta stem ćelija označen kao "S1 faktor," eritropoetin, i trombopoetin, njihove aktivne fragmente, njihove derivate, njihove varijante, ili njihove bilo kakve kombinacije.
[0168] Tehnike za konjugaciju ovakvih terapeutskih ostataka (moiety) za antitela su poznata videt na primer, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al., (eds.), pp.243-56 (Alan R. Liss, Inc.1985), Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al., (eds.), pp.623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987), Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., (eds.), pp. 475-506 (1985), "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al., (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985) and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toksin Conjugates", Immunol. Rev.62, 119-58 (1982).
[0169] Dodatno korisni substituenti konjugata uključuju anti-kaner retionide. Taksan konjugat (videti naprimer Jaime et al., Anticancer Res.21(2A), 1119-28 (2001), konjugati cisplatine, konjugati tapsigargina, konjugati linoleumske kiseline, konjugati kalihemicina, (videti na prmer Damle et al., Curr Opin Pharmacol. 3(4), 386-90 (2003), konjugati doksorubicina konjugati geldanamicina, i slični, takođe mogu biti korisni za promovisanje tretmana kancera (videti generalno Trail et al., Cancer Immunol Immunother.52(5), 328-37 (2003)).
Formulacija i način administracije
[0170] Agensi koji se koriste u ovom pronalsaku mogu biti formulisani kao farmaceutske kompozicije sa farmaceutski prihvatljivim nosačima ili diluentima kao i bilo koji poznati adjuvant ili ekscipijenti u skladu sa konvencionalnim tehnika kao što su one otkrivene u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995.
[0171] Farmaceutski prihvatljivi nosači ili diluenti kao i bilo koji poznati adjuvanti il ekscipijenti bi trebalo da su pogodni za odabrano jedinjenje koje koristi ovaj pronalazak i odabran način administracije. Pogodnost za nosače i druge komponente farmaceutskih kompozicija je determinisana na osnovu nedostatka značajno negativnog uticaja na željena biološka svojstva odabranog jedninjenja ili farmaceutske kompozicije (na primer manje od suštinskog uticaja 10% ili manje relativne inhibicije, 5% ili manje relativne inhibicije itd)) na vezivanje antigena.
[0172] Farmaceutska kompozicija iz ovog pronalaska može takođe da uključi diluente, filere, soli, pufere, deterdžente (na primer nejonske deterdžente kao Tween-80), stabilizatore, (na rpimer šećere ili amino kompozicije bez proteina).
[0173] Stvarno nivoi doza aktivnih sastojaka u farmaceutskim mompozicijama mogu varirati tako da se postigne količina antivnog sastojka koje je efektivna u dostizanju željenog terapeutskog odgovora u određenom pacijentu, kompoziciji, i načinu administracije a da pri tome nije toskična za pacijenta. Selektovani nivoi doze će zavisiti od različitih farmakokinetičkih faktora uključujući aktivnost određene kompozicije koja se primenjuje, ili njegovog estra ili amida, rutu administracije, brzina ekskrecije određenog jedinjenja koje se primenjuje, dužinu tretmana, druge lekove, jedinajnje i/ili materijale koji se koriste u kombinaciji sa određenim jedinjenjem koje se primenjuje, starost, pol, težina, stanje, generalno zdravlje i prethodnu medicinsku istoriju pacijenta koji se tretira, i slične faktore dobro poznate u medicini.
[0174] Farmaceutska kompozicija može se administrirati bilo kojim pogodnim putem ili načinom. Pogodni putevi administracije jedinjenja iz ovog pronalaska in vivo i in vitro su dobro poznati u nauci i mogu biti selektovani od strane stručnjaka u nauci.
[0175] Jedinjenja koja se koriste u ovom pronalasku mogu se administrirati preko bilo kog pogodnog puta, kao štp je oralni, nazalni, inhalatorni, topikalni (uključujući bukalnim transdermalni i sublingvalni) rektalni, vaginalni i/ili parenteralni put.
[0176] U jednom ostvarenju, jedno ili više jedninjenja koja se koriste u ovom pronalasku se dostavljaju oralno, na primer sa inertnim diluentom ili sa nosačem koji se asimiluje i moše da se jede, Akrtivni sastojak može biti zatvoren u čvrstoj ili mekoj gel kapsui, komrimovan u tablete, ili inkorporisan direktono u ishranu subjekta. Farmaceutske kompozicije koje su pogodne za oralnu administraciju uključuju tablete, bukalne tablete, “troche” (podjezične lozenge), kapsule, eliksire, suspenzije, sirupe, “wafers” koje se jedu i slične koje sadrže ovakve nosače poznati kao prikladni su u nauci. Kako bi se dozvilila oralna administracija može biti potrebno da se jedninjenje obloži sa, ili koadministrira sa meterijalom kako bi se sprečila njegova inaktivacija.
[0177] U jednom ostvarenju, jedno ili više jedninjenja koja se koriste u ovom pronalasku su administrirana parenteralno.
[0178] Izrazi “parenteralna administracija” i “parenteralno administrirano” kao što se ovde koristi označava načine administracije koji nisu enteralni i topikalni načini administracije, nnajčešće putem injektiranja, epidermalnu, intravenoznu, intramuskularnu, intraarterijalnu, intratekalnu, intrackapsularnu, intraorbitalnu, intracardialnu, intradermalnu, intraperitonealnu, intratendinouznu, transtrahealnu, subkutanoznu, subkutikularnu, intraarticularnu, subkapsularnu, subarachnoidnu, intraspinalnu, intrakranijalnu, intrato- raklnu, epiduralnu i intrastemalnu injekciju i infuziju.
[0179] U jednom ostvarenju, jedinjenje se daministrira intravenzonim ili subkutanoznim injektiranjem ili infuzijom.
[0180] U jednom ostvarenju, jedninjenja koja se koriste u ovom pronalasku se dostavljaju u kristalnoj formi putem subkutanozne injekcijecf. Yang et al., PNAS USA 100(12), 6934-6939 (2003).
[0181] Farmaceutske kompozicije koje se koriste u ovom pronalasku mogu biti formulisane za određene puteve administracije, kao što je oralni, nazalni, topikalni (uključujući bukalni transdermalni i sublingvalni) rektalni, vaginalni i/ili parenteralni put administracije. Farmacautske kompozicije mogu zgodno da se prezentuju u formama jediničnih doza i mogu se pripremiti bilo kjom metodom poznatom u nauci u oblasti farmacije. Količina aktivnog jedinjenja koje se može kombinovati sa materijalom nosača kako bi se proizvela forma pojedinačne doze variraće u zavisnosti od subjekta koji će se tretirati i od načina administriranja. Količina aktivnog sastojka koji semože kombinovati sa materijalom nosačem kako bi se đ proizvela forma pojedinačne doze generalno će biti količina komopozicije koja proizvodi terapeutski efekat. Generalno, od sto posto, ova količina će varirati u opsegu od oko 0.01% do oko 99% aktivnog sastojka, kao od oko 0.1% do oko 70%, kao na primer od oko 1% do oko 30%.
[0182] Bez obzira na put administracije koji je odabran, jedinjenja koja se koriste u ovom pronalasku i koja se mogu koristiti u formi farmaceutski prihvatljive soli ili pogodne hidratisane forme, i/ili farmaceutske kompozicije su formulisane i farmaceutski prihvatljive forme doza konvencionalnim metodama poznatimu u nauci. “Farmaceutski prihvatljiva so” se odnosi na so koja zadržava željenu biološku aktivnost proditeljskog jedinjenja i ne izaziva nikakav neželjeni toksikološki efekat (videti na primer Berge, S.M. et al., J. Pharm. Sci. 66, 1-19 (1977)). Primeri ovakvih soli uključuju soli sa dodatkom kiseline i soli sa dodatkom baze. Soli sa dodatkom kiseline uključuju one dobijene iz netoksičnih neorganskih kiselina kao što je hidrohlorna, azotna, fosforna, sumporna, hidrobromna, hidrojodna, fosforna kiselina i slično kao i netoksične organske kiseline kao alifatične mono i dikarboksilne kiseline, fenil -substituisane alkanoične kisleine, hidroksi alkanoične kisleine, aromatične kiseline, alifatične i aromatične sulfonnske kielisne i slične. Soli sa dodatkom baze uključuju one dobijene iz alkalnih zemljšnih matala, kao natrijum, kalijum, magneziju, kalcijum i slično, kao i netoksični organski amini, kao N,N’-dibenzilethilendiamin, N-methilglukamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, ethilenediamin, prokain i slično.
[0183] Farmaceutski prihvaltljivi nosači uključuju bilo koji od odgivarajućih rastvarača, medijuma za disperziju, omotača, antibakterijskih i antifungalnih agenasa, izotoničnih agenasa, antioksidanata, i agenasa za odlaganje absorbcije, i slične koji su fiziološki kompatibilnisa jedinjenjem iz ovog pronalaska.
[0184] Primeri odgovarajućih vodenih i ne-vodenih nosača koji se mogu primeniti u farmaceutskim kompozicijama uključuju vodu, fiziološki rastvor, fiziološki rastvor puferisan fosfatom, etanol, dekstrozu, poliole (kao glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slične) i njihove odgvarajuće mešavine, biljna ulja, kao maslinovo ulje, “com” ulje, kikiruki ulje, ulje semena pamuka, i sezamovo ulje, koloidalne rastvore karboksimetil celuloze, tragakant gum i injektabilni organski estri, kao etil oleat i/ili različiti puferi. Drugi nosači su dobor poznati u nauci u oblasti farmacije.
[0185] Framaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne pudere za za ekstepora preparacije sterilnih injektibilnih rastvora ili dizperzije. Upotreba ovakvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je poznata u nauci. Osim u krajnjim granicama kada je bilo koji konvencionalni medijum ili agens nekompatibilan sa aktivnim jedinjenjem njihova upotreba u farmaceutskim kompozicijama se razmatra i kontemlira.
[0186] Odgovarajuća flusdinost se može odrđati na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao lecitina, održavanjem odgovarajuće veličine partikule u slučaju disperzije, i upotrebom surfaktanata.
[0187] Farmaceutske kompozicije obuhvataju agense koji se koriste u ovom pronalsaku i mogu takođe obuhvatati farmaceutski prihvatljive antioksidanse na primer: (1) antioksidanes rastvorljive u vodi, kao aksorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum matabisulfat, natrijum sulfit i slične; (2) antioksidanes rastorljive u ulju kao askorbil palmitat, butilovan hidroksianizol (BHA), butilovan hidroksitoluen (BHT), lecitin, propiil galat, alfa-tokoferol, i slične; i (3) m e ta l he l i ra j uć e a ge ns e ka o limunska kiselina, ethilenediamin tetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, tartarna kiselina, fosforna kiselina i slične.
[0188] Farmaceutske kompozicije mogu takođe obuhvatati izotonične agense kao šećere, polialkohole kao manitol, sorbitol, glicerol ili natrijum hlorid u kompozicijama.
[0189] Farmaceutski prihvatljivi diluenti (rastvarači) uključuju fiziološki rastvor i vodene puferske rastvore.
[0190] Farmaceutske kompozicije koje seoriste u ovom pronalasku mogu takođe sadržati jedan ili više adjuvanata koji su odabrani za određenu rutu (put) administracije kao što su prezervativi (konzervansi), ovlaživači, smulzifikujući agensi, agensi za disperziju, prezervatili ili puferi koji mogu pojačati rok trajanja ili efektivnost farmaceutske kompozicije. Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu na primer biti pomešani zajedno sa laktozom, magnezijum stearatom, magnezijum oksidom, solima natrijuma i kalcijuma ili sa fofornom ili sumpornom kiselinom, akacijom, žalatinom, natrijum alginatom, polivinilpirolidinom, i/ili polivinil alkoholoma. Drugi primeri adjuvanata su QS21, GM-CSF, SRL-172, histamin dihidroclorid, thimokartin, Tio-TEPA, monofosforil-lipid A/micobacteria kompozicije, alum, nekompletan Frojndov adjuvant, montanid ISA, ribi adjuvant sistem, TiterMax adjuvant, sinteks adjuvant formulacije, imuno-stimulišućig compleksi (ISCOMs), gerbu adjuvant, CpG oligodeoksinukleotidi, lipopolisaharidi, i poliinosinična:policitidična kiselina.
[0191] Prevencija prisustva mikroorganizama može se obezbediti putem i procedura sterilizacije i inkluzije različitih antibakterijskih i antifungalnih agenasa, na primer, parabena, hlorbutanola, fenola, sorbične kiseline i slično. Dodatno, produžena absorbcija injektabilne farmaceutske forme može se realizovati inkluzijom agenasa koji odlažu absorbciju, kao aliminijum monostearat i želatin.
[0192] Farmaceutske kompozicije koje obuhvataju jedinjenje za upotrebu u ovom pronalsaku mogu takođe uključiti njihovu pogodnu so. Bilo koja pogodna so, kao so alkalnog zemljipnog metala i bilo kojoj porgodnoj formi (na primer puferisana so), mogu se koristiti u stabilizaciji jedinjenja koje se koristi u ovom pronalsaku. Pogodne soli tipično uključuju natrijum hlorid, natrijum sukcinat, natrijum sulfat, kalijum hlorid, magnezijum hlorid, magnezijum sulfat, i kalcijum hlorid. U jednom ostvarenju, aluminijumova so se koristi za stabilizaciju jedinjenja koje se koristi u ovom pronalasku u farmaceutskoj kompoziciji, pri čemu aluminijumova so može takođe poslužiti kao adjuvant kada se takva kompozicija administrira pacijentu.
[0193] Jedninjenja koja se koriste u ovom pronalsaku mogu se pripremiti sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje protiv brzog otpuštanja, kao formulacija za kontrolisa no oslobađanje, uključujući implante, transdermalne flastere, i mikrooinkapsulirane sisteme dostave. Ovakvi nosači mogu uključiti želatin, gliceril monostearat, gliceril distearat, biodegradabilne, biokompatibilne polimere kao etilen vinil acetat, polianhidride, poliglikoličnu kiselinu, kolagen, poliortoestre, i poli mlečnu kiselinu samu ili sa voskom, ili drugim materijalima koji su poznati u nauci. Videti na primer, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
[0194] Da bi se kompozicije sdministrirale odrešenim rutama tj putevima, mođe ibti potrebno da se jedinjenje obloži sa, ili ko-administrira jedninjenje sa, materijalom da se spreči njegova aktivacija. Na primer, jedinjenje koje se koristi u metodi iz pronalaska može se administrirati subjektu na odgovarajućem nosaču, na primer, lipozomima, ili diluentu. Lipozomi uključuju voda-u-ulju-u-vodi CGF emulzije kao i konvencionalne lipozome (Strejan et al., J. Neuroimmunol.7, 27 (1984)).
[0195] U zavisnosti od puta administracije, aktovno jedinjenje može biti obloženo u material kako bi se jeidnjenje zaštitilo id delovanja kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu ianktivirati jedinjenje. Na primer, jedinjenje može da se adinistrira subjektu na odogvarajućem nosaču, na primer, lipozomima. Lipozomi uključuju voda-u-uljuu-vodi CGF emulzije kao i konvencionalne lipozome (Strejan et al., J. Neuroimmunol.
7, 27 (1984)).
[0196] U jednom ostvarenju ovog pronalska jedinjenja za upotrebu u ovom pronalsku mogu biti formulisana u lipozomima. U daljem ostvarenju lipozomi uključuju cilnji ostatak. U dalje ostvarenju, jedinjenja u lipozomima se dostavljaju bolus injekcijom na mesto proksimalno želejnoj povrpini, na primer, mesto inflamacije ili infekcije, ili mesto tumora. Kompozicija mora biti fluidna do granice da pottoji lakko dvanje preko šprica i igle. Mora biti stabilno u uslovima proizvodnje i čuvanja i mora biti prezervirano od kontaminacija poreklom od mikroorganizama kao što su bakterije i gljive.
[0197] U jednom ostvarenju jedinjenja koja se koriste u pvom peronalasku se mogu formulisati kako bi se sprečio ili redukovao transport kroz placenta. Ovo se može izvesti metodama poznatim u nauci, na primer., PEGilacijom jedinjenja ili upotrebom F(ab’)2fragmenata. Dalje reference se mogu videti u Cunningham-Rundles C et al., J Immunol Methods. 152, 177-190 (1992) and to Landor M., Ann Allergy Asthma Immunol 74, 279-283 (1995).
[0198] Farmaceutski prihvatljivi nosači za parenteralnu administraciju uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne pudere za iznenadnu (extemporaneous) pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Upotreba ovakvim medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne substance poznata je u nauci. Osim do nivoa do kog konvencionalni medijum ili agens je nekompatibilan sa aktivnom substancom, njihova upotreba u farmaceutskim kompozicijama je konteplirana. Dodatna aktivna jedinjenja mogu takođe biti ugrađana u kompozicije.
[0199] Farmaceutske kompozicije za injektiranje mogu tipično biti sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skaldištenja, Kompozicija može biti formulisana kao rastvor, mikroemulzija, lipozom, ili druga uređena struktura pogodna za visoke koncentracije leka. Nosač može biti vodeni ili ne-vodeni rastvor ili medijum za disperziju koji sadrži na primer vodu, etanol, poliole (kao poliole (kao glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slične) i njihove odgvarajuće mešavine, biljna ulja, kao maslinovo ulje, i injektabilne organske ester kao etil oleat. Odgovarajuća fluidnost može da se održi na primer, upotrebom omotača kao što je lecithin zadržavanjem odrešene veličine partikule koja se zahteva, u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima biće poželjno da se uključe izotonični agensi, na primer šećeri, polialkoholi kao manitol, sorbitol, glicerol ili natrijum hlorid u kompozicijama. Produžena absorbcija injektabilnih farmaceutskih kompozicija mogu se realizovati uključivanjem u kompoziciju agensa koji odlaže apsorbciju,na primer, soli monostearata i želatin. Sterilni injektabilni rastvori mogu se pripremiti ugradnjom aktivnog jedinjenja u željenu količinu odgovarajućeg rastvarača sa jednom ili više kombinacija sastojaka na primer, kao što je nabrojano iznad, ukoliko treba, nakon čega sledi sterilizacija mikrofiltracijom. Generalno, disperzije se pripremaju ugradnjom aktivnog jedinjenja u sterilno dostavno sredstvo (vehicle) koje sdrži bazični disperzioni medijum i neophodne druge sastojke na primer neke od onih navedenih gore. U slučaju sterilnih praškova za preparacijua sterilnih injektibilnih rastvora, metode primeri preparacija su sušenje u vakuumu i sušenje smrzavanjem (freeze drying) (liofilizacija) koja rezultira u puder (prašku) aktivne supstance plus što sadrži i bilo koji dodatan željeni sastojak iz prethodnog njegovog rastvora koji je sterilisan filtracijom.
[0200] Sterilni injektabilni rastvori mogu se pripremiti inkorporacijom aktivnog jedinjenja u željenoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili u kombinaciji sa gore navedenim, ukoliko je potrebno nakon čega sledi sterilizacija mikrofiltracijom. Uopšteno, disperzije se pripremaju inkorporacijom aktivnog jedinjenj a prevozno sredstvo (vehicle) koje sadrži bazični medijum za diperziju i neophodne sastpjke iz gore navedenih. U slučaju sterilnih pudera (praškova) za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, primeri metoda za pripremu su vakuum sušenje i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija) koje omogućavaju dobijanje praška aktivne supstance plus dodatnih željenih sastojaka koji su se nalazili u rastvoru koji je setrilisan filterom.
[0201] U jednom ostvarenju pronalaska, pomenuti najmenje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata melfalan, naznačeno time da melfalan je administrira intavenozno ili peroralno.
[0202] U drugom ostvarenju pronalaska, pomenuti najmenje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata derivate glutaminske kiseline, kao što je talidomid (Thalomid®) ili analog talidomida na primer, CC-5013 (lenalidomid, Rev- limid™) ili CC4047 (Actimid™), naznačeno time da se pomenuti derivate glutaminske kiseline administrira peroralno.
[0203] U drugom ostvarenju pronalaska, pomenuti najmenje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata inhibitor proteozoma, kao na primer bortezomib (Velcade®), naznačeno time da se bortezomid administrira intravenozno.
[0204] U drugom ostvarenju pronalaska, pomenuti najmenje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata vinka alkaloid, kao na primer vinkristin, naznačeno time da se vinkristin administrira intravenozno.
[0205] U drugom ostvarenju pronalaska, pomenuti najmenje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata antraciklin, kao što je doksorubicin, naznačeno time da se doksorubicin administrira intravenozno.
[0206] U drugom ostvarenju pronalaska, pomenuti najmenje jedan kortikosteroid obuhvata prednizon, naznačeno time da se prednizon administrira peroralno.
[0207] drugom ostvarenju pronalaska, pomenuti najmenje jedan kortikosteroid obuhvata prednizon, naznačeno time da se prednizon administrira peroralno.
Pacijenti i bolesti koje treba tretirati
[0208] Individue koje treba tretirati sa kombinovanoj terapiji iz ovog pronalaska mogu na primer uključiti humane pacijente koji imaju poremećaje koji se mogu korigovati ili ublažiti putem inhibicije CD38 inhibicije, kao što je enzimskom aktivnošću, signalnom transdukcijom, indukcijom ekspresije citokina, indukcijom proliferacije ili diferencijacije, i/ili indukcijom lize i/ili eliminacijom/redukcijom broja CD38 eksprimirajućih ćelija.
[0209] Na primer, anti-CD38 antitelo može se koristiti za izazivanje in vitro jedne ili više sledećih bioloških aktivnosti: inhibicija CD38 funkcija (kao enzimatska aktivnost, signalna transdukcija, indukcija ekspresije citokina, indukcija proilferacije ili difernecijacije i/ili indukcija lize) ubijlanje ćelija koje eksprimiraju CD38, posredovanje u fagocitozi ili ADCC ćelija koje eksprimiraju CD38 u prisustvu humanih efektornih ćelija i posredovanje CDC-a ćelije koja eksprimira CD38 u prisustvu komplementa ili ubijanjem CD38 eksprimirajućih ćelija putem apoptoze.
[0210] U jednom ostvarenju, imunokonjugati koji siu ovde ekpsrimirani mogu se kroistiti za ciljanje jedinjenja (na primer terapeutskih agenasa, obeležja, citokina, imunosupresanata, itd) ka ćelijama koje imaju CD38 vezan za svoju površinu upotrebom ovakvih ciljajućih jedinjenja kao terapeustkih ostataka u imunokonjugatima.
[0211] Ćelije koje imaju vezan CD38 na svojoj površini mogu se ubiti administraccijom takvih imunokonjugata.
[0212] Anti-CD38 antitela se koriste za inhibiciju CD38 indukovanih aktivnosti koje su povezne sa određenim poremećajima ili za eliminaciju ili redukciju broja ćelija koje eksprimiraju CD 38.
[0213] Poremećaj koji uključuje ćelije koje eksprimiraju CD38 može biti tumorogenei poremećaj, kao poremećaj koga karakteriše prisustvo tumorskih ćelija koje eksprimiraju CD38 uklkučujući na primer, limfom B ćelija, malignitete plazma ćelija, T/NK limfome i mijeloidne malignitete.
[0214] Primeri ovakvih tumorogenih bolesti obuhvataju limfom B ćelija/leukemije uključujući limfoplastičnu leukemiju prekursora B ćelija/limfom i ne -Hočkinsonove limfome; akutnu polimijelocitnu leukemiju, akutnu limfoblastnu leukemiju i neoplazme zrelih B ćelija (CLL), limfom malih limfocita (SLL), akutnu limfocitičnu leukemiju B ćelija, polimfocitičnu leukemiju B ćelija, limfoplazmatični limfom, limfom ćelija plašta (MCL), folikularni limfom (FL), uključujući FL niskog stepena, srednje jakog stepena i visokog stepena, limfom folikularnog centra koeže, limfom marginalne zone B ćelija (MALT tip, nodalni i slezinski tip), leukemija dlakavih ćelija, limfom difunih velikih B ćelija, Burkitov limfom, plazmacitoma, mijeloma plazma ćelija, leukemija plazma ćelija, postrtransplantni limfoptoliferativni poremećaj, Waldenstromova makroglobulinemija, leukemije plazma ćelija i anaplastični limfom velikih ćelija (ALCL).
[0215] U jednom ostvarenju, poremećaj kojiuključuje ćelije koje eksprimiraju CD38 je multipli mijelom.
[0216] Primeri ne-Hočkinsonovih limfoma su limfomatoidna granulomastoze, primarni efuzioni limfom, limfom intravaskularnih velikih B ćelija, limfom “mediastinal” velikih B ćelija, oboljenja teškog lanca (uključujući γ, μ i α, bolesti) limfome indukovane terapijom sa imunosupresivnim agensima, kao limfom indukovan sa ciklosporinom i limfom indukovan sa metotreksatom.
[0217] U jednom ostvarenju ovog pronalaska, poremećaj koji ukljuluje ćelije koje eksprimiraju CD38 moguće biti Hočkinsonov limfom.
[0218] Primeri poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimiraju Cd38 mogu biti malignitetno dobijene iz T i NK ćelija uključujući: zreleT ćelije i NK ćelije neoplazme uključujući prolimfocitičnu leukemiju T ćelija, velika granulocitna limfocitična leukemija T ćelija, agresivna leukemija NK ćelija, adutna leukemija/limfoma T ćelija, ekstranodalna limfoma NK/T ćelija, nazalni tip, enteropatija-tip lomfoma T ćelija, hepato slezina limfoma T ćelija, subkutanozna “panniculitis”- slična limfoma T ćelija, blastična limfoma NK ćelija, Mycosis Fungoides/Sézary sindrom, primarni kutanozni CD30 pozitivni T ćelijski limfoproliferativni poremećaji (primarna kutanozna anaplastičma limfoma velikih ćelija CALCL, limfomatodini papulozis, granične lezije), angioimunoblastični limfom T ćelija, nespecificiran limfom perifernih T ćelija, i anaplastični limfom velikih ćelija.
[0219] Primeri maligniteta koji su izvedeni iz mijeloidnih ćečija uključuju akutnu mijeloidnu leukemiju, uključujući akutnu promijelocitičnu leukemiju, i hronočnu mijeoproliferativne bolesti, uključujući hroničnu mijeloidnu leukemiju.
Doziranje i režimi tretmana
[0220] Tretman na osnovu ovog pronalaska uključuje “terapeutski efektivnu količinu” medikamenata koji se koriste. “Terapeutski efektivna količina” odnosi se na efektivnu količinu, pri doziranju i za periode vremena koji su neophodni, da bi se ostvario željeni terapeustki rezultat. Terapeutski efektivna količina može da varira u skladu sa faktorime kao što je stanje bolesti, godište, pol, i težina individue, i sposobnost medikamenata da izazovu željeni odgovor u ondividui. Terapeutski efektivna količina je takođe ona čiji toekični ili razarajući efekti antitela ili dela antitela su prevagnuti od starne terapeustki benefitnih (korisnih) efekata. U kontekstu efektivne količine ove kombinovane terapije, terapeutska količina uključuje količine koje su terapeutski efektivne samo u kombinaciji sa drgim jedinjenjima na primer količine koje bi bile preniske da budu efektivne ako se primenjuju u monoterapiji.
[0221] “Terapeutski efektivna količina” za tumorsku terapiju se meri sposobnošću terapije da satbilizuje progresiju (naperdak) bolesti, Sposobnost jedinjenja da inhibira kancer može se evaluirati u ivotinjskom model sistemu koji može da predvidi efikasnost u humanism tumorima. Alternativno, ova osobina kompozicije može se evaluirati pregledom sposobnosti jedinjenja da inhibira rast ćelija ili da indukuje apoptozu u in vtro esejima koji su poznati onima koji se bave naukom. Terapeutski efektivna količina terapeutskog jedinjenja može da smanji veličinu tumora ili na drugi način da ublaži simptome u subjektu. Neko koj se bavi naukom moće da odredi ovakvu količinu na osnovu faktora kao što su veličina subjekta, težina simptoma kod subjekta, i određena kompozicija ili put administarcije koji je odabran.
[0222] Režimi doziranja su prilagođeni da obezbede željeni odgovor (na primer teraputski odgovor). Na primer, pojedinačna bolus doza može se administrirati, nekoliko podeljenih doza mogu se adminitrirati tokom vremena ili doza može biti proporcionalno redukovana ili povećana u zavisnost od hotnosti terapeutske situacije. Parenterane kompozicije mogu biti formulisane u formi jediničnih doza radi lakše administracije i uniformisano dozirane. Forma jedinične doze odnosi se na fizički diskretne jedinice koje su prilagođene kao jedinične doze za subjekta koji treba da se tretira; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja koja je proračunata da proizcvede željeni terapeutski efekat u asocijaciji sa neophodnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija formi jediničnih doza iz ovog pronalaska je diktirana i direktno zavisi od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog efekta koji treba da se postigne i (b) ograničenja koja postoje u nauci vezanoj za doziranje i forme jedinjenja (compounding) kao aktivno jedinjenje za teretiranje senzitivnosti u individuama.
[0223] Efikasne doze i režimi doziranja za anti-CD38 antitela koji se ovde koriste u ovom pronalasku zaviše od bolesti ili stanje koje treba tretirati i može biti determinisano od strane osobe stručne u nauci. Kao primer, nelimitirajući opseg za terapeutski efektivnu količinu anti-CD38 antitela koje se koristi u ovom pronalasku je oko 0.1-100 mg/kg, kao oko 0.1-50 mg/kg, na primer oko 0.1-20 mg/kg, kao oko 0.1-10 mg/kg, na primer oko 0.5, oko kao na primer 0.3, oko t 1, ili oko 3 mg/kg. U drugom ostvarenju, antitelo se administrira u dozi od 1 mg/kg ili više, kao u dozi od 1 do 20 mg/kg, e.g. u dozi od 5 do 20 mg/kg, na primer u dozi od 8 mg/kg.
[0224] Prosečan lekar ili veterinar iz ove oblasti će lako odrediti i prepisati potrebnu efikasnu kličinu farmaceutske kompozicije. Na primer, lekar ili veterinar može da počne sa dozama korišćenog leka u farmaceutskoj kompoziciji koje su manje nego što je potrebno u cilju postizanja željnog terapeutskog efekta i postepeno povećavati dozu do postizanja željenog efekta. Generalno, pogodna dnevna doza kompozicije će biti ta količina jedinjenja koja je najniža efikasna doza da bi se proizveo željeni terapeutski efekat. Takva efikasna doza će generalno zavisiti od gore opisanih faktora. Davanje može biti intravensko, intramuskularno, intraperitonealno ili subkutanozno i na primer davnje proksimalno na ciljano mesto. Ukoliko je poželjno, efikasna dnevna doza farmaceutske kompozicije može biti davana dva, tri, četiri, pet, šest ili više subdoza davanih odvojeno u odgovarajućim intervalima u toku dana, opciono u jediničnim doznim oblicima. Kada je moguće da se jedinjenje daje samo, poželjno je dati jedinjenje kao gore opisanu farmaceutsku kompoziciju.
[0225] U jednom ostvarenju, anti-CD38 antitelo se administrira infuzijom u mesečnoj dozi od oko 10 do 500 mg/m<2>, kao od oko 200 do 400 mg/m<2>. Ovakva administracija može se ponoviti na primer 1 do 8 puta, kao 3 do 5 puta. Administracija se može izvesti kontinuiranom infuzijom tokom perioda od 2 do 24 sata, kao od 2 do 12 sati.
[0226] U jednom ostvarenju, anti-CD38 antitelo se administrira sporom kontinualnom izfuzijom tokom dužeg perioda, kao dužeg od 24 sata, kako bi se redukovali toksični sporedni neželjeni efekti.
[0227] U jednom ostvarenju, anti-CD38 antitelo se administrira u nedeljnim dozama od 250 mg do 2000 mg, kao na primer 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg ili 2000 mg, do 8 times, kao do 4 do 6 puta. Administracija se može izvesti kontinualnom infuzijom u period od 2 do 24 sata, kao od 2 do 12 sati. Ovakav režim se može ponoviti jednom ili više puta ikoliko je neophodno, na primer nakob 6 meseci ili 12 meseci. Doziranje može biti idređeno ili podeđeno merenjem količine jedinjenja iz ovog pronalaska u krivi nakon administracije na primer uzimanjem biolškog uzorka i upotrebom idiopatskih antitela koja ciljaju tj targetiraju region za vezivanje antigena anti-CD38 antitela.
[0228] U daljem ostvarenju, anti-CD38 antitelo se administrira jednom nedeljno tokom 2 do 12 nedelja, kao tokom 3 do 10 nedelja, kao 4 do 8 nedelja.
[0229] U jednom ostvarenju, anti-CD38 antitelo se administrira terapijom održavanja, kao na primer, jednom nedeljno tokom perioda od 6 meseci ili više.
[0230] U jednom ostvarenju, anti-CD38 antitelo se administrira režimom koji uključuje jednu infuziju anti-CD38 antitela nakon čega sledi infuzija anti-CD38 antitela koji je konjugovan sa radioizotopom. Režim se može ponoviti na primer 7 do 9 dana kasnije.
[0231] Kao nelimitirajući primeri, tretma na osnovu ovog pronalaska može biti obezbeđen kao dnevna doza antitela u količini od oko 0.1-100 mg/kg, kao 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ili 100 mg/kg, dnevno, makar jednog od dana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ili 40, ili alternativno, najmenje jedne nedelje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 nakon inicijacije tretmana, ili bilo koje njihove kombinacije, upotrebom pojedinačne ili podeljenih doza svakih 24, 12, 8, 6, 4, or 2 sata ili njihove kombinacije.
[0232] U jednom ostvarenju pronalaska, pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni agens obuhvata melfalan i pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata prednizon. Tipično melafalan se dozira intravenozno IV, ali može se koristiti peroralno (PO) na rpimer, u opsegu od 0.2 - 0.25 mg/kg dnevno ili na primer 7-9 mg/m2). Prednozin može biti na primer doziran sa 2 mg/kg tokom 4 dana svakih 4-6 nedelja (Alexanian et al., J Am Med Assoc 1969;208:1680). U drugimostvarenjima, melfalan se može koristiti u visokim doznim režimima kao pojedinačna doaz do 140 mg/m2 (IV) ili intermedijerne doze u opsegu od 25 do 75 mg/m2 (IV), jedan primer je 40 mg/d administrirani dana 1-4, 9-12 i17-20 svakih 5 nedelja ciklusa (Tsakanikas et al., Oncology 1991;48:369, Richardson PG Am J Oncol 2005;4:737).
[0233] U drugom ostvarenju pronalaska, pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni agens obuhvata talidomid (Thalomid®), i pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon. Talidomid može na primer biti primenjen u dozi od 200 mg/d (PO), ili na primer u opsegu od 50 do 400 mg/d zajedno sa na primer, dozom deksometazona od 40 mg/d ili administriranom dnevno ili administriranom sekvencijalno na primer dana 1-4, 9-12 i 17-20 svakog 28-dnevnog ciklusa. (Rajkumar SV J Clin Oncol 2006;24:431).
[0234] U drugom ostvarenju pronalaska, pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni agens obuhvata lenalidomid, i pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon. Lenalidomid može na primer biti administriran u dozama od 25 mg/d dnevno administriran (PO), i deksometazon na primer u opsegu od 40 mg/d administriranom PO), na primer danadnevno ili administriranom sekvencijalno na primer dana 1-4, 9-12 i 17-2028-dnevnog ciklusa opcionalno kasnije samo dana 1-4 svakog ciklusa (Rajkumar SV, ASH 2004).
[0235] U drugom ostvarenju pronalaska, pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni agens obuhvata bortezomib (Velcade®). Bortezomib može na primer biti korišćen u kombinaciji sa deksametazonom. Ova kombinacija se može koristiti obe postavke i u indukciji i održavanju. Jedan primer je bortezomib 1.3 mg/m2 dana 1,4,8 i 11 svakog 21-dan c i lkusa (indukciona faza, normalno do 8 ciklusa nakon čega slede dani 1,8,11,15 i 22 svakih 5 nedelja ciklusa održavanja (Richardson PG N Engl J Med 2005;352:2487).
[0236] U drugom ostvarenju pronalaska, pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni agens obuhvata vinkristin i doksorubicin, i pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon. Vinkristin se može administrirati kontinualnom IV infuzijom, 0.4 mg po danu (dana 1-4 svakog 4 nedeljnog ciklusa) i doksorubicin na primer, u dozi od 9 mg/m2/d kontinualnom IV infuzijama, danima 1-4 svakog 4 nedeljnog ciklusa. Deksametazon se može dozirati na primer 40 mg dana 1-4, 9-12 i 17-21 svakog 4 nedeljnog ciklusa. Alternativno, može se koristiti pegilovani lipozomalni doksorubicin (na primer u dozi od 40 mg/m2 dana 1 u nedeljnom ciklusu) (Rifkin Cancer 2006; 106:848).
Dalje kombinacije
[0237] Kombinovana terapija iz ovog ptonalska može dalje biti kombinovana sa drugim medikamentima, na primer, kombinovana sa daljim terapeutskim agensima relevantnim za bolest ili stanje koje treba da se tretira. Ovakva administracija može biti simultana, odvojena il sekvecijalna. Za simultanu administraciju agensi se mogu administrirati ko jedna kompozicija ili kao odvojene kompozicije, kako je prigodno.
[0238] U skladu sa tim, ovaj pronalazak obezbeđuje kombinovanu terapiju za tretiranje poremećaja koji uključuju ćelije koje eksprimiraju CD38 kao što je gore opisano, metode koje obuhvataju trostruku terapiju iz ovog pronalaska koja je kombinovana sa jednim ili više terapeutskih agenasa kao što je opisano u tekstu koji sledi.
[0239] U jednom ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju najmanje jednog hemoterapeustkog agensa, najmanje jednog anti -inflaminatornog agensa, ili najmanje jednog imunosupresivnog i/ili imunomoduatornog agensa.
[0240] U jednom ostvarenju, ovakav hemoterapeustki agens može biti selektovan od antimetabolite, kao što je such as metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, fludarabin, 5-fluorouracil, dekarbazin, hidroksiurea, asparaginaza, gemcitabin, cladribine i slični agensi.
[0241] U jednom ostvarenju, ovakav hemoterapeustki agens može biti selektovan od antibiotika, kao što je daktinomicin (nekadšnji aktinomicin), bleomicin, daunorubicin (nekadšnji daunomicin), idarubicin, mitramicin, mitomicin, mitoksantron, plikamicin, antramicin (AMC) i slični agensi.
[0242] U jednom ostvarenju, ovakav hemoterapeustki agens može biti selektovan od anti mitotičnih agenasa, kao što su taksani , na primer doketaksel i paciltaksel.
[0243] U jednom ostvarenju, ovakav hemoterapeustki agens može biti selektovan od inhibitora topoizomeraze kao što je topotekan.
[0244] U jednom ostvarenju, ovakav hemoterapeustki agens može biti selektovan od inhibitora faktora rasta, kao što je inhibitor ErbB1 (EGFR) (kao gefitinib (Iressa®), cetuksimab (Erbitux®), erlotinib (Tarceva®), 2F8 (otkriven u WO 2002/100348) i slični agensi), inhibitora ErbB2 (Her2/neu) (kao što je trastuzumab (Herceptin®) i slični agensi) i slični agensi. U jednom ostvarenju, ovakav inhibitor faktora rasta može biti inhibitor famesil tranferaze, kao SCH-66336 i R115777. U jednom ostvarenju, ovakav inhibitor faktora rasta može biti inhibitor vaskularnog endotelijaonog faktora rasta (VEGF) kao bevacizumab (Avastin®).
[0245] U jednom ostvarenju, ovakav hemoterapeustki agens može biti inhibitor tirozin kinze, kao imatinib (Glivec, Gleevec STI571), lapatinib, PTK787/ZK222584 i slični agensi.
[0246] U jednom ostvarenju, ovakav hemoterapeustki agens može biti inhibitor histon deacetilaze. Primeri ovakvih inhibitora histon decetilaze uključuju hidroksamični baziran na kiselini hibridna polarna jedinjenja, ka SAHA (suberilanilid hidroksamična kiselina).
[0247] U jednom ostvarenju, ovakav hemoterapeustki agens može biti P38a MAP kinazni inhibitor, kao SCIO-469.
[0248] U dalejm ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju najmanje jednog inhibitora angiogeneze, neovasularizacije i/ili druge vaskularizacije subjektu kome je to potrebno.
[0249] Primeri ovakvih inhibitora angiogeneze su inhbitori urokinaze, inhibitori metalorpoteinaze matriksa (kao marimastat, neovastat, BAY 12-9566, AG 3340, BMS-275291 i slični agensi), inhibitori migracije endotelijalnih ćelija i proliferacije (kao TNP-470, skvaalamin, 2-metoksiestradiol, “combretastatin”s, endostatin, angiostatin, penicilamin, SCH66336 (Schering-Plough Corp, Madison, NJ), R115777 (Janssen Pharmaceutica, Inc, Titusville, NJ) i slični agensi), antagonisti angiogenih faktora rasta (kao što je ZD6474, SU6668, antitela protiv angiogenih agenasa i/ili njihovih receptora (kao VEGF, bFGF, i angiopoietin-1), Sugen 5416, SU5402, antiangiogeni ribozim (kao angiozim), interferon α (such as interferon α2a), suramin i slični agensi) VEGF-R kinzani inhibitori i drugi antiangiogeni inhibitori tirozin kinaze (kao SU011248), inhibitori endotel i ja lnih specifičnihintegrin/preživl javanje s ignalnih moleula ( kao vitaks in i s l ični agensi), antagonisti/helatori bakra (kao tetrat iomolibdat, kaptopri l i ls ični agensi), karboksiamido tr iazol (CAI), ABT-627, CM101, interleukin-12 (IL-12), IM862, PNU145156E kao i nukleotidni molekuli koji inhibiraju angiogenezu (kao antisens-VEGF-cDNK, cDNK koja kodira angiostatin cDNK koja kodira p53 i cDNK koja kodira deficijentni VEGF receptor2) i slični agensi.
[0250] Drugi primeri ovakvih inhibitora angiogeneze, neovaskularizacije i/ili druge vaskularizacije su derivati antiangiogenog heparina i srodni molekuči (na primer., heparinaza III), temozolomid, NK4, faktor inhibicijemigracije makrofaga (MIF) inhibitori ciklooksigenaze-2, inhibitori hypoksija-inducibilnog faktora 1, anti-angiogeni izoflavoni, “ oltipraz”, fumagilin i njegovi analozi, a n a l o z i somatostatina, pentosan polisulfat, n a t r i j u m tekogalan, dalteparin, tumstatin, trombospondin, NM-3, kombrestatin, kanstatin, avastatin, antitela protiv drugih relevantnih targeta (ciljeva) (kao anti-alfav/beta-3 integrin i anti-kininostatin mAbs) i slični agensi.
[0251] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju anti-kancer imunogena, kao kancer antigen/tumor-poevazan antigen (na primer epitelijalni molekul ćelijske adhezije (Ep- CAM/TACSTD1), mucin 1 (MUC1), karcionembrioni antigen (CEA), tumor-povezani glikoprotein 72 (TAG-72), gp100, Melan-A, MART-1, KDR, RCAS1, MDA7, tumor-povezane viralne vakcine (na primer humane papilomavirus vakcine), tumor-izvedeni protein toplotnog šoka i lsični agnesi. Mnogobrojni drugi pogodni kancer antigen/tumor povezani antigeni opisani bilo gde drugo ovde i slični moeluli poznati u nauci mogu se takođe ili alternativno koristiti u ovakvom ostvarenju. Anti-kancer imunogeni peptide takođe uključuju anti-idiotipske “vaksine” kao <bec3 anti-idiotipska antitela, Mitu-momab, CeaVac i srodna anti-idiotipska antitela, anti-idiotipsko antiteo na MG7 antitelo, i druga anti-kancer anti-idiotipska antitela (videti na primer, Birebent et al., Vaccine.21(15), 1601-12 (2003), Li et al., Chin Med J (Engl).114(9), 962-6 (2001), Schmitt et al., Hybridoma.13(5), 389-96 (1994), Maloney et al., Hybridoma.4(3), 191-209 (1985), Raychardhuri et al., J Immunol. 137(5), 1743-9 (1986), Pohl et al., Int J Cancer. 50(6), 958-67 (1992), Bohlen et al., Cytokines Mol Ther.2(4), 231-8 (1996) and Maruyama, J Immunol Methods. 264(1-2), 121-33 (2002)). Ovakva anti-idiotipska Abs (antitela) mogu opcionalno biti konjugovana za nosač, koji može biti sintetički (tipično inertan) molekularni nosač, protein (na primer “keyhole limpet hemocyanin” (KLH) (videti na primer Ochi et al., Eur J Immunol.
17(11), 1645-8 (1987)), ili ćelijski (na primer crveno krvno zrnce- videti na primer Wi et al., J Immunol Methods.122(2), 227-34 (1989)).
[0252] U daljem ostvarenju kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju bifosfonata. Primeri potencijalno pogodnihh bifoosfonta su pamidronat (Aredia®), zoledronična kiselina (Zometa®), klodronat (Bonefos®), risendronat (Actonel®), ibandronat (Boniva®), etidronat (Didronel®), alendronat (Fosamax®), tiludronat (Skelid®), inkadronat (Yamanouchi Pharmaceutical) i minodronat (YM529, Yamanouchi).
[0253] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju faktor stimulacije kolonija. Promeri pogodnih faktora stimulcije kolonija su faktori stimulacije granulocitne kolonije (G-CSF), kao filgrastim (Neupogen®) i pegfilgrastim (Neulasta®), faktori stimulacije granulocitne makrofagne kolonije (GM-CSF) kao sargramostim (Leukine®).
[0254] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju eritropoetskog agensa. Primeri pogodnih eritropoetskih agenasa su eritropoetin (EPO), kao epoetin alfa (na primer Procrit®, Epogen®, i Eprex®) i epoetin beta (na primer NeoRecormon®) i protein stimulatori eritropoeze (na primer Aranesp®).
[0255] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju anti-kancer citokinam hemokina ili njihovu kombinaciju. Primeri pogodnih citokina i faktora rasta uključuju IFNγ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNα (e.g., INFα2b), IFNβ, GM-CSF, CD40L, Flt3 ligand, faktor stem ćelija, “ancestim”, i TNFα. Pogodni hemokini mogu uključiti Glu-Leu-Arg (ELR)-negativne hemokine kao IP-10, MCP-3, MIG, and SDF-1α iz humanih CXC i C-C familija citokina. Pogodni citokini uključuju derivate citokina, varijante citokina, fragmente citokina, i fuzione protein citokina.
[0256] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju agensa koji moduliše na primer pojačava ili inhibira, ekspresiju ili aktivnost, Fcα or Fcγ receptora. Primeri agenasa pogodnih za ovu primenu uključuju interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), interleukin-6 (IL-6), faktore stimulacije granulocitne kolonije (GCSF), kao filgrastim (Neupogen®) i pegfilgrastim (Neulasta®), i faktore stimulacije granulocitne makrofagne kolonije (GM-CSF) kao sargramostim (Leukine®), interferon-y (IFN-γ), i faktor nekroze tumora (TNF).
[0257] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju regulator kontrole/apoptoze ćelijskog ciklusa (ili “regulatorni agens”). Regulator kontrole/apoptoze ćelijskog ciklusa može uključiti molecule (i) koji targetiraju i modulišu kontrolu ćelijskog ciklusa/apoptoze kao cdc-25 (such as NSC 663284), (ii) ciklin zavisnue kinase koje prekomerno stimulišu ćelijski ciklus (kao flavopiridol (L868275, HMR1275), 7-hidroksistaurosporin (UCN-01, KW-2401), i roskovitin (R-roscovitine, CYC202)), i (iii) modulatore telomeraze (kao BIBR1532, SOT-095, GRN163
i kompozicije opisane u na primer US 6,440,735 i US 6,713,055). Nelimitirajući primeri molekula koji interferiraju sa apopotskim putevima uključuju TNF-srodni apoptozni indukujući ligand (TRAIL)/apoptosa-2 ligand (Apo-2L), agens koji indukuje NFκB blokadu koja dovodi do inhibicije proizvodnje IL-6, antitela koja ajtiviraju TRAIL receptore, IFN-ove, A antisens Bcl-2 i As2O3(arsenik trioksid, Trisenox®).
[0258] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju hormonske regulatorne agenase regulatora, kao agenasa korisnih za antiandrogen i anti-estrogen terapiju. Primeri ovakvih hormosnkih regulatornih agenasa su tamoksifen, idoksifen, fulvestrant, droloksifen, toremifen, raloksifen, dietilstilbestrol, etiinil estradiol/estinil, anti androgene (kao flutamind/euleksin), progestin (kao hidroksiprogesteron kaproat, medroksiprogesteron/provera, megestrol acepat/megace), adrenokortikosteroid (kao hidrokortizon, prednizon), lutenizirajući luteinizing hormonoslobođajući hormon (i njihove analoge i druge LHRH agonise kao buserelin i goserelin), inhibitor aromataze (kao anastrazole/arimideks, aminoglutetimid/citraden, eksemestan), inhibitor hormona (kao “octreotide”/sandostatin) i slični agensi..
[0259] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju anti-anergičnih agenasa (na primer jedinjenja malih molekula, protein, glikorpteini, ili antitela koja umanjuju toleranciju na tumorkse i kancerne antigene.), Primeri ovakvih jedinjenja su molekuli koji blokiraju aktivnost CTLA-4, kao MDX-010 (Phan et al., PNAS USA 100, 8372 (2003)).
[0260] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju nukleinskih kiselina koje sadrže tumor supresor gen i vektora kao što je humani rekombinantni deficijentni u replikaciji adenovirusni vektor divljeg tipa (WT) p53/SCH58500, etc.; antisens nukleinske kiseline koje targetiraju oncogene, mutirani ili deregulisani geni; ili siRNK koja je tergetovana ka mutiranim ili deregulisanim genima.
Primeri tageta tumor supresorauključuju na primerBRCA1, RB1, BRCA2, DPC4 (Smad4), MSH2, MLH1, i DCC.
[0261] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju anticancer nukleinske kiseline kao genasens (augmerosen/G3139), LY900003 (ISIS 3521), ISIS 2503, OGX-011 (ISIS 112989), LE-AON/LEraf-AON (lipozom inkapsuliran c-raf antisens oligonukleotid/ ISIS-5132), MG98, i druge antisens nukleinske kiseline koje targetiraju PKC α, klusterin, IGFBP-ove, protein kinazu A, ciklin D1, ili Bcl-2h.
[0262] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju anticancer inhibitorni RNK molekul (videti na primer Lin et al., Curr Cancer Drug Targets.1(3), 241-7 (2001), Erratum in: Curr Cancer Drug Targets.3(3), 237 (2003), Lima et al., Cancer Gene Ther.11(5), 309-16 (2004), Grzmil et al., Int J Oncol.4(1), 97-105 (2004), Collis et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys. 57(2 Suppl), S144 (2003), Yang et al., Oncogene. 22(36), 5694-701 (2003) i Zhang et al., Biochem Biophys Res Commun.303(4), 1169-78 (2003)).
[0263] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju virusa, viralnih proteina, i slično. Virus i degfic i jentni za repl ikaci ju koj i su generalno sposobni za jednu i l i samo nekol iko rundi repl ikacije in vivo, i koji targeti i traju ćel i je tumora, mogu na primer biti korisne komponente ovakveih kompozici ja i metoda. Ovakvi v iralni agensi mogu obuhvatit i i l i bit i povezani sa nukleinskim kisel inama koje kodiraju imunostimulanse kao GM-CSF i/ili IL-2. Oba i prirodni onkolitični i ovakvi rekombinantni onkolitični virusi (na primer HSV-1 virusi, reovirusi, adenovirusi deficijentni u replikaciji i senzitivni u replikaciji itd) mogu biti korisne komponente u ovakvim metodama i kompozicijama (videti na primer instance Shah et al., J Neurooncol.
65(3), 203-26 (2003), Stiles et al., Surgery. 134(2), 357-64 (2003), Sunarmura et al., Pancreas. 28(3), 326-9 (2004), Teshigahara et al., J Surg Oncol.85(1), 42-7 (2004), Varghese et al., Cancer Gene Ther. 9(12), 967-78 (2002), Wildner et al., Cancer Res. 59(2), 410-3 (1999), Yamanaka, Int J Oncol. 24(4), 919-23 (2004) i Zwiebel et al., Semin Oncol. 28(4), 336-43 (2001).
[0264] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje može da uključuje "cele ćelije i "adoptivne" imunoterapeutske metode. Na primer, ovakve metode mogu obuhavati infuzione ili reinfuzione ćelije imunskog sistema (na primer tumor infiltrirajuće limfocite (TIL-ove) kao CD4<+>i/ili CD8<+>T ćelije (na primer T ćelije proširene sa tumor specifičnim antigenima i/ili genetskim poboljšanjima), B ćelije koje eksprimiraju antitelo ili druge antitelo prdukujuće i/ili prezentujuće ćelije, dendritične ćelije (na primer anticitokin eksprimirajuće rekombinantne dendritične ćelije, dendritične ćelije kultivisane sa DC-proširujućim agensom kao što je GM-CSF i/ili Flt3-L, i/ili dendritične ćelije napunjene tumor-povezanim antigenom) antitumorske NK ćelije, taozvane hibridne ćelije ili njihove kombinacije. Ćelijski čizati mogu takođe biti korisni u ovakvim metodama i kompozicijama. Ćelijske “vakcine” u kliničkim studijma mogu biti korisne u takvom aspekyu da uključuju Canvaxin™, APC-8015 (Dendreon), HSPPC-96 (Antigenics), i Melacine® ćelijske lizate. Antigeni dobijeni iz ćelija kancera i njihove mešavine (videti na primer Bystryn et al., Clinical Cancer Research Vol. 7, 1882-1887, July 2001), opcionalno unapred pomešane sa adjuvantima kao što je alum, mogu takođe biti komponente u ovakvim metodama i kombinacijama kompozicija.
[0265] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje primenu internih metoda vakcinacije. Interna vakcinacija se odnosi na indukovanu smrt ćelija tumora ili kancera, kao smrt ćelija tumora ili kancera indukovana lekom ili indukovana radijacijom, u pacijentu, koja tipično vodi ka izizivanju i podizanju imunog sistema ka (i) ćelim tumorskim ćelijama ili (ii) delova tumorskih ćelija uključujući (a) sekretovane proteine, glikoproteine ili druge produkte, (b) proteine povezane sa membranom ili glikopoteine ili druge komponente povezane sa ili ubačene u membrane, i/ili (c) intracelularne protein ili druge intracelularne komponente. Interni imuni odgovor indukovan vakcinacijom može biti humoralni (na primer posredovan antitelokomplementom) ili posredovan ćelijama (na primer razvoj i/ili povećanje endogenih citotoksičnihT limfocita koji prepoznaju interno ubijene ćelije tumora ili njihovih delova.
[0266] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju komplementa. U skladu sa tim, upotreba kompozicija koje sadrže anti-CD38 antitela sa serumom ili kompelemtom je takođe u opsegu ovog pronalaska. U ovim kompozicijama komplement je lociran u blizini anti-CD38 antitela, na primer konjugacijom ili može biti pripremljena za simultanu administraciju. Alternativno, anti-CD38 antitela i komplement ili serum mogu biti administrirani odvojeno.
[0267] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju agenasa za indukciju diferencijacije, retinoičnu kiselinu i analoge retinoične kiseline (kao sve trans retinoične kiseline, 13-cis retinoičnu kiselinu i slične agense), analoge vitamin D (kao seokalcitol i slične agense), inhibitore ErbB3, ErbB4, IGF-IR, insulinski receptor, PDGFRa, PDGFRbeta, Flk2, Flt4, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, TRKA, TRKC, c-met, Ron, Sea, Tie, Tie2, Eph, Ret, Ros, Alk, LTK, PTK7 i slične agense
[0268] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju kathepsina B, modulatore kathepsin D dehidrogenazne aktivnosti, glutation-S-transferazu (kao glutacilcistein sintetazu i laktat dehidrogenazu), ili slične agense.
[0269] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju of estramustina ili epirubicina.
[0270] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju inhibitora HSP90 kao 17-alil amino geldanamicin, antitela usmerena oritiv tumorskog antigena kao PSA, CA125, KSA, itd, integrine kao integrin β1, inhibitore VCAM ili slične agense.
[0271] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju inhibitora kalcineurina (kao valspodar, PSC 833 i drugi inhibitori MDR-1 ili pglikooproteina), TOR-inhibitore (kao sirolimus, everolimus i rapamicin) i inhibitore "lymphocyte homing" (kućenje limforcita) mehanizama (kao FTY720), i agense sa efektima na ćelijsku signalizaciju kao inhibitore adhezionih molekula (na primer anti-LFA, itd.).
[0272] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje radioterapiju.
[0273] Radioterapija može takođe obuhvatiti radijaciju ili povezanu administraciju radiofarmaceutikala pacijentu kome se obezbežuje terapija. Izvor radijacije može biti ili eksterni ili interni zrak radiacione terapije (EBRT), brahiterapije (BT) ili radioterapije usmerene na skelet). Radioaktivni elementi koji se mogu koristiti u praktikovanju takvih metoda uključuju na primer, radijum, cezijum-137, iridijum- 192, americijum-241, zlato-198, kobalt-57, bakar-67, tehnecijum-99, jod-123, jod-131, i indijum-111.
[0274] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključujetransplantaciju analoga perifernih stem ćelija ili koštane srži.
[0275] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje ortopedske intervencije.
[0276] Ortopedske intervencije se mogu koristiti u tretmanima poremećaja koji uključuju ćelije koje eksprimiraju CD38, kao što je multipla mijeloma, kako bi se kontrolisao bol i zadržala funkcija ili mobilnost. Ovakve intervencije mogu uključiti fizikalnu terapiju, deobu kosti da bi se spreče ili tretiraju prelomi, ili hirurške procedure (manje ili veće) da se poprave frakture.
[0277] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje dostavu jednog i l i više agenasa koj i promovišu pristup CD38 antitela i l i kombinovane kompozici je u unutrašnjost tumora. Ovakve metode mogu na primer bit i izvedene u asocijacij i sa dostavom relaksina, koji ima sposobnost relaksaci je tumora (videti na primer, US 6,719,977). U jednom ostvarenju, anti-CD38 antitelo koje se koristi u ovom pronalasku može biti vezano ze peptid koji prodire u ćeliju (CPP). Ćelijski prodirući peptide (CPP) su srodni peptide (kao konstruisana antitela koja prodiru u ćeliju) i opisani sun a primer u Zhao et al., J Immunol Methods. 254(1-2), 137-45 (2001), Hong et al., Cancer Res.60(23), 6551-6 (2000). Lindgren et al., Biochem J.377(Pt 1), 69-76 (2004), Buerger et al., J Cancer Res Clin Oncol. 129(12), 669-75 (2003), Pooga et al., FASEB J.12(1), 67-77 (1998) i Tseng et al., Mol Pharmacol.62(4), 864-72 (2002).
[0278] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju najmanje jednog antiinflamatornog agensa.
[0279] U jednom ostvarenju ovakav anti-inflaminatorni agens može biti odabran iz grupe steroidnih lekova i NSAID (nesteroidni antiinflamatorni lekovi).
[0280] U jednom ostvarenju ovakav anti-inflaminatorni agens može biti odabran iz grupe koja obuhvata aspirin i druge salicylate, inhibitore Cox2 (kao rofekoksib i celekoksib), NSAIDs (kao ibubrufen, fenobrufen, naproksen, sulindak, dikofenak, piroksikam, ketobrufen, diflunizal, nabumeton, etodolak, oksaprozin, i indometacin), anti-IL6R antitela, anti-IL8 antitela (na primer 10F8 opisano u WO2004/058797), anti-IL15 antitela, anti-IL15R antitela, anti-CD4 antitela, anti-CD11a antitela (na primer, efalizumab), antialfa-4/beta-1 integrin (VLA4) antitela (na primer natalizumab), CTLA4-Ig za tretiranje inflamatornih bolesti, prednizolon, prednizon, antireumatskih lekova koji modifikuju bolest (DMARD-ovi) kao metotreksat, hidrokshlorokin, sulfasalazin, inhibitor sinteze pirimidina (kao leflunomid), IL-1 receptor blokirajući agensi (kao anakinra), TNF-α blokirajući agensi (kao etanercept, infliksimab, i adalimumab) i slični agensi.
[0281] U daljem ostvarneju kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju najmanje jednog imunosupresivnog i/ili imunomoduatornog agensa subjektu kome je potreban.
[0282] U jednom ostvarenju, ovakav imunosupresivan i/ili imunomoduatoran agens može biti selektovan od ciklosporina, azatioprina, micofenolne kiseline, mikofenolat “mofetil”, kortikosteroida kao na primer prednizona, metotreksata, soli zlata, sulfasalazina, antimalarika, “brequinar”, leflunomida, mizoribina, 15-deoksispergualina, 6-merkaptopurina, ciklofosfamida, rapamicina, takrolimusa (FK-506), OKT3, anti-timocit globulina, thimopentina, timozina i sličnih agenasa.
[0283] U jednom ostvarenju, ovakav imunosupresivan i/ili imunomoduatoran agens može biti selektovan iz grupe imunosupresivnih antitela, kao na primer antitela koja se vezuju za p75 od IL-2 receptora, ili antitela koja se vezuju za na primer, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD28, B7, CD40, CD45, IFNγ, TNF-α, IL-4, IL-5, IL-6R, IL-6; IGF, IGFR1, IL-7, IL-8, IL-10, CD11a, ili CD58, ili antitela koja se vezuju za njihov ligand.
[0284] U jednom ostvarenju ovakav imunosupresivan i/ili imunomoduatoran agens može biti selektovan od solubilnih IL-15R, IL-10, B7 molekula (B7-1, B7-2, njihovih varijanti ili fragmenata) ICOS, i OX40, inhibitora negativnog T ćelijskog regulatora (kao antitelo protiv CTLA4) i sličnih agenasa.
[0285] U daljem ostvarenju, kobinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje adminstraciju anti- C3b(i) antitela.
[0286] U daljem ostvarenju, kobinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje administraciju inhibitora histonske deacetilaze (na primer, fenilbutirat) i/ili DNK reparirajućih agenasa (na primer DNK repair enzimi i srodne kompizicije kao dimercin).
[0287] U daljem ostvarenju, kombinovana terapija iz pronalaska dalje uključuje anticancer usmerenu fotodinamičku terapiju (na primer anti kancer laserska terapija koja opcionalno može da se praktikuje uz upotrebu fotosensitiivirajućih agenasa, videti na primer, Zhang et al., J Control Release. 93(2), 141-50 (2003)), anti-kancer terapije zvučnum talasima i šok talasima (videti na primer Kambe et al., Hum Cell. 10(1), 87-94 (1997)), i/ili anticancer nutriceutska terapija (videti na primer, Roudebush et al., Vet Clin North Am Small Anim Pract. 34(1), 249-69, viii (2004) i Rafi, Nutrition. 20(1), 78-82 (2004).
[0288] Sve meted koje su ovde opisane mogu se izvesti po bilo kom pogodnom redosledu ukoliko nije ovde drugačije naznačeno ili na neki drugi način očigledno u kontadikciji sa kontekstom.
[0289] Ovaj pronalazak je dlaje ilustrovan primerima koji slede koje ne treba uzeti kao limitirajuće.
PRIMERI
PRIMER 1
Priprema luciferaza-transfektovanih (Daudi-luc) ćelija
[0290] Kultura Daudi ćelija (koje potiču iz Burkittovog limfoma) je kultivisana u RPMI 1640 kultivacionom medijumu u koji je dodato 10% FCS (Optimum C241, Višent Inc., St. Bruno, KC, Kanada), 2 mM L-glutamina, 100 IU/ml penicilina, 100 mg/ml streptomicina, 1 mM natrijum piruvata (svi dobijeni od Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, Škotska). Medijum je obnavljan dva puta nedeljno. Pre transfekcije ćelije su podeljene i zasejane pri 1-15 x 106 ćelija/ml kako bi se obezbedilo optimalni rast.
Transfekcija luciferaze
[0291] 8.2 x 10<6>CD38<+>Daudi ćelija je uzeto iz 350 l RPMI (obogaćenog sa 10% dFCS, Gibco BRL) i prebačeno u kivetu za elektroporaciju (Biorad, Hemel Hempstead, Herts, UK). Zatim je dodato 40 μg gWIZ luciferaze iz GTS (Aldevron, Fargo, ND, SAD) i 10 μg pPur vektora (BD Biosciences, Alphen a/d Rijn, Holandija), koja obezbeđuje rezistenciju na puromicin. Nakon odlaganja ćelija na ledu tokom 10 minuta, ćelije su elektroporirane (250 V, 950 μF; Gene Pulser II, Biorad Laboratories GmbH, Minhen, Nemačka). Ćelije su ponovo ostavljene na ledu, i prebačene u 40 ml RPMI (obogaćenog sa 10% FCS). Nakon toga ćelije su stavljene u ploče za kulturu tkiva sa 96 bunarića (100 μl po bunariću). Nakon 48 sati, dodat je puromicin (finalna koncentracija: 1 μg/ml; Sigma-Aldrich Chemie BV, Zvijndrecht, Holandija). Klonovi rezistentni na puromicin dalje su rasli u pločama za kulturu tkiva sa 24 bunarića.
Određivanje aktivnosti luciferaze
[0292] Luciferazna aktivnost ćelija određena je korišćenjem sistema za ispitivanje luciferaze (# E4030, Promega, Madison, VI, Amerika).1x10<5>ćelija je centrifugirano (13.500 rpm, 1 min) u “eppendorf” centrifugi, a pelet je ispran u 100 μl PBS-u. Nakon centrifugiranja (13.500 rpm, 1 min), pelet je liziran sa 20 μl “Reporter Lysis” puferom (Promega), zamrznut i otopljen. Posle centrifugiranja (13.500 rpm, 1 min), 20 μl supernatanta je odliveno i dodato je 100 μl reagensa za ispitivanje luciferaze (u specijalnim luminometarskim epruvetama, Promega). Luminiscencija je izmerena (10 sek) u luminometru (LB9507, Berthold, Vilvoorde, Belgija).
PRIMER 2
Imunizacija miševa i generisanje hibridoma
Imunizacioni protocol za -003
[0293] HCo12 miševi su imunizirani svake dve nedelje sa 20 g prečišćenog HA-CD38. Prva imunizacija je izvedena i.p. (intraperitonalno) u prisustvu 100 μl PBS-a, pomešan sa 100 μl kompletnog Freundovog adjuvanta (CFA). Posle ove prve imunizacije, sledeća pojačanja (13x) sa prečišćenim HA-CD38 su izvedena u prisustvu 100 μl PBS, pomešanog sa 100 μl nekompletnog Freundovog adjuvanta (IFA) naizmenično s.c. (subkutano) i i.p. (intraperitonalno) Nakon razvoja titra, miševi su dozirani sa 20 μg HA-CD38 u PBS, i.v. (intravenozno).
Imunizacioni protokol za -005 i -024
[0294] HCo12 miševi su imunizirani svake dve nedelje sa 20 μg prečišćenog HA-CD38 naizmenično sa NIH-3T3-CD38 transfektovanim ćelijama. Prva imunizacija je izvedena sa 5 x 10<6>ćelija u 100 μl PBS-a, pomešanih sa 100 μl CFA, i.p., druga i naredne imunizacije sa HA-CD38 s.c., u prisustvu 100 μl PBS-a, pomešanih sa 100 μl IFA. Sledeće imunizacije sa transfektovanim ćelijama su izvedene u prisustvu 200 μl PBS-a. Nakon razvoja titra, miševi su dozirani sa 20 μg HA-CD38 u PBS-u, i.v.
Generisanje hibridoma koji proizvode humana monoklonska antitela na CD38
[0295] Mišji splenociti su izolovani iz HCo12 miševa i fuzionisani sa PEG-om u mišjoj mijelomskoj ćelijskoj liniji na osnovu standardnih protokola. Dobijeni hibridomi su zatim testirani na produkciju humanih antitela pomoću ELISA-e i za CD38 specifičnost pomoću humanih CD38-transfekovanih NS/0 ćelija korišćenjem FACS analize i rekombinantnog HA-CD38 vezivanja proteina pomoću ELISA-e. Izabrane su tri hibridomske ćelijske linije koje eksprimiraju humana monoklonska anti-CD38 antitela, -003, -005 i -024.
PRIMER 3
Transfekcija NIH ćelija sa CD38
[0296] Vektor (pclpuroCD38) za proizvodnju NIH-3T3-CD38 ćelija dobijen je od Prof. M. Glennie (Tenovus Research Laboratori, Southampton General Hospital, Southampton, UK). NIH-3T3 ćelije (DSMZ, ACC 59; 150,000 ćelija/bbunarić; 0.5 ml; ploče ravnog dna sa 96 bunarića, Greiner) su kultivisane u DMEM-u (obogaćen glukozom 4.5 g/l, 10% FCS, L-glutaminom, Na-piruvatom; BioVhittaker) tokom 24 h. Zatim su DNK (0.8 μg) i lipofektamin (Invitrogen, Breda, Holandija) razblaženi u DMEM-u i mešani (20 min, ST(sobna temperatura)).
Nakon toga, smeša (100 μl) je dodata u svaki bunarić i inkubirana (ON (preko noći), 37°C).
Skrining (pretraživanje) CD38 ekspresije
[0297] NIH-3T3-CD38 ćelije su isprane (u 1 ml PBS-u) i tripsinizovane (200 μl,
tripsin-EDTA, BioVhittaker). Zatim je dodato 1 ml DMEM-a i smeša je pipetirana u FACS epruvete. Posle centrifugiranja (1200 rpm, 5 min), ćelije su isprane u FACS puferu (FB; PBS, 0.05% BSA, 0.02% NaN3) i resuspendovane u 1 ml FP (fiziološki pufer). Posle centrifugiranja (1200 rpm (obrtaja po min), 5 min), supernatant je uklonjen i dodat je mišji anti-humani CD38-PE (razblaženje 1/50, Sankuin, Amsterdam, Holandija). Posle ispiranja ćelija dva puta u FP, ćelije su resuspendovane u FP za akviziciju protočnom citometrijom.
Proširenje i selekcija
[0298] Posle tretmana tripsinom, ćelije su prebačene u T25 boce (Greiner) u DMEM-u (obogaćenom glukozom 4.5 g/l, 2 mM L-glutaminom i puromicinom (2 μg/ml) BioWhittaker). Ćelije otporne na puromicin testirane su na stabilnu CD38 ekspresiju protočnom citometrijom nakon dve nedelje u medijumu koji sadrži puromicin. NIH-3T3-CD38 odabrane ćelije su subklonirane ograničavajućim razblaživanjem. Posle širenja (rasta) ovih ćelija, svih 15 NIH-3T3-CD38 klonova je pregledano na ekspresiju CD38. NIH-3T3-CD38 ćelije sa visokim CD38 su zamrznute u tečnom azotu (-80°C) do upotrebe.
Kultura NIH-3T3-CD38 ćelija
[0299] Ćelije su gajene u DMEM-u (obogaćenom glukozom (4.5 g/l), 10% FCS, 2 mM L-glutaminom, Na-piruvatom, penicilinom, streptomicinom). Ćelije su pasažirane (presejane) dva puta nedeljno upotrebom tripsin/EDTA i zasejanene u koncentraciji 1x10<6>ćelija/T75 posudi. NIH-3T3-CD38 ćelije sa visokim CD38 su zamrznute u tečnom azotu (-80°C) do upotrebe.
Prečišćavanje HA-CD38 antigena
[0300] Sefaroza 4B (Amersham Bioscience, Upsala, Švedska) je vezana sa anti-CD38 antitelom (Serotec, Okford, UK). Kolona (cevčica kolone HR5/20 je bila pakovana do visine od 12 cm, obim kolone 2.4 ml; maksimalna brzina protoka 0.5 ml/min) je ekvilibrisana sa najmanje 5 PBS zapremina kolone (ZK). Uzorak je filtriran i napunjen u kolonu. Kolona je isprana sa PBS-om dok se signal ne vrati na baznu liniju (približno 3 ZK). Elucija je izvršena sa 0.1 M glicinom na pH 2. Eluirane frakcije su neutralizovane sa 1% (v/v) 2 M Tris-HClom, pH 9.
Prečišćavanje anti-CD38 antitela
[0301] Humana anti-CD38 antitela su prečišćena iz supernatanata kulture tkiva. Prvo, supernatanti su filtrirani preko 0.20 M “dead-end” filtera. Zatim je supernatant nanet na 5 ml proteina A kolonu (rProtein A FF, Amersham Bioscience) i eluiran sa 0.1 M limunska kiselina-NaOH, pH 3. Eluat je odmah neutralizovan sa 2 M Tris-HCl-om, pH 9 i dijaliziran O/N (preko noći) sa 12.6 mM natrijum fosfata, 140 mM NaCl, pH 7.4 (B. Braun, Oss, Holandija). Nakon dijalize uzorci su sterilno filtrirani preko 0.20 μM “dead-end” filtera.
Prečišćavanje His-CD38 smeše (serije)
[0302] Protein je prisutan u supernatantu ćelijske kulture His-CD38-ekspresujućih ćelija pomoću DNK konstrukta koji sadrži sekvencu za ekstracelularni domen CD38. Dodatna poli-His-sekvenca je uključena u konstrukte i prisutna je na N-kraju proteina. Ovj dodatak omogućava prečišćavanje sa afinitetnom hromatografijom sa imobilizovanim metalom. U ovom procesu, helator fiksiran na hromatografskoj smoli se puni sa kationima Co<2+>. Posebno, sekvenca koja uključuje 6 histidinskih aminokiselina snažno vezuje Co<2+>. Zbog toga se His-obeleženi CD38 proteini snažno vezuju za takve kolone, dok će ostali proteini prisutni u supematantu prolaziti kroz kolonu ili će biti isprani. Snažno vezani His-obeleženi CD38 proteini se zatim eluiraju puferom koji sadrži imidazol, koji se takmiči za vezivanje His-a za Co<2+>. Kada se dovoljno His-CD38 prečisti, eluent se ukloni od proteina zamenom pufera na koloni za desalinizaciju.
PRIMER 4
Vezivanje -003, -005 i -024 za CD38-transfektovane CHO (CHO-CD38) ćelije, za Daudi-luc ćelije i za sveže tumorske ćelije multila mijeloma (MM)
[0303] Posle sakupljanja i brojanja, Daudi-luc ćelije, CHO ćelije transfektovane sa CD38 i kontrolne CHO ćelije su resuspendovane u PBS-u (1 x 10<6>ćelija/ml). Zatim su ćelije stavljene u V ploče sa 96 bunarića (100 μl/bunar) i isprane dva puta u PBS-BSA (PBS obogaćen sa 0.1% BSA i 0.02% Na-azidom). Nakon toga, 50 μl rastvora antitela u PBS-BSA je dodato ćelijama (4°C, 30 min). Nakon pranja tri puta u PBS-BSA, dodato je 50 μl (1:400 razblaženje) zečjeg anti-humanog IgG-FITC u PBS-BSA (4°C u mraku, 30 min). Ćelije su isprane tri puta i specifično vezivanje CD38-antitela za CHO-CD38 i Daudi-luc ćelije detektovano je protočnom citometrijom. HuMab-KLH (humano monoklonsko antitelo protiv KLH (Keyhole Limpet Haemocyanin) generisano od strane Genmab B.V., Utrecht, Holandija korišćenjem imunizacionih protokola koji su opisani ovde. Slike 1 i 2 pokazuju da se -003, -005 i -024 vežu za CHO-CD38 ćelije i Daudi-luc ćelije, iako sa različitim EC50(Tabela 1). Pokazano je da nema vezivanja za kontrolne CHO ćelije (podaci nisu prikazani).
[0304] Sveže MM tumorske ćelije dobijene su od Dr. Lokhorst (Univerzitetski medicinski centar Utreht, Utreht, Holandija). Tumorske ćelije su izolovane iz koštane srži pacijenata sa multiplom mijelomom pomoću Ficoll-a (Bio Vhittaker; gradijent za separaciju limfocita, cat. br. 17-829E). Posle sakupljanja i brojanja, MM ćelije (100,000 ćelija/bunarić) su resuspendovane sa 25 μl FITC-obeleženim CD38-specifičnim antitelima i 25 μl CD138.
Nakon inkubacije (4°C, 30 min), ćelije su isprane u PBS-BSA i PE-obeleženi kozji-anti-mišji IgG (1:200; Jackson ImmunoResearch Europe Ltd. Soham, UK) je dodat. Nakon inkubacije (4°C, 30 min) i ispiranja ćelija u PBS-BSA, merena je fluorescencija protočnom citometrijom.
[0305] Slika 1 pokazuje da se -003, -005 i-0024 vezuju za MM ćelije.
Tabela 1 - EC50 vrednosti vezivanja CD-38-atitela na CHO-CD38 ćelije, Daudi-luc ćelije i sveže MM tumorske ćelije
PRIMER 5
Antitelo-zavisna ćelijski posredovana citotoksičnost
[0306] Daudi-luc ćelije, sveže multipla mijeloma tumorske ćelije, sveže tumorske ćelije leukemije plazma ćelija i JK6L i AMO-1 ćelije multipla mijeloma su sakupljene (5x10<6>ćelija) u RPMI<++>(RPMI 1640 medijum za gajenje obogaćen sa 10% kosmičkog telećeg seruma (HiClone, Logan, UT, SAD), kome je dodato 100 μCi<51>Cr (Chromium-51; Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, Holandija), i smeša je inkubirana u vodenom kupatilu na 37°C tokom 1 h. Posle ispiranja ćelija (dva puta u PBS-u, 1500 rpm, 5 min), ćelije su resuspendovane u RPMI<++>i izbrojane isključivanjem trypan plavim. Ćelije su nanete u koncentraciji od 1x10<5>ćelija/ml.
Priprema efektorskih ćelija
[0307] Sveže mononuklearne ćelije periferne krvi (zdravi dobrovoljci, UMC Utrecht, Utrecht, Holandija) izolovane su iz 40 ml heparinske krvi pomoću Ficoll-a (Bio Whittaker; medijum za razdvajanje limfocita, cat.br. 17-829E) prema uputstvima proizvođača. Posle resuspendovanja ćelija u RPMI<++>, ćelije su izbrojane isključivanjem tripan plavim i nanete u koncentraciji od 1x10<7>ćelija/ml.
ADCC setovanja
[0308] 50 l<51>Cr -obeleženih ciljnih ćelija je pipetirano u ploče sa 96 bunarića, dodato je 50 μl antitela, razblaženih u RPMI<++>(finalna koncentracije 10, 1, 0.1, 0.01 g/ml). Ćelije su inkubirane (ST (sobna temperatura), 15 min) pa je dodato 50 μl efektorskih ćelija, što je rezultiralo odnosom efektor: target od 100: 1 (za određivanje maksimalne lize, dodato je 100 μl 5% Triton-Ks100 umesto efektorskih ćelija; za određivanje spontane lize, korišćene su 50 μl target ćelije i 100 μl RPMI<++>). Ćelije su centrifugirane (500 rpm, 5 min) i inkubirane (37°C, 5% CO2, 4 h). Posle centrifugiranja ćelija (1500 rpm, 5 min), 100 l supernatanta je sakupljeno u mikronske epruvete, i brojano u gama brojaču. Procenat specifičnog liziranja izračunat je na sledeći način:
(cpm uzorak-samo cpm target ćelije) / (cpm maksimalna liza - samo cpm target ćelije) gde je cpm brojan po minuti.
[0309] U Daudi-luc ćelijama (Slika 4 i Tabela 2) -003, -005 i -024 indukuju lizu pomoću ADCC, i -003, i -005 rade nešto bolje od rituksimaba (anti-CD20 mAb). Interesantno, takođe kada se koriste sveže multipla mijeloma tumorske ćelije (dobijene od dr. H. Lokhorsta, UMCU, Holandija) kao ciljne ćelije, ADCC se indukuje sa -003, -005 i -024 (Slika 5A i Tabela2).
Tabela 2 - EC50vrednosti CD38-specifičnih antitela dobijenih u ADCC
Obogaćivanje mononuklearnih ćelija ljudske periferne krvi Erlangen
[0310] Humana krv od volontera (Univerzitet Erlangen, Erlangen, Nemačka) razblažena je dva puta u RPMI 1640, a krvne ćelije su nanošene na Ficoll (medijum za razdvajanje limfocita 1077 g/ml, 710 g, ST, 20 min; BioVhittaker, Cambrek Bio Science Verviers, Verviers, Belgija, kat.br. 17-829E, lot br. 014832). Mononuklearne ćelije periferne krvi (MNCs) su sakupljene iz interfaze, isprane i resuspendovane u RPMI 1640 medijumu za kultivaciju obogaćenom sa 10% FCS, 2 mM L-glutamina, 5 U/ml penicilina, 50 μg/ml streptomicina (sve izvedeno iz BioVhittaker) u koje je dodat 25 mM HEPES (BioVhittaker).
ADCC setovanje II
[0311] Target B-ćelije (sveže tumorske ćelije plazma ćelijske leukemije, JK6L i AMO-1 B-ćelijske linije, dobijene od Dr. T.Valerius, Univerzitet u Erlangenu, Erlangen, Nemačka) obeležene su sa 20 μCi<51>Cr (Amersham Biosciences, Upsala, Švedska) 2 sata. Posle opsežnog pranja u RPMI-10, ćelije su podešene na 1x10<5>ćelija/ml. MNC (50 μl), senzibilisana antitela (50 μl) i RPMI-10 (50 μl) dodati su u mikrotitarske ploče sa okruglim dnom (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Nemačka). Testovi su započeti dodavanjem svežih tumorskih ćelije plazma ćelijske leukemije, JK6L ili AMO-1 ćelija (50 μl) do konačne zapremine od 200 μl. Korišćen je efektorski target (E:T) odnos od 40:1. Posle inkubacije (3 h, 3°C), eseji su zaustavljeni centrifugiranjem, a oslobađanje<51>Cr u triplikatu je mereno brojanjima u minuti (cpm) u scintilacionom brojaču. Procenat ćelijske citotoksičnosti izračunat je korišćenjem sledeće formule:
% specifična liza = (eksperimentalni cpm – bazalni cpm)/ (maksimalni cpm – bazalni cpm) x 100
sa maksimalnim oslobađanjem<51>Cr određenim dodavanjem perhlorne kiseline (3% finalne koncentracije) target ćelijama, a bazalno oslobađanje je mereno u odsustvu senzibilisanih antitela i efektorskih ćelija.
[0312] U obe linije ćelija sa multiplim mijelomom (tj. JK6L i AMO-1), liza je indukovana i sa -003 i -005 (slike 6 i 7), čak i kada je ekspresija CD38 niska (AMO-1 ćelijska linija).
[0313] -003, -005 i -024 indukuju ADCC primarnetumorske ćelije plazma ćelijske leukemije(Slika 5B).
PRIMER 6
Citotoksičnost zavisna od komplementa
[0314] Nakon sakupljanja i brojanja Daudi-luc ćelija, vitalnost ćelija treba da bude 90%. Posle ispiranja (PBS), ćelije su resuspendovane do 2.0x10<6>ćelija/ml u RPMI-B (RPMI obogaćen sa 1% BSA). Nakon toga, ćelije se prebacuju u ploče sa okruglim dnom sa 96 bunarića sa 1x10<5>ćelija/bunarić (50 µl/bunarčiću). Zatim se u bunariće doda 50 µl l antitela (konačna koncentracija u opsegu između 0-100 µg/ml (trostruka razblaženja u RPMI-B)). Nakon inkubacije (RT, 15 min), 11 µl sakupljenog humanog seruma (združenog od 18 zdravih donora) dodato je u svaki bunarić (37°C, 45 min). Bunarići su promešani jednom i 120 µl je preneto u FACS epruvete (Greiner). Zatim je u ovu suspenziju dodato 10 µl propidijum jodida (PI; Sigma-Aldrich Chemie B.V.) (rastvor 10 µg/ml). Liza je detektovana protočnom citometrijom (FACScalibur ™, Becton Dickinson, San Diego, CA, SAD) merenjem procenta mrtvih ćelija (odgovara PI-pozitivnim ćelijama).
[0315] Slika 8 i Tabela 2 pokazuju da se liza Daudi-luc ćelija indukuje sa -005 (∼60% maksimalne lize) i da se liza sa -003 vidi samo pri veoma visokim koncentracijama antitela. -024 ne indukuje CDC u Daudi ćelijama (podaci nisu prikazani). U CHO-CD38 ćelijama, liza je indukovana i sa -003, -005 i -024 (Slika 9 i Tabela 3). Liza sa -003 je indukovana pri višim koncentracijama. U tumorskim ćelijama (sve dobijeno od Dr. Lokhorst i Dr. Bloem,
[0316]Univerzitetski medicinski centar Utreht, Holandija), dobijenim od različitih MM pacijenata (A: 3% refraktornih tumorskih ćelija, B: 9% refraktornih tumorskih ćelija, C: 30-40% tumorskih ćelija, i D: 70% tumorskih ćelija), CDC posredovana liza je uočena u prisustvu -005, ali ne u prisustvu -003 (Slika 10). -024 takođe indukuje lizu MM ćelija tumora (Slika 10E).
Tabela 3 - EC50vrednosti CD38-specifičnih Tabela 3 - EC50vrednosti CD38-specifičnih antitela dobijenih u CDC
PRIMER 7
Unakrsne blok studije korišćenjem FACS-a
[0317] CHO-CD38 ćelije su inkubirane sa viškom neobeleženog CD38-specifičnog antitela (4°C, 15 min). Zatim su ćelije inkubirane sa FITC-obeleženim CD38-specifičnim antitelima (koncentracija je približno EC90, 4°C, 45 min). Posle dvostrukog ispiranja ćelija sa PBS-BSA, fluorescencija je merena protočnom citometrijom. Slika 11 prikazuje da neobeleženi -003 blokira vezivanje FITC-obeleženog -003, dok vezivanje FITC-obeleženog -005 nije blokirano. Takođe neobeleženi -005 blokira vezivanje FITC-obeleženog -005, dok vezivanje FITC- obeleženog -003 nije blokirano. -003 i -005 se vezuju za različite epitope, jer ne kompetiraju za vezivanje.
PRIMER 8
Unakrsne blok studije korišćenjem ELISA-e
[0318] Rastvorljivi humani CD38 je nanet na površinu ELISA ploče. Obloženi CD38 je inkubiran sa viškom neobeleženih CD38 specifičnih antitela oko 15 minuta i zatim su dodata biotinilisana CD38-specifična antitela (koncentracije približno EC90, ST, 1 sat). Posle trostrukog ispiranja sa PBS/Tween-om, dodat je streptavidin konjugovan sa peroksidazom rena (HRP) i smeša je inkubirana 1 sat na ST. Kompleks se može detektovati dodavanjem ABTS-rastvorom,a HRP posredovana supstratna konverzija merena korišćenjem ELISA čitača na OD 405 nm.
PRIMER 9
[0319] CD38 specifična antitela su naneta na površinu ELISA ploče. Antitela vezana na ploču su inkubirana biotinilovanim rastvorljivim CD38 u prisustvu viška CD38 specifičnih antitela u tečnoj fazi. Posle ispiranja sa PBS/Tween-om, vezani biotinilovani CD38 je detektovan sa HRP-konjugovanim streptavidinom tokom 1 h na ST. Ovaj kompleks se može detektovati dodavanjem ABTS-rastvora (nakon ispiranja sa PBS/Tween-om) i HRP posredovana konverzija supstrata merena korišćenjem ELISA čitača na OD 405 nm.
PRIMER 10
Reaktivnost sa panelom humanih tkiva i unakrsna reaktivnost sa tkivom makakija imunohistohemijom
[0320] Preseci zamrznutog ljudskog tkiva (dobijeni od Dr. H. Niessen, Free Universiti Medical Center, Amsterdam, Holandija) ili tkiva majmuna (Inveresk Research, Glasgov, Škotska) su izrezani na 6 μm i sušeni na vazduhu preko noći. Ovi kriostat preseci fiksirani su u acetonu (ST, 10 min) i osušeni na vazduhu (oko 5 min). Nakon toga, preseci su inkubirani sa 1 x limunskom kiselinom/fosfatnim puferom koji je sadržao 0.1% H202(pH 5.8; Sigma) da bi se blokirala endogena peroksidaza. Nakon 20 min na ST, preseci su isprani dva puta PBS-om i 0.05% Tween-20 (PBST, ST, 5 min; Riedel de-Haen, Nemačka). Zatim su preseci inkubirani sa avidinom (ST, 15 min; DAKO, Glostrup, Danska), isprani dva puta PBST-om, i inkubirani biotinom (ST, 15 min; DAKO) kako bi se blokirao endogeni biotin. Posle ispiranja preseka dva puta sa PBST, preseci su preinkubirani sa PBST<++>(PBST sa dodatkom 10% normalnog humanog seruma (NHS, CLB, Amsterdam, Holandija) i 10% normalnog kozjeg seruma (NGS; DAKO) (ST, 20 min). Posle upijanja preinkubacionog seruma, preseci su inkubirani sa FITC-obeleženim primarnim antitelom razblaženim u 2% PBST<++>u naznačenim koncentracijama (ST, 60 min). Nakon toga, preseci su inkubirani sa zečjim anti-FITC (1). : 1000; DAKO) u 2% PBST<++>(ST, 30 min) Posle ispiranja preseka sa PBST, preseci su inkubirani sa kozjim-anti-zečjim biotinom (1: 400; DAKO) u 2% PBST<++>(ST, 30 min) Nakon toga, preseci su isprani i inkubirani sa SABC-HRP (1:100; DAKO) u 2% PBST<++>(ST, 30 min). Nakon dvostrukog ispiranja preseka u PBST, oni su inkubirani (ST, 10 min) sa amino-etil-karbazol razvojnim rastvorom (50 mM acetatni pufer, pH 4.9, 0.01% H202; Riedel-de-Haen). Konačno, preseci su isprani u “milipore” H2O (5 min) i kontrastno bojeni hematoksilinom (DAKO). Upotrebom glicergela (37°C), preseci su fiksirani pokrivačima i proučavani svetlosnom mikroskopijom (Akiovision-2; Zeiss, Thornvood, NI, SAD).
[0321] Bronhijalni epitel je obojen sa -003 i -005 (Slike 12B i 13B) kao i poprečno prugasti mišić (miociti, Slike 12C i 13C), makrofagi, limfociti i plazma B ćelije (Slike 12A i 13A). -024 ima slično bojenje poprečno prugastog mišića i bronhijalnog epitela, ali je bojenje bilo manje intenzivno. Nije zabeleženo bojenje endotelnih ćelija, ni sa -003 (Slika 14D), -005 (14E) niti sa -024 (podaci nisu prikazani), dok je jasno bojenje primećeno sa pozitivnim kontrolnim antitelima na marker endotelnih ćelija CD31 (Slika 14A) i vVF (14B). Anti-KLH je korišćen kao negativno kontrolno antitelo (Slika 14C). -003 (Slika 12D) i -024 (podaci nisu prikazani), ali ne i -005 (Slika 13D) unakrsno reaguju sa limfoidnim tkivom makaki majmuna.
PRIMER 11
Unakrsna reaktivnost sa makaki i rezus majmunskim perifernim mononuklearnim krvinim ćelijama (PBMC) korišćenjem protočne citometrije
[0322] 5 ml periferne krvi makaki majmuna (Inveresk Research) je lizirano dodavanjem 4.5 ml šok pufera (1.7 mM NH4Cl, 1 mM EDTA), 40 ml H20 i 450 μl 10% KHCO3. Posle hemolize ćelije su centrifugirane (1200 rpm, 10 min) i isprane tri puta u PBS-u. Posle brojanja ćelija sa tripan plavim, ćelije su resuspendovane u PBS-BSA (1x10<6>ćelija /ml).
[0323] 17.5 ml periferne krvi rezus majmuna (BPRC, Rijsvijk, Holandija) je razblaženo 1:1 sa RPMI 1640 i nanošeno na Ficoll (1.077 g/ml; BioVhittaker, kat. br.17-829E, lot br. 014832). Posle centrifugiranja (710 g, ST, 20 min), interfaza je sakupljena i isprana dva puta u RPMI. Nakon poslednjeg ispiranja ćelije su resuspendovane u RPMI 1640 u koncentraciji od 1x10<5>ćelija/50 ml.
[0324] Ćelije su prebačene u ploču sa 96 bunarića (100,000 PBMC/bunarić), isprane u FACS puferu (PBS, 0.05% BSA, 0.02% NaN3) i inkubirane sa primarnim antitelima (4°C, 30 min). Posle ispiranja u PBS-BSA, dodato je 50 ml FITC-obeleženog rb-anti-hlgG (DAKO, Glostrup, Danska) (4°C, 30 min). Konačno, ćelije su sakupljene u FACS epruvetama u ukupnoj zapremini od 150 μl. Uzorci su mereni i analizirani pomoću FACScalibur ™ (Becton Dickinson, San Diego, CA, SAD).
[0325] Uz pomoć protočne citometrije prikazana je unakrsna reaktivnost sa -003 na makaka limfocitima (Slika 15A) i monocitima (Slika 15B), ali ne sa -005. Takođe u rezus majmuna, unakrsna reaktivnost sa -003 je uočena na mononuklearnim ćelijama, ali ne i sa -005 (Slika 15C).
PRIMER 12
Proširenje (internalizacija) eksperimenata
[0326] CHO-CD38 ćelije su obojene sa koncentracijom zasićenja FITC-označenih CD38-specifičnih antitela (na ledu, 30 min). Posle ispiranja ćelija (u RPMI1640 obogaćenom sa 10% FCS), jedan deo ćelija je zagrejan do 37°C, da bi se omogućila internalizacija, a drugi deo je ostavljen na ledu. U nekoliko vremenskih intervala (0-120 min) uzeti su alikvoti ćelija i prebačeni u ledeno hladan PBS-BSA da se zaustavi internalizacija. Posle ispiranja uzoraka dva puta sa PBS-BSA, EtBr (razblažen u PBS-BSA, konačne koncentracije 2 mg/ml) je dodat uzorcima da se smanji membranski vezan FITC.
Fluorescencija je merena protočnom citometrijom.
[0327] Slike 16A i 16B pokazuju da su -003 i -005 internalizovane sa CHO-CD38 ćelijama u toku 5 minuta na 37°C.
PRIMER 13
In vivo SCID-luciferaza eksperimenti
[0328] U ovom modelu tumorske ćelije su transfektovane sa luciferazom svica. Posle davanja luciferina (Molecular Probes, Leiden, Holandija) miševima, obeležene ćelije se mogu detektovati in vivo bioluminiscentnim isijavanjem pomoću visoko osetljive CCD kamere, up. Vettervald i saradnici, American Journal of Pathologi 160 (3), 1143-1153 (2002).
[0329] Daudi ćelije su transfektovane sa gWIZ luciferazom iz Gene Therapy Sistems (San Diego, CA) i gajene u RPMI sa 10% FCS, Pen/Strep, Natrijum piruvatom i 1 mg/ml puromicinom (Sigma). Ćelije su analizirane za ekspresiju luciferaze (izraženu u RLU/1x10<5>ćelija) u luminometru i za ekspresiju CD38 pomoću FACS-a. 2.5 x 10<6>luciferazatransfektovanih Daudi ćelija/miš je injekcirano i.v. u SCID miševe. Miševi su tretirani sa -003, -005, izotip kontrolnim antitelom (HuMab-KLH) ili rituksimabom (anti-CD20 antitelo). Antitela su injektirana intraperitonealno. Korišćena su četiri seta tretmana (videti Tabelu 4). U preventivnom setu, antitelo (100 μg/miš) i ćelije su davane istovremeno. U terapeutskom setu antitelo (300 μg/miš) je primenjeno 7 dana nakon davanja ćelija. U terapijskom setu II, antitelo (10 μg/miš) je primenjeno 14 dana nakon davanja ćelija. U terapeutskom setu III, antitelo (100 μg/miš) je primenjeno 7 dana nakon davanja ćelija. Za snimanje, miševi su anestezirani pomoću i.p. ubrizgavanjem smeše ketamin/ksilazin/atropin. Sintetički D-luciferin (natrijumova so, molekularne probe) je dat i.p. u dozi od 25 mg/ml. Miševi su zatim stavljeni u svetlu kutiju i posle 3 min, snimanje je započeto korišćenjem CCD detektora sa hlađenim tečnim azotom VersArrai 1300B (Roper Scientific). Fotoni emitovani iz luciferaze su prebrojani tokom perioda izlaganja od 5 min. Pod osvetljenjem su napravljene crno-bele slike za referencu. Za prikupljanje podataka i analizu slika korišćen je MetaVue softver (Universal Imaging Corp). Statistička značajnost razlika između grupa je utvrđena korišćenjem jednosmerne analize varijanse sa Nevman-Keuls post testom koristeći GraphPad PRISM verziju 3.02 (Graphpad Softvare Inc).
Tabela 4 – Setovanje tretmana za in vivo luciferaza eksperimente
[0330] Slike 17A i 17B pokazuju da -003 i -005 inhibiraju rast tumorskih ćelija u preventivnom setu i u terapeutskom setu, slično inhibiciji koja se vidi za anti-CD20 antitelo. Oba antitela imaju značajno bolje rezultate od izotip kontrolnog antitela. Takođe u terapijskom setu II CD38-antitela usporavaju rast Daudi-luc ćelija tumora (Slika 17C). U terapijskim setu III, -003 i -024 pokazuju jasnu inhibiciju rasta Daudi-luc tumorskih ćelija (Slika 17D).
PRIMER 14
Apoptoza
[0331] Apoptozni test je izveden prema uputstvima proizvođača (Aneksin-V apoptozni komplet, BD Biosciences, Alphen a.d. Rijn, Holandija). Ukratko, CD38 mAbs su dodati u 2.5 x 10<5>ćelija (Daudi ćelije transfektirane luciferazom, u 0.5 ml RPMI<++>u ploči sa 24 bunarića), u koncentraciji od 5 μg/ml -003 ili -005 ili anti-CD20 antitela samih ili u prisustvu unakrsno blokirajućih rb-anti-hIgG (50 g/ml).
[0332] Posle inkubacije (37°C, 5% C02, 20 h), ćelije su pažljivo sakupljene i isprane sa puferom za vezivanje (1200 rpm, 4°C, 5 min, BD Biosciences). Talozi je resuspendovana u 100 l pufera za vezivanje. Zatim je u suspenziju dodato 5 μl Annekin-V-FITC (BD Biosciences) i 10 μl PI (BD Biosciences) i inkubirano 15 minuta na ST. 400 μl pufera za vezivanje je dodato i uzorci su izmereni (očitavanje PI u FL2). Za analizu apoptotskih ćelija, sve aneksin-V-pozitivne ćelije su prebrojane protočnom citometrijom koristeći FACScalibur protočni citometar sa CellKuest pro softverom (BD Biosciences). Za analizu je prikupljeno najmanje 10.000 događaja. Ova populacija uključuje i PI-pozitivne kao i PI-negativne ćelije.
[0333] Slika 18 pokazuje da -003 i -005 ne indukuju apoptozu. Međutim, posle unakrsnog povezivanja, uočena je apoptoza target ćelija. -003 indukovao je apoptozu nakon unakrsnog povezivanja koja je bila slična apoptozi indukovanoj anti-CD20 antitelom (rituksimabom). -005 je bio manje sposoban da indukuje apoptozu nakon unakrsnog povezivanja. Slični rezultati su dobijeni sa RAMOS ćelijama kao target ćelijama (podaci nisu prikazani).
PRIMER 15
Uticaj -005 na B ćelije tkivog transplantata u RA-SCID modelu miša
[0334] SCID-miševi, soj CB-17/lcrCrl-SCID-bg, muški/ženski, 4-12 nedelja, kupljeni od Charles River Laboratories Nederland (Maastricht, Holandija) su držani u IVC kavezima pod standardnim uslovima temperature i svetlosti, i hranjeni laboratorijskom hranom i vodom ad libitum. Pre implantacije, miševi (tri miša u svakoj eksperimentalnoj grupi, dan 0) su anestezirani intraperitonealnom injekcijom ketamina (NIMATEK, EuroVet) i ksilazina (Rompun, Baier) u odnosu 1:1. Mali rez na koži napravljen je hirurškim makazama. Upaljeno sinovijalno tkivo pacijenta sa reumatoidnim artritisom koji je podvrgnut operaciji zglobne zamene implantirano je subkutano kao grupa od šest malih fragmenata (ukupno 2-3 mm<3>) na svakom boku miša. Rana je zatvorena pomoću Permacol cijanoakrilatnog lepka. Prvog dana eksperimenta analizirano je preostalo sinovijalno tkivo da bi se proverilo da li su B ćelije u upaljenim sinovijalnim transplantatima. -005 (12 mg/kg) ili kontrolno antitelo (anti-KLH, 30 mg/kg) je injekcirano (i.v.), u zapremini od 200 l na 8. dan eksperimenta. Na kraju eksperimenta (14. dan) miševi su žrtvovani inhalacijom CO2i sinovijalni transplantati su eksplanirani. Jedan od graftova je zamrznut u OCT jedinjenju (TissueTek, Sacura Finetek Europe) za dalju imunhistokemijsku analizu, a drugi je zamrznut potapanjem u tečni azot za dalju RNK analizu.
Imunohistohemija
[0335] 5 μM kriosekcije na preparatima SuperFrost (Menzel GmbH, Braunschveig) su pripremljene upotrebom LEICA CM1900 kriostata i čuvane na -80°C. Odmrznuti peseci su fiksirani u acetonu 10 min, osušeni na sobnoj temperaturi i isprani 3 x 5 min u PBS-u. Svi koraci su izvedeni na sobnoj temperaturi. Aktivnost endogene peroksidaze je blokirana inkubacijom sa PBS-om obogaćenim sa 0.3% vodonik peroksida i 0.1% natrijum azida tokom 20 min. Isečci su isprani 3 x 5 min u PBS-u i inkubirani sa 10% normalnog humanog seruma (NHS)/10% normalnog seruma zeca (NRbS) u PBS/1% BSA tokom 30 min. Sledeće, primarno antitelo (mišji mAb) razblaženo u PBS-u obogaćenom sa 1% BSA/10% NHS/10% NRbS je inkubirano 60 min. Nakon 3 x 2 min ispiranja u PBS-u, HRP-konjugat (kozji anti-mišji Ig-HRP; DAKO P0447) razblažen 1:50 u PBS-u (obogaćen sa 1% BSA/10% NHS/10% NRbS) je dodat tokom 30 minuta. Signal peroksidaze je poboljšan korišćenjem TSA™ Biotin sistema (Perkin Elmer Life Sciences, NEL700). Isečci su isprani 3 x 2 min u PBS-u i inkubira sa biotinil tiramidom razblaženim 1:1600 u amplifikacionom puferu 30 min. Posle 3 x 2 min ispiranja u PBS-u, streptavidin-HRP razblažen 1:400 u PBS-u (obogaćenom sa 1% BSA) je dodat 30 minuta. Isečci su isprani 3 x 2 min u PBS-u i inkubirani sa DAB rastvorom (DAKO Citomation K3465) tokom 5 min. Reakcija boje je zaustavljena destilovanom vodom. Konačno, pločice su obojene hematoksilinom (MERCK), oprane tekućom vodom i pokrivene Kaiserovim glicerinom i pokrivačima.
Bodovanje intenziteta bojenja
[0336] Ocenjivanje obojenih ksenografta sinovijalnog tkiva izvršeno je na slepom metodom od strane dve obučene osobe. Prvo je najjači isečak izabran iz niza sekcija i ovaj referentni isečak je dobilo maksimalni rezultat 8. Intenzitet bojenja u drugim isečcima je zatim ocenjen na skali od 0 do 8, u odnosu na referentni deo.
Statistička analiza
[0337] Ocenjivanje intenziteta bojenja analizirano je Kruskal-Vallisovim jednosmernim ANOVA-om, a zatim Dunnovim višestrukim uporednim testom pomoću Graph Pad Prism verzije 4.01 (Graph Pad softvare, Inc., San Diego, CA, SAD).
[0338] Slika 19 i Slika 21 pokazuju da se broj anti-CD38-pozitivnih plazma ćelija smanjuje nakon tretmana sa -005. Bojenje plazma ćelija sa anti-CD138 potvrđuje da -005 dovodi do smanjenog broja plazma ćelija (Slike 20 i 22).
PRIMER 16
Sekvenciranje kodirajuće sekvence humanih antitela protiv kodirajuće CD38
Priprema RNK
[0339] Ukupna RNK je pripremljena iz 5x10<6>ćelija ćelijskih linija hibridoma koje eksprimiraju monoklonsko antitelo -003,-005 i -024, respektivno, sa RNeasy kit-om (Kiagen, Vestburg, Leusden, Holandija) prema protokolu proizvođača.
cDNK priprema -003, -005 i -024
[0340] Od RNK, 5'-RACE-komplementarna DNK (cDNK) je pripremljena iz 100 ng ukupne RNK, korišćenjem kita za pojačavanje SMART RACE cDNA (Clontech), sledeći protokol proizvođača.
[0341] Oligonukleotidni prajmeri su sintetisani i kvantifikovani od strane Isogen Bioscience (Maarssen, Holandija). Prajmeri su rastvoreni u H20 do 100 pmol/ l i čuvani na -20°C. Rezime svih PCR i prajmera sekvenciranja je tabelirano prikazan (Tabela 5). Za PCR, PfuTurbo® Hotstart DNK polimeraza (Stratagene, Amsterdam, Holandija; proizvod # 600322) je korišćena u skladu sa uputstvima proizvođača. Svaka reakciona mešavina je sadržala 200 μM mešanih dNTP (Roche Diagnostics, Almere, Holandija; proizvod # 1814362), 12 pmol reverznog primera (RACEG1A1 za VH3003-005, RACEVHApal za VH3003-003 i RACEVLBsiVI za VL3003-003 i 005), 7.2 pmol UPM-Mik (UPM-Mik: 2μM ShortUPMH3 i 0.4 μM LongUPMH3), 0.6 μl 5'RACE cDNK templeta i 1.5 jedinica PfuTurbo® Hotstart DNK polimeraze u PCR reakcionom puferu (isporučen sa polimerazom) u ukupnoj zapremini od 30 μl. PCR reakcije su izvedene u TGradient Thermocicler 96 (Vhatman Biometra, Goettingen, Nemačka; proizvod # 050-801) korišćenjem 35 ciklusa programa: denaturisanje na 95°C tokom 2 min; 35 ciklusa od 95°C tokom 30 sekundi, 55°C u trajanju od 30 sekundi i 72°C tokom 1.5 min; završna ekstenzija na 72°C tokom 10 min. Po potrebi, PCR mešavine su čuvane na 4°C do dalje analize ili obrade.
Tabela 5 - Prajmeri
Kloniranje-003-2F5 VHi VLi -005 VLi -024 VHi VLu pGEMT-Vektor Sistem II
[0342] Produkti reakcije su odvojeni elektroforezom na 1% TAE agaroznom gelu i obojeni etidijum bromidom. Trake odgovarajuće veličine su izrezane iz gelova i DNK je izolovana iz agaroze korišćenjem Qiaexll gel extraction kit-a (Qiagen, cat no 20021).
[0343] PCR fragmenti izolovani iz gela su A –repovani pomoću inkubacije na 72°C 10 min sa 200 μM dATP i 2.5 jedinice Amplitaq-a (Perkin Elmer) i prečišćeni pomoću kolona za minieluciju (Qiagen). A-repni PCR fragmenti su klonirani u pGEMT easy vektor (Promega) korišćenjem vektorskog sistema i protokola pGEMT easy II (LJ270, strana 3/4). 2 μl mešavine za ligaciju je transformisano u OneShot DH5αT1<R>kompetentnu E. Coli (Invitrogen) i naneto na LB/Amp/IPTG/Xsgal ploče.
Sekvenciranje
[0344] V-regioni -003 i -024 kao i -005 VLregion su sekvencirani pomoću AGOWA (Berlin, Nemačka) nakon odabira 20 (VH-003), 16 (VL-003), 15 (VL-005) i 6 (VHi VL-024) belih kolonija, izolovanja plazmida i sekvenciranja sa M13 reverznim prajmerom. -005 VHregion je sekvenciran direktno iz PCR proizvoda korišćenjem HCsek5 prajmera. Sekvence su analizirane korišćenjem Vector NTI naprednog paketa (Invitrogen).
Generisanje ekspresionih vektora za antitelo -003, -005, -024 i Morphosys antitelo 3079
[0345] VHkodirajući region -003 je amplifikovan PCR-om iz pGemT plazmidnog klona koji sadrži VHregion -003, upotrebom prajmera VH3003-003for i RACEVHApal, uvodeći pogodna restrikciona mesta (Hindlll i Apal) za kloniranje u pConG1f0.4 (Lonza Biologics, Slough, UK) i idealnu Kozak sekvencu (GCCGCCACC). Vektor pConGlf0.4 sadrži postojani region teškog lanca humanog IgG1. VHPCR fragment je ubačen, u “frejm” (u okvir čitanja), u pConGlf0.4 vektor pomoću Hindlll i Apal. Konstrukt je proveren analizom sekvence.
[0346] VHkodirajući region -005 je umnožen PCR-om iz pGemT plazmidnog klona koji sadrži VHregion od -005, upotrebom prajmera VH3003-5for i RACEVHApaI, uvođenjem pogodnih restrikcionih mesta (Hindlll i Apal) za kloniranje u pConG1f0.4 i idealnu Kozakovu sekvencu. VHPCR fragment je ubačen, u okvir čitanja, u pConGlf0.4 vektor pomoću Hindlll i Apal. Konstrukt je proveren analizom sekvence.
[0347] VHkodirajući region -024 je amplifikovan PCR-om iz pGemT plazmidnog klona koji sadrži VHregion od -024, upotrebom prajmera VH300324ekfor i RACEVHApaI, uvođenjem pogodnih restrikcionih mesta (Hindlll i ApaI) za kloniranje u pConG1f0.4 i idealnu Kozak sekvencu. VHPCR fragment je ubačen, u okvir čitanja, u pConGlf0.4 vektor pomoću Hindlll i Apal. Konstrukt je proveren analizom sekvence.
[0348] VHkodirajući region Morphosys antitela 3079 je sintetisan od strane GeneArt (Regensburg, Nemačka), na osnovu podataka objavljenih u patentu WO 2005/103083 A2. Kodirajući region je bio kodon optimizovan za ekspresiju u HEK ćelijama kako bi se povećali nivoi ekspresije i pogodna mesta za restrikciju (Hindlll i Apal) za kloniranje u pConGlf0.4 i uvedena je idealna Kozak sekvenca. Plazmid koji je sadržao sintetisani VHregion je digeriran sa Apal i Hindlll i VHfragment je ubačen, u okvir čitanja, u pConGlf0.4 vektor.
[0349] VLkodirajući region -005 je amplifikovan PCR-om iz pGemT plazmidnog klona koji sadrži VLregion -005, korišćenjem primera VL3003-5ekfor i RACEVLBsiVI, uvođenjem pogodnih restrikcionih mesta (Hindlll i Pfl23II) za kloniranje u pConKappa0.4 (Lonza Biologics) i idealnu Kozak sekvencu. Vektor pConKappa0.4 sadrži postojani region kapa lakog lanca. VLPCR fragment je ubačen u okvir čitanja, u vektor pConKappa0.4 pomoću HindIII i Pfl23II. Konstrukt je proveren analizom sekvence.
[0350] VLkodirajući region -003 je amplifikovan PCR-om iz pGemT plazmidnog klona koji sadrži VLregion -003, korišćenjem primera VL3003-003for i RACEVLBsiWI, uvođenjem pogodnih restrikcionih mesta (Hindlll i Pfl23II) za kloniranje u pConKappa0.4 i idealnu Kozak sekvencu. VLPCR fragment je ubačen u okvir čitanja, u vektor pConKappa0.4 pomoću HindIII i Pfl23II. Konstrukt je proveren analizom sekvence.
[0351] VLkodirajući region -024 je amplifikovan PCR-om iz pGemT plazmidnog klona koji sadrži VLregion -024, upotrebom primera VL3003-24-5ekfor i RACEVLBsiWI, uvođenjem pogodnih restrikcionih mesta (Hindlll i Pfl23II) za kloniranje u pConKappa0.4 i idealnu Kozak sekvencu. VLPCR fragment je ubačen, u okvir čitanja, u pConKappa0.4 vektor pomoću Hindlll i Pfl23II. Konstrukt je proveren analizom sekvence.
[0352] VLkodirajući region Morphosys antitela 3079 je sintetisan od strane GeneArt, na osnovu podataka objavljenih u WO 2005/103083. Kodirajući region je kodon optimizovan za ekspresiju u HEK ćelijama; da bi se povećali nivoi ekspresije i pogodna restrikciona mesta (Hindlll i Pfl23II) za kloniranje u pConKappa0.4 i uvedena je idealna Kozak sekvenca. Plazmid, koji sadrži sintetisani VLregion, digeriran je sa Pfl23II i Hindlll i VH fragment je ubačen, u okvir čitanja, u pConKappa0.4 vektor.
[0353] Antitela su prolazno eksprimirana u HEK-293F ćelije, kao što je opisano u Primeru 17, kotransfektovanjem njihovih vektora teškog lanca i lakog lanca.
Generisanje stabilnih ćelijskih linija u CHO-K1SV ćelijama
[0354] Za generisanje stabilnih ćelijskih linija, vektori teškog i lakog lanca od -003 ili -005 su kombinovani u jednom dvostrukom genskom vektoru standardnim tehnikama kloniranja.
[0355] Dvostruki gen vektori -003 ili -005 su linearizovani i transfektovani u CHO-K1SV (Lonza Biologics) ćelije, u suštini kao što je opisano od strane proizvođača. Stabilne ćelijske linije su odabrane selekcijom sa 25 μM L-metionin sulfoksiminom (MSX) kao što je opisano u Lonza Biologics. Vrhunski proizvedeni klonovi su odabrani i propagirani u CD-CHO (Invitrogen) medijumu i antitela su prečišćena iz supernatanta ćelijske kulture kao što je opisano u Primeru 3.
PRIMER 17
Mapiranje epitopa korišćenjem mesto-dirigovane mutageneze
[0356] Oligonukleotidni prajmeri su sintetisani i kvantifikovani od strane Isogen Bioscience (Maarssen, Holandija). Prajmeri su rastvoreni u H20 do 100 pmol/μl i čuvani na -20°C. Sažetak svih PCR-ova i prajmera za sekvenciranje je prikazan u Tabeli 6. Za PCR, PfuTurbo® Hotstart DNA polimeraza (Stratagene, Amsterdam, Holandija) je korišćena u skladu sa uputstvima proizvođača. Svaka reakciona smeša je sadržala 200 μM mešanih dNTP (Roche Diagnostics, Almere, Holandija), 10 pmol oba, prednjeg i obrnutog primera, 100 ng genomske DNK ili 1 ng plazmidne DNK i 1 jedinicu PfuTurbo® Hotstart DNK polimeraze u PCR reakcionom puferu (isporučen sa polimerazom) u ukupnom zapremini od 20 μl. PCR reakcije su izvedene sa TGradient Thermocicler 96 (Vhatman Biometra, Goettingen, Nemačka) korišćenjem 32-ciklusnog programa: denaturisanje na 95°C tokom 2 min; 30 ciklusa od 95°C tokom 30 sekundi, gradijent 60-70°C (ili druga specifična temperatura “anilinga” (topljenja DNK)) tokom 30 sekundi i 72°C tokom 3 min; završna ekstenzija na 72°C tokom 10 min. Ako je prikladno, PCR smeše su skladištene na 4°C do dalje analize ili obrade.
[0357] Agarozna gel elektroforeza je izvedena u skladu sa Sambrook-om (Sambrook, Russell et al.2000) korišćenjem gelova od 50 ml, u 1 x Tris Acetat EDTA puferu. DNK je vizualizovana dodavanjem etidijum bromida u gel i posmatranjem pod UV svetlom. Slike sa gela su snimljene pomoću CCD kamere i sistema za analizu slike (GeneGnome; Singene, preko Vestburg B.V., Leusden, Holandija).
[0358] Prečišćavanje željenih PCR fragmenata je izvedeno upotrebom MinElute PCR Purification Kit-a (Qiagen, via Vestburg, Leusden, Holandija; proizvod # 28006), prema uputstvima proizvođača. Izolovana DNK je kvantifikovana pomoću UV spektroskopije (vidi dole) i kvalitet je procenjen pomoću agarozne gel elektroforeze.
[0359] Alternativno, PCR ili produkti digestije su odvojeni elektroforezom u agaroznom gelu (na primer, kada je bilo prisutno više fragmenata) korišćenjem 1% Tris Acetat EDTA agaroznog gela. Željeni fragment je isecan iz gela i regenerisan (ekstrahovan iz gela) korišćenjem QIAEX II Gel Extraction Kit-a (Qiagen; proizvod # 20051), prema uputstvima proizvođača.
[0360] Optička gustina nukleinskih kiselina je određena korišćenjem NanoDrop ND-1000 spektrofotometra (Isogen Life Science, Maarssen, Holandija) prema uputstvima proizvođača. Koncentracija DNK je merena analizom optičke gustine (OD) na 260 nm (jedna jedinica OD260nm= 50 μg/ml). Za sve uzorke, pufer u kome su rastvorene nukleinske kiseline je korišćen kao referenca.
[0361] Restrikcijski enzimi i suplementi dobijeni su od New England Biolabs-a (Beverli, MA, SAD) ili Fermetas-a (Vilnius, Litvanija) i korišćeni su u skladu sa uputstvima proizvođača. DNK (100 ng) je sečena (digerirana) sa 5 jedinica enzima u odgovarajućem puferu u konačnoj zapremini od 10 μl (reakcioni volumeni su povećani prema potrebi). Digestije su inkubirane na preporučenoj temperaturi najmanje 60 minuta. Za fragmente koji zahtevaju dvostruko sečenje sa restrikcionim enzimima koji uključuju nekompatibilne pufere ili temperaturne zahteve, digestije su izvršene sekvencijalno. Ako je neophodno, produkti digestije su prečišćeni elektroforezom u agaroznom gelu i ekstrakcijom iz gela.
[0362] Ligacije DNK fragmenata su izvedena sa Quick Ligation Kit-om (Nev England Biolabs) prema uputstvima proizvođača. Za svaku ligaciju, vektorska DNK je pomešana sa približno trostrukim molarnim viškom DNK za inserciju.
[0363] Plazmidna DNK (1-5 μl DNK rastvora, tipično 2 μl DNK ligacijske smeše) je transformisana u One Shot DH5α-T1<R>E. coli ćelije (Invitrogen, Breda, Holandija; proizvod # 12297-016) korišćenjem metode toplotnog šoka, prema uputstvima proizvođača. Sledeće, ćelije su nanete na Luria-Bertani (LB) agar ploče koje sadrže 50 μg/ml ampicilina. Ploče su inkubirane 16-18 h na 37°C sve dok bakterijske kolonije nisu postale vidljive.
[0364] Bakterijske kolonije su pregledane na prisustvo vektora koji sadrže željene sekvence pomoću PCR-a iz kolonije korišćenjem ThermoStart PCR Master Mix-a (Abgene, via Vetsburg, Leusden, Holandija; proizvod # AB-938-DC15/b) i prajmera pConGlsek1 i pEE13.4seqrev2 (Tabela 6). Odabrane kolonije su lagano dodirnute vrhom 20 μl pipete i kratko dotaknute sa 2 ml LB-a za kultivisanje na maloj skali, a zatim resuspendovane u PCR smeši. PCR je urađen u TGradient Thermocicler 96 korišćenjem 35-ciklusnog programa: denaturacija na 95°C tokom 15 min; 35 ciklusa od 94°C u trajanju od 30 sekundi, 55°C tokom 30 sekundi i 72°C tokom 2 min; zatim završni korak ekstenzije od 10 min na 72°C. Ako je prikladno, PCR smeše su skladištene na 4°C do analize pomoću elektroforeze u agaroznom gelu.
[0365] Plazmidna DNK je izolovana iz E. coli kultura upotrebom sledećih Qiagen kitova (via Westburg, Leusden, Holandija), u skladu sa uputstvima proizvođača. Za obimnu pripremu plazmida korišćen je (iz 50-150 ml kulture) ili HiSpeed Plasmid Maxi Kit (proizvod # 12663) ili HiSpeed Plasmid Midi Kit (proizvod # 12643). Za pripremu plazmida na maloj skali ( ± 2 ml kulture) korišćen je Qiaprep Spin Miniprep Kit (proizvod # 27106) i DNK je eluirana u 50 μl puferu za ispiranje (isporučen sa kitom (kompletom)).
Konstrukcija HA-CD38 ekspresionog vektora pEE13.4HACD38
[0366] Ekstracelularni domen humanog CD38 je amplifikovan iz plazmida pClpuroCD38 (dobijenog od prof. M. Glennie, Tenovus Research Laboratory, Southampton General Hospital, Southampton, UK) korišćenjem primera cd38forha i cd38ekrev. Ovom PCR reakcijom uveden je HA-tag. Ovaj PCR proizvod je korišćen kao šablon (templet) za drugu PCR reakciju sa prajmerima SPHMM38ek i cd38ekrev. Ovom PCR reakcijom, za optimalnu ekspresiju, uvedeni su signalni peptid SPHMM, restrikciona mesta i idealna Kozak sekvenca (GCCGCCACC). Nakon prečišćavanja, ovaj PCR fragment je kloniran u ekspresioni vektor pEE13.4 (Lonza Biologics) i kompletna kodirajuća sekvenca je potvrđena sekvenciranjem sa prajmerima pConKseq1, pEE13.4seqrev, cd38seq1for i cd38seq2rev (Tabela 6). Ovaj konstrukt je nazvan pEE13.4HACD38.
Mesto specifična mutageneza
[0367] Konstruisana su tri pojedinačna mutirana proteina huCD38, u kojima je T mutiran sa A na poziciji 237 (T237A, SEQ ID No:32), Q je mutiran u R na poziciji 272 (K272R, SEQ ID No:33), ili je S mutiran u F na poziciji 274 (S274F, SEQ ID No:34). Mesto specifična mutageneza je izvedena korištenjem QuickChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit-om (Stratagene, Amsterdam, Holandija) prema uputama proizvođača. Ova metoda uključuje uvođenje utišanog (silent) dodatnog restrikcionog mesta ili gubitak restrikcionog mesta na scenu za uspešnu mutagenezu (dodatno Xba1 mesto za T237A mutanta, dodatno Bcg1 mesto za K272R mutanta i gubitak Ssp1 mesta za S274F mutanta). Ukratko, 5 μl 10x reakcionog pufera, 1 μl oligonukleotida HACD38T237Afor2, HACD38K272Rfor ili HACD38S274Ffor (100 pmol/ l), 1 μl oligonukleotida HACD38T237Arev2, HACD38K272Rrev ili HACD38S274Frev (100 pmol/μl), 1 μl dNTP mix-a, 3 μl Quicksolution, 1 μl plazmida pEE13.4HACD38 (50 ng/μl) i 1 μl PfuUltra HF DNK polimeraze su pomešani u ukupnoj zapremini od 50 μl i amplifikovani sa TGradient Thermocicler 96 (Whatman Biometra, Goettingen, Nemačka; proizvod # 050-801) koristeći 18-ciklusnog programa: denaturacija na 95°C tokom 1 min; 18 ciklusa od 95°C u trajanju od 50 sekundi, 60°C u trajanju od 50 sekundi i 68°C tokom 10 minuta. PCR smeše su skladištene na 4°C do dalje obrade. Sledeće, PCR smeše su inkubirane sa 1 μl DpnI tokom 60 min na 37°C da se digerira (iseče) pEE13.4HACD38 WT vektor i skladištene na 4°C do dalje obrade. Reakciona smeša je istaložena sa 5 μl 3 M NaAc i 125 μl etanola, inkubirana 20 minuta na -20°C i oborena 20 minuta na 4°C na 14000xg. DNK talog je ispran sa 70% etanolom, osušen i rastvoren u 4 μl vode. Ukupno 4 μl reakcione zapremine je transformisano u One Shot Top 10DH5αT1<R>kompetentne E. coli ćelije (Invitrogen, Breda, Holandija) u skladu sa uputstvima proizvođača (Invitrogen). Sledeće, ćelije su nanete na Luria-Bertani (LB) agar ploče koje sadrže 50 μg/ml ampicilina. Ploče su inkubirane 16-18 h na 37°C sve do očigledne pojave bakterijskih kolonija. Kolonije su pregledane pomoću PCR-a upotrebom prajmera pConG1seq1 i pEE13.4seqrev2 (Tabela 5) i digerirane sa relevantnim restrikcionim enzimima da se potvrdi inkorporacija mutiranog oligonukleotida. 2 pozitivna klona od svakog mutanta su nagajena i izolovana je plazmidna DNK. Kompletna HACD38 kodirajuća sekvenca je određena korišćenjem prajmera cd38seq1for, pConG1seq1 i pEE13.4seqrev2 da bi se potvrdilo prisustvo mutacija i odsustvo dodatnih neželjenih mutacija.
DNK sekvenciranje
[0368] Uzorci plazmidne DNK su poslati u AGOWA (Berlin, Nemačka) na analizu sekvenci. Sekvence su analizirane pomoću naprednog Vector NTI softvera (Informak, Okford, UK).
Prelazna ekspresija u HEK-293F ćelijama
[0369] Freestile™ 293-F (HEK-293 subklon prilagođen za rast u suspenziji i hemijski definisanom Freestyle medijumu, (HEK-293F)) ćelije su dobijene od Invitrogen-a transfektovane su sa pEE13.4HACD38 i sa tri konstrukta koji nose mutacije T237A, K272R i S274F, prema protokolu proizvođača koristeći 293fectin (Invitrogen). Supernatanti kultura transfektovanih ćelija su korišćeni u ELISA testu za studije vezivanja anti-CD38.
Vezivanje Anti-CD38 antitela
[0370] ELISA ploče (Greiner, # 655092) su obložene O/N na 4°C sa 1 μg anti-HA antitelima (Sigma, # H-9658) je kasnije zaustavljene sa 2% pilećeg seruma. Supernatanti kulture transfektovanih HEK293F ćelija su razblaženi, dodati na ELISA ploče i inkubirani 1 sat na ST. Posle ispiranja, dodata su serijska razblaženja HuMabs -003 i -005 i inkubirana tokom 1 h na ST. Vezana antitela su detektovana sa HRP-konjugovanim kozjim-anti-humanim IgG antitelima. Esej je razvijen sa ABTS (Roche, # 1112597) i apsorbancija je merena na 405 nm korišćenjem spektrofotometra.
[0371] Kao što se može videti iz Slika 23A-23C, oba -003 i -005 se vezuju za wt humani CD38. Vezivanje -003 nije bilo pogođeno (nije bilo onemogućeno) uvođenjem mutacija T237A (Slika 23A), K272R (Slika 23B) ili S274F (Slika 23C). -005 je bio u stanju da veže CD38 sa mutacijom T237A (Slika 23A). Vezivanje -005 za CD38 sa mutacijom K272R bilo je pod velikim uticajem (pogođeno) (Slika 23B), kako u odnosu na EC50, tako i kod maksimalnog kapaciteta vezivanja. -005 nije bio u stanju da se veže za mutirani CD38 gde je serin na položaju 274 zamenjen fenilalaninom (Slika 23C).
[0372] Ovi podaci pokazuju da se -003 i -005 vezuju za različite epitope. Pored toga, ove su studije otkrile da je vezivanje -005 za CD38 osetljivo na mutacije na pozicijama 272 i 274. Naročito S274 je esencijalna za vezivanje -005 za CD38.
Tabela 6 prajmeri
PRIMER 18
Indukcija proliferacije PBMC
[0373] -003, -005 i -024 su testirani u eseju kako je suštinski opisano u Ausiello et al., Tissue antigens 56, 538-547 (2000). Ukratko, PBMC iz zdravih donora su kultivisani sa 1x10<5>ćelija/bunarić u pločama sa ravnim dnom ploča sa 96 bunarića u prisustvu antitela (konačna koncentracija: 1.1 - 3.3 - 10 - 30 μg/ml) u 200 μl RPMI<++>. Kao pozitivna kontrola korišćena je stimulacija ćelija sa IL-15 (333 ng/ml; Amgen Inc., Thousand Oaks, CA, SAD). Nakon 4-dnevne inkubacije na 37°C, dodato je 30 μl<3>H -timidina (16.7 μCi/ml) i gajenje je nastavljeno O/N.
Inkorporacija<3>H -timidina je procenjena korišćenjem Packard Cobra gama brojača (Packard Instruments, Meriden, DT, SAD), u skladu sa uputstvima proizvođača. Podaci su prikazani kao srednji cpm ( ± SEM) PBMC dobijenih od 10 donora. Rezultati pokazuju da -003 i -005 ne indukuju značajnu proliferaciju PBMC (Slika 24A). Takođe -024 nije izazvao značajnu proliferaciju PBMC (podaci nisu prikazani).
PRIMER 19
Indukcija IL-6
[0374] -003, -005 i -024 su testirani u eseju kao što je opisano u Ausiello et al., Tissue antigens 56, 538-547 (2000). Ukratko, PBMC su kultivisane na 1x10<6>ćelija/bunariću u 48-komornim pločama u prisustvu 20 μg/ml antitela i 10 ng/ml LPS-a (Sigma-Aldrich Chemie, Zvijndrecht, Holandija) u 500 l RPMI<++>. Posle inkubacije O/N na 37°C, supernatant je sakupljen i čuvan na -20°C. Koncentracija IL-6 je procenjena pomoću ELISA-e (IL-6 ELISA kit, U-CyTech Biosciences, Utrecht, Holandija) u skladu sa uputstvima proizvođača. Podaci su prikazani kao srednja koncentracija u pg/ml ( ± SEM) od 7 donora. Rezultati pokazuju da -003 i -005 ne izazivaju oslobađanje značajnih nivoa IL-6 (Slika 24B). Takođe -024 nije indukovao oslobađanje značajnih nivoa IL-6 (podaci nisu prikazani).
PRIMER 20
Indukcija oslobađanja IFN-γ
[0375] -003, -005 i -024 su testirani u eseju kao što je opisano u Ausiello et al., Tissue antigens 56, 538-547 (2000). Ukratko, PBMC su kultivisane na 1x10<6>ćelija/bunariću u 48-komornim pločama u prisustvu 20 μg/ml antitela i 1 μg/ml OKT-3 (Sanquin, Amsterdam, Holandija) u 500 μl RPMI<++>. Nakon inkubacije O/N na 37°C, supernatant je sakupljen i čuvan na -20°C. Koncentracija IFN-γ je procenjena pomoću ELISA-e (IFN- γ ELISA kit, U-CyTech Biosciences, Utrecht, Holandija) u skladu sa uputstvima proizvođača. Podaci su prikazani kao srednja koncentracija u pg/ml (6 ± SEM) od 9 donora. Rezultati pokazuju da -003 i -005 ne indukuju oslobađanje detektabilnog nivoa IFN- γ (Slika 24C). Takođe -024 nije indukovao oslobađanje značajnih nivoa IFN- γ (podaci nisu prikazani).
PRIMER 21
Afinitet vezivanja -003 i -005 za rekombinantni CD38
[0376] Vezivanje -003 i -005 za CD38 je testirano korišćenjem površinske plazmonske rezonance. Ukratko, prečišćena antitela su imobilisana na CM-5 senzorskom čipu (Biacore, Uppsala, Švedska) preko anime vezivanja. HA-obeleženi CD38 (vidi Primer 3) je preliven, a vezivanje antigena za mAb je detektovano promenom indeksa refrakcije na površini čipa pomoću Biacore 3000 (Biacore). Konstante asocijacije i brzine za -003 (Tabela 7) i -005 (Tabela 8) su sumirane u nastavku, srednja vrednost 3 eksperimenta ± SD, i pokazuju da i -003 i -005 imaju visok afinitet za CD38.
Tabela 7 – Konstante asocijacije i brzine na 25°C
003
ka(1/Ms) 2.17x10<5>± 2.65x104
kd(1/s) 1.9x10<-4>± -6
4.51x10
1.14x10<9>± 8
KA(1/M) 1.58x10
KD(M) 8.85x10<-10>± 1.2x10<-10>
Tabela 8 – Konstante asocijacije i brzine na 25°C
005
ka(1/Ms) 8.88x10<4>± 1.95x10<4>
kd(1/s) 5.22x10<-4>± 1.16x10<-5>
KA(1/M) 1.7x10<8>±3.68x10<7>
KD(M) 6.06x10<-9>± 1.21x10<-9>
PRIMER 22
Mapiranje epitope
Mapiranje epitopa korišćenjem PEPSCAN metode
[0377] Prema poznatim procedurama (Geysen et al. 1984. Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid. Proc Natl Acad Sci USA 81:3998; Slootstra et al. 1996. Structural aspects of antibody-antigen interaction revealed through small random peptide libraries. Mol Divers 1:87; Puijk et al. 2001. Segment synthesis. In PCT, The Netherlands, p.1.), preklapajuće 20-merne linearne i 15-merne peptidne petlje su sintetisane pokrivajući 138 aminokiselina na C-kraju humanog CD38. Štaviše, na osnovu sekvence na C-terminusu pojedinačnih peptidnih petlji napravljeni su peptidi različitih veličina koji su pokrivali region KNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI, region CVHNLQPEKVQTLEAWVIHGG i region CLESIISKRNIQFSAKNIYRC. Pored toga, dizajnirani su ekstra setovi da rekonstruišu regione sa dvostrukom petljom sastavljeni od SKRNIQFSCKNIYR i EKVQTLEAWVIHGG. Prirodni cisteini su zamenjeni alaninima. Peptidi su pregledani u ELISA eseju koristeći mini-PEPSCAN kartice u formatu kreditne kartice.
Sinteza peptide
[0378] Peptidi su sintetisani korišćenjem standardne Fmoc-hemije i deprotektovani korišćenjem TFA sa čistačima (sakupljačima). Nakon toga, deprotektovani peptidi su stavljeni u reakciju na “microarray”-u sa 0.5 mM rastvorom 2,6-bis (bromometil)piridina ili 2,4,6-tris (bromometil) mezitilena u amonijum bikarbonatu (20 mM, pH 7.9), obogaćenim acetonitrilom (1:1 [zapremina/ zapremina]). “Microarray”-i su pažljivo klackani u rastvoru 30-60 min, dok nisu potpuno prekriveni u rastvoru. Najzad, “microarray”-i su oprani intenzivno sa viškom Millipore H2O i sonificirani u puferu za narušavanje (razaranje) koji sadrži 1% natrijum dodecilsulfata, 0.1% β-merkaptoetanola, u PBS-u (pH 7.2) na 70°C u trajanju od 30 min, praćeno sonikacijom u milipore H2O još 45 min.
PEPSCAN ELISA-esej
[0379] Polietilenske kartice sa 455-bunarića formata kreditne kartice, koje sadrže kovalentno vezane peptide, inkubirane su sa serumom (npr. razblaženje 1:1000 u rastvoru za blokiranje koji sadrži 5% konjskog seruma [zapremina/zapremina] i 5% ovalbumina [težina/zapremina]) (4°C, preko noći). Posle ispiranja, peptidi su inkubirani sa zečjom-anti-humanom Ig peroksidazom (razblaženje 1:1000, 25°C, 1 sat), i nakon ispiranja dodat je supstrat peroksidaze (2,2'-azino-di-3-etilbenztiazolin sulfonat i 2 μl/ml 3% H2O2). Posle jednog sata, razvoj boje je meren pomoću CCD-kamere i sistema za obradu slike. Podešavanje se sastoji od CCD-kamere sa objektivom od 55 mm (Sony CCD kamera KSC-77RR, Nikon mikro-nikkor 55 mm f/2.8 objektiv), adaptera za fotoaparat (Sony Camera adapter DC-77RR) i Softverski paket Optimas za obradu slike, verzija 6.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD 20910, SAD; Optimas radi na kompjuterskom sistemu pentium II).
Metod za prezentaciju (predstavljanje) epitope
[0380] Pojedinačne aminokiseline su identifikovane dipeptidnim motivima koji predstavljaju najmanje jedinstvene jedinice u humanoj CD38 aminokiselinskoj sekvenci. Svi motivi dipeptida prisutni u svakom od 1164 testiranih peptida su dobili ELISA vrednost dobijenu za odgovarajući ceo peptid. Da bi se dipeptidni motivi rangirali od jakog do lošeg vezivanja, relativni signal je izračunat deljenjem vrednosti ELISA-e dobijene za svaki pojedinačni motiv sa prosečnom ELISA vrednošću od svih 1164 testiranih linearnih i peptide sa petljom, i oni su sortirani ka smanjenim vrednostima. Na ovaj način, razmatrani su doprinosi amino kiselina konformacionim epitopima. Za svaki od testiranih mAb, svi dipeptidni motivi bodovani iznad 2.5 (tj. ELISA vrednosti peptida koji sadrže ove motive bili su najmanje 2.5 puta prosečne ELISA vrednosti onih dobijenih sa svih 1164 peptida) su odabrani. Podaci su dekonvoluirani u pojedinačne doprinose aminokiselina koji su predstavljeni na linearnoj CD38 sekvenci pomoću sistema bodovanja. Pretraživanjem linearne sekvence CD38 i korišćenjem jedinstvenih dipeptidnih jedinica kao referentne tačke, dodeljena je jedna tačka svaki put kada je CD38 aminokiselina bila prisutna u ovom setu visoko vrednovanih peptida.
[0381] Nađeno je da se svi -003, 005 i -024 vezuju za regione SKRNIQFSCKNIYR i EKVQTLEAWVIHGG humanog CD38. -003 posebno prepoznaje motive RNIQF i WVIH, -005 posebno prepoznaje motive KRN i VQTL.
PRIMER 23
Enzimatska aktivnost
[0382] Enzimatska aktivnost humanog CD38 merena je u eseju koji je u osnovi opisan u Graeff et al., J. Biol. Chem. 269, 30260-30267 (1994). Ukratko, supstrat NGD<+>(80 μM) je inkubiran sa CD38 (0.6 μg/ml His-obeleženog ekstracelularnog domena humanog CD38, vidi Primer 3 u vezi prečišćavanja His-CD38) u puferu koji sadrži 20 mM Tris-HCl, pH 7.0. Proizvodnja cGDPR se može pratiti spektrofotometrijski na talasnoj dužini emisije od 410 nm (ekscitacija na 300 nm). U ovom primeru korišćen je ekscitacioni filter od 340 ± 60 nm i emisioni filter od 430 ± 8 nm.
[0383] Da bi se testirao efekat -003, -005 i -024 na enzimsku aktivnost CD38, rekombinantni His-CD38 protein je prethodno inkubiran 15 min na sobnoj temperaturi sa različitim koncentracijama (30, 3, 0.3 i 0.03 µg/ml) različitih antitela pre dodavanja supstrata NGD<+>. Proizvodnja ciklične GDP-riboze (cGDPR) zabeležena je u različitim vremenskim tačkama nakon dodavanja antitela (3, 6, 9, 12, 30, 45, 60, 75 i 90 min).
[0384] Slika 25B pokazuje da -005 ima izražen inhibitorni efekat na proizvodnju cGDPR. Nakon 90 minuta, dodavanje -005 od 30 i 3 μg/ml rezultiralo je smanjenjem proizvodnje cGDPR od 32% i 34% (Tabela 9). Slični rezultati su uočeni u nezavisnim eksperimentima koristeći različite serije -005.
[0385] Nije zabeležen inhibitorni efekat na produkciju cGPDR nakon dodatka -003 (Slika 25B, Tabela 9), -024 (Slika 25D, Tabela 9) ili anti-KLH (Slika 25A, Tabela 9).
[0386] Na osnovu ovih nalaza takođe se očekuje da -005 inhibira sintezu ciklične ADP-riboze (cADPR) iz NAD<+>. Inhibicija sinteze cADPR može se odrediti pomoću HPLC metode opisane u Munshi et al., J. Biol. Chem.275, 21566-21571 (2000).
Tabela 9. Produkcija cGDPriboze u prisustvu CD38-specifičnih antitela
PRIMER 24
Poređenje -003 i -005 sa Morphosys antitelom 3079.
[0387] Antitela -003 i -005 su funkcionalno upoređena sa Morphosys antitelom 3079 (TH-3079). Postupci za kloniranje i ekspresiju Morphosys antitela TH-3079 opisani su u Primeru 16. Postupci za CDC su opisani u Primeru 6. Metode za ADCC su opisane u Primeru 5. Slika 26A pokazuje da -005 i -003 i TH-3079 indukuju CDC-posredovanu lizu CD38-transfektovanih CHO ćelija, sa sličnom maksimalnom lizom. Kada se uporede vrednosti EC50, -005 antitelo je bolje nego TH3079 u indukciji lize CHO-CD38 ćelija, sa 2 puta nižom EC50(vidi Tabelu 10).
[0388] Slika 26B pokazuje da je -005 superiorniji od TH-3079 u indukciji CDC-posredovane lize Daudi-luciferaznih ćelija, sa maksimalnom lizom od strane -005 koja je 2-3 puta veća nego TH3079. Kada se EC50vrednosti uporede, -005 antitelo je slično sa TH-3079 u indukovanju lize Daudi-luciferaznih ćelija (videti Tabelu 10). -003 ne indukuje značajno CDC-posredovanu lizu Daudi-luciferaznih ćelija.
[0389] Slika 26C pokazuje da u ovom eksperimentu -005, -003 i TH-3079 posreduju u lizi Daudi target ćelija preko ADCC. Nije nađena razlika u (log) EC50i maksimalnoj lizi (Tabela 11, n = 5).
Tabela 10. Maximalna liza i EC50vrednosti CD38-specifičnih antitela u CDC.
Tabela 11. Maximalna liza i EC50vrednosti CD38-specifičnih antitela u ADCC.
PRIMER 25
Inhibicija ćelijski eksprimirane CD38 enzimske aktivnosti
[0390] Enzimska aktivnost ćelijski eksprimiranog humanog CD38 merena je u eseju koji je, u osnovi, opisan u Graeff et al., J. Biol. Chem.269, 30260-30267 (1994). Ukratko, supstrat NGD (80 μM) je inkubiran sa 10<5>CHO ćelija transfektovanih humanim CD38 (CHO-CD38 ćelijama) u puferu koji sadrži 20 mM Tris-HCI, pH 7.0 obogaćenim sa 30 μg/ml IgG1. Proizvodnja cGDPR se može pratiti spektrofotometrijski na talasnoj dužini emisije od 410 nm (ekscitacija na 300 nm). U ovom primeru korišćen je ekscitacioni filter od 340 ± 60 nm i emisioni filter od 430 ± 8 nm.
[0391] Da bi se testirao efekat -005 i -003 na enzimsku aktivnost ćelijski ekspresionog CD38, CHO-CD38 ćelije su prethodno inkubirane u 15' na sobnoj temperaturi sa različitim koncentracijama (30, 3, 0.3 i 0.03 μg/ml) različitih antitela pre dodavanja supstrata NGD. Proizvodnja cGDPR je zabeležena u različitim vremenskim tačkama nakon dodavanja supstrata NGD (3, 6, 9, 12, 30, 45, 60, 112 i 156 min).
[0392] Posle 156 minuta, dodavanje 30 i 3 μg/ml -005 rezultiralo je smanjenjem produkcije cGDPR od 21% i 18%. Nikakav inhibitorni efekat na proizvodnju cGPDR nije primećen nakon dodavanja -003 ili IgG1 kontrolnog antitela (Tabela 12).
Table 12. Produkcija cGDPriboze u prisustvu CD38-specifičnih antitela ili IgG1 kontrole.
PRIMER 26
Vezivanje antitela -005 za EBV transformisane B ćelije šimpanze
[0393] Nakon sakupljanja i brojanja, EBV transformisane B ćelije šimpanze (dobijene od Biomedical Centra za istraživanje primata, Odeljenje imunobiologije, Rijswijk, Holandija) su resuspendovane (1 x 10<6>ćelija/ml) u PBS-BSA (PBS obogaćen sa 0.1% BSA i 0.02% Naazidom). Zatim su ćelije stavljene u ploče sa 96 bunarića sa V-dnom (100 μl/bunariću) i isprane dva puta u PBS-BSA. Posle toga, u ćelije je dodato 50 μl rastvora FITC-obeleženog -005 antitela u PBS-BSA (4°C, 30 min). Ćelije su isprane tri puta i specifično vezivanje -005 za EBV transformisane B ćelije šimpanze je detektovano protočnom citometrijom. FITC obeleženo HuMab-KLH (humano monoklonsko antitelo na KLH (keyhole limpet haemocyanin) generisano od strane Genmab B.V., Utrecht, Holandija korišćenjem imunizacionih protokola opisanih ovde) korišćeno je kao kontrola. Slika 27 prikazuje dozno zavisno vezivanje -005 za EBV transformisane B ćelije šimpanze. Nije zabeleženo dozno vezivanje za EBV transformisane B ćelije šimpanze sa kontrolnim antitelom HuMab-KLH.
PRIMER 27
In vitro kombinovana terapija antitela -005 sa deksametazonom i bortezomibom
[0394] Antitelo -005 je testirano na njegovu sposobnost da indukuje ćelijsku smrt multipla mijeloma ćelijske linije UM6 in vitro podešavanjem trostruke kombinacije sa Deksametazonom (Dex) i Bortezomibom (Bor; Velcade®). Ishod trostrukog tretmana je upoređen sa pojedinačnim lekovima i dvostrukim kombinovanim tretmanima.
[0395] 3x10<5>UM6 ćelije su inkubirane preko noći na 37°C samo sa medijumom, sa Dexom (20 μM), sa Bor-om (15 pM) ili sa kombinacijom Bor-a i Dex-a. Posle 23 sata, dodat je -005 (10 g/ml), a 15 minuta nakon toga je dodat normalan humani serum i uzorci su inkubirani još 45 minuta na 37°C. Finalno, dodato je 10 μl propidijum jodida (PI; Sigma-Aldrich Chemie BV; 10 μg/ml), a liziranje ćelija je detektovano protočnom citometrijom korišćenjem FACS Calibur™ (Becton Dickinson) merenjem procenta PI-pozitivnih ćelija.
[0396] Kao što se može videti na Slici 28, trostruko lečenje je premašilo lizu koja je primećena sa bilo kojim od pojedinačnih ili dvostrukih kombinovanih tretmana. Ovaj efekat je primećen u dva nezavisna eksperimenta.
PRIMER 28
[0397] Pacijenti sa kliničkom dijagnozom multipla mijelome tretirani su kombinacijom anti-CD38 antitela-005, melfalanom i prednizonom.
[0398] Jedinjenja su data pacijentima prema sledećem rasporedu doziranja:
- antitelo -005: 8 mg/kg dato jednom nedeljno tokom 4 nedelje (IV)
- melfalan: 0.2 mg/kg po danu IV 4 dana svakih 4-6 nedelja
- prednizon: 2 mg/kg PO 4 dana svakih 4-6 nedelja
[0399] Odgovor je determinisan smanjenjem M-proteina u serumu, smanjenjem broja plazma ćelija u koštanoj srži i smanjenjem Benze-Jones proteina u urinu i redukciji/odsustvu novih osteolitičnih koštanih lezija.
PRIMER 29
[0400] Pacijenti sa kliničkom dijagnozom multipla mijelome tretirani se kombinacijom anti-CD38 antitela -005, talidomidom i deksametazonom.
[0401] Jedinjenja su data pacijentima prema sledećem rasporedu doziranja:
<->antitelo -005: 8 mg/kg dato jednom nedeljno tokom 4 nedelje (IV)
<->talidomid: 200 mg/dan (PO)
<->deksametazon: 40 mg/dan na dan 1- 4, 9-12 i 17-20 svakih 28 dana ciklusa (PO)
[0402] Odgovor je determinisan smanjenjem M-proteina u serumu, smanjenjem broja plazma ćelija u koštanoj srži i smanjenjem Benze-Jones proteina u urinu i redukciji/odsustvu novih osteolitičnih koštanih lezija.
PRIMER 30
[0403] Pacijenti sa kliničkom dijagnozom multipla mijelome tretirani se kombinacijom anti-CD38 antitela -005, lenalidomidom i deksametazonom.
[0404] Jedinjenja su data pacijentima prema sledećem rasporedu doziranja:
<->antitelo -005: 8 mg/kg dato jednom nedeljno tokom 4 nedelje (IV)
<->lenalidomid: 25 mg/dan (PO)
<->deksametazon: 40 mg/dan na dan 1-4, 9-12 i 17-20 svakih 28 dana ciklusa (PO)
[0405] Odgovor je determinisan smanjenjem M-proteina u serumu, smanjenjem broja plazma ćelija u koštanoj srži i smanjenjem Benze-Jones proteina u urinu i redukciji/odsustvu novih osteolitičnih koštanih lezija.
PRIMER 31
[0406] Pacijenti sa kliničkom dijagnozom multipla mijelome tretirani se kombinacijom anti-CD38 antitela -005, bortezomibom i deksametazonom.
[0407] Jedinjenja su data pacijentima prema sledećem rasporedu doziranja:
<->antitelo -005: 8 mg/kg dato jednom nedeljno tokom 4 nedelje (IV
<2>
<->bortezomib: 1.3 mg/m na dan 1, 4, 6 i 11, svakih 21 dan ciklusa (IV)
<->deksametazon: 40 mg/dan na dan 1-4, 9-12 i 17-20 svakih 28 dana ciklusa (PO) Odgovor je determinisan smanjenjem M-proteina u serumu, smanjenjem broja plazma ćelija u koštanoj srži i smanjenjem Benze-Jones proteina u urinu i redukciji/odsustvu novih osteolitičnih koštanih lezija.

Claims (25)

Patentni zahtevi
1. Humano IgG1 izotip antitelo koje vezuje CD38 za upotrebu u tretmanima kancera pri čemu je antitelo za administraciju, ili da se administrira u kombinovanoj terapiji sa najmanje jednim kortikosteroidom, pri čemu najmanje jedan kortikosteroid obuhvata glukokortikoid, i najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens, pri čemu pomenuti najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata (i) talidomid ili analog talidomida i/ili (ii) inhibitor proteozoma, i pri čemu pomenuto antitelo obuhvata varijabilne regione humanog lakog lanaca i humanog teškog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca obuhvata VLCDR1 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:13, VLCDR2 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:14 i VLCDR3 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:15, i varijabilni region teškog lanca koji obuhvata VHCDR1 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:18, VHCDR2 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:19 i VHCDR3 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:20.
2. Antitelo za upotrebu na osnovu patentnog zahteva 1, pri čemu nakon pomenutog tretmana sledi autologna transplantacija perifernih stem ćelija ili koštane srži.
3. Antitelo za upotrebu na osnovu patentnog zahteva 1 ili 2, pri čemu najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens dalje obuhvata citotoksični agens i/ili inhibitor angiogeneze.
4. Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kojih prethodnih patentnih zahteva, pri čemu najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens dalje obuhvata alkilirajući agens.
5. Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kojih prethodnih patentnih zahteva, pri čemu najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens dalje obuhvata jedan ili više agenasa koji su odabrani iz grupe koja se sastoji od: melfalana, mehloretamina, tioepa, hlorambucila, karmustina, lomustina, ciklofosfamida, busulfana, dibromomanitola, streptozotocina, dakarbazina, prokarbazina, mitomicina C, cisplatine i drugih derivate platine.
6. Antitelo za upotrebu na osnovu patentnog zahteva 5, pri čemu pomenuti derivat platine je karboplatina.
7. Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kojih prethodnih patentnih zahteva, pri čemu pomenuti najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata analog talidomida koji je lenalidomid ili CC4047.
8. Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kojih prethodnih patentnih zahteva, pri čemu pomenuti najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata inhibitor proteozoma koji je bortezomib.
9. Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kojih prethodnih patentnih zahteva, pri čemu pomenuti najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens dalje obuhvata vinka alkaloid.
10. Antitelo za upotrebu na osnovu patentnog zahteva 9, pri čemu je vinka alkaloid vinkristin.
11. Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kojih prethodnih patentnih zahteva, pri čemu pomenuti najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens dalje obuhvata antraciklin.
12. Antitelo za upotrebu na osnovu patentnog zahteva 11, pri čemu je antraciklin doksorubicin.
13. Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kojih prethodnih patentnih zahteva, pri čemu pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata prednizon.
14. Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kojih prethodnih patentnih zahteva, pri čemu:
(a) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata prednizon i pomenuti najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata talidomid;
(b) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata prednizon i pomenuti najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata bortezomib; ili
(c) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata prednizon i pomenuti najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata bortezomib i dalje obuhvata melfalan.
15. Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kojih prethodnih patentnih zahteva, pri čemu pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata prednizon i pomenuti najmanje jedan nekortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata melfalan i talidomid.
16. Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kojih prethodnih patentnih zahteva, pri čemu pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon.
17. Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kojih prethodnih patentnih zahteva, pri čemu:
(a) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon i pomenuti najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata talidomid i/ili lenalidomid; (b) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon i pomenuti najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata CC4047;
(c) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon i pomenuti najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata bortezomib;
(d) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon i pomenuti najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata lenalidomid i dalje obuhvata bortezomib; ili
(e) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon i pomenuti najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata talidomid i dalje obuhvata bortezomib.
18. Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kojih prethodnih patentnih zahteva, pri čemu pomenuto antitelo je antitelo koje obuhvata VLregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:12, i VHregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:17.
19. Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kojih prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je pomenuti kancer multipli mijelom ili hronična limfocitna leukemija.
20 Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kojih prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je pomenuti kancer rekurentan ili refraktoran.
21. Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kojih prethodnih patentnih zahteva, pri čemu pomenuta individua nije prethodno podvrgnuta anti-kancer tretmanima za isti kancer.
22. Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kojih od patentnih zahteva 1 do 20, pri čemu individua nije odgovorila na prethodnu anti-kancer terapiju za isti kancer.
23. Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kojih prethodnih patentnih zahteva, pri čemu se antitelo, najmanje jedan kortikosteroid i najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens svi administriraju odvojeno.
24. Antitelo za upotrebu na osnovu bilo kojih prethodnih patentnih zahteva, pri čemu:
(a) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon, pomenuti najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata bortezomib i antitelo obuhvata VLregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:12, i VHregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:17;
(b) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon, pomenuti najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata lenalidomid i antitelo obuhvata VLregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:12, i VHregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:17;
c) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon, pomenuti najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata lenalidomid i dalje obuhvata bortezomib i antitelo obuhvata VLregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:12, i VHregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:17; d) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon, pomenuti najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata talidomid i dalje obuhvata bortezomib i antitelo obuhvata VLregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:12, i VHregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:17; e) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata deksametazon, pomenuti najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata CC4047 i antitelo obuhvata VLregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:12, i VHregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:17; ili
f) pomenuti najmanje jedan kortikosteroid obuhvata prednizon, pomenuti najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata bortezomib i dalje obuhvata melfalan i antitelo obuhvata VLregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:12, i VHregion koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID NO:17.
25. Upotreba humanog IgG1 izotip antitela koje vezuje CD38 u proizvodnji medikamenata za tretman kancera, pri čemu je medikament za administraciju, ili treba da se administrira u kombinovanoj terapiji sa sa najmanje jednim kortikosteroidom, pri čemu najmanje jedan kortikosteroid obuhvata glukokortikoid, i najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens pri čemu pomenuti najmanje jedan ne-kortikosteroidni hemoterapeutski agens obuhvata (i) talidomid ili analog talidomida i/ili (ii) inhibitor proteozoma, i pri čemu pomenuto antitelo obuhvata varijabilne regione humanog lakog lanca i humanog teškog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca obuhvata VLCDR1 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:13, VLCDR2 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:14 i VL CDR3 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:15, i varijabilni region teškog lanca koji obuhvata VHCDR1 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:18, VHCDR2 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:19 i VHCDR3 koji ima sekvencu označenu kao u SEQ ID NO:20.
RS20190880A 2006-09-26 2007-09-26 Anti-cd38 plus kortikosteroidi plus nekortikosteroidni hemoterapeutik za tretiranje tumora RS59005B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US84732906P 2006-09-26 2006-09-26
DKPA200601232 2006-09-26
EP07817816.7A EP2081595B1 (en) 2006-09-26 2007-09-26 Anti-cd38 plus corticosteroids plus a non-corticosteroid chemotherapeutic for treating tumors
PCT/DK2007/000418 WO2008037257A2 (en) 2006-09-26 2007-09-26 Anti-cd38 plus corticosteroids plus a non-corticosteroid chemotherapeutic for treating tumors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59005B1 true RS59005B1 (sr) 2019-08-30

Family

ID=39156080

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190880A RS59005B1 (sr) 2006-09-26 2007-09-26 Anti-cd38 plus kortikosteroidi plus nekortikosteroidni hemoterapeutik za tretiranje tumora

Country Status (24)

Country Link
US (4) US9040050B2 (sr)
EP (3) EP2081595B1 (sr)
JP (7) JP5476122B2 (sr)
AU (2) AU2007302448C1 (sr)
CA (1) CA2664740C (sr)
CY (7) CY1121813T1 (sr)
DK (1) DK2081595T3 (sr)
EA (1) EA034877B1 (sr)
ES (1) ES2732278T3 (sr)
FI (1) FIC20250018I1 (sr)
FR (7) FR19C1056I1 (sr)
HR (1) HRP20191115T1 (sr)
HU (7) HUE044136T2 (sr)
IL (2) IL197727A (sr)
LT (8) LT2081595T (sr)
LU (3) LUC00130I2 (sr)
ME (1) ME03503B (sr)
NZ (1) NZ576122A (sr)
PL (1) PL2081595T3 (sr)
PT (1) PT2081595T (sr)
RS (1) RS59005B1 (sr)
SI (1) SI2081595T1 (sr)
TR (1) TR201910145T4 (sr)
WO (1) WO2008037257A2 (sr)

Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3312196B1 (en) * 2005-03-23 2019-07-17 Genmab A/S Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma
NZ576122A (en) * 2006-09-26 2012-09-28 Genmab As Anti-cd38 plus corticosteroids plus a non-corticosteroid chemotherapeutic for treating tumors
EP2191840A1 (en) * 2008-11-28 2010-06-02 Sanofi-Aventis Antitumor combinations containing antibodies recognizing specifically CD38 and melphalan
EP2191841A1 (en) * 2008-11-28 2010-06-02 Sanofi-Aventis Antitumor combinations containing antibodies recognizing specifically CD38 and vincristine
EP2191842A1 (en) * 2008-11-28 2010-06-02 Sanofi-Aventis Antitumor combinations containing antibodies recognizing specifically CD38 and cytarabine
BR112012009250A2 (pt) * 2009-10-21 2017-06-20 Immunogen Inc composição compreendendo conjugado anti-cd56-maitansinoide e uso da mesma
EP3613774A1 (en) 2010-06-09 2020-02-26 Genmab A/S Antibodies against human cd38
CN103118706B (zh) * 2010-09-27 2016-05-18 莫佛塞斯公司 抗cd38抗体与来那度胺或硼替佐米用于治疗多发性骨髓瘤和nhl
UA112170C2 (uk) * 2010-12-10 2016-08-10 Санофі Протипухлинна комбінація, що містить антитіло, яке специфічно розпізнає cd38, і бортезоміб
JOP20210044A1 (ar) * 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
ES2792062T3 (es) 2011-05-09 2020-11-06 Mayo Found Medical Education & Res Tratamientos contra el cáncer
EP3559049B1 (en) 2011-10-28 2025-06-11 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
BR112015006731A2 (pt) 2012-09-25 2017-07-04 Morphosys Ag combinações e usos das mesmas
ES2899643T3 (es) 2012-10-01 2022-03-14 Mayo Found Medical Education & Res Tratamientos para el cáncer
US10342869B2 (en) 2012-12-07 2019-07-09 The Regents Of The University Of California Compositions comprising anti-CD38 antibodies and lenalidomide
UA118255C2 (uk) * 2012-12-07 2018-12-26 Санофі Композиція, яка містить антитіло до cd38 і леналідомід
PL2968555T3 (pl) 2013-03-13 2020-11-16 Sanofi Kompozycje zawierające przeciwciała anty-cd38 i karfilzomib
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
FI3677591T3 (fi) 2013-04-29 2023-04-03 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-cd38-vasta-aineet ja fuusiot heikennetylle interferonille alfa-2b
US20150118251A1 (en) * 2013-10-31 2015-04-30 Sanofi Specific anti-cd38 antibodies for treating human cancers
US9603927B2 (en) * 2014-02-28 2017-03-28 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-CD38 antibodies
US9732154B2 (en) * 2014-02-28 2017-08-15 Janssen Biotech, Inc. Anti-CD38 antibodies for treatment of acute lymphoblastic leukemia
UA119352C2 (uk) * 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
AU2015274408A1 (en) 2014-06-13 2017-01-12 Mayo Foundation For Medical Education And Research Treating lymphomas
US10213513B2 (en) * 2014-06-16 2019-02-26 Mayo Foundation For Medical Education And Research Treating myelomas
US10617757B2 (en) * 2014-08-08 2020-04-14 The Regents Of The University Of California Methods for treating multiple myeloma
EP3191187B1 (en) * 2014-09-09 2021-07-28 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with anti-cd38 antibodies
US9446148B2 (en) 2014-10-06 2016-09-20 Mayo Foundation For Medical Education And Research Carrier-antibody compositions and methods of making and using the same
EA037749B1 (ru) 2014-10-29 2021-05-18 Тева Фармасьютикалз Острэйлиа Пти Лтд ВАРИАНТЫ ИНТЕРФЕРОНА 2b
JP6802791B2 (ja) * 2014-12-04 2020-12-23 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 急性骨髄性白血病の治療のための抗ｃｄ３８抗体
PL3294769T3 (pl) 2015-05-13 2021-07-05 Morphosys Ag Leczenie szpiczaka mnogiego (mm)
BR112017024877A2 (pt) 2015-05-20 2019-09-17 Janssen Biotech, Inc. anticorpo anti-cd38 e seu uso no tratamento de amiloidose de cadeia leve e outras malignidades hematológicas positivas para cd38
WO2016205334A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Vascular Strategies Llc Drug delivery and imaging chemical conjugate, formulations and methods of use thereof
NZ777133A (en) * 2015-06-22 2025-05-02 Janssen Biotech Inc Combination therapies for heme malignancies with anti-cd38 antibodies and survivin inhibitors
US20170044265A1 (en) * 2015-06-24 2017-02-16 Janssen Biotech, Inc. Immune Modulation and Treatment of Solid Tumors with Antibodies that Specifically Bind CD38
PE20181090A1 (es) * 2015-06-24 2018-07-09 Janssen Biotech Inc Modulacion y tratamiento inmunes de tumores solidos con anticuerpos que se unen especificamente a cd38
TW201707725A (zh) 2015-08-18 2017-03-01 美國馬友醫藥教育研究基金會 載體－抗體組合物及其製造及使用方法
TW201713360A (en) 2015-10-06 2017-04-16 Mayo Foundation Methods of treating cancer using compositions of antibodies and carrier proteins
US10781261B2 (en) 2015-11-03 2020-09-22 Janssen Biotech, Inc. Subcutaneous formulations of anti-CD38 antibodies and their uses
MD3827845T2 (ro) 2015-11-03 2022-09-30 Janssen Biotech Inc Formulări subcutanate de anticorpi anti-CD38 și utilizări ale acestora
US11571469B2 (en) 2016-01-07 2023-02-07 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods of treating cancer with interferon wherein the cancer cells are HLA negative or have reduced HLA expression
US11351254B2 (en) 2016-02-12 2022-06-07 Mayo Foundation For Medical Education And Research Hematologic cancer treatments
CA3018341A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods for reducing toxicity of a chemotherapeutic drug
WO2017165439A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods for improving the therapeutic index for a chemotherapeutic drug
US10618969B2 (en) 2016-04-06 2020-04-14 Mayo Foundation For Medical Education And Research Carrier-binding agent compositions and methods of making and using the same
US20190233533A1 (en) 2016-06-28 2019-08-01 Umc Utrecht Holding B.V. Treatment Of IgE-Mediated Diseases With Antibodies That Specifically Bind CD38
EP3484923A1 (en) 2016-07-15 2019-05-22 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods and materials for assessing response to plasmablast- and plasma cell-depleting therapies
CA3035378A1 (en) 2016-09-01 2018-03-08 Mayo Foundation For Medical Education And Research Carrier-pd-l1 binding agent compositions for treating cancers
EP3506950A1 (en) 2016-09-01 2019-07-10 Mayo Foundation for Medical Education and Research Methods and compositions for targeting t-cell cancers
EP3509643A1 (en) 2016-09-06 2019-07-17 Mayo Foundation for Medical Education and Research Paclitaxel-albumin-binding agent compositions and methods for using and making the same
EP3509635A1 (en) 2016-09-06 2019-07-17 Vavotar Life Sciences LLC Methods of treating triple-negative breast cancer using compositions of antibodies and carrier proteins
AU2017324335A1 (en) 2016-09-06 2019-03-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods of treating PD-L1 expressing cancer
JP7516047B2 (ja) * 2016-11-23 2024-07-16 アセチロン ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とｃｄ３８阻害剤とを含む医薬組み合わせ物及びその使用方法
US10799536B2 (en) 2016-12-09 2020-10-13 Onk Therapeutics Limited Method of treating multiple myeloma using natural killer cells expressing a chimeric antigen receptor for CD38
ES2911243T3 (es) * 2017-08-10 2022-05-18 Grifols Diagnostic Solutions Inc Composiciones, procedimientos y/o kits que comprenden un dominio extracelular recombinante de cd38 humano
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
MA50514A (fr) 2017-10-31 2020-09-09 Janssen Biotech Inc Méthodes de traitement du myélome multiple à haut risque
CN112739715A (zh) 2018-01-12 2021-04-30 武田药品工业株式会社 抗cd38抗体的皮下给药
JP6648171B2 (ja) * 2018-02-02 2020-02-14 テバ・ファーマシューティカルズ・オーストラリア・ピーティワイ・リミテッド 抗ｃｄ３８抗体及び弱毒化インターフェロンアルファ−２ｂとの融合物
CA3100157A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating cancers and enhancing efficacy of t cell redirecting therapeutics
WO2020012038A1 (en) 2018-07-13 2020-01-16 Genmab A/S Trogocytosis-mediated therapy using cd38 antibodies
CN120865412A (zh) 2018-07-13 2025-10-31 根马布股份公司 Cd38抗体变体及其用途
WO2020072840A1 (en) * 2018-10-03 2020-04-09 Prescient Pharma Llc Compositions and methods for isolating circulating cells
JP7687956B2 (ja) 2019-03-15 2025-06-03 モルフォシス・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 自己抗体介在性自己免疫疾患の処置のための、抗ｃｄ３８抗体及びその医薬組成物
EP3980064A1 (en) 2019-06-10 2022-04-13 Takeda Pharmaceutical Company Limited Combination therapies using cd-38 antibodies
GB201916150D0 (en) 2019-11-06 2019-12-18 Univ Of Ireland Galway Treatment of multiple myeloma
CN112876563B (zh) 2019-11-29 2022-08-16 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 药物组合物及其制备方法和应用
JP6853392B2 (ja) * 2020-01-15 2021-03-31 テバ・ファーマシューティカルズ・オーストラリア・ピーティワイ・リミテッド 抗ｃｄ３８抗体及び弱毒化インターフェロンアルファ−２ｂとの融合物
KR20220130724A (ko) 2020-01-16 2022-09-27 젠맵 에이/에스 Cd38 항체의 제제 및 그의 용도
IL295896A (en) 2020-02-26 2022-10-01 Biograph 55 Inc c19 c38 bispecific antibodies
EP4121112A4 (en) 2020-05-08 2023-11-15 The University Of Southern California Site-specific antibody-drug conjugates by adp-ribosyl cyclases
KR20230079074A (ko) * 2020-09-01 2023-06-05 더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 면역글로불린 ｅ 항체 조성물 및 사용 방법
TW202235435A (zh) 2021-01-14 2022-09-16 德商莫菲西斯公司 抗cd38抗體及其用途
TW202302642A (zh) 2021-03-01 2023-01-16 德商莫菲西斯公司 用於治療抗體介導移植物排斥用途之抗ｃｄ３８抗體
TW202321303A (zh) 2021-07-19 2023-06-01 德商莫菲西斯公司 抗pla2r自體抗體媒介膜性腎病變之治療
EP4612177A1 (en) 2022-10-31 2025-09-10 Genmab A/S Cd38 antibodies and uses thereof
TW202440636A (zh) 2023-03-21 2024-10-16 美商傳記５５有限公司 Ｃｄ１９／ｃｄ３８多特異性抗體

Family Cites Families (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
JPS63501765A (ja) 1985-11-01 1988-07-21 インタ−ナショナル、ジェネティック、エンジニアリング　インコ−ポレ−テッド 抗体遺伝子のモジュ−ル組立体、それにより産生された抗体及び用途
US5618920A (en) * 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
WO1989008114A1 (en) 1988-02-25 1989-09-08 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
JPH06508511A (ja) 1990-07-10 1994-09-29 ケンブリッジ　アンティボディー　テクノロジー　リミティド 特異的な結合ペアーの構成員の製造方法
WO1992001049A2 (en) 1990-07-13 1992-01-23 The General Hospital Corporation Cd53 cell surface antigen and use thereof
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5194594A (en) 1990-09-07 1993-03-16 Techniclone, Inc. Modified antibodies
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
DE69233769D1 (de) 1991-03-01 2009-09-24 Dyax Corp Chimäres Protein mit Mikroprotein mit zwei oder mehr Disulfidbindungen und Ausgestaltungen davon
ATE414768T1 (de) 1991-04-10 2008-12-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
JPH06508880A (ja) 1991-07-08 1994-10-06 ユニバーシティ　オブ　マサチューセッツ　アット　アムハースト サーモトロピック液晶セグメント化ブロックコポリマー
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
ATE181571T1 (de) 1991-09-23 1999-07-15 Medical Res Council Methoden zur herstellung humanisierter antikörper
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
WO1994017184A1 (en) 1993-01-29 1994-08-04 Schering Corporation Modulation of physiological responses of lymphocytes by cd38 or antibodies thereto
DK0804070T3 (da) 1993-03-09 2000-08-07 Genzyme Corp Fremgangsmåde til isolering af proteiner fra mælk
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
GB9424449D0 (en) 1994-12-02 1995-01-18 Wellcome Found Antibodies
JP4233608B2 (ja) 1996-10-15 2009-03-04 塩野義製薬株式会社 自己抗体測定方法
EP0932417B1 (en) 1996-10-17 2003-03-05 Immunomedics, Inc. Non-antigenic toxin-conjugate and fusion protein of internalizing receptor system
WO2000006194A2 (en) 1997-02-05 2000-02-10 Biotransplant, Inc. Depletion of cells responsible for antibody-mediated graft rejection
EP0975674B1 (en) 1997-05-02 2005-08-17 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Immunotoxins, comprising an onc protein, directed against malignant cells
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US6719977B1 (en) 1998-02-12 2004-04-13 The General Hospital Corporation Methods to potentiate cancer therapies
CA2347067C (en) 1998-03-31 2013-09-17 Geron Corporation Dendritic cell vaccine containing telomerase reverse transcriptase for the treatment of cancer
AU770718B2 (en) * 1998-06-05 2004-02-26 Mayo Foundation For Medical Education And Research Use of genetically engineered antibodies to CD38 to treat multiple myeloma
KR101023367B1 (ko) * 1998-08-11 2011-03-18 바이오겐 아이덱 인크. Ｂ-세포 림프종을 치료하기 위한 항-ｃｄ２０ 항체를 포함하는 약제
US7223397B1 (en) 1999-01-07 2007-05-29 Research Development Foundation Potentiation of anti-CD38-Immunotoxin cytotoxicity
US20050037969A1 (en) 1999-05-14 2005-02-17 Arbor Vita Corporation Molecular interactions in hematopoietic cells
IL147765A0 (en) 1999-07-29 2002-08-14 Medarex Inc HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO HER2/neu
NZ517202A (en) 1999-08-24 2004-05-28 Medarex Inc Human CTLA-4 antibodies and their uses
EP1174440A1 (en) 2000-07-19 2002-01-23 U-BISys B.V. A selectively-expressed epitope on the human CD38 molecule detected by a phage display library-derived human scFv antibody fragment
AU1331802A (en) 2000-10-17 2002-04-29 Trudeau Inst Inc Cd38 modulated chemotaxis
US20070042436A1 (en) 2000-10-17 2007-02-22 Lund Frances E CD38 modulated chemotaxis
US6713055B2 (en) 2000-11-27 2004-03-30 Geron Corporation Glycosyltransferase vectors for treating cancer
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
JP4298498B2 (ja) 2001-06-13 2009-07-22 ゲンマブ エー／エス 上皮成長因子受容体（ｅｇｆｒ）に対するヒトモノクローナル抗体
US20040166490A1 (en) 2002-12-17 2004-08-26 Morris David W. Novel therapeutic targets in cancer
US20040019915A1 (en) 2002-04-01 2004-01-29 Challita-Eid Pia M. Nucleic acid and corresponding protein entitled 213P1F11 useful in treatment and detection of cancer
EP1393720A1 (en) 2002-08-27 2004-03-03 Universiteit Utrecht Vesicle-encapsulated corticosteroids for treatment of cancer
PL216630B1 (pl) 2002-10-17 2014-04-30 Genmab As Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wiążące ludzki CD20, związane z tym przeciwciałem transfektoma, komórka gospodarza, transgeniczne zwierzę lub roślina, kompozycja, immunokoniugat, cząsteczka bispecyficzna, wektor ekspresyjny, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie medyczne, zestaw oraz przeciwciało antyidiotypowe i jego zastosowanie
NZ540555A (en) 2002-11-15 2008-04-30 Genmab As Antibody therapeutics for treatingand/or preventing diseases associated with cells expressing CD25, including autoimmune diseases, inflammatory and hyperproliferative skin disorders
ES2373947T3 (es) 2002-12-16 2012-02-10 Genmab A/S Anticuerpos monoclonales humanos contra interleucina 8 (il-8).
EP2216342B1 (en) * 2003-07-31 2015-04-22 Immunomedics, Inc. Anti-CD19 antibodies
EP1689435A4 (en) 2003-10-22 2007-10-03 Univ Rochester ANTI-THYMOCYTE ANTISERUM AND ITS USE FOR TRIGGERING B-CELL APOPTOSIS
DK1684805T3 (da) * 2003-11-04 2010-10-04 Novartis Vaccines & Diagnostic Anvendelse af antagonist anti-CD40-monoklonale antistoffer til behandling af multipel myeloma
KR20060124607A (ko) * 2003-11-06 2006-12-05 셀진 코포레이션 암 및 그 밖의 질환의 치료 및 관리를 위하여탈리도마이드를 사용하는 방법 및 조성물
AU2005235811B2 (en) * 2004-02-06 2011-11-03 Morphosys Ag Anti-CD38 human antibodies and uses therefor
NZ548990A (en) 2004-02-06 2009-06-26 Morphosys Ag Anti-CD38 human antibodies and uses therefor
US20050266008A1 (en) 2004-03-29 2005-12-01 Medarex, Inc. Human anti-IRTA-5 antibodies
US7589804B2 (en) * 2004-04-21 2009-09-15 Dai Nippon Printing Co., Ltd. Color filter and liquid crystal display comprising the same
US20060019303A1 (en) 2004-07-23 2006-01-26 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Method to identify and analyze genes having modified expression in stimulated T cells
EP3312196B1 (en) 2005-03-23 2019-07-17 Genmab A/S Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma
US20090123950A1 (en) 2005-05-24 2009-05-14 Morphosys Ag Generation And Profiling Of Fully Human Hucal Gold®-Derived Therapeutic Antibodies Specific For Human CD38
NZ576122A (en) * 2006-09-26 2012-09-28 Genmab As Anti-cd38 plus corticosteroids plus a non-corticosteroid chemotherapeutic for treating tumors
US20090076249A1 (en) 2007-09-19 2009-03-19 Michel De Weers Antibodies against CD38 for treatment of multiple myeloma

Also Published As

Publication number Publication date
EP3753576A1 (en) 2020-12-23
FR19C1056I1 (fr) 2019-11-15
AU2007302448B2 (en) 2013-12-19
FR19C1057I1 (fr) 2019-11-15
CY2021037I1 (el) 2022-03-24
LUC00128I2 (sr) 2024-05-22
WO2008037257A2 (en) 2008-04-03
HUS1900044I1 (hu) 2019-11-28
FR20C1034I1 (fr) 2020-10-02
HUS2100056I1 (hu) 2022-01-28
CY2019036I1 (el) 2020-05-29
SI2081595T1 (sl) 2019-10-30
ME03503B (me) 2020-04-20
JP2014141492A (ja) 2014-08-07
IL197727A (en) 2017-01-31
CY2019037I2 (el) 2020-05-29
JP6907165B2 (ja) 2021-07-21
ES2732278T3 (es) 2019-11-21
PL2081595T3 (pl) 2019-11-29
CA2664740C (en) 2021-11-16
CY2020016I2 (el) 2020-11-25
LUC00130I2 (sr) 2024-05-22
AU2013203186C1 (en) 2019-02-14
PT2081595T (pt) 2019-07-16
AU2007302448C1 (en) 2019-02-14
LT2081595T (lt) 2019-07-10
HUS1900043I1 (hu) 2019-11-28
EP3569245A1 (en) 2019-11-20
CY1121813T1 (el) 2020-05-29
CA2664740A1 (en) 2008-04-03
LTPA2021015I1 (sr) 2022-01-25
JP2016188228A (ja) 2016-11-04
EA034877B1 (ru) 2020-04-01
LTPA2025516I1 (sr) 2025-05-12
HRP20191115T1 (hr) 2019-09-20
US20240165226A1 (en) 2024-05-23
US20100092489A1 (en) 2010-04-15
FIC20250018I1 (fi) 2025-04-17
NZ576122A (en) 2012-09-28
FR19C1055I1 (fr) 2019-11-15
CY2021037I2 (el) 2022-03-24
LTPA2019515I1 (lt) 2019-10-25
CY2021038I2 (el) 2023-11-15
CY2019037I1 (el) 2020-05-29
HUS2500018I1 (hu) 2025-05-28
JP5476122B2 (ja) 2014-04-23
WO2008037257A3 (en) 2008-06-05
LTPA2019514I1 (lt) 2025-12-29
US9040050B2 (en) 2015-05-26
JP2023120436A (ja) 2023-08-29
EP2081595B1 (en) 2019-04-10
EA200970317A1 (ru) 2009-10-30
CY2019035I2 (el) 2020-05-29
JP2025143484A (ja) 2025-10-01
FR25C1015I1 (fr) 2025-06-20
JP2010504363A (ja) 2010-02-12
LTPA2021014I1 (sr) 2022-01-10
CY2019035I1 (el) 2020-05-29
AU2007302448A1 (en) 2008-04-03
CY2020016I1 (el) 2020-11-25
AU2013203186B2 (en) 2016-06-16
JP2021119198A (ja) 2021-08-12
HUS2100057I1 (hu) 2022-01-28
CY2019036I2 (el) 2020-05-29
JP2019001804A (ja) 2019-01-10
JP6607825B2 (ja) 2019-11-20
LUC00129I2 (sr) 2024-05-22
CY2021038I1 (el) 2022-03-24
HUS1900045I1 (hu) 2019-11-28
US20200114000A1 (en) 2020-04-16
FR21C1063I1 (fr) 2022-02-18
IL248204A0 (en) 2016-11-30
LTPA2020520I1 (lt) 2020-07-27
FR21C1062I1 (fr) 2022-02-18
AU2013203186A1 (en) 2013-05-02
LTPA2019516I1 (lt) 2019-10-25
HUE044136T2 (hu) 2019-09-30
US20150231235A1 (en) 2015-08-20
EP2081595A2 (en) 2009-07-29
IL197727A0 (en) 2011-08-01
DK2081595T3 (da) 2019-07-15
TR201910145T4 (tr) 2019-08-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240165226A1 (en) Combination treatment of cd38-expressing tumors
JP6494053B2 (ja) 多発性骨髄腫の治療のためのｃｄ３８に対する抗体
JP6609580B2 (ja) ヒトｃｄ３８に対する抗体
AU2018200516A1 (en) Combination treatment of CD38-expressing tumors
HK40043436A (en) Combination treatment of cd38-expressing tumors
HK40017597A (en) Combination treatment of cd38-expressing tumors
HK40048777A (en) Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma
RS55442B1 (sr) Antitela protiv cd38 za lečenje multiplog mijeloma