JP2014141492A - Cd38発現腫瘍の併用処置法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】i)CD38に結合する非アゴニスト抗体、ii)少なくとも1つのグルココルチコイド、および、iii)サリドマイドもしくはサリドマイド類似体またはプロテアソーム阻害剤を含む、少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤を組み合わせてなる、薬学的組成物。
【選択図】なし
Description
本発明は、CD38に結合する抗体、コルチコステロイド、および非コルチコステロイド化学療法剤を含む併用療法を用いた癌の処置に関する。
多発性骨髄腫は、低い増殖指数および延長された寿命を持つ分泌性形質細胞の骨髄における潜在的蓄積を特徴とするB細胞悪性腫瘍である。本疾患は、最終的には骨および骨髄を攻撃し、骨格系の全体にわたる多発性の腫瘍および病変を結果的に生じさせる。
i)CD38に結合する非アゴニスト抗体、
ii)少なくとも1つのコルチコステロイド、および
iii)少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤
の投与を含む方法に関する。
- メルファランなどの、アルキル化薬剤、
および/または
- サリドマイドもしくはレナリドマイドなどの、グルタミン酸誘導体
および/または
- ボルテゾミブなどの、プロテアソーム阻害剤
を含む。
i)CD38に結合する非アゴニスト抗体、
ii)任意で少なくとも1つのコルチコステロイド、および
iii)任意で少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤
の投与、それに続く自己末梢幹細胞移植または骨髄移植を含む方法に関する。
i)CD38に結合する非アゴニスト抗体、
ii)少なくとも1つのコルチコステロイド、および
iii)少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤
を含む、CD38を発現する腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害するための治療的組み合わせに関する。
[請求項1001]
個体に対する
i)CD38に結合する非アゴニスト抗体、
ii)少なくとも1つのコルチコステロイド、および
iii)少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤
の投与を含む、
それを必要とする個体でCD38を発現する腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害するための方法。
[請求項1002]
個体に対する
i)CD38に結合する非アゴニスト抗体、
ii)任意で少なくとも1つのコルチコステロイド、および
iii)任意で少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤
の投与、
続いて自己末梢幹細胞移植または骨髄移植を含む、
それを必要とする個体でCD38を発現する腫瘍細胞が関与する癌を処置するための方法。
[請求項1003]
少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤が細胞毒性薬剤および/または血管形成阻害剤を含む、請求項1001または1002記載の方法。
[請求項1004]
少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤がアルキル化薬剤を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1005]
少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤が、メルファラン、メクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、カルムスチン(BSNU)、ロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン(DTIC)、プロカルバジン、マイトマイシンC、シスプラチン、およびカルボプラチンなどの、その他のプラチナ誘導体からなる群より選択される1つまたは複数の薬剤を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1006]
少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤が、サリドマイド(Thalomid(登録商標))またはサリドマイド類似体、例えば、CC-5013(レナリドマイド、Revlimid(商標))もしくはCC4047(Actimid(商標))などの、グルタミン酸誘導体を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1007]
少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤が、ボルテゾミブ(Velcade(登録商標))などの、プロテアソーム阻害剤を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1008]
少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤が、ビンクリスチンなどの、ビンカアルカロイドを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1009]
少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤が、ドキソルビシンなどの、アントラサイクリンを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1010]
少なくとも1つのコルチコステロイドがグルココルチコイドを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1011]
少なくとも1つのコルチコステロイドがプレドニゾンを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1012]
少なくとも1つのコルチコステロイドがプレドニゾンを含み、かつ少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤がメルファランを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1013]
少なくとも1つのコルチコステロイドがプレドニゾンを含み、かつ少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤がサリドマイドを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1014]
少なくとも1つのコルチコステロイドがプレドニゾンを含み、かつ少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤がメルファランおよびサリドマイドを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1015]
少なくとも1つのコルチコステロイドがデキサメタゾンを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1016]
少なくとも1つのコルチコステロイドがデキサメタゾンを含み、かつ少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤がサリドマイドおよび/またはレナリドマイドを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1017]
少なくとも1つのコルチコステロイドがデキサメタゾンを含み、かつ少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤がビンクリスチンおよび/またはドキソルビシンを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1018]
インターフェロン-アルファのさらなる投与を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1019]
抗体がモノクローナル抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1020]
抗体がヒトモノクローナル抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1021]
抗体がCD38のアンタゴニストである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1022]
抗体が、本明細書の実施例19で記載した方法によって決定される場合、ヒト単球または末梢血単核細胞による顕著なIL-6の放出を誘導しない抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1023]
抗体が、本明細書の実施例20で記載した方法によって決定される場合、ヒトT細胞または末梢血単核細胞による検出可能なIFN-γの放出を誘導しない抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1024]
抗体が、CD38発現細胞によって内在化される抗体であって、例えば本明細書の実施例12で記載した方法により37℃で5〜15分以内にCHO-CD38細胞によって内在化される抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1025]
抗体が、ADCCを誘導する抗体であって、例えば本明細書の実施例5で記載した方法によって決定される場合、Daudi-luc細胞で15 ng/ml未満、例えば10 ng/ml未満のEC50値を持ち、かつMM細胞で75 ng/ml未満、例えば50 ng/ml、30 ng/ml、または10 ng/ml未満のEC50値を持つ抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1026]
抗体が、補体の存在下でCDCを誘導する抗体であって、例えば本明細書の実施例6で記載した方法により、daudi-lucまたはCD38-CHO細胞で5 μg/ml未満、例えば1 μg/ml未満のEC50値を持つ抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1027]
抗体がcGDPRの合成を阻害する抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1028]
抗体がcADPRの合成を阻害する抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1029]
抗体が、本明細書の実施例20で記載した表面プラズモン共鳴によって決定される場合、10-8 M未満、例えば10-8 M〜10-11 Mの範囲内、例えば7×10-9 M〜10-10 Mの範囲内の親和性(KD)でヒトCD38に結合する抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1030]
抗体が、本明細書の実施例24で記載した分光光度法によって決定される場合、3 μg/mlの濃度で90分後に少なくとも25%、例えば少なくとも30%、cGDPRの合成を阻害する抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1031]
抗体が、Munshi et al., J. Biol. Chem. 275, 21566-21571(2000)に記載されるHPLC法によって決定される場合、3 μg/mlの濃度で90分後に少なくとも25%、例えば少なくとも30%、cADPRの合成を阻害する抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1032]
抗体が、配列番号:10に示された配列を有するVH CDR3を含む抗体、または例えば、該抗体と同じエピトープに結合することによって、該抗体とCD38結合を競合する抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1033]
抗体が、配列番号:5に示された配列を有するVL CDR3および配列番号:10に示された配列を有するVH CDR3を含む抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1034]
抗体がヒト軽鎖およびヒト重鎖可変領域を含む抗体であって、
軽鎖可変領域が、配列番号:3に示された配列を有するVL CDR1、配列番号:4に示された配列を有するVL CDR2、および配列番号:5に示された配列を有するVL CDR3を含み、かつ重鎖可変領域が、配列番号:8に示された配列を有するVH CDR1、配列番号:9に示された配列を有するVH CDR2、および配列番号:10に示された配列を有するVH CDR3を含む抗体である、
前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1035]
抗体が、配列番号:2に示されたアミノ酸配列を有するVL領域、または配列番号:2に示された配列と少なくとも約90%、例えば少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性を有するVL領域を含む抗体である、請求項1032〜1034のいずれか一項記載の方法。
[請求項1036]
抗体が、配列番号:7に示されたアミノ酸配列を有するVH領域、または配列番号:7に示された配列と少なくとも約90%、例えば少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性を有するVH領域、または配列番号:7に示された配列と比較して1〜5個、例えば1〜3個のアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するVH領域を含む抗体である、請求項1032〜1035のいずれか一項記載の方法。
[請求項1037]
抗体が、配列番号:20に示された配列を有するVH CDR3を含む抗体、または例えば、該抗体と同じエピトープに結合することによって、該抗体とCD38結合を競合する抗体である、請求項1001〜1031のいずれか一項記載の方法。
[請求項1038]
抗体が、配列番号:15に示された配列を有するVL CDR3および配列番号:20に示された配列を有するVH CDR3を含む抗体である、請求項1001〜1031のいずれか一項記載の方法。
[請求項1039]
抗体がヒト軽鎖およびヒト重鎖可変領域を含む抗体であって、
軽鎖可変領域が、配列番号:13に示された配列を有するVL CDR1、配列番号:14に示された配列を有するVL CDR2、および配列番号:15に示された配列を有するVL CDR3を含み、かつ重鎖可変領域が、配列番号:18に示された配列を有するVH CDR1、配列番号:19に示された配列を有するVH CDR2、および配列番号:20に示された配列を有するVH CDR3を含む抗体である、
請求項1001〜1031のいずれか一項記載の方法。
[請求項1040]
抗体が、配列番号:12に示されたアミノ酸配列を有するVL領域、または配列番号:12による配列と少なくとも約90%、例えば少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性を有するVL領域を含む抗体である、請求項1037〜1039のいずれか一項記載の方法。
[請求項1041]
抗体が、配列番号:17に示されたアミノ酸配列を有するVH領域、または配列番号:17に示された配列と少なくとも約90%、例えば少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性を有するVH領域、または配列番号:17に示された配列と比較して1〜5個、例えば1〜3個のアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するVH領域を含む抗体である、請求項1037〜1040のいずれか一項記載の方法。
[請求項1042]
抗体が、配列番号:30に示された配列を有するVH CDR3を含む抗体、または例えば、該抗体と同じエピトープに結合することによって、該抗体とCD38結合を競合する抗体である、請求項1001〜1031のいずれか一項記載の方法。
[請求項1043]
抗体が、配列番号:25に示された配列を有するVL CDR3および配列番号:30に示された配列を有するVH CDR3を含む抗体である、請求項1001〜1031のいずれか一項記載の方法。
[請求項1044]
抗体がヒト軽鎖およびヒト重鎖可変領域を含む抗体であって、
軽鎖可変領域が、配列番号:23に示された配列を有するVL CDR1、配列番号:24に示された配列を有するVL CDR2、および配列番号:25に示された配列を有するVL CDR3を含み、かつ重鎖可変領域が、配列番号:28に示された配列を有するVH CDR1、配列番号:29に示された配列を有するVH CDR2、および配列番号:30に示された配列を有するVH CDR3を含む抗体である、
請求項1001〜1031のいずれか一項記載の方法。
[請求項1045]
抗体が、配列番号:22に示されたアミノ酸配列を有するVL領域、または配列番号:22による配列と少なくとも約90%、例えば少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性を有するVL領域を含む抗体である、請求項1042〜1044のいずれか一項記載の方法。
[請求項1046]
抗体が、配列番号:27に示されたアミノ酸配列を有するVH領域、または配列番号:27に示された配列と少なくとも約90%、例えば少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性を有するVH領域、または配列番号:27に示された配列と比較して1〜5個、例えば1〜3個のアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するVH領域を含む抗体である、請求項1042〜1045のいずれか一項記載の方法。
[請求項1047]
抗体が、全長のIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE、またはIgM抗体、例えばIgG1抗体、好ましくはIgG1,κ抗体、またはIgM抗体、好ましくはIgM,κ抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1048]
抗体が、
(i)ヒトHv1263/3M28(VHI)生殖系列配列に由来する重鎖可変領域アミノ酸配列およびヒトL15(VκI)生殖系列配列に由来する軽鎖可変領域アミノ酸配列;または
(ii)ヒトVH3-DP-47/V3-23(VHIII)生殖系列配列に由来する重鎖可変領域アミノ酸配列およびヒトL6(VκI)生殖系列配列に由来する軽鎖可変領域アミノ酸配列
を含むヒトモノクローナル抗体である、
前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1049]
抗体が抗体断片または単鎖抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1050]
抗体が、細胞毒性薬剤、放射性同位体、または薬物にコンジュゲートされている、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1051]
抗体が、
前記請求項のいずれか一項で規定されたような抗体、および
ヒトエフェクター細胞に対する結合特異性
を含む二重特異性または多重特異性の分子である、
前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1052]
抗体が、
前記請求項のいずれか一項で規定されたような抗体、および
CD3、CD4、CD138、IL-15R、膜結合もしくは受容体結合型TNF-α、ヒトFc受容体、または膜結合もしくは受容体結合型IL-15に対する結合特異性
を含む二重特異性または多重特異性の分子である、
前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1053]
腫瘍細胞が多発性骨髄腫細胞または慢性リンパ球性白血病細胞である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1054]
腫瘍細胞が再発性または難治性の腫瘍細胞である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1055]
個体が65歳または65歳より上である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1056]
個体が65歳未満である、請求項1001〜1054のいずれか一項記載の方法。
[請求項1057]
個体が、同じ癌に対する前抗癌処置を受けていない、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1058]
個体が、同じ癌に対する前抗癌処置に応答していない、請求項1001〜1056のいずれか一項記載の方法。
[請求項1059]
個体が、自己末梢幹細胞移植または骨髄移植を事前に受けている、請求項1001〜1056または1058のいずれか一項記載の方法。
[請求項1060]
個体が、後で自己末梢幹細胞移植または骨髄移植を受けるよう登録されている、請求項1001または1003〜1059のいずれか一項記載の方法。
[請求項1061]
抗体、少なくとも1つのコルチコステロイド、および少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤が同時に投与される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1062]
抗体、少なくとも1つのコルチコステロイド、および少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤が順次投与される、請求項1001〜1060のいずれか一項記載の方法。
[請求項1063]
抗体、少なくとも1つのコルチコステロイド、および少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤が全て個別に投与される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1064]
抗体、少なくとも1つのコルチコステロイド、および少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤が、1つまたは2つの薬学的組成物として同時投与される、請求項1001〜1060のいずれか一項記載の方法。
[請求項1065]
抗体が、少なくとも1つのコルチコステロイドおよび少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤の投与の少なくとも1日前、例えば少なくとも2日前、例えば少なくとも1週間前に投与される、請求項1062記載の方法。
[請求項1066]
抗体が、1 mg/kgまたはそれ以上の用量、例えば1〜20 mg/kgの用量、例えば5〜20 mg/kgの用量、例えば8 mg/kgの用量で投与される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1067]
抗体が、2〜12週間、例えば3〜10週間、例えば4〜8週間、週に1回投与される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
[請求項1068]
前記請求項のいずれか一項または複数項記載の特色を含む、個体でCD38を発現する細胞を伴う癌を処置する方法。
[請求項1069]
癌が多発性骨髄腫または慢性リンパ球性白血病である、請求項1068記載の方法。
[請求項1070]
少なくとも1つのコルチコステロイドおよび少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤の併用療法で投与するためか、または投与されるべき、癌の処置のための医薬の製造におけるCD38に結合する抗体の使用。
[請求項1071]
請求項1001〜1067のいずれか一項または複数項記載の特色を含む、請求項1070記載の使用。
[請求項1072]
個別、順次、および/または同時投与に好適である、
i)CD38に結合する非アゴニスト抗体、
ii)少なくとも1つのコルチコステロイド、および
iii)少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤
を含む、CD38を発現する腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害するための治療的組み合わせ。
[請求項1073]
組成物が請求項1001〜1067のいずれか一項または複数項記載の特色を含む、請求項1072記載の治療的組み合わせ。
配列番号:1 抗体-003のVL領域のヌクレオチド配列。
配列番号:2 抗体-003のVL領域のアミノ酸配列。
配列番号:3 配列番号:2のaa 24〜34を含む抗体-003のVL CDR1のアミノ酸配列。
配列番号:4 配列番号:2のaa 50〜56を含む抗体-003のVL CDR2のアミノ酸配列。
配列番号:5 配列番号:2のaa 89〜97を含む抗体-003のVL CDR3のアミノ酸配列。
配列番号:6 抗体-003のVH領域のヌクレオチド配列。
配列番号:7 抗体-003のVH領域のアミノ酸配列。
配列番号:8 配列番号:7のaa 31〜35を含む抗体-003のVH CDR1のアミノ酸配列。
配列番号:9 配列番号:7のaa 50〜66を含む抗体-003のVH CDR2のアミノ酸配列。
配列番号:10 配列番号:7のaa 99〜109を含む抗体-003のVH CDR3のアミノ酸配列。
配列番号:11 抗体-005のVL領域のヌクレオチド配列。
配列番号:12 抗体-005のVL領域のアミノ酸配列。
配列番号:13 配列番号:12のaa 24〜34を含む抗体-005のVL CDR1のアミノ酸配列。
配列番号:14 配列番号:12のaa 50〜56を含む抗体-005のVL CDR2のアミノ酸配列。
配列番号:15 配列番号:12のaa 89〜97を含む抗体-005のVL CDR3のアミノ酸配列。
配列番号:16 抗体-005のVH領域のヌクレオチド配列。
配列番号:17 抗体-005のVH領域のアミノ酸配列。
配列番号:18 配列番号:17のaa 31〜35を含む抗体-005のVH CDR1のアミノ酸配列。
配列番号:19 配列番号:17のaa 50〜66を含む抗体-005のVH CDR2のアミノ酸配列。
配列番号:20 配列番号:17のaa 99〜111を含む抗体-005のVH CDR3のアミノ酸配列。
配列番号:21 抗体-024のVL領域のヌクレオチド配列。
配列番号:22 抗体-024のVL領域のアミノ酸配列。
配列番号:23 配列番号:22のaa 24〜34を含む抗体-024のVL CDR1のアミノ酸配列。
配列番号:24 配列番号:22のaa 50〜56を含む抗体-024のVL CDR2のアミノ酸配列。
配列番号:25 配列番号:22のaa 89〜97を含む抗体-024のVL CDR3のアミノ酸配列。
配列番号:26 抗体-024のVH領域のヌクレオチド配列。
配列番号:27 抗体-024のVH領域のアミノ酸配列。
配列番号:28 配列番号:27のaa 31〜35を含む抗体-024のVH CDR1のアミノ酸配列。
配列番号:29 配列番号:27のaa 50〜66を含む抗体-024のVH CDR2のアミノ酸配列。
配列番号:30 配列番号:27のaa 99〜111を含む抗体-024のVH CDR3のアミノ酸配列。
配列番号:31 ヒトCD38の配列。
配列番号:32 位置237のスレオニン残基がアラニン残基と置換されている、突然変異体ヒトCD38の配列。
配列番号:33 位置272のグルタミン残基がアルギニン残基と置換されている、突然変異体ヒトCD38の配列。
配列番号:34 位置274のセリン残基がフェニルアラニン残基と置換されている、突然変異体ヒトCD38の配列。
定義
本明細書で用いる場合の「CD38に結合する非アゴニスト抗体」または「抗CD38抗体」は、アイソタイプ対照抗体または培地のみによって誘導される増殖と比較した場合に、CD38への結合によって末梢血単核細胞の顕著な増殖を誘導しない抗体を指す(例えば、本明細書で下記の実施例18に記載した通りにアッセイされる)。ある態様において、本発明で用いる抗CD38抗体は、CD38の非アゴニストであるだけでなく、アンタゴニストでもある。
第一の主な局面において、本発明は、それを必要とする個体でCD38を発現する腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害するための方法であって、個体に対する
i)CD38に結合する、すなわち、特異的に結合する非アゴニスト抗体、
ii)少なくとも1つのコルチコステロイド、および
iii)少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤
の投与を含む方法に関する。
i)CD38に結合する、すなわち、特異的に結合する非アゴニスト抗体、
ii)任意で少なくとも1つのコルチコステロイド、および
iii)任意で少なくとも1つの、非アルキル化非コルチコステロイド化学療法剤などの、非コルチコステロイド化学療法剤
の投与、続いて自己末梢幹細胞移植または骨髄移植を含む方法に関する。
- 本明細書の実施例19に記載した方法によって決定される場合、ヒト単球もしくは末梢血単核細胞による顕著なIL-6の放出を誘導しない抗体
および/または
- 本明細書の実施例20に記載した方法によって決定される場合、ヒトT細胞もしくは末梢血単核細胞による検出可能なIFN-γの放出を誘導しない抗体
および/または
- 本明細書の実施例12に記載した方法により37℃で5〜15分以内にCHO-CD38細胞によって内在化されるような、CD38発現細胞によって内在化される抗体
および/または
- 本明細書の実施例5に記載した方法によって決定される場合、Daudi-luc細胞で15 ng/ml未満、例えば10 ng/ml未満のEC50値を持ち、かつMM細胞で75 ng/ml未満、例えば50 ng/ml、30 ng/ml、または10 ng/ml未満のEC50値を持つような、ADCCを誘導する抗体
および/または
- 本明細書の実施例6に記載した方法により、daudi-lucもしくはCD38-CHO細胞で5 μg/ml未満、例えば1 μg/ml未満のEC50値を持つような、補体の存在下でCDCを誘導する抗体
および/または
- cGDPRの合成を阻害する抗体
および/または
- cADPRの合成を阻害する抗体
および/または
- 本明細書の実施例20に記載した表面プラズモン共鳴によって決定される場合、10-8 M未満、例えば10-8 M〜10-11 Mの範囲内、例えば7×10-9 M〜10-10 Mの範囲内の親和性(KD)でヒトCD38に結合する抗体
および/または
- 本明細書の実施例24に記載した分光光度法によって決定される場合、3 μg/mlの濃度で90分後に少なくとも25%、例えば少なくとも30%、cGDPRの合成を阻害する抗体
および/または
- Munshi et al., J. Biol. Chem. 275, 21566-21571(2000)に記載されたHPLC法によって決定される場合、3 μg/mlの濃度で90分後に少なくとも25%、例えば少なくとも30%、cADPRの合成を阻害する抗体
である。
抗体は、
- 配列番号:2の配列からなるVL領域および配列番号:7の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、
- 配列番号:12の配列からなるVL領域および配列番号:17の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、ならびに
- 配列番号:22の配列からなるVL領域および配列番号:27の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体
からなる群より選択される。
抗体は、
- 配列番号:2の配列からなるVL領域および配列番号:7の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、
- 配列番号:12の配列からなるVL領域および配列番号:17の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、ならびに
- 配列番号:22の配列からなるVL領域および配列番号:27の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体
からなる群より選択される。
抗体は、
- 配列番号:2の配列からなるVL領域および配列番号:7の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、
- 配列番号:12の配列からなるVL領域および配列番号:17の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、ならびに
- 配列番号:22の配列からなるVL領域および配列番号:27の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体
からなる群より選択される。
抗体は、
- 配列番号:2の配列からなるVL領域および配列番号:7の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、
- 配列番号:12の配列からなるVL領域および配列番号:17の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、ならびに
- 配列番号:22の配列からなるVL領域および配列番号:27の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体
からなる群より選択される。
少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤は、ボルテゾミブ(Velcade(登録商標))などの、プロテアソーム阻害剤を含み、かつ
抗体は、
- 配列番号:2の配列からなるVL領域および配列番号:7の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、
- 配列番号:12の配列からなるVL領域および配列番号:17の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、ならびに
- 配列番号:22の配列からなるVL領域および配列番号:27の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体
からなる群より選択される。
抗体は、
- 配列番号:2の配列からなるVL領域および配列番号:7の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、
- 配列番号:12の配列からなるVL領域および配列番号:17の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、ならびに
- 配列番号:22の配列からなるVL領域および配列番号:27の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体
からなる群より選択される。
抗体は、
- 配列番号:2の配列からなるVL領域および配列番号:7の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、
- 配列番号:12の配列からなるVL領域および配列番号:17の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、ならびに
- 配列番号:22の配列からなるVL領域および配列番号:27の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体
からなる群より選択される。
抗体は、
- 配列番号:2の配列からなるVL領域および配列番号:7の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、
- 配列番号:12の配列からなるVL領域および配列番号:17の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、ならびに
- 配列番号:22の配列からなるVL領域および配列番号:27の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体
からなる群より選択される。
抗体は、
- 配列番号:2の配列からなるVL領域および配列番号:7の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、
- 配列番号:12の配列からなるVL領域および配列番号:17の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、ならびに
- 配列番号:22の配列からなるVL領域および配列番号:27の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体
からなる群より選択される。
少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤はメルファランを含み、かつ
抗体は、
- 配列番号:2の配列からなるVL領域および配列番号:7の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、
- 配列番号:12の配列からなるVL領域および配列番号:17の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、ならびに
- 配列番号:22の配列からなるVL領域および配列番号:27の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体
からなる群より選択される。
少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤はサリドマイドを含み、かつ
抗体は、
- 配列番号:2の配列からなるVL領域および配列番号:7の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、
- 配列番号:12の配列からなるVL領域および配列番号:17の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、ならびに
- 配列番号:22の配列からなるVL領域および配列番号:27の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体
からなる群より選択される。
少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤はメルファランおよびサリドマイドを含み、かつ
抗体は、
- 配列番号:2の配列からなるVL領域および配列番号:7の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、
- 配列番号:12の配列からなるVL領域および配列番号:17の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、ならびに
- 配列番号:22の配列からなるVL領域および配列番号:27の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体
からなる群より選択される。
抗体は、
- 配列番号:2の配列からなるVL領域および配列番号:7の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、
- 配列番号:12の配列からなるVL領域および配列番号:17の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、ならびに
- 配列番号:22の配列からなるVL領域および配列番号:27の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体
からなる群より選択される。
少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤はサリドマイドおよび/またはレナリドマイドを含み、かつ
抗体は、
- 配列番号:2の配列からなるVL領域および配列番号:7の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、
- 配列番号:12の配列からなるVL領域および配列番号:17の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、ならびに
- 配列番号:22の配列からなるVL領域および配列番号:27の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体
からなる群より選択される。
少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤はビンクリスチンおよび/またはドキソルビシンを含み、かつ
抗体は、
- 配列番号:2の配列からなるVL領域および配列番号:7の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、
- 配列番号:12の配列からなるVL領域および配列番号:17の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体、ならびに
- 配列番号:22の配列からなるVL領域および配列番号:27の配列からなるVH領域を有するヒトモノクローナルIgG1抗体
からなる群より選択される。
保存的置換のためのアミノ酸残基のクラス
代替の保存的アミノ酸残基置換のクラス
アミノ酸残基の代替の物理的および機能的分類
本発明のある態様において、使用する抗体を誘導体化するかまたは別の機能性分子、例えば別のペプチド(Fab'断片など)もしくはタンパク質に連結し、複数の結合部位または標的エピトープに結合する二重特異性または多重特異性分子を作製してもよい。例えば、本発明で用いる抗体は、(例えば化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性の会合によるか、または別の方法で)別の抗体、ペプチド、または結合ミメティックなどの、1つまたは複数のその他の結合分子に機能的に連結されてもよい。
ある態様において、本発明は、細胞毒素、化学療法薬物、免疫抑制剤、または放射性同位体などの、治療的部分にコンジュゲートされたCD38抗体を用いる。そのようなコンジュゲートを、本明細書では「免疫コンジュゲート」と称する。1つまたは複数の細胞毒素を含む免疫コンジュゲートを「免疫毒素」と称する。
本発明で用いる薬剤を、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, Gennaro, 編, Mack Publishing社, Easton, PA, 1995に開示されている技術などの従来の技術に従って、薬学的に許容される担体または希釈剤だけでなく、任意のその他の公知のアジュバントおよび賦形剤と共に製剤化してもよい。
本発明の併用療法によって処置し得る個体には、例えば、酵素活性、シグナル伝達、サイトカイン発現の誘導、増殖もしくは分化の誘導、および/もしくは溶解の誘導などの、CD38機能を阻害すること、ならびに/またはCD38発現細胞の数を削除する/低下させることによって是正または改善し得る障害を有するヒト患者が含まれる。
i) CD38に結合する非アゴニスト抗体、
ii) 少なくとも1つのコルチコステロイド、および
iii) 少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤
の投与を含む、方法を提供する。抗CD38抗体を用いて、ある種の障害と関連するCD38誘導性の活性を阻害するかまたはCD38を発現する細胞の数を削減するかもしくは低下させる。
本発明による処置には、使用する「治療的有効量」の医薬が含まれる。「治療的有効量」は、所望の治療結果を達成するために、必要な投薬量で、必要な期間、有効な量を指す。治療的有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに医薬が個人において所望の応答を誘発する能力によって変化する可能性がある。治療的有効量はまた、治療的に有益な効果が抗体または抗体部分の任意の毒性効果または有害効果に優る量でもある。本併用療法の文脈において、治療量には、その他の化合物との組み合わせでのみ治療的に有効である量、例えば、少な過ぎて単一治療では有効ではないと考えられる量が含まれる。
本発明の併用療法をその他の医薬とさらに組み合わせてもよく、すなわち、処置されるべき疾患または状態に関連のあるさらなる治療薬剤と組み合わせてもよい。そのような投与は、同時か、個別か、または順次であってもよい。同時投与については、適当な場合、薬剤を1つの組成物としてまたは別々の組成物として投与してもよい。
ルシフェラーゼをトランスフェクトした(Daudi-luc)細胞の作製
Daudi細胞(バーキットリンパ腫が起源である)の培養を、10% FCS(Optimum C241, Wisent社, St. Bruno, QC, Canada)、2 mM L-グルタミン、100 IU/mlペニシリン、100 mg/mlストレプトマイシン、1 mMピルビン酸ナトリウム(全てGibco BRL, Life Technologies, Paisley, Scotlandから得た)を補充したRPMI 1640培養培地中で培養した。培地を週に2回補給した。トランスフェクションの前に、細胞を分割し、生存および最適な成長を確実にするために1〜1.5×106細胞/mlで播種した。
8.2×106 CD38+ Daudi細胞を、(10% dFCS, Gibco BRLを補充した)350 μl RPMI中に採取し、エレクトロポレーションキュベット(Biorad, Hemel Hempstead, Herts, UK)に移した。その後、GTS(Aldevron, Fargo, ND, USA)からの40 μg gWIZルシフェラーゼおよびピューロマイシン耐性を付与する、10 μg pPurベクター(BD Biosciences, Alphen a/d Rijn, The Netherlands)を添加した。細胞を氷上で10分間静置した後、細胞をエレクトロポレートした(250V, 950μF;Gene Pulser II, Biorad Laboratories GmbH, Munchen, Germany)。細胞を再び氷上で静置し、(10% FCSを補充した)40 ml RPMI中に採取した。その後、細胞を96ウェル組織培養プレート中に全てプレーティングした(ウェル当たり100 μl)。48時間後、ピューロマイシン(最終濃度:1 μg/ml;Sigma-Aldrich Chemie BV, Zwijndrecht, The Netherlands)を添加した。ピューロマイシン耐性クローンを、24ウェル組織培養プレート中でさらに成長させた。
ルシフェラーゼアッセイシステム(#E4030, Promega, Madison, WI, USA)を用いて、細胞のルシフェラーゼ活性を決定した。1×105細胞をエッペンドルフ遠心分離機で遠心分離し(13.500 rpm, 1分)、ペレットを100 μl PBS中で洗浄した。遠心分離(13.500 rpm, 1分)後、ペレットを20 μlレポーター溶解緩衝剤(Promega)で溶解し、凍結し、融解した。遠心分離(13,500 rpm, 1分)後、20 μl上清を捨て、100 μlルシフェラーゼアッセイ試薬を(Promegaの特別のルミノメーターチューブ中に)添加した。発光をルミノメーター(LB9507, Berthold, Vilvoorde, Belgium)中で測定した(10秒)。
マウスの免疫化およびハイブリドーマの作製
-003についての免疫化プロトコル
HCo12マウスを2週間毎に20 μgの精製HA-CD38で免疫化した。最初の免疫化を、100 μlの完全フロイントアジュバント(CFA)と混合した、100 μl PBSの存在下で、i.p.で行なった。この最初の免疫化の後、続く精製HA-CD38によるブースト(13×)を、100 μlの不完全フロイントアジュバント(IFA)と混合した、100 μl PBSの存在下で、s.c.およびi.p.で交互に行なった。力価の拡張後、マウスを、PBA中の20 μg HA-CD38で、i.v.でブーストした。
HCo12マウスを2週間毎に20 μg精製HA-CD38とNIH-3T3-CD38トランスフェクト細胞で交互に免疫化した。最初の免疫化を、100 μl CFAと混合した、100 μl PBS中の5×106細胞で、i.p.で行ない、2回目およびその後のHA-CD38による免疫化を、100 μl IFAと混合した、100μl PBSの存在下で、s.c.で行なった。その後のトランスフェクト細胞による免疫化を、200 μl PBSの存在下で行なった。力価の拡張後、マウスを、PBS中の20 μg HA-CD38で、i.v.でブーストした。
マウス脾臓細胞をHCo12マウスから単離し、標準的なプロトコルに基づいてPEGでマウス骨髄腫細胞株に融合させた。その後、結果として得られるハイブリドーマを、ヒト抗体産生についてはELISAで、CD38特異性については、FACS解析でヒトCD38トランスフェクトNS/0細胞を用いてかつELISAで組換えHA-CD38タンパク質結合を用いて、スクリーニングした。それぞれ、-003、-005、および-024という、ヒトモノクローナル抗CD38抗体を発現する3つのハイブリドーマ細胞株を選択した。
CD38によるNIH細胞のトランスフェクション
NIH-3T3-CD38細胞を産生するためのベクター(pclpuroCD38)をM. Glennie教授(Tenovus Research Laboratory, Southampton General Hospital, Southampton, UK)から得た。NIH-3T3細胞(DSMZ、ACC 59;150,000細胞/ウェル;0.5 ml;96ウェル平底プレート、Greiner)を(グルコース[4.5 g/l]、10% FCS、L-グルタミン、ピルビン酸-Na;BioWhittakerを補充した)DMEM中で24時間培養した。その後、DNA(0.8 μg)およびリポフェクトアミン(Invitrogen, Breda, The Netherlands)をDMEM中で希釈し、混合した(20分、室温)。その後、混合物(100 μl)を各ウェルに添加し、およびインキュベートした(終夜、37℃)。
NIH-3T3-CD38細胞を(1 ml PBS中で)洗浄し、トリプシン処理した(200 μl、トリプシン-EDTA、BioWhittaker)。その後、1 mlのDMEMを添加し、混合物をピペッティングしてFACSチューブに入れた。遠心分離後(1200 rpm、5分)、細胞をFACS緩衝剤(FB;PBS、0.05% BSA、0.02% NaN3)中で洗浄し、1 ml FBに再懸濁した。遠心分離後(1200 rpm、5分)、上清を除去し、マウス抗ヒトCD38-PEを添加した(1/50希釈、Sanquin、Amsterdam、The Netherlands)。細胞をFB中で2回洗浄した後、フローサイトメトリーで得るために細胞をFBに再懸濁した。
トリプシン処置後、細胞を(グルコース 4.5 g/l、2 mM L-グルタミン、およびピューロマイシン(2 μg/ml)BioWhittakerを補充した)DMEM中のT25フラスコ(Greiner)に移した。ピューロマイシン含有培地にして2週間後に、ピューロマイシン耐性細胞を安定なCD38発現についてフローサイトメトリーで検査した。NIH-3T3-CD38選択細胞を限界希釈でサブクローニングした。これらの細胞を拡大した後、15個のNIH-3T3-CD38クローン全てをCD38発現についてスクリーニングした。CD38high NIH-3T3-CD38細胞を、使用するまで液体窒素(-80℃)中で凍結した。
細胞を(グルコース(4.5 g/l)、10% FCS、2 mM L-グルタミン、ピルビン酸-Na、ペニシリン、ストレプトマイシンを補充した)DMEM中で培養した。細胞を、トリプシン/EDTAの使用によって週に2回継代し、1×106細胞/T75フラスコの濃度で播種した。CD38high NIH-3T3-CD38細胞を、使用するまで液体窒素(-80℃)中で凍結した。
セファロース4B(Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden)を、抗CD38抗体(Serotec, Oxford, UK)とカップリングした。カラム(カラムチューブHR5/20は12 cmベッド高まで詰められている、カラム容量2.4 ml;最大流速0.5 ml/分)を、少なくとも5カラム容量(CV)のPBSで平衡化した。試料を濾過し、カラムに充填した。シグナルがベースラインに戻るまで、カラムをPBSで洗浄した(およそ3CV)。溶出をpH 2の0.1 Mグリシンで実行した。溶出分画を1%(v/v) 2 M Tris-HCl、pH 9で中和した。
ヒト抗CD38抗体を組織培養上清から精製した。まず、上清を0.20 μMデッドエンドフィルターに通して濾過した。その後、上清を5 mlプロテインAカラム(rProtein A FF, Amersham Bioscience)に充填し、0.1 Mクエン酸-NaOH、pH 3で溶出した。溶出物を2 M Tris-HCl、pH 9ですぐに中和し、12.6 mMリン酸ナトリウム、140 mM NaCl、pH 7.4(B. Braun, Oss, The Netherlands)に対して終夜透析した。透析後、試料を0.20 μMデッドエンドフィルターに通して滅菌濾過した。
本タンパク質は、CD38の細胞外ドメインの配列を含むDNAコンストラクトを持つ、His-CD38発現細胞の細胞培養上清中に存在する。付加的なポリHisタグ配列がコンストラクト中に含まれており、かつ本タンパク質のN末端に存在する。このタグによって、固相化した金属親和性クロマトグラフィーによる精製が可能になる。この過程において、クロマトグラフィー樹脂上に固定されたキレート剤は、Co2+陽イオンによって電荷を帯びている。実際、6つのヒスチジンアミノ酸を含む配列は、Co2+に強く結合する。それゆえ、Hisタグ付きCD38タンパク質がそのようなカラムに強く結合するのに対し、培養上清中に存在するその他のタンパク質はカラムを素通りするかまたは洗い流されると考えられる。その後、強く結合した、Hisタグ付きCD38タンパク質を、HisのCo2+への結合と競合する、イミダゾールを含む緩衝剤で溶出する。十分なHis-CD38を精製したら、溶出物を脱塩カラムによる緩衝剤交換によって本タンパク質から除去する。
CD38トランスフェクトCHO(CHO-CD38)細胞、Daudi-luc細胞、および新鮮な多発性骨髄腫(MM)腫瘍細胞への-003、-005、および-024の結合
採取および計数の後、Daudi-luc細胞、CD38をトランスフェクトしたCHO細胞、および対照CHO細胞をPBSに再懸濁した(1×106細胞/ml)。その後、細胞を96ウェルV底プレート(100 μl/ウェル)中に置き、PBS-BSA(0.1% BSAおよび0.02%アジ化-Naを補充したPBS)中で2回洗浄した。その後、PBS-BSA中の50 μl抗体溶液を細胞に添加した(4℃、30分)。PBS-BSA中で3回洗浄した後、PBS-BSA中の50 μl(1:400希釈)のウサギ抗ヒトIgG-FITC抗体溶液を添加した(4℃暗所で、30分)。細胞を3回洗浄し、CD38抗体のCHO-CD38細胞およびDaudi-luc細胞への特異的結合をフローサイトメトリーで検出した。HuMab-KLH(本明細書中の別の場所に記載された免疫化プロトコルの使用によりGenmab B. V., Utrecht, The Netherlandsによって作製されたKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)に対するヒトモノクローナル抗体)を対照として用いた。図1および2は、異なるEC50ではあるが、-003、-005、および-024が、CHO-CD38細胞およびDaudi-luc細胞に結合することを示している(表1)。対照CHO細胞への結合は観察されなかった(データは示さない)。
抗体依存性の細胞を介する細胞毒性
Daudi-luc細胞、新鮮な多発性骨髄腫腫瘍細胞、新鮮な形質細胞白血病腫瘍細胞、ならびにJK6LおよびAMO-1多発性骨髄腫細胞(5×106細胞)を、100 μCi 51Cr(クロミウム-51;Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, The Netherlands)を添加した、RPMI++(10% コスミック(cosmic)ウシ血清(HyClone, Logan, UT, USA)を補充したRPMI 1640培養培地)中に回収し、混合物を37℃の水槽で1時間インキュベートした。細胞の洗浄(PBS中で2回、1500 rpm、5分)後、細胞をRPMI++に再懸濁し、トリパンブルー排出によって計数した。細胞を1×105細胞/mlの濃度にした。
新鮮な末梢血単核細胞(健常ボランティア, UMC Utrecht, Utrecht, The Netherlands)を、製造元の取扱説明書に従って、フィコール(Bio Whittaker;リンパ球分離培地、カタログ17-829E)で40 mlのヘパリン血液から単離した。RPMI++における細胞の再懸濁の後、トリパンブルー排出によって細胞を計数し、1×107細胞/mlの濃度にした。
50 μlの51Cr標識した標的細胞をピペッティングして96ウェルプレート中に入れ、50 μlの抗体を添加し、RPMI++中で希釈した(最終濃度10、1、0.1、0.01 μg/ml)。細胞をインキュベートし(室温、15分)、50 μlエフェクター細胞を添加し、結果的に100:1のエフェクター 対 標的比にした(最大溶解の決定のために、エフェクター細胞の代わりに、100 μl 5% Triton-X100を添加し;自発的な溶解の決定のために、50 μl標的細胞および100 μl RPMI++を用いた)。細胞をスピンダウンし(500 rpm、5分)、インキュベートした(37℃、5% CO2、4時間)。細胞をスピンダウンした後(1500 rpm、5分)、100 μlの上清をマイクロニックチューブ中に採取し、ガンマカウンターで計数した。パーセンテージ特異的溶解を以下のように計算した:
(cpm試料 - cpm標的細胞のみ)/(cpm最大溶解 - cpm標的細胞のみ)
式中cpmは1分当たりのカウントである。
ヒトボランティア由来のヒト血液(university Erlangen, Erlangen, Germany)をRPMI 1640中で2回希釈し、血液細胞をフィコール上に重層した(リンパ球分離培地1077 g/ml、710 g、RT、20分;BioWhittaker, Cambrex Bio Science Vervier, Verviers, Belgium, カタログ. 17-829E, ロット番号. 0148 32)。末梢血単核細胞(MNC)を中間層から回収し、洗浄し、10% FCS、2 mM L-グルタミン、5 U/mlペニシリン、50 μg/mlストレプトマイシン(全てBioWhittakerから得た)を補充したRPMI 1640培養培地に再懸濁し、そこに25 mM HEPES(BioWhittaker)を添加した。
標的B細胞(新鮮な形質細胞白血病腫瘍細胞、T. Valerius博士, University of Erlangen, Erlangen, Germanyから得た、JK6LおよびAMO-1 B細胞株)を20 μCi 51Cr(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)で2時間標識した。RPMI-10中での徹底的な洗浄の後、細胞を1×105細胞/mlに合わせた。MNC(50 μl)、感作抗体(50 μl)、およびRPMI-10(50 μl)を丸底マイクロタイタープレート(Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany)に添加した。新鮮な形質細胞白血病腫瘍細胞、JK6L、またはAMO-1細胞(50 μl)を添加し、200μlの最終容量にすることによってアッセイを開始した。40:1のエフェクター対標的(E:T)比を用いた。インキュベーション(3時間、37℃)後、アッセイを遠心分離によって停止し、3通り由来の51Cr放出をシンチレーションカウンター中でカウント毎分(cpm)として測定した。細胞の細胞毒性のパーセンテージを以下の公式を用いて計算した:
%特異的溶解 =(実験cpm - 基礎cpm)/(最大cpm - 基礎cpm)×100
最大の51Cr放出は過塩素酸(3%最終濃度)を標的細胞に添加することにより決定し、基礎放出は感作抗体およびエフェクター細胞の非存在下で測定した。
補体依存性の細胞毒性
Daudi-luc細胞の採取および計数の後、細胞の生存率は≧90%であるべきである。洗浄(PBS)後、細胞を2.0×106細胞/mlでRPMI-B(1% BSAを補充したRPMI)に再懸濁する。その後、細胞を96ウェル丸底プレート中に1×105細胞/ウェル(50 μl/ウェル)で置く。その後、50 μl抗体をウェルに添加する(0〜100 μg/mlの間の最終濃度範囲(RPMI-B中で3倍希釈))。インキュベーション(室温、15分)後、11 μlのプールしたヒト血清(18人の健常ドナーのプール)を各ウェルに添加した(37℃、45分)。ウェルを1回再懸濁し、120 μlをFACSチューブ(Greiner)に移した。その後、10 μlヨウ化プロピジウム(PI;Sigma-Aldrich Chemie B.V.)をこの懸濁液に添加した(10 μg/ml溶液)。溶解を(PI陽性細胞に対応する)死細胞のパーセンテージの測定によってフローサイトメトリー(FACScalibur(商標), Becton Dickinson, San Diego, CA, USA)で検出した。
FACSを用いた交差阻止の検討
CHO-CD38細胞を過剰の非標識CD38特異的抗体とインキュベートした(4℃、15分)。その後、細胞をFITC標識CD38特異的抗体とインキュベートした(濃度はEC90に近い、4℃、45分)。細胞をPBS-BSAで2回洗浄した後、蛍光をフローサイトメトリーで測定した。図11は、非標識-003がFITC標識-003の結合を阻止するのに対し、FITC標識-005の結合は阻止されないことを示している。また、非標識-005はFITC標識-005の結合を阻止するのに対し、FITC標識-003の結合は阻止されない。それらが結合を競合しないので、-003および-005は異なるエピトープに結合する。
ELISAを用いた交差阻止の検討
可溶型ヒトCD38をELISAプレートの表面にコーティングする。コーティングしたCD38を過剰の非標識CD38特異的抗体と約15分間インキュベートし、その後ビオチン化CD38特異的抗体を添加する(濃度はEC90に近い、室温、1時間)。PBS/Tweenで3回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)をコンジュゲートしたストレプトアビジンを添加し、混合物を1時間RTでインキュベートする。複合体をABTS溶液の添加によって検出することができ、HRPを介する基質変換を、ELISAリーダーを用いてOD 405 nmで測定する。
サンドイッチELISAを用いた交差阻止の検討
CD38特異的抗体をELISAプレートの表面にコーティングする。プレートに結合した抗体を、流体相中で過剰のCD38特異的抗体の存在下でビオチン化した可溶型CD38とインキュベートする。PBS/Tweenで洗浄した後、結合したビオチン化CD38を、HRPコンジュゲートしたストレプトアビジンによって1時間RTで検出する。この複合体を(PBS/Tweenで洗浄した後)ABTS溶液の添加によって検出することができ、HRPを介する基質変換を、ELISAリーダーを用いてOD 405 nmで測定する。
免疫組織化学によるヒト組織のパネルとの反応性およびカニクイザル組織との交差反応性
凍結ヒト組織(H. Niessen博士, Free University Medical Center, Amsterdam, The Netherlandsから得た)およびサル組織(Inveresk Research, Glasgow, Scotland)由来の切片を6 μmで切り、終夜風乾した。これらのクライオスタット切片をアセトン中で固定し(RT、10分)、風乾した(およそ5分)。その後、切片を、0.1% H2O2(pH 5.8;Sigma)を含む1×クエン酸/リン酸緩衝剤とインキュベートして内在性のペルオキシダーゼを阻止した。RTで20分後、切片をPBSおよび0.05% Tween-20(PBST、RT、5分;Riedel de-Haen, Germany)で2回洗浄した。その後、切片をアビジンとインキュベートし(RT、15分;DAKO, Glostrup, Denmark)、PBSTで2回洗浄し、ビオチンとインキュベートして内在性のビオチンを阻止した(RT、15分;DAKO)。切片をPBSTで2回洗浄した後、切片をPBST++(10% 正常ヒト血清(NHS, CLB, Amsterdam, Netherlands)および10% 正常ヤギ血清(NGS;DAKO)を補充したPBST)とプレインキュベートした(RT、20分)。プレインキュベーション血清を吸い取った後、切片を2% PBST++中で希釈した表示された濃度のFITC標識1次抗体とインキュベートした(RT、60分)。その後、切片を2% PBST++中でウサギ抗FITC(1:1000;DAKO)とインキュベートした(RT、30分)。切片をPBSTで洗浄した後、切片を2% PBST++中でヤギ抗ウサギビオチン(1:400;DAKO)とインキュベートした(RT、30分)。その後、切片を洗浄し、2% PBST++中でSABC-HRP(1:100;DAKO)とインキュベートした(RT、30分)。切片をPBST中で2回洗浄した後、それらをアミノ-エチル-カルバゾル(AEC)現像溶液(50 mM酢酸緩衝剤、pH 4.9、0.01% H2O2;Riedel-de-Haen)とインキュベートした(RT、10分)。最後に、切片をミリポアH2O中で洗浄し(5分)、ヘマトキシリン(DAKO)で対比染色した。グリセルゲルの使用(37℃)によって、切片をカバースリップで固定し、光学顕微鏡(Axiovision-2;Zeiss, Thornwood, NY, USA)で検討した。
フローサイトメトリーによるカニクイザルまたはアカゲザル末梢血単核細胞(PBMC)との交差反応性
5 mlのカニクイザル末梢血(Inveresk Research)を、4.5 mlショック緩衝剤(1.7 mM NH4CL、1 mM EDTA)、40 ml H2O、および450 μl 10% KHCO3を添加することによって、溶解した。溶血後、細胞を遠心分離し(1200 rpm、10分)、PBS中で3回洗浄した。トリパンブルーで細胞を計数した後、細胞をPBS-BSAに再懸濁した(1×106細胞/ml)。
内在化実験
CHO-CD38細胞を飽和濃度のFITC標識CD38特異的抗体で染色した(氷上、30分)。(10% FCSを補充したRPMI 1640中での)細胞の洗浄後、内在化を可能にするために、一方の細胞プールを37℃まで温め、他方のプールを氷上に放置した。数分の間隔(0〜120分)で、細胞アリコートを採取し、氷冷PBS-BSAに移して内在化を停止させた。試料をPBS-BSAで2回洗浄した後、EtBr(PBS-BSAに希釈、最終濃度2 mg/ml)を試料に添加し、膜に結合したFITCをクエンチングさせた。蛍光をフローサイトメトリーで測定した。
インビボSCIDルシフェラーゼ実験
このモデルでは、腫瘍細胞にホタルルシフェラーゼをトランスフェクトする。マウスへのルシフェリン(Molecular Probes, Leiden, The Netherlands)の投与により、標識細胞を、高感度CCDカメラを用いた生物発光イメージングによってインビボで検出することができる。Wetterwald et al., American Journal of Pathology 160(3), 1143-1153(2002)を参照されたい。
アポトーシス
製造元の取扱説明書(アネキシン-Vアポトーシスキット, BD Biosciences, Alphen a.d. Rijn, Netherlands)に従って、アポトーシスアッセイを実行した。手短に言えば、CD38 mAbを、5 μg/mlの-003もしくは-005または抗CD20抗体の濃度で、単独かまたは交差遮断rb-抗hIgG(50 μg/ml)の存在下で、2.5×105細胞(ルシフェラーゼトランスフェクトDaudi細胞、0.5ml RPMI++を含む24ウェルプレート中)に添加した。
RA-SCIDマウスモデルにおける組織移植片B細胞に対する-005の効果
滑膜組織の移植
Charles River Laboratories Nederland(Maastricht, the Netherlands)から購入した、SCIDマウス、系統C. B.-17/lcrCrI-SCID-bg、オス/メス、4〜12週、を標準的な温度および照明の条件下でIVCケージの中で飼い、実験室食および水を好きな時に食べさせた。移植前に、マウス(各実験群に3匹のマウス、0日目)に、比率1:1のケタミン(NIMATEK, EuroVet)およびキシラジン(Rompun, Bayer)の腹腔内注射で麻酔をかけた。手術バサミを用いて皮膚の小さい切開を作った。関節交換手術を受けている関節リウマチのある患者由来の炎症を起こした滑膜組織を、マウスの各脇腹に6つの小さい断片(合計2〜3 mm3)の塊として皮下に移植した。Permacolシアノアクリレート接着剤を用いて傷を閉じた。実験の1日目に、炎症を起こした滑膜移植物中のB細胞を調べるために、残りの滑膜組織を解析した。-005(12 mg/kg)または対照抗体(抗KLH、30 mg/kg)を、200 μlの容量で実験の8日目に(i.v.)注射した。実験の最後(14日目)に、マウスをCO2吸入によって屠殺し、滑膜移植片を外植した。移植片のうちの1つを、さらなる免疫組織化学的解析用にOCT化合物(TissueTek, Sacura Finetek Europe)中ですぐに凍結し、別の1つをさらなるRNA解析用に浸漬によって液体窒素中で凍結した。
SuperFrost(Menzel GmbH, Braunschweig)スライド上の5 μM凍結切片を、LEICA CM1900クライオスタットを用いて調製し、-80℃で保存した。融解した切片をアセトン中で10分間固定し、室温で乾燥させ、3×5分PBS中で洗浄した。全工程を室温で行なった。内在性のペルオキシダーゼ活性を、0.3%過酸化水素および0.1%アジ化ナトリウムを補充したPBSとのインキュベーションによって20分間遮断した。スライドを3×5分PBS中で洗浄し、PBS/1% BSA中の10%正常ヒト血清(NHS)/10%正常ウサギ血清(NRbS)と30分間インキュベートした。次に、1% BSA/10% NHS/10% NRbSを補充したPBSに希釈した1次抗体(マウスmAb)を60分間インキュベートした。PBS中での3×2分の洗浄後、(1% BSA/10% NHS/10% NRbSを補充した)PBSに1:50で希釈したHRPコンジュゲート(ヤギ抗マウスIg-HRP;DAKO P0447)を30分間添加した。ペルオキシダーゼシグナルを、TSA(商標)ビオチンシステム(Perkin Elmer Life Sciences, NEL700)を用いて増強した。スライドを3×2分PBS中で洗浄し、増幅緩衝剤に1:1600で希釈したビオチニルチラミドと30分間インキュベートした。PBS中での3×2分の洗浄後、(1% BSAを補充した)PBSに1:400で希釈したストレプトアビジン-HRPを30分間添加した。スライドを3×2分PBS中で洗浄し、DAB溶液(DAKO Cytomation K3465)と5分間インキュベートした。呈色反応を蒸留水で停止させた。最後に、スライドをヘマトキシリン(MERCK)で対比染色し、流水で洗浄し、カイザーのグリセリンおよびカバースリップで覆った。
染色した滑膜組織異種移植片のスコアリングは、2人の熟練の人によって盲式で行なわれた。最初に最も強い切片を一連の切片より選択し、この参照切片に最高スコア8を与えた。その後、その他の切片における染色強度を、参照切片と比べて、0〜8の等級でスコアリングした。
染色強度のスコアリングをクラスカル-ワリスの1方向ANOVAによって解析し、その後Graph Pad Prism第4.01版(Graph Pad software社, San Diego, CA, USA)を用いてダンの多重比較検定を行なった。
CD38に対するヒト抗体のコード配列のシークエンシング
RNA調製
トータルRNAを、製造元のプロトコルに従ってRNeasyキット(Qiagen, Westburg, Leusden, Netherlands)で、それぞれ、モノクローナル抗体-003、-005、および-024を発現する5×106細胞のハイブリドーマ細胞株から調製した。
RNAの5'RACE相補的DNA(cDNA)を、製造元のプロトコルに従って、SMART RACE cDNA増幅キット(Clontech)を用いて、100 ngトータルRNAから調製した。
反応産物を、電気泳動によって1% TAEアガロースゲルで分離し、エチジウムブロマイドで染色した。正確なサイズのバンドをゲルから切り出し、DNAをQiaexIIゲル抽出キット(Qiagen, カタログ番号20021)を用いてアガロースから単離した。
それぞれ20(VH-003)、16(VL-003)、15(VL-005)、ならびに6(VHおよびVL-024)の白コロニーを拾い、プラスミドを単離し、M13リバースプライマーで配列解析した後、AGOWA(Berlin, Germany)によって-003および-024のV領域ならびに-005 VL領域を配列解析した。-005 VH領域は、プライマーHCseq5を用いることによりPCR産物に対して直接配列解析した。配列は、Vector NTI改良型一式(Invitrogen)を用いて解析した。
-003のVHコード領域を、pConG1f0.4(Lonza Biologics, Slough, UK)へのクローニングのための好適な制限部位(HindIIIおよびApaI)ならびに理想的Kozak配列(GCCGCCACC)を導入した、プライマーVH3003-003forおよびRACEVHApaIを用いて、-003のVH領域を含むpGemTプラスミドクローンからPCRで増幅した。pConG1f0.4ベクターは、ヒトIgG1の重鎖定常領域を含む。VH PCR断片を、HindIIIおよびApaIを用いて、インフレームで、pConG1f0.4ベクターに挿入した。コンストラクトを配列解析によって調べた。
安定細胞株の作製のために、-003または-005の重鎖および軽鎖のベクターを、標準的なクローニング技術によって、1つの2遺伝子ベクター中で組み合わせた。
部位特異的突然変異生成を用いたエピトープマッピング
オリゴヌクレオチドプライマーは、Isogen Bioscience(Maarssen, The Netherlands)によって合成および定量された。プライマーを100 pmol/μlまでH2Oに溶かし、-20℃で保存した。全てのPCRおよびシークエンシングプライマーのまとめを表6に示す。PCRのために、製造元の取扱説明書に従って、PfuTurbo(登録商標)Hotstart DNAポリメラーゼ(Stratagene, Amsterdam, The Netherlands)を用いた。各反応混合液は、20 μlの全容量の(ポリメラーゼを補充した)PCR反応緩衝剤中に、200 μMの混合dNTP(Roche Diagnostics, Almere, The Netherlands)、10 pmolのフォワードおよびリバース両方のプライマー、100 ngのゲノムDNAまたは1 ngのプラスミドDNA、ならびに1ユニットのPfuTurbo(登録商標)Hotstart DNAポリメラーゼを含んだ。PCR反応を、TGradient Thermocycler 96(Whatman Biometra, Goettingen, Germany)で32サイクルプログラム、95℃で2分間の変性;30サイクルの95℃ 30秒間、60〜70℃勾配(または別の特定のアニーリング温度) 30秒間、および72℃ 3分間;72℃で10分間の最終伸長を用いて実行した。適当な場合、さらなる解析または処理までPCR混合物を4℃で保存した。
プライマーcd38forhaおよびcd38exrevを用いて、ヒトCD38の細胞外ドメインを(M. Glennie教授, Tenovus Research Laboratory, Southampton General Hospital, Southampton, UKから得た)プラスミドpCIpuroCD38から増幅した。このPCR反応によって、HA-タグが導入された。このPCR産物を、プライマーSPHMM38exおよびcd38exrevを用いた第2のPCR反応のための鋳型として用いた。このPCR反応によって、シグナルペプチドSPHMM、制限部位、および最適発現のための理想的Kozak配列(GCCGCCACC)が導入された。精製後、このPCR断片を発現ベクターpEE13.4(Lonza Biologics)にクローニングし、完全コード配列を、プライマーpConKseq1、pEE13.4seqrev、cd38seq1for、およびcd38seq2rev(表6)を用いたシークエンシングによって確認した。このコンストラクトをpEE13.4HACD38と名付けた。
位置237でTがAに突然変異しているか(T237A、配列番号:32)、位置272でQがRに突然変異しているか(Q272R、配列番号:33)、または位置274でSがFに突然変異している(S274F、配列番号:34)、huCD38の3つの単一突然変異体タンパク質を構築した。製造元の取扱説明書に従ってQuickChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, Amsterdam, The Netherlands)を用いて部位特異的突然変異生成を行なった。この方法には、成功した突然変異生成をスクリーニングするためのサイレントの余分な制限部位の導入または制限部位の損失が含まれる(T237A突然変異体については余分なXba1部位、Q272R突然変異体については余分なBcg1、およびS274F突然変異体についてはSsp1部位の損失)。簡潔には、5 μlの10×反応緩衝剤、1 μlのオリゴヌクレオチドHACD38T237Afor2、HACD38Q272Rfor、またはHACD38S274Ffor(100 pmol/μl)、1 μlのオリゴヌクレオチドHACD38T237Arev2、HACD38Q272Rrev、またはHACD38S274Frev(100 pmol/μl)、1 μlのdNTPミックス、3 μlのQuick溶液、1 μlのプラスミドpEE13.4HACD38(50 ng/μl)、および1 μlのPfuUltra HF DNAポリメラーゼを、50 μlの全容量中で混合し、TGradient Thermocycler 96(Whatman Biometra, Goettingen, Germany;製品# 050-801)で18サイクルプログラム:95℃で1分間の変性;18サイクルの95℃ 50秒間、60℃ 50秒間、および68℃ 10分間を用いて増幅した。PCR混合物を、さらなる処理まで4℃で保存した。次に、PCR混合物を37℃で60分間、1 μl DpnIとインキュベートして、pEE13.4HACD38 WTベクターを消化し、さらなる処理まで4℃で保存した。反応混合物を5 μlの3M NaAcおよび125 μlエタノールで沈殿させ、-20℃で20分間インキュベートし、14000×gで4℃で20分間スピンダウンした。DNAペレットを70%エタノールで洗浄し、乾燥させ、4 μlの水に溶かした。合計4 μlの反応容量を、製造元の取扱説明書(Invitrogen)に従って、One Shot Top 10DH5αT1Rコンピテント大腸菌細胞(Invitrogen, Breda, The Netherlands)に形質転換した。次に、細胞を、50 μg/mlアンピシリンを含むルリア-ベルターニ(LB)寒天プレートにプレーティングした。細菌コロニーがはっきりとするまで37℃で16〜18時間インキュベートした。プライマーpConG1seq1およびpEE13.4seqrev2(表5)を用いたコロニーPCRによってコロニーをスクリーニングし、関連する制限酵素で消化して、突然変異原性オリゴヌクレオチドの取込みをスクリーニングした。各突然変異体について2つの陽性クローンを成長させ、プラスミドDNAを単離した。完全なHACD38コード配列を、プライマーcd38seq1for、pConG1seq1、およびpEE13.4seqrev2を用いて決定し、突然変異の存在および付加的な望まない突然変異の不在を確認した。
配列解析のために、プラスミドDNA試料をAGOWA(Berlin, Germany)に送付した。VectorNTI改良ソフトウェア(Informax, Oxford, UK)を用いて、配列を解析した。
Freestyle(商標)293-F(懸濁による成育および化学的に規定されたFreestyle培地に適応したHEK-293サブクローン、(HEK-293F))細胞をInvitrogenから入手し、293fectin(Invitrogen)を用いて、製造元のプロトコルに従って、pEE13.4HACD38ならびに突然変異T237A、Q272R、およびS274Fを持つ3つのコンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞の培養上清をELISAで抗CD38結合検討のために用いた。
ELISAプレート(Greiner, #655092)を、1 μg抗HA抗体(Sigma, #H-9658)4℃でO/Nでコーティングし、その後2%ニワトリ血清でブロッキングした。トランスフェクトされたHEK293F細胞の培養上清を希釈し、ELISAプレートに適用し、RTで1時間インキュベートした。洗浄後、HuMab -003および-005の段階希釈を添加し、RTで1時間インキュベートした。結合した抗体をHRPコンジュゲートしたヤギ抗ヒトIgG抗体で検出した。アッセイをABTS(Roche, # 1112597)で発色させ、分光光度計を用いて405nmで吸収を測定した。
PBMCの増殖の誘導
-003、-005、および-024を、本質的にAusiello et al., Tissue antigens 56, 538-547(2000)に記載されたようなアッセイで検査した。簡潔には、健常ドナー由来PBMCを、200 μl RPMI++中の抗体(最終濃度:1.1-3.3-10-30 μg/ml)の存在下で、平底96ウェルプレート中に1×105細胞/ウェルで培養した。IL-15(333 ng/ml;Amgen社, Thousand Oaks, CA, USA)による細胞の刺激を陽性対照として用いた。37℃で4日間のインキュベーション後、30 μlの3H-チミジン(16.7μCi/ml)を添加し、培養をO/Nで続けた。3H-チミジン取込みを、製造元の取扱説明書に従って、Packard Cobraガンマカウンター(Packard Instruments, Meriden, DT, USA)を用いて評価した。データを、10人のドナーから得られたPBMCの平均cpm(±SEM)として示す。本結果は、-003および-005が顕著なPBMCの増殖を誘導しないということを示している(図24A)。また、-024も顕著なPBMCの増殖を誘導しなかった(データは示さない)。
IL-6の誘導
-003、-005、および-024を、Ausiello et al., Tissue antigens 56, 538-547(2000)に記載されたようなアッセイで検査した。簡潔には、PBMCを、500 μl RPMI++中の20 μg/mlの抗体および10 ng/ml LPS(Sigma-Aldrich Chemie, Zwijndrecht, The Netherlands)の存在下で、48ウェルプレート中に1×106細胞/ウェルで培養した。37℃でのO/Nインキュベーション後、上清を採取し、-20℃で保存した。IL-6濃度を、製造元の取扱説明書に従ってELISA(IL-6 ELISAキット, U-CyTech Biosciences, Utrecht, The Netherlands)で評価した。データを7人のドナーからのpg/ml(±SEM)の平均濃度として示す。本結果は、-003および-005が顕著なIL-6レベルの放出を誘導しないということを示している(図24B)。また、-024も顕著なIL-6レベルの放出を誘導しなかった(データは示さない)。
IFN-γの放出の誘導
-003、-005、および-024を、Ausiello et al., Tissue antigens 56, 538-547(2000)に記載されたようなアッセイで検査した。簡潔には、PBMCを、500 μl RPMI++中の20 μg/mlの抗体および1 μg/ml OKT-3(Sanquin, Amsterdam, The Netherlands)の存在下で、48ウェルプレート中に1×106細胞/ウェルで培養した。37℃でのO/Nインキュベーション後、上清を採取し、-20℃で保存した。IFN-γ濃度を、製造元の取扱説明書に従ってELISA(IFN-γ ELISAキット, U-CyTech Biosciences, Utrecht, The Netherlands)で評価した。データを、9人のドナーからのpg/ml(±SEM)の平均濃度として示す。本結果は、-003および-005が検出可能なIFN-γレベルの放出を誘導しないということを示している(図24C)。また、-024も顕著なIFN-γレベルの放出を誘導しなかった(データは示さない)。
-003および-005の組換えCD38への結合の親和性
-003および-005のCD38への結合を、表面プラズモン共鳴を用いて検査した。簡潔には、精製抗体を、アミンカップリングを介してCM-5センサーチップ(Biacore, Uppsala, Sweden)上に固相化した。HAタグ付きCD38(実施例3参照)を一面に流し、抗原のmAbへの結合を、Biacore 3000(Biacore)を用いてチップの表面における屈折率の変化によって検出した。-003(表7)および-005(表8)についての会合定数および速度定数は、3回の実験の平均±SDとして以下にまとめられており、-003および-005の両方がCD38に対する高い親和性を有するということを示している。
エピトープマッピング
PEPSCAN法を用いたエピトープマッピング
公知の手順(Geysen et al. 1984. Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid. Proc Natl Acad Sci USA 81:3998;Slootstra et al. 1996. Structural aspects of antibody-antigen interaction revealed through small random peptide libraries. Mol Divers 1:87;Puijk et al. 2001. Segment synthesis. In PCT, The Netherlands, p.1.)に従って、ヒトCD38のC末端の138アミノ酸を網羅する、重複する20-merの線状ペプチドおよび15-merのループ状ペプチドを合成した。さらに、C末端の配列に基づいて、領域
領域
および領域
を網羅する、異なるサイズの1つのループ状のペプチドを作製した。さらに、余分のセットを設計して、
および
から構成される2重のループ状の領域を再構築した。ネイティブのシステインをアラニンによって置き換えた。ペプチドを、クレジットカード形式の小型PEPSCANカードを用いたELISAアッセイでスクリーニングした。
ペプチドを標準的なFmoc化学を用いて合成し、捕捉剤を含むTFAを用いて脱保護した。その後、脱保護ペプチドを、アセトニトリル(1:1[容量/容量])を補充した、重炭酸アンモニウム(20 mM、pH 7.9)中の2,6-ビス(ブロモメチル)ピリジンまたは2,4,6-トリス(ブロモメチル)メシチレンの0.5 mM溶液を用いてマイクロアレイ上で反応させた。溶液中で完全に覆いながら、マイクロアレイを溶液中で30〜60分間穏やかに振盪した。最後に、マイクロアレイを過剰のMillipore H2Oで徹底的に洗浄し、PBS(pH 7.2)に1%ドデシル硫酸ナトリウム、0.1% β-メルカプトエタノールを含む破壊緩衝剤中で、70℃で30分間、超音波処理し、その後millipore H2O中でさらに45分間超音波処理した。
共有結合で連結したペプチドを含む、455-ウェルのクレジットカード形式ポリエチレンカードを(例えば、5%ウマ血清[容量/容量]および5%オボアルブミン[重量/容量]を含むブロッキング溶液に1:1000で希釈した)血清とインキュベートした(4℃、終夜)。洗浄後、ペプチドをウサギ抗ヒトIgペルオキシダーゼ(1:1000希釈、25℃、1時間)とインキュベートし、洗浄後、ペルオキシダーゼ基質(2,2'-アジノ-ジ-3-エチルベンズチアゾリンスルホネートおよび2 μl/ml 3% H2O2)を添加した。1時間後、色の発色をCCDカメラおよび画像処理システムで測定した。設定は、55 mmレンズ(Sony CCD Video Camera XC-77RR、Nikon micro-nikkor 55 mm f/2.8レンズ)付きのCCDカメラ、カメラアダプター(Sony CameraアダプターDC-77RR)、およびImage Processing SoftwareパッケージOptimas、バージョン6.5からなる(Media Cybernetics, Silver Spring, MD 20910, U.S.A.;Optimasは、ペンティアムIIコンピュータシステム上で動く)。
個々のアミノ酸をヒトCD38アミノ酸配列における最小の固有の単位を表すジペプチドモチーフによって同定した。検査した1164個のペプチドの各々に存在する全てのジペプチドモチーフに、それぞれのペプチド全体について得られたELISA値を与えた。ジペプチドモチーフを強い結合から弱い結合へと順位付けるために、各々の個々のモチーフについて得られたELISA値を1164個全ての検査した線状ペプチドおよびループ状ペプチドからの平均ELISA値で割ることによって相対的シグナルを計算し、これらを値の減少について選別した。このように、立体構造エピトープに対するアミノ酸寄与を考慮した。検査したmAbの各々について、2.5を上回るスコアのジペプチドモチーフ(すわなち、これらのモチーフを含むペプチドのELISA値は、1164個全てのペプチドについて得られたペプチドの平均ELISA値の少なくとも2.5倍である)を選択した。データをデコンボリュートし、スコアリングシステムによって線状CD38配列上に表示される1アミノ酸寄与を得た。線状CD38配列に沿ってウォーキングし、かつ固有のジペプチド単位を参照点として用いることによって、CD38アミノ酸がこの組の高スコアペプチドに存在する度に、1点を与えた。
酵素活性
ヒトCD38の酵素活性を、本質的にGraeff et al., J. Biol. Chem. 269, 30260-30267(1994)に記載されたようなアッセイで測定した。簡潔には、基質NGD+(80 μM)を、20 mM Tris-HCl、pH 7.0を含む緩衝剤中でCD38(0.6 μg/mlのHisタグ付きヒトCD38の細胞外ドメイン、His-CD38の精製に関しては実施例3参照)とインキュベートした。cGDPRの産生を410 nmの放射波長(300 nmでの励起)で分光光度法によってモニタリングすることができる。この実施例では、340 ± 60 nmの励起フィルターおよび430 ± 8 nmの放射フィルターを用いた。
-003および-005のMorphosys抗体3079との比較
抗体-003および-005をMorphosys抗体3079(TH-3079)と機能的に比較した。Morphosys抗体TH-3079のクローニングおよび発現のための方法は実施例16に記載されている。CDCのための方法は実施例6に記載されている。ADCCのための方法は実施例5に記載されている。図26Aは、-005および-003およびTH-3079が、よく似た最大溶解を示して、CDCを介するCD38トランスフェクトCHO細胞の溶解を誘導するということを示している。EC50値を比較した場合、-005抗体は、CHO-CD38細胞の溶解を誘導する点でTH3079よりも良く、2倍低いEC50を有する(表10参照)。
細胞に発現したCD38酵素活性の阻害
細胞に発現したヒトCD38の酵素活性を、本質的にGraeff et al., J. Biol. Chem. 269, 30260-30267(1994)に記載されたようなアッセイで測定した。簡潔には、基質NGD(80 μM)を、30 μg/mlのIgG1を補充した20 mM Tris-HCl, pH 7.0を含む緩衝剤中でヒトCD38をトランスフェクトした105 CHO細胞(CHO-CD38細胞)とインキュベートした。cGDPRの産生は、410 nmの放射波長(300 nm での励起)で分光光度法によってモニタリングすることができる。この実施例では、340 ± 60 nmの励起フィルターおよび430 ± 8 nmの放射フィルターを用いた。
EBV形質転換チンパンジーB細胞への抗体-005の結合
採取および計数の後、(Biomedical Primate Research Centre, Department Immunobiology, Rijswijk, The Netherlandsから受け取った)EBV形質転換チンパンジーB細胞を、PBS-BSA(0.1% BSAおよび0.02% アジ化-Naを補充したPBS)に再懸濁した(1×106 細胞/ml)。その後、細胞を96ウェルのV底プレート中に置き(100 μl/ウェル)、PBS-BSA中で2回洗浄した。その後、PBS-BSA中の50 μlのFITC標識した-005抗体溶液を細胞に添加した(4℃、30分)。細胞を3回洗浄し、EBV形質転換チンパンジーB細胞への-005の特異的結合をフローサイトメトリーで検出した。FITC標識したHuMab-KLH(本明細書の別の箇所で記載した免疫化プロトコルの使用によりGenmab B.V., Utrecht, The Netherlandsによって作製されたKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)に対するヒトモノクローナル抗体)を対照として用いた。図27は、EBV形質転換チンパンジーB細胞への-005の用量依存的な結合を示す。EBV形質転換チンパンジーB細胞への用量依存的な結合は、対照抗体HuMab-KLHでは観察されなかった。
抗体-005のデキサメタゾンおよびボルテゾミブとのインビトロ併用療法
デキサメタゾン(Dex)およびボルテゾミブ(Bor;Velcade(登録商標))を用いる三重の組み合わせセッティングにおいてインビトロで多発性骨髄腫細胞株UM6の細胞死を誘導するその能力について抗体-005を検討した。三重処置の結果を、単一の薬物処置および二重の併用処置と比較した。
多発性骨髄腫の臨床的診断のある患者を、抗CD38抗体-005、メルファラン、およびプレドニゾンの組み合わせで処置する。
- 抗体-005: 8 mg/kgを週に1回4週間投与する(IV)
- メルファラン: 1日に0.2 mg/kgをIVで4日間4〜6週毎に
- プレドニゾン: 2 mg/kgをPOで4日間4〜6週毎に。
多発性骨髄腫の臨床的診断のある患者を、抗CD38抗体-005、サリドマイド、およびデキサメタゾンの組み合わせで処置する。
- 抗体-005: 8 mg/kgを週に1回4週間投与する(IV)
- サリドマイド: 200 mg/日(PO)
- デキサメタゾン:各28日サイクルの1〜4、9〜12、および17〜20日目に40 mg/日(PO)。
多発性骨髄腫の臨床的診断のある患者を、抗CD38抗体-005、レナリドマイド、およびデキサメタゾンの組み合わせで処置する。
- 抗体-005: 8 mg/kgを週に1回4週間投与する(IV)
- レナリドマイド: 25 mg/日(PO)
- デキサメタゾン: 各28日サイクルの1〜4、9〜12、および17〜20日目に40 mg/日(PO)。
多発性骨髄腫の臨床的診断のある患者を、抗CD38抗体-005、ボルテゾミブ、およびデキサメタゾンの組み合わせで処置する。
- 抗体-005: 8 mg/kgを週に1回4週間投与する(IV)
- ボルテゾミブ: 各21日サイクルの1、4、6、および11日目に1.3 mg/m2(IV)
- デキサメタゾン: 各28日サイクルの1〜4、9〜12、および17〜20日目に40 mg/日(PO)。
Claims (27)
- i)以下からなる群より選択されるヒト軽鎖可変領域およびヒト重鎖可変領域を含む、CD38に結合する非アゴニスト抗体:
a)該軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:3に示される配列を有するVL CDR1、SEQ ID NO:4に示される配列を有するVL CDR2およびSEQ ID NO:5に示される配列を有するVL CDR3を含み、該重鎖可変領域が、SEQ ID NO:8に示される配列を有するVH CDR1、SEQ ID NO:9に示される配列を有するVH CDR2およびSEQ ID NO:10に示される配列を有するVH CDR3を含む、
b)該軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:13に示される配列を有するVL CDR1、SEQ ID NO:14に示される配列を有するVL CDR2およびSEQ ID NO:15に示される配列を有するVL CDR3を含み、該重鎖可変領域が、SEQ ID NO:18に示される配列を有するVH CDR1、SEQ ID NO:19に示される配列を有するVH CDR2およびSEQ ID NO:20に示される配列を有するVH CDR3を含む、ならびに
c)該軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:23に示される配列を有するVL CDR1、SEQ ID NO:24に示される配列を有するVL CDR2およびSEQ ID NO:25に示される配列を有するVL CDR3を含み、該重鎖可変領域が、SEQ ID NO:28に示される配列を有するVH CDR1、SEQ ID NO:29に示される配列を有するVH CDR2およびSEQ ID NO:30に示される配列を有するVH CDR3を含む、
ii)少なくとも1つのグルココルチコイド、および
iii)サリドマイドもしくはサリドマイド類似体またはプロテアソーム阻害剤を含む、少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤
を組み合わせてなる、
それを必要とする個体に該抗体、該少なくとも1つのグルココルチコイドおよび少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤とを同時にまたは個別に投与してCD38を発現する腫瘍細胞の成長および/または増殖を阻害するための薬学的組成物。 - i)以下からなる群より選択されるヒト軽鎖可変領域およびヒト重鎖可変領域を含む、CD38に結合する非アゴニスト抗体:
a)該軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:3に示される配列を有するVL CDR1、SEQ ID NO:4に示される配列を有するVL CDR2およびSEQ ID NO:5に示される配列を有するVL CDR3を含み、該重鎖可変領域が、SEQ ID NO:8に示される配列を有するVH CDR1、SEQ ID NO:9に示される配列を有するVH CDR2およびSEQ ID NO:10に示される配列を有するVH CDR3を含む、
b)該軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:13に示される配列を有するVL CDR1、SEQ ID NO:14に示される配列を有するVL CDR2およびSEQ ID NO:15に示される配列を有するVL CDR3を含み、該重鎖可変領域が、SEQ ID NO:18に示される配列を有するVH CDR1、SEQ ID NO:19に示される配列を有するVH CDR2およびSEQ ID NO:20に示される配列を有するVH CDR3を含む、ならびに
c)該軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:23に示される配列を有するVL CDR1、SEQ ID NO:24に示される配列を有するVL CDR2およびSEQ ID NO:25に示される配列を有するVL CDR3を含み、該重鎖可変領域が、SEQ ID NO:28に示される配列を有するVH CDR1、SEQ ID NO:29に示される配列を有するVH CDR2およびSEQ ID NO:30に示される配列を有するVH CDR3を含む、
ii)少なくとも1つのグルココルチコイド、および
iii)サリドマイドもしくはサリドマイド類似体またはプロテアソーム阻害剤を含む、少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤
を組み合わせてなる、
該抗体、該少なくとも1つのグルココルチコイドおよび少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤とを同時にまたは個別に投与して、それを必要とする個体でCD38を発現する腫瘍細胞が関与する癌を処置するための薬学的組成物。 - 自己末梢幹細胞移植または骨髄移植の前に個体に投与される、請求項1または2記載の薬学的組成物。
- 細胞毒性薬剤および/または血管形成阻害剤を含む少なくとも1つのさらなる非コルチコステロイド化学療法剤を組み合わせてなる、請求項1〜3のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- アルキル化薬剤を含む少なくとも1つのさらなる非コルチコステロイド化学療法剤を組み合わせてなる、請求項1〜4のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- メルファラン、メクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、カルムスチン(BSNU)、ロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン(DTIC)、プロカルバジン、マイトマイシンC、シスプラチン、およびカルボプラチンなどの、その他のプラチナ誘導体からなる群より選択される1つまたは複数の薬剤を含む少なくとも1つのさらなる非コルチコステロイド化学療法剤を組み合わせてなる、請求項1〜5のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤が、サリドマイドである、請求項1〜6のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- サリドマイド類似体がCC-5013またはCC4047である、請求項1〜6のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- プロテアソーム阻害剤が、ボルテゾミブである、請求項1〜6のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- ビンクリスチンなどの、ビンカアルカロイドを含む少なくとも1つのさらなる非コルチコステロイド化学療法剤を組み合わせてなる、請求項1〜9のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- ドキソルビシンなどの、アントラサイクリンを含む少なくとも1つのさらなる非コルチコステロイド化学療法剤を組み合わせてなる、請求項1〜10のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 少なくとも1つのグルココルチコイドがプレドニゾンを含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 少なくとも1つのグルココルチコイドがプレドニゾンを含み、かつ少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤がサリドマイドを含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 少なくとも1つのグルココルチコイドがプレドニゾンを含み、かつ少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤がメルファランおよびサリドマイドを含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 少なくとも1つのグルココルチコイドがデキサメタゾンを含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 少なくとも1つのグルココルチコイドがデキサメタゾンを含み、かつ少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤がサリドマイドおよび/またはレナリドマイドを含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項1〜16のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 抗体がヒトモノクローナル抗体である、請求項1〜17のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 抗体がCD38のアンタゴニストである、請求項1〜18のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 抗体が、配列番号:2に示されたアミノ酸配列を有するVL領域、および配列番号:7に示されたアミノ酸配列を有するVH領域を含む抗体である、請求項1〜19のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 抗体が、配列番号:12に示されたアミノ酸配列を有するVL領域、および配列番号:17に示されたアミノ酸配列を有するVH領域を含む抗体である、請求項1〜19のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 抗体が、配列番号:22に示されたアミノ酸配列を有するVL領域、および配列番号:27に示されたアミノ酸配列を有するVH領域を含む抗体である、請求項1〜19のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 腫瘍細胞が多発性骨髄腫細胞または慢性リンパ球性白血病細胞である、請求項1〜22のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 腫瘍細胞が再発性または難治性の腫瘍細胞である、請求項1〜23のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 個体が、同じ癌に対する前抗癌処置を受けていない、請求項1〜24のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 個体が、同じ癌に対する前抗癌処置に応答していない、請求項1〜24のいずれか一項記載の薬学的組成物。
- 抗体、少なくとも1つのグルココルチコイド、および少なくとも1つの非コルチコステロイド化学療法剤が全て個別に投与される、請求項1〜26のいずれか一項記載の薬学的組成物。
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