RS55442B1 - Antitela protiv cd38 za lečenje multiplog mijeloma - Google Patents

Antitela protiv cd38 za lečenje multiplog mijeloma

Info

Publication number
RS55442B1
RS55442B1 RS20161147A RSP20161147A RS55442B1 RS 55442 B1 RS55442 B1 RS 55442B1 RS 20161147 A RS20161147 A RS 20161147A RS P20161147 A RSP20161147 A RS P20161147A RS 55442 B1 RS55442 B1 RS 55442B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
antibody
human
peptide
sequence
Prior art date
Application number
RS20161147A
Other languages
English (en)
Inventor
Michel De Weers
Yvo Graus
Judith Oprins
Paul Parren
Jan Van De Winkel
Martine Van Vugt
Original Assignee
Genmab As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genmab As filed Critical Genmab As
Priority claimed from PCT/DK2006/000166 external-priority patent/WO2006099875A1/en
Publication of RS55442B1 publication Critical patent/RS55442B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

OBLAST TEHNIKE
[0001]Predmetni pronalazak se odnosi na antitela koja vezuju CD38, takva antitela imaju specifične karakteristike i korisna su za lečenje inter alia multiplog mijeloma.
POZADINA
[0002]Multipli mijelomje malignitet B ćelija koji je okarakterisan latentnom akumulacijom sekretornih plazma ćelija u koštanoj srži sa niskim proliferativnim indeksom i produženim životnim vekom. Bolest na kraju napada kosti i koštanu srž, što dovodi do višestrukih tumora i lezija širom skeletnog sistema.
[0003]Približno 1% svih kancera, a nešto više od 10% svih hematoloških maligniteta, može se pripisati multiplom mijelomu (MM). Učestalost MM-a se povećava u starosnoj populaciji, sa prosečnom starošću u vreme postavljanja dijagnoze oko 61 godina.
[0004]Trenutno dostupne terapije multiplog mijeloma uključuju hemoterapiju, transplantaciju matičnih ćelija, Thalomid<R>(talidomid), Velcade<R>(bortezomib), Aredia<R>(pamidronat), i Zometa<R>(zoledronatna kiselina). Sadašnji protokoli lečenja, koji uključuju kombinaciju hemoterapeutskih agenasa kao što su vinkristin, BCNU, melfalan, ciklofosfamid, adriamicin i prednizon ili deksametazon, doprinose kompletnoj stopi remisije od samo oko 5%, a medijana preživljavanja je oko 36-48 meseci od vremena postavljanja dijagnoze. Najnovija dostignuća koriste visoke doze hemoterapije praćene transplatacijom autologne koštane srži ili transplantacijom mononuklearnih ćelija periferne krvi, koja su povećala potpunu stopu remisije i trajanje remisije. Ipak, ukupno preživljavanje je tek neznatno produženo i nije bilo dobijenih dokaza za izlečenje. Konačno, svi MM pacijenti imaju povraćaj bolesti, čak i pod terapijom održavanja sa interferonom-alfa (IFN-a) samostalno ili u kombinaciji sa steroidima.[0005]Efikasnost dostupnih hemoterapeutskih režima lečenja MM je ograničena niskom stopom ćelijske proliferacije i razvojem rezistencije na više lekova. Za više od 90% pacijenata sa MM-om, bolest postaje hemorezistentna. Kao rezultat toga, traže se alternativni režimi u lečenju usmereni ka adoptivnoj imunoterapiji ciljanjem površinskih antigena na plazma ćelijama.
[0006]CD38 je primer antigena izraženog na takvim malignim plazma ćelijama i izražen je u različitim malignim hematološkim oboljenjima, uključujući ali nije ograničen na multipli mijelom, B-ćelijsku hroničnu limfocitnu leukemiju, B-ćelijsku akutnu limfocitnu leukemiju, Valdenstrom makroglobulinemiju, primarnu sistemsku amiloidozu, mantle ćelijski limfom, pro-limfocitnu/mijelocitnu leukemiju, akutnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu mijeloidnu leukemiju, folikularni limfom, NK-ćelijsku leukemiju i plazma-ćelijsku leukemiju. Ekspresija CD38 je opisana na epitelnim/endotelijalnim ćelijama različitog porekla, uključujući žlezdani epitel prostate, ćelije ostrvaca u pankreasu, duktalni epitel u žlezdama, uključujući parotidnu žlezdu, bronhijalne epitelne ćelije, ćelije testisa i jajnika i tumor epitela kod kolorektalnog adenokarcinoma. Bolesti, u kojima bi ekspresija CD38 mogla biti angažovana, uključuju, ali nisu ograničene na bronho-cpitclnc karcinome pluća, kancer dojke (razvija se od maligne proliferacije obloge epitela u kanalima i lobulima dojke), tumore pankreasa, razvijene iz B-ćelija (insulinome), tumore koji proističu iz crevnog epitela (npr adenokarcinom i karcinom skvamoznih ćelija) u CNS-u, neuroblastome koji eksprimiraju CD38. Ostale bolesti obuhvataju karcinom prostate, seminome testisa i jajnika.
[0007]Normalno, CD38 je eksprimiran od strane hemopoetskih ćelija i u čvrstim tkivima. Što se tiče hemopoetskih ćelija, većina medularnih timocita su CD38 , u odmoru i cirkulišuće T- i B-ćelije su CD38" i aktivirane ćelije su CD38<+>. CD38 je takođe izražen na oko 80% NK ćelija u odmoru i monocitima i na limfnom čvoru germinalnog centra limfoblasta, plazma B ćelijama i nekim intrafolikularnim ćelijama. CD38 takođe može biti eksprimiran od strane dendritskih ćelija. Značajan deo normalnih ćelija koštane srži, posebno prekursornih ćelija, eksprimira CD38. Pored toga, 50-80% krvnih ćelija pupčane vrpce je CD38<+>i ostaje tako u ljudskoj krvi u prve dve do tri godine života. Dodatno, limfoidnim prekusornim ćelijama, CD38 je takođe eksprimiran na eritrocitima i na trombocitima.
[0008]Sto se tiče čvrstih tkiva, CD38 je eksprimiran u crevima pomoću intra-epitelnih ćelija i lamine proprie limfocita od strane Purkinijevih ćelija i neurofibrilarnih čvorova u mozgu, epitelnih ćelija u prostati, p ćelija u pankreasu, osteoklasta u kostima, retinalnih ćelija u oku, i sarcolemma glatkih i prugastih mišića.
[0009]Funkcije pripisane CD38 uključuju obe i posredovanje receptora u adheziji i signalne događaje i (ekto-) enzimsku aktivnost. Kao ektoenzim, CD38 koristi NAD<+>kao supstrat za formiranje ciklične ADP-riboze (cADPR) i ADPR, ali takođe i nikotinamida i nikotinske kiseline-adenin dinukleotid fosfata (NAADP). cADPR se pokazao da deluje kao drugi glasnik za mobilizaciju Ca<2+>od strane endoplazmatskog retikuluma. Pored signalizacije preko Ca<2+>, CD38 signalizacija se odvija preko unakrsne komunikacije antigen-receptornih kompleksa na T i B ćelijama ili drugih vrsta kompleksa receptora, npr MHC molekula, pa je na ovaj način uključen u nekoliko ćelijskih odgovora, ali takođe u prebacivanju i sekreciji IgGl.
[0010]Anti-CD38 antitela su opisana u literaturi, na primer u Lande R, et al., Cell Immunol. 220(1), 30-8 (2002), Ausicllo CM, ct al, Tissuc Antigcns. 56 (6), 539- 47 (2000), i Cotncr T. ct al., Int J Immunopharmacol. 3(3), 255-68 (1981). Ellis, J.H. et al (J. Immunol, 1995, 155: 925-937) opisuju misija anti-CD38 mAt označena AT13/5 i humanizovani oblik AT13/5. CD38 ima niz funkcija, koje mogu ili ne moraju biti aktivirane od strane molekula vezivanjem za CD38. Na primer mišje anti-CD38 antitelo IB4 ima agonistička svojstva u odnosu na CD38 (Ausiello CM, et al., supra). Pokazano je da IB4 indukuje aktivaciju T ćelija kao što je naznačeno mobilizacijom Ca<2+>u Jurkat ćelijama (Zubiaur M, et al., J. Immunol. 159 (1), 193-205 (1997), izaziva značajnu proliferaciju mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC-a), indukuje oslobađanje značajnih nivoa IL-6 i indukuje oslobađanje detektovanih nivoa IFN-y (Lande, Zubiaur Morra, Ansiello supra).
SUŠTINA PRONALASKA
[0011]Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo koje se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br:31), a koje se ne vezuje za mutanta humanog CD38 gde je ostatak serina na položaju 274 supstituisan sa ostatkom fenilalanina (SEK ID Br:34) u istom stepenu u kome se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br:31), a koje se ne vezuje za mutanta humanog CD38 gde je ostatak glutamina na položaju 272 supstituisan sa ostatkom arginina (SEK ID Br:33) u istom stepenu u kome se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br:31); pri čemu antitelo prepoznaje motive KRN i VOTL humanog CD38 (SEK ID Br:31).
[0012]Antitelo iz pronalaska može dodatno da se vezuje za mutanta humanog CD38 gde je ostatak treonina na položaju 237 supstituisan sa ostatkom alanina (SEK ID Br:32), u istom stepenu u kome se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br:31).
[0013]Bilo koje antitelo iz pronalaska kao što je gore opisano može dodatno da sadrži VHCDR3 koji ima sekvencu kao što je dalje izneto u SEK ID Br:20.
[0014]Bilo koje antitelo iz pronalaska kao što je gore opisano može biti humano monoklonsko antitelo.
[0015]Bilo koje antitelo iz pronalaska kao što je gore opisano može biti karakterisano time što je ono pune dužine IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ili IgM antitelo, kao što je IgGl antitelo, poželjno TgG1 ,k antitelo ili IgM antitelo, poželjno kao IgM,kantitelo.
[0016]Bilo koje antitelo iz pronalaska kao što je gore opisano može biti fragment antitela ili pojedinačni lanac antitela.
[0017]Bilo koje antitelo iz pronalaska kao što je gore opisano može dalje da sadrži
linker helator za vezivanje radioizotopa.
[0018]Bilo koje antitelo iz pronalaska kao što jc gore opisano može biti u suštinski izolovanom obliku.
[0019]Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira bilo koje od gore opisanih antitela.
[0020]Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira bilo koje od gore opisanih antitela. Takav ekspresioni vektor može dalje da sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni region lakog lanca, teškog lanca ili oba i lakih i teških lanaca humanog antitela.
[0021]Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje eukariotsku ili prokariotsku ćeliju domaćina koja proizvodi bilo koje od gore opisanih antitela.
[0022]Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje imunokonjugat koji sadrži bilo koje od gore opisanih antitela vezanih za citotoksični agens, radioizotop, ili lek.
[0023]Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje bispecifičan ili multispecifičan molekul koji sadrži bilo koje od gore opisanih antitela i ima vezujuće specifičnosti za humanu efektorsku ćeliju.
[0024]Takav bispecifičan ili multispecifičan molekul može da sadrži bilo koje od gore opisanih antitela i vezujućih specifičnosti za CD3, CD4, CD138, IL-15R, membranski vezan ili receptorno vezan TNF-a, humani Fc receptor, ili membranski vezan ili receptorno vezan IL-15.
[0025]Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bilo koje od gore opisanih antitela, imunokonjugate, bispecifične ili multispecifične molekule i farmaceutski prihvatljiv nosač. Takva farmaceutska kompozicija može dodatno da sadrži jedan ili više terapcutskih agenasa.
[0026] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje bilo koje od gore opisanih antitela, imunokonjugate, bispecifične ili multispecifične molekule, ili farmaceutske kompozicije, ili bilo koji od gore opisanih ekspresionih vektora za upotrebu kao leka.
[0027] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje bilo koje od gore opisanih antitela, imunokonjugate, bispecifične ili multispecifične molekule, ili farmaceutske kompozicije, ili bilo koji od gore opisanih ekspresionih vektora za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije bolesti ili poremećaja u kome učestvuju ćelije koje izražavaju CD38, pri čemu je bolest ili poremećaj izabran iz grupe koja se sastoji od B-ćelijskih limfoma/leukemija uključujući prekusorne B ćelijske limfoblastne leukemije/limfome i B ćelijske nehočkinske limfome; akutnu limfoblastnu leukemiju; neoplazme odraslih B ćelija uključujući B ćelijsku hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL)/sitnoćelijski limfocitni limfom (SLL); B ćelijsku akutnu limfocitnu leukemiju; B ćelijsku prolimfocitnu leukemiju; limfoplazmacitni limfom; mantle ćelijski limfom (MCL); folikularni limfom (FL) uključujući niskog stepena, srednjeg-stepena i visokog stepena FL; folikularni centralni limfom kože; marginalno zonalni B ćelijski limfom uključujući MALT tip, nodalni i splenični tip; leukemiju dlakastih ćelija; difuzni krupno ćelijski B limfom; Burkitt-ov limfom; plazmacitom; plazma ćelijski mijelom; plazma ćelijsku leukemiju; post-transplatacioni limfoproliferativni poremećaj; Valdenstrom makroglobulinemiju; plazma ćelijske leukemije; anaplastični krupnoćelijski limfom (ALCL); multipli mijelom; Hočkinov limfom; odrasle T ćelijske i NK ćelijske neoplazme uključujući T ćelijsku prolimfocitnu leukemiju; T ćelijsku krupnogranularnu limfocitnu leukemiju, agresivnu NK ćelijsku leukemiju; adultnu T ćelijsku leukemiju/limfom; ekstranodalni NK/T ćelijski limfom; nazalni tip, enteropatijski-tip T ćelijskog limfoma; hepatosplenični T ćelijski limfom; subkutani panikulitisu-sličan T ćelijski limfom; blastni NK ćelijski limfom; Mvcosis Fungoides/Sezarv sindrom; primarni kutani CD30 pozitivni T ćelijski limfoproliferativni poremećaji uključujući kutani anaplastični krupnoćelijski limfom C-ALCL, limfomatoidnu papulozu i granične lezije; angioimunoblastni T ćelijski limfom, periferni T ćelijski limfom nespecifikovan; anaplastični krupnoćelijski limfom; akutnu mijeloidnu leukemiju uključujući akutnu promijelocitnu leukemiju; i hronične mijeloproliferativne bolesti uključujući hroničnu mijeloidnu leukemiju. B ćelijski nehočkinski limfom može biti izabran iz grupe koja sc sastoji od limfomatoidnih granulomatosisa; primarnog efuzionog limfoma; intravaskularnog krupnoćelijskog B limfoma, medij astinalnog krupnoćelijskog B limfoma; bolesti teškog lanca uključuju y, u. i a bolesti; limfome uzrokovane terapijom sa imunosupresivnim agensima uključujući ciklosporin-indukovan limfom; i metotreksat-indukovan limfom.
[0028] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje bilo koje od gore opisanih antitela, imunokonjugate, bispecifične ili multispecifične molekule, ili farmaceutske kompozicije, ili bilo koji od gore opisanih ekspresionih vektora za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije multiplog mijeloma.
[0029]U predmetnom pronalasku gde se bilo koje od gore opisanih antitela, imunokonjugata, bispecifičnih ili multispecifičnih molekula, ili farmaceutskih kompozicija, ili bilo koji od gore opisanih ekspresionih vektora koriste u bilo kojim gore opisanim postupcima za lcčcnjc ili prevenciju bolesti, postupak može dodatno da sadrži primenu jednog ili više terapeutskih agenasa na subjektu. Jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa može biti izabran od hemoterapeutskog agensa, anti-inflamatornog agensa, ili imunosupresivnog i/ili imunomodulatornog agensa. Jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa može biti izabran iz grupe koja se sastoji od cisplatina, gefitiniba, cetuksimaba, rituksimaba, bevacizumaba, erlotiniba, bortezomiba, talidomida, pamidronata, zoledronatne kiseline, klodronata, risendronata, ibandronata, etidronata, alendronata, tiludronata, arsen trioksida, lenalidomida, filgrastima, pegfilgrastima, sargramostima,suberoilanilid hidroksamične kiseline, i SCIO-460.
[0030] Predmetni pronalazak takođe obezbeđujein vitrometod za detekciju prisustva CD38 antigena, ili ćelije koja eksprimira CD38, u uzorku koji obuhvata: a) dovođenje u kontakt uzorka sa bilo kojim od gore opisanih antitela pod uslovima koji dozvoljavaju obrazovanje kompleksa između antitela i CD38;
b) otkrivanje formiranja kompleksa.
[0031] Takođe je ovde opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38 kodirano od strane
(i) nukleinskih kiselina humanog lakog lanca i humanog teškog lanca koje sadrže nukleotidne sekvence u njihovim varijabilnim regionima kao što je navedeno u SEK ID Br: 1 i SEK ID Br: 6, respektivno; (ii) nukleinskih kiselina humanog lakog lanca i humanog teškog lanca koje sadrže nukleotidne sekvence u njihovim varijabilnim regionima kao što je navedeno u SEK ID Br: Ili SEK ID Br: 16, respektivno; (iii) nukleinskih kiselina humanog lakog lanca i humanog teškog lanca koje sadrže nukleotidne sekvence u njihovim varijabilnim regionima kao što je navedeno u SEK ID Br: 21 i SEK ID Br:
26, respektivno; ili
(iv) nukleinskih kiselina humanog lakog lanca i humanog teškog lanca koje sadrže nukleotidne sekvence u njihovim varijabilnim regionima, koje su konzervativne sekventne modifikacije sekvenci dalje iznetih u (i), (ii) ili (iii).
[0032] Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38 koje sadrži VHCDR3 koji ima sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 10.
[0033] Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VLCDR3 koji ima sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 5 i VHCDR3 koji ima sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 10.
[0034]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži varijabilne regione humanog lakog lanca i humanog teškog lanca, gde varijabilni region lakog lanca sadrži VLCDR1 koji ima sekvencu kao što jc navedeno u SEK ID Br: 3, VLCDR2 koji ima sekvencu kao što jc navedeno u SEK ID Br: 4 i VLCDR3 koji ima sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 5, i varijabilni region teškog lanca sadrži VHCDR1 koji ima sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 8, a VHCDR2 koji ima sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 9 i VHCDR3 koji ima sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 10.
[0035]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VLregion koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 2.
[0036]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VLregion koji ima najmanje oko 90%, kao što je najmanje oko 95%> identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom kao što je navedeno u SEK ID Br: 2.
[0037]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VHregion koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 7.
[0038]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VHregion koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata VHCDR1 - VHCDR3 region iz SEK ID Br: 7.
[0039]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VHregion koji
ima najmanje oko 90%>, kao što je najmanje oko 95%> identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom kao što je navedeno u SEK ID Br: 7 ili prema VHCDR1 - VHCDR3 obuhvatnom regionu iz SEK ID Br: 7.
[0040]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VHregion
koji ima 1-5, kao što su 1-3 aminokiselinske supstitucije, brisanja ili dopuna u odnosu na sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 7 ili prema VHCDR1 - VHCDR3 obuhvatnom regionu iz SEK ID Br: 7.
[0041]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VLregion kao što je gore definisano i VHregion kao što je gore definisano.
[0042]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VHCDR3 koji ima sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 20.
[0043]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VLCDR3 koji ima sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 15 i VHCDR3 koji ima sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 20.
[0044]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži varijabilne regione humanog lakog lanca i humanog teškog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži VLCDR1 koji ima sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 13, VLCDR2 koji ima sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 14 i VLCDR3 koji ima sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 15, a varijabilni region teškog lanca sadrži VHCDR1 koji ima sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 18, VHCDR2 koji ima sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 19 i VHCDR3 koji ima sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 20.
[0045]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VLregion koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 12.
[0046]Ovde jc opisano antitelo koje sc vezuje za humani CD38, koje sadrži VLregion koji ima najmanje oko 90%, kao što je najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom prema SEK ID Br: 12.
[0047]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VHregion koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 17.
[0048]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VHregion koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja obuhvata VHCDR1 - VHCDR3 region iz SEK ID Br: 17.
[0049]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VHregion koji
ima najmanje oko 90%>, kao što je najmanje oko 95%> identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom kao što je navedeno u SEK ID Br: 17 ili prema VHCDR1 - VHCDR3 obuhvatnom regionu iz SEK ID Br: 17.
[0050]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VHregion koji ima 1-5, poput 1-3 aminokiselinskih supstitucija, brisanja ili dopuna u odnosu na sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 17 ili prema VHCDR1 - VHCDR3 obuhvatnom regionu iz SEK ID Br: 17.
[0051]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VLregion kao što je gore definisano i VHregion kao što je gore definisano.
[0052]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VHCDR3 koji ima sekvencu kao što je dalje izneto u SEK ID Br: 30.
[0053]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VLCDR3 koji ima sekvencu kao što je dalje izneto u SEK ID Br: 25 i VHCDR3 koji ima sekvencu kao što je dalje izneto u SEK ID Br: 30.
[0054]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži varijabilne regione humanog lakog lanca i humanog teškog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži VLCDR1 koji ima sekvencu kao što je dalje izneto u SEK TD Br: 23, VLCDR2 koji ima sekvencu kao što je dalje izneto u SEK ID Br: 24 i VLCDR3 koji ima sekvencu kao što je dalje izneto u SEK ID Br: 25, a varijabilni region teškog lanca sadrži VHCDR1 koji ima sekvencu kao što je dalje izneto u SEK ID Br: 28, VHCDR2 koji ima sekvencu kao što je dalje izneto u SEK ID Br: 29, VHCDR3 koji ima sekvencu kao što jc dalje izneto u SEK ID Br: 30.
[0055]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VLregion koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je dalje izneto u SEK ID Br: 22.
[0056]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VLregion koji ima najmanje oko 90%, kao što je najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom prema SEK ID Br: 22.
[0057]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VHregion koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je dalje izneto u SEK ID Br: 27.
[0058]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VHregion koji sadrži aminokiselinsku sekvencu obuhvatajući VHCDR1 - VHCDR3 region iz SEK ID Br: 27.
[0059]Ovde jc opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VHregion koji ima najmanje oko 90%, kao što je najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence sa SEK ID Br: 27 ili prema VHCDR1 - VHCDR3 obuhvatnom regionu iz SEK ID Br: 27.
[0060]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VHregion koji ima 1-5, poput 1-3 aminokiselinskih supstitucija, brisanja ili dopuna u odnosu na sekvencu kao što je dalje izneto u SEK ID Br: 27 ili u odnosu na VHCDR1 - VHCDR3 obuhvatni region iz SEK ID Br: 27.
[0061]Ovde je opisano antitelo koje se vezuje za humani CD38, koje sadrži VLregion kao što je gore definisano i VH region kao što je gore definisano.
[0062]Ovde je opisan peptid koji se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31), a koji se ne vezuje za mutanta humanog CD38, gde je ostatak serina na položaju 274 supstituisan sa ostatkom fenilalanina (SEK ID Br: 34), u istom stepenu kojim se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
[0063]Ovde je opisan peptid kao što je gore definisan, pri čemu je EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, gde je ostatak serina na položaju 274 supstituisan sa ostatkom fenilalanina (SEK ID BR: 34), manja od 50%, kao što je manja od 10%, manja od 5% ili manja od 1%> od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
[0064]Ovde je opisan peptid koji se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31), a koji se ne vezuje za mutanta humanog CD38, gde je ostatak glutamina na položaju 272 supstituisan sa ostatkom arginina (SEK ID Br: 33), u istom stepenu kojim se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
[0065]Ovde je opisan peptid kao što je gore definisano, pri čemu je EC5ovezivanja peptida za mutanta humanog CD38, gde je ostatak glutamina na položaju 272 supstituisan ostatkom arginina (SEK ID Br: 33), manja od 50%, kao što je manja od 10%, manja od 5% ili manja od 1% od EC™ vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
[0066]Ovde je opisan peptid kao što je gore definisano gde se pomenuti peptid vezuje za mutanta humanog CD38, pri čemu je ostatak treonina na položaju 237 supstituisan ostatkom alanina (SEK ID Br: 32), u istom stepenu kojim se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
[0067]Ovde je opisan peptid kao što je gore definisano, pri čemu EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, gde je ostatak treonina na položaju 237 supstituisan sa ostatkom alanina (SEK ID Br: 32) odgovara 75% - 125% od EC5ovezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
[0068]Ovde je opisan peptid koji se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31), pri čemu peptid poseduje sledeće karakteristike vezivanja: (I) vezuje se za mutanta humanog CD38, gde je serinski ostatak na položaju 274 supstituisan sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34), u istom stepenu u kome se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31), (ii) vezuje se za mutanta humanog CD38, gde je glutaminski ostatak na položaju 272 supstituisan sa argininskim ostatkom (SEK ID Br: 33), u istom stepenu u kome se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31), i (iii) vezuje se za mutanta humanog CD38, gde je treoninski ostatak na položaju 237 supstituisan sa alaninskim ostatkom (SEK ID Br: 32), u istom stepenu u kome se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
[0069]Ovde je opisan peptid koji se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31), pri čemu peptid poseduje sledeće karakteristike vezivanja: (i) ne vezuje se za mutanta humanog CD38, gde je serinski ostatak na položaju 274 supstituisan sa fcnilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34), u istom stepenu u kome se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31), (ii) ne vezuje se za mutanta humanog CD38, gde je glutaminski ostatak na položaju 272 supstituisan sa argininskim ostatkom (SEK ID Br: 33), u istom stepenu u kome se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31), (iii) vezuje se za mutanta humanog CD38, gde je treoninski ostatak na položaju 237 supstituisan sa alaninskim ostatkom (SEK ID Br: 32), u istom stepenu u kome se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
[0070]Ovde je opisan peptid kao što je gore definisano, pri čemu se EC50određuje korišćenjem tehnike ELISA kao što je opisano u Primeru 17 opisa.
[0071]Ovde je opisan peptid koji se takmiči sa antitelom prema realizaciji (i) iznad za vezivanje za CD38. U jednoj realizaciji konkurencija se određuje upotrebom tehnike ELISA kao što je opisano u Primeru 8 ili 9 specifikacije, gde je konkurencija definisana signalom od najmanje 90%, što je procenjeno apsorpcijom, ili upotrebom merenja unakrsnog blokiranja kao što je opisano u primeru 7 specifikacije, gde je konkurencija definisana signalom od najmanje 90%> što je procenjeno fluorescencijom.
[0072]Ovde je opisan peptid koji se specifično vezuje za CD38 epitop, što je epitop koji je takođe specifično vezan od strane antitela kao stoje gore definisano.
[0073]Ovde je opisan peptid koji se specifično vezuje za region SKRNIQFSCKNIYR i region EKVQTLEAWVIHGG humanog CD38 (SEK ID Br: 31).
[0074]Ovde je opisan peptid koji suštinski ima iste specifične vezujuće karakteristike za vezivanje humanog CD38 kao i antitelo kao što je iznad definisano.
[0075]Ovde je opisan peptid koji se vezuje za humani CD38, peptid koji poseduje jednu ili više od sledećih karakteristika: (i) deluje kao antagonist za CD38; (ii) ne izaziva značajnu proliferaciju mononuklearnih ćelija periferne krvi što je utvrđeno postupkom opisanom u primeru 18 specifikacije; (iii) ne izaziva značajno oslobađanje IL-6 od strane humanih monocita ili mononuklearnih ćelija periferne krvi stoje utvrđeno postupkom opisanom u primeru 19 specifikacije; (iv) ne izaziva oslobađanje detektibilnog IFN-y od strane humanih T ćelija ili mononuklearnih ćelija periferne krvi što je utvrđeno postupkom opisanom u primeru 20 specifikacije; (v) internalizovan je pomoću CD38 eksprimiranih ćelija; kao što je internalizovan pomoću CHO-CD38 ćelija unutar 5 do 15 minuta na 37°C postupkom koji je opisan u primeru 12 u specifikaciji; (vi) indukuje ADCC; kao što je sa EC50vrednošću ispod 15 ng/ml, kao što je ispod 10 ng/ml u Daudi-luc ćelijama i sa EC5ovrednošću ispod 75 ng/ml, kao što je ispod 50 ng/ml, 30 ng/ml ili 10 ng/ml u MM ćelijama kao što je određeno postupkom opisanom u primeru 5 specifikacije; (vii) indukuje CDC u prisustvu komplementa; kao što je sa EC50vrednošću ispod 5 ng/ml, kao što je ispod 1 ug/ml u Daudi-luc ili CD38-CHO ćelijama postupkom opisanom u Primeru 6 specifikacije; (viii) inhibira sintezu cGDPR-a;
(ix) inhibira sintezu cADPR-a;
(x) vezuje se za humani CD38 sa afinitetom (KD) od ispod IO"<8>M, kao što je u opsegu od IO"<8>M do IO"<11>M, na primer u rasponu od 7 x 10"" M do 10"<10>M, kao što je određeno pomoću površinske plazmonske rezonance opisanom u primeru 20 specifikacije.
[0076]Ovde je opisan peptid kao što je gore definisano, koji inhibira sintezu cGDPR-a od najmanje 25%, kao što je najmanje 30% nakon 90 minuta u koncentraciji od 3 ug/ml kao što je utvrđeno spektrofotometrijskim postupkom opisanom u primeru 24 specifikacije.
[0077]Ovde je opisan peptid kao što je gore definisano, koji inhibira sintezu cADPR-a od najmanje 25%, kao što je najmanje 30% nakon 90 minuta u koncentraciji od 3 ug/ml kao što je određeno HPLC metodom opisanom u Munshi et al, J. Biol. Chem. 275,21566-21571 (2000).
[0078]U jednoj realizaciji peptid kao što je prethodno definisano je humano monoklonsko antitelo.
[0079]Ovde je opisano antitelo kao što je gore definisano, karakterisano time, što je ono pune dužine IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ili IgM antitelo, kao što je IgGl antitelo, poželjno IgGl,kantitelo ili IgM antitelo, poželjno IGM,kantitelo. Ovde je opisano izolovano humano monoklonsko antitelo koje sadrži (i) varijabilni region teškog lanca aminokiselinske sekvence izvedene od humane Hvl263/3M28 (VHI) embrionske sekvence i varijabilni region lakog lanca aminokiselinske sekvence izvedene od humane L15 (VkI) embrionske sekvence, pri čemu se humano antitelo vezuje za humani CD38; ili (ii) varijabilni region teškog lanca aminokiselinske sekvence izvedene iz humane VH3-DP-47/V3-23 (VHIH) embrionske sekvence i varijabilni region lakog lanca aminokiselinske sekvence izvedene iz humane L6 (VkI) embrionske sekvence, pri čemu se humano antitelo vezuje za humani CD38.
[0080]Ovde je opisan peptid kao što je gore definisan, pri čemu je peptid glikoziliran u eukariotskoj ćeliji.
[0081]U jednoj realizaciji antitelo prema pronalasku je fragment antitela ili antitelo sa jednim lancem.
[0082]Ovde je opisan peptid kao što je gore definisan, koji dalje obuhvata helator linker za vezivanje radioizotopa.
[0083]Ovde je opisan peptid kao što je gore definisan, koji je u suštinski izolovanom obliku.
[0084]Ovde opisana je izolovana nukleinska kiselina koja kodira peptid kao što je iznad definisano.
[0085]Ovde je opisan ekspresioni vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira peptid kao što je iznad definisano.
[0086] Ovde jc opisan ekspresioni vektor koji sadrži
(i) VLnukleotidnu sekvencu iz SEK ID Br: 1,
(ii) VHnukleotidnu sekvencu iz SEK ID Br: 6,
(iii) VLnukleotidnu sekvencu iz SEK ID Br: 1 i VHnukleotidnu sekvencu iz SEK ID Br: 6; (iv) VLnukleotidnu sekvencu iz SEK ID Br: 11; (v) VHnukleotidnu sekvencu iz SEK ID Br: 16; (vi) VLnukleotidnu sekvencu iz SEK ID Br: 11 i VHnukleotidnu sekvencu iz SEK ID Br: 16; (vii) VLnukleotidnu sekvencu iz SEK ID Br: 21;
(viii) VHnukleotidnu sekvencu iz SEK ID Br: 26; ili
(ix) VLnukleotidnu sekvencu iz SEK ID Br: 21 i VH nukleotidnu sekvencu iz SEK ID Br: 26.
[0087] Ovde je opisan ekspresioni vektor kao što je gore definisano, koji dalje obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni region lakog lanca, teškog lanca ili oboje i lakih i teških lanaca humanog antitela.
[0088] Ovde je opisan ekspresioni vektor kao što je gore definisano, pri čemu nukleotidna sekvenca koja kodira konstantan region lakog lanca, teškog lanca ili oba i lake i teške lance humanog antitela kodira IgGl antitelo.
[0089] Ovde je opisan hibridom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo kodirano od strane humanog lakog lanca i humanog teškog lanca nukleinskih kiselina koji sadrže
(i) humani laki lanac i humani teški lanac nukleinskih kiselina koje sadrže nukleotidne sekvence u njihovim varijabilnim regionima kao što je navedeno u SEK ID Br: 1 i SEK ID Br: 6, respektivno; (ii) humani laki lanac i humani teški lanac nukleinskih kiselina koje sadrže nukleotidne sekvence u njihovim varijabilnim regionima kao što jc navedeno u SEK ID Br: 11 i SEK ID Br: 16, respektivno; (iii) humani laki lanac i humani teški lanac nukleinskih kiselina koje sadrže nukleotidne sekvence u njihovim varijabilnim regionima kao što je navedeno u SEK ID Br: 21 i SEK ID Br: 26, respektivno; ili (iv) humani laki lanac i humani teški lanac nukleinskih kiselina koje sadrže nukleotidne sekvence u njihovim varijabilnim regionima, koje su konzervativne sekventne modifikacije sekvenci dalje iznete u (i), (ii) ili (iii).[0090]Ovde je opisan hibridom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo koje ima varijabilne regione humanog teškog lanca i lakog lanca koji sadrže (i) humani laki lanac varijabilne aminokiselinske sekvence kao što je navedena u SEK ID Br: 2, i humani teški lanac varijabilne amino sekvence kao što je navedena u: SEK ID Br: 7; (ii) humani laki lanac varijabilne aminokiselinske sekvence kao što je navedena u SEK ID Br: 12, i humani teški lanac varijabilne amino sekvence kao što je navedena u SEK ID Br: 17; (iii) humani laki lanac varijabilne aminokiselinske sekvence kao što je navedena u SEK ID Br: 22 i humani teški lanac varijabilne amino sekvence kao što je navedena u SEK ID Br: 27;
ili
(iv) konzervativne sekventne modifikacije humanog lakog lanaca i humanog teškog lanca varijabilnih aminokiselinskih sekvenci kao što je utvrđeno pod (i), (ii) ili (iii).[0091]Ovde je opisan tranfektom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo kodirano od strane nukleinskih kiselina humanog lakog lanca i humanog teškog lanca koji sadrže (i) humani laki lanac i humani teški lanac nukleinskih kiselina koje sadrže nukleotidne sekvence u njihovim varijabilnim regionima, kao što je navedeno u SEK ID Br: 1 i SEK ID Br: 6, respektivno; (ii) humani laki lanac i humani teški lanac nukleinskih kiselina koje sadrže nukleotidne sekvence u njihovim varijabilnim regionima kao što je navedeno u SEK ID Br: 11 i SEK ID Br: 16, respektivno; (iii) humani laki lanac i humani teški lanac nukleinskih kiselina koje sadrže nukleotidne sekvence u njihovim varijabilnim regionima kao što je navedeno u SEK ID Br: 21 i SEK ID Br: 26, respektivno; ili (iv) humani laki lanac i humani teški lanac nukleinskih kiselina koje sadrže nukleotidne sekvence u njihovim varijabilnim regionima, koje su konzervativne sekventne modifikacije sekvenci dalje iznete u (i), (ii) ili (iii).
[0092]Ovde jc opisan transfcktom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo
koje ima varijabilne regione humanog teškog lanca i lakog lanca koji sadrže
(i) varijabilnu aminokiselinsku sekvencu humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID
Br: 2 i varijabilnu amino sekvencu humanog teškog lanca kao što je navedeno u: SEK ID Br: 7;
(ii) varijabilnu aminokiselinsku sekvencu humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID
Br: 12 i varijabilnu amino sekvencu humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 17;
(iii) varijabilnu aminokiselinsku sekvencu humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID
Br: 22 i varijabilnu amino sekvencu humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 27; ili (iv) konzervativne sekventne modifikacije varijabilnih aminokiselinskih sekvenci humanog lakog lanca i humanog teškog lanca kao što jc utvrđeno pod (i), (ii) ili (iii).
[0093]Ovde je opisana eukariotska ili prokariotska ćelija domaćina koja proizvodi peptid u skladu kao što je prethodno definisano.
[0094]Ovde je opisana eukariotska ili prokariotska ćelija domaćina koja sadrži ekspresioni vektor kao što je prethodno definisano.
[0095]Ovde je opisana transgena nehumana životinja ili biljka koja sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju humani teški lanac i humani laki lanac, pri čemu životinja ili biljka proizvode detektibilnu količinu peptida kao što je gore definisano.
[0096]Ovde je opisan imunokonjugat koji sadrži peptid kao što je prethodno definisano vezan sa citotoksičnim agensom, radioaktivnim izotopom ili lekom.
[0097]Ovde je opisan imunokonjugat koji sadrži peptid kao što je prethodno definisano, pri čemu je peptid monomerno IgM antitelo vezano sa citotoksičnim agensom, radioaktivnim izotopom ili lekom.
[0098]Ovde je opisan bispecifičan ili multispecifičan molekul koji sadrži peptid kako je gore definisano i specifičnost vezivanja za humanu efektorsku ćeliju.
[0099]Ovde je opisan bispecifičan ili multispecifičan molekul koji sadrži peptid kao što je prethodno definisano i specifičnost vezivanja za CD3, CD4, CD138, IL-15R, membranski vezani ili receptorom vezani TNF-a, humani Fc receptor ili membranski vezani ili receptorom vezani IL-15.
[0100]Ovde je opisana farmaceutska kompozicija koja sadrži peptid kao što je prethodno definisano, ili imunokonjugat kao što je prethodno definisano i farmaceutski prihvatljiv nosač.[0101]Ovde je opisana farmaceutska kompozicija kao što je gore definisano koja sadrži jedno ili više dodatnih terapeutskih sredstava.
[0102]Ovde je opisan postupak inhibicije rasta i/ili proliferacije ćelija koje eksprimiraju CD38, koji obuhvata primenu peptida kao što je gore definisano, imunokonjugata kao što je gore definisano, farmaceutske kompozicije kao što je gore definisano, ili ekspresionog vektora kao što je gore definisano, tako daje inhibiran rast i/ili proliferacija ćelija.
[0103]Ovde je opisan postupak za lečenje bolesti ili poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimiraju CD38 u subjektu, pri čemu taj postupak obuhvata primenu peptida kao što je gore definisano, imunokonjugata kao što je gore definisano, farmaceutske kompozicije kao što je gore definisano, ili ekspresionog vektora kao što je gore definisano na subjektu kome je to potrebno.
[0104]Ovde je opisan postupak za prevenciju bolesti ili poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimiraju CD38 u subjektu, pri čemu taj postupak obuhvata primenu peptida kao što je gore definisano, imunokonjugata kao što je gore definisano, farmaceutske kompozicije kao što je gore definisano, ili ekspresionog vektora kao što je gore definisano subjektu kome je to potrebno.
[0105]U jednoj realizaciji bolest ili poremećaj je reumatoidni artritis.
[0106]U jednoj realizaciji bolest ili poremećaj je multipli mijelom.
[0107]U jednoj realizaciji, postupak obuhvata primenu jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa na subjektu.
[0108]U jednoj realizaciji jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa su izabrani od hemoterapcutskog agensa, anti-inflamatornog agensa, ili imunosupresivnog i/ili imunomodulatornog agensa.
[0109]U jednoj realizaciji jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa su izabrani iz grupe koju čine cisplatin, gefitinib, cetuksimab, rituksimab, bevacizumab, erlotinib, bortezormb, talidomid, pamidronat, zoledronatna kiselina, klodronat, risendronat, ibandronat, etidronat, alendronat, tiludronat, arsen trioksid, lenalidomid, filgrastim, pegfilgrastim, sargramostim, suberoilanilid hidroksamična kiselina i SCIO-469.
[0110]Ovde opisan jein vitrometod za detekciju prisustva CD38 antigena, ili ćelije koja eksprimira CD38, u uzorku koji obuhvata: a) dovođenje u kontakt uzorka sa peptidom kao što je gore definisano pod uslovima koji dozvoljavaju formiranje kompleksa između peptida i CD38; i
b) detektovanje formiranja kompleksa.
[0111]Ovde opisan je komplet za detekciju prisustva CD38 antigena, ili ćelije koja eksprimira CD38, u
uzorku koji sadrži peptid kako je iznad definisano.
[0112]Ovde opisan jein vivometod za detekciju CD38 antigena, ili ćelije koja eksprimira CD38, kod subjekta koji obuhvata: a) primenu peptida kao što je iznad definisano pod uslovima koji dozvoljavaju formiranje kompleksa između peptida i CD38; i
b) detektovanje formiranog kompleksa.
[0113]Ovde je opisano anti-idiotipsko antitelo koje se vezuje za antitelo kao što je gore definisano.
[0114]U jednoj realizaciji anti-idiotipsko antitelo je korišćeno za detekciju nivoa antitela kao što je gore definisano u uzorku.
[0115]U jednoj realizaciji anti-idiotipsko antitelo je korišćeno za detekciju nivoa humanog monoklonskog antitela protiv CD38 u uzorku.
KRATAK OPIS SLIKA
[0116]Slika 1A pokazuje vezivanje -003, -005 i izotipskog kontrolnog antitela HuMAb-KLH za CD38-transfektovane CHO (CHO-CD38) ćelije kao što je izmereno protočnom citometrijom. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 4. Slika 1B prikazuje vezivanje -024 i HuMAb-KLH za CD38-transfektovane CHO (CHO-CD38) ćelije kao što je izmereno protočnom citometrijom. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 4. Slika 2A prikazuje vezivanje -003, -005 i HuMAb-KLH za Daudi ćelije kao što je izmereno protočnom citometrijom. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 4. Slika 2B prikazuje vezivanje -024 i HuMAb-KLH za Daudi ćelije kao što jc izmereno protočnom citometrijom. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 4. Slika 3 prikazuje vezivanje -003, -005, -024 i HuMAb-KLH za ćelije multiplog mijeloma. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 4. Slika 4A prikazuje sposobnost -003 i -005 da indukuju lizu Daudi ćelija pomoću ADCC u poređenju sa rituksimabom i HuMAb-KLH. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 5. Slika 4B prikazuje sposobnost -024 da indukuje lizu Daudi ćelija pomoću ADCC u poređenju sa HuMAb-KLH. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 5. Slika 5A prikazuje sposobnost -003, -005 i -024 da indukuju lizu svežih tumorskih ćelija multiplog mijeloma pomoću ADCC u poređenju sa HuMAb-KLH. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 5. Slika 5B prikazuje sposobnost -003, -005 i -024 da indukuju lizu svežih tumorskih ćelija plazma ćelijske leukemije pomoću ADCC u poređenju sa HuMAb-KLH. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 5. Slika 6 prikazuje sposobnost -003 i -005 da indukuju lizu JK6L (ćelijske linije multiplog mijeloma) pomoću ADCC u poređenju sa HuMAb-KLH. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 5. Slika 7 prikazuje sposobnost -003 i -005 da indukuju lizu AMO-1 (ćelijske linije multiplog mijeloma) pomoću ADCC u poređenju sa HuMAb-KLH. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 5. Slika 8 prikazuje CDC-posredovanu lizu Daudi-luc ćelija izazvanu pomoću -003 i -005 u poređenju sa HuMAb-KLH. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 6. Slika 9A prikazuje CDC-posredovanu lizu CHO-CD38 ćelija indukovanu pomoću -003 i -005 poređenjem sa HuMAb-KLH. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 6. Slika 9B prikazuje CDC-posredovanu lizu CHO-CD38 ćelija indukovanu pomoću -024 u poređenju sa HuMAb-KLH. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 6.
Slika 10A prikazuje CDC-posredovanu lizu 3% tumorskih refraktornih ćelija u prisustvu
-003, -005 i HuMAb-KLH. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 6.
Slika 10B prikazuje CDC-posredovanu lizu 9% tumorskih refraktornih ćelija u prisustvu
-003, -005 i HuMAb-KLH. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 6.
Slika 10C prikazuje CDC-posredovanu lizu 30-40% tumorskih ćelija u prisustvu -003,
-005 i HuMAb-KLH. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 6.
Slika 10D prikazuje CDC-posredovanu lizu 70% tumorskih ćelija u prisustvu -003, -005 i HuMAb-KLH. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 6.
Slika 10E prikazuje CDC-posredovanu lizu ćelija multiplog mijeloma u prisustvu -024 i HuMAb-KLH. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 6.
Slika 11 prikazuje da -003 i -005 ne čine unakrsno blok vezivanje za CD38. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 7.
Slika 12A prikazuje imunohistološko bojenje makrofaga, limfocita i plazma B ćelija sa -003. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 10.
Slika 12B prikazuje imunohistološko bojenje bronhijalnog epitela sa -003. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 10.
Slika 12C prikazuje imunohistološko bojenje miocita sa -003. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 10.
Slika 12D prikazuje imunohistološko bojenje cvnomolgus limfnog tkiva sa -003. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 10.
Slika 13A prikazuje imunohistološko bojenje makrofaga, limfocita i plazma B ćelija sa -005. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 10.
Slika 13B prikazuje imunohistološko bojenje bronhijalnog epitela sa -005. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 10.
Slika 13C prikazuje imunohistološko bojenje miocita sa -005. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 10.
Slika 13D prikazuje imunohistološko bojenje limfnog tkiva cvnomolgusa sa -005. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 10.
Slika 14A prikazuje imunohistološko bojenje endotela jetre sa CD31. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 10.
Slika 14B prikazuje imunohistološko bojenje endotela jetre sa vWF. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 10.
Slika 14C prikazuje imunohistološko bojenje endotela jetre sa anti-KLH. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 10.
Slika 14D prikazuje imunohistološko bojenje endotela jetre sa -003. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 10.
Slika 14E prikazuje imunohistološko bojenje endotela jetre sa -005. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 10.
Slika 15A prikazuje unakrsnu reaktivnost -003 i -005 u poređenju sa HuMAb-KLH na limfocitima makakija merenu protočnom citometrijom. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 11. Slika 15B prikazuje unakrsnu reaktivnost -003 i -005 u poređenju sa HuMAb-KLH na monocitima makakija merenu protočnom citometrijom. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 11. Slika 15C prikazuje unakrsnu reaktivnost -003 i -005 u poređenju sa HuMAb-KLH na PBMC rezus majmuna merenu protočnom citometrijom. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 11. Slika 16A prikazuje internalizaciju -003 merenu EtBr-suzbijanjem. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 12.
Slika 16B prikazuje internalizaciju -005 merenu EtBr-suzbijanjem. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 12.
Slika 17A prikazuje inhibiciju rasta tumorskih ćelija uzrokovanu -003 i -005 u poređenju sa anti-CD20 monoklonskim antitelom (rituksimabom) i HuMAb-KLH u preventivnom okruženju merenuin vivoslikanjem SCID luciferaze. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 13.
Slika 17B pokazuje inhibiciju rasta tumorskih ćelija izazvanu -003 i -005 u poređenju sa anti- CD20 monoklonskim antitelom (rituksimabom) i HuMAb-KLH u terapijskom okruženju i merenuin vivoslikanjem SCID luciferaze. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 13.
Slika 17C prikazuje inhibiciju rasta tumorskih ćelija tumora izazvanu -003 i -005 u poređenju sa anti-CD20 monoklonskim antitelom (rituksimabom) i HuMAb-KLH u terapijskom okruženju II merenuin vivoslikanjem SCID luciferase. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 13.
Slika 17D prikazuje inhibiciju rasta tumorskih ćelija pomoću -003 i -024 u poređenju sa HuMAb-KLH u terapijskom okruženju III merenuin vivoslikanjem SCID luciferaze. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 13.
Slika 18 prikazuje indukciju apoptoze pomoću -003 i -005 u poređenju sa anti-CD20 monoklonskim antitelom (rituksimabom) i HuMAb-KLH bez ili sa unakrsnim vezivanjem. Eksperimentalno podešavanje je opisano u Primeru 14.
Slika 19 prikazuje histološku ocenu za CD38-pozitivne ćelije u implantiranim RA-SCID ksenograftovima miševa u 14-om danu, nakon tretmana sa anti-KLH (HuMAb-KLH) ili -005. Postupci su opisani u Primeru 15.
Slika 20 prikazuje histološku ocenu za CD138-pozitivne ćelije u implantiranim RA-SCID ksenograftovima miševa u 14-om danu, nakon tretmana sa anti-KLH ili -005. Postupci su opisani u Primeru 15.
Slika 21 prikazuje CD38 bojenje B ćelija u ksenograftovima pre implantacije (A), ili nakon tretmana sa anti-KLH (B), ili -005 (C). Postupci su opisani u Primeru 15.
Slika 22 prikazuje CD138 bojenje B ćelija u ksenograftovima pre implantacije (A), ili nakon tretmana sa anti-KLH (B), ili -005 (C). Postupci su opisani u Primeru 15.
Slika 23 prikazuje vezivanje -003 i -005 za divlji tip i mutanta humanog CD38 kao što je mereno pomoću ELISA. 23A: Vezivanje -003 i -005 na T237A mutanta humanog CD38. 23B: Vezivanje -003 i -005 na 0272R mutanta humanog CD38. 23C: Vezivanje -003 i -005 na S274F mutanta humanog CD38. Postupci su opisani u Primeru 17.
Slika 24 prikazuje efekat -003 i -005 u poređenju sa HuMAb-KLH na proliferaciju (A), proizvodnju IL-6 (B) i proizvodnju IFN-y (C) kod humanih PBMC-a. Postupci su opisani u Primerima 18, 19 i 20, respektivno.
Slika 25 prikazuje enzimsku proizvodnju cGDP riboze u prisustvu različitih koncentracija
-003 (B), -005 (C), -024 (D) ili anti-KLH (A). Postupci su opisani u Primeru 23.
Slika 26 prikazuje poređenje između -003, -005 i Morfozis antitela TH-3079 u CDC kod CHO-CD38 ćelija (26A), CDC kod Daudi ćelija (26B), i ADCC kod Daudi ćelija (26C).
[0117]Sekvence pronalaska su prikazane u priloženom listingu sekvenci.
SEK ID Br: 1 je nukleotidna sekvenca VLregiona antitela -003.
SEK ID Br: 2 je aminokiselinska sekvenca VLregiona antitela -003.
SEK ID Br: 3 je aminokiselinska sekvenca VLCDR1 -003 antitela koja sadrži 24-34 ak iz SEK ID Br: 2. SEK ID Br: 4 je aminokiselinska sekvenca VLCDR2 -003 antitela koja sadrži 50-56 ak iz SEK ID Br: 2.
SEK ID Br: 5 je aminokiselinska sekvenca VLCDR3 -003 antitela koja sadrži 89-97 ak iz SEK ID Br: 2. SEK ID Br: 6 je nukleotidna sekvenca VHregiona antitela -003.
SEK ID Br: 7 je aminokiselinska sekvenca VHregiona antitela -003.
SEK ID Br: 8 je aminokiselinska sekvenca VHCDR1 -003 antitela koja sadrži 31-35 ak iz SEK ID Br: 7. SEK ID Br: 9 je aminokiselinska sekvenca VHCDR2 -003 antitela koja sadrži 50-66 ak iz SEK TD Br: 7. SEK ID Br: 10 je aminokiselinska sekvenca V„ CDR3 -003 antitela koja sadrži 99-109 akiz SEK ID Br: 7.
SEK ID Br: 11 je nukleotidna sekvenca VLregiona antitela -005.
SEK ID Br: 12 je aminokiselinska sekvenca VLregiona antitela -005.
SEK ID Br: 13 je aminokiselinska sekvenca VLCDR1 -005 antitela koja sadrži 24-34 ak iz SEK ID Br: 12.
SEK ID Br: 14 je aminokiselinska sekvenca VLCDR2 -005 antitela koja sadrži 50-56 ak iz SEK ID Br: 12.
SEK ID Br: 15 je aminokiselinska sekvenca VLCDR3 -005 antitela koja sadrži 89-97 ak iz SEK ID Br: 12.
SEK ID Br: 16 je nukleotidna sekvenca VHregiona antitela -005.
SEK ID Br: 17 je aminokiselinska sekvenca VHregiona antitela -005.
SEK ID Br: 18 je aminokiselinska sekvenca VHCDR1 -005 antitela koja sadrži 31-35 ak iz SEK ID Br: 17.
SEK ID Br: 19 je aminokiselinska sekvenca VHCDR2 -005 antitela koja sadrži 50-66 ak iz SEK ID Br: 17.
SEK ID Br: 20 je aminokiselinska sekvenca VHCDR3 -005 antitela koja sadrži 99-111 ak iz SEK ID Br: 17.
SEK ID Br: 21 je nukleotidna sekvenca VLregiona antitela -024.
SEK ID Br: 22 je aminokiselinska sekvenca VLregiona antitela -024.
SEK ID Br: 23 je aminokiselinska sekvenca VLCDR1 -024 antitela koja sadrži 24-34 ak iz SEK ID Br: 22.
SEK ID Br: 24 je aminokiselinska sekvenca VLCDR2 -024 antitela koja sadrži 50-56 ak iz SEK ID Br: 22.
SEK ID Br: 25 je aminokiselinska sekvenca V, CDR3 -024 antitela koja sadrži 89-97 ak iz SEK ID Br: 22.
SEK TD Br: 26 je nukleotidna sekvenca VHregiona antitela -024.
SEK ID Br: 27 je aminokiselinska sekvenca VHregiona antitela -024.
SEK ID Br: 28 je aminokiselinska sekvenca Vn CDR1 -024 antitela koja sadrži 31-35 ak iz SEK ID Br: 27.
SEK ID Br: 29 je aminokiselinska sekvenca VHCDR2 -024 antitela koja sadrži 50-66 ak iz SEK ID Br: 27.
SEK ID Br: 30 je aminokiselinska sekvenca VHCDR3 -024 antitela koja sadrži 99-111 ak iz SEK ID Br: 27.
SEK ID Br: 31 je sekvenca humanog CD38.
SEK ID Br: 32 je sekvenca mutanta humanog CD38, gde je treoninski ostatak na položaju 237 supstituisan alaninskim ostatkom.
SEK ID Br: 33 je sekvenca mutanta humanog CD38, gde je glutaminski ostatak na položaju 272 supstituisan sa argininskim ostatkom.
SEK ID Br: 34 je sekvenca mutanta humanog CD38, gde je serinski ostatak na položaju 274 supstituisan sa fenilalaninskim ostatkom.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0118]Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-CD38 antitela, koja mogu biti korisna u lečenju, dijagnostici i prevenciji raznih poremećaja koji uključuju ćelije koje eksprimiraju CD38, kao što je multipli mijelom. Jedna realizacija u skladu sa pronalaskom je antitelo -005. -005 je humano monoklonsko IgGl antitelo koje ima VLregion koji se sastoji od sekvence SEK ID Br: 12 i VHregion koji se sastoji od sekvence SEK ID Br: 17.
[0119]Takođe ovde opisani su CD38 vezujući peptidi („CD38BPs"), koji mogu biti korisni u lečenju, dijagnostici i prevenciji raznih poremećaja koji uključuju ćelije koje eksprimiraju CD38, kao što je multipli mijelom.
[0120]U jednoj realizaciji, jedan CD38BP je antitelo -003. -003 je humano monoklonsko IgGl antitelo koje ima VLregion koji se sastoji od sekvence SEK ID Br: 2 i VHregion koji se sastoji od sekvence SEK TD Br: 7.
[0121]U jednoj realizaciji, jedan CD38BPje antitelo -024. -024 je humano monoklonsko IgGl antitelo koje ima VLregion koji se sastoji od sekvence SEK ID Br: 22 i VHregion koji se sastoji od sekvence SEK ID Br: 27.
[0122]Antitela stupaju u interakciju sa ciljanim antigenima prvenstveno preko aminokiselinskih ostataka koji se nalaze u šest regiona teškog i lakog lanca koji određuju komplementarnost (CDRs). Iz tog razloga, sekvence aminokiselina unutar CDR-a su mnogo raznovrsnije između pojedinačnih antitela nego što su to sekvence koje su izvan CDR-a. Zbog toga što su CDR sekvence odgovorne za većinu interakcija antitelo-antigen, moguće je eksprimirati rekombinantna antitela koja oponašaju svojstva specifičnih antitela koja se prirodno javljaju konstruisanjem ekspresionih vektora koji uključuju CDR sekvence iz specifičnog antitela koje se prirodno javlja nakalemljenog na okvirne sekvence iz različitih antitela sa različitim svojstvima (videti na primer Riechmann, L. et al., Nature 332, 323-327 (1998), Jones, P. et al, Nature 321, 522-525 (1986) i Oueen, C. et al. , PNAS USA 86, 10029-10033 (1989)).
[0123]Pošto jc dobro poznato u struci da antitela CDR3 domena teškog lanca igraju posebno važnu ulogu u specifičnosti vezivanja/afinitetu antitela za antigen (Ditzel HJ, et al, J Immunol. 157(2), 739-49
(1996), Barbas SM et al, J. Am. Chem. Soc. 116, 2161-2162 (1994), i Barbas SM et al., Proc Natl Acad Sci USA 92 (7), 2529-33 (1995), CD38BPs prema pronalasku mogu da sadrže teški lanac CDR3s od - 003 ili -024. CD38BPs pronalaska mogu takođe da sadrže teški i laki lanac CDR3s od -003 ili -024. CD38BPs pronalaska mogu dodatno da sadrže CDR2s za -003 i -024, respektivno. CD38BPs pronalaska mogu dalje da sadrže CDRs za -003 i -024, respektivno.
[0124]Anti-CD38 antitela u skladu sa pronalaskom kao što je ovde opisano mogu da sadrže teški lanac CDR3 iz -005 i mogu takođe da sadrže teški i laki lanac CDR3 iz -005. Antitela
u skladu sa pronalaskom kao što je ovde opisano mogu dodatno da sadrže CDR2 iz -005 i mogu dodatno da sadrže CDR1 iz -005.
[0125]Takođe su ovde opisani CD38BPs, koji konkurišu sa -003 za vezivanje za CD38.
[0126]Ovde opisani su CD38BPs, koji konkurišu sa -005 za vezivanje za CD38.
[0127]Ovde opisani su CD38BPs, koji konkurišu sa -024 za vezivanje za CD38.
[0128]U jednom izvođenju, konkurencija se određuje upotrebom tehnike ELISA kao što je opisano u odeljku sa primerima.
[0129]U jednom izvođenju, konkurencija se određuje upotrebom FACS kao što je opisano u odeljku sa primerima.
[0130]Ovde opisan je jedan CD38BP koji se specifično vezuje za epitop CD38, epitopa koji je takođe specifično vezan pomoću -003 ili -024.
[0131]Antitela u skladu sa pronalaskom kao što je ovde opisano se specifično vezuju za CD38 epitop, epitop koji je takođe specifično vezan pomoću -005.
[0132]Ovde opisan je jedan CD38BP koji suštinski ima iste specifične vezujuće karakteristike za vezivanje humanog CD38 kao -003 ili -005 ili -024.
[0133]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VLCDR1 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 3.
[0134]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VLCDR2 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 4.
[0135]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VLCDR3 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 5.
[0136]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VLCDR3 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br:
5 i VLCDR1 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 3.
[0137]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VLCDR3 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br:
5 i VLCDR2 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 4.
[0138]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VLCDR3 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 5 ijedan VLCDR2 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 4 ijedan VLCDR1 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 3.
[0139]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VHCDR1 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 8.
[0140]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VHCDR2 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 9.
[0141]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VHCDR3 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 10.
[0142]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VHCDR3 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br:
10 ijedan VHCDR1 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 8.
[0143]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VHCDR3 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br:
10 ijedan VHCDR2 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 9.
[0144]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VHCDR3 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 10 ijedan VHCDR2 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 9 ijedan VHCDR1 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 8.
[0145]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VLCDR1 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 13.
[0146]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VLCDR2 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 14.
[0147]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VLCDR3 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 15.
[0148]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VLCDR3 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br:
15 ijedan VLCDR1 koji se u osnovi sastoji od SEK TD Br: 13.
[0149]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VLCDR3 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br:
15 ijedan VLCDR2 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 14.
[0150]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VLCDR3 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 15 ijedan VLCDR2 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 14 ijedan VLCDR1 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 13.
[0151]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VHCDR1 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 18.
[0152]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VHCDR2 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 19.
[0153]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VHCDR3 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 20.
[0154]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VHCDR3 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br:
20 ijedan VHCDR1 koji se u osnovi sastoji od SEK ID Br: 18.
[0155]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VHCDR3 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 20 ijedan Vn CDR2 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 19.
[0156]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VHCDR3 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 20 i jedan VHCDR2 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 19 i jedan VHCDR1 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 18.
[0157]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VLCDR1 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 23.
[0158]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VLCDR2 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 24.
[0159]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VLCDR3 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 25.
[0160]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VLCDR3 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 25 ijedan VLCDR1 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 23.
[0161]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VLCDR3 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 25 i VLCDR2 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 24.
[0162]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VLCDR3 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 25 i jedan VLCDR2 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 24 ijedan VLCDR1 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 23.
[0163]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži VHCDR1 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 28.
[0164]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži VHCDR2 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 29.
[0165]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži VHCDR3 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 30.
[0166]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VHCDR3 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 30 ijedan VHCDR1 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 28.
[0167]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VHCDR3 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 30 ijedan VHCDR2 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 29.
[0168]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži jedan VHCDR3 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 30 i jedan VHCDR2 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 29 i jedan VHCDR1 koji se sastoji uglavnom od SEK TD Br: 28.
[0169]Ovde opisan je jedan CD38BP koji sadrži
(a) prvi VLregion koji sadrži tri VLCDR segmenta, koji se nezavisno jedan od drugoga sastoje od SEK ID Br: 3, SEK ID Br: 4, i SEK ID Br: 5; i (b) prvi VHregion koji sadrži tri VHCDR segmenta, koji se nezavisno jedan od drugoga sastoje od SEK ID Br: 8, SEK ID Br: 9 i SEK ID Br: 10. Ovde opisan je CD38BP koji sadrži (a) prvi VLregion koji sadrži tri VLCDR segmenta, koji se nezavisno jedan od drugoga sastoje od SEK ID Br: 13, SEK ID Br: 14 i SEK ID Br: 15; i (b) prvi VHregion koji sadrži tri VHCDR segmenta, koji se nezavisno jedan od drugoga sastoje od SEK ID Br: 18, SEK ID Br: 19, i SEK ID Br: 20. Ovde opisan je CD38BP koji sadrži (a) prvi VLregion koji sadrži tri VLCDR segmenta, koji se nezavisno jedan od drugoga sastoje uglavnom od SEK ID Br: 23, SEK ID Br: 24, i SEK ID Br: 25; i (b) prvi VHregion koji sadrži tri VHCDR segmenta, koji se nezavisno jedan od drugoga sastoje uglavnom od SEK ID Br: 28, SEK ID Br: 29, i SEK ID Br: 30.
[0170]U jednoj realizaciji, VLregion i VHregion su prisutni na istom lancu u peptidu.
[0171]U daljoj realizaciji, VLregion i VHregion su razdvojeni fleksibilnim linkerom.
[0172]U jednoj realizaciji, VLregion i VHregion su prisutni na odvojenim lancima u peptidu.
[0173]U daljoj realizaciji, VLregion i Vn region su prisutni na odvojenim lancima u peptidu u kontekstu imunoglobulinskog savijanja proteina.
[0174]U jednoj realizaciji, prvi VLregion i prvi VHregion su orijentisani tako da se tri CDRs u VLregionu i tri CDRs u VHregionu kooperativno udružuju da doprinesu u selektivnom i/ ili specifičnom vezivanju antigenske determinante na humanom CD38.
[0175]U daljoj realizaciji, peptid sadrži drugi VLregion identičan prvom VLregionu i drugi VHregion identičan prvom VHregionu, gde se drugi VLregion i drugi VHregion kooperativno udružuju da doprinesu u selektivnom i/ili specifičnom vezivanju antigenske determinante na humanom CD38.
[0176]Ovde je opisan jedan CD38BP koji sadrži VLregion koji je funkcionalna varijanta VLregiona - 003 ili -005 ili -024.
[0177]U jednoj realizaciji, VLregion CD38BP se u osnovi sastoji od sekvence koja ima najmanje oko 50%, najmanje 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence prema sekvenci u skladu sa SEK ID Br: 2 ili SEK ID Br: 12 ili SEK ID Br: 22, respektivno. U jednoj realizaciji, CD38BP ima najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% vezujućih karakteristika epitopa sa - 003 ili -005 ili -024, respektivno.
[0178]Ovde je opisan jedan CD38BP koji sadrži VHregion koji je funkcionalna varijanta VHregiona - 003 ili -005 ili -024.
[0179]U jednoj realizaciji, VHregion peptida se u osnovi sastoji od sekvence koja ima najmanje oko 50%, najmanje 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence prema sekvenci u skladu sa SEK ID Br: 7 ili SEK ID Br: 17 ili SEK ID Br: 27, respektivno. U jednoj realizaciji, CD38BP ima najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% epitop vezujućih karakteristika sa - 003 ili -005 ili -024, respektivno.
[0180]Ovde je opisan jedan CD38BP koji sadrži najmanje jedan CDR koji je funkcionalna varijanta CDR -003 ili -005 ili -024.
[0181]U jednoj realizaciji, najmanje jedan od CDRs peptida se sastoji suštinski od sekvence koja ima najmanje oko 50%, najmanje 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%), najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%> identičnosti aminokiselinske sekvence prema sekvenci u skladu sa SEK ID Br: 3, SEK ID Br: 4, SEK ID Br: 5, SEK ID Br: 8, SEK ID Br: 9, ili SEK ID BR: 10, ili u skladu sa SEK ID Br: 13, SEK ID Br: 14, SEK ID Br: 15, SEK ID Br: 18, SEK ID Br: 19, ili SEK ID Br: 20, ili u skladu sa SEK ID Br: 23, SEK ID Br: 24, SEK ID Br: 25, SEK ID Br: 28, SEK ID Br: 29, ili SEK ID Br: 30, respektivno. U jednoj realizaciji, CD38BP ima najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% vezujućih karakteristika epitopa sa - 003 ili -005 ili -024, respektivno.
[0182]U jednoj realizaciji, CD38BP ima najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%>, ili najmanje oko 95% afiniteta, aviditeta ili specifičnosti sa -003 ili -005 ili -024.
[0183]U jednoj realizaciji, CD38BP se takmiči sa ili -003 ili -005 ili -024 za vezivanje za CD38. U daljem ostvarenju, konkurencija se određuje upotrebom ELISA kao što je opisano u odeljku sa primerima. Prema sledećem aspektu, konkurencija se određuje upotrebom FACS kao što je opisano u odeljku sa primerima.
[0184]U jednoj realizaciji, CD38BP se specifično vezuje za jedan CD38 epitop, epitop koji je takođe specifično vezan od strane -003 ili -005 ili -024.
[0185]U jednoj realizaciji, CD38BP se vezuje za humani CD38 sa većim afinitetom nego -003 ili -005 ili -024.
[0186]U jednoj realizaciji, CD38BP ima u suštini iste specifične CD38 vezujuće karakteristike kao -003 ili -005 ili -024.
[0187]U jednoj realizaciji, CD38BP je suštinski oslobođen od drugih CD38 vezujućih peptida.
[0188]CD38BPs predmetnog pronalaska su antitela, kao što su humana antitela, humanizovana antitela ili himerična antitela.
[0189]U jednoj realizaciji, antitelo iz predmetnog pronalaska je monoklonsko antitelo.
[0190]U jednoj realizaciji, antitelo iz predmetnog pronalaska je IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ili IgM antitelo. U daljoj realizaciji, antitelo je IgGl antitelo. U daljoj realizaciji, antitelo je IgGl,kantitelo. Prema sledećem aspektu, antitelo je IgM antitelo. U daljoj realizaciji, antitelo je IgMkantitelo.
[0191]U jednoj realizaciji, antitelo iz predmetnog pronalaska je fragment antitela ili antitelo sa jednim lancem.
[0192]U jednoj realizaciji, CD38BP je glikoziliran u eukariotskoj ćeliji.
[0193] U jednoj realizaciji, CD38BP dalje sadrži linker helator za pričvršćivanje radioizotopa.
[0194]U jednoj realizaciji, CD38BP je u suštinski izolovanom obliku.
[0195] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira CD38 antitelo iz predmetnog pronalaska.
[0196]Predmetni pronalazak obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira CD38 antitelo iz predmetnog pronalaska.
[0197] U jednoj realizaciji u skladu sa pronalaskom, ekspresioni vektor sadrži VLnukleotidnu sekvencu od SEK ID Br: 11, VHnukleotidnu sekvencu od SEK ID Br: 16 ili VLnukleotidnu sekvencu od SEK ID Br: 11 i VHnukleotidnu sekvencu od SEK ID Br: 16.
[0198]U daljoj realizaciji, ekspresioni vektor dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni region lakog lanca, teškog lanca ili i lakih i teških lanaca humanog antitela.
[0199]U daljoj realizaciji, nukleotidna sekvenca koja kodira konstantni region lakog lanca, teškog lanca ili oboje i lake i teške lance humanog antitela kodira IgGl antitelo.
[0200]Ovde opisan jc hibridom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo kodirano od strane humanog lakog lanca i humanog teškog lanca nukleinskih kiselina koji sadrže nukleotidne sekvence u varijabilnom regionu lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 1, ili njihove konzervativne sekventne modifikacije, i nukleotidne sekvence u varijabilnom regionu teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 6, ili njihove konzervativne sekventne modifikacije. U jednoj realizaciji, nukleinske kiseline humanog lakog lanca sadrže nukleotidnu sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 1, i nukleinske kiseline humanog teškog lanca sadrže nukleotidnu sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 6.
[0201]Ovde opisan je hibridom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo
koje ima varijabilne regione humanog teškog lanca i lakog lanca koji sadrže varijabilnu aminokiselinsku sekvencu humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 2 ili konzervativnim modifikacijama sekvence i varijabilnu amino sekvencu humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 7, ili konzervativnim modifikacijama sekvence. U jednoj realizaciji, varijabilni region humanog lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 2, a varijabilni region humanog teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 7.
[0202]Ovde opisan je transfektom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo kodirano od strane varijabilnih nukleinskih kiselina humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 1, ili konzervativnim modifikacijama sekvence i nukleinskih kiselina humanog teškog lanca kao što je navedeno SEK ID Br: 6, ili konzervativnim modifikacijama sekvence. U jednoj realizaciji, humano monoklonsko anti-CD38 antitelo je kodirano od strane varijabilnih nukleinskih kiselina humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 1 i nukleinskih kiselina humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 6.
[0203]Ovde opisan je transfektom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo koje ima varijabilne regione humanog teškog lanca i lakog lanca koji sadrže varijabilnu aminokiselinsku sekvencu humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 2 ili konzervativnim modifikacijama sekvence i varijabilnu aminokiselinsku sekvencu humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 7, ili konzervativnim modifikacijama sekvence. U jednoj realizaciji, humani laki lanac sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 2, a humani teški lanac sadrži varijabilnu amino sekvencu teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 7.
[0204]Ovde opisan je hibridom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo u skladu sa pronalaskom kodirano od strane humanog lakog lanca i humanog teškog lanca nukleinskih kiselina koji sadrže nukleotidne sekvence u varijabilnom regionu lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 11, ili konzervativnim modifikacijama sekvence, i nukleotidne sekvence u varijabilnom regionu teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 16, ili konzervativnim modifikacijama sekvence. U jednoj realizaciji, nukleinske kiseline humanog lakog lanca sadrže nukleotidnu sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 11, a nukleinske kiseline humanog teškog lanca sadrže nukleotidnu sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 16.
[0205]Ovde opisan je jedan hibridom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo u skladu sa pronalaskom i koje ima varijabilne regione humanog teškog lanca i lakog lanca koji sadrže varijabilnu aminokiselinsku sekvencu humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 12, ili konzervativnim modifikacijama sekvence, i varijabilnu amino sekvencu humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 17, ili konzervativnim modifikacijama sekvence. U jednoj realizaciji, varijabilni region humanog lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 12, a varijabilni region humanog teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 17.
[0206]Ovde opisan je jedan transfektom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo u skladu sa pronalaskom i koje je kodirano od strane varijabilnih nukleinskih kiselina humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 11, ili konzervativnim modifikacijama sekvence i nukleinskih kiselina humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 16, ili konzervativnim modifikacijama sekvence. U jednoj realizaciji, humano monoklonsko anti-CD38 antitelo je kodirano od strane varijabilnih nukleinskih kiselina humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 11 i nukleinskih kiselina humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 16.
[0207]Ovde opisan je jedan transfektom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo u skladu sa pronalaskom i koje ima varijabilne regione humanog teškog lanca i lakog lanca koji sadrže varijabilnu aminokiselinsku sekvencu humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 12, ili konzervativnim modifikacijama sekvence i varijabilnu aminokiselinsku sekvencu humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 17, ili konzervativnim modifikacijama sekvence. U jednoj realizaciji, humani laki lanac sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 12, a humani teški lanac sadrži varijabilnu amino sekvencu humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK TD Br: 17.
[0208]Ovde opisan je jedan hibridom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo kodirano od strane nukleinskih kiselina humanog lakog lanca i humanog teškog lanca koje sadrže nukleotidne sekvence u varijabilnom regionu lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 21, ili konzervativnim modifikacijama sekvence i nukleotidne sekvence u varijabilnom regionu teškog lanca kao što jc navedeno u SEK ID Br: 26, ili konzervativnim modifikacijama sekvence. U jednoj realizaciji, nukleinske kiseline humanog lakog lanca sadrže nukleotidnu sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 21, a nukleinske kiseline humanog teškog lanca sadrže nukleotidnu sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 26.
[0209]Ovde opisan je jedan hibridom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo koje ima varijabilne regione humanog teškog lanca i lakog lanca koji sadrže varijabilnu aminokiselinsku sekvencu humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br:
22, ili konzervativne modifikacije sekvence, i varijabilnu aminokiselinsku sekvencu humanog
lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 27, ili konzervativne modifikacije sekvence. U jednoj realizaciji, varijabilni region humanog lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 22, a varijabilni region humanog teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEK ID No: 27.
[0210]Ovde opisan je jedan transfektom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo kodirano od strane varijabilnih nukleinskih kiselina humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 21, ili konzervativnim modifikacijama sekvence i nukleinskih kiselina humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 26, ili konzervativnim modifikacijama sekvence. U jednoj realizaciji, humano monoklonsko anti-CD38 antitelo je kodirano od varijabilnih nukleinskih kiselina humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 21 i nukleinskih kiselina humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 26.
[0211]Ovde opisan je jedan transfektom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo koje ima varijabilne regione humanog teškog lanca i lakog lanca koji sadrže varijabilnu aminokiselinsku sekvencu humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 22, ili konzervativnim modifikacijama sekvence, i varijabilnu amino sekvencu humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 27, ili konzervativnim modifikacijama sekvence. U jednoj realizaciji, humani laki lanac sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 22, a humani teški lanac sadrži varijabilnu amino sekvencu humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 27.
[0212]Predmetni pronalazak obezbeđuje eukariotsku ili prokariotsku ćeliju domaćina koja proizvodi anti-CD38 antitelo iz predmetnog pronalaska.
[0213]Predmetni pronalazak obezbeđuje eukariotsku ili prokariotsku ćeliju domaćina koja sadrži ekspresioni vektor iz predmetnog pronalaska.
[0214]Ovde je opisana transgena nehumana životinja ili biljka koja sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju humani teški lanac i humani laki lanac, pri čemu životinja ili biljka proizvodi detektibilnu količinu CD38BP kao što je ovde opisano.
[0215]Predmetni pronalazak obezbeđuje imunokonjugate koji sadrže anti-CD38 antitelo prema predmetnom pronalasku koje je vezano sa citotoksičnim agensom, radioaktivnim izotopom ili lekom. U jednoj realizaciji, antitelo je monomerno IgM antitelo povezano sa citotoksičnim agensom, radioaktivnim izotopom ili lekom.
[0216]Predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifičan ili multispecifičan molekul koji sadrži anti-CD38 antitelo iz predmetnog pronalaska i specifičnost vezivanja za humanu efektorsku ćeliju. U jednoj realizaciji, vezujuća specifičnost za humanu efektorsku ćeliju predstavlja specifičnost vezivanja za CD3, CD4, CD 13 8, IL-15R, membranski vezan ili receptorno vezan TNF-a, humani Fc receptor ili membranski vezan ili receptorno vezan IL -15.
[0217]Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-idiotipsko antitelo koje se vezuje za CD38BP kao što je ovde opisano.
[0218]Predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu anti-idiotipskog antitela za detekciju nivoa humanog monoklonskog antitela protiv CD38 u uzorku.
[0219]Sledi spisak izabranih realizacija.
Realizacija 1: Antitelo koje se vezuje za humani CD38 je kodirano od strane nukleinskih kiselina humanog lakog lanca i humanog teškog lanca koje sadrže nukleotidne sekvence u njihovim varijabilnim regionima kao što je navedeno u SEK ID Br: 1 i SEK ID Br: 6, respektivno, ili njihovim konzervativnim modifikacijama sekvence .
Realizacija 2: Antitelo koje se vezuje za humani CD38 je kodirano od strane nukleinskih kiselina humanog lakog lanca i humanog teškog lanca koje sadrže nukleotidne sekvence u njihovim varijabilnim regionima kao što je navedeno u SEK ID Br: 1 i SEK ID Br: 6, respektivno. Realizacija 3: Antitelo koje se vezuje za humani CD38 je kodirano od strane nukleinskih kiselina humanog lakog lanca i humanog teškog lanca koje sadrže nukleotidne sekvence u njihovim varijabilnim regionima kao što je navedeno u SEK ID Br: Ili SEK ID Br: 16, respektivno, ili njihovim konzervativnim modifikacijama sekvence.
Realizacija 4: Antitelo koje se vezuje za humani CD38 je kodirano od strane nukleinskih kiselina humanog lakog lanca i humanog teškog lanca koje sadrže nukleotidne sekvence u njihovim varijabilnim regionima kao što je navedeno u SEK ID Br: 11 i SEK ID Br: 16, respektivno. Realizacija 5: Antitelo koje se vezuje za humani CD38 je kodirano od strane nukleinskih kiselina humanog lakog lanca i humanog teškog lanca koje sadrže nukleotidne sekvence u njihovim varijabilnim regionima kao što je navedeno u SEK ID Br: 21 i SEK ID Br: 26, respektivno, ili njihovim konzervativnim modifikacijama sekvence.
Realizacija 6: Antitelo koje se vezuje za humani CD38 je kodirano od strane nukleinskih kiselina humanog lakog lanca i humanog teškog lanca koje sadrže nukleotidne sekvence u njihovim varijabilnim regionima kao što je navedeno u SEK ID Br: 21 i SEK ID Br: 26, respektivno. Realizacija 7: Peptid koji se takmiči sa antitelom prema realizaciji 2 za vezivanje za CD38. Realizacija 8: Peptid prema realizaciji 7, gde se konkurencija određuje upotrebom tehnike ELISA kao što je opisano u Primeru 8 ili 9 specifikacije.
Realizacija 9: Peptid prema realizaciji 7, gde se konkurencija određuje korišćenjem merenja unakrsnog blokiranja kao što jc opisano u Primeru 7 specifikacije.
Realizacija 10: Peptid koji se specifično vezuje za CD38 epitop, epitop koji je takođe specifično vezan od strane antitela prema realizaciji 2.
Realizacija 11: Peptid koji suštinski ima iste specifične vezujuće karakteristike za vezivanje humanog CD38 kao i antitelo prema realizaciji 2.
Realizacija 12: Peptid sadrži VLCDR1 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 3.
Realizacija 13: Peptid sadrži VLCDR2 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 4.
Realizacija 14: Peptid sadrži VLCDR3 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 5.
Realizacija 15: Peptid prema realizaciji 14, takav peptid takođe sadrži VLCDR1 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 3.
Realizacija 16: Peptid prema realizaciji 14, takav peptid takođe sadrži VLCDR2 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 4.
Realizacija 17: Peptid prema realizaciji 16, takav peptid takođe sadrži VLCDR1 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 3.
Realizacija 18: Peptid koji sadrži VHCDR1 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 8.
Realizacija 19: Peptid koji sadrži VHCDR2 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 9.
Realizacija 20: Peptid koji sadrži VHCDR3 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 10.
Realizacija 21: Peptid prema realizaciji 20, takav peptid takođe sadrži VHCDR1 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 8.
Realizacija 22: Peptid prema realizaciji 20, takav peptid takođe sadrži VHCDR2 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 9.
Realizacija 23: Peptid prema realizaciji 22, takav peptid takođe sadrži VHCDR1 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 8.
Realizacija 24: Peptid sadrži
(a) prvi VLregion koji sadrži tri VLCDR segmenta, koji se nezavisno jedan od drugoga u osnovi sastoje od SEK ID Br: 3, SEK ID Br: 4, i SEK ID Br: 5; i (b) prvi VHregion koji sadrži tri VHCDR segmenta, koji se nezavisno jedan od drugoga u osnovi sastoje od SEK ID Br: 8, SEK ID Br: 9 i SEK ID Br: 10.
Realizacija 25: Peptid prema realizaciji 24, pri čemu su na istom lancu u peptidu prisutni Vi. region i VHregion.
Realizacija 26: Peptid prema realizaciji 25, pri čemu su VLregion i VHregion odvojeni fleksibilnim veznikom.
Realizacija 27: Peptid prema realizaciji 24, pri čemu su na odvojenim lancima u peptidu prisutni VLregion i VHregion.
Realizacija 28: Peptid prema realizaciji 27, pri čemu su VLregion i VHregion prisutni na odvojenim lancima u peptidu u kontekstu imunoglobulinskog savijanja proteina.
Realizacija 29: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 24 do 28, pri čemu su prvi VLregion i prvi VHregion orijentisani tako da se tri CDR-a u VLregionu i tri CDR-a u VHregionu kooperativno udružuju da doprinesu selektivno i/ili specifično vezivanje antigenske determinante na humanom CD38.
Realizacija 30: Peptid prema realizaciji 29, pri čemu peptid sadrži drugi VLregion identičan prvom VLregionu i drugi VHregion identičan prvom VHregionu, gde se drugi VLregion i drugi VHregion kooperativno udružuju da doprinesu u selektivnom i/ili specifičnom vezivanju antigenske determinante na humanom CD38.
Realizacija 31: Peptid sadrži VLregion koji je funkcionalna varijanta VLregiona antitela prema realizaciji 2.
Realizacija 32: Peptid prema realizaciji 31, pri čemu se VLregion peptida suštinski sastoji od sekvence koja ima najmanje oko 50%, najmanje 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80 %, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom u skladu sa SEK ID Br: 2.
Realizacija 33: Peptid sadrži VHregion koji je funkcionalna varijanta VHregiona antitela prema realizaciji 2.
Realizacija 34: Peptid prema realizaciji 33, pri čemu se VHregion peptida suštinski sastoji od sekvence koja ima najmanje oko 50%, najmanje 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80 %>, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom koja je u skladu sa SEK ID Br: 7.
Realizacija 35: Peptid sadrži najmanje jedan CDR koji je funkcionalna varijanta CDR antitela iz realizacije 2.
Realizacija 36: Peptid prema realizaciji 35, gde se najmanje jedan od CDRs peptida
suštinski sastoji od sekvence koja ima najmanje oko 50%, najmanje 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%>, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom prema SEK ID Br: 3, SEK ID Br: 4, SEK ID Br: 5, SEK ID Br: 8, SEK ID Br: 9, ili SEK ID Br: 10.
Realizacija 37: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 31 do 36, pri čemu peptid ima najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%>, najmanje oko 80%>, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% vezujućih karakteristika epitopa sa antitelom iz realizacije 2.
Realizacija 38: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 31 do 36, pri čemu peptid ima najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%>, najmanje oko 80%>, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% afiniteta, aviditeta ili specifičnosti antitela iz realizacije 2.
Realizacija 39: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 12 do 38, pri čemu peptid specifično vezuje humani CD38.
Realizacija 40: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 12 do 39, peptid koji se takmiči sa antitelom prema realizaciji 2 za vezivanje za CD38.
Realizacija 41: Peptid prema realizaciji 40, pri čemu sc konkurencija određuje upotrebom tehnike ELISA kao što je opisano u Primeru 8 ili 9 specifikacije.
Realizacija 42: Peptid prema realizaciji 7, gde se konkurencija određuje korišćenjem merenja unakrsnog blokiranja kao što je opisano u Primeru 7 specifikacije.
Realizacija 43: Peptid prema realizaciji 39, takav peptid se specifično vezuje za epitop CD38, epitopa koji je takođe specifično vezan od strane antitela prema realizaciji 2.
Realizacija 44: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 39 do 43, pri čemu se peptid vezuje za humani CD38 sa većim afinitetom od antitela prema realizaciji 2.
Realizacija 45: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 39 do 43, pri čemu peptid suštinski ima iste specifične CD38 vezujuće karakteristike kao antitelo prema realizaciji 2.
Realizacija 46: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 39 do 45, pri čemu jc peptid koji vezuje CD38 suštinski slobodan od drugih CD38 vezujućih peptida.
Realizacija 47: Peptid koji se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31), a koji se ne vezuje za mutanta humanog CD38, pri čemu je serinski ostatak na položaju 274 supstituisan sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34) u istoj meri u kojoj se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
Realizacija 48: Peptid prema realizaciji 47, pri čemu je EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je serinski ostatak na položaju 274 supstituisan sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34), manja od 50% od EC5ovezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
Realizacija 49: Peptid prema realizaciji 48, pri čemu je EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je serinski ostatak na položaju 274 supstituisan sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34), manja od 10% od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
Realizacija 50: Peptid prema realizaciji 49, pri čemu je EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je serinski ostatak na položaju 274 supstituisan sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34), manja od 5% od EC50 vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
Realizacija 51: Peptid prema realizaciji 50, pri čemu je EC5ovezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je serinski ostatak na položaju 274 supstituisan sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34), manja od 1% od EC5ovezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
Realizacija 52: Peptid koji se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31), a koji se ne vezuje za mutanta humanog CD38, pri čemu je glutaminski ostatak na položaju 272 supstituisan sa argininskim ostatkom (SEK ID Br: 33) u istoj meri u kojoj se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
Realizacija 53: Peptid prema realizaciji 52, pri čemu je EC50(polu-maksimalna efektivna koncentracija) vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, gde jc serinski ostatak na položaju 274 supstituisan sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34), manja od 50% od EC5ovezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
Realizacija 54: Peptid prema realizaciji 53, pri čemu je EC5ovezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je serinski ostatak na položaju 274 supstituisan sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34), manja od 10% od EC5ovezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
Realizacija 55: Peptid bilo kojoj od realizacija 47 do 51 koji se ne vezuje za mutanta humanog CD38, gde je glutaminski ostatak na položaju 272 supstituisan sa argininskim ostatkom (SEK ID Br: 33) u istom stepenu u kome sc vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
Realizacija 56: Peptid prema realizaciji 55, pri čemu pri čemu je EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je serinski ostatak na položaju 274 supstituisan sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34), manja od 50% od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
Realizacija 57: Peptid prema realizaciji 56, pri čemu pri čemu je EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je serinski ostatak na položaju 274 supstituisan sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34), manja od 10% od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
Realizacija 58: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 47 do 57, pri čemu se pomenuti peptid vezuje za mutanta humanog CD38, pri čemu je treoninski ostatak na položaju 237 supstituisan sa alaninskim ostatkom (SEK ID Br: 32) u istom stepenu u kome se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
Realizacija 59: Peptid prema realizaciji 58, pri čemu je EC50(polu-maksimalna efektivna koncentracija) vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, gde je treoninski ostatak na položaju 237 supstituisan sa alaninskim ostatkom (SEK ID Br: 32) viša od 75 % od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
Realizacija 60: Peptid prema realizaciji 59, pri čemu EC50(polu-maksimalna efektivna koncentracija) vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je treoninski ostatak na položaju 237 supstituisan sa alaninskim ostatkom (SEK ID Br: 32) je viša od 85% od EC5ovezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
Realizacija 61: Peptid prema realizaciji 60, pri čemu EC5ovezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je treoninski ostatak na položaju 237 supstituisan sa alaninskim ostatkom (SEK ID Br: 32) je viša od 90 % od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK TD Br: 31).
Realizacija 62: Peptid prema realizaciji 61, pri čemu EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je treoninski ostatak na položaju 237 supstituisan sa alaninskim ostatkom (SEK ID Br: 32) je viša od 95 % od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
Realizacija 63: Peptid koji sc takmiči sa antitelom prema realizaciji 4 za vezivanje za CD38. Realizacija 64: Peptid prema realizaciji 63, pri čemu se konkurencija određuje upotrebom ELISA kao što je opisano u Primeru 8 ili 9 specifikacije.
Realizacija 65: Peptid prema realizaciji 63, pri čemu se konkurencija određuje korišćenjem merenja unakrsnog blokiranja kao što je opisano u Primeru 7 specifikacije.
Realizacija 66: Peptid koji se specifično vezuje za CD38 epitop, epitopa koji je takođe specifično vezan od strane antitela prema realizaciji 4.
Realizacija 67: Peptid koji suštinski ima iste specifične vezujuće karakteristike za vezivanje humanog CD38 kao i antitelo prema realizaciji 4.
Realizacija 68: Peptid sadrži VLCDR1 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 13.
Realizacija 69: Peptid sadrži VLCDR2 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 14.
Realizacija 70: Peptid sadrži VLCDR3 koji sc suštinski sastoji od SEK ID Br: 15.
Realizacija 71: Peptid prema realizaciji 70, peptida koji takođe sadrži VLCDR1 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 13.
Realizacija 72: Peptid prema realizaciji 70, peptida koji takođe sadrži VLCDR2 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 14.
Realizacija 73: Peptid prema realizaciji 72, peptida koji takođe sadrži VLCDR1 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 13.
Realizacija 74: Peptid koji sadrži VHCDR1 se suštinski sastoji od SEK ID Br: 18.
Realizacija 75: Peptid koji sadrži VHCDR2 se suštinski sastoji od SEK ID Br: 19.
Realizacija 76: Peptid koji sadrži VHCDR3 se suštinski sastoji od SEK ID Br: 20.
Realizacija 77: Peptid prema realizaciji 76, peptida koji takođe sadrži VHCDR1 se suštinski sastoji od SEK ID Br: 18.
Realizacija 78: Peptid prema realizaciji 76, peptida koji takođe sadrži VHCDR2 se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 19.
Realizacija 79: Peptid prema realizaciji 78, peptida koji takođe sadrži VHCDR1 se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 18.
Realizacija 80: Peptid sadrži
(a) prvi VLregion koji sadrži tri VLCDR segmenta, koji se nezavisno jedan od drugoga u osnovi sastoje od SEK ID Br: 13, SEK ID Br: 14 i SEK ID Br: 15; i (b) prvi VHregion koji sadrži tri VHCDR segmenta, koji se nezavisno jedan od drugoga u osnovi sastoje od SEK ID Br: 18, SEK ID Br: 19, i SEK ID Br: 20.
Realizacija 81: Peptid prema realizaciji 80, pri čemu su na istom lancu u peptidu prisutni VLregion i VHregion.
Realizacija 82: Peptid prema realizaciji 81, pri čemu su VLregion i VHregion odvojeni fleksibilnim linkerom.
Realizacija 83: Peptid prema realizaciji 80, pri čemu su na odvojenim lancima u peptidu prisutni VLregion i VHregion.
Realizacija 84: Peptid prema realizaciji 83, pri čemu su na odvojenim lancima u peptidu prisutni VLregion i VHregion u kontekstu imunoglobulin -strukog proteina.
Realizacija 85: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 80 do 84, pri čemu su prvi VLregion i prvi VHregion orijentisani tako da se tri CDR u VLregionu i tri CDR u VHregionu kooperativno udružuju da doprinesu u selektivnom i/ili specifičnom vezivanju antigenske determinante na humanom CD38.
Realizacija 86: Peptid prema realizaciji 85, pri čemu peptid sadrži drugi VLregion identičan prvom VLregionu i drugi VHregion identičan prvom VHregionu, pri čemu se drugi VLregion i drugi VHregion kooperativno udružuju da doprinesu u selektivnom i/ili specifičnom vezivanju antigenske determinante na humanom CD38.
Realizacija 87: Peptid sadrži VLregion koji je funkcionalna varijanta VLregiona antitela prema realizaciji 4.
Realizacija 88: Peptid prema realizaciji 87, pri čemu se VLregion peptida suštinski sastoji od sekvence koja ima najmanje oko 50%, najmanje 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80 %, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom prema SEK ID Br: 12.
Realizacija 89: Peptid sadrži VHregion koji je funkcionalna varijanta VHregiona antitela prema realizaciji 4.
Realizacija 90: Peptid prema realizaciji 89, pri se čemu VHregion peptida suštinski sastoji od sekvence koja ima najmanje oko 50%, najmanje 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80 %, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom prema SEK ID Br: 17.
Realizacija 91: Peptid sadrži najmanje jedan CDR koji je funkcionalna varijanta CDR antitela prema realizaciji 4.
Realizacija 92: Peptid prema realizaciji 91, pri čemu se najmanje jedan od CDRs peptida suštinski sastoji od sekvence koja ima najmanje oko 50%, najmanje 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%>, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom prema SEK ID Br: 13, SEK ID Br: 14, SEK ID Br: 15, SEK ID Br: 18, SEK ID Br: 19, ili SEK ID Br: 20.
Realizacija 93: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 87 do 92, pri čemu peptid ima najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%>, najmanje oko 80%>, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% vezujućih karakteristika za epitop od antitela prema realizaciji 4.
Realizacija 94: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 87 do 92, pri čemu peptid ima najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% afiniteta, aviditeta ili specifičnosti antitela prema realizaciji 4.
Realizacija 95: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 68 do 94, takav peptid specifično vezuje humani CD38.
Realizacija 96: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 68 do 95, peptida koji se takmiči sa antitelom prema realizaciji 4 za vezivanje za CD38.
Realizacija 97: Peptid prema realizaciji 96, pri čemu se konkurencija određuje upotrebom ELISA kao stoje opisano u Primeru 8 ili 9 specifikacije.
Realizacija 98: Peptid prema realizaciji 96, pri čemu se konkurencija određuje korišćenjem merenja unakrsnog blokiranja kao što je opisano u Primeru 7 specifikacije.
Realizacija 99: Peptid prema realizaciji 95, peptida koji se specifično vezuje za CD38 epitop, isti epitop je takođe specifično vezan od strane antitela prema realizaciji 4.
Realizacija 100: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 95 do 99, pri čemu sc peptid vezuje za humani CD38 sa većim afinitetom nego antitelo prema realizaciji 4.
Realizacija 101: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 95 do 99, pri čemu peptid u suštini ima iste specifične CD38 vezujuće karakteristike kao i antitelo prema realizaciji 4.
Realizacija 102: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 95 do 101, pri čemu je peptid koji vezuje CD38 suštinski slobodan od drugih CD38 vezujućih peptida.
Realizacija 103: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 63 do 102, koji se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31), a koji se ne vezuje za mutanta humanog CD38, pri čemu je serinski ostatak na položaju 274 zamenjen sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34) u istom stepenu kojim se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
Realizacija 104: Peptid prema realizaciji 103, pri čemu je EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, gde je serinski ostatak na položaju 274 zamenjen sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34), manja od 50% od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31). Realizacija 105: Peptid prema realizaciji 104, pri čemu je EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, gde je serinski ostatak na položaju 274 zamenjen sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34), manja od 10% od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31). Realizacija 106: Peptid prema realizaciji 105, pri čemu je EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, gde je serinski ostatak na položaju 274 zamenjen sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34), manja od 5% od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31). Realizacija 107: Peptid prema realizaciji 106, pri čemu je EC5ovezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je serinski ostatak na položaju 274 zamenjen sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34), manja od 1% od EC5ovezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
Realizacija 108: Peptid koji se vezuje za humani CD38 (SEK TD Br: 31), a koji se ne vezuje za mutanta humanog CD38, pri čemu je glutaminski ostatak na položaju 272 zamenjen sa argininskim ostatkom (SEK ID Br: 33) u istom stepenu kojim se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31). Realizacija 109: Peptid prema realizaciji 108, pri čemu je EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu jc serinski ostatak na položaju 274 zamenjen sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34), manja od 50% od EC5ovezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
Realizacija 110: Peptid prema realizaciji 109, pri čemu je EC5ovezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je serinski ostatak na položaju 274 zamenjen sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34), manja od 10% od EC5ovezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
Realizacija 111: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 103 do 107 koji se ne vezuje za mutanta humanog CD38, pri čemu je glutaminski ostatak na položaju 272 zamenjen sa argininskim ostatkom (SEK ID Br: 33) u istom stepenu kojim sc vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
Realizacija 112: Peptid prema realizaciji 111, pri čemu je EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, gde je serinski ostatak na položaju 274 zamenjen sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34), manja od 50% od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31). Realizacija 113: Peptid prema realizaciji 112, pri čemu je EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, gde je serinski ostatak na položaju 274 zamenjen sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34), manja od 10% od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31). Realizacija 114: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 103 do 113, pri čemu se navedeni peptid vezuje za mutanta humanog CD38, pri čemu je treoninski ostatak na položaju 237 zamenjen sa alaninskim ostatkom (SEK ID Br: 32) u istom stepenu kojim se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
Realizacija 115: Peptid prema realizaciji 114, pri čemu je EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je treoninski ostatak na položaju 237 zamenjen sa alaninskim ostatkom (SEK ID Br: 32) viša od 75 % od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31). Realizacija 116: Peptid prema realizaciji 115, pri čemu je EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je treoninski ostatak na položaju 237 zamenjen sa alaninskim ostatkom (SEK ID Br: 32) viša od 85% od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31). Realizacija 117: Peptid prema realizaciji 116, gde je EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je treoninski ostatak na položaju 237 zamenjen sa alaninskim ostatkom (SEK ID Br: 32) viša od 90 % od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
Realizacija 118: Peptid prema realizaciji 117, gde je EC5ovezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je treoninski ostatak na položaju 237 zamenjen sa alaninskim ostatkom (SEK ID Br: 32) viša od 95 % od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK TD Br: 31).
Realizacija 119: Peptid koji se takmiči sa antitelom prema realizaciji 6 za vezivanje za CD38. Realizacija 120: Peptid prema realizaciji 119, pri čemu se konkurencija određuje upotrebom tehnike ELISA kao što je opisano u Primeru 8 ili 9 specifikacije.
Realizacija 121: Peptid prema realizaciji 119, pri čemu se konkurencija određuje korišćenjem mercnja unakrsnog blokiranja kao što jc opisano u Primeru 7 specifikacije.
Realizacija 122: Peptid koji se specifično vezuje za CD38 epitop, epitopa koji je takođe specifično vezan antitelom prema realizaciji 6.
Realizacija 123: Peptid koji suštinski ima iste specifične vezujuće karakteristike za vezivanje humanog CD38 kao antitelo prema realizaciji 6.
Realizacija 124: Peptid sadrži VLCDR1 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 23.
Realizacija 125: Peptid sadrži VLCDR2 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 24.
Realizacija 126: Peptid sadrži VLCDR3 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 25.
Realizacija 127: Peptid prema realizaciji 126, takav peptid takođe sadrži VLCDR1 koji se sastoji uglavnom od SEK ID Br: 23.
Realizacija 128: Peptid prema realizaciji 126, peptid koji takođe sadrži VLCDR2 koji sc suštinski sastoji od SEK ID Br: 24.
Realizacija 129: Peptid prema realizaciji 128, peptid koji takođe sadrži VLCDR1 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 23.
Realizacija 130: Peptid koji sadrži VHCDR1 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 28. Realizacija 131: Peptid koji sadrži VHCDR2 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 29. Realizacija 132: Peptid koji sadrži VHCDR3 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 30. Realizacija 133: Peptid prema realizaciji 132, peptid koji takođe sadrži VHCDR1 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 28.
Realizacija 134: Peptid prema realizaciji 132, peptid koji takođe sadrži VHCDR2 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 29.
Realizacija 135: Peptid prema realizaciji 134, peptid koji takođe sadrži VHCDR1 koji se suštinski sastoji od SEK ID Br: 28.
Realizacija 136: Peptid sadrži
(a) prvi VLregion koji sadrži tri VLCDR segmenta, koji se nezavisno jedan od drugoga u osnovi sastoje od SEK ID Br: 23, SEK ID Br: 24 i SEK ID Br: 25; i (b) prvi VHregion koji sadrži tri VHCDR segmenta, koji se nezavisno jedan od drugoga u osnovi sastoje od SEK ID Br: 28, SEK ID Br: 29, i SEK ID Br: 30.
Realizacija 137: Peptid prema realizaciji 136, pri čemu su V,. region i VHregion prisutni na istom lancu u peptidu.
Realizacija 138: Peptid prema realizaciji 137, pri čemu su VLregion i VHregion odvojeni fleksibilnim linkerom.
Realizacija 139: Peptid prema realizaciji 136, pri čemu su VLregion i VHregion prisutni na odvojenim lancima u peptidu.
Realizacija 140: Peptid prema realizaciji 139, pri čemu su VLregion i VHregion prisutni na odvojenim lancima u peptidu u kontekstu imunoglobulin -strukog proteina.
Realizacija 141: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 136 do 140, pri čemu su prvi VLregion i prvi VHregion orijentisani tako da se tri CDR segmenta u VLregionu i tri CDR segmenta u VHregionu kooperativno udružuju da doprinesu u selektivnom i/ili specifičnom vezivanju antigenske determinante na humanom CD38.
Realizacija 142: Peptid prema realizaciji 141, pri čemu peptid sadrži drugi VLregion identičan prvom VLregionu i drugi VHregion identičan prvom VHregionu, pri čemu se drugi VLregion i drugi VHregion kooperativno udružuju da doprinesu u selektivnom i/ili specifičnom vezivanju antigenske determinante na humanom CD38.
Realizacija 143: Peptid sadrži VLregion koji je funkcionalna varijanta VLregiona antitela prema realizaciji 6.
Realizacija 144: Peptid prema realizaciji 143, pri čemu sc VLregion peptida suštinski sastoji od sekvence koja ima najmanje oko 50%, najmanje 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80 %, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom prema SEK ID Br: 22.
Realizacija 145: Peptid sadrži VHregion koji je funkcionalna varijanta VHregiona antitela prema realizaciji 6.
Realizacija 146: Peptid prema realizaciji 145, pri čemu se VHregion peptida suštinski sastoji od sekvence koja ima najmanje oko 50%, najmanje 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80 %, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom prema SEK ID Br: 27.
Realizacija 147: Peptid sadrži najmanje jedan CDR koji je funkcionalna varijanta CDR antitela prema realizaciji 6.
Realizacija 148: Peptid prema realizaciji 147, pri čemu se najmanje jedan od CDRs peptida suštinski sastoji od sekvence koja ima najmanje oko 50%, najmanje 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom prema SEK ID Br: 23, SEK ID Br: 24, SEK ID Br: 25, SEK ID Br: 28, SEK ID Br: 29, ili SEK ID Br: 30.
Realizacija 149: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 143 do 148, pri čemu peptid ima najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% karakteristika vezivanja za epitop od antitela prema realizaciji 6.
Realizacija 150: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 143 do 148, pri čemu peptid ima najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95% afiniteta, aviditeta ili specifičnosti antitela prema realizaciji 6.
Realizacija 151: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 124 do 150, peptid koji specifično vezuje humani CD38.
Realizacija 152: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 124 do 151, peptid koji se takmiči sa antitelom prema realizaciji 6 za vezivanje za CD38.
Realizacija 153: Peptid prema realizaciji 152, pri čemu sc konkurencija određuje upotrebom ELISA kao što je opisano u Primeru 8 ili 9 specifikacije.
Realizacija 154: Peptid prema realizaciji 152, pri čemu se konkurencija određuje korišćenjem merenja unakrsnog blokiranja kao što je opisano u Primeru 7 specifikacije.
Realizacija 155: Peptid prema realizaciji 151, što se peptid specifično vezuje za CD38 epitop, epitopa koji je takođe specifično vezan od strane antitela prema realizaciji 6.
Realizacija 156: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 151 do 155, pri čemu se peptid vezuje za humani CD38 sa većim afinitetom nego antitelo prema realizaciji 6.
Realizacija 157: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 151 do 155, pri čemu peptid suštinski ima iste specifične CD38 vezujuće karakteristike kao antitelo prema realizaciji 6.
Realizacija 158: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 151 do 157, pri čemu jc peptid koji sc vezuje za CD38 suštinski slobodan od drugih CD38 vezujućih peptida.
Realizacija 159: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 1 do 158, pri čemu peptid nije agonist CD38.
Realizacija 160: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 1 do 159, pri čemu peptid ne indukuje značajnu proliferaciju mononuklearnih ćelija periferne krvi.
Realizacija 161: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 1 do 160, pri čemu peptid ne indukuje oslobađanje značajnog nivoa IL-6 od strane humanih monocita ili mononuklearnih ćelija periferne krvi.
Realizacija 162: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 1 do 161, pri čemu peptid ne izaziva oslobađanje detektibilnog IFN-y od strane humanih T ćelija ili mononuklearnih ćelija periferne krvi.
Realizacija 163: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 7 do 162, pri čemu je peptid antitelo. Realizacija 164: Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 1 do 6, ili 163, što antitelo predstavlja humano antitelo.
Realizacija 165: Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 1 do 6, ili 163, što je antitelo humanizovano antitelo.
Realizacija 166: Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 1 do 6, ili 163, što je antitelo himerno antitelo.
Realizacija 167: Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 1 do 6, ili 163 do 166, što je antitelo monoklonsko antitelo.
Realizacija 168: Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 1 do 6, ili 163 do 167, naznačeno time da je ono IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ili IgM antitelo.
Realizacija 169: Antitelo prema realizaciji 168, naznačeno time da je ono IgGl antitelo. Realizacija 170: Antitelo prema realizaciji 169, naznačeno time daje antitelo IgGl,kantitelo. Realizacija 171: Antitelo prema realizaciji 168, naznačeno time daje ono IgM antitelo. Realizacija 172: Antitelo prema realizaciji 171, naznačeno time daje antitelo IgM,kantitelo. Realizacija 173: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 2 do 172, pri čemu jc peptid glikoziliran u eukariotskoj ćeliji.
Realizacija 174: Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 1 do 6, ili 163 do 173, što je antitelo fragment antitela ili antitelo sa jednim lancem.
Realizacija 175: Peptid ili antitelo prema bilo kojoj od realizacija 1 do 174, dalje sadrži linker helator za vezivanje radioizotopa.
Realizacija 176: Peptid prema bilo kojoj od realizacija 1 do 175, što je takav peptid u suštinski izolovanom obliku.
Realizacija 177: Izolovana nukleinska kiselina koja kodira peptid prema bilo kojoj od realizacija 1 do 175.
Realizacija 178: Ekspresioni vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira peptid prema bilo kojoj od realizacija 1 do 175.
Realizacija 179: Ekspresioni vektor koji sadrži VLnukleotidnu sekvencu od SEK ID Br: 1, VHnukleotidnu sekvencu od SEK ID Br: 6, ili VLnukleotidnu sekvencu od SEK ID Br: 1 i VHnukleotidnu sekvencu od SEK ID Br: 6.
Realizacija 180: Ekspresioni vektor koji sadrži VLnukleotidnu sekvencu od SEK ID Br: 11, VHnukleotidnu sekvencu od SEK ID Br: 16, ili VLnukleotidnu sekvencu od SEK ID Br: 11 i VHnukleotidnu sekvencu od SEK ID Br: 16.
Realizacija 181: Ekspresioni vektor prema realizaciji 179 ili realizaciji 180, dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni region lakog lanca, teškog lanca ili i lakih i teških lanaca humanog antitela.
Realizacija 182: Ekspresioni vektor prema realizaciji 181, pri čemu nukleotidna sekvenca koja kodira konstantni region lakog lanca, teškog lanca ili i lakih i teških lanaca humanog antitela kodira IgGl antitelo.
Realizacija 183: Hibridom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo kodirano od strane nukleinskih kiselina humanog lakog lanca i humanog teškog lanca koje sadrže nukleotidne sekvence u varijabilnom regionu lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 1, ili konzervativne modifikacije sekvence i nukleotidne sekvence u varijabilnom regionu teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 6, ili konzervativne modifikacije sekvence.
Realizacija 184: Hibridom prema realizaciji 183, pri čemu nukleinske kiseline humanog lakog lanca sadrže nukleotidnu sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 1, a nukleinske kiseline humanog teškog lanca sadrže nukleotidnu sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 6. Realizacija 185: Hibridom koji proizvodi humano monoklonalno anti-CD38 antitelo koje ima varijabilne regione humanog teškog lanca i lakog lanca koji sadrže varijabilnu aminokiselinsku sekvencu humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 2 ili konzervativne modifikacije sekvence i varijabilnu amino sekvencu humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 7, ili konzervativne modifikacije sekvence.
Realizacija 186: Hibridom prema realizaciji 185, pri čemu varijabilni region humanog lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 2, a varijabilni region humanog teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 7. Realizacija 187: Transfektom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo kodirano od strane varijabilnih nukleinskih kiselina humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 1, ili konzervativne modifikacije sekvence i nukleinskih kiselina humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br : 6, ili konzervativne modifikacije sekvence.
Realizacija 188: Transfektom prema realizaciji 187, gde je humano monoklonsko anti-CD38 antitelo kodirano od strane varijabilnih nukleinskih kiselina humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 1 i nukleinskih kiselina humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 6.
Realizacija 189: Transfektom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo koje ima varijabilne regione humanog lakog lanca i teškog lanca koji sadrže varijabilnu aminokiselinsku sekvencu humanog lakog lanca kao što jc navedeno u SEK ID Br: 2 ili konzervativne modifikacije sekvence i varijabilnu amino sekvencu humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 7, ili konzervativne modifikacije sekvence.
Realizacija 190: Transfektom prema realizaciji 189, pri čemu humani laki lanac sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 2, a humani teški lanac sadrži varijabilnu amino sekvencu humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 7.
Realizacija 191: Hibridom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo kodirano od strane nukleinskih kiselina humanog lakog lanca i humanog teškog lanca koje sadrže nukleotidne sekvence u varijabilnom regionu lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 11, ili konzervativne modifikacije sekvence i nukleotidne sekvence u varijabilnom regionu teškog lanca kao stoje navedeno u SEK ID Br: 16, ili konzervativne modifikacije sekvence.
Realizacija 192: Hibridom prema realizaciji 191, pri čemu nukleinske kiseline humanog lakog lanca sadrže nukleotidnu sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 11, a nukleinske kiseline humanog teškog lanca sadrže nukleotidnu sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 16. Realizacija 193: Hibridom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo koje ima varijabilne regione humanog teškog lanca i lakog lanca koji sadrže varijabilnu aminokiselinsku sekvencu humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 12, ili konzervativne modifikacije sekvence i varijabilnu amino sekvencu humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 17, ili konzervativne modifikacije sekvence.
Realizacija 194: Hibridom prema realizaciji 193, pri čemu varijabilni region humanog lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 12, a varijabilni region humanog teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEK ID Br: 17. Realizacija 195: Transfektom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo kodirano od strane varijabilnih nukleinskih kiselina humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 11, ili konzervativne modifikacije sekvence, i nukleinskih kiselina humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 16, ili konzervativne modifikacije sekvence.
Realizacija 196: Transfektom prema realizaciji 195, gde je humano monoklonsko anti-CD38 antitelo kodirano od strane varijabilnih nukleinskih kiselina humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 11, i nukleinskih kiselina humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 16.
Realizacija 197: Transfektom koji proizvodi humano monoklonsko anti-CD38 antitelo koje ima varijabilne regione humanog lakog lanca i teškog lanca koji sadrže varijabilnu aminokiselinsku sekvencu humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 12, ili konzervativne modifikacije sekvence i varijabilnu amino sekvencu humanog teškog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 17, ili konzervativne modifikacije sekvence.
Realizacija 198: Transfektom prema realizaciji 197, pri čemu humani laki lanac sadrži varijabilnu aminokiselinsku sekvencu humanog lakog lanca kao što je navedeno u SEK ID Br: 12, a humani teški lanac sadrži varijabilnu amino sekvencu humanog teškog lanca kao što jc navedeno u SEK ID Br: 17.
Realizacija 199: Eukariotska ili prokariotska ćelija domaćina koja proizvodi peptid prema bilo kojoj od realizacija 1 do 175.
Realizacija 200: Eukariotska ili prokariotska ćelija domaćina koja sadrži ekspresioni vektor prema realizaciji 178.
Realizacija 201: Transgena nehumana životinja ili biljka koja sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju humani teški lanac i humani laki lanac, pri čemu životinja ili biljka proizvode detektibilne količine peptida prema bilo kojoj od realizacija 1 do 175.
Realizacija 202: Imunokonjugat sadrži peptid prema bilo kojoj od realizacija 1 do 174 povezan sa citotoksičnim agensom, radioaktivnim izotopom ili lekom.
Realizacija 203: Imunokonjugat sadrži peptid prema bilo kojoj od realizacija 1 do 168 ili realizacijama 171 do 174, pri čemu je peptid monomerno IgM antitelo povezano sa citotoksičnim agensom, radioaktivnim izotopom ili lekom.
Realizacija 204: Bispecifičan ili multispecifičan molekul koji sadrži peptid prema bilo kojoj od realizacija 1 do 175 i ima vezujuće specifičnosti za humanu efektorsku ćeliju.
Realizacija 205: Bispecifičan ili multispecifičan molekul koji sadrži peptid prema bilo kojoj od realizacija 1 do 175 i ima vezujuće specifičnosti za CD3, CD4, IL- 15R, membranski vezan ili receptorno vezan TNF-a, humani Fc receptor, ili membranski vezan ili receptorno vezan IL-15. Realizacija 206: Farmaceutska kompozicija koja sadrži peptid prema bilo kojoj od realizacija 1 do 176 ili imunokonjugat prema bilo kojoj od realizacija 202 do 205 i farmaceutski prihvatljiv nosač. Realizacija 207: Farmaceutska kompozicija prema realizaciji 206 koja sadrži jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa.
Realizacija 208: Postupak za inhibiciju rasta i/ili proliferacije ćelija koje eksprimiraju CD38, koji sadrži primenu peptida prema bilo kojoj od realizacija 1 do 176, imunokonjugata prema bilo kojoj od realizacija 202 do 205, farmaceutske kompozicije prema realizaciji 206 ili 207, ili ekspresionog vektora prema bilo kojoj od realizacija 178 do 182, tako daje inhibiran rast i/ili proliferacija ćelija. Realizacija 209: Postupak za lečenje bolesti ili poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimiraju CD38 u subjektu, pri čemu taj postupak obuhvata primenu terapeutski efikasne količine peptida prema bilo kojoj od realizacija 1 do 176, imunokonjugata prema bilo kojoj od realizacija 202 do 205, farmaceutske kompozicije prema realizaciji 206 ili 207, ili ekspresionog vektora prema bilo kojoj od realizacija 178 do 182 na subjektu kome je to potrebno.
Realizacija 210: Postupak za prevenciju bolesti ili poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimiraju CD38 u subjektu, pri čemu taj postupak obuhvata primenu terapeutski efikasne količine peptida u skladu sa bilo kojom od realizacija 1 do 176, imunokonjugata prema bilo kojoj od realizacija 202 do 205, farmaceutske kompozicije prema realizaciji 206 ili 207, ili ekspresionog vektora prema bilo kojoj od realizacija 178 do 182 kod subjekta kome jc to potrebno. Realizacija 211: Postupak prema realizaciji 209 ili realizaciji 210, pri čemu je bolest ili poremećaj reumatoidni artritis.
Realizacija 212: Postupak prema realizaciji 209 ili realizaciji 210, pri čemu je bolest ili poremećaj multipli mijelom.
Realizacija 213: Postupak prema bilo kojoj od realizacija 209 do 212, pri čemu postupak obuhvata primenu jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa na subjektu.
Realizacija 214: Postupak prema realizaciji 213, pri čemu su jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa odabrani od hemoterapeutskog agensa, antiinflamatornog agensa ili imunosupresivnog i/ili imunomodulatornog agensa.
Realizacija 215: Postupak prema realizaciji 213, pri čemu su jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa odabrani iz grupe koju čine cisplatin, gefitinib, cetuksimab, rituksimab, bevacizumab, erlotinib, bortezomib, talidomid, pamidronat, zoledronska kiselina, klodronat, risendronat, ibandronat, etidronat, alendronat, tiludronat, arsen trioksid, lenalidomid, filgrastim, pegfilgrastim, sargramostim, suberoilanilid hidroksamična kiselina i SCIO-469.
Realizacija 216:In vitrometod za detekciju prisustva CD38 antigena, ili ćelije koja eksprimira CD38, u uzorku koji obuhvata:
a) kontaktiranje uzorka sa peptidom prema bilo kojoj od realizacija 1 do 176
pod uslovima koji dozvoljavaju formiranje kompleksa između antitela i CD38; i
b) detekciju formiranja kompleksa.
Realizacija 217:In vitro metodprema realizaciji 216, gde je pomenuti peptid antitelo.
Realizacija 218: Komplet za detektciju prisustva CD38 antigena, ili ćelije koja
eksprimira CD38, u uzorku koji sadrži peptid prema bilo kojoj od realizacija 1 do 176. Realizacija 219:In vivometod za detekciju CD38 antigena, ili ćelije koja eksprimira
CD38, kod subjekta koji obuhvata:
a) primenu peptida prema bilo kojoj od realizacija 1 do 176 pod uslovima koji dozvoljavaju formiranje kompleksa između antitela i CD38; i
b) detektovanje formiranog kompleksa.
Realizacija 220:In vitrometod prema realizaciji 219, gde je pomenuti peptid antitelo.
Realizacija 221: Anti-idiotipsko antitelo koje se vezuje za peptid prema bilo kojoj od realizacija 2,4 ili 163 do 174.
Realizacija 222. Upotreba anti-idiotipskskog antitela prema realizaciji 221 za detekciju
nivoa peptida prema bilo kojoj od realizacija 2, 4 ili 163 do 174 u uzorku.
Realizacija 223. Upotreba anti-idiotipskog antitela prema realizaciji 221 za detekciju
nivoa humanog monoklonskog antitela protiv CD38 u uzorku.
[0220]Izrazi "CD38" i "CD38 antigen" su ovde naizmenično korišćeni i uključuju bilo koje varijante, izoforme i homologne vrste humanog CD38, koje prirodno eksprimiraju ćelije ili su izražene na ćelijima koje su transfektovane sa CD38 genom. Sinonimi za CD38, kao što je poznato u struci, uključuju ADP ribozil ciklazu 1, cADPr hidrolazu 1, CD38-rsl, Cikličnu ADP-riboza hidrolazu 1, 1-19, NIM-R5 antigen.
[0221]Izraz peptid u odnosu na oba CD38-vezujuće peptide i ne-CD38 peptide koji su ovde opisani uključuje bilo koji pogodan peptid i mogu se koristiti kao sinonimi sa izrazima polipeptid i protein, osim ako nije drugačije naznačeno ili kontradiktorno kontekstu; pod uslovom da čitalac prepoznaje da svaki tip odgovarajućeg molekula koji sadrži amino kiselinski polimer može biti povezan sa značajnim razlikama i tako formiraju pojedinačne realizacije ovog pronalaska (na primer, peptid, kao što je antitelo, koji se sastoji od višestrukih polipeptidnih lanaca, se značajno razlikuje od, na primer, antitela sa jednim lancem, peptida imunoadhezina ili jednolančanog imunogenog peptida). Prema tome, izraz peptid ovde se generalno može razumeti kao pozivanje na bilo koji pogodan peptid, bilo koje pogodne veličine i sastava (u odnosu na broj aminokiselina i broj povezanih lanaca u molekuli proteina). Staviše, peptidi u kontekstu inventivnih postupaka i kompozicija koje su ovde opisane mogu da sadrže neprirodne i/ili ne-L aminokiselinske ostatke, ukoliko nije drugačije naznačeno ili kontradiktorno kontekstu.
[0222]Kao što će biti dalje razmotreno ovde, ukoliko nije drugačije naznačeno ili kontradiktorno kontekstu, izraz peptid (i ako se govori o pojedinačnim realizacijama izraz (i) polipeptid i/ ili protein) takođe obuhvata derivatizovane molekule peptida. Ukratko, u kontekstu ovog pronalaska, derivat je peptid u kome je jedan ili više aminokiselinskih ostataka peptida hemijski modifikovan (na primer alkilacijom, acilovanjem, formiranjem estra ili amida) ili udružen sa jednim ili više ne-aminokiselinskih organskih i/ili neorganskih atomskih ili molekulskih supstituenata (na primer polietilen glikol (PEG) grupa, lipofilni supstituent (koji opciono može biti povezan sa aminokiselinskom sekvencom peptida od strane prostornog ostatka ili grupe kao što je P-alanin, y-aminobuterna kiselina (GABA), L/D-glutaminska kiselina, ćilibarna kiselina, i slično), fluorofor, biotin, radionuklid, itd) i može takođe ili alternativno da sadrži neesencijalne, neprirodne, i / ili ne-L aminokiselinske ostatke, ukoliko nije drugačije naznačeno ili kontradiktorno kontekstu (međutim, treba ponovo priznati da se takvi derivati mogu, prema sebi, smatrati nezavisnim karakteristikama i inkluzije takvih molekula u smislu peptida se vrše radi pogodnosti u opisu ovog pronalaska, a ne impliciraju bilo kakvu vrstu jednakosti između golih peptida i takvih derivata). Neograničavajući primeri takvih aminokiselinskih ostataka uključuju na primer 2-amino-adipinsku kiselinu, 3-amino-adipinsku kiselinu, p-alanin, p-aminopropionsku kiselinu, 2-aminobuternu kiselinu, 4-aminobuternu kiselinu, 6-aminokapronsku kiselinu, 2-aminoheptanoičnu kiselinu, 2-aminoizobuternu kiselinu, 3-aminoizobuternu kiselinu, 2-aminopimelinsku kiselinu, 2,4-diaminobuternu kiselinu, dezmozin, 2,2'-diaminopimelinsku kiselinu, 2,3-diaminopropionsku kiselinu, N-etilglicin, N-etilasparagin, hidroksilizin, alo- hidroksilizin, 3-hidrokiprolin, 4-hidroksiprolin, izodczmozin, aloizolcucin, N-mctilglicin, N-mctilizolcucin, 6-N-mctillizin, N-mctilvalin, norvalin, norleucin, ornitin i statin halogenirane aminokiseline.
[0223]Antigen vezujući peptidi se odnose na bilo koji peptid koji se specifično vezuje za deo datog antigena pod ćelijskim i/ili fiziološkim uslovima u periodu vremena dovoljnom da se izazove, promoviše, poboljša i/ili na drugi način modulira fiziološki efekat povezan sa antigenom; da omoguće detekciju pomoću tehnika ELISA, Western blot ili drugom sličnom tehnikom vezivanja pogodnog proteina koje su ovde opisane i/ili su poznate u tehnici i/ili na drugi način budu detektibilno vezani za njega nakon relevantnog vremenskog perioda (na primer, najmanje oko 15 minuta, najmanje oko 30 minuta, najmanje oko 45 minuta, najmanje oko 1 sat, najmanje oko 2 sata, najmanje oko 4 sata, najmanje oko 6 sati, najmanje oko 12 sati, oko 1-24 sati, oko 1 -36 sati, oko 1-48 sati, oko 1-72 sati, oko jedne nedelje, ili duže).
[0224]CD38 vezujući peptid ili CD38BP, je antigen vezujući peptid koji se specifično vezuje za antigen CD38. U jednoj realizaciji, vezivanje CD38BP na CD38 je mereno korišćenjem postupka opisanog u primeru 4.
[0225]Izraz imunoglobulin se odnosi na klasu strukturno srodnih glikoproteina koji se sastoje od dva para polipeptidnih lanaca, jedan par lakih (L) lanaca niske molekulske težine i jedan par teških (H) lanca, sva četiri su međusobno povezana disulfidnim vezama. Struktura imunoglobulina je dobro karakterisana. videti na primer Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W. ed., 2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989)). Ukratko, svaki teški lanac se obično sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde je skraćeno kao VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca se tipično sastoji od tri domena, CH1, CH2, i CH3. Svaki laki lanac se tipično sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde je skraćeno kao VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca se obično sastoji od jednog domena, CL. VHi VLregioni mogu biti dalje podeljeni u regione hipervarijabilnosti (ili hipervarijabilni regioni koji mogu biti hipervarijabilni u sekvenci i/ili obliku strukturno definisanih petlji), takođe označeni regionima koji određuju komplementarnost (CDRs), prošarani regionima koji su konzervativniji, označeni kao okvirni regioni (FRs).
[0226]Svaki VHi VLse obično sastoji od tri CDRs i četiri FRs, uređenih od amino-terminusa do karboksi-tcrminusa u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (videti Chothia i Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)). Tipično, numeracija aminokiselinskih ostataka u ovom regionu se vrši postupkom opisanim u Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) (izrazi kao što su numeracija ostataka varijabilnog domena kao što je u Kabat ili prema Kabatu ovde se odnosi na ovaj numerički sistem za varijabilne domene teškog lanca ili varijabilne domene lakog lanca). Korišćenjem ovog numeričkog sistema, stvarna linearna aminokiselinska sekvenca peptida može sadržati manje ili dodatne aminokiseline koje odgovaraju na skraćivanje, ili umetanje u, FR ili CDR varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može uključivati umetanje pojedinačne aminokiseline (ostatak 52a prema Kabatu) posle ostatka 52 VHCDR2 i umetanje ostataka (na primer ostaci 82a, 82b, i 82c, itd prema Kabatu) posle FR ostatka 82 teškog lanca. Kabat numerisanje ostataka se može odrediti za dato antitelo poravnavanjem na regionima homologijc sekvence antitela sa "standardnom" Kabat numerisanom sekvencom.
[0227]Izraz antitelo (At) u kontekstu predmetnog pronalaska se odnosi na molekul imunoglobulina, fragment molekula imunoglobulina, ili bilo koji njihov derivat, koji ima sposobnost da se specifično veže za antigen pod tipičnim fiziološkim uslovima u značajnim periodima vremena kao što je najmanje oko 30 minuta, najmanje oko 45 minuta, najmanje oko jedan sat, najmanje oko dva sata, najmanje oko četiri sata, najmanje oko 8 sati, najmanje oko 12 sati, oko 24 sati ili više, oko 48 sati ili više, oko 3, 4, 5, 6, 7 ili više dana, itd, ili bilo koji drugi relevantan funkcionalno-definisani period (kao što je vreme dovoljno da indukuje, promoviše, poboljša i/ili modulira fiziološki odgovor povezan sa antitelom koje se vezuje za antigen).
[0228]Varijabilni regioni teških i lakih lanaca molekula imunoglobulina sadrže vezujući domen koji stupa u interakciju sa antigenom. Konstantni regioni antitela (At-a) mogu da posreduju u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunog sistema (kao što su efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.
[0229]Anti-CD38 antitelo može biti bispecifično antitelo, dvojno antitelo, ili sličan molekul (videti na primer PNAS USA 90 (14), 6444-8 (1993) za opis dvojnih antitela). Zaista, bispecifična antitela, dvojna tela, i slično, koja su obezbeđena predmetnim pronalaskom mogu vezati bilo koji pogodan cilj dodatno sa delom CD38.
[0230]Kao što je gore navedeno, izraz antitelo koji se ovde koristi, ukoliko nije drugačije naznačeno ili jasno kontradiktorno kontekstu, uključuje fragmente antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen. Pokazalo se da se antigen-vezujuća funkcija antitela može izvršiti pomoću fragmenata antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih unutar izraza "antitelo" uključuju (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CLi CH1 domena; (ii) F(ab)2i F(ab')2fragmenti, dvovalentni fragmenti koji sadrže dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fd fragment koji se sastoji uglavnom od VH i CH1 domena; (iv) Fv fragment koji se sastoji uglavnom od VL i VHdomena jednog kraka antitela, (v) dAt fragment (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), koji se esencijalno sastoji od VHdomena; (vi) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR) i (vii) kombinacija dva ili više izolovanih CDRs koja može biti eventualno pridružena sintetičkim linkerom. Nadalje, iako su dva domena Fv fragmenta, VLi VH, kodirana odvojenim genima, ona mogu biti spojena, primenom rekombinantnih postupaka, pomoću sintetičkog linkera koji im omogućava da budu napravljeni kao jedan proteinski lanac u kome su VLi VHregioni spareni tako da formiraju monovalentne molekule (poznate kao jednolančana antitela ili jednolančani Fv (scFv), videti na primer Bird et al, Science 242, 423-426 (1988) i Huston et al., PNAS USA 85, 5879 - 5883 (1988)). Takva jednolančana antitela su obuhvaćena unutar izraza antitelo ukoliko nije drugačije naznačeno ili jasno naznačeno u kontekstu. Drugi oblici jednolančanih antitela, poput dvojnih antitela su uključeni unutar izraza antitelo. Iako su takvi fragmenti generalno uključeni unutar značenja antitela, oni su kolektivno i svaki nezavisno jedinstvene karakteristike predmetnog pronalaska, ispoljavaju različite biološke osobine i korisnost. Ovi i drugi korisni fragmenti antitela u kontekstu predmetnog pronalaska su ovde dalje razmatrani.
[0231]Takođe treba biti shvaćeno da izraz antitelo takođe generalno obuhvata poliklonska antitela, monoklonska antitela (mAt-a), polipeptide slične antitelima, poput himernih antitela i humanizovanih antitela, antiidiotipska (anti-Id) antitela za antitela, i fragmente antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen (antigen-vezujući fragmenti) obezbeđene bilo kojom poznatim tehnikom, kao što su enzimsko razlaganje, sinteza peptida i rekombinantne tehnike. Antitelo kao generisano može posedovati bilo koji izotip.
[0232]Anti-CD38 antitelo je antitelo kao što je gore opisano, koje se specifično vezuje za CD38 antigen.
[0233]Izraz "epitop" označava determinantu proteina sposobnu za specifično vezivanje za antitelo. Epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupacija molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju u tome što se vezivanje za prethodni, ali ne i drugi gubi u prisustvu denaturisanih rastvarača. Epitop može sadržati aminokiselinske ostatke neposredno uključene u vezivanje (takođe se zove imunodominantna komponenta epitopa) i druge aminokiselinske ostatke, koji nisu direktno uključeni u vezivanje, kao što su aminokiselinski ostaci koji su efektivno blokirani od strane specifičnog antigen vezujućeg peptida (drugim rečima, aminokiselinski ostatak je u okviru otiska specifičnog antigen vezujućeg peptida).
[0234]Izraz "bispecifičan molekul" ima nameru da uključi bilo koji agens, kao što je protein, peptid ili proteinski ili peptidni kompleks, koji ima dve različite specifičnosti vezivanja. Na primer, molekul može da se veže za, ili stupa u interakciju sa, (a) antigenom na površini ćelije (b) Fc receptorom na površini efektorske ćelije. Izraz "multispecifičan molekul" ima nameru da uključi bilo koji agens, na primer protein, peptid ili proteinski ili peptidni kompleks, koji ima više od dve različite specifičnosti vezivanja. Na primer, molekul se može vezati za, ili stupa u interakciju sa, (a) antigenom na površini ćelije, (b) Fc receptorom na površini efektorske ćelije, i (c) najmanje jednom drugom komponentom. Prema tome, predmetni pronalazak obuhvata, ali nije ograničen na, bispecifičan, trispecifičan, tetraspecifičan i druge multispecifične molekule koji su usmereni na CD38, i druge površinske ćelijske antigene ili ciljeve, poput Fc receptora na efektorskim ćelijama.
[0235]Izraz "bispecifična antitela" je namenjen da uključuje sva anti-CD38 antitela, što je bispecifičan molekul. Izraz "bispecifična antitela" takođe uključuje dvojna antitela. Dvojna antitela su dvovalentna, bispecifična antitela u kojima su VHi VLdomeni eksprimirani na jednom lancu polipeptida, ali korišćenjem linkera koji je suviše kratak da dozvoli sparivanje između dva domena na istom lancu, prisiljavajući domene da se spare sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvarajući dva antigen vezujuća mesta (videti na primer Holliger, P. et al, PNAS USA 90, 6444-6448 (1993), Poljak, RJ. et al, Structure2, 1121-1123 (1994)).
[0236]Kako se ovde koristi, izraz "efektorska ćelija" se odnosi na imunu ćeliju koja je uključena u efektorsku fazu imunog odgovora, za razliku od kognitivnih i aktivacionih faza imunog odgovora. Primcri imunih ćelija uključuju ćelije mijeloidnog ili limfnog porekla, na primer limfocitc (kao što su B ćelije i T ćelije, uključujući citolitičke T ćelije (CTL)), ćelije ubice, ćelije prirodne ubice, makrofage, monocite, eozinofile, neutronfile, polimorfonuklearne ćelije, granulocite, mastocite i bazofile. Neke efektorske ćelije ispoljavaju specifične Fc receptore i vrše specifične funkcije imunog sistema. U nekim izvođenjima, efektorska ćelija je sposobna da indukuje antitelom-zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC), kao što je neutrofil koji je sposoban da indukuje ADCC. Na primer, monociti, makrofage, koji eksprimiraju FcR su uključeni u specifičnom ubijanju ciljnih ćelija i predstavljanju antigena drugim komponentama imunskog sistema, ili se vezuju za ćelije koje predstavljaju antigene. U nekim izvođenjima, efektorska ćelija može fagocitirati ciljni antigen, ciljnu ćeliju ili mikroorganizam. Ekspresija određenog FcR na efektorskoj ćeliji se može regulisati humoralnim faktorima kao što su citokini. Na primer, ekspresija FcyRI je nađena daje ushodno regulisana interferonom y (IFN-y) i/ili G-CSF-om. Ova povećana ekspresija povećava citotoksičnu aktivnost FcyRI-nosećih ćelija protiv ciljeva. Efektorska ćelija može fagocitovati ili lizirati ciljni antigen ili ciljnu ćeliju.
[0237] Izraz "humano antitelo", kako se ovde koristi, namerava da uključi antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione poreklom od humane embrionske linije imunoglobulinskih sekvenci. Humana antitela iz ovog pronalaska mogu uključivati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani od strane humanih imunoglobulinskih sekvenci embrionske linije (na primer mutacije uvedene slučajnom ili mesto-specifičnom mutagenezomin vitroili putem somatske mutacijein vivo).Međutim, izraz "humano antitelo", kako se ovde koristi, nije namenjen da uključuje antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz embrionske linije drugih vrsta sisara, kao što je miš, nakalemljenih na humane okvirne sekvence.
[0238] Kako se ovde koristi, humano antitelo je "izvedeno iz" posebne embrionske sekvence ako je antitelo dobijeno iz sistema korišćenjem humanih imunoglobulinskih sekvenci, na primer imunizacijom transgenog miša koji nosi humane imunoglobulinske gene ili pomoću skrininga biblioteke humanog imunoglobulinskog gena, i pri čemu je izabrano humano antitelo najmanje 90%, kao što je najmanje 95%, na primer najmanje 96%, kao što je najmanje 97%, na primer najmanje 98%>, ili kao što je najmanje 99% identično u aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom kodiranom od strane embrionskog genskog segmenta VHili VLvarijabilnog regiona. Tipično, humano antitelo koje potiče iz posebne humane sekvence embrionskog genskog segmenta VHili VLvarijabilnog regiona prikazaće ne više od 10 aminokiselinskih razlika, kao što je ne više od 5, na primer ne više od 4, 3, 2 ili 1 aminokiselinskih razlika od aminokiselinske sekvence kodirane od strane embrionskog gena imunoglobulina.
[0239] Himerno antitelo je antitelo koje sadrži jedan ili više regiona iz jednog antitela i jedan ili više regiona iz jednog ili više drugih antitela izvedenih iz drugih vrsta. Monovalentno himerno antitelo je dimer (HL)) formirano od himernog H lanca povezanog preko disulfidnih mostova sa himernim L lancem. Dvovalentno himerno antitelo je tetramer (H2L2) formiran od dva HL dimera povezanih preko najmanje jednog disulfidnog mosta. Polivalentno himerno antitelo može takođe biti proizvedeno, na primer, korišćenjem regiona CH koji oligomerizuje (npr iz IgM H lanca, ili[ i lanca).Tipično, himerno antitelo se odnosi na antitelo u kome je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan sa odgovarajućim sckvcncama u antitclima izvedenim iz određenih vrsta ili pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca (-aca) identičan sa ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz drugih vrsta ili koja pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmenti takvih antitela, sve dok ispoljavaju željenu biološku aktivnost (videti na primer US 4,816,567 i Morrison et al., PNAS USA 81, 6851-6855 (1984)). Himerna antitela se proizvode rekombinantnim postupcima dobro poznatim u tehnici (videti na primer Cabillv et al., PNAS USA 81, 3273-3277 (1984), Morrison et al., PNAS USA 81, 6851-6855 (1984), Boulianne et al, Nature 312, 643-646 (1984), EP125023, Neuberger et al., Nature 314, 268-270 (1985), EP171496, EP173494, WO86/01533, EP184187, Sahagan et al., J. Immunol. 137. 1066-1074 (1986), WO87/02671, Liu et al, PNAS USA 84, 3439-3443 (1987), Sun et al., PNAS USA 84, 214-218 (1987), Better et al., Science 240, 1041-1043 (1988) i Harlow et al, Antibodies:A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,
(1988)).
[0240]Humanizovano antitelo je antitelo koje je izvedeno iz nehumanih vrsta u kojima su određene aminokiseline u okvirnim i konstantnim domenima teških i lakih lanaca mutirane kako bi se izbegao ili ukinuo imuni odgovor kod čoveka. Humanizovani oblici nehumanih (na primjer mišjih) antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz nehumanog imunoglobulina. U najvećem delu, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitela primaoca) u kojima su ostaci iz hipervarijabilnog regiona primaoca zamenjeni ostacima iz hipervarijabilnih regiona nehumanih vrsta (donora antitela) kao što su miš, pacov, zec ili nehumani primat koji ima željene karakteristike vezivanja antigena poput specifičnosti i afiniteta. U nekim slučajevima, ostaci Fv okvirnog regiona (FR) humanog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim nehumanim ostacima. Pored toga, humanizovana antitela mogu da sadrže ostatke koji se ne nalaze u antitelu primaoca ili u antitelu donatora. Ove modifikacije su napravljene da dalje optimizuju performanse antitela. Uopšteno, humanizovano antitelo će suštinski sadržati sve od najmanje jednog, i tipično dva, varijabilna domena, u kojima sve ili suštinski sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onima iz nehumanog imunoglobulina i svi ili suštinski svi regioni FR su oni od sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će opciono takođe sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično od humanog imunoglobulina. Za više detalja, pogledati Joncs ct al., Nature 321, 522-525 (1986), Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988) i Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596 (1992).
[0241]Izrazi "monoklonsko antitelo" ili "kompozicija monoklonskog antitela", kako su ovde korišćeni označavaju preparat molekule antitela odabranog molekularnog sastava. Kompozicija monoklonskog antitela prikazuje jednu specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop. Prema tome, izraz "humano monoklonsko antitelo" se odnosi na antitela koja prikazuju jednu specifičnost vezivanja koja ima varijabilne i konstantne regione poreklom od humane embrionske linije imunoglobulinskih sekvenci. Humana monoklonska antitela mogu biti generisana pomoću hibridoma koji obuhvata B ćelije dobijene iz transgenih ili transhromozomskih nehumanih životinja, kao što je transgeni miš, koji ima genom koji sadrži humani teški lanac transgena i laki lanac transgena, fuzionisane sa besmrtnom ćelijom. Monoklonsko antitelo može biti skraćeno kao mAt.
[0242]Izraz "rekombinantno humano antitelo", kako se ovde koristi, obuhvata sva humana antitela koja su pripremljena, eksprimirana, kreirana ili izolovana pomoću rekombinantnih sredstava, kao što su (a) antitela izolovana iz životinje (kao što je miš) koji je transgeni ili transhromozomalni za humane imunoglobulinske gene ili hibridoma pripremljenog iz nje (opisano dalje na drugom mestu ovde), (b) antitela izolovana iz ćelija domaćina transformisanih da eksprimiraju antitela, kao što je od transfektoma, (c) antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanih antitela, i (d) antitela pripremljena, eksprimirana, kreirana ili izolovana na bilo koji drugi način koja uključuju uplitanje humanih sekvenci imunoglobulinskih gena sa drugim DNK sekvencama. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstantne regione poreklom od humane embrionske linije imunoglobulinskih sekvenci. U nekim realizacijama, međutim, takva rekombinantna humana antitela se mogu podvrgnutiin vitromutagenezi (ili, kada se koristi transgena životinja za humane Ig sekvence,in vivosomatskoj mutagenezi) i stoga aminokiselinske sekvence VHi VLregiona rekombinantnih antitela su sekvence koje, iako izvedene iz i vezane za humane embrionske linije VHi VLsekvenci, ne mogu prirodno da postoje unutar embrionskog repertoara humanog antitelain vivo.
[0243]Kao što se ovde koristi, "heterologno antitelo" je definisano u odnosu na transgeni nehumani organizam koji proizvodi takvo antitelo. Ovaj izraz se odnosi na antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara onoj koja je nađena u organizmu koji se ne sastoji od nehumane životinje, i generalno od drugih vrsta nego od transgene nehumane životinje.
[0244]"Izolovano antitelo" kako se ovde koristi, treba da označi antitelo koje je suštinski oslobođeno od drugih antitela koja imaju različite antigenske specifičnosti (npr izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CD38 je suštinski bez antitela koja specifično vezuju druge antigene od CD38). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop, izoformu ili varijantu humanog CD38 može, međutim, imati unakrsnu reaktivnost sa drugim srodnim antigenima, na primer od drugih vrsta (poput CD38 homolognih vrsta). Staviše, izolovano antitelo može biti suštinski oslobođeno od drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija. U jednoj realizaciji ovog pronalaska, kombinacije "izolovanih" monoklonskih antitela koja imaju različite specifičnosti se kombinuju u dobro definisanoj kompoziciji.
[0245]Kako sc ovde koristi, "specifično vezivanje" sc odnosi na antigen vezujućeg peptida, kao što jc antitelo, vezivanje unapred određenog antigena. Tipično, antigen vezujući peptid, kao što je antitelo, vezuje se sa afinitetom koji odgovara KDod oko IO"<7>M ili manje, kao što je oko IO"<8>M ili manje, kao što je oko 10"<9>M ili manje, oko 10"'<n>M ili manje, ili oko 10"" M ili manje kada se određuje tehnologijom površinske plazmonske rezonance (SPR) instrumentom BIAcore 3000 korišćenjem rekombinantnog CD38 kao liganda i antitela kao analita. Peptid koji vezuje antigen se može vezati za unapred određeni antigen sa afinitetom koji odgovara KDkoji je najmanje deset puta niži, kao što je najmanje 100 puta niži, na primer, najmanje 1000 puta niži, kao što je najmanje 10,000 puta niži, na primer, najmanje 100,000 puta niži od afiniteta za vezivanje nespecifičnog antigena (npr BSA, kazein) drugog od unapred određenog antigena ili usko vezanih antigena. Iznos sa kojim je afinitet niži zavisi od KDantigen vezujućeg peptida, tako da kada je KDantigen vezujućeg peptida vrlo niska (to jest, peptid koji vezuje antigen jc visoko specifičan), tada iznos sa kojim jc afinitet za antigen niži od afiniteta za nespecifični antigen može biti najmanje 10,000 puta. Izrazi "antigen vezujući peptid koji prepoznaje antigen" i "antigen vezujući peptid specifičan za antigen" su ovde korišćeni naizmenično sa izrazom "antigen vezujući peptid koji se specifično vezuje za antigen". Isto tako, izrazi "antitelo koje prepoznaje antigen" i "antitelo specifično za antigen" su ovde korišćeni naizmenično sa izrazom "antitelo koje se specifično vezuje za antigen".
[0246]Izraz "k/ (sec"<1>), kako se ovde koristi, označava konstantu ravnoteže brzine disocijacije određene antitelo-antigen interakcije. Pomenuta vrednost se takođe naziva koff vrednost.
[0247]Izraz "ka" (M"<1>x sek "'), kako se ovde koristi, treba da se odnosi na konstantu ravnoteže brzine asocijacije određene antitelo-antigen interakcije.
[0248]Izraz "KD" (M), kako se ovde koristi, treba da označi konstantu ravnoteže disocijacije određene interakcije antitelo-antigen.
[0249]Izraz "KA" (M"<1>), kako se ovde koristi, treba da se odnosi na konstantu ravnoteže asocijacije određene interakcije antitelo-antigen a dobija se deljenjem kasa kj.
[0250]Kako se ovde koristi, "izotip" se odnosi na klasu antitela (na primer IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ili IgM) koje je kodirano genima konstantnog regiona teškog lanca.
[0251]Kako se ovde koristi, "izotipsko prebacivanje" se odnosi na fenomen kojim se klasa ili izotip, antitela menja iz jedne klase imunoglobulina u jednu od drugih klasa imunoglobulina.
[0252]Kako se ovde koristi, "neprebačeni izotip" se odnosi na isotipsku klasu teškog lanca koji je proizveden kada nema prebacivanja izotipa; CH gen koji kodira neprebačeni izotip je obično prvi CH gen neposredno nishodno od funkcionalno preuređenog VDJ gena. Izotipsko prebacivanje je klasifikovano kao klasično ili neklasično prebacivanje izotipa. Klasično prebacivanje izotipa nastaje rekombinantnim događajima koji uključuju najmanje jedan prebačajni region sekvence u transgen. Neklasično prebacivanje izotipa može doći, na primer, homolognom rekombinacijom između humanog au i humanog £u (S-povezano brisanje). Alternativni neklasični mehanizmi prebacivanja, kao što su intertransgene i/ili interhromozomalne rekombinacije, između ostalog, mogu se desiti i ostvariti prebacivanje izotipa.
[0253]Kako sc ovde koristi, termin "sekvenca prekidač" sc odnosi na one DNK sekvence odgovorne za prekidač rekombinacije. "Prekidač donor" sekvenca, tipično\ iprekidač region, biće 5' (tj, ushodno) od konstrukta regiona koji će biti obrisan tokom prekidač rekombinacije. "Prekidač akceptor" region će biti između konstrukta regiona koji će biti obrisan i konstantnog regiona za zamenu (na primjer, y,<g>, itd). Pošto ne postoji specifično mesto gde se rekombinacija uvek dešava, konačna sekvenca gena tipično nije predvidiva iz konstrukta.
[0254]Kako se ovde koristi, "glikozilacija" se definiše kao uzorak ugljenohidratnih jedinica koje su kovalentno vezane za protein, preciznije za imunoglobulinski (antitelo) protein. Obrazac glikozilacije heterolognog antitela može se okarakterisati kao suštinski sličan obrascu glikozilacije koji se dešava normalno na antitelima proizvedenih od strane vrste nehumane transgene životinje, kada bi onaj ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike prepoznao obrazac glikozilacije heterolognog antitela kao sličniji navedenom obrascu glikozilacije u vrstama nehumanih transgcnih životinja nego za vrste iz koje su dobij eni CH geni transgena.
[0255]Izraz "prirodni" kako se ovde koristi kada se primeni na objekat odnosi se na činjenicu da se objekat može naći u prirodi. Na primer, polipeptid ili polinukleotidna sekvenca koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) koji se mogu izolovati iz izvora u prirodi i koja nije namerno modifikovana od strane čoveka u laboratoriji je prirodna.
[0256]Izraz "preuređen" kako se ovde koristi odnosi se na konfiguraciju teškog lanca ili lakog lanca imunoglobulinskog lokusa gde je V segment odmah pozicioniran susedno prema D-J ili J segmentu u konformaciji koja kodira u suštini potpuni VHili VLdomen, respektivno. Preuređeni imunoglobulinski (antitela) genski lokus se može identifikovati poređenjem sa embrionskom DNK; preuređeni lokus će imati najmanje jedan rekombinovani heptamer/ nonamer homologni element.
[0257]Izraz "ne-preuređen" ili "embrionske konfiguracije" kako se ovde koristi u vezi sa V segmentom odnose se na konfiguraciju gde V segment nije rekombinovan tako da odmah bude susedan prema D ili J segmentu.
[0258]Izraz "molekul nukleinske kiseline", kako se ovde koristi, treba da uključi molekule DNK i RNK molekula. Molekul nukleinske kiseline može biti jednolančani ili dvolančani, ali je poželjna dvolančana DNK. Nukleinske kiseline mogu biti prisutne u celim ćelijama, u ćelijskom lizatu ili u delimično prečišćenom ili suštinski čistom obliku. Nukleinska kiselina je "izolovana" ili "postala suštinski čista" kada se prečišćava od drugih ćelijskih komponenata ili drugih zagađivača, poput drugih ćelijskih nukleinskih kiselina ili proteina, standardnim tehnikama, uključujući alkalni/SDS tretman, CsCI vezivanje, hromatografijom na koloni, agaroza gel elektroforezom i drugim dobro poznatim postupcima u tehnici. Videti, F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biologv, Greene Publishing and Wiley Interscience New York (1987).
[0259]Nukleinska kiselina je "operativno vezana" kada je postavljena u funkcionalnu vezu sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, promoter ili pojačivač je operativno vezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence. U pogledu transkripcije regulatornih sekvenci, operativno vezan znači da su DNK sekvence koje su povezane susedne i, tamo gde je potrebno da se spoje dva proteinska kodirajuća regiona, susedne i u čitajućem okviru. Za prekidač sekvence koje su operativno povezane ukazuje da su sekvence sposobne da utiču na prekidač rekombinacije.
[0260]Kako se ovde koristi, izraz "inhibiraju rast" (na primer, kada se odnosi na ćelije) je namenjen da obuhvati bilo koje merljivo smanjenje rasta ćelija u kontaktu sa CD38BP-om, kao što je anti-CD38 antitelo, u poređenju sa rastom istih ćelija koje nisu u kontaktu sa CD38BP-om, kao što je anti-CD38 antitelo, na primer inhibicija rasta kulture ćelija od najmanje oko 10%, 20%>, 30%, 40%, 50%, 60%>, 70 %, 80%, 90%, 99%, ih 100%.
[0261]Kako se ovde koristi, izrazi "inhibira vezivanje" i "blokira vezivanje" (na primer, kada se odnosi na inhibiciju/blokiranje vezivanja CD38 vezujućeg partnera za CD38) se koriste naizmenično i obuhvataju i delimičnu i potpunu inhibiciju/blokiranje. Inhibicija/blokiranje vezivanja vezujućeg partnera CD38 za CD38 mogu da smanje ili izmene normalan nivo ili vrstu ćelijske signalizacije koja se javlja kada sc vezujući partner CD38 vezuje za CD38 bez inhibicijc ili blokiranja. Inhibicija i blokiranje imaju takođe cilj da uključe svako merljivo smanjenje u afinitetu vezivanja vezujućeg partnera CD38 za CD38 kada je u kontaktu sa CD38BP-om, kao što je anti-CD38 antitelo, u poređenju sa Ugandom koji nije u kontaktu sa CD38BP-om, kao što je anti-CD38 antitelo, na primer blokiranje vezivanja vezujućeg partnera CD38 za CD38 od najmanje oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% , 99%, ili 100%.
[0262] "Ciljna ćelija" označava svaku neželjenu ćeliju kod subjekta (na primer čoveka ili životinje) koja može biti ciljana od strane kompozicije (koja sadrži na primer CD38BP, kao što je humano monoklonsko anti-CD38 antitelo, i/ili bispecifičan ili multispecifičan molekul usmeren protiv CD38) iz predmetnog pronalaska. U nekim realizacijama, ciljna ćelija je ćelija koja eksprimira ili prekomerno eksprimira CD38. Ćelije koje eksprimiraju CD38 obično uključuju hemopoetske ćelije, kao što su medularni timociti, aktivirane T i B ćelije, 80% od NK ćelija u odmoru i monociti, limfoblasti germinalnog centra limfnog čvora, plazma B ćelije i neke intrafolikularne ćelije, dendritske ćelije, normalne ćelije koštane srži, posebne prekursorske ćelije, 50-80% od krvnih ćelija pupčane vrpce, eritrociti i trombociti. CD38 takođe može biti eksprimiran od strane ne-hemopoetskih ćelija, kao što su intra-epitelne ćelije i lamina propria limfocita u crevima, od strane Purkinijevih ćelija i neurofibrilarnih čvorova u mozgu, epitelnih ćelija u prostati, P ćelija u pankreasu, osteoklasta u kostima, retinalnih ćelija u oku, i sarcolemma glatkih i prugastih mišića. Na malignim ćelijama, CD38 je eksprimiran u različitim malignim hematološkim bolestima, uključujući ali nije ograničen na multipli mijelom, primarnu ili sekundarnu leukemiju plazma ćelija, B-ćelijsku hroničnu limfocitnu leukemiju, B-ćelijsku akutnu limfocitnu leukemiju, Valdenstrom makroglobulinemiju, primarnu sistemsku amiloidozu, mantle ćelijski limfom, pro-limfocitnu/mijelocitnu leukemiju, akutnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu mijeloidnu leukemiju, folikularni limfom, NK-ćelijsku leukemiju.
[0263] Tzraz "vektor", kako se ovde koristi, namerava da se odnosi na molekul nukleinske kiseline sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu sa kojom je vezan. Jedan tip vektora je "plazmid" koji se odnosi na kružnu dvolančanu DNK petlju u koju dodatni segmenti DNK mogu biti povezani. Drugi tip vektora je virusni vektor, gde dodatni segmenti DNK mogu biti vezani u virusni genom. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćina u koju su uvedeni (na primer bakterijski vektori koji imaju bakterijsko poreklo replikacije i epizomalni vektori sisara). Drugi vektori (kao što su ne-epizomalni vektori sisara) mogu biti integrisani u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina i tako se repliciraju zajedno sa genomom domaćina. Štaviše, određeni vektori su sposobni da usmeravaju ekspresiju gena za koje su operativno vezani. Takvi vektori su ovde označeni kao "rekombinantni ekspresioni vektori" (ili jednostavno, "ekspresioni vektori"). Uopšteno, ekspresioni vektori koji se koriste u tehnikama rekombinantne DNK su često u formi plazmida. U opisu predmetnog pronalaska, "plazmid" i "vektor" se mogu koristiti naizmenično pošto je plazmid najčešće korišćeni oblik vektora. Međutim, predmetni pronalazak namerava da obuhvati i druge oblike ekspresionih vektora, kao što su virusni vektori (kao što je replikacija nepotpunih retrovirusa, adenovirusa i adeno-povezanih virusa), koji služe ekvivalentnim funkcijama.
[0264]Izraz "rekombinantna ćelija domaćina" (ili jednostavno "ćelija domaćina"), kako sc ovde koristi, treba da se odnosi na ćeliju u koju je uveden rekombinantni ekspresioni vektor. Treba razumeti da se ovakvi izrazi odnose ne samo na pojedine sadržaje ćelije već i na potomstvo takve ćelije. Zbog toga što se određene modifikacije mogu pojaviti u sledećim generacijama ili zbog mutacije ili ekoloških uticaja, takvo potomstvo ne može, u stvari, biti identično roditeljskoj ćeliji, ali je ipak uključeno u okviru pojma "ćelije domaćina" kako se ovde koristi. Rekombinantne ćelije domaćina uključuju, na primer, transfektome, kao što su CHO ćelije, NS/0 ćelije, i limfocitne ćelije.
[0265]Izraz "regulatorna sekvenca" je određen tako da obuhvata promotere, inhensere i druge elemente kontrole ekspresije (npr poliadenilacione signale) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena sa lanca antitela. Ovakve regulatorne sekvence su opisane, na primer, u Goeddel, Gene Expression Technologv. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Biće jasno stručnjacima u tehnici da dizajn ekspresionog vektora, uključujući odabir regulatornih sekvenci može da zavisi od faktora kao što su izbor ćelije domaćina koja treba da se transformiše, željenog nivoa ekspresije proteina, itd. Primeri regulatornih sekvenci za ekspresiju ćelije domaćina sisara uključuju virusne elemente koji upravljaju visokim nivoima proteinske ekspresije u ćelijama sisara, kao što su promoteri i/ili pojačivači izvedeni od citomegalovirusa (CMV), Simian Virusa 40 (SV40), adenovirusa, (npr adenovirusni glavni kasni promoter (AdMLP)) i polioma. Alternativno, nevirusne regulatorne sekvence mogu da se koriste, kao što su promoter ubikvitin iliP-globin promoter.
[0266]Kako se ovde koristi, izraz "subjekat" uključuje bilo čoveka ili ne-humanu životinju. Izraz "ne-humana životinja" obuhvata sve kičmenjake, recimo sisare i ne-sisare, kao što su ne-humani primati, ovca, pas, krava, pilići, vodozemci, gmizavci, itd.
[0267]Različiti oblici izraza "transfekcija" namenjeni su da obuhvate širok spektar tehnika koje se najčešće koriste za uvođenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina, npr elektroporacijom, precipitacijom kalcijum fosfata, DEAE-dekstran transfekcijom, lipofektin transfekcijom i slično.
[0268]Izraz "transfektomi", kako se ovde koristi, obuhvata rekombinantne eukariotske ćelije domaćina koje eksprimiraju antitelo, kao što su CHO ćelije, NS/0 ćelije, HEK293 ćelije, biljne ćelije, ili gljive, uključujući ćelije kvasca.
[0269]Izraz "ne-humana životinja" uključuje sve kičmenjake, na primer, sisare i one koji nisu sisari, kao što su ne-humani primati, ovca, pas, krava, kokoške, vodozemci, gmizavci, itd. Izraz "ne-humana životinja" uključuje sve kičmenjake, na primer, sisare i one koji nisu sisari, kao što su ne-humani primati, ovca, pas, krava, kokoške, vodozemci, gmizavci, itd. Izraz "ne-humana životinja" uključuje sve kičmenjake, na primer, sisare i one koji nisu sisari, kao što su ne-humani primati, ovca, pas, krave, kokoške, vodozemci, gmizavci, itd.
[0270]Izrazi "transgena, ne-humana životinja" se odnose na ne-humanu životinju koja ima genom koji sadrži jedan ili više transgena humanog teškog i/ili lakog lanca ili transhromozome (ili integrisane ili ncintcgrisanc u prirodni genom DNK životinje) i koja jc sposobna da eksprimira potpuno humana antitela. Na primer, transgeni miš može imati humani laki lanac transgena i ili humani teški lanac transgena ili humani teški lanac transhromozoma, tako da miš proizvodi humana anti-CD38 antitela kada je imunizovan sa CD38 antigenom i/ili ćelijama koje eksprimiraju CD38. Transgen humanog teškog lanca može biti integrisan u hromozomalnu DNK miša, kao što je slučaj za transgene miševe, na primer HuMAb miševi, poput HCo7 ili HCol2 miševa, ili transgen humanog teškog lanca se može održavati ekstrahromozomalno, kao što je slučaj za transhromozomalne miševe KM kao što je opisano u WO02/43478. Takvi transgeni i transhromozomalni miševi (kolektivno ovde označeni kao "transgeni miševi") su u stanju da proizvede višestruke izotipove humanih monoklonskih antitela na dati antigen (kao što je IgG, IgA, IgM, IgD i/ili IgE) prolazeći V-D-J rekombinaciju i prebacivanje izotipa. Transgena, nehumana životinja može se koristiti za proizvodnju antitela protiv određenog antigena uvođenjem gena koji kodira takvo specifično antitelo, na primer operativnim vezivanjem gena na gen koji je izražen u mleku životinje.
[0271]Izraz specifičnost se ovde odnosi na sposobnost CD38 vezujućeg peptida, kao što je anti-CD38 antitelo, da prepozna epitop unutar CD38, dok ima samo malu ili nema detektibilnu reaktivnost sa drugim delovima CD38 (uključujući druge epitope koji su vezani drugim CD38BP-ima, kao što su anti-CD38 antitela). Specifičnost može biti relativno određena testovima konkurencije kao što je ovde opisano. Specifičnost se može posebno odrediti bilo kojom tehnikom identifikacije/karakterizacije epitopa koje su ovde opisane ili njihovim ekvivalentima poznatim u tehnici.
[0272]Antitelo specifično za određenu antigensku determinantu ipak može unakrsno da reaguje sa drugim biomolekulima koji mogu biti prisutni u nekom biološkom kontekstu sa CD38. Tipičnije, CD38BP, kao što je anti-CD38 antitelo, može unakrsno da reaguje sa CD38 homolozima iz drugih vrsta. U jednom ili oba konteksta, obično takva unakrsno reaktivna antitela su selektivna za humani CD38 u pogledu relevantne strukture i/ili faktora okoline.
[0273]Izraz selektivnost se ovde koristi za preferencijalna vezivanja CD38BP, kao što je anti-CD38 antitelo, za određeni region, metu, ili peptid; tipično za region ili za epitop CD38, nasuprot jednom ili više drugih bioloških molekula, struktura, ćelija, tkiva, itd. U jednoj realizaciji, CD38BP, kao što je anti-CD38 antitelo, prema predmetnom pronalasku jc selektivno za deo CD38 u kontekstu kanecroznih ćelija debelog creva (tj anti-CD38 antitelo se selektivno vezuje za deo CD38 više od ostalih komponenata kanceroznih ćelija debelog creva).
[0274]CD38BP antitela predmetnog pronalaska se obično koriste u i obezbeđena su u najmanje suštinski izolovanom obliku. Suštinski izolovani molekul je molekul koji je dominantna vrsta u kompoziciji pri čemu se utvrdi u odnosu na klasu molekula kojoj od njih pripada (tj, čini najmanje oko 50% vrste molekula u kompoziciji i tipično čini najmanje oko 70%, najmanje oko 80%>, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili više od vrste molekula, npr peptid, u kompoziciji ( npr kompozicija će ispoljiti najmanje oko 98%, 98% ili 99% homogenosti za CD38BP u kontekstu svih prisutnih peptidnih vrsta)).
[0275]Izolovani molekul sc odnosi na molekul koji nije povezan sa značajnim nivoima (kao što jc više od oko 1%, više od oko 2%, više od oko 3%, ili više od oko 5%) svih nebitnih i nepoželjnih fizioloških faktora, poput ne-CD38 vezujućih biomolekula (ili CD38 vezujući molekuli koji mogu ometati vezivanja i/ili aktivnost CD38BP antitela iz predmetnog pronalaska) sadržanih unutar ćelije ili životinje u kojoj se proizvodi CD38BP. Izolovani molekul se takođe odnosi na bilo koji molekul koji je prošao kroz takvu fazu prečišćavanja zbog ljudske intervencije (bilo automatsko, manuelno ili oba načina). U mnogim različitim kompozicijama koje su obezbeđene predmetnim pronalaskom, kao u kompoziciji koja sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, CD38BP može biti prisutan u relativno malim količinama u smislu broja ukupnih molekulskih vrsta u preparatu (na primer u slučaju kompozicije koja sadrži veliku količinu farmaceutski prihvatljivog nosača, stabilizatora, i /ili konzervansa). U nekim slučajevima dodatni peptidi, kao što je BSA, mogu biti uključeni u takvu kompoziciju sa prethodno prečišćenim CD38BP. Međutim, pod uslovom da su takvi dodatni sastojci kompozicije prihvatljivi za predviđenu primenu CD38BP, takva kompozicija se još uvek može opisati kao ona koja sadrži izolovani CD38BP.
[0276]Antitela CD38BPs iz predmetnog pronalaska su obično suštinski slobodna od drugih CD38BPs, poput CD38BPs koji imaju različite antigenske specifičnosti. Međutim, ovaj pronalazak takođe obezbeđuju preparat koji sadrži niz CD38BP antitela sa različitim specifičnostima i karakteristikama (npr predmetni pronalazak obezbeđuje "koktel" od CD38BPs koji imaju različitu specifičnost i /ili selektivne karakteristike).
[0277]"Lečenje" podrazumeva primenu efikasne količine terapeutski aktivnog jedinjenja iz predmetnog pronalaska sa ciljem ublažavanja, poboljšanja ili uklanjanja (lečenja) simptoma ili stanja bolesti.
[0278]U jednoj realizaciji, sadašnji pronalazak obezbeđuje jedan CD38BP koji sadrži VLregion koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 2.
[0279]U jednoj realizaciji, ovde je obezbeđen jedan CD38BP koji sadrži VHregion koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 6.
[0280]U jednoj realizaciji, ovde je obezbeđen jedan CD38BP koji sadrži VLregion koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 2 i VH region koji se u osnovi sastoji od sekvence SEK ID Br: 6.
[0281]U jednoj realizaciji, ovde jc obezbeđen jedan CD38BP koji sadrži VLCDR1 koji sc suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 3.
[0282]U jednoj realizaciji, ovde je obezbeđen jedan CD38BP koji sadrži VLCDR2 koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 4.
[0283]U jednoj realizaciji, ovde je obezbeđen jedan CD38BP koji sadrži VLCDR3 koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 5.
[0284]U jednoj realizaciji, ovde je obezbeđen jedan CD38BP koji sadrži VHCDR1 koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 8.
[0285]U jednoj realizaciji, ovde je obezbeđen jedan CD38BP koji sadrži VHCDR2 koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 9.
[0286]U jednoj realizaciji, ovde jc obezbeđen jedan CD38BP koji sadrži VHCDR3 koji sc suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 10.
[0287]U jednoj realizaciji, ovde je obezbeđen jedan CD38BP koji sadrži VLCDRs (VLCDR1, CDR2 i CDR3) koji se suštinski sastoje od SEK ID Br: 3, SEK ID Br: 4 i SEK ID Br: 5, respektivno.
[0288]U jednoj realizaciji, ovde je obezbeđen jedan CD38BP koji sadrži VHCDRs (VHCDR1, CDR2 i CDR3) koji se suštinski sastoje od SEK ID Br: 8, SEK ID Br: 9 i SEK ID Br: 10, respektivno.
[0289]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen jedan CD38BP koji sadrži
(a) tri VLCDR segmenta, koja se nezavisno suštinski sastoje od SEK ID Br: 3, SEK ID
broj: 4 i SEK ID Br: 5 u neposrednoj blizini jedan prema drugom (npr, u blizini razmaka VLCDR segmenata u anti-CD38 antitelu divljeg tipa) u CD38BP-Ui
(b) tri VHCDR segmenata koja se nezavisno suštinski sastoje od SEK ID Br: 8, SEK
ID broj: 9 i SEK ID Br: 10 u neposrednoj blizini jedan prema drugom (npr, u blizini
razmaka VHCDR segmenata u anti-CD38 antitelu divljeg tipa) u CD38BP-U.
[0290]U daljem ostvarenju, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži fleksibilan linker koji se nalazi izmedju VLregiona i VHregiona CD38BP. Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje CD38BP, gde su regioni VLi VHpredstavljeni na odvojenim lancima u kontekstu imunoglobulin - strukog proteina i orijentisani tako da se VLCDR1, CDR2, CDR3 i VHCDR1, CDR2 i CDR3 kooperativno udružuju da doprinese u selektivnom i/ili specifičnom vezivanju antigenske determinante na CD38. Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje CD38BP koji sadrži dva seta varijabilnih domena (kompleta od udruženih VLi VHdomena na pridruženim odvojenim lancima), tako da CD38BP sadrži dva identična mesta za vezivanje antigenske determinante.
[0291]Za svaki od takvih CD38BPs opisanih u ovom paragrafu očekuje se, da bar delimično, imaju sličnu specifičnost za epitop, selektivnost, i druga svojstva kao i antitelo koje ima VLregion koji se sastoji od sekvence SEK ID Br: 2 i VHregion koji se sastoji od sekvence SEK ID Br: 7, i shodno tome, mogu biti korisni u lečenju multiplog mijeloma.
[0292]Ujednoj realizaciji, ovde jc obezbeđen CD38BP koji sadrži VLregion koji sc suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 12.
[0293]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VHregion koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 17.
[0294]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VLregion koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 12 i VH region koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 17.
[0295]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VLCDR1 koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 13.
[0296]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VLCDR2 koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 14.
[0297]Ujednoj realizaciji, ovde jc obezbeđen CD38BP koji sadrži VLCDR3 koji sc suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 15.
[0298]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VHCDR1 koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 18.
[0299]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VHCDR2 koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 19.
[0300]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VHCDR3 koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 20.
[0301]U jednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VLCDR segmente (VLCDR1, CDR2 i CDR3) koji se suštinski sastoje od SEK ID Br: 13, SEK ID Br: 14 i SEK ID Br: 15, respektivno.
[0302]U jednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VHCDR segmente (VHCDR1, CDR2 i CDR3) koji se suštinski sastoje od SEK ID Br: 18, SEK ID Br: 19 i SEK ID Br: 20, respektivno.
[0303]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži (a) tri VLCDR segmenta, koja se nezavisno suštinski sastoje od SEK ID Br: 13, SEK ID Br: 14 i SEK ID Br: 15 u neposrednoj blizini jedan prema drugom (npr, u blizini razmaka VLCDR segmenata u anti-CD38 antitelu divljeg tipa) u CD38BP i (b) tri VHCDR segmenta koja se nezavisno suštinski sastoje od SEK ID Br: 18, SEK ID Br: 19 i SEK ID Br: 20 u neposrednoj blizini jedan prema drugom (npr, u blizini razmaka VHCDR segmenata u anti-CD38 antitelu divljeg tipa) u CD38BP.
CD38BP antitela iz pronalaska mogu da sadrže fleksibilan linker koji se nalazi
izmedju VLregiona i VHregiona CD38BP. VLi VHregioni mogu biti predstavljeni na odvojenim lancima u kontekstu proteina imunoglobulin -strukog i orijentisani tako da se VLCDR1, CDR2, CDR3 i VHCDR1, CDR2 i CDR3 kooperativno udružuju da doprinesu u selektivnom i/ili specifičnom vezivanju antigenske determinante na CD38. CD38BP može da sadrži dva seta varijabilnih domena (kompleta udruženih VLi VHdomena na pridruženim odvojenim lancima), tako da CD38BP sadrži dva identična mesta za vezivanje antigenske determinante.
[0304]Za svaki od takvih CD38BPs opisanih u ovom paragrafu se očekuje, da bar delimično, imaju sličnu specifičnost za epitop, selektivnost, i druga svojstva kao antitelo koje ima VLregion koji sadrži sekvencu SEK ID Br: 12 i VHregion koji sadrži sekvencu SEK ID Br: 17, i, shodno tome, mogu biti korisni u lečenju multiplog mijeloma.
[0305]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VLregion koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 22.
[0306]U jednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VHregion koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 27.
[0307]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VLregion koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 22 i VHregion koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 27.
[0308]Ujednoj realizaciji, ovde jc obezbeđen CD38BP koji sadrži VLCDR1 koji sc suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 23.
[0309]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VLCDR2 koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 24.
[0310]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VLCDR3 koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 25.
[0311]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VHCDR1 koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 28.
[0312]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VHCDR2 koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 29.
[0313]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VHCDR3 koji se suštinski sastoji od sekvence SEK ID Br: 30.
[0314]U jednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VLCDRs (VLCDR1, CDR2 i CDR3) koji se suštinski sastoje od SEK ID Br: 23, SEK ID Br: 24 i SEK ID Br: 25, respektivno.
[0315]U jednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VHCDRs (VHCDR1, CDR2 i CDR3) koji se suštinski sastoje od SEK ID Br: 28, SEK ID Br: 29 i SEK ID Br: 30, respektivno.
[0316]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži
(a) tri VLCDR segmenta, koja se nezavisno suštinski sastoje od SEK ID Br: 23,
SEK ID Br: 24 i SEK ID Br: 25 u neposrednoj blizini jedan prema drugom (npr, u blizini
razmaka Vt, CDR segmenata u anti-CD38 antitelu divljeg tipa) u CD38BP i (b) tri VHCDR segmenta koja se nezavisno suštinski sastoje od SEK ID Br: 28,
SEK ID Br: 29 i SEK ID Br: 30 u neposrednoj blizini jedan prema drugom (npr, u blizini
razmaka VHCDR segmenata u anti-CD38 antitelu divljeg tipa) u CD38BP.
[0317]U daljoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži fleksibilni linker koji se nalazi izmedju VLregiona i VHregiona CD38BP. Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje CD38BP, gde su regioni VLi VHpredstavljeni na odvojenim lancima u kontekstu imunoglobulin - strukog proteina i orijentisani tako da se VLCDR1, CDR2, CDR3 i VHCDR1, CDR2 i CDR3 kooperativno udružuju da doprinesu u selektivnom i/ili specifičnom vezivanju antigenske determinante na CD38. Prema sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje CD38BP koji sadrži dva seta varijabilnih domena (kompleta udruženih VLi VHdomena na pridruženim odvojenim lancima), tako da CD38BP sadrži dva identična mesta za vezivanje antigenske determinante.
[0318]Za svaki od takvih CD38BP-a opisanih u ovom paragrafu očekuje se, da bar delimično, imaju slične specifičnosti epitopa, selektivnost, i druga svojstva kao antitelo koje ima VLregion koji sadrži sekvencu SEK ID Br: 22 i VHregion koji sadrži sekvencu SEK ID Br: 27, i, shodno tome, mogu biti korisni u lečenju multiplog mijeloma.
[0319]Ujednoj realizaciji, ovde jc obezbeđen CD38BP koji sadrži VLCDR1 koji sc suštinski sastoji od sekvence u skladu sa SEK ID Br: 3 ili SEK ID Br: 13 ili SEK ID Br: 23, pri čemu nedostaju N-terminalni ostatak i/ili jedan, dva ili tri C-terminalna aminokiselinska ostatka.
[0320]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VLCDR2 koji se suštinski sastoji od sekvence u skladu sa SEK ID Br: 4 ili SEK ID Br: 14 ili SEK ID Br: 24, pri čemu nedostaju jedan ili dva N-terminalna ostatka i/ili jedan, dva ili tri C-terminalna ostatka.
[0321]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VLCDR3 koji se suštinski sastoji od sekvence u skladu sa SEK ID Br: 5 ili SEK ID Br: 15 ili SEK ID Br: 25, pri čemu nedostaju N-terminalni ostatak i / ili jedan, dva, tri, ili četiri C-terminalna ostatka.
[0322]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VHCDR1 koji se suštinski sastoji od sekvence u skladu sa SEK ID Br: 8, ili SEK ID Br: 18 ili SEK ID Br: 28, pri čemu nedostaju jedan, dva, tri, ili četiri N-terminalna ostatka i/ ili jedan, dva, tri, ili četiri C-terminalna ostatka.
[0323]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VHCDR2 koji se suštinski sastoji od sekvence u skladu sa SEK ID Br: 9 ili SEK ID Br: 19 ili SEK ID Br: 29, pri čemu nedostaju jedan, dva, tri, četiri, ili pet od njihovih N-terminalnih aminokiselina i/ili jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest od njihovih C-terminalnih aminokiselina.
[0324]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži VHCDR3 koji se suštinski sastoji od sekvence u skladu sa SEK ID Br: 10 ili SEK ID Br: 20 ili SEK ID Br: 30, pri čemu nedostaju N-terminalna jedan, dva ili tri aminokiselinska ostatka i/ili C-terminalna jedan, dva, tri, ili četiri aminokiselinska ostatka.
[0325]Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje CD38BPs gde su ove "skraćene" CDR sekvence kombinovane jedna sa drugom i/ili sa drugim CDR sekvencama ovde opisanim.
[0326]Ujednoj realizaciji, ovaj pronalazak obezbeđuje CD38BP koji sadrži (a) tri VLCDR segmenta, koja se nezavisno suštinski sastoje od SEK ID Br: 3, SEK ID Br: 4 i SEK ID Br: 5 u neposrednoj blizini jedan prema drugom u CD38BP (npr, u blizini razmaka VLCDR segmenata u anti-CD38 antitelu divljeg tipa) i (b) tri VHCDR segmenta koja sc nezavisno suštinski sastoje od SEK ID Br: 8, SEK ID Br: 9 i SEK ID Br: 10 u neposrednoj blizini jedan prema drugom (npr, u blizini razmaka VHCDR segmenata u anti-CD38 antitelu divljeg tipa) u CD38BP.
[0327]U daljoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži fleksibilan linker koji se nalazi izmedju VLregiona i VHregiona CD38BP-a.
[0328]U daljoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP gde su regioni VLi VHpredstavljeni na odvojenim lancima u kontekstu imunoglobulin -strukog proteina i orijentisani tako da se VLCDR1,
CDR2, CDR3 i VHCDR1, CDR2 i CDR3 kooperativno udružuju da doprinesu u selektivnom i/ili specifičnom vezivanju antigenske determinante na CD38. U daljem
ostvarenju, ovaj pronalazak obezbeđuje CD38BP koji sadrži dva seta varijabilnih domena (kompleta udruženih VLi VHdomena na pridruženim odvojenim lancima), tako da CD38BP sadrži dva identična mesta za vezivanje antigenske determinante. Za svakog od takvih
CD38BPs opisanih u ovom paragrafu očekuje se, da bar delimično, imaju slične specifičnosti za epitop, selektivnost, i druga svojstva sa antitelom koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 2 i VHsekvencu SEK ID Br: 7 .
[0329]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži (a) tri VLCDR segmenta koja se nezavisno suštinski sastoje od SEK ID Br: 13, SEK ID BR: 14 i SEK ID Br: 15 u neposrednoj blizini jedan prema drugom u CD38BP ( npr, u blizini razmaka VLCDR segmenata u anti-CD38 antitelu divljeg tipa) i (b) tri VHCDR segmenta koja se nezavisno suštinski sastoje od SEK ID Br: 18, SEK ID Br: 19 i SEK ID Br: 20 u neposrednoj blizini jedan prema drugom (npr, u blizini razmaka VHCDR segmenata u anti-CD38 antitelu divljeg tipa) u CD38BP.
[0330]U daljoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži fleksibilni linker koji se nalazi izmedju VLregiona i VHregiona CD38BP.
[0331]U daljoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP pri čemu su regioni VLi VHpredstavljeni na odvojenim lancima u kontekstu imunoglobulin -strukog proteina i orijentisani tako da se VLCDR1, CDR2, CDR3 i VHCDR1, CDR2 i CDR3 kooperativno udružuju da doprinesu u selektivnom i/ili specifičnom vezivanju antigenske determinante na CD38. U daljem ostvarenju, ovaj pronalazak obezbeđuje CD38BP koji sadrži dva seta varijabilnih domena (kompleta udruženih VLi VHdomena na udruženim odvojenim lancima), tako da CD38BP sadrži dva identična mesta za vezivanje antigenske determinante. Za svaki od takvih CD38BPs opisanih u ovom paragrafu očekuje se, da bar delimično, imaju slične specifičnosti epitopa, selektivnost, i druga svojstva sa antitelom koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 12 i VHsekvencu SEK ID Br: 17 .
[0332]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži
(a) tri VLCDR segmenta, koja se nezavisno suštinski sastoje od SEK ID Br: 23,
SEK ID Br: 24 i SEK ID Br: 25 u neposrednoj blizini jedan prema drugom u CD38BP
(npr, u blizini razmaka VLCDR segmenata u anti-CD38 antitelu divljeg tipa) i (b) tri VHCDR segmenta koja se nezavisno suštinski sastoje od SEK ID Br: 28,
SEK ID Br: 29 i SEK ID Br: 30 u neposrednoj blizini jedan prema drugom (npr, u blizini
razmaka VHCDR segmenata u anti-CD38 antitelu divljeg tipa) u CD38BP.
[0333]U daljem ostvarenju, ovaj pronalazak obezbeđuje CD38BP koji sadrži fleksibilan
linker koji se nalazi izmedju VLregiona i VHregiona CD38BP.
[0334] U daljoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP gde su regioni VLi VHpredstavljeni na odvojenim lancima u kontekstu imunoglobulin -strukog proteina i orijentisani tako da sc VLCDR1, CDR2, CDR3 i VHCDR1, CDR2 i CDR3 kooperativno udružuju da doprinesu selektivnom i/ili specifičnom vezivanju antigenske determinante na CD38. U daljem ostvarenju, ovaj pronalazak obezbeđuje CD38BP koji sadrži dva seta varijabilnih domena (kompleta udruženih VLi VHdomena na pridruženim odvojenim lancima), tako da CD38BP sadrži dva identična mesta za vezivanje antigenske determinante. Za svakog od takvih CD38BPs opisanih u ovom paragrafu očekuje se, da bar delimično, imaju slične specifičnosti epitopa, selektivnost, i druga svojstva sa antitelom koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 22 i VHsekvencu SEK ID Br: 27 .
[0335] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje CD38BPs koji sadrže funkcionalne varijante VLregiona, VHregiona, ili jedan ili više CDR segmenata antitela iz primera. Funkcionalna varijanta VL, VH, ili CDR se koristi u kontekstu CD38BP koja još uvek dozvoljava CD38BP da zadrži najmanje značajan procenat (najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili više) afiniteta/aviditeta i/ili specifičnosti/selektivnosti roditeljskog antitela i u nekim slučajevima takav CD38BP može biti povezan sa većim afinitetom, selektivnošću i/ili specifičnošću nego roditeljsko antitelo.
[0336] U jednoj realizaciji, ovaj pronalazak obezbeđuje CD38BP koji sadrži varijantu VLkoji se suštinski sastoji od sekvence koja ima najmanje oko 50%, kao što je najmanje 60%, na primer, najmanje oko 70%o, kao što je najmanje oko 75%o, na primer najmanje oko 80%, kao što je najmanje oko 85%>, na primer, najmanje oko 90%, kao što je najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom prema SEK ID Br: 2 ili SEK ID Br: 12 ili SEK ID Br: 22, pri čemu CD38BP ima najmanje značajan procenat od (najmanje oko 50%>, 60%>, 70%, 80%>, 90%, 95%> ili više) vezujućih karakteristika za epitop sa antitelom koje ima varijantu Vi. sekvence od SEK ID Br: 2 ili SEK ID Br: 12 ili SEK ID Br: 22, respektivno, kao što je antitelo koje ima VLsekvencu od SEK ID Br: 2 i VHsekvencu od SEK ID Br: 7 i antitelo koje ima VLsekvencu od SEK TD Br: 12 i VHsekvencu od SEK TD Br: 17, i antitelo koje ima VLsekvencu od SEK TD Br: 22 i VHsekvencu od SEK TD Br: 27, respektivno.
[0337] Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži varijantu VLCDR1 koji se
suštinski sastoji od sekvence sa najmanje oko 50%>, kao što je najmanje 60%, na primer najmanje oko 70%, kao što je najmanje oko 75%, na primer najmanje oko 80%, kao što je najmanje oko 85%, na primer, najmanje oko 90%, kao što jc najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom koja je u skladu sa bilo kojom od SEK ID Br: 3 ili
SEK ID Br: 13 ili SEK ID Br: 23, pri čemu CD38BP ima najmanje značajan procenat (najmanje oko 50%, 60%, 70%), 80%, 90%), 95% ili više) vezujućih karakteristika za epitop sa antitelom koje ima varijantu VLCDR1 od sekvence SEK ID Br: 3 ili SEK ID Br: 13 ili SEK ID Br: 23, respektivno, kao što je antitelo koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 2 ili SEK ID Br: 12 ili SEK ID Br: 22, respektivno, kao što je antitelo koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 2 i VHsekvencu SEK ID Br: 7, ili antitelo koji ima VLsekvencu SEK ID Br: 12 i VHsekvencu SEK ID Br: 17, ili antitelo koji ima VLsekvencu SEK ID Br: 22 i VHsekvencu SEK ID Br: 27, respektivno.
[0338]Ujednoj realizaciji, ovaj pronalazak obezbeđuje CD38BP koji sadrži varijantu VLCDR2 koji se suštinski sastoji od sekvence koja ima najmanje oko 50%, kao što je najmanje 60%, na primer najmanje oko 70%), kao što jc najmanje oko 75%>, na primer najmanje oko 80%, kao što jc najmanje oko 85%), na primer najmanje oko 90%, kao što je najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom prema bilo kojoj od SEK ID Br-a: 4 ili 14 , pri čemu CD38BP ima najmanje značajan procenat (najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80%>, 90%, 95% ili više) vezujućih karakteristika za epitop sa antitelom koje ima varijantu VLCDR2 sekvence od SEK ID Br: 4 ili SEK ID Br: 14 ili SEK ID Br: 24, respektivno, kao što je antitelo koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 2 ili SEK ID Br: 12 ili SEK ID Br: 22, respektivno, kao što je antitelo koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 2 i VHsekvencu SEK ID Br: 7, ili antitelo koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 12 i VHsekvencu SEK ID Br: 17, ili antitelo koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 22 i VHsekvencu SEK ID Br: 27, respektivno.
[0339]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži varijantu VLCDR3 koji se suštinski sastoji od sekvence koja ima najmanje oko 50%, kao što je najmanje 60%, na primer najmanje oko 70%, kao što je najmanje oko 75%, na primer najmanje oko 80%, kao što je najmanje oko 85%, na primer najmanje oko 90%, kao što je najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom prema bilo kojoj od SEK ID Br: 5 ili SEK ID Br: 15 ili SEK ID Br: 25, pri čemu CD38BP ima najmanje značajan procenat (najmanje oko 50%>, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili više) vezujućih karakteristika za epitop sa antitelom koje ima varijantu VLCDR3 sekvence od SEK ID Br: 5 ili SEK ID Br: 15 ili SEK ID Br: 25, respektivno, kao što je antitelo koji ima VLsekvencu SEK ID Br: 2 ili SEK ID Br: 12 ili SEK ID Br: 22, respektivno, kao što je antitelo koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 2 i VHsekvencu SEK ID Br: 7, ili antitelo koji ima VLsekvencu SEK ID Br: 12 i VHsekvencu SEK ID Br: 17, ili antitelo koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 22 i VHsekvencu SEK ID Br: 27, respektivno.
[0340]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži varijantu VHkoji se suštinski sastoji od sekvence koja ima najmanje oko 50%, kao što je najmanje 60%, na primer
najmanje oko 70%, kao što je najmanje oko 75%, na primer najmanje oko 80%, kao što je najmanje oko 85%, na primer najmanje oko 90%, kao što je najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom prema bilo kojoj od SEK ID Br: 7 ili SEK ID Br: 17 ili SEK ID Br: 27, pri čemu CD38BP ima najmanje značajan procenat (najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili više) vezujućih karakteristika za epitop sa antitelom koje ima varijantu VHsekvence SEK ID Br: 7 ili SEK ID Br: 17 ili SEK ID Br: 27, respektivno, kao što jc antitelo koje ima VHsekvencu SEK ID Br: 7 i VLsekvencu SEK ID Br: 2, ili antitelo koje ima Vh sekvencu SEK ID Br: 17 i Vl sekvencu SEK ID Br: 12, ili antitelo koje ima Vh sekvencu SEK ID Br: 27 i VLsekvencu SEK ID Br: 22, respektivno.
[0341]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži varijantu VHCDR1 koji se suštinski sastoji od sekvence koja ima najmanje oko 50%, kao što je najmanje 60%, na primer najmanje oko 70%, kao što je najmanje oko 75%, na primer najmanje oko 80%, kao što je najmanje oko 85%, na primer najmanje oko 90%, kao što je najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom prema bilo kojoj od SEK ID Br: 8, ili SEK ID Br: 18 ili SEK ID Br: 28, pri čemu CD38BP ima najmanje značajan procenat (najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili više) vezujućih karakteristika za epitop sa antitelom koje ima varijantu VHCDR1 sekvence od SEK ID Br: 8, ili SEK ID Br: 18 ili SEK ID Br: 28, respektivno, kao što je antitelo koje ima VHsekvencu SEK ID Br: 7 ili SEK ID Br: 17 ili SEK ID Br: 27, respektivno, kao što jc antitelo koje ima VHsekvencu SEK ID Br: 7 i VLsekvencu SEK ID Br: 2, ili antitelo koje ima VHsekvencu SEK ID Br: 17 i VLsekvencu SEK ID Br: 12, ili antitelo koje ima VHsekvencu SEK ID Br: 27 i VLsekvencu SEK ID Br: 22, respektivno.
[0342]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži varijantu VHCDR2 koji se suštinski sastoji od sekvence koja ima najmanje oko 50%, kao što je najmanje 60%, na primer najmanje oko 70%, kao što je najmanje oko 75%, na primer najmanje oko 80%, kao što je najmanje oko 85%, na primer najmanje oko 90%, kao što je najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom prema bilo kojoj od SEK ID Br: 9 ili SEK ID Br: 19 ili SEK ID Br: 29, pri čemu CD38BP ima najmanje značajan procenat (najmanje oko 50%>, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili više) vezujućih karakteristika za epitop sa antitelom koje ima varijantu VHCDR2 sekvence od SEK ID Br: 9 ili SEK ID Br: 19 ili SEK ID Br: 29, respektivno, kao što je antitelo koje ima VHsekvencu SEK ID Br: 7 ili SEK ID Br: 17 ili SEK ID Br: 27, respektivno, kao što je antitelo koje ima VHsekvencu SEK ID Br: 7 i VLsekvencu SEK ID Br: 2, ili antitelo koje ima VHsekvencu SEK ID Br: 17 i VLsekvencu SEK ID Br: 12, ili antitelo koje ima VHsekvencu SEK ID Br: 27 i VLsekvencu SEK ID Br: 22, respektivno.
[0343]Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP koji sadrži varijantu VHCDR3 koji se suštinski sastoji od sekvence koja ima najmanje oko 50%, kao što je najmanje 60%, na primer najmanje oko 70%, kao što je najmanje oko 75%, na primer najmanje oko 80%, kao što je najmanje oko 85%, na primer, najmanje oko 90%, kao što je najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom prema bilo kojoj od SEK ID Br: 10 ili SEK ID Br: 20 ili SEK ID Br: 30, pri čemu CD38BP ima najmanje značajan procenat (najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili više) od vezujućih karakteristika za epitop sa antitelom koje ima varijantu VHCDR3 sekvence SEK ID Br: 10 ili SEK ID Br: 20 ili SEK ID Br: 30, respektivno, kao što je antitelo koje ima VHsekvencu SEK ID Br: 7 ili SEK ID Br: 17 ili SEK ID Br: 27, respektivno, kao što je antitelo koje ima VHsekvencu SEK TD Br: 7 i VLsekvencu SEK TD Br: 2, ili antitelo koje ima VHsekvencu SEK ID Br: 17 i VLsekvencu SEK TD Br: 12, ili antitelo koje ima VHsekvencu SEK ID Br: 27 i VL sekvencu SEK ID Br: 22, respektivno.
[0344]Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje dele sekvence (tj % homologije = # identičnih položaja / ukupan # položaja x 100), uzimajući u obzir broj razmaka i dužinu svakog razmaka, koju treba uvesti za optimalno poravnavanje dve sekvence. Porcđcnjc sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može se postići korišćenjem matematičkog algoritma, kao što je opisano ispod u primerima koji nisu ograničavajući.
[0345]Procenat identičnosti između dve nukleotidne sekvence može se odrediti korišćenjem programa GAP u GCG softverskom paketu (dostupnom na http://www.gcg.com), koristeći NWSgapdna. CMP matrica i težine razmaka od 40, 50, 60, 70, ili 80 i težine dužine 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. Procenat identičnosti između dve nukleotidne ili aminokiselinske sekvence se može takođe odrediti korišćenjem algoritma prema E. Mevers i W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988)) koji je ugrađen u ALIGN program (verzija 2.0), koristeći PAM120 tabelu težine ostatka, kaznu od 12 za dužinu praznina i kaznu od 4 za praznine. Pored toga, procenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence može se odrediti korišćenjem Needleman i Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970)) algoritma koji je inkorporiran u GAP program GCG softverskog paketa (dostupan na http://www.gcg.com), koristeći ili Blossum 62 matricu ili matricu PAM250, praznine težina 16, 14, 12, 10, 8, 6 ili 4 i dužine težina 1, 2, 3, 4, 5 ili 6.
[0346]Sekvence nukleinskih kiselina i proteina iz ovog pronalaska mogu dalje da se koriste kao " upitne sekvence " da bi se izvršila pretraga prema javnoj bazi podataka, na primer, identifikacija srodnih sekvenci. Takve pretrage mogu biti izvedene korišćenjem NBLAST i XBLAST programa (verzija 2.0) prema Altschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-10 (1990). BLAST pretraživanja nukleotida se mogu obaviti sa programom NBLAST, rezultat = 100, dužina reči = 12 za dobijanje nukleotidne sekvence homologne sa molekulima nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku. BLAST pretraživanje proteina se može obaviti sa programom XBLAST, rezultat = 50, dužina reči = 3 za dobijanje aminokiselinske sekvence, homologne sa molekulima proteina prema predmetnom pronalasku. Da se dobiju poravnanja prekida u svrhu poređenja, Gapped BLAST može da se koristi kako je opisano prema Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17), 3389-3402 (1997). Kada se koriste BLAST i Gapped BLAST programi, mogu se koristiti standardni parametri odgovarajućih programa (npr XBLAST i NBLAST). Pogledati http://ww.ncbi.nlm.nih.gov.
[0347]Sekvenca CDR varijanti se može razlikovati od sekvence CDR od sekvenci roditeljskog antitela kroz pretežno konzervativne supstitucije; na primer najmanje oko 35%, oko 50% ili više, oko 60%> ili više, oko 70% ili više, oko 75% ili više, oko 80% ili više, oko 85% ili više, oko 90% ili više, oko 95%> ili više (npr oko 65-99%) od supstitucija u varijanti su konzervativne zamene aminokiselinskog ostatka. U kontekstu sadašnjeg pronalaska, konzervativne supstitucije mogu biti definisane supstitucijama unutar klasa aminokiselina koje se ogledaju ujednoj ili više od sledećih tri tabela:
[0348]Više konzervativnih supstitucionih grupacija uključuju: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, i asparagin-glutamin. Dodatne grupe amino kiselina se takođe mogu formulisati korišćenjem principa opisanih u, npr, Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties (2d Ed.1993), W.H. Freeman and Companv.
[0349]U jednoj realizaciji, konzervacija u smislu hidropatskih/hidrofilnih svojstava i težine ostatka/veličine je takođe suštinski zadržana u varijanti CDR u poređenju sa CDR antitela iz primera (npr težinska klasa, hidropatski rezultat, ili obe sekvence su najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95% ili više (npr oko 65-99%) zadržane). Na primer, konzervativne supstitucije ostataka mogu takođe, ili alternativno biti zasnovane na zameni jako ili slabo baziranih težinski baziranih konzervacionih grupa, koje su poznate u tehnici.[0350]Zadržavanja sličnih ostataka mogu takođe ili alternativno biti izmerena pomoću sličnosti rezultata, kao što je određeno korišćenjem BLAST programa (npr BLAST 2.2.8 dostupan preko NCBI). Pogodne varijante tipično ispoljavaju najmanje oko 45%, kao što jc najmanje oko 55%, najmanje oko 65%, najmanje oko 75%, najmanje oko 85%>, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili više (np, oko 70-99%) sličnosti sa roditeljskim peptidom.
[0351]Značajne promene u funkciji mogu biti izvršene izborom supstitucija koje su manje konzervativne od onih koje su prikazane u definisanim grupama, gore. Na primer, ne-konzervativne supstitucije mogu biti izvršene, a koje mnogo značajnije utiču na strukturu peptida u oblasti promene, na primer, alfa-heliksna ili beta-sheet struktura; naelektrisanje ili hidrofobnost molekula na ciljnom mestu; ili bočnog lanca. Supstitucije za koje se generalno očekuje da proizvedu najveće promene u svojstvima peptida su one gde se 1) hidrofilni ostatak, npr seril ili treonil, zamenjuje za (od strane) hidrofobni(og) ostatak(a), npr leucil, izoleucil, fenilalanil, valil ili alanil; 2) cistein ili prolin je supstituisan od strane bilo kog drugog ostatka; 3) ostatak koji ima elektropozitivni bočni lanac, npr lizil, arginil ili histidil, je supstituisan sa (od strane) elektronegativnim(og) ostatkom (a), npr, glutamil ili aspartil; ili 4) ostatak koji ima glomazan bočni lanac, npr fenilalanin, se zamenjuje (od strane) ostatkom(a) koji nema bočni lanac, npr glicin. Prema tome, ove i druge nekonzervativne supstitucije mogu se uvesti u peptidne varijante gde se traže značajne promene u funkciji/strukturi i takve promene se izbegavaju tamo gde je poželjno očuvanje strukture/funkcije.
[0352]Pogodan način za generisanje supstitucionih varijanti je sazrevanje afiniteta korišćenjem bakteriofaga uz korišćenje postupaka poznatih u tehnici. Kako bi se identifikovao kandidat za mesto hipervarijabilnog regiona za modifikaciju, alanin skenirajuće mutageneze mogu se obavljati da bi se identifikovali hipervarijabilni regioni ostataka koji značajno doprinose vezivanju antigena. Alternativno ili dodatno, može biti korisno da se analizira kristalna struktura kompleksa antigen-antitelo da bi se identifikovale kontaktne tačke između antitela i antigena. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci su verovatno pogodni kandidati za supstituciju.
[0353]Gde su hipervarijabilna regionska ubacivanja izvršena da generišu varijantu antitela, tipičan opseg dužine hipervarijabilnog regiona u pitanju u poznatim antitelima se treba uzeti u obzir. Na primer, za prvi hipervarijabilni region varijabilnog domena lakog lanca, ubacivanja se mogu uvesti u V,. CDR1 sekvencu roditeljskog antitela dok zadržava suštinsku sličnost i time očekivanu odgovarajuću veličinu, koja prema Kabat et al., supra, npr, obično ima ukupno oko 9-20 (na primer, oko 10-17) ostataka. Slično tome, VLCDR2 obično ima ukupnu dužinu od oko 5-10 ostataka; VLCDR3 obično ima dužinu od oko 7-20 ostataka; VHCDR1 obično ima dužinu od oko 10-15 ostataka; VHCDR2 tipično ima dužinu od oko 15-20 ostataka; i VH CDR3 obično ima dužinu od oko 6-30 ostataka (npr, 3-25 ostataka). Umetanja u VHregion se obično vrše u VHCDR3 i tipično blizu C-terminala domena, kao što je oko 97-102 ostataka od roditeljskog VHCDR3 (npr susedan sa, ili C-tcrminal u sekvenci sa, broj ostatka 100 od roditeljske VH CDR3 sekvence) korišćenjem poravnanja i brojeva kao što je opisano prema Kabatu. Varijante antitela sa ubačenim aminokiselinskim ostatkom (-cima) u hipervarijabilnom regionu se stoga mogu pripremiti nasumično, posebno tamo gde je početni afinitet vezivanja roditeljskog antitela za ciljni antigen takav da se slučajno proizvedene varijante antitela mogu snimiti. Na primer, izlaganje faga obezbeđuje pogodan metod za skrining takvih nasumičnih varijanti.
[0354]U dizajnu, konstrukciji, i /ili evaluaciji CDR varijanti mora se posvetiti pažnja zbog činjenice da se CDR regioni mogu menjati kako bi se omogućilo bolje vezivanje za epitop. Antitela CDR-a obično rade obezbeđivanjem komplementarne površine, eventualno uključujući prste koji mogu da proviruju u površinski protein antigena ili drugu paratop strukturu, na kojoj epitop odgovara. Ako se epitop ne uklapa dobro, antitelo ne može ponuditi najbolji afinitet. Međutim, kao i sa epitopima, tamo često ima nekoliko ključnih ostataka u paratop strukturi koja čine većinu ovoga vezivanja. Stoga, CDR sekvence mogu značajno da variraju u dužini i kompoziciji između antitela za isti peptid. Prosečan stručnjak će prepoznati da određeni ostaci, kao što su tirozinski ostaci (npr, u kontekstu VHCDR3 sekvenci), koji često značajno doprinose takvom vezivanju za epitop, su tipično zadržani u CDR varijanti.
[0355]Varijante CDR regiona mogu takođe povećati kontakte aminokiselina između antigena i varijanti antitela, u poređenju sa aminokiselinskim kontaktima između antigena i roditeljskog antitela, uvođenjem jednog ili više aminokiselinskih ostataka (bilo supstitucijom ili umetanjem) koji povećavaju kontakte ili energično povoljne interakcije između jednog ili više aminokiselinskih ostataka prisutnih u antigenu i jednog ili više aminokiselinskih ostataka prisutnih u antitelu. Aminokiselinske interakcije od značaja mogu biti izabrane od vodoničnih interakcija, Van der Valsovih interakcija, i jonskih interakcija.
[0356]Oni koji su verzirani u stanje tehnike će biti svesni dodatnih principa korisnih u dizajnu i izboru CD38BP koji sadrži CDR varijante antitela prema predmetnom pronalasku.
[0357]U kontekstu CDR varijanti, koje su varijante CDRs antitela iz primera, posebno u kontekstu varijante CDR u anti-CD38 antitelu ili njihovim fragmentima, ostaci potrebni za podršku i/ili orijentaciju CDR strukturne strukture petlje (i) mogu tipično biti zadržani; ostaci koji spadaju u oko 10 angstrema CDR strukturne petlje (ali opciono samo ostaci u ovoj površini koji takođe poseduju dostupnu površinu rastvorljivu u vodi od oko 5 angstrema<2>ili veću) mogu tipično biti nemodifikovani ili modifikovani samo konzervativnim supstitucijama aminokiselinskog ostatka; i/ili aminokiselinska sekvenca može tipično biti predmet samo ograničenog broja ubacivanja/ ili brisanja (ako ih ima), tako da su CDR strukturne nalik strukturi petlje zadržane u varijanti (opis srodnih tehnika i relevantnih principa je obezbeđen na primer Schiweck et al., J. Mol. Biol. 268(5), 934-51 (1997), Morea, Biophvs Chem. 68(1-3), 9-16 (1997), Shirai et al., FEBS Lett. 399(1-2), 1-8 (1996), Shirai et al., FEBS Lett. 455(1-2), 188-97 (1999), Reckzo et al., Protein Eng. 8(4), 389-95 (1995) i Eigenbrot et al., J. Mol Biol. 229(4), 969-95 (1993). Videti takođe WO 03/048185, WO 03/070747 i WO 03/027246.
[0358]Dodatne tehnike koje se mogu koristiti za generisanje varijante antitela obuhvataju usmerenu evoluciju i druge generacione tehnike varijante opisane u na primer US 20040009498, Marks et al., Methods Mol Biol. 248, 327-43 (2004), Azriel-Rosenfeld et al, J. Mol Biol. 335(1), 177-92 (2004), Park ct al, Biochcm Biophys Rcs Commun. 275(2), 553-7 (2000), Kang ct al, Proc Natl Acad Sci USA. 88 (24), 11120-3 (1991), Zahnd et al, J Biol Chem. 279(18), 18870-7 (2004), Xu et al, Chem Biol. 9(8), 933-42 (2002), Border et al, Proc Natl Acad Sci USA. 97 (20), 10701-5 (2000), Crameri et al., Nat Med. 2(1), 100-2 (1996) i kao više uopšteno opisani u, na primer WO 03/048185.
[0359]Generisane varijante antitela mogu biti podvrgnute bilo kojoj pogodnoj skrining tehnici i antitela sa pogodnim i poželjno superiornim osobinama u jednom ili više relevantnih određivanja mogu biti odabrana za dalji razvoj.
[0360]CD38BPs koji sadrže CDR sekvence kao što je gore opisano mogu sadržati bilo koji pogodan broj i kombinacije takvog VLi VHCDR segmenta dok zadržava najmanje značajan procenat (najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili više ) afiniteta/aviditeta i/ili specifičnosti/selektivnosti antitela koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 2 i VHsekvencu SEK ID Br: 7, i/ili antitela koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 12 i VHsekvencu SEK ID Br: 17 i/ili antitela koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 22 i VHsekvencu SEK ID Br: 27, ali se opciono razlikuju po drugim karakteristikama, kao što je imunogenost kod humanog pacijenta, afiniteta za epitop, povećanog poluvremena života, itd. U nekim slučajevima takav CD38BP može biti povezan sa većim afinitetom, selektivnošću i/ili specifičnošću od roditeljskog antitela. U jednom izvođenju, manje od punog kompleta VLCDR segmenata i/ili VHCDR segmenata je prisutno u CD38BP-U. Ujednoj realizaciji svi VLCDR segmenti i VHCDR segmenti su prisutni.
[0361]Primeri drugih funkcionalnih svojstava antitela, koja mogu biti promenjena ili zadržana u varijanti CD38BPs predmetnog pronalaska kao što je upoređeno sa -003 i -005 i -024, su: (1) vezivanje za CD38 sa visokim afinitetom; (2) niska stopa disocijacije sa CD38; (3) inhibicija ili blokiranje CD38-vezivanja za CD38 metu; (4) eliminacija T ćelija ili B ćelija koje eksprimiraju CD38; (5) indukcija visokog stepena CDC bilo od CD55/59 negativnih ili CD55/59 pozitivnih ćelija; (6) translokacija u lipidne splavove nakon vezivanja za CD38; (7) tolerizacija T ćelija; (8) inhibicija proliferacije Tor B ćelija koje eksprimiraju CD38; (9) internalizacija CD38; (10) inhibicija ili izazivanje CD38 enzimske aktivnosti; (11) inhibicija ili izazivanje CD38-indukovane signalne transdukcije; (12) indukcija ili inhibicija produkcije citokina; (13) indukcija ili blokiranje T ćelijske ili B ćelijske diferencijacije; (14) indukcija ili spašavanje od apoptoze; (15) slabljenje ili povećanje indukcije lize od strane NK ćelija; (16) indukcija ili inhibicija proizvodnje insulina od strane P ćelija u pankreasu; (17) produženo preživljavanje subjekta sa tumorskim ćelijama koje eksprimiraju CD38; i / ili (18) indukcija ADCC od CD38 ciljeva kada se pomeša sa odgovarajućim efektorskom ćelijom.
Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje CD38BP vezujuće peptide koje karakteriše u pogledu njihove sposobnosti da se takmiče (kompetitivno inhibiraju) ili unakrsno takmiče (tj relativno delimično inhibiraju vezivanje epitopa) sa antitelom koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 2 i VHsekvencu SEK ID Br: 7 (kao što je antitelo -003), ili antitelo koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 12 i VH sekvencu SEK ID Br: 17 (kao što je antitelo -005) ili antitelo koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 22 i VH sekvencu SEK ID Br: 27, (kao što je antitelo -024), za vezivanje za CD38.
[0362]Takav CD38BP može biti, na primer, Fab fragment, izveden iz antitela koje se vezuje za epitop koji je identičan ili se preklapa sa epitopom koji je vezan od strane antitela koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 2 i VHsekvencu SEK ID Br: 7, ili antitela koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 12 i VHsekvencu SEK ID Br: 17 ili antitela koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 22 i VHsekvencu SEK ID Br: 27. Takav Fab fragment, zbog svoje relativno male veličine u poređenju sa molekulima mAt-a, sc nc može značajno takmičiti sa navedenim antitelima za vezivanje za CD38, iako antitelo iz koga proističe to radi. Ipak, takav CD38BP može biti koristan u sličnom ciljanju susednih regiona CD38 (na primer u kontekstu ciljanja citotoksinom, radionuklidom ili slično u kontekstu imunokonjugata CD38BP). Stoga, takvi CD38BPs mogu biti korisni u kontekstu postupaka predmetnog pronalaska kao što je ovde opisano.
[0363] Kompeticija za vezivanje za CD38 ili deo CD38 od strane dva ili više CD38BPs se može odrediti bilo kojom pogodnim tehnikom. U jednoj realizaciji, konkurencija se određuje na primer kako je opisano u Primeru 7, 8 i 9.
[0364] Kompeticija u kontekstu predmetnog pronalaska se odnosi na svako detektovano značajno smanjenje sklonosti određenog molekula da veže određenog vezujućeg partnera u prisustvu drugog molekula koji vezuje vezujućeg partnera. Tipično, kompeticija označava najmanje oko 10% smanjenja, kao što je najmanje oko 15%, ili najmanje oko 20% smanjenja u vezivanju između CD38BP i
(a) oblika CD38 (na primer "obrađeni", "zreo", "neprerađeni", "neobrađeni" ili "nezreo" CD38); (b) oblika slobodnog CD38 (npr CD38 fragment proizvedenin vivoobradom); (c) heterodimernog peptida sastavljenog od drugog peptida povezanog sa CD38, kao što je CD31,iCD38; (d) kompleksa CD38 ijedne ili više podloga, kao što su cAMP, NAD + i / ili cADPR; (e) dimerizovanog, povezanog i/ili prerađenog dimera CD38 sa rastvorljivim ligandom, kao što je CD31; ili
(f) delom CD38,
izazvanog prisustvom drugog CD38BP kao što je određeno, npr ELISA analizom ili FACS analizom (kao što je opisano u delu sa primerima) korišćenjem dovoljne količine dva ili više konkurentna CD38BPs i CD38 molekula. Takođe može biti slučaj da kompeticija može postojati između CD38BPs u odnosu na više od jednog CD38, i/ili deo CD38, npr u kontekstu gde su vezujuća svojstva antitela za određeni region CD38 zadržana u fragmentima, kao u slučaju veoma dobro predstavljenog linearnog epitopa koji je smešten u različitim testiranim fragmenatima ili konformacionog epitopa koji je predstavljen u dovoljno velikim CD38 fragmentima kao i u CD38.
[0365] Procenjivanje konkurencije obično uključuje ocenu relativnog inhibitornog vezivanja korišćenjem prve količine prvog molekula; druge količine drugog molekula; i treće količine trećeg molekula (ili standarda određenog studijama vezivanja koji se može razumno porediti sa novim podacima vezivanja u pogledu prvog i drugog molekula kao surogata za stvarne istovremene podatke), pri čemu su svi iznosi, prva, druga, i treća količina dovoljne da se napravi poređenje koje daje informacije o selektivnosti i/ili specifičnosti molekula koji je u pitanju u odnosu na druge prisutne molekule. Prva, druga, i treća količina mogu varirati u zavisnosti od prirode CD38BP i potencijalnih ciljeva koji su stoga u pitanju. Na primer, za ELISA procene, slične onima opisanim u odeljku sa primerima, oko 5-50 ug (np, oko 10-50 ug, oko 20-50 ug, oko 5-20 ug, oko 10-20 ug, itd) CD38BP i /ili CD38 ciljeva su potrebne da bi se procenilo da li postoji kompeticija. Uslovi takođe treba da bude pogodni za vezivanje. Tipično, fiziološki ili skoro-fiziološki uslovi (npr temperatura od oko 20-40°C, pH od oko 7-8, itd) su pogodni za CD38BP: CD38 vezivanje.
[0366]Često je kompeticija obeležena značajno većom relativnom inhibicijom od oko 5%, kao što je određeno pomoću ELISA i/ili FACS analiza. Može biti poželjno da se odredi viši prag relativne inhibicij e kao kriterij um/determinanta šta je pogodan nivo kompeticije u određenom kontekstu (npr, gde se analiza konkurencije koristi u izboru ili snimanju novih antitela dizajniranih sa nameravanom funkcijom blokiranja vezivanja drugog peptida ili vezivanja molekula za CD38 (npr prirodni vezujući partneri za CD38 kao što su CD31, takođe se zove CD31 antigen, EndoCAM, GPIIA', PECAM-1, trombocitni/endotelni ćelijski adhezioni molekul ili prirodno anti-CD38 antitelo)). Tako, na primer, moguće je postaviti kriterijum za konkurentnost pri čemu je detektovano najmanje oko 10% relativne inhibicije; najmanje oko 15% relativne inhibicije je detektovano; ili najmanje oko 20% relativne inhibicije je detektovano pre nego što se antitelo smatra dovoljno konkurentnim. U slučajevima gde se epitopi koji pripadaju konkurentskim antitelima nalaze u blizini u antigenu, konkurencija može biti obeležena većom od oko 40% relativne inhibicije CD38 vezivanja (npr najmanje oko 45%> inhibicije, kao što je najmanje oko 50%> inhibicije, na primer, najmanje oko 55% inhibicije, kao što je najmanje oko 60% inhibicije, na primer, najmanje oko 65%> inhibicije, kao što je najmanje oko 70%o inhibicije, na primer, najmanje oko 75% inhibicije, kao što je najmanje oko 80 % inhibicije, na primer, najmanje oko 85% inhibicije, kao što je najmanje inhibicije oko 90%, na primer, najmanje oko 95% inhibicije ili viši nivo relativne inhibicije).
[0367]Konkurencija se može smatrati suprotnom od unakrsne reaktivnosti između molekula i dva potencijalna vezujuća partnera. U izvesnim izvođenjima, CD38BP antitelo predmetnog pronalaska može da se specifično vezuje za jedan ili više ostataka ili regiona u CD38 ali takođe ne reaguje unakrsno sa drugim peptidima, peptidnim regionima ili molekulima, npr predmetni pronalazak obezbeđuje anti-CD38 antitelo koje ne reaguje unakrsno sa proteinima homolognim sa CD38, kao što je BST-1 (koštane srži strome ćelija antigen-1) i Mo5, takođe se zove CD157; ili anti-CD38 antitela mogu da ne reaguju unakrsno sa CD38 u kontekstu normalnog tkiva, kao što su tkiva koji nisu uključena u multiplom mijelomu. Tipično, nedostatak unakrsne reaktivnosti znači manje od oko 5% relativne kompetitivne inhibicije između molekula kada se procene vrše pomoću ELISA i / ili FACS analiza korišćenjem dovoljne količine molekula pod pogodnim uslovima određivanja.
[0368]Ujednoj realizaciji, ovaj pronalazak obezbeđuje CD38BP koji se takmiči sa antitelom koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 2 i VHsekvencu SEK ID Br: 7, kao što je antitelo -003, za vezivanje za CD38 ili njegovog dela.
[0369]Ujednoj realizaciji, ovaj pronalazak obezbeđuje CD38BP koji se takmiči sa antitelom koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 12 i VHsekvencu SEK ID Br: 17, kao što je antitelo -005, za vezivanje za CD38 ili njegovog dela.
[0370]Ujednoj realizaciji, ovaj pronalazak obezbeđuje CD38BP koji se takmiči sa antitelom koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 22 i VHsekvencu SEK ID Br: 27, kao što je antitelo -024, za vezivanje za CD38 ili njegovog dela.
[0371]Kao što je diskutovano na drugom mestu, ovde se koristi, ukoliko nije drugačije naznačeno ili jasno kontradiktorno kontekstu, pozivanje na vezivanje CD38BP za CD38 sa namerom da se odnosi na vezivanje u bilo kom pogodnom kontekstu, kao što je u konformacionom kontekstu gde je prisutna struktura CD38; ili u kontekstu linearnog epitopa. Naravno, vezivanje u ograničenom podskupu takvog konteksta može biti važna karakteristika u vezi sa bilo kojim CD38BP.
[0372]Dodatne metode za određivanje CD38BP specifičnosti kompetitivnom inhibicijom se mogu naći u, na primer, Harlovv et al, Antibodies: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunologv, Greene Publishing Assoc. and Wiley InterScience N.Y., (1992, 1993), and
Muller, Meth. Enzvmol. 92, 589-601 (1983)).
[0373]Humani CD38 sadrži niz različitih epitopa, koji mogu obuhvatiti (1) antigenske determinante peptida koje su sadržane unutar pojedinačnih peptidnih lanaca unutar humanog CD38; (2) konformacione antigenske determinante koje se sastoje od jedne ili više ne susednih aminokiselina na određenom lancu i/ili aminokiselina predstavljenih na prostorno susednim ali odvojenim peptidnim lancima (tipično tamo gde se odgovarajuće aminokiselinske sekvence lanaca nalaze isprekidano duž humane CD38 polipeptidne sekvence); (3) post-translacione antigenske determinante koje se sastoje, u celini ili delimično, od molekularne strukture kovalentno vezane za humani CD38, kao što su ugljeno hidratne grupe; ili (4) kombinacije od (l)-(3).
[0374]Epitop u kontekstu predmetnog pronalaska obuhvata bilo koji peptid ili determinantu peptidnog-derivata sposobnu za specifično vezivanje imunoglobulina. Epitop može da sadrži bilo koji pogodan broj aminokiselina, u bilo kom pogodnom položaju (u odnosu na linearnu sekvencu CD38) orijentacije (u pogledu savijenog CD38 ili njegovog fragmenta), aminokiselinski sastav (i posledično, bar delimično, naelektrisanje). Tako, na primer, epitop može biti sastavljen od oko 3-10 aminokiselina, tipično 3-8 aminokiselina, ujednoj ili više susednih ili nesusednih lokacija u odnosu na primarnu sekvencu CD38 (na primer neki epitop može suštinski da se sastoji od 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 aminokiselinskih ostataka distribuiranih u 1, 2, 3, 4, ili 5 nesusednih lokacija u CD38). Alternativno, na primer, epitop se može smatrati definisanim pomoću regiona od oko 5-40 susednih aminokiselinskih ostataka (npr oko 7-30 aminokiselinskih ostataka, oko 5-20 aminokiselinskih ostataka, ili oko 3-15 aminokiselinskih ostataka) u CD38 (samostalno ili u kombinaciji sa delom susednog CD38 domena). U nekim od epitopa može biti slučaj da su samo jedan aminokiselinski ostatak ili samo nekoliko aminokiselinskih ostataka kritični za CDR ili CDR(s) prepoznavanje (i time najvažnije CD38BP : CD38 antigenu afinitet i aviditet). Kao takav, epitop se može okarakterisati na osnovu jednog ili više takvih kritičnih ostataka, sa priznanjem da drugi ostaci mogu takođe činiti neki manji doprinos prema epitopu. U slučaju epitopa definisanog od strane regiona aminokiselina, može biti da jedna ili više aminokiselina u regionu čine samo mali doprinos ili čak zancmarljiv doprinos za vezivanje antitela, tako da ostatak može biti predmet supstitucije sa nekim odgovarajućim različitim ostatkom bez rezultiranja u "gubitku" epitopa prema najmanje nekom od CD38BPs specifičnih za njega.
[0375]U jednoj realizaciji, ovde je obezbeđen CD38BP, kao što je anti-CD38 antitelo, koje se specifično vezuje za CD38 epitop koji je takođe specifično vezan od strane antitela koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 2 i VHsekvencu SEK ID Br: 7 (kao što je antitelo -003), ili antitela u skladu sa pronalaskom koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 12 i VHsekvencu SEK ID Br: 17 (kao što je antitelo - 005) ili antitela koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 22 i VHsekvencu SEK ID Br: 27 (kao što je antitelo - 024). Moguće je da CD38BP-i imaju jedan ili više CDR segmenata koji se razlikuju od CDR segmenata antitela koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 2 i VHsekvencu SEK ID Br: 7, ili CDR segmenata antitela koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 12 i VHsekvencu SEK ID Br: 17, ili CDR segmenata antitela koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 22 i VHsekvencu SEK ID Br: 27, mogu i dalje biti specifični za isti epitop kao i antitelo koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 2 i VHsekvencu SEK ID Br: 7, kao i antitelo koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 12 i VHsekvencu SEK ID Br: 17 i kao i antitelo koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 22 i VHsekvencu SEK ID Br: 27, respektivno. U nekim takvim slučajevima, CD38BP u pitanju može prepoznati ili biti više specifičan/selektivniji za određene strukture ili regione epitopa od antitela koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 2 i VHsekvencu SEK ID Br: 7 i antitela koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 12 i VHsekvencu SEK ID Br: 17 i antitela koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 22 i VHsekvencu SEK ID Br: 27 respektivno.
[0376]CD38 epitop vezan od strane antitela koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 2 i VHsekvencu SEK ID Br: 7 (kao što je antitelo -003), ili antitela koje ima V,. sekvencu SEK ID Br: 12 i VHsekvencu SEK ID Br: 17 (kao što je antitelo -005) ili antitela koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 22 i VHsekvencu SEK ID Br: 27 (kao što je antitelo -024), može biti identifikovan preko standardnih tehnika mapiranja i karakteri zaci ja, daljom preradom od koje mogu da se identifikuju bilo kojom pogodnim tehnikom, brojnim primerima koji su dostupni stručnjacima. Ove tehnike se takođe mogu koristiti za identifikaciju i/ili karakterizaciju epitopa za CD38BPs uopšte. Kao jedan primer tih metoda mapiranja/karakterizacije, epitop za anti-CD38 antitelo se može odrediti pomoću epitopa "otiska-stopala" korišćenjem hemijske modifikacije izloženih amina/karboksila u CD38 proteinu. Jedan konkretan primer takve tehnike otisaka-stopala je upotreba HXMS (vodonik-deuterijum razmene detektovane pomoću masene spektrometrije pri čemu se dešava razmena vodonik/deuterijum sa receptora i liganda amidnih protona proteina, vezivanje, i razmena unatrag, pri čemu su osnovne amidne grupe koje učestvuju u vezivanju proteina zaštićene od razmene unatrag i stoga će ostati deuterisane. Relevantni regioni mogu biti identifikovani u ovom trenutku peptičkom proteolizom, brzom microbore separacijom visoke performanse tečnom hromatografijom i/ili elektrosprej jonizacionom masenom spektrometrijom. Videti, npr, Ehring H, Analvtical Biochemistrv, 267 (2) 252-259 (1999) i/ili Engen, J. R. and Smith, D.L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A. Drugi primer pogodne tehnike za identifikaciju epitopa je mapiranje epitopa nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR), gde se tipično porede položaji signala u dvodimenzionalnim NMR spektrima slobodnog antigena i kompleksiranog antigena sa antigen vezujućim peptidom, kao što jc antitelo. Antigen jc tipično selektivno izotopski obeležen sa 15N, tako da se vide samo signali koji odgovaraju antigenu i nema vidljivih signala od antigen vezujućeg peptida u NMR-spektru. Signali antigena poreklom od aminokiselina uključenih u interakciju sa antigen vezujućim peptidom će tipično menjati položaj u spektrima kompleksa u odnosu na spektre slobodnog antigena, i aminokiseline uključene u vezivanju se mogu identifikovati na taj način. Videti na primer Ernest Schering Res Found Workshop. (44), 149-67 (2004), Huang et al, Journal of Molecular Biology 281 (1), 61-67 (1998) and Saito and Patterson, Methods. 9(3), 516-24 (1996).
[0377]Mapiranje epitopa/karakterizacija se može izvršiti korišćenjem metoda masene spektrometrije. Videti na primer Downward, J Mass Spectrom. 35 (4), 493-503 (2000) and Kiselar and Dovvnard, Anal Chem. 71. (9), 1792-801 (1999).
[0378]Tehnike digestije proteazama mogu takođe biti korisne u kontekstu mapiranja epitopa i identifikacije. Antigenske determinante-relevantnih regiona/sekvenci se mogu odrediti digestijom proteaza, npr korišćenjem tripsina u odnosu od oko 1:50 prema CD38 preko noći (O/N) digestijom na 37°C i pH 7-8, praćeno analizama masene spektrometrije (MS) za identifikaciju peptida. Peptidi zaštićeni od cepanja tripsinom od strane CD38BP se mogu naknadno identifikovati poređenjem uzoraka podvrgnutih tripsinskoj digestiji i uzoraka inkubiranih sa CD38BP, a zatim podvrgnutih digestiji sa npr tripsinom (time otkrivajući otisak stopala vezujućeg agensa). Drugi enzimi kao himotripsin, pepsin, itd se mogu takođe, ili alternativno koristiti u sličnoj metodi karakterizacije epitopa. CD38BP koji daje značajno isti rezultat kao antitelo koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 2 i VHsekvencu SEK ID Br: 7 (kao što je antitelo -003), ili antitelo koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 12 i VHsekvencu SEK ID Br: 17 (kao što je antitelo -005) ili antitelo koje ima V,. sekvencu SEK ID Br: 22 i VHsekvencu SEK ID Br: 27 (kao što je antitelo -024), u ovim merenjima se smatra da se antitelo vezuje za isti epitop kao i antitelo koje ima VLsekvencu SEK TD Br: 2 i VHsekvencu SEK TD Br: 7 (kao što je antitelo -003), ili antitelo koje ima VLsekvencu SEK TD Br: 12 i VHsekvencu SEK TD Br: 17 (kao što je antitelo -005) ili antitelo koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 22 i VHsekvencu SEK ID Br: 27 (kao što je antitelo -024), respektivno. Videti na primer Manca, Ann Ist Super Sanita. 27 (1), 15-9 (1991) za diskusiju sličnih tehnika.
[0379]Mapiranje epitopa kompetitivnim vezivanjem za CD38 sa dva antitela gde je jedno biotinilovano jc drugi metod za identifikaciju relevantnih regiona antigenske determinante.
[0380]Vezivanje antitela za linearne i lančane peptide CD38 pomoću PEPSCAN-baziranog enzimski-povezanog imuno testa je drugi način za identifikaciju relevantnih regiona antigenskih determinanti, videti na primer Slootstra-JW et al. Mol-Divers. 1, 87-96 (1996).[0381]Usmerena mutageneza je još jedan način za identifikaciju relevantnih regiona antigenske determinante, videti na primer Polyak and Deans, Blood 99, 3956-3962 (2002).
[0382]Različite tehnike prikaza faga se takođe mogu koristiti za identifikaciju epitopa. Pogledajte na primer Wang and Yu, Curr Drug Targets. 5(1), 1-15 (2004), Burton, Immunotechnology. 1(2), 87-94 (1995 Aug), Cortese et al., Immunotechnology. 1 (2), 87-94 (1995) and Irving et al, Curr Opin Chem Biol. 5(3), 314-24 (2001). Konsenzus epitopi takođe mogu biti identifikovani preko modifikovanih srodnih tehnika prikaza faga (videti, http://www.cs.montana.edu/~mumey/papers/jcb03.pdf) za diskusiju.
[0383]Druge metode potencijalno korisne u mapiranju epitopa uključuju tehnike kristalografije, tehnike difrakcije X-zraka (kao što je difrakcija X-zraka/sekvence studiona tehnika razvijena od strane Poljaka i drugih u periodu 1970-1980), kao i primenu
[0384]Multipin tehnologije sinteze peptida. Kompjuterski baziranih metoda kao što su analize sekvence i analize trodimenzionalne strukture i prijema se takođe mogu koristiti za identifikaciju antigenske determinante. Na primer, epitop se takođe može odrediti pomoću molekulskog modelovanja korišćenjem strukture CD38 sa prijemom strukture Fab fragmenta pojedinačnog monoklonskog antitela. Ovi i drugi postupci mapiranja su izloženi u izdanju Mapiranje Epitopa praktičan pristup (Westwood and Hay Eds.) 2001 Oxford University Press.
[0385]U jednoj realizaciji, ovaj pronalazak obezbeđuje CD38BP koji ima suštinski iste specifične CD38-vezujuće karakteristike jednog ili više mAt-a koja su odabrana od antitela koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 2 i VHsekvencu SEK ID Br: 7 (kao što je antitelo -003), ili antitela koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 12 i VHsekvencu SEK ID Br: 17 (kao što je antitelo -005) ili antitela koje ima VLsekvencu SEK ID Br: 22 i VHsekvencu SEK ID Br: 27 (kao što je antitelo -024).
[0386]Studije mapiranja su pokazale da se nekoliko monoklonskih antitela pokrenutih protiv humanog CD38 vezuju za epitope C-terminalnog regiona CD38 (220-296) (Hoshino et al. J. Immunol., 1997, 158:741-747, i Ferrero et al., BMC Immunology, 2004, 5:21). U okviru ovog regiona su pronađene tri aminokiselinske razlike između humane i cinomolgus CD38 sekvence: T237, Q272 i S274 kod ljudi odgovaraju A238, R273 i F275 kod makakija. -005 se ne vezuje za cinomolgus tkiva (prikazano u primerima 10 i 11). Postoji ograničen broj aminokiselinskih razlika između humane i majmunske CD38 sekvence, na primer u karboksi terminalnom delu na proteinu, na primer sledeće tri razlike aminokiselina između humane i cinomolgus CD38 sekvence: T237, Q272 i S274 kod ljudskih CD38s odgovaraju A238, R273 i F275 kod cinomolgus majmuna CD38 (uporediti SEK TD Br.21 i SEK ID Br.22). -005 se ne vezuje za mutanta huCD38 proteina, pri čemu je glutaminski ostatak na položaju 272 iz SEK ID Br: 31 zamenjen sa argininskim ostatkom (Q272R), ili za mutanta huCD38 proteina, pri čemu je serinski ostatak na položaju 274 iz SEK ID Br: 31 zamenjen sa fenilalaninskim ostatkom (S274F)
(prikazanom u primeru 17) u istoj meri u kojoj sc vezuje za humani CD38 divljeg tipa. Vezivanje -005 je naročito anulirano aminokiselinskom supstitucijom na položaju S274F.
[0387]Shodno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje peptide, koji se vezuju za humani CD38 (SEK ID Br: 31), a koji se ne vezuju za mutanta humanog CD38, gde je glutaminski ostatak na položaju 272 zamenjen sa argininskim ostatkom (SEK ID Br : 33) u istom stepenu u kome se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
[0388]Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje peptide, koji se vezuju za humani CD38 (SEK ID Br: 31), a koji se ne vezuju za mutanta humanog CD38, pri čemu je serinski ostatak na položaju 274 zamenjen sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34) u istoj meri za koju se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
[0389]Izraz "u istoj meri ili u istom stepenu" treba tumačiti tako da jc vezivanje peptida za mutanta humanog CD38 značajno niže nego vezivanje peptida za humani CD38 divljeg tipa. Vezivanje peptida za molekule CD38 (divljeg tipa i mutanta) može biti određeno na više načina i to je u okviru zajedničkog opšteg znanja stručnjaka u tehnici da utvrdi da li je vezivanje za mutanta "značajno niže" nego vezivanje za divljeg tipa. Veliki broj različitih tehnika za određivanje vezivanja peptida za drugi peptid su dostupna stručnjaku u tehnici, na primer ELISA, radioimuno testovi, BIAjezgro ili protočna citometrija.
[0390]Jedan metod određivanja vezivanja je određivanjem EC50vezivanja peptida za protein mutanta i za protein divljeg tipa zatim poređenjem dobijenih vrednosti. Drugi metod određivanja vezivanja je ispitivanjem veličine vezivanja pri zasićenim koncentracijama (na primer plato vezujućeg signala), ili određivanjem kinetičkih konstanti brzine ko„ i k<,ff na primer pomoću BIAjezgra.
[0391]U jednojrealizaciji, vezivanje peptida u pitanju za CD38 proteine (mutanta ili divljeg tipa) se vrši korišćenjem ELISA kao što je opisano u Primeru 17.
[0392]U jednoj realizaciji, EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je serinski ostatak na položaju 274 zamenjen sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34), je manja od 50% od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31). U jednoj realizaciji, EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je serinski ostatak na položaju 274 zamenjen sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34), je manja od 10% od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31). Ujednoj realizaciji, EC5ovezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je serinski ostatak na položaju 274 zamenjen sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34), je manja od 5% od EC5ovezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31). U jednoj realizaciji, EC5ovezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je serinski ostatak na položaju 274 zamenjen sa fenilalaninskim ostatkom (SEK ID Br: 34), je manja od 1% od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
[0393]Ujednoj realizaciji, EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je glutaminski ostatak na položaju 272 zamenjen sa argininskim ostatkom (SEK ID Br: 33), je manja od 50% od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31). U jednoj realizaciji, EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu jc glutaminski ostatak na položaju 272 zamenjen sa argininskim ostatkom (SEK ID Br: 33), je manja od 10% od EC5ovezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
[0394]Ujednoj realizaciji, peptid se vezuje za mutanta humanog CD38, pri čemu je treoninski ostatak na položaju 237 zamenjen sa alaninskim ostatkom (SEK ID Br: 32) u istom stepenu kojim se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br: 31). U jednoj realizaciji, EC5ovezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je treoninski ostatak na položaju 237 zamenjen sa alaninskim ostatkom (SEK ID Br: 32) je viša od 75% od EC5ovezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31). U jednoj realizaciji, EC5ovezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je treoninski ostatak na položaju 237 zamenjen sa alaninskim ostatkom (SEK ID Br: 32) je viša od 85% od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31). Ujednoj realizaciji, EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je treoninski ostatak na položaju 237 zamenjen sa alaninskim ostatkom (SEK ID Br: 32) jc viša od 90% od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31). U jednoj realizaciji, EC50vezivanja peptida za mutanta humanog CD38, pri čemu je treoninski ostatak na položaju 237 zamenjen sa alaninskim ostatkom (SEK ID Br: 32) je viša od 95% od EC50vezivanja peptida za humani CD38 (SEK ID Br: 31).
[0395]Za identifikaciju više specifičnih regiona antigenske determinante u CD38, razne prediktivne analitičke metode se mogu primeniti. U prvom analitičkom pristupu, CD38 može biti analiziran u ime (1) visoko hidropatskih regiona (metodom Kyte-Doolittle); (2) antigenosti mereno metodom protruzionog indeksa; (3) antigenosti kako je utvrđeno metodom Parker; (4) antigenosti kako je utvrđeno metodom HoppAVoods; i (5) hidrofilnosti mereno metodama Goldman, Engleman i Steitz. Sekvence u rasponu od 10-40 aminokiselina u dužini mogu biti izabrane na osnovu izlaganja jedne ili više od ovih osobina. Razlog za ovaj pristup je opšti konsenzus da su mnogi idealni B ćelijski epitopi hidrofilne, površinski orijentisane, i fleksibilne sekvence od oko 8-10 aminokiselina u dužini.
[0396]Ovde su obezbeđeni CD38BPs specifični za CD38-regione CD38 antigena koji su identifikovani na takav način. Staviše, krajevi ovih sekvenci se mogu uporediti sa predviđenim regionima antigenske determinante koje se nalaze u drugim analizama ovde opisanim da obezbede dodatne verovatno specifične regione koji sadže antigenske-determinante. Druga slična poređenja mogu lako da se vrše da obezbede dodatne verovatne regione antigenskih determinanti, gde se CD38BPs koji se vezuju sa ovim regionima antigenskih determinanti mogu smatrati drugom karakteristikom ovog pronalaska.
[0397]CD38BPs predmetnog pronalaska su antitela. Neograničavajući primeri CD38 vezujućih imunoglobulinskih molekula koji su obezbeđeni predmetnim pronalaskom uključuju (a) potpuno funkcionalan, imunoglobulinski molekul koji sadrži: (i) dva identična himerna teška lanca koji sadrže varijabilni region sa humanom B ćelijskom specifičnošću površinskog antigena i humani konstantan region i (ii) dva potpuno identična (tj ne-himerna) humana laka lanca; (b) potpun, funkcionalan, imunoglobulinski molekul koji sadrži: (i) dva identična himerna teška lanca koji sadrže varijabilni region kao što je naznačeno i humani konstantni region, i (ii) dva identična cela (tj ne-himerna) nehumana laka lanca; (c) monovalentno antitelo, tj kompletan, funkcionalni molekul imunoglobulina koji sadrži: (i) dva identična himerna teška lanca koji sadrže varijabilni region kao što je prikazano, i humani konstantni region, i (ii) dva različita laka lanca, samo jedan od kojih ima istu specifičnost kao varijabilni region teških lanaca. Dobijeni molekul antitela se vezuje za samo jedan njihov kraj i stoga je nesposoban za dvovalentno vezivanje. Kao druga ilustracija, imunoglobulin- srodni peptidi koji su obezbeđeni predmetnim pronalaskom može se reći da uključuju sledeće: (a) ceo molekul imunoglobulina; (b) scFv; (c) monoklonsko antitelo; (d) humano antitelo; (e) himerno antitelo; (f) humanizovano antitelo; (g) Fab fragment; (h) Fab' fragment; (i) F(ab')2fragment; (j) Fv molekula; i (k) disulfidno vezan Fv molekul.
[0398]Ujednoj realizaciji, CD38BP predmetnog pronalaska je poliklonsko antitelo. Ujednoj realizaciji, CD38BP predmetnog pronalaska je monoklonsko antitelo. U daljoj realizaciji, CD38BP predmetnog pronalaska predstavlja humano monoklonsko antitelo. U drugoj daljoj realizaciji, CD38BP predmetnog pronalaska je humanizovano antitelo. U drugoj daljoj realizaciji, CD38BP predmetnog pronalaska je himerno antitelo. U drugoj daljoj realizaciji, CD38BP predmetnog pronalaska jc monoklonsko antitelo poreklom u potpunosti od vrsta sisara različitih od ljudi. U daljoj realizaciji, CD38BP predmetnog pronalaska je u potpunosti mišje monoklonsko antitelo.
[0399]Monoklonsko antitelo se odnosi na kompoziciju koja sadrži homogenu populaciju antitela koja ima jedinstvenu strukturu i specifičnost. Tipično monoklonsko antitelo je antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj, pojedinačna antitela koja sačinjavaju populaciju su identična izuzev mogućih prirodnih mutacija koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična i svako monoklonsko antitelo je tipično usmereno protiv jednog epitopa, što je u kontrastu sa poliklonskim antitelima preparata koja tipično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih epitopa. Da je antitelo monoklonsko ne treba tumačiti kao zahtev za proizvodnju antitela nekom određenom metodom. Na primer, monoklonska antitela iz ovog pronalaska mogu se proizvesti postupkom hibridoma koji je prvo opisan od strane Kohler et al, Nature 256, 495 (1975), ili mogu biti proizvedena metodama rekombinantne DNK. Monoklonska antitela mogu takođe biti izolovana iz biblioteka fagnih antitela korišćenjem tehnika opisanih, na primer, Clackson et al, Nature 352, 624-628
(1991) andMarks et al, J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991).
[0400]Monoklonska antitela se mogu dobiti od bilo kog pogodnog izvora. Tako, na primer, monoklonska antitela se mogu dobiti iz hibridoma pripremljenih iz slezine mišijih B ćelija dobijenih od miševa imunizovanih sa antigenom od interesa, na primer u obliku ćelija koje eksprimiraju antigen na površini, ili nukleinske kiseline koja kodira antigen od interesa. Monoklonska antitela mogu se takođe dobiti iz hibridoma izvedenih iz humanih imunizovanih ćelija koje eksprimiraju antitela ili ne-humanih sisara kao što su pacovi, psi, primati, itd.[0401]Alternativno, klonirani geni antitela mogu biti izraženi u drugim ekspresionim sistemima, uključujući prokariotske ćelije, kao što su mikroorganizmi, poputE. coli,za proizvodnju jednolančanih Fv antitela, alge, kao i ćelije insekata. Pored toga, antitela mogu biti proizvedena u transgenim ne-humanim životinjama, kao što su u mleku od ovaca i zečeva ili u kokošijim jajima, ili u transgenim biljkama. Pogledajte na primer Verma, R., et al., J.Immunol. Meth. 216,165-181 (1998); Pollock et al., J.Immunol. Meth. 231, 147-157 (1999); and Fischer, R., et al, Biol. Chem. 380, 825-839 (1999).
[0402]U jednoj realizaciji, humana monoklonska antitela usmerena protiv CD38 mogu biti generisana korišćenjem transgenih ili trans hromozomalnih miševa koji nose delove ljudskog imunog sistema pre nego sistema miša. Takvi transgeni i transhromozomalni miševi obuhvataju miševe koji se ovde odnose na HuMAb miševe i KM miševe, respektivno, a kolektivno su ovde označeni kao "transgeni miševi". Humano monoklonsko antitelo generisano u takvim miševima može biti skraćeno kao HuMAb.
[0403]HuMAb miš sadrži humani imunoglobulinski gen minilokusa koji kodira imunoglobulinske sekvence ne-preuređenog humanog teškog lanca (u i y) iklakog lanca, zajedno sa ciljanim mutacijama koje inaktiviraju endogene lokuse u iklanca (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). Shodno tome, miševi ispoljavaju smanjenu ekspresiju mišjeg IgM iliki kao odgovor na imunizaciju, uvedeni humani teški i laki lanac transgena, prolaze kroz promenu klase i somatske mutacije za generisanje humanih IgG,kmonoklonskih antitela visokog afiniteta (Lonberg, N. et al (1994), supra; reviewed in Lonbcrg, N. Handbook of Expcrimcntal Pharmacologv 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13, 65-93 (1995) and Harding, F. and Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536-546 (1995)). Dobijanje HuMAb miševa je detaljno opisano u Tavlor, L. et al, Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon. et al, J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Tavlor, L. et al., International Immunology 6, 579-591
(1994), Fishvvild, D. et al, Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Videti takođe US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 i WO 01/09187.
[0405]HCo7 miševi imaju JKD poremećaj u njihovim endogenim genima lakog lanca (kapa) (kao što je opisano u Chen et al, EMBO J. 12, 821-830 (1993)), CMD poremećaj u njihovim endogenim genima teškog lanca (kao što je opisano u Primeru 1 WO 01/14424), KCo5 transgen humanog kapa lakog lanca (kao što je opisano u Fishvvild et al.. Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), i HCo7 transgen humanog teškog lanca (kao što je opisano u US 5,770,429).
[0405]HCol2 miševi imaju JKD poremećaj u njihovim endogenim genima lakog lanca (kapa) (kao što je opisano u Chen et al, EMBO J. 12, 821-830 (1993)), CMD poremećaj u njihovim endogenim genima teškog lanca (kao što je opisano u Primeru 1 WO 01/14424), KCo5 transgen humanog kapa lakog lanca (kao što je opisano u Fishvvild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), i HCol2 transgen humanog teškog lanca (kao što je opisano u Primeru 2 WO 01/14424). U KM mišjem soju, endogeni mišji gen kapa lakog lanca je homozigotno prekinut kao što je opisano u Chen et al., EMBO J..12, 811-820 (1993) i endogeni mišji gen za teški lanac je homozigotno prekinut kao što je opisano u Primeru 1 WO 01/09187. Ovaj mišji soj nosi transgen humanog kapa lakog lanca, KCo5, kao što je opisano u Fishvvild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Ovaj mišji soj takođe nosi transhromozom humanog teškog lanca sastavljen od hromozom 14 fragmenta hHCF (SC20) kao što je opisano u WO 02/43478.
[0406]KM miš sadrži transhromozom humanog teškog lanca i transgen humanog kapa lakog lanca. Endogeni mišji geni teškog i lakog lanca su takođe poremećeni kod KM miševa tako da imunizacija miševa dovodi do proizvodnje humanih imunoglobulina umesto mišjih imunoglobulina. Konstrukcija miševa KM i njihovo korišćenje za podizanje humanih imunoglobulina je detaljno opisano u WO 02/43478.
[0407]Splenociti iz ovih transgenih miševa mogu biti korišćeni za generisanje hibridoma koji sekretuju humana monoklonska antitela prema dobro poznatim tehnikama. Takvi transgeni sisari, sisari koji sadrže operabilnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ekspresiju CD38BP, sisari stabilno transfektovani sa jednom ili više CD38-kodirajućih sekvenci nukleinske kiseline, i slično, su dodatne karakteristike uključujući antitela iz predmetnog pronalaska.
[0408]Humana monoklonska ili poliklonska antitela iz sadašnjeg pronalaska, ili antitela iz sadašnjeg pronalaska koja potiču iz drugih vrsta mogu takođe biti generisana transgeno preko generacije drugog nehumanog sisara ili biljke koja jc transgena za imunoglobulinskc sekvence teškog i lakog lanca od interesa i proizvodnja antitela u povratnom obliku iz nje. U vezi sa transgenom proizvodnjom u sisarima, antitela mogu biti proizvedena u, i obnovljena iz, mleka koza, krava ili drugih sisara. Videti, na primer, US 5,827,690, US 5,756,687, US 5,750,172 i US 5,741,957.
[0409]Nadalje, humana antitela iz sadašnjeg pronalaska ili antitela iz sadašnjeg pronalaska iz drugih vrsta mogu se generisati preko tehnologija tipa displeja (ispoljavanja), uključujući, bez ograničenja, ispoljavanja na fagima, ispoljavanja na retrovirusima, ispoljavanja na ribozomima i druge tehnike, upotrebom tehnika dobro poznatih u struci i tako dobij eni molekuli mogu biti podvrgnuti dodatnom sazrevanju, kao što je sazrevanje afiniteta, kako su takve tehnike dobro poznate u tehnici (videti na primer Hoogenboom et al, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991) (ispoljavanja na fagima), Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996) (ispoljavanja na fagima), Hanes and Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997) (ribozomalni displej), Parmley and Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (ispoljavanja na fagima), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hoogenboom et al., Immunol. Revievvs 130, 43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992), i US 5,733,743). Ako se displej tehnologije koriste za proizvodnju antitela koja nisu ljudska, takva antitela mogu biti humanizovana, na primer kao što je opisano na drugom mestu ovde.
[0410]Humanizovana monoklonska antitela iz sadašnjeg pronalaska mogu se generisati spajanjem konstantnih domena iz humanog antitela sa varijabilnim domenima ne-humanih vrsta. Primeri kako se izrađuju humanizovana antitela se mogu naći u na primer US 6,054,297, US 5,886,152 i US 5,877,293. Humanizovano antitelo je dizajnirano da ima veću homologiju prema humanom imunoglobulinu od monoklonskih antitela životinjskog porekla. Nehumani aminokiselinski ostaci od "uvezenog"
(životinjskog) varijabilnog domena su obično transfektovani u humani "kičmeni stub". Humanizacija može u suštini biti izvedena sledeći metodu Winter i saradnika (Jones et al., Nature 321, 522-525
(1986), Riechmann et al., Nature 332, 323-327 (1988), Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536
(1988)), supstitucijom glodarskih regiona koji određuju komplementarnost ("CDR-a") ili CDR sekvenci za odgovarajuće sekvence humanog antitela. Shodno tome, u takvim "humanizovanim" antitelima, CDR delovi humanog varijabilnog domena su zamenjeni odgovarajućom sekvencom iz vrste koja nije humana. Tako, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima su neki CDR ostaci i moguće neki okvirni ostaci zamenjeni sa ostacima iz analognih mesta u antitelima glodara. Izbor humanih varijabilnih domena, i lakih i teških, koji će se koristiti u izradi humanizovanih antitela je važan da se smanji antigenost. Prema takozvanoj "najbolje-uklapajućoj (best-fit)" metodi, sekvenca varijabilnog domena antitela glodara se ispituje u odnosu na celu biblioteku poznatih humanih sekvenci varijabilnog domena. Humana sekvenca koja je najbliža onoj koja je od glodara se onda prihvata kao humani okvir (FR) za humanizovano antitelo (Sims et al., J. Immunol., 151, 2296 (1993), Chothia et al, J. Mol. Biol. 196, 901 (1987)). Druga metoda koristi poseban okvir izveden iz konsenzus sekvence svih humanih antitela određene podgrupe lakih ili teških lanaca. Isti okvir se može koristiti za nekoliko različitih humanizovanih antitela (Čarter et al, PNAS USA 89, 4285 (1992), Presta et al., J. Immunol. 151, 2623
(1993)).
[0411]Tipično, takođe je važno da humanizovana antitela zadržavaju visok afinitet za antigen i druga poželjna biološka svojstva. Da bi se postigao ovaj cilj, humanizovana antitela mogu biti pripremljena procesom analize roditeljskih sekvenci i različitih konceptualnih humanizovanih proizvoda korišćenjem trodimenzionalnih modela roditeljskih i humanizovanih sekvenci. Trodimenzionalni modeli imunoglobulina su uobičajeno dostupni i poznati su prosečnom stručnjaku. Dostupni su kompjuterski programi koji ilustruju i prikazuju verovatne trodimenzionalne konformacione strukture odabranih kandidata imunoglobulinskih sekvenci. Inspekcija ovih prikaza dozvoljava analizu verovatne uloge određenih ostataka u funkcionisanju kandidata imunoglobulinske sekvence, tj, analizu ostataka koji utiču na sposobnost kandidata imunoglobulina da veže svoj antigen. Na ovaj način, FR ostaci mogu biti odabrani i kombinovani od sekvenci primaoca i uvezenih sekvenci tako da se željene karakteristike antitela, kao što je povećan afinitet za ciljni antigen (e), uvećaju do krajnosti, iako su CDR ostaci oni koji direktno i najznačajnije utiću na vezivanje antigena.
[0412]Mišja antitela ili antitela iz drugih vrsta mogu biti humanizovana ili primatizovana korišćenjem nekih pogodnih tehnika, veliki broj pogodnih tehnika je već dobro poznat u tehnici (videti na primer Winter and Harris Immunol Today 14, 43-46 (1993) and Wright et al., Crit. Revievvs in Immunol. 125-168 (1992)). Antitelo od interesa se može konstruisati pomoću tehnika rekombinantne DNK da zameni CH1, CH2, CH3, domene šarki i/ili domene okvira sa odgovarajućom humanom sekvencom (videti WO 92/02190 i US 5,530,101, US 5,585,089, US 5,693,761, US 5,693,792, US 5,714,350, i US 5,777,085).
[0413]Humanizacija antitela može takođe biti izvedena sledeći metodu VVinter i saradnika (Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986), Riechmann et al, Nature 332, 323-327 (1988), Verhoeven et al, Science 239, 1534-1536 (1988)), supstitucijom glodarskih CDRs ili CDR sekvenci odgovarajućim sekvencama humanog antitela. Shodno tome, takva "humanizovana" antitela su, u izvesnom smislu, himerna antitela (US 4,816,567), gde je suštinski manje od netaknutog humanog varijabilnog domena supstituisano odgovarajućom sekvencom iz ne-humane vrste. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima su neki CDR ostaci i moguće neki FR ostaci, zamenjeni sa ostacima iz analognih mesta u antitelima glodara.
[0414]Takođe, upotreba Ig cDNK za izgradnju himernih imunoglobulinskih gena jc poznata u tehnici (videti na primer Liu et al., PNAS USA 84, 3439 (1987) i J.Immunol. 139, 3521 (1987)). mRNK je izolovana iz hibridoma ili druge ćelije koja proizvodi antitelo i koristi se za proizvodnju cDNK: cDNK od interesa može biti pojačana reakcijom lančane polimeraze korišćenjem specifičnih prajmera (US 4,683,195 i US 4,683,202). Alternativno, bibliotekaje napravljena i ekranizovana da se izoluje sekvenca od interesa. DNK sekvenca koja kodira varijabilni region antitela je zatim fuzionisana za humani konstantni region sekvenci. Sekvence humanih konstantnih regiona (kao i varijabilnih regiona) mogu se naći u Kabat et al.,(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N. I. H. publication no. 91-3242 i noviji i srodni podaci se mogu naći na http://www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/ Generallnfo.html. Izbor izotipa će tipično biti vođen željenim efektorskim funkcijama, kao što je fiksacija komplementa, ili aktivnost u ćelijskoj citotoksičnosti koja zavisi od antitela. Primeri izotipova su IgGl, IgG2, IgG3, i IgG4. Bilo koji od konstantnih regiona humanog lakog lanca, kapa ili lambda, može da se koristi. Himerno, humanizovano antitelo se može zatim eksprimirati konvencionalnim metodama.
[0415]CD38BPs predmetnog pronalaska mogu biti u bilo kom pogodnom obliku u vezi sa multimerizacijom. Anti-CD38 antitela i fragmenti antitela mogu biti najmanje u heterotrimernoj formi ako ne i u višim multimernim oblicima kao što su oni povezani sa IgM antitelima. U drugim ostvarenjima, CD38BP može biti prikazan kao dimer ili monomer. Monomerni CD38BPs predmetnog pronalaska mogu biti, na primer, modifikovani bilo kojom pogodnom tehnikom tako da formiraju multimerne peptidne kompozicije.
[0416]Ako je poželjno, klasa anti-CD38 antitela iz sadašnjeg pronalaska može biti prebačena poznatim postupcima. Na primer, antitelo predmetnog pronalaska, koje je prvobitno IgM može biti klase prebačene u IgG antitelo prema predstavljenom pronalasku. Nadalje, tehnike prebacivanja klase se mogu koristiti za pretvaranje jedne IgG podklase u drugu, na primer od IgGl do IgG2. Stoga, efektorska funkcija antitela predmetnog pronalaska može biti promenjena prebacivanjem izotipa na, npr, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ili IgM antitela za razne terapeutske svrhe.
[0417]Ujednoj realizaciji antitelo predmetnog pronalaska je IgGl antitelo, na primer neki IgGl,kili IgGl,Xizotipa. U drugoj realizaciji antitelo predmetnog pronalaska je IgG3 antitelo, na primer neki IgG3,kili IgG3,Xizotipa. U drugoj realizaciji antitelo predmetnog pronalaska je IgG4 antitelo, na primer neki IgG4,kili IgG4,Xizotipa. U drugoj realizaciji antitelo predmetnog pronalaska je IgAl ili IgA2 antitelo. U drugoj realizaciji antitelo predmetnog pronalaska je IgM antitelo.
[0418]Anti-CD38 antitela mogu biti regenerisana iz rekombinantnih kombinatornih biblioteka antitela, kao što je displej biblioteke scFv faga, koji može biti napravljen sa humanim VLi VHcDNK dobijenim iz iRNK izvedene iz humanih limfocita. Postupci za dobijanje i pretraživanje takvih biblioteka su poznati u tehnici. Postoji veliki broj komercijalno dostupnih kompleta za generisanje biblioteka prikaza faga. Postoje i drugi postupci i reagensi koji se mogu koristiti za generisanje i skrining biblioteka prikaza antitela (videti na primer US 5,223,409, WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690, Fuchs et al, Bio/Technology 9, 1370-1372
(1991), Hay ct al, Hum. Antibod. Hybridomas 3, 81-85 (1992), Husc ct al, Science 246, 1275-1281
(1989), McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990), Griffiths et al, EMBO J. 12, 725-734 (1993), Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226, 889-896 (1992), Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991), Gram et al., PNAS USA 89, 3576-3580 (1992), Garrad et al, Bio/ Technology 9, 1373-1377 (1991), Hoogenboom et al., Nuc Acid Res 19, 4133-4137 (1991) i Barbas et al, PNAS USA 88, 7978-7982
(1991)). Pogodne sekvence VLi VHnukleinske kiseline mogu biti odabrane korišćenjem nekog odgovarajućeg postupka. Na primer, VLi VHnukleinske kiseline mogu biti izabrane korišćenjem metoda utiskivanja epitopa opisanih u WO 93/06213. Biblioteke antitela, kao što su scFv biblioteke se mogu dobiti i testirati korišćenjem poznatih i pogodnih metoda (sa humanim peptidima koji sadrže CD38 kao antigen (e)), kao što su oni opisani u na primer WO92/01047, McCaffertv et al., Nature 348, 552-554
(1990) i Griffiths et al, EMBO J. 12, 725-734 (1993). Takve biblioteke antitela i druge kombinacije CD38BP-a (biblioteke, bazeni, itd) su karakteristike koje uključuju antitela predmetnog pronalaska koja se mogu koristiti terapeutski za pružanje sveobuhvatni)'eg imunog odgovora; kao alati u skrining metodama za imunogene peptide, male molekule, druga anti-CD38 antitela (npr, putem testova konkurencije), i slično; i /ili u dijagnostičkim postupcima i kompozicijama (npr imunoesej čipa sadrži panel takvih antitela koja su opciono udružena sa drugim antitelima mogu biti pripremljena standardnim tehnikama). Kada su početni humani VLi VHsegmenti odabrani, eksperimenti "mešanja i sparivanja", u kojima se različiti parovi početno odabranih VL i VHsegmenata pretražuju za vezujući peptid koji sadrži CD38, se mogu izvršiti za selekciju poželjnih kombinacija VL/VHparova. Na primer, reaktivnost peptida se može odrediti pomoću ELISA ili drugim metodama pogodnim u analizi epitopa (videti na primer Scott, J.K. and Smith, G.P. Science 249, 386-390 (1990), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378- 6382
(1990), Felici et al, J. Mol. Biol. 222, 301-310 (1991) and Kuwabara et al., Nature Biotechnology 15, 74-78 (1997) za diskusiju takvih tehnika i principa). Antitela mogu biti izabrana na osnovu njihovog afiniteta za antigen i/ili na osnovu njihovih kinetika disocijacije (off-rate) od antigena (videti na primer Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226, 889-896 (1992)).
[0419]Da bi se dalje poboljšao kvalitet i/ili različitost anti-CD38 antitela, VLi VHsegmenti VL/VHpara (-ova) mogu biti nasumično mutirani, na primer unutar CDR3 regiona VHi/ili VL, u procesu analognom sain vivoprocesom somatske mutacije odgovornom za sazrevanje afiniteta antitela tokom prirodnog imunog odgovora. Ovoin vitrosazrevanje afiniteta može se postići proširenjem VHi VLregiona korišćenjem PCR prajmera komplemetarnih sa VHCDR3 ili VLCDR3, respektivno, što su takvi prajmeri tipično "zabodeni" sa slučajnom mešavinom četiri nukleotidne baze u određenim položajima, tako da dobijeni PCR proizvodi kodiraju VHi V,. segmente u koje su nasumične uvedene mutacije u VHi/ili VLCDR3 regionima. Ovi nasumično mutirani VHi VLsegmenti mogu se ponovo ispitati za vezivanje za peptide koji sadrže CD38.
[0420]Nakon skrininga, nukleinska kiselina koja kodira izabrano antitelo može biti regenerisana iz displeja paketa (npr iz genoma faga) i subklonirana u odgovarajući vektor standardnim tehnikama rekombinantne DNK. Ukoliko se želi, takva antitelo-kodirajuća nukleinska kiselina može biti dalje manipulisana da kreira druge oblike antitela ili CD38BPs. Da eksprimira rekombinantno antitelo izolovano pretraživanjem kombinatornc biblioteke, tipično nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu koja kodira antitelo se klonira u rekombinantni ekspresioni vektor i uvodi u odgovarajuću ćeliju domaćina (ćelije sisara, ćelije kvasca, itd) pod uslovima pogodnim za ekspresiju nukleinske kiseline i proizvodnju antitela.
[0420]Visoko afinitetna peptidna antitela, kao što je humani jedno-lančani Fv (scFv) i Fab fragmenti antitela, mogu takođe biti izolovani iz takvih biblioteka korišćenjem panning tehnike u kojoj je antigen od interesa imobilizovan na čvrstoj površini, kao što su mikrotitarske ploče ili kuglice (videti na primer Barbas and Burton, Trends. Biotechnol. 14, 230-234 (1996) i Aujame et al, Hum. Antibodies 8, 155-68
(1997). Ispoljavanja na fagu iz velikih prirodnih biblioteka takođe omogućavaju da se izoluju humana antitela direktno bez imunizacije (videti na primer de Haard et al, J. Biol. Chem. 274(26), 18218-18230
(1999)).
[0422]Anti-CD38 antitela iz predmetnog pronalaska mogu biti varijanta anti-CD38 antitela. "Varijanta" anti-CD38 antitela je antitelo koje se razlikuje od roditeljskog antitela (obično je generisano imunizacijom) sa jednom ili više pogodnih izmena aminokiselinskih ostataka, odnosno supstitucija, brisanja, umetanja ili dodacima terminalnoj sekvenci, u CDRs ili drugim VH i/ili VLsekvencama (pod uslovom da je najmanje bitna količina vezujućih karakteristika za epitop od matičnog antitela zadržana, ako ne unapređena, ovim promenama).
[0423]Varijacije u jednoj varijanti antitela mogu biti u svakom od okvirnih regiona, konstantnom domenu, i/ili varijabilnim regionima (ili bilo koji ili više njihovih CDR segmenata) u jednoj varijanti antitela. Alternativno, varijacije mogu biti napravljene u samo jednom od okvirnih regiona, varijabilnih regiona (ili jednom njihovom CDR segmentu), ili konstantnom domenu u antitelu. Alanin skenirajuća tehnika mutageneze, kao što je opisano prema Cunningham and Wells, Science 244, 1081-1085 (1989), može biti korišćena za identifikaciju odgovarajućih ostataka za supstituciju ili brisanje u stvaranju CD38BPs koji sadrže varijantu VL, VH, ili posebnih CDR sekvenci, iako ostale pogodne tehnike mutageneze takođe mogu biti primenjene. Višestruke aminokiselinske supstitucije mogu takođe biti napravljene i testirane korišćenjem poznatih metoda mutageneze i skrininga, kao što su one opisane prema Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241, 53-57 (1988) ili Bovie and Sauer, PNAS USA 86, 2152-2156(1989).
[0424]Tako, na primer, u varijanti antitela jedan ili više aminokiselinskih ostataka mogu biti uvedeni ili umetnuti u ili u blizini jednog ili više hipervarijabilnih regiona roditeljskog antitela, kao što su u jednom ili više CDR segmenata. Varijanta anti-CD38 antitela može sadržati bilo koji broj umetnutih aminokiselinskih ostataka, pod uslovom ponovo da najmanje bitna količina vezujućih karakteristika za epitop od roditeljskog antitela bude zadržana. Varijanta anti-CD38 antitela može na primer, sadržati od oko 1-30 umetnutih aminokiselinskih ostataka, na primer od oko 1-10, kao što je na primer od oko 2-10, na primer od 2-5 ili kao što je od oko 1-5 umetnutih aminokiselinskih ostataka. Tsto tako, varijanta anti-CD38 antitela može na primer sadržati od oko 1-30 brisanih aminokiselinskih ostataka, na primer od oko 1-10, kao što je na primer od oko 2-10, na primer od 2-5 ili kao što je od oko 1-5 brisanih aminokiselinskih ostataka. Isto tako, varijanta anti-CD38 antitela može na primer sadržati od oko 1-30 supstituisanih aminokiselinskih ostataka, na primer od oko 1-10, kao što jc na primer od oko 2-10, na primer od 2-5 ili kao što je od oko 1-5 supstituisanih aminokiselinskih ostataka. Isto tako, varijanta anti-CD38 antitela može na primer sadržati od oko 1-30 dodataka aminokiselinskim ostacima terminalne sekvence, na primer od oko 1-10, kao što je na primer od oko 2-10, na primer od 2-5 ili kao što je od oko 1-5 dodataka aminokiselinskim ostacima terminalne sekvence. Varijanta antitela može takođe da sadrži kombinaciju od dva ili više takvih umetanja, brisanja, supstitucija i dodataka aminokiselinskom ostatku terminalne sekvence, pod uslovom da varijanta poseduje najmanje značajnu proporciju matičnih antitela sa afinitetom, specifičnošću i/ili selektivnošću u odnosu na jedan ili više epitopa CD38.
[0425]Razmatranja u odabiru varijanti antitela (npr očuvanje aminokiselinskog ostatka funkcionalnih karakteristika, očuvanje aminokiselinskih ostataka na osnovu hidropatskih karakteristika, i/ili očuvanje aminokiselinskih ostataka na osnovu tcžinc/vcličinc), su opisane na drugom mestu ovde. Tipično, aminokiselinske izmene sekvence, kao što su konzervativne varijacije supstitucije, poželjno suštinski ne menjaju stmkturne karakteristike roditeljske sekvence (npr zamena aminokiseline ne bi trebalo da teži da se poremeti sekundarna struktura koja karakteriše funkciju roditeljske sekvence). Primeri u struci priznatih polipeptidnih sekundarnih i tercijarnih struktura su opisani u, npr, Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, ed., W.H. Freeman and Companv, New York (1984)), Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)) i Thornton et al, Nature 354, 105 (1991). Dodatni principi relevantni za dizajn i konstrukciju varijanti peptida je diskutovan u, na primer Collinet et al, J Biol Chem 275 (23), 17428-33 (2000).
[0426]Varijante aminokiselinske sekvence antitela mogu se dobiti uvođenjem odgovarajućih nukleotidnih promena u nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo (na primer, mutageneze usmerene na određeno mesto) ili hemijskom sintezom peptida. Takve varijante uključuju, na primer, brisanja od, i/ili umetanja u i/ili supstitucije sa i/ili dodavanje ostataka terminalnoj sekvenci unutar aminokiselinskih sekvenci antitela ovde u primerima. Bilo koja kombinacija brisanja, umetanja, i supstitucija može biti načinjena da se dođe do željene varijante, pod uslovom da varijanta poseduje najmanje značajan procenat vezujućih karakteristika epitopa od matičnog antitela. Aminokiselinska sekvenca se menja, u odnosu na roditeljsko antitelo, takođe može se menjati post-translacionim procesima varijante antitela u odnosu na matično antitelo, kao što je promena broja ili položaja mesta glikozilacije.
[0427]Varijante antitela iz predmetnog pronalaska mogu da sadrže izmene u hipervarijabilnom regionu, kao što su u CDR segmentima. Primeri CD38BPs sadrže takve CDR varijante koje su opisane na drugom mestu ovde i kao stoje opisano gore, takvi CD38BPs mogu biti antitela.
[0428]Varijante antitela iz predmetnog pronalaska mogu da sadrže okvirne (FR) izmene, što je izvan hipervarijabilnog regiona, na primer u Fc regionu, takve promene mogu biti u vezi sa svojstvima prednosti, kao što je promena funkcije ili farmakokinetičkih svojstava antitela. Na primer, supstitucija ili druga izmena (umetanje, brisanje, dodaci terminalnoj sekvenci ili bilo koja njihova kombinacija) u okvirnom regionu ili konstantnom domenu može biti povezana sa povećanjem poluživota varijantnog antitela u odnosu na roditeljsko antitelo, ili mogu biti napravljene da izmene imunogenost varijante antitela u odnosu na roditeljsko antitelo, da obezbede mesto za kovalentno ili nc-kovalentno vezivanje za drugi molekul ili da menjaju takve osobine kao što fiksacija komplementa, koja na primer rezultira smanjenjem ili povećanjem Clq vezivanja i CDC ili FcyR vezivanja i antitelo-zavisne ćelijske citotoksičnosti (ADCC). Supstitucije mogu na primer biti napravljene u jednom ili više aminokiselinskih ostataka 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320, i 322 konstantnog regiona teškog lanca, čime se izaziva izmena u efektorskoj funkciji dok se zadržava vezivanje antigena u poređenju sa nemodifikovanim antitelom, cf. US 5,624,821 i US 5,648,260. Dalja referenca može biti WO 00/42072 koja otkriva antitela sa izmenjenim regionima Fc koji povećavaju ADCC, i WO 94/29351 otkriva antitela koja imaju mutacije u N-terminalnom regionu CH2 domena koje menjaju sposobnost antitela da se veže za FcRI i na taj način smanjuje se sposobnost antitela da se vežu za Clq što zauzvrat smanjuje sposobnost antitela da fiksiraju komplement. Nadalje, Shields et al., J. Biol. Chem. 276, 6591-6604 (2001) uči da kombinacija varijanti, poboljšava FcyRIII vezivanje, na primer T256A/S298A, S298A/E333A, i S298A/E333A/ K334A,.
[0429]In vivopoluživot antitela može takođe biti poboljšan modifikacijom popravljenog receptornog epitopa Ig konstantnog domena ili Ig-nalik konstantnog domena tako da molekul ne sadrži netaknut CH2 domen ili netaknut Ig Fc region, cf. US 6,121,022 i US 6,194,551.In vivopoluživot može dalje biti povećan mutacijama u Fc regionu, npr supstitucijom treonina sa leucinom na položaju 252, treonina sa serinom na položaju 254, ili treonina sa fenilalaninom na položaju 256, cf. US 6,277,375.
[0430]Anti-CD38 antitela predmetnog pronalaska mogu biti varijanta anti-CD38 antitela gde su potencijalni T ćelijski epitopi u antitelu smanjeni ili eliminisani racionalnim dizajnom. Tako, na primer, ujednoj realizaciji predmetni pronalazak obezbeđuje "deimunizovano" anti-CD38 antitelo u kome su potencijalni T ćelijski epitopi eliminisani. Dizajn i konstrukcija deimunizovanih anti-CD38 antitela se može postići bilo kojom pogodnim tehnikom (videti na primer WO/9852976 u pogledu postupaka za dobijanje deimunizovanih antitela). Očekuje se da imunogenost kod ljudi bude eliminisana ili značajno smanjena kada se takvi CD38BPs (na primer, varijanta anti-CD38 antitela) primenjuju.
[0431]Druge okvirne mutacije mogu uključiti promene sekvence koje mogu da smanje podložnost proteolizi, smanje podložnost oksidaciji, i/ili predstavljaju ili modifikuju druge fizičko-hemijske ili funkcionalne osobine kod udružene varijante antitela.
[0432]Varijacije aminokiselinske sekvence u okviru mogu rezultirati u izmenjenom mehanizmu glikozilacije u varijanti antitela u odnosu na roditeljsko antitelo. Izmenom se podrazumeva brisanje jedne ili više ugljenohidratnih grupa koje se nalaze u roditeljskom antitelu, i/ili dodavanje jednog ili više mesta glikozilacije koja nisu prisutna u roditeljskom antitelu. Glikozilacija antitela je tipično ili N-vezana ili O-vezana. N-vezana se odnosi na vezivanje ugljenohidratne grupe na bočni lanac asparaginskog ostatka. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja aminokiselina izuzev prolina, su uobičajene sekvence za prepoznavanje enzimskog vezivanja ugljenohidratne grupe za asparaginski bočni lanac. Tako, prisustvo bilo koje od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu može kreirati potencijalno mesto glikozilacije. O-povezana glikozilacija se odnosi na vezivanja šećera kao što su N-acetilgalaktozamin, galaktoze ili ksiloze za hidroksiamino kiselinu, najčešće scrin ili trconin, iako sc mogu koristiti 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin. Dodavanje glikozilacionih mesta na antitelu može biti pogodno postignuto izmenom aminokiselinske sekvence tako da ono sadrži jednu ili više gore opisanih tripeptidnih sekvenci (za N-vezana mesta glikozilacije). Izmena može takođe biti napravljena dodavanjem, ili supstitucijom, jednog ili više serinskih ili treoninskih ostataka u sekvenci originalnog antitela (za O-vezana mesta glikozilacije).
[0433]Antitela se takođe mogu eksprimirati u transfektomu koji ne dodaje jedinicu fukoze normalno vezanu za ugljenihidrat vezan za Asn na položaju 297 od Fc kako bi se poboljšao afinitet Fc za FcyRIII što zauzvrat dovodi do povećanog ADCC antitela u prisustvu NK ćelija, cf. Shield et al., J. Biol. Chem. 277, 26733 (2002). Druge metode modifikovanja glikozilacije sa fokusom na fukozilaciju su opisane u
WO 00/61739 prema Kyowa. Osim toga, modifikacija galaktozilacije može biti napravljena u cilju modifikacije CDC. Dalje reference mogu biti u WO 99/54342 i Umana et al., Nat. Biotechnol. 17, 176
(1999) otkrivajući CHO ćelijsku liniju konstruisanu tako da eksprimira GntUI što dovodi do ekspresije monoklonskih antitela sa izmenjenim gliko-formama i poboljšanom ADCC aktivnošću.
[0434]Druge potencijalno pogodne tehnike za pripremu novih anti-CD38 antitela uključuju CDR šetajuće mutageneze, menjanje položaja lanca antitela, "škrta mutageneza" (Balint and Larrick, Gene 137, 109-118 (1993)), i druge tehnike sazrevanja afiniteta (videti na primer Wu et al, PNAS USA 95, 6037-42 (1998)). Procedure repertoara kloniranja takođe mogu biti korisne u proizvodnji varijanti antitela (videti na primer WO 96/33279).
[0435]Postoji veliki broj tehnika poznatih za generisanje CDR varijanti, bilo koja takva pogodna tehnika ili kombinacija se mogu koristiti u kontekstu predmetnog pronalaska za generisanje CDR varijanti CDR segmenata antitela iz primera. Primeri takvih tehnika uključuju uklanjanje neesencijalnih ostataka kao što je opisano u Studnicka et al., Protein Engineering 7, 805-814 (1994) (videti takođe Soderlind et al., Immunotechnology. 4(3-4), 279-85 (1999), CDR šetajuće mutageneze i druge veštačke tehnike sazrevanja afiniteta (videti na primer Yang et al., Journal of Molecular Biology 254 (3), 392-403
(1995), CDR tehnike mešanja gde su tipično CDR segmenti umnoženi različitim setom genskih šablona koji opciono sadrže sintetske oligonukleotide, konstantne regione VL, VH, i/ili su CDR umnoženi, i različiti fragmenti pomešani (u jednolančanom ili dvolančanom obliku) i udruženi lančanom reakcijom polimeraze (PCR) da bi se proizveo set genskih proizvoda za kodiranje antitela-fragmenta koji nose mešani CDR uveden u master okvira, koji je umnožen korišćenjem eksternih prajmera koji ih vezuje za mesta koja su izvan umetnutih restrikcionih mesta da bi se obezbedila proizvodnja pune-dužine proizvoda, koji se ubacuju u vektor izbora i koriste za eksprimiranje varijanti proteina koji sadrže CDR. Odgovarajuća struktura može se odrediti baterijom od varijante/mimetičkih struktura i onih iz matičnih sekvenci, npr poređenjem NMR struktura rešenja. Korisne metode racionalnog dizajna varijanti CDR sekvenci su opisane u, na primer WO 91/09967 i WO 93/16184. Dodatni primeri takvih postupaka su obezbeđeni na drugom mestu ovde.
[0436]Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje fragmente antitela (uključujući varijante antitela) predmetnog pronalaska, takvi fragmenti imaju sposobnost da se vežu za CD38 (CD38 vezujući fragmenti). CD38BPs tako obuhvataju molekule nalik antitelima koji sadrže manju od pune tetramerske strukture povezanu sa antitelima koja sc prirodno javljaju. Fragment antitela može biti bilo koji peptid koji sadrži deo pune dužine antitela, generalno antigen vezujući ili njegov varijabilni region (ovo uključuje, na primer, fragmente humanizovanih antitela koji sadrže CDR segmente od jednog antitela prema predstavljenom pronalasku, njihove varijante ili druge CDR segmente koji omogućavaju antigenskom fragmentu da se takmiči sa antitelom iz ovog pronalaska za CD38 vezivanje). U jednom aspektu, fragment antitela se odnosi na peptid koji se suštinski sastoji ili se sastoji samo od dela molekule antitela. U jednoj realizaciji, sadašnji pronalazak obezbeđuje fragment antitela koji sadrži najmanje deo jednog varijabilnog domena teškog lanca koji sadrži jedan ili više VHCDR segmenata antitela prema predstavljenom pronalasku i opciono takođe varijabilni domen lakog lanca koji sadrži jedan ili više VLCDR segmenata antitela iz predmetnog pronalaska, pri čemu je varijabilni domen teškog lanca, i opciono varijabilni domen lakog lanca, opciono fuzionisan(i) sa dodatnom polovinom, kao što jc konstantni domen imunoglobulina. Konstantni domeni sekvenci mogu sc dodati sekvenci (ama) teškog lanca i/ili lakog lanca da formiraju vrstu sa delimičnom dužinom teškog i/ili lakog lanca (-aca). Konstantni regioni, ili njihovi delovi, od bilo kog izotipa antitela mogu se koristiti za ovu svrhu, uključujući IgG, IgM, IgA, IgD i IgE konstantne regione.
[0437]Primeri fragmenata antitela koji vezuju CD38 uključuju Fab, Fab', F(ab')2, i Fv fragmente. Fragment antitela u kontekstu ovog pronalaska može takođe da sadrži peptid koji sadrži CDR i slično. U jednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje fragment antitela koji sadrži prvi polipeptidni lanac koji sadrži bilo koji od CDR segmenata teškog lanca ovde opisanih i drugi polipeptidni lanac koji sadrži bilo koji od CDR segmenata lakog lanca ovde opisanih, gde su dva polipeptidna lanca kovalentno vezana sa jednim ili više interlančanih disulfidnih veza. U jednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje dvolančani fragment antitela koji ima takve osobine gde je fragment antitela izabran od Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, i / ili F(ab')2fragmenata.
[0438]Antitela mogu biti fragmentirana korišćenjem konvencionalnih tehnika, a fragmenti ispitivani za upotrebu na isti način kao što je opisano gore za cela antitela. Na primer, F(ab')2fragmenti mogu biti generisani tretiranjem antitela sa pepsinom. Dobijeni F(ab')2fragment može biti tretiran da redukuje disulfidne mostove u proizvodnji Fab' fragmenata. Fab fragmenti mogu biti dobijeni tretiranjem IgG antitela sa papainom; Fab' fragmenti se mogu dobiti digestijom sa pepsinom IgG antitela. Fab' fragment se može takođe proizvesti vezivanjem Fab' dole opisanog preko tioetarske veze ili disulfidne veze. Fab' fragment je fragment antitela dobijen cepanjem disulfidne veze u zglobnom regionu F(ab')2. Fab' fragment se može dobiti tretiranjem F(ab')2fragmenta sa redukcionim sredstvom, kao što je ditiotreitol. Peptidni fragmenti antitela mogu takođe biti generisani putem ekspresije nukleinskih kiselina koje kodiraju takve peptide u rekombinantnim ćelijama (videti na primer Evans et al., J. Immunol. Meth. 184, 123-38 (1995)). Na primer, himerni gen koji kodira deo F(ab')2fragmenta može uključivati DNK sekvence koje kodiraju CH1 domen i zglobni region H lanca, praćene jednim translacionim stop kodonom da se dobije takav skraćeni fragment molekule antitela.
[0439]CD38BPs takođe uključuju univalentna antitela i jednolančana antitela. Jednolančana antitela su peptidi u kojima su povezani Fv regioni teškog i lakog lanca. U jednoj realizaciji, sadašnji pronalazak obezbeđuje jednolančani Fv (scFv), pri čemu su teški i laki lanci u Fv anti-CD38 antitela iz predmetnog pronalaska spojeni sa fleksibilnim peptidnim linkerom (tipično od oko 10, 12, 15 ili više aminokiselinskih ostataka) u jednom peptidnom lancu. Metode za produkciju takvih antitela su opisane u na primer US 4,946,778, Pluckthun in The Pharmacologv of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, str. 269-315 (1994), Bird et al, Science 242, 423-426 (1988), Huston et al, PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) i McCaffertv et al., Nature 348, 552-554 (1990). Jednolančano antitelo može biti jednovalentno, ako se koriste samo jedan VHi VL, bivalentno, ako se koriste dva VH i VL, ili polivalentno, ako se koriste više od dva VHi VL.
[0440]Ujednoj realizaciji predmetnog pronalaska, CD38BP može biti deri vatizo van ili vezan za drugi funkcionalni molekul, na primer drugi peptid ili protein (kao što je Fab<1>fragment) za generisanje bispccifičnog ili multispccifičnog molekula koji sc vezuje za više mesta vezivanja ili ciljnih epitopa. Na primer, antitelo iz predmetnog pronalaska može biti funkcionalno povezano (npr hemijskim kuplovanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnim udruživanjem ili drugačije) za jedan ili više drugih vezujućih molekula, kao što su drugo antitelo, peptid ili vezujući mimetik. Ujednoj varijanti, CD38BP je antitelo predmetnog pronalaska.
[0441]Prema tome, predmetni pronalazak obuhvata bispecifične i multispecifične molekule koji sadrže najmanje jednu prvu specifičnost vezivanja za CD38 i drugu specifičnost vezivanja za drugi ciljni epitop. Ujednoj realizaciji predmetnog pronalaska, drugi ciljni epitop je Fc receptor, npr humani FcyRI (CD64) ili humani Fca receptor (CD89) ili receptor T ćelija, npr CD3. Ujednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifične i multispecifične molekule sposobne da se vežu kako za FcyR, FcaR ili FceR koje eksprimiraju efektorske ćelije (npr monociti, makrofagi ili polimorfonuklearne ćelije (PMN)) i da ciljaju ćelije koje eksprimiraju CD38. Ovi bispecifični i multispecifični molekuli ciljaju ćelije koje eksprimiraju CD38 do efektorskih ćelija i aktiviraju Fc receptorom-posredovane efektorske ćelijske aktivnosti, poput fagocitoze ćelija koje eksprimiraju CD38, antitelo zavisne ćelijske citotoksičnosti (ADCC), oslobađanje citokina ili generaciju superoksidnog anjona.
[0442]Bispecifični i multispecifični molekuli predmetnog pronalaska mogu dalje da uključe treću specifičnost vezivanja, pored anti-Fc vezujuće specifičnosti i izvesne anti-CD38 vezujuće specifičnosti. U jednom izvođenju, treća vezujuća specifičnost je izvestan deo faktora anti-pojačanja (EF), npr molekul koji se vezuje za površinski protein uključen u citotoksičnom dejstvu i time povećava imuni odgovor protiv ciljne ćelije, "deo anti-inhenser faktora" može biti antitelo, funkcionalni fragment antitela ili ligand koji se vezuje za dati molekul, npr antigen ili receptor, a time dovodi do pojačanja efekata vezujućih determinanti za Fc receptor ili ciljni ćelijski antigen, "deo anti-inhenser faktora" može vezati Fc receptor ili ciljani ćelijski antigen. Alternativno, deo faktora anti-inhensera se može vezati za entitet koji je različit od entiteta prema kome se prva i druga vezujuća specifičnost vezuju. Na primer, deo faktora anti-inhensera može vezati citotoksičnu T ćeliju (npr, preko CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ili drugih imunih ćelija što rezultira povećanjem imunog odgovora protiv ciljne ćelije).
[0443]U jednoj realizaciji, bispecifični i multispecifični molekuli predmetnog pronalaska sadrže kao specifičnost za vezivanje najmanje jedno dodatno antitelo, uključujući, npr., Fab, Fab', F(ab')2, Fv ili scFv. Dalje antitelo može takođe biti dimer lakog lanca ili teškog lanca, ili bilo koji njihov minimalan fragment kao što je Fv ili jednolančani konstrukt kao što je opisano u Ladner et al., US 4,946,778. Antitelo može takođe biti imunoglobulinski fuzioni protein vezujućeg domena kao što je opisano u US 2003/0118592 i US 2003/0133939.
[0444]U jednoj realizaciji, specifičnost vezivanja za Fc receptor je obezbeđena humanim monoklonskim antitelom, čije vezivanje nije blokirano od strane humanog imunoglobulina G (IgG). Kako se ovde koristi, izraz "IgG receptor" se odnosi na bilo koji od osam y-lanaca gena lociranih na hromozomu 1. Ovi geni kodiraju ukupno dvanaest transmembranskih ili rastvorljivih izoformi receptora koje su grupisane u tri klase Fc<*>receptora FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16). U jednoj realizaciji, Fcy receptor je humani visokog afiniteta FcyRI. Proizvodnja i karakterizacija ovih monoklonskih antitela jc opisana od strane Fangcr ct al., u WO 88/00052 i u US 4,954,617. Ova antitela se vezuju za epitop FcyRI, FcyPJI ili FcyPJII na mestu koje je različito od Fcy mesta vezivanja na receptom i tako njihovo vezivanje nije blokirano značajno fiziološkim nivoima IgG. Specifična anti-FcyRI antitela korisna u predmetnom pronalasku su mAt 22, mAt 32, mAt 44, mAt 62 i mAt 197. U drugim realizacijama, anti-Fcy receptora antitelo je humanizovani oblik mAt 22 (H22). Proizvodnja i karakterizacija H22 antitela je opisana u Graziano, R.F. et al., J. Immunol. 155 (10), 4996-5002 (1995) i WO 94/10332. Ćelijska linija proizvedena H22 antitelima je deponovana u American Type Culture Collection 4. novembra 1992. godine pod oznakom HA022CL1 i ima pristupni broj CRL 11177.
[0445]Ujednoj varijanti, specifičnost vezivanja za receptor Fc je obezbeđena antitelom koje se vezuje za humani IgA receptor, npr Fca receptor (Fcal (CD89)), vezivanje koje u jednom aspektu nije blokirano od strane humanog imunoglobulina A (IgA). Izraz "IgA receptor" namerava da uključi proizvod gena jednog a-gena (FcaRI) koji se nalazi na hromozomu 19. Ovaj gen je poznato da kodira nekoliko alternativno spojenih transmembranskih izoformi od 55 do 110 kDa. FcaRI (CD89) je konstitutivno eksprimiran na monocitima/makrofagima, eozinofilnim i neutrofilnim granulocitima, ali ne i na ne-efektorskim ćelijskim populacijama. FcaRI ima srednji afinitet za oba IgAl i IgA2, koji je povećan nakon izlaganja citokinima kao što je G-CSF ili GM-CSF (Morton, H.C. et al, Critical Reviews in Immunologv 16, 423-440 (1996)). Četiri FcaRI-specifična monoklonska antitela, identifikovana kao A3, A59, A62 i A77, koja vezuju FcaRI izvan IgA ligand vezujućeg domena, su opisana (Monteiro, RC. et al., J. Immunol. 148, 1764 (1992)).
[0446]FcaRI, FcyRI, FcyRII i FcyRIII, naročito FcyRII i FcyRIII, su primeri okidač receptora za upotrebu u predmetnom pronalasku jer su oni (1) eksprimirani prvenstveno na imunim efektorskim ćelijama, npr monocitima, PMN, makrofagima i dendritskim ćelijama; (2) izraženi u visokim nivoima (npr 5,000-100,000 po ćeliji); (3) posrednici citotoksičnih aktivnosti (na primer ADCC, fagocitoza); i (4) posreduju pojačanu prezentaciju antigena, uključujući samo-antigene, ciljane za njih.
[0447]U jednom izvođenju, CD38BP predmetnog pronalaska je multispecifično anti-CD38 antitelo ili molekul nalik antitelu, poseban takav primer je neko bispecifično antitelo koje sadrži najmanje jedan par VHsekvence i VLsekvence lanaca specifičnih za epitop koji se sastoji najmanje delimično u CD38 i drugo najmanje jednog para VHi VLsekvence lanaca specifičnih za drugi epitop. VHi VLsekvence u bispecifičnom antitelu mogu da sadrže kompletne VHi VLsekvence koje odgovaraju anti-CD38 VHi VLregionima, varijante VH i/ili VLsekvence, ili odgovarajuće delove VH i/ili VLregiona, kao što je odgovarajuća kombinacija CDR sekvenci i drugih sekvenci dovoljna da obezbedi vezivanje za epitope od interesa.
[0448]Primeri bispecifičnih molekula antitela sadrže (i) dva antitela jedno sa specifičnošću za CD38 i drugo za drugu metu koja su zajedno konjugovana (ii) jedno antitelo koje ima jedan lanac specifičan za CD38 i drugi lanac specifičan za drugi molekul, i (iii) jedan lanac antitela koje ima specifičnost za CD38 i drugi molekul. Tipično, druga meta/drugi molekul je molekul izuzev CD38. Ujednoj realizaciji, drugi molekul je antigen kancera/ tumorski povezan antigen kao što je karcinoembrionalni antigen (CEA), specifični antigen prostate (PSA), RAGE (antigen bubrega), a-fetoprotein, CAMEL (CTL-prepoznat antigen kod melanoma), CT antigeni (kao što su Magc-B5, -B6, -C2, -C3, i D; Magc-12; CT10; NY-ESO-1, SSX-2, GAGE, BAGE, MAGE, i SAGE), mucinski antigeni (npr MUCI, mucin-CA125 itd), gangliozid antigeni, tirozinaza, gp75, C-myc, Marti, MelanA, MUM-1, MUM-2, MUM-3, HLA-B7 i Ep-CAM . U jednoj realizaciji, drugi molekul je kancer-udruženi integrin, kao što je a5|33 integrin. U jednoj realizaciji, drugi molekul je angiogeni faktor ili drugi faktor rasta povezan sa kancerom, kao što je vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF), faktor rasta fibroblasta (FGF), epidermalni faktor rasta (EGF), epidermalni faktor rasta receptor (EGFR), angiogenin i njihove receptore, naročito receptore povezane sa progresijom kancera (recimo jedan od HER1-HER4 receptora). Ostali proteini progresijom-povezanih kancera koji su ovde diskutovani takođe mogu biti pogodni drugi molekuli. U jednoj realizaciji, drugi molekul je molekul eksprimiran na površini ćelija multiplog mijeloma kao što je CD138.
[0449]U jednom aspektu, bispecifično antitelo predmetnog pronalaska je dvojno antitelo.[0450]Bispecifična antitela takođe uključuju umrežena ili "heterokonjugat" antitela. Na primer, jedno od antitela u jednom heterokonjugatu može biti spojeno sa avidinom a drugo sa biotinom. Takva antitela su, na primer, predložena da ciljaju ćelije imunog sistema do neželjenih ćelija (videti na primer US 4,676,980). Heterokonjugati antitela se mogu napraviti korišćenjem bilo koje pogodne metode umrežavanja. Pogodni peptidni agensi za unakrsno vezivanje i tehnike su dobro poznate u tehnici, i primeri takvih agenasa i tehnika su opisani na primer u US 4,676,980.
[0451]Stoga, iako se diskusija ovde može fokusirati na antitela, treba shvatiti da se realizacije i karakteristike antitela mogu podjednako primeniti na fragmente antitela, kao što su Fab fragmenti, Fab' fragmenti, i scFv peptida, antitela nalik peptidima (peptidi koji sadrže CDR), bi- i multi-specifična antitela i druge CD38BPs, kao odgovarajuće, pod uslovom da CD38BP iz predmetnog pronalaska zadržava najmanje značajan procenat antigen-vezujućih svojstava iz odgovarajućeg kompletnog antitela. U nekim slučajevima, fragmenti antitela mogu biti povezani sa nižim afinitetom za vezivanje antigena, ali mogu ponuditi druge karakteristike prednosti koje se mogu nadoknaditi za svaki takav gubitak u afinitetu.
[0452]Anti-CD38 antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom, mogu biti izabrana na osnovu njihove sposobnosti da obezbede sposobnost fiksacije komplementa, ili ne. Postoje brojni izotipovi antitela koja su sposobna za fiksaciju komplementa i CDC, uključujući, bez ograničenja, sledeće: mišji IgM, mišji IgG2a, mišji IgG2b, mišji IgG3, humani IgM, humani IgGl, i humani IgG3. Ti izotipovi koji ne uključuju, bez ograničenja, humani IgG2 i humani IgG4. Određivanje izotipa i druge metode za modifikaciju fiksacije komplementa i CDC funkcionalne karakteristike antitela su poznate u tehnici.
[0453]CD38BPs ovde opisani takođe obuhvataju imunoadhezine, koji su takvi molekuli gde su jedan ili više CDRs iz anti-CD38 antitela kovalentno ili nekovalentno povezani sa molekulom. Izvestan imunoadhezin može inkorporirati CDRs kao deo većeg polipeptidnog lanca, može kovalentno vezati CDRs na drugi polipeptidni lanac, ili može ugraditi CDRs nekovalentno. CDRs dozvoljavaju imunoadhezinu da se specifično veže za CD38.
[0454]Antitela predmetnog pronalaska mogu takođe biti obezbeđena kao CD38BP fuzioni proteini. CD38BP fuzioni proteini mogu da sadrže bilo koju pogodnu sekvencu amino kiseline ili kombinaciju sekvenci koje su specifične i/ili selektivne za najmanje jedan domen koji je bar delimično obuhvaćen unutar CD38 (npr anti-CD38 antitelo VHdomen, VLdomen ili posebno CDR istog) i najmanje jednu nehomolognu i tipično značajno nesličnu aminokiselinsku sekvencu (npr, manje od oko 40%, manje od oko 35%o, manje od oko 30%>, manje od oko 25%, ili manje od oko 20% identičnosti aminokiselinske sekvence sa CD38-specifičnom/selektivnom sekvencom) koja daje merljivu biološku funkciju i/ili karakteristike za fuzioni protein koje ne mogu samo da bude pripisane CD38-specifičnoj/selektivnoj sekvenci (npr povećanjein vivopolu-života, fluorescencija, povećanje ciljanja za određeni tip ćelija, itd). Funkcionalne sekvence takvih fuzionih proteina mogu da se razdvoje fleksibilnim veznikom (-cima). Sekundarna sekvenca (e) se takođe mogu izvesti iz citotoksičnih ili apoptotičkih peptida. Sekundarne sekvence mogu takođe dati dijagnostičke karakteristike. Primeri takvih sekvenci obuhvataju one izvedene iz lako vidljivih enzima kao što je peroksidaza rena.
[0455]CD38BP fuzioni proteini mogu takođe biti okarakterisani sadržajem oznake epitopa. Označena epitop sekvenca je aminokiselinska sekvenca koja ima dovoljno ostataka da obezbedi epitop protiv koga može da se izradi antitelo, u kontekstu CD38BP, ipak je dovoljno kratka tako da suštinski ne ometa aktivnosti (selektivnost, specifičnost, afinitet, i / ili biološku aktivnost) CD38BP (u poređenju sa roditeljskim CD38BP kome nedostaje označen epitop). Oznaka (tag) epitopa je poželjno dovoljno jedinstvena tako da antitelo anti-epitop oznake ne reaguje suštinski unakrsno sa drugim epitopima. Odgovarajući označeni polipeptidi generalno imaju najmanje oko 6 aminokiselinskih ostataka i obično između oko 8-50 aminokiselinskih ostataka (npr oko 9-30 ostataka). Primeri oznaka epitopa uključuju grip HA oznaku polipeptida i njegovog 12CA5 antitela (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159-2165
(1988)); c-myc tag i 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 i 9E10 antitela uz nju (Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5 (12), 3610-3616 (1985)) i Herpes Simpleks virus glikoprotein D (gD) oznaku i njegovo antitelo (Paborsky et al., Protein Engineering 3 (6), 547-553 (1990)). U izvesnim izvođenjima, oznaka epitopa je "spasonosni receptor za vezivanje epitopa". Kako se ovde koristi, izraz "spasonosni receptor koji vezuje epitop" se odnosi epitop Fc regiona IgG molekula (na primjer IgGl, IgG2, IgG3 ili IgG4) koji je odgovoran za povećanjein vivoserumskog polu-života IgG molekula.
[0456]CD38BPs iz ovog pronalaska takođe obuhvataju CD38BP derivate. Derivat je peptid u kome je jedan ili više aminokiselinskih ostataka peptida hemijski modifikovano (npr alkilacijom, acilovanjem, formiranjem estra ili amida) ili kovalentnim vezivanjem sa jednim ili više heterolognih supstituenata (npr lipofilnim supstituentom, PEG molekulom, peptidom bočnog lanca povezanog pogodnim organskim ostatkom linkera, itd). Peptid takođe može biti konjugovan sa terapijskom grupom, kao što je citotoksin, hemoterapeutski lek, imunosupresor ili radioaktivni izotop (takozvani imunokonjugati). Uopšteno, CD38BPs ovde opisani mogu biti modifikovani uključivanjem bilo kojeg pogodnog broja takvih modifikovanih aminokiselina i/ ili asocijacijama sa takvim konjugovanim supstituentima. Prikladnost u ovom kontekstu generalno je određena sposobnošću da bar suštinski zadrže CD38 selektivnost i/ili specifičnost povezane sa ne-izvedenim roditeljskim CD38BP-om. Uključivanje jedne ili više modifikovanih aminokiselina može biti korisno u, na primer, (a) povećanju polu-života serumskog polipeptida, (b) smanjenju antigenosti polipeptida, ili (c) povećanju polipeptidne stabilnosti skladištenja. Aminokiselina(e) su modifikovane, na primer, ko-translaciono ili post-translaciono tokom rekombinantne proizvodnje (npr., N-povezana glikozilacija na N-X-S/T motivima tokom ekspresije u ćelijama sisara) ili modifikovane pomoću sintetičkih sredstava. Neograničavajući primeri modifikovanih amino kiselina obuhvataju glikozilovanu aminokiselinu, sulfatnu aminokiselinu, prenilovanu (npr, farnezilovanu, geranilgeranilovanu) aminokiselinu, acetilovanu aminokiselinu, acilovanu aminokiselinu, PEGilovanu aminokiselinu, biotinilovanu aminokiselinu, karboksilovanu aminokiselinu, fosforilovanu aminokiselinu i slično. Reference adekvatne kao vodič za jednog od stručnjaka u modifikaciji aminokiselina su prepune u literaturi. Primeri protokola se nalaze u Walker (1998) Protein protocols on Cd-Rom, Humana Press, Towata, NJ. Modifikovana aminokiselina može biti izabrana od glikozilovane aminokiseline, PEGilovane aminokiseline, farnezilovane aminokiseline, acetilovane aminokiseline, biotinilovane aminokiseline, amino kiseline/konjugovane sa lipidnom grupom, i amino kiseline konjugovane sa organskim derivatizujućim sredstvom.
[0457]Dodatno, antitela mogu biti hemijski modifikovana kovalentnim vezivanjem za polimer da se na primer poveća njihov cirkulišući poluživot. Primeri polimera i metode za njihovo vezivanje za peptide, ilustrovane su na primer u US 4,766,106, US 4,179,337, US 4,495,285 i US 4,609,546. Dodatni ilustrativni polimeri uključuju polioksietilovane poliole i polietilen glikol (PEG) (npr PEG molekulske mase između oko 1,000 i oko 40,000, kao što je između oko 2000 i oko 20,000, npr oko 3,000-12,000).
[0458]U jednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje CD38BP koji je konjugovan sa drugim molekulom koji je izabran od jednog radionuklida, jednog enzima, jedne enzimske podloge, jednog kofaktora, jednog fluorescentnog markera, jednog hemiluminiscentnog markera, jednog peptidnog taga ili magnetne čestice. U jednoj realizaciji, CD38BP može biti konjugovan sa jednim(om) ili više fragmenata antitela, nukleinskih kiselina (oligonukleotida), nukleaza, hormona, imunomodulatora, helatora, jedinjenja bora, fotoaktivnih agenasa, boja, i slično. Ovi i drugi pogodni agensi mogu biti kuplovani ili direktno ili indirektno sa CD38BPs iz predmetnog pronalaska. Jedan primer posrednog kuplovanja drugog agensa je kuplovanje pomoću ostatka za razdvajanje. Ovi agensi za razdvajanje, zauzvrat, mogu biti ili ncrastvorljivi ili rastvorljivi (videti na primer Dicncr ct al., Science 231, 148
(1986)) i mogu biti izabrani da omoguće oslobađanje leka iz CD38BP na ciljanom mestu i/ili pod određenim uslovima. Dodatni primeri terapeutskih agenasa koji se mogu spajati sa CD38BP-ima uključuju lektine i fluorescentne peptide.
[0459]Ujednoj realizaciji, obezbeđeni su derivati CD38BPs koji sadrže jednu ili više radioobeleženih aminokiselina. Radioaktivno obeleženi CD38BPs se mogu koristiti i u dijagnostičkim i terapijskim svrhama (konjugacija sa radioaktivno obeleženim molekulima je još jedna moguća osobina). Neograničavajući primeri obeleživača za polipeptide obuhvataju, ali nisu ograničeni na<3>H,14C,<15>N,35S,<90>Y,9<9>Tc,<125>I,131I i<186>Re. Postupci za dobijanje radioaktivno obeleženih aminokiselina i srodnih peptidnih derivata su poznati u tehnici (videti na primer Junghans et al., in Cancer Chemotherapv and Biotherapv 655-686 (2d edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) i US 4,681,581, US 4,735,210, US 5,101,827, US 5,102,990 (US RE35,500), US 5,648,471 i US 5,697,902. Na primer, radioizotop može biti konjugovan pomoću hloramin T postupka.
[0460]Pogodni radionuklidi u dijagnostičkim kontekstima su izotopi indijuma i u kontekstu terapeutskih primena izotopi itrijuma, koji su citotoksični. Foton-emitujući radioizotopi, generalno, imaju prednost u dijagnostici (radioimunoscintigrafijske (RIS) metode). Auger elektroni imaju veoma kratku dužinu putanje (5-10 nm) i treba da budu internalizovani da bi bili citotoksični (videti na primer Adelstein et al., Nucl. Med. Biol. 14, 165-169 (1987)). Shodno tome, peptidi konjugovani sa takvim izotopima mogu biti korisni u dijagnostičkim postupcima, ali samo peptide koji su internalizovani treba razmotriti za radioizotope koji emituju Auger elektrone u terapijskim kontekstima. Alfa čestice treba da budu blizu ćelija (u okviru 3-4 prečnika ćelija) da bi bile efikasne kao terapijska sredstva (Vriesendorp et al., "Radioimmunoglobulin therapv", in High Dose Cancer Therapv Armitage et al., (eds). (Williams & Wilkins, Baltimore, Md. 1992)). I Auger elektroni i alfa emiteri se mogu smatrati da imaju visoku selektivnost jer njihove emisije kratkog dometa obično ne zrače susedne normalne ćelije.
[0461]Radiometali mIn i<90>Y su, respektivno jedan čist y-emitter i jedan čist p-emitter. Jod-125, najčešće korišćen emiter auger elektrona, ima poluživot od oko 60 dana i često se oslobađa iz imunokonjugatain vivo(zbog dehalogenizacija). Najčešće razmatrani alfa emiteri za kliničku upotrebu, astatin-211 i bizmut-212, imaju relativno kratke polu-živote (7,2 hi 1,0 h, respektivno) i raspadaju se u radioaktivne izotope koji možda ne mogu biti zadržani od strane imunokonjugata nakon prve alfa emisije (Wilbur, Antibiot. Immunoconjug. Radiopharm. 4, 5-97 (1991)). Za dijagnostičku primenu, mogu se koristiti CD38BPs označeni indijumom-111 ili tehnecijumom-99m. Oba ova izotopa emituju gama zrake unutar odgovarajućeg raspona energije za snimanje, (100-250 keV). Energije ispod ovog opsega, tipično ne prodiru dovoljno da dostignu eksterni uređaj za snimanje. Viši nivoi energije se teško kolimiraju i daju dijagnostičke snimke sa slabom rezolucijom. Kratak poluraspad<99>Tc obično ograničava njegovu upotrebu u imunokonjugatima sa brzom apsorpcijom tumora.
[0462]U jednoj realizaciji, obezbeđeni su prvi i drugi CD38BPs konjugovani sa prvim i drugim radioizotopima. U drugoj realizaciji, obezbeđen je jedan CD38BP konjugovan sa dva radioaktivna izotopa. Prednost korišćenja dva odvojena radioaktivna izotopa, na primer, jednog za snimanje i jednog u terapiji, jc u tome što sc tako olakšava bolesničko lcčcnjc. Niska količina radioaktivnosti koja sc koristi dijagnostički ne predstavlja opasnost od zračenja, dok će zračenje koje emituje terapijski izotop, kao što je čist P-emiter, tipično u velikoj meri biti apsorbovano u blizini ciljnih ćelija.
[0463]Radioizotopi mogu biti vezani direktno ili indirektno na CD38BP. Radioizotopi<l25>I,<n>'l,<99>Tc,1<86>Re j<188>Re mogu biti, na primer, kovalentno vezani za proteine (uključujući antitela) putem aminokiselinskih funkcionalnih grupa. Za radioaktivni jod obično preko fenolne grupe nađene na tirozinu. Postoje brojne metode da se ovo izvrši: hloramin-T (videti na primer Greenvvood et al, Biochem J. 89, 114-123 (1963) i jodogen (Salacinski et al, Anal. Biochem. 117, 136-146 (1981)). Tc i Re izotopi mogu biti kovalentno vezani preko sulfhidrilne grupe cisteina (videti na primer Griffiths et al., Cancer Res. 51, 4594-4602 (1991)). Međutim, takve kompozicije mogu biti relativno pogodnije za dijagnostičke svrhe pošto telo često kida ove kovalentne veze, oslobađajući radioizotope u cirkulatorni sistem.
[0464]CD38BP može da bude obeležen i enzimima koji su korisni za detekciju, kao što je peroksidaza rena, P-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza, glukozna oksidaza i slično. CD38BP takođe može obeležen biotinom, i shodno detektovan putem indirektnih merenja vezivanja avidina ili streptavidina. CD38BP može takođe biti obeležen sa unapred određenim polipeptidnim epitopima koje prepoznaje sekundarni reporter (npr par sekvenci leucinskog zatvarača, vezivna mesta za sekundarna antitela, domeni za vezivanje metala, epitopske oznake, itd). Dodatni primeri kandidata kao enzimskih konjugata uključuju malat dehidrogenazu, stafilokoknu nukleazu, delta-V-steroid izomerazu, alkohol dehidrogenazu kvasca, a-glicerofosfat dehidrogenazu, triozafosfat izomerazu, asparaginazu, oksidaze glukoze, ribonukleazu, ureazu, katalazu, glukoza-6-fosfat dehidrogenazu, glukoamilazu i acetilholinesterazu.
[0465]Dodatni primeri grupa za obeležavanje generalno uključuju, ali nisu ograničeni na spinske obeleživače molekula i druge grupe za označavanje od dijagnostičke vrednosti.
[0466]Ujednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje umrežene derivate CD38BP-a. Na primer, takav derivat CD38BP-a se može proizvesti unakrsnim vezivanjem dva ili više antitela, od kojih je najmanje jedno specifično/selektivno za CD38 (istog tipa ili različitih tipova, npr da kreiraju bispecifična antitela). Pogodni umreživači uključuju one koji su heterobifunkcionalni, koji imaju dve različite reaktivne grupe razdvojene odgovarajućim sredstvom za razdvajanje (npr m-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid estar) ili homobifunkcionalni (npr disukcinimidil suberat). Takvi linkeri su dostupni preko Pierce Chemical Companv, Rockford, III.
[0467]CD38BP-i mogu takođe biti konjugovani sa bilo kojim pogodnim tipom hemijske grupe, kao što je polietilen glikol (PEG), metil ili etil grupa, ili ugljenohidratna grupa. Ove i druge pogodne konjugovane grupe mogu se koristiti za poboljšanje bioloških karakteristika CD38BP-a, npr za povećanje polu-života u serumu, rastvorljivosti i / ili tkivnog vezivanja.
[0468]CD38BP derivati se mogu proizvesti hemijskom konjugacijom radioizotopa, proteina, ili drugog agensa/ostatka/jedinjenja u (a) N-terminalnom delu ili C-terminalnom delu CD38BP-a ili njegove podjedinice (npr H lanac, L lanac anti-CD38 antitela, ili anti-CD38 specifičan/selektivan fragment) odgovarajuće supstituentne grupe ili bočnog lanca ili (b) lancu šećera u CD38BP (videti, npr, Antibodv Engineering Handbook, edited by Osamu Kanemitsu, published by Chijin Shokan (1994)). Derivati mogu takođe biti generisani konjugacijom na internim ostacima ili šećera, gde je pogodno.
[0469]CD38BPs mogu takođe biti derivatizovani sa agensima detekcije, na primer fluorescentnim jedinjenjima, uključujući fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, 5-dimetilamin-l-naftalensulfonil hlorid, fosfolantanide i slično. Dodatni primeri pogodnih fluorescentnih oznaka uk<l>jučuju<125>EU oznaku, izotiocijanat oznaku, fikoeritin oznaku, fikocijanin oznaku, alofikocijan oznaku, o-ftaldehid oznaku, fluoreskamin oznaku i si. Primeri hemiluminiscentnih oznaka uključuju luminalne oznake, izoluminalne oznake, aromatične akridinijum estarske oznake, imidazol oznake, akridinijum oznake soli, oksalat estar oznake, luciferin oznake, luciferaza oznake, ekvorin oznake, itd.
[0470]Ujednoj realizaciji, derivat CD38BP-a sadrži konjugovanu nuklcinsku kiselinu ili molekul vezan za nukleinsku kiselinu. U jednoj takvoj koncepciji, konjugovana nukleinska kiselina je citotoksična ribonukleaza. U jednoj realizaciji, konjugovana nukleinska kiselina je antisens nukleinska kiselina (na primer S100A10 cilja antisens molekul, koji takođe može biti nezavisna komponenta u kombinovanoj kompoziciji ili postupku kombinovane primene kao što je ovde opisano-videti na primer Zhang et al, J Biol Chem. 279(3), 2053-62 (2004)). Ujednoj realizaciji, konjugovana nukleinska kiselina je inhibitorni RNK molekul (npr siRNA molekul). U jednoj realizaciji, konjugovana nukleinska kiselina je imunostimulatorna nukleinska kiselina (npr imunostimulatorni CpG motiv koji sadrži DNK molekul). U jednoj realizaciji, konjugovana nukleinska kiselina je ekspresiona kaseta kodirana za ekspresiju tumor supresornog gena, vakcine protiv raka, anti-kancer citokina ili apoptoznog agensa. Takvi derivati takođe mogu sadržati konjugacije nukleinskih kiselina kodiranih za ekspresiju jednog ili više citotoksičnih proteina, kao što su biljni i bakterijski toksini.
[0471]U jednoj realizaciji, CD38BP je konjugovan sa funkcionalnim molekulom nukleinske kiseline. Funkcionalne nukleinske kiseline uključuju antisens molekule, uplitanja molekula nukleinskih kiselina (npr, siRNK molekula), aptamere, ribozime, molekule koje formiraju tripleks, i spoljne vodič sekvence. Funkcionalni molekuli nukleinske kiseline mogu da deluju kao efektori, inhibitori, modulatori i stimulatori specifične aktivnosti posedovane ciljnim molekulom, ili funkcionalne molekule nukleinske kiseline mogu posedovati de novo aktivnost nezavisnu od bilo koje druge molekule. Reprezentativan uzorak metoda i tehnika koje pomažu u dizajnu i korišćenju antisens molekula se može naći u sledećoj neograničavajućoj listi američkih patenata: US 5,135,917, US 5,294,533, US 5,627,158, US 5,641,754, US 5,691,317, US 5,780,607, US 5,786,138, US 5,849,903, US 5,856,103, US 5,919,772, US 5,955,590, US 5,990,088, US 5,994,320, US 5,998,602, US 6,005,095, US 6,007,995, US 6,013,522, US 6,017,898, US 6,018,042, US 6,025,198, US 6,033,910, US 6,040,296, US 6,046,004, US 6,046,319 i US 6,057,437.
[0472]Ujednoj realizaciji, CD38BP je konjugovan sa aptamerom. Aptameri su molekuli koji interaguju sa ciljnim molekulom, na primer na specifičan način. Tipično aptameri su male nukleinske kiseline u rasponu od 15-50 baza u dužini savijenih u definisane sekundarne i tercijarne strukture, kao što su matične petlje ili G-kvartcti. Aptameri mogu vezati male molekule, kao što su ATP (US 5,631,146) i teofilin (US 5,580,737), kao i velike molekule, kao što su reverzne transkriptaze (US 5,786,462) i trombin (US 5,543,293). Reprezentativni primeri kako se prave i koriste aptameri da vezuju veliki broj različitih ciljnih molekula se mogu naći u sledećoj neograničavajućoj listi američkih patenata: US 5,476,766, US 5,503,978, US 5,631,146, US 5,731,424, US 5,780,228, US 5,792,613, US 5,795,721, US 5,846,713, US 5,858,660, US 5,861,254, US 5,864,026, US 5,869,641, US 5,958,691, US 6,001,988, US 6,011,020, US 6,013,443, US 6,020,130, US 6,028,186, US 6,030,776 i US 6,051,698.
[0473]Antitela predmetnog pronalaska mogu biti obezbeđena kao CD38BP koji je konjugovan sa ribozimom. Ribozimi su molekuli nukleinske kiseline, koji su sposobni da katalizuju hemijske reakcije, bilo intramolekularno ili intermolekularno. Ribozimi su stoga katalitičke nukleinske kiseline. Postoji veliki broj različitih tipova ribozima koji katalizuju reakcije tipa nukleaze ili polimeraze nukleinske kiseline koje sc zasnivaju na ribozima pronađenim u prirodnim sistemima, kao što (a) čekičasti ribozimi, (opisano u na primer US 5,334,711, US 5,436,330, US 5,616,466, US 5,633,133, US 5,646,020, US 5,652,094, US 5,712,384, US 5,770,715, US 5,856,463, US 5,861,288, US 5,891,683, US 5,891,684, US 5,985,621, US 5,989,908, US 5,998,193, US 5,998,203, WO 9858058, WO 9858057 i WO 9718312), (b), ukosnički ribozimi (opisani u na primer US 5,631,115, US 5,646,031, US 5,683,902, US 5,712,384, US 5,856,188, US 5,866,701, US 5,869,339 i US 6,022,962), i (c) tetrahimen ribozimi (opisano u na primer US 5,595,873 i US 5,652,107). Postoje brojni ribozimi koje nisu pronađeni u prirodnim sistemima, ali koji su projektovani da katalizuju specifične reakcije de novo (primeri koji su opisani u na primer US 5,580,967, US 5,688,670, US 5,807,718 i US 5,910,408). Ribozimi tipično prilepljuju RNK ili DNK supstrat, a češće prilepljuju RNK supstrat. Ribozimi obično prilepljuju supstrate nukleinske kiseline putem prepoznavanja i vezivanja ciljnog supstrata sa kasnijim cepanjem. Ovo prepoznavanje se često zasniva uglavnom na kanonskoj ili ne-kanonskoj osnovi interakcije parova. Ova osobina čini ribozime posebno dobrim kandidatima za ciljno specifično cepanje nukleinskih kiselina iz razloga prepoznavanja ciljne podloge koja se zasniva na sekvenci ciljnih supstrata. Reprezentativni primeri kako se prave i koriste ribozimi kako bi podstakli niz različitih reakcija se može naći u sledećoj neograničavajućoj listi američkih patenata: US 5,646,042, US 5,693,535, US 5,731,295, US 5,811,300, US 5,837,855, US 5,869,253, US 5,877,021, US 5,877,022, US 5,972,699, US 5,972,704, US 5,989,906 i US 6,017,756.
[0474]Antitela predmetnog pronalaska mogu biti obezbeđena u obliku CD38BP-a koji je konjugovan sa tripleks obrazujućom funkcijom nukleinske kiseline. Takvi molekuli nukleinske kiseline mogu da interaguju bilo sa dvolančanom ili jednolančanom nukleinskom kiselinom. Kada tripleks molekuli interaguju sa ciljnim regionom, formira se struktura nazvana tripleks, u kome tri lanca DNK formiraju kompleks zavistan od oba Watson-Crick i Hoogsteen uparivanja baza. Tripleks molekuli mogu da vezuju ciljne oblasti sa visokim afinitetom i specifičnošću. Reprezentativni primeri kako se prave i koriste molekuli za formiranje tripleksa za vezivanje velikog broja različitih ciljnih molekula mogu se naći u sledećoj neograničavajućoj listi nakon američkih patenata: US 5,176,996, US 5,645,985, US 5,650,316, US 5,683,874, US 5,693,773, US 5,834,185, US 5,869,246, US 5,874,566 i US 5,962,426.
[0475]Ujednoj realizaciji, CD38BP jc konjugovan na spoljnu vodič sekvencu. Spoljne vodič sekvence (EGSs) su molekule koje se vezuju za ciljni molekul nukleinske kiseline koja formira kompleks koji je prepoznat od strane RNaze P, koja čepa ciljni molekul. EGSs mogu biti dizajnirane kako bi specifično ciljale RNK molekul izbora. RNKzom P pomaže u transferu za obradu RNK (tRNK) u ćeliji. Bakterijski RNKzom P, može se regrutovati za cepanje praktično bilo koje RNK sekvence korišćenjem EGS koja izaziva ciljni RNK: EGS kompleks da imitira prirodni tRNK substrat, (videti na primer WO 92/03566 i Forster and Altman, Science 238, 407-409 (1990) za diskusiju). Reprezentativni primeri kako se prave i koriste EGS molekule kako bi se olakšalo cepanje različitih ciljnih molekula su navedeni u sledećoj neograničavajućoj listi američkih patenata: US 5,168,053, US 5,624,824, US 5,683,873, US 5,728,521, US 5,869,248 i US 5,877,162.
[0476]Ujednoj realizaciji, CD38BP jc konjugovan sa ometajućim molekulom nukleinske kiseline, kao što je siRNK ili drugi RNK interferencije molekula (npr, inhibitorna dvolančana (ds) RNK molekula sa oko 20-25 nukleotida) koja ima za cilj da ometa akciju ekspresionog proizvoda ciljnog gena, kao što je proizvod genske ekspresije uključen u CD38 posredovanoj bolesti ili stanju. Postupci za proizvodnju i upotrebu interferirajućih molekula nukleinske kiseline su dati u na primer Nishikura, Cell. 107(4), 415-8
(2001), Fjose et al, Biotechnol Annu Rev. 7, 31-57 (2001), Hanon, Nature 418, 244-51 (2002), Brantl, Biochim Biophvs Acta. 1575(1-3), 15-25 (2002), Tuschl, Chembiochem. 2(4), 239-45 (2001), Caplen, Expert Opin Biol Ther. 3(4), 575-86 (2003), Lu et al., Curr Opin Mol Ther. 5(3), 225-34 (2003), Shuey et al, Drug Discov Today. 7(20), 1040-6 (2002), Shi, Trends Genet. 19(1), 9-12 (2003), Kovar et al., Semin Cancer Biol. 13(4), 275-81 (2003), Lavrey et al, Curr Opin Drug Discov Devel. 6(4), 561-9
(2003), Clewey, Commun Dis Public Health. 6(2), 162-3 (2003), Duxbury et al, J Surg Res. 117(2), 339-44 (2004), Caplen et al., Ann NY Acad Sci. 1002, 56-62 (2003), WO 01/75164, US 6,506,559, US 20040086884, US 20040077574, US 20040063654, US 20040033602, US 20030167490, US 20030157030, US 20030114409, US 20030108923, US 20040014113 i US 20020132788.
[0477]Ujednoj realizaciji, CD38BP je konjugovan sa tumorski ciljanim domenom peptida ili molekula. Ujednoj realizaciji, CD38BP je konjugovan sa tumorski ciljanom sekvencom faktora VII.
[0478]Bilo koji metod poznat u struci za konjugaciju CD38BP do konjugovanog (ih) molekula, kao što su oni gore opisani, mogu se koristiti, uključujući one metode opisane prema Hunter et al., Nature 144, 945 (1962), David et al., Biochemistry, 13, 1014 (1974), Pain et al, J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981) i Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982). Vezivanje/konjugacija se može postići na bilo koji pogodan način. Na primer, neka kovalentna veza može imati oblik disulfidne veze (ako je potrebno i pogodno, jedan CD38BP može biti konstruisan tako da sadrži dodatni cisteinski kodon, koji poželjno ne ometa CD38 vezujuću aktivnost molekula. Molekul toksina, derivatizovan sa sulfhidrilnom grupom reaktivan sa cisteinom modifikovanog CD38BP, može da formira imunokonjugat sa CD38BP. Alternativno, sulfhidrilna grupa se može uvesti direktno u CD38BP korišćenjem polipeptidnih tehnika čvrste faze. Na primer, uvođenje sulfhidrilnih grupa u peptide je opisano prema Hiskey, Peptides 3, 137
(1981). Uvođenje sulfhidrilnih grupa u proteine je opisano u Maasen et al., Eur. J. Biochem. 134, 32
(1983). Kada su odgovarajuće sulfhidrilnc grupe prisutne, citotoksin i CD38BP mogu biti prečišćeni, obe sumporne grupe redukovane; citotoksin i ligand izmešani (na primer u odnosu od oko 1: 5 do 1: 20); i fornnranje disulfidne veze je omogućeno da se nastavi do kraja (generalno oko 20 do 30 minuta) na sobnoj temperaturi. Smeša se zatim može dijalizovati nasuprot fosfatnom puferu ili hromatografisati na smoli kao što je Sephadex za uklanjanje neodreagovanog Uganda i molekula toksina.
[0479]Brojni tipovi citotoksičnih jedinjenja mogu biti spojeni sa proteinima kroz upotrebu reaktivne grupe na citotoksičnom jedinjenju ili putem upotrebe unakrsno vezivnog agensa. Uobičajena reaktivna grupa koja će formirati stabilnu kovalentnu vezuin vivosa aminom je izotiocijanat (Means et al., Chemical modifications of proteins (Holden-Day, San Francisco 1971) pp. 105-110). Ova grupa prvenstveno reaguje sa e-amino grupom lizina. Maleimid je uobičajeno korišćena reaktivna grupa za formiranje stabilnein vivokovalentne veze sa sulfhidrilnom grupom na cisteinu (Ji., Methods Enzvmol 91, 580-609 (1983)). Monoklonska antitela su tipično nesposobna da formiraju kovalentne veze sa radiometalmm j onima, ali oni mogu biti vezani za antitelo indirektno preko upotrebe helatnih agenasa koji su kovalentno povezani sa antitelima. Helatni agensi mogu biti vezani preko amina (Meares et al., Anal. Biochem. 142, 68-78 (1984)) i sulfhidrilnih grupa (Kovama, Chem. Abstr. 120, 217262t (1994)) aminokiselinskih ostataka i preko ugljenohidratnih grupa (Rodvvell et al., PNAS USA 83, 2632-2636
(1986), Ouadri et al., Nucl. Med. Biol. 20, 559-570 (1993)). Pošto ovi helatni agensi sadrže dve vrste funkcionalnih grupa, jedne da vezuju jone metala i druge da pridružuju helat za antitelo, često se nazivaju bifunkcionalnim helirajućim agensima (Sundberg et al., Nature 250, 587-588 (1974)).
[0480]Agensi za umrežavanje koji imaju dve reaktivne funkcionalne grupe su klasifikovani kao homo ili heterobifunkcionalni. Primeri homobifunkcionalnih agenasa za umrežavanje uključuju bismaleimidoheksan (BMH) koji je reaktivan sa sulfhidrilnim grupama (Chen et al., J Biol Chem 266, 18237-18243 (1991)) i etilen glikolbis[sukcinimidilsukciat] (EGS) koji je reaktivan sa amino grupama (Browning et al., J. Immunol. 143, 1859-1867 (1989)). Primer heterobifunkcionalnog umreživača je m-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid estar (MBS) (Myers et al., J. Immunol. Meth. 121, 129-142
(1989)). Ove metodologije su jednostavne i obično se koriste.
[0481]Terapeutski ili dijagnostički agens može takođe, ili alternativno biti vezan na zglobnom regionu redukovane komponente antitela putem formiranja disulfidne veze. Kao alternativa, takvi peptidi mogu biti vezani za komponentu antitela korišćenjem heterobifunkcionalnog unakrsnog linkera, kao što je N-sukcinil 3-(2-piridilditio) proprionat (SPDP). Yu et al., Int. J. Cancer 56, 244 (1994). Opšte tehnike za takvu konjugaciju su dobro poznate u tehnici. Videti, na primer, Wong, Chemistry Of Protein Conjugation And Cross-Linking (CRC Press 1991), Upeslacis et al, "Modification of Antibodies by Chemical Methods,"In Monoclonal Antibodies: Principles And Applications, Birch et al, (eds.) (Wiley-Liss, Inc. 1995), Priče, "Proizvodnja i karakterizacija od sintetskog peptida-izvedenih antitela," u monoklonskim antitelima:. Proizvodnja, inženjering i klinička primena, Ritter et al., (eds.) (Cambridge University Press 1995).
[0482]U nekim realizacijama, markeri ili drugi konjugovani supstituenti su vezani za CD38BP aminokiselinske sekvence kracima za razdvajanje različitih dužina da bi se smanjila potencijalna sterična prenapregnutost.
[0483]Neobeleženi CD38BP (i) može da se koristi u kombinaciji sa drugim obeleženim antitelima (sekundarna antitela) koja su reaktivna sa CD38BP(-ima), kao što su antitela specifična za humane imunoglobulinske konstantne regione koja se vezuju za anti-CD38 mAt. Alternativno, jedan CD38BP može biti direktno obeležen. Širok spektar markera može biti korišćen za direktno ili indirektno obeležavanje CD38BPs, poput markiranja sa radionuklidima, fluorom, enzimima, enzimskim supstratima, enzimskim kofaktorima, enzimskim inhibitorima, ligandima (posebno haptenima), itd.
[0484]Umetanja aminokiselinske sekvence uključuju amino- i/ili karboksil-terminalne fuzije u rasponu dužine od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotinu ili više ostataka, kao i intrasekventna umetanja jednog ili više aminokiselinskih ostataka. Primeri terminalnih ubacivanja uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom ili antitelo fuzionisano sa oznakom epitopa. Druge varijante umetanja molekula antitela uključuju fuziju sa N- ili C-tcrminusom antitela enzima ili polipeptida ili PEG-a koji povećava poluživot serumskih antitela. Takvi fuzioni proteini anti-CD38 antitela i slični fuzioni proteini koji sadrže CD38BP sekvence su druga karakteristika predmetnog pronalaska.
[0485]Ujednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje molekule koji sadrže CD38BP, kao što je humano anti-CD38 antitelo, prema predmetnom pronalasku konjugovano sa terapijskom grupom, kao što je citotoksin, hemoterapeutski lek, imunosupresor ili radioizotop. Takvi konjugati su ovde označeni kao "imunokonjugati". Imunokonjugati koji obuhvataju jedan ili više citotoksina se nazivaju "imunotoksinima".
[0486]Citotoksin ili citotoksični agens uključuje bilo koji agens koji je štetan za (npr, ubija) ćelije. Za opis ovih klasa lekova koji su dobro poznati u tehnici, i njihovim mehanizmima delovanja, pogledajte Goodman et al., Goodman and Gilman: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th ed., Macmillan Publishing Co, 1990. Dodatne tehnike relevantne za pripremu imunotoksina antitela su dati u na primer Vitetta, Immunol. Today 14, 252 (1993) i US 5,194,594.
[0487]Podesni terapeutski agensi za formiranje imunokonjugata iz predmetnog pronalaska obuhvataju taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, aktinomicin D, 1-dehidro-testosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin, antimetabolite (kao što je metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, fludarabin, 5-fluorouracil, dekarbazin, hidroksiurea, asparaginaza, gemcitabin, kladribin), agense za alkilovanje (kao što je mehloretamin, tioepa, hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU), lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, dakarbazin (DTIC), prokarbazin, mitomicin C, cisplatin i druge derivate platine, kao što je karboplatin), antibiotike (kao što je daktinomicin (bivši aktinomicin), bleomicin, daunorubicin (bivši daunomicin), doksorubicin, idarubicin, mitramicin, kalihemicin, mitomicin, mitoksantron, plikamicin, antramicin (AMC)), difterični toksin i srodne molekule (kao što je difterični A lanac i njegove aktivne fragmente i hibridne molekule), ricinski toksin (kao što je ricin A ili toksin deglikozilovanog ricinskog A lanca), toksin kolere, Shiga slični toksin (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), LT toksin, C3 toksin, Shiga toksin, toksin pertuzisa, toksin tetanusa, soj Bowman-Birk inhibitor protcaze, Pscudomonas egzotoksin, alorin, saporin, modecein, gelanin, abrin A lanac, modecein A lanac, alfa-sarcin, Aleurites fordii proteine, diantin proteine, Phvtolacca americana proteine (PAPI, PAPU i PAP-S), inhibitor momordica eharantia, curcin, krotin, inhibitor saponaria officinalis, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin i enomicin toksine. Terapeutski agensi, koji se mogu primeniti u kombinaciji sa jednim CD38BP prema predmetnom pronalasku kao što je opisano na drugom mestu ovde, mogu takođe biti kandidati terapeutskih grupa korisnih za konjugaciju sa CD38BP predmetnog pronalaska. Na primer, ostatak leka može biti protein ili polipeptid koji poseduje željenu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu da uključuju, na primer, enzimski aktivan toksin, ili njegov aktivni fragment, kao što je abrin, ricin A, egzotoksin pseudomonasa ili difterični toksin; protein kao što je tumor nekrotični faktor ili interferon y; ili, modifikatore biološkog odgovora, kao što su, na primer, limfokini, interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), interleukin-6 (IL-6), faktor stimulacije kolonije granulocita i makrofaga (GM-CSF), faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF), ili druge faktore rasta i apotopični indukujući protein izolovan iz mitohondrija.
[0488]U jednom ostvarenju, citotoksični agens je kaliheamicin, 90Y, 125I i<1>31I.
[0489]Drugi primeri terapeutskih citotoksina koji mogu biti konjugovani sa CD38BP predmetnog pronalaska uključuju kaliheamicine i duokarmicine. Kao što je gore navedeno, za ostatak leka ne treba tumačiti da je ograničen prema klasičnim hemijskim terapeutskim agensima. Na primer, ostatak leka može biti protein ili polipeptid koji ima željenu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu uključivati, na primer, agens aktivan na površini ćelije, kao što su enzimi fosfolipaze, npr fosfolipaza C.
[0490]Lizirani deo toksina tipično može lako biti spojen sa Fab fragmentom antitela ili fragmentom antitela prema predmetnom pronalasku. Drugi pogodni konjugovani molekuli uključuju ribonukleaze (RNaze), DNAze I, stafilokokni enterotoksin-A, antivirusni protein vinobojke, difterični toksin i Pseudomonas endotoksin. Videti, na primer, Pastan et al., Cell 47, 641 (1986) i Goldenberg, Calif. A Cancer Journal for Clinicians 44, 43 (1994). Dodatni toksini pogodni za upotrebu u predmetnom pronalasku su poznati stručnjacima u tehnici (videti na primer US 6,077,499).
[0491]Konjugati CD38BP-a, kao što su antitela i takvih citotoksičnih grupa se mogu napraviti korišćenjem različitih bifunkcionalnih proteinskih agenasa za kuplovanje. Primeri takvih reagenasa obuhvataju SPDP, IT, bifunkcionalne imidoestarske derivate kao što je dimetil adipimidat HCI, aktivne estre kao što je disukcinimidil suberat, aldehide kao što je glutaraldehid, bis-azido jedinjenja kao što je bis (p-azidobenzoil) heksandiamin, bis- diazonijum derivate kao što je bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin, diizocijanate kao što je tolilen 2,6-diizocijanat, i bis-aktivna jedinjenja fluora, kao što je l,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen i anti-mitotičke agense (npr vinkristin, vinblastin, docetaksel, paklitaksel i vinorelbin).
[0492]Tehnike za konjugaciju takvih terapeutskih grupa sa CD38BP-ima, kao što su antitela, su dobro poznata, videti na primer Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Tmmunotargeting Of Drugs in Cancer Therapv", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapv, Reisfeld et al., (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985), Hellstrom et al, "Antibodies for Drug Deliverv", in Controlled Drug Deliverv (2nd ed.), Robinson et al., (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987), Torp, "Antibodv Carriers of Cytotoxic Agcnts In Cancer Thcrapy: A Rcvicvv", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., (eds.), pp. 475-506 (1985), "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody hi Cancer Therapy" in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al., (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985) i Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev 62, 119-58 (1982).
[0493]Ujednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje CD38BP koja je konjugovan sa mešanim toksinom. Molekul mešanog toksina je molekul izveden iz dva različita (tipično polipeptidna) toksina. Generalno, peptidni toksini sadrže jedan ili više domena odgovornih za generalizovano vezivanje za eukariotske ćelije, najmanje jedan enzimski aktivan domen i najmanje jedan translokacijski domen. Vezujući i translokacijski domeni su potrebni za prepoznavanje ćelije i ulazak toksina respektivno. Prirodni proteini koji su poznati da imaju translokacijski domen uključuju difterični toksin, Pseudomonas egzotoksin A, i eventualno druge peptidne toksine. Translokacijski domeni difteričnog toksina i Pseudomonas egzotoksina A su dobro karakterisani (videti na primer Hoch et al., PNAS USA 82, 1692 (1985), Colombatti et al, J. Biol. Chem. 261, 3030 (1986) i Deleers et al, FEBS Lett. 160, 82
(1983)), i postojanje i lokacija takvog domena u drugim molekulima može se odrediti metodama kao što su one navedene prema Hwang et al., Cell 48, 129 (1987) i Gray et al., PNAS USA 81 2645 (1984). S obzirom na ove tehnike, može se formirati koristan hibridni molekul mešovitog toksina, na primer, fuzionisanjem enzimski aktivne A podjedinice E. coli Shiga-slični toksin (Caldervvood et al., PNAS USA 84, 4364 (1987)) sa translokacijskim domenom (aminokiselinski ostaci 202 do 460) difteričnog toksina, na ciljnom molekulu za određeni ćelijski tip, kao što je opisano u US 5,906,820. Ciljani deo trodelnog hibrida može uzrokovati da se molekul specifično vezuje za ciljne ćelije, a translokacijski deo difteričnog toksina može da deluje umetanjem enzimski aktivne A podjedinice Shiga-sličnog toksina u ciljnu ćeliju. Enzimski aktivan deo Shiga-nalik toksina, kao difterični toksin, deluje na proteinsku sintezu ćelijske mašinerije sprečavanjem sinteze proteina, čime se ubija ciljna ćelija.
[0494]Imunokonjugati prema prikazanom pronalasku mogu takođe sadržati radioaktivni izotop, npr jod-131, itrijum-90 ili indijum-111, za generisanje citotoksičnih radiofarmaceutika za lečenje poremećaja povezanih sa CD38, kao što je multipli mijelom.
[0495]U jednoj realizaciji, CD38BPs, kao što su humana antitela iz predmetnog pronalaska su vezana za linker-helator, npr tiuksetan, što omogućava antitelu da bude konjugovano sa radioaktivnim izotopom.
[0496]Dodatno korisni supstituenti konjugata uključuju retinoide protiv kancera. Konjugati taksana (videti na primer Jaime et al., Anticancer Res. 21. (2A), 1119-28 (2001), konjugati cisplatina, konjugati tapsigargina, konjugati linolne kiseline, konjugati kaliheamicina (videti na primer Damle et al., Curr Opin Pharmacol. 3 (4), 386-90 (2003), konjugati doksorubicina, konjugati geldanamicina, i slično, takođe mogu biti korisni u promovisanju lečenja kancera (videti, generalno, Trail et al, Cancer Immunol Immunother. 52(5), 328-37 (2003)).
[0497]U jednoj realizaciji, ovde su obezbeđena sekundarna i anti-idiotipska antitela izazvana protiv anti-CD38 antitela iz predmetnog pronalaska. Sekundarna antitela sc odnose na antitela specifična za, a tipično izazvana protiv, anti-CD38 antitela. Anti-idiotipsko (Id) antitelo je antitelo koje prepoznaje jedinstvene determinante obično povezane sa antigen-vezujućim mestom antitela. Id antitela mogu biti pripremljena imunizacijom životinja istih vrsta i genetskog tipa kao izvor anti-CD38 mAt sa mAt prema kome je anti-Id pripremljen. Imunizovana životinja obično prepoznaje i reaguje na idiotipske determinante imunizujućeg antitela proizvodnjom antitela na ove idiotipske determinante (anti-Id antitela). Takva antitela su opisana na primer u US 4,699,880.
[0498]Anti-Id antitelo se takođe može koristiti kao "imunogen" da izazove imuni odgovor u još jednoj životinji, proizvodeći takozvano anti-anti-Id antitelo. Anti-anti Id može biti epitopikalno identičan sa originalnim mAt, koje indukuje anti-Id. Tako, korišćenjem antitela prema idiotipskim determinantama mAt, moguće je identifikovati druge klonove koji eksprimiraju antitela identične specifičnosti. Anti-Id antitela mogu da variraju (proizvodeći time anti-Id varijante antitela) i/ ili dcrivatizovana bilo kojom pogodnom tehnikom, kao što su one opisane na drugom mestu ovde u odnosu na anti-CD38 antitela i druge CD38BPs predmetnog pronalaska. Na primer, anti-Id mAt-a mogu biti spojena sa nosačem kao što je hemocijanin iz zubaca prilepka (KLH) i koristi se za imunizaciju BALB/c miševa. Serumi iz ovih miševa tipično će sadržati anti-anti-Id antitela koje imaju slične osobine vezivanja, ako ne identične sa originalnim/matičnim CD38 antitelom.
[0499]Ujednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira CD38BP. Nukleinska kiselina koja kodira CD38BP može imati pogodne karakteristike i obuhvata bilo koje prikladne funkcije ili njihove kombinacije. Tako, na primer, nukleinska kiselina koja kodira CD38BP može biti u obliku DNK, RNK, ili hibrida istog, i može uključivati bazu koja se ne nalazi prirodno, modifikovanu osnovu (npr fosfotioatnu osnovu koja promoviše stabilnost nukleinske kiseline), ili oboje. Nukleinska kiselina pogodno sadrži karakteristike koje podstiču željenu ekspresiju u ciljnoj ćeliji (-ama) domaćina, replikaciju i / ili selekciju. Primeri takvih karakteristika uključuju poreklo replikacione komponente, izbor genske komponente, komponente promotera, komponentu inhenser elementa, komponentu poliadenilovane sekvence, komponentu završetka, i slično.
[0500]Ujednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira CD38BP. Vektor se odnosi na nosača isporuke koji promoviše ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira CD38BP, proizvodnju jednog CD38BP peptida, transfekciju/ transformaciju ciljnih ćelija, replikaciju nukleinske kiseline koja kodira CD38BP, promoviše stabilnost nukleinske kiseline, promoviše detekciju nukleinske kiseline i/ ili transformisanih/ transficiranih ćelija, ili na drugi način daje povoljnu biološku funkciju za nukleinsku kiselinu koja kodira CD38BP. Vektor u kontekstu predmetnog pronalaska može biti bilo koji pogodni vektor, uključujući hromozomske, ne-hromozomske, i sintetičke vektore nukleinske kiseline (sekvencu nukleinske kiseline koji sadrži odgovarajući skup elemenata za kontrolu ekspresije). Primeri takvih vektora uključuju derivate SV40, bakterijske plazmide, DNK faga, bakulovirus, plazmide kvasca, vektore izvedene iz kombinacija plazmida i DNK faga i virusnih vektora nukleinske kiseline (RNK ili DNK). U jednom izvođenju, nukleinska kiselina koja kodira CD38BP se sastoji u golom DNK ili RNK vektoru, uključujući, na primer, jedan linearni ekspresioni element (kao što jc opisano u na primer Sykcs and Johnston, Nat Biotcch 17, 355-59 (1997)), jedan kompaktni vektor nukleinske kiseline (kao što je opisano u, na primer US 6,077, 835 i / ili WO 00/70087), plazmidski vektor kao što je pBR322, pUC 19/18 ili pUC 118/119, jedan "midge" minimalne veličine vektor nukleinske kiseline (kao što je opisano u, na primer Schakovvski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)), ili jednu vektorsku konstrukciju precipitirane nukleinske kiseline, kao što je CaP04-precipitiran konstrukt (kao što je opisano u, na primer WO 00/46147, Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al, Cell 14, 725 (1978), i Coraro i Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)). Takvi vektori nukleinskih kiselina i njihovo korišćenje su dobro poznati u tehnici (videti na primer US 5,589,466 i US 5,973,972).
[0501]U jednoj realizaciji, vektor je pogodan za ekspresiju CD38BP-a u bakterijskoj ćeliji. Primeri takvih vektora obuhvataju, na primer, vektore koji usmeravaju visok nivo ekspresije fuzionih proteina koji sc lako pročišćavaju (na primer multifunkcionalnim kloniranjem E. coli i ekspresijom vektora kao što je BlueScript (Stratagene), pPN vektora (Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509
(1989), pET vektora (Novagen, Madison Wl) i slično).
[0502]Ekspresioni vektor može takođe ili alternativno biti vektor pogodan za ekspresiju u sistemu kvasca. Svaki vektor pogodan za ekspresiju u sistemu kvasca se može koristiti. Pogodni vektori za upotrebu u na primer Saccharomvces cerevisiae uključuju, na primer, vektore koji sadrže konstitutivne ili inducibilne promotere kao što je alfa faktor, alkoholna oksidaza i PGH (revijski prikazano u: F. Ausubel et al, ed. Current Protocols in Molecular Biologv, Greene Publishing i Wiley Interscience New York (1987), i Grant et al., Methods in Enzvmol 153, 516-544 (1987)).
[0503]Nukleinska kiselina i/ili vektor mogu takođe da sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira sekvencu sekrecije/ lokalizacije, koja može da cilja polipeptid, kao što je nascentni polipeptidni lanac, do željenog ćelijskom odeljka, membrane ili organele, ili koja usmerava sekreciju polipeptida u periplazmatskom prostoru ili u medije ćelijske kulture. Takve sekvence su poznate u tehnici, i obuhvataju lidere sekrecije ili signalne peptide, sekvence ciljanja organela (npr sekvence nuklearne lokalizacije, ER retencioni signali, mitohondrijalne tranzit sekvence, hloroplast tranzit sekvence), membranske lokalizacije/ anker sekvence (npr stop transfer sekvence, GPI anker sekvence), i slično.
[0504]Nukleinske kiseline koje kodiraju CD38BP mogu da sadrže ili mogu biti povezane sa bilo kojim pogodnim promoterom, inhenserom i drugim elementima koji olakšavaju ekspresiju. Primeri takvih elemenata uključuju jake ekspresione promotere (npr humani CMV IE promoter/inhenser kao i RSV, SV40, SL3-3, MMTV, i HIV LTR promotere), efikasne poli (A) završne sekvence, mesto početka replikacije za plazmidske proizvode u E. coli, gen antibiotske otpornosti kao selektivni marker, i/ili mesto pogodno za kloniranje (npr, polilinker). Nukleinske kiseline mogu takođe da sadrže inducibilni promoter nasuprot konstitutivnog promotera kao što je CMV IE (iskusni stručnjak će prepoznati da su takvi izrazi deskriptori stepena genske ekspresije pod određenim uslovima).
[0505]U jednoj realizaciji, nukleinska kiselina može biti postavljena u i/ili isporučena ćeliji domaćina ili životinji domaćina preko virusnog vektora. Bilo koji pogodni virusni vektor se može koristiti u ovom pogledu, i nekoliko je poznato u tehnici. Virusni vektor može sadržati bilo koji broj virusmh polinukleotida, sam ili u kombinaciji sa jednim ili više virusnih proteina koji olakšavaju isporuku, replikaciju i/ili ekspresiju nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska u željenoj ćeliji domaćina. Virusni vektor može biti polinukleotid koji sadrži ceo ili deo virusnog genoma, virusni protein/konjugata nukleinske kiseline, čestice poput virusa (VLP), vektor sličan onima opisanim u US 5,849,586 i WO 97/04748, ili netaknuta virusna čestica koja sadrži viralne nukleinske kiseline i nukleinsku kiselinu iz predmetnog pronalaska. Virusna čestica virusnog vektora može sadržati virusne čestice divljeg tipa ili modifikovanu virusnu česticu. Virusni vektor može biti vektor koji zahteva prisustvo drugog vektora ili divlji tip virusa za replikaciju i/ili ekspresiju (tj, može biti virus zavisan od pomagača), kao što je adenovirusni vektor amplikona. Tipično, takvi virusni vektori se sastoje uglavnom od virusne čestice divljeg tipa ili virusne čestice modifikovane u njegovom proteinu i/ili sadržaju nukleinske kiseline za povećanje kapaciteta transgena ili pomoć u transfekciji i/ili ekspresiji nukleinske kiseline (primeri takvih vektora uključuju virus herpesa/AAV amplikonc). Tipično, virusni vektor jc sličan i/ili izveden iz virusa koji obično inficira ljude. Pogodne čestice virusnog vektora u ovom pogledu, obuhvataju, na primer, čestice adenovirusnog vektora (uključujući bilo virus ili je izveden od virusa Adenoviridae), čestice adeno-asociranog virusnog vektora (AAV vektorske čestice) ili drugi Parvovirusi i parvovirusne vektorske čestice, papiloma virusne vektorske čestice, flavivirusni vektori, alfavirusni vektori, herpes virusni vektori, virusni vektori boginja, retrovirusni vektori, uključujući lentivirusne vektore. Primeri takvih virusa i virusnih vektora su u npr Fields et al., eds., Virologv Raven Press, Ltd., New York (3rd ed., 1996. and 4th ed., 2001), Encvclopedia of Virologv, R.G. Webster et al.,eds., Academic Press (2nd ed., 1999), Fundamental Virologv, Fields et al., eds., Lippincott-Raven (3rd ed., 1995), Levine, "Viruses," Scientific American Librarv No. 37 ( 1992), Medical Virologv, D.O. White et al., eds., Acad. Press (2nd ed. 1994), i Introduction to Modern Virologv, Dimock, N. J. et al., eds., Blackwell Scientific Publications, Ltd. (1994).
[0506]Virusni vektori koji mogu biti angažovani sa polinukleotidima pronalaska i postupci opisani ovde uključuju adenovirus i adeno-asocirane vektore, kao u na primer Čarter, Curr Opinion Biotech 3, 533-539 (1992) i Muzcvzka, Curr Top Microbiol Immunol 158, 97-129 (1992). Dodatni tipovi i aspekti AAV vektora su opisani u na primer Čarter, Contrib. Microbiol. 4, 85-86 (2000), Smith-Arica, Curr. Cardiol. Rep. 3(1), 41-49 (2001), Taj, J. Biomed. Sci. 7(4), 279-91 (2000), Vigna et al., J. Gene Med. 2(5), 308-16 (2000), Klimatcheva et al., Front. Biosci. 4, D481-96 (1999), Lever et al., Biochem. Soc. Trans. 27(6), 841-47 (1999), Snvder, J. Gene Med. 1(3), 166-75 (1999), Gerich et al, Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. 5(2), 118-23 (1998), i During, Adv. Drug Deliv. Review 27 (1), 83-94 (1997) i US 4,797,368, US 5,139,941, US 5,173,414, US 5,614,404, US 5,658,785, US 5,858,775 i US 5,994,136). Adeno-asocirani virusni vektori mogu biti izgrađeni i/ili prečišćeni primenom navedenih metoda, na primer, u US 4,797,368 i Laughlin et al., Gene 23, 65-73 (1983).
[0507]Drugi tip virusnog vektora koji može biti angažovan sa polinukleotidima i postupcima prema prikazanom pronalasku je papiloma virusni vektor. Pogodni papiloma virusni vektori su poznati u tehnici i opisani u, npr, Hevvson, Mol Med, Today 5 (1), 8 (1999), Stephens, Biochem J. 248 (1), 1-11
(1987) i US 5,719,054. Primeri papiloma virusnih vektora su dati u WO 99/21979, na primer. Alfavirusni vektori mogu biti vektori isporuke gena u drugim kontekstima. Alfavirusni vektori su poznati u struci i opisani su u na primer Čarter, Curr Opinion Biotech 3, 533-539 (1992), Muzcvzka, Curr Top Microbiol Immunol. 158, 97-129 (1992), Schlesinger, Expert Opin Biol, Ther. 1(2), 177-91
(2001), Polo et al, Dev Biol (Basel). 104, 181-5 (2000), Wahlfors et al., Gene Ther. 7(6), 472-80
(2000), Colombage et al., Virologv. 250 (1), 151-63 (1998) i WO 01/81609, WO 00/39318, WO 01/81553, WO 95/07994 i WO 92/10578.
[0508]Druga grupa virusnih vektora su herpes virusni vektori. Primeri herpes virusnih vektora su opisani u npr Lachmann et al., Curr Opin Mol Ther 1 (5), 622-32 (1999), Fraefel et al., Adv Virus Res. 55, 425-51 (2000), Huard et al, Neuromuscul 7 (5), 299-313 (1997), Glorioso et al., Annu Rev Microbiol. 49, 675-710 (1995), Latchman, Mol Biotechnol. 2 (2), 179-95 (1994), i Frenkel et al, Gene Ther. 1 (Suppl 1), S40-6 (1994), kao i US 6,261,552 i US 5,599,691.
[0509]Rctrovirusni vektori, uključujući lentivirusne vektore, takođe mogu biti pogodni nosači genske isporuke u specifičnim kontekstima. Postoje brojni retrovirusni vektori koji su poznati u tehnici. Primeri retrovirusnih vektora su opisani u na primer Miller, Curr Top Microbiol Immunol 158, 1-24 (1992), Salmons i Gunzburg, Human Gene Therapv 4, 129-141 (1993), Miller et al., Methods in Enzymology 217, 581-599 (1994), Weber et al., Curr Opin Mol Ther. 3(5), 439-53 (2001), Hu et al., Pharmacol Rev. 52(4), 493-511 (2000), Kim et al., Adv Virus Res. 55, 545-63 (2000), Palu et al, Rev Med Virol. 10 (3), 185-202 (2000) i Takeuchi et al, Adv Exp Med Biol. 465, 23-35 (2000), kao i US 6,326,195, US 5,888,502, US 5,580,766, i US 5.672,510.
[0510]Adenovirusni vektori mogu takođe biti pogodni virusni vektori za transfer gena. Adenovirusni vektori su dobro poznati u struci i opisani u na primer Graham et al, Mol Biotechnol 33 (3), 207-220
(1995), Stephenson, Clin Diagn Virol 10 (2-3), 187-94 (1998), Jacobs, Clin Sci (Lond). 85(2), 117-22
(1993) , US 5,922,576, US 5,965,358 i US 6,168,941 i W098/22588, W098/56937, W099/15686, V/099/54441, i WO00/32754. Adenovirusni vektori, herpes virusni vektori i Sindbis virusni vektori, korisni u praksi iz predmetnog pronalaska, opisani su u na primer Jolly Cancer Gene Therapy 1, 51-64
(1994) , Latchman Molec Biotechnol 2, 179-195 (1994) i Johanning et al., Nucl Acids Res 23, 1495-1501 (1995).
[0511]Drugi pogodni virusni vektori uključuju boginja virusne vektore. Primeri takvih vektora su razmatrani u na primer Berencsi et al., J Infect Dis 183 (8), 1171-9 (2001), Rosemvirth et al., Vaccine 19 (13-14), 1661-70 (2001), Kittlesen et al, J Immunol 164 (8), 4204-11 (2000), Brown et al., Gene Ther 7 (19), 1680-9 (2000), Kanesa-thasan et al., Vaccine 19 (4-5), 483-91 (2000), Sten, Drua 60 (2), 249-71
(2000). Vakcinija virusni vektori mogu biti boginja virusni vektori. Primeri takvih vektora i njihova upotrebu je data u npr Venugopal et al., Res Vet Sci 57 (2), 188-193 (1994), Moss Dev Biol Štand 82, 55-63 (1994), Weisz et al., Mol Cell Biol 43, 137-159 (1994), Mahr and Payne, Immunobiology 184 (2-3), 126-146 (1992), Hruby, Clin Microbiol Rev 3 (2), 153-170 (1990) i WO92/07944, WO98/13500 i WO89/08716.
[0512]Druge karakteristike predmetnog pronalaska uključuju rekombinantne ćelije, kao što su kvasac, bakterijske i ćelije sisara (npr besmrtne ćelije sisara) koje sadrže takvu nukleinsku kiselinu, vektor, ili kombinaciju jednog ili oba istih. Na primer, u jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje ćeliju koja sadrži nukleinsku kiselinu stabilno integrisanu u ćelijski genom koji sadrži sekvencu kodiranja za ekspresiju CD38BP antitela iz predmetnog pronalaska. Ujednoj realizaciji, obezbeđena je ćelija koja sadrži neintegrisanu nukleinsku kiselinu, kao što je plazmid, kozmid, fagermd ili linearni ekspresioni element, koji sadrži sekvencu kodiranja za ekspresiju CD38BP antitela.
[0513]Takođe ovde opisani su imunogeni peptidi koji sadrže bilo koji od gore opisanih delova antigenskih determinanti od CD38 specifičnih za CD38BPs kao što je ovde opisano, kao što su delovi antigenske determinante CD38 specifični za -003 i -005 i -024. Takvi imunogeni se mogu koristiti da izazovu direktan imuni odgovor u postupku koji obuhvata aktivni imunoterapijski režim. Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje fuzioni protein koji sadrži takav CD38 imunogen i fuzionu partner sekvencu koja poboljšava poluživot antitela (na primer, uključivanjem sekvence imunoglobulinskog domena); olakšava detekciju i/ili prečišćavanje fuzionog proteina (što obuhvata, na primer, jednu fluorescentnu peptidnu sekvencu, jednu reporter enzimsku sekvencu, jedan epitop taga, jednu heksa-histidinsku sekvencu, ili slično); promoviše ciljanje fuzionog proteina (na primer, sadrži ligand ili deo Uganda specifičnog za receptor na ciljnoj ćeliji); promoviše indukciju posebnog imunog odgovora (npr odgovara antigenu kancera ili njegovom imunogenskom fragmentu); je citotoksični agens; ili ostvaruje bilo koju njihovu kombinaciju (npr toplotni udar fuzionog proteinskog partnera može povećati imuni odgovor generisan protiv ne-sličnog, heterolognog antigenskog dela fuzionog proteina, uz istovremeno povećanjein vivopoluživota fuzionog proteina). Fuzioni proteini mogu takođe da sadrže jedno ili više mesta razdvajanja, naročito između domena.
[0514]Varijante takvih peptida i derivati takvih imunogenih peptida ili imunogene varijante peptida su dodatne karakteristike kao što je ovde opisano (npr takvi CD38 imunogeni peptidni derivati mogu biti modifikovani hemijskim spajanjem, genetičkom fuzijom, neko valentnim udruživanjem i slično, sa drugim molekulskim entitetima, kao što su antitela, toksini, radioizotopi, citotoksični agensi ili citostatički agensi). Peptidni mimitopi, sadrže sekvence CD38 epitopa, koji mogu takođe, na primer, biti korisni kao kandidati za vakcine. Takvi peptidi mogu takođe biti korisni u prečišćavanju anti-CD38 antitela. Pored B-ćelijskih epitopskih sekvenci ovde opisanih, takvi peptidi se mogu konstruisati ili izabrati da takođe ili alternativno sadrže jedan ili više anti-CD38 T ćelijskih epitopa. Takvi epitopi mogu biti identifikovani bilo kojom pogodnom tehnikom poznatom u struci (na primer, pomoću prognoze T ćelijskog epitopa softverskim aplikacijama).
[0515]U jednoj realizaciji, ovde je obezbeđena nukleinska kiselina koja kodira takav imunogeni peptid. Takva nukleinska kiselina može biti isporučena domaćinu u pogodnom vektoru, kao što je ciljani vektor ili replikaciono deficitaran (na primer, ciljani vektor nukleinske kiseline ili replikaciono deficitaran, ciljani adenovirusni vektor). Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje kompozicije jednog ili više takvih imunogenih peptida i/ili nukleinskih kiselina koje kodiraju imunogeni peptid.
[0516]CD38BP antitela predmetnog pronalaska uključuju "neutrališuća" antitela. Izraz
"neutrališuće antitelo "se odnosi na CD38BP antitelo koje je sposobno da suštinski inhibira ili eliminiše biološku aktivnost CD38 udruženih peptida. Tipično, jedan neutrališući CD38BP, kao što je jedno neutrališuće anti-CD38 antitelo, može inhibirati, direktno ili indirektno, funkciju CD38, kao što jc enzimska aktivnost, signalna transdukcija, indukcija ekspresije citokina, indukcija proliferacije ili diferencijacije, ili indukcija Uze, u meri koja je približno jednaka ili veća od inhibicije takvih ćelija usled primene približno jednake količine -003 ili -005 ili -024.
[0517]Jedan CD38BP predmetnog pronalaska može imati bilo koji pogodan afinitet i/ili avidnost za jedan ili više epitopa sadržanih bar delimično u CD38. Afinitet se odnosi na jačinu vezivanja od strane CD38BP takvog epitopa. Tipično, afinitet se meri konstantom disocijacije Kd, definisanom kao [At] x [Ag] / [At-Ag] gde je [At-Ag] molarna koncentracija (antitelo-antigen kompleksa ili CD38BP-antigen kompleksa), [At] je molarna koncentracija nevezanog antitela (ili CD38BP) i [Ag] je molarna koncentracija nevezanog antigena. Konstanta afiniteta Kaje definisana pomoću 1/Kđ. Pogodni postupci za određivanje specifičnosti i afiniteta kompetitivnom inhibicijom mogu se naći u na primer Harlovv et al., Antibodies: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunologv, Greene Publishing Assoc, and Wiley InterScience N.Y., (1992, 1993) i Muller, Meth. Enzvmol. 92, 589-601 (1983).
[0518]Jedan CD38BP, a posebno anti-CD38 antitela iz predmetnog pronalaska mogu imati afinitet za najmanje jedan epitop bar delimično sadržan u CD38 u opsegu od oko 10<4>do oko 10<10>M"<1>. Izraz imunoreaguje ovde se tipično odnosi na vezivanja CD38BP na CD38 epitop sa konstantom disocijacije Kd nižom od oko IO"<4>M.
[0519]Jedan CD38BP može imati afinitet koji je najmanje tako veliki za CD38 kao -003 i -005 i -024, a u nekim realizacijama ima afinitet koji je najmanje tako veliki kao -003 i -005 i -024. Afinitet se može odrediti bilo kojim od postupaka opisanih drugde ovde ili njihovim poznatim ekvivalentima u tehnici. Primer jedne metode koja se može koristiti za određivanje afiniteta je obezbeđena u Scatchard analizama prema Munson & Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980). Afinitet vezivanja takođe može biti određen ravnotežnim metodama (na primer enzimski-povezanim immunoabsorbentnim testom (ELISA) ili radioimuno testom (RIA)) ili kinetičkim analizama (na primer BIACORE™ analizom).
[0520]Tipično, konstanta disocijacije za CD38BPs, kao što su anti-CD38 antitela, prema predmetnom pronalasku je manja od oko 100 nM, manja od oko 50 nM, manja od oko 10 nM, oko 5 nM ili manje, oko 1 nM ili manje, oko 0,5 nM ili manje, oko 0,1 nM ili manje, oko 0,01 nM ili manje, ili čak oko 0,001 nM ili manje.
[0521]CD38BPs, kao što su anti-CD38 antitela, prema predmetnom pronalasku, mogu da ispoljavaju slične funkcionalne karakteristike kao -003 i -005 i -024, kao što se može odrediti pomoću ogleda antitelo-zavisne ćelijske citotoksičnosti (ADCC) i komplementom-posredovane citotoksičnosti (CDC)
(videti, na primer US 5500362).
[0522]U jednoj realizaciji, anti-CD38 antitelo prema predmetnom pronalasku ne deluje kao agonist CD38, već kao antagonist za CD38. Agonist za CD38 je molekul, koji aktivira jednu ili više funkcija pripisanih CD38. Takve funkcije mogu da uključuju posredovanje receptora u adheziji i signalne događaje i (ekto-) enzimsku aktivnost. Staviše, kao ektoenzime, CD38 koristi NAD<+>kao supstrat za formiranje ciklične ADP-riboze (cADPR) i ADPR, ali i nikotinamida i nikotinske kiseline-adenin dinuklcotid fosfata (NAADP). cADPR jc pokazano da deluje kao drugi glasnik za mobilizaciju Ca<2+>iz endoplazmatičnog retikuluma. Pored signalizacije preko Ca<2+>, CD38 signalizacija se odvija preko ometanja-komunikacije sa kompleksima antigen-receptor na T i B ćelijama ili drugim tipovima kompleksa receptora, npr MHC molekula, pa je na ovaj način uključen u nekoliko ćelijskih odgovora, ali takođe u prekopčavanju i sekreciji IgGl.
[0523]U jednoj realizaciji, izvesno anti-CD38 antitelo prema predmetnom pronalasku ne izaziva značajnu proliferaciju PBMC-a. U jednoj realizaciji, neko anti-CD38 antitelo prema predmetnom pronalasku ne izaziva oslobađanje značajnih nivoa IL-6. Ujednoj realizaciji, izvesno anti-CD38 antitelo prema predmetnom pronalasku ne izaziva oslobađanje detektovanih nivoa IFN-y. Takvi testovi mogu biti izmereni kao stoje opisano u Ausiello et al., Tissue antigens 56, 538-547 (2000).
[0524]Anti-CD38 antitela iz predmetnog pronalaska, kao i drugi CD38BPs kao što jc ovde opisano, mogu biti pripremljeni rekombinantnom ekspresijom u bilo kom pogodnom tipu ćelija ili životinja.
[0525]Rekombinantni CD38BPs, poput rekombinantnih antitela, kao što su rekombinantna humana antitela, obuhvataju CD38BPs, kao što su antitela, kao što su humana antitela koja se pripremaju, eksprimiraju, stvaraju ili izoluju pomoću rekombinantnih sredstava, kao što su CD38BPs, kao što su antitela, kao što su humana antitela eksprimirana korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora transficiranog u ćeliju domaćina.
[0526]Rekombinantna antitela, kao što su rekombinantna humana antitela takođe uključuju antitela izolovana iz rekombinantne kombinatorne biblioteke humanog antitela, antitela izolovana iz životinja, kao što su transgene životinje ili antitela pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na bilo koji drugi način koji podrazumeva spajanje humane sekvence nukleinske kiseline koja kodira immunoglobuline sa drugim sekvencama nukleinskih kiselina egzogenim u odnosu na humane nukleinske kiseline koje kodiraju imunoglobuline i humanih gena koji kodiraju imunoglobuline. Rekombinantna humana antitela tipično imaju varijabilne i konstantne regione poreklom od humane matične linije imunoglobulinskih sekvenci. U nekim rešenjima, međutim, takva rekombinantna humana antitela su podvrgnutain vitromutagenezi (ili, kada se koristi transgena životinja za humane Ig sekvence,in vivosomatskoj mutagenezi) i time aminokiselinske sekvence VHi VLregiona rekombinantnih antitela mogu biti sekvence koje, iako izvedene iz i vezane za humane matične linije VHi VLsekvenci, mogu da ne postoje prirodno unutar embrionskog repertoara humanog antitelain vivo.Obe vrste humanih antitela su obezbeđene u skladu sa predmetnim pronalaskom.
[0527]Pogodni postupci za proizvodnju rekombinantnog proteina su poznati u tehnici, videti na primer (Sambrook and Russell (eds.), Molecular Cloning, third edition, 2001, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, New York, USA.
[0528]Isto tako, pogodni postupci za proizvodnju antitela su poznati u tehnici i uključuju one opisane u npr Harlow et al., Antibodies: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N.Y, (1988), Harlovv and Lane: Using Antibodies: A Laboratorv Manual (Cold Spring Harbor Laboratorv Press (1999)), US 4,376,110 i Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biologv, Grccnc Publishing Assoc, and Wilcy Intcrscicncc N.Y., (1987, 1992). Monoklonska antitela sc mogu izraditi korišćenjem metode hibridoma koju su prvi opisali Kohler et al, Nature 256, 495 (1975), ili drugim dobro poznatim, kasnije razvijenim postupcima (videti, npr Goding, Monoclonal Antibodies: Principles andPractice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Hibridomi korisni u proizvodnji anti-CD38 antitela prema predmetnom pronalasku su takođe obezbeđeni predmetnim pronalaskom. Takvi hibridomi se mogu formirati hemijskom fuzijom, električnom fuzijom ili bilo kojom drugom pogodnim tehnikom, sa bilo kojim pogodnim tipom mijeloma, heteromijeloma, foblastoidne ćelije, plazmocitoma ili njihovog drugog ekvivalenta i bilo kog pogodnog tipa ćelije koje eksprimiraju antitela. Transformisane besmrtne B ćelije takođe mogu biti korišćene da efikasno proizvode antitela iz predmetnog pronalaska i takođe su obezbeđene u skladu sa predmetnim pronalaskom. Takve ćelije mogu biti proizvedene standardnim tehnikama, kao stoje transformacija sa Epštajn Barovim virusom, ili transformacionim genom. (Videti, na primer, "Kontinuirano proliferišuće humane ćelijske linije koje sintetišu antitelo predodređene specifičnosti," Zurav/aki, V.R. et al., u Monoklonskim antitelima, izd. od Kennett R.H. et al, Plenum Press, N.Y. 1980, pp 19-33). Stoga, stabilne i kontinuirane i/ili ćelije koje eksprimiraju imortalizovana anti-CD38 antitela i ćelijske linije su karakteristika predmetnog pronalaska. Eukariotske i prokariotske ćelije (npr ćelije kvasca, kontinuirane i/ili imortalizovane ćelijske linije sisara (npr izvedene ćelijske linije iz ćelija koje proizvode limfoidna antitela), biljne ćelije, ćelije insekata i bakterijske ćelije kao što su E. coli ćelije, itd) sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju CD38BP ili fragment CD38BP, obezbeđene su u skladu sa predmetnim pronalaskom. Transgene životinje, kao što su ne-humani primati, glodari (npr, hrčci, morska prasad, i pacovi - uključujući njihove modifikovane sojeve kao što su teško kombinovani imunodeficijentni (SCID) miševi i druge imunokompromitovane vrste životinja), psi, itd, koji eksprimiraju humana anti-CD38 antitela iz predmetnog pronalaska su takođe obezbeđeni u skladu sa predmetnim pronalaskom.
[0529]Rekombinantne ćelije koje sadrže egzogene nukleinske kiseline koje kodiraju CD38BPs mogu biti pripremljene bilo kojom pogodnim tehnikom (npr transfekcijom/ transformacijom sa nezaštićenim DNK plazmidskim vektorom, virusnim vektorom, invazivnim vektorom bakterijske ćelije ili drugim celim ćelijskim vektorom itd, koje sadrže CD38BP-kodirajuću sekvencu (ili sekvence) dostavljene u ćeliju olakšanom transfekcijom precipitacijom kalcijum fosfatom, ciljanja posredovanog receptorom i transfekcije, biolistik isporuke, elektroporacijom, transfekcije posredovane dekstranom, transformacije posredovane lipozomom, fuzijom protoplasta, direktno mikroinjektiranjem, itd). Postupci transformisanja/transfekcije ćelija su dobro poznati u struci (videti, npr Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratorv Press (2d Edition, 1989 and 3rd Edition, 2001) i F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biologv, Green Publishing and Wiley InterScience New York (1987). Takve rekombinantne ćelije su karakteristika u skladu sa predmetnim pronalaskom.
[0530]Ćelijske linije dostupne kao domaćini za ekspresiju rekombinantnog proteina su dobro poznate u struci i uključuju mnoge imortalizovane ćelijske linije dostupne iz American Type Culture Collection (ATCC). Ovo uključuje, inter alia, ćelije jajnika kineskog brčka (CHO), NSO, SP2 ćelije, HeLa ćelije, bubrežne ćelije mladunca hrčka (BHK ćelije), ćelije bubrega majmuna (COS), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr, Hep G2), A549 ćelije, i brojne druge ćelijske linije. Druge ćelijske linije koje se mogu koristiti su ćelijske linije insekata, kao što su Sf9 ćelije. Kada nukleinske kiseline (ili vektori koji sadrže nukleinske kiseline) kodiraju proteine, kao što su CD38BPs (uključujući anti-CD38 antitela), uvode se u sisarske ćelije domaćina, proteini, kao što su CD38BPs, mogu biti proizvedeni gajenjem ćelija domaćina u vremenskom periodu dovoljnom za ekspresiju proteina, kao što je CD38BP, u ćelijama domaćina ili sekrecijom proteina, kao što je CD38BP, u medij umu za kulturu u kome se gaje ćelije domaćina. CD38BPs mogu biti regenerisani iz medijuma za kulturu korišćenjem standardnih postupaka za prečišćavanje proteina. CD38BPs takođe mogu biti obnovljeni iz lizata ćelija domaćina kada se direktno eksprimiraju bez sekretornog signala.
[0531]CD38BPs, kao što su anti-CD38 antitela, sc takođe mogu proizvesti u bakterijskim ćelijama i eukariotskim jednoćelijskim mikroorganizmima, kao što je kvasac. Bakterijske ćelije koje proizvode CD38BPs, kao što su anti-CD38 antitela, obično nemaju normalnu glikozilaciju i proizvedena anti-CD38 antitela od strane bakterijske ćelije mogu stoga biti više ili manje deficijentna u pogledu ADCC funkcija i drugih aspekata imunog odgovora u vezi sa anti-CD38 antitelima proizvedenim u ćelijama sisara i/ili životinja (npr, angažovanje NK ćelija). Proizvedeni CD38BPs u ćelijama kvasca, kao što su anti-CD38 antitela obično pokazuju različite tipove mehanizama glikozilacije u odnosu na antitela koja su proizvedena u ćelijama sisara. Međutim, postupci za proizvodnju antitela sa efikasnom glikozilacijom u kvascu su trenutno razvijeni od strane kompanija kao što su Glvcofi, Inc. (Liban, NH, USA). Videti takođe Wildt S et al, Nat Rev Microbiol. 3(2), 119-28 (2005).
[0532]Kada se rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju CD38BP gene (uključujući gene za anti-CD38 antitelo) uvedu u sisarske ćelije domaćina, CD38BPs se proizvode gajenjem ćelija domaćina tokom perioda vremena dovoljnog da se omogući ekspresija CD38BP u ćelijama domaćina ili sekrecija antitela u medijumu za kulturu u kome se gaje ćelije domaćina. Prečišćavanje antitela i drugih CD38BPs iz ćelijskih kultura, ćelijskih lizata, i životinja (npr, iz ascitne tečnosti transgene životinje koja proizvodi anti-CD38 antitela) može se postići primenom bilo kojim brojnim pogodnim tehnikama poznatih u tehnici, uključujući, npr imunoafinitetno prečišćavanje na koloni; precipitacija sulfata; hromatofokusiranje; preparativna SDS-PAGE, i slično.
[0533]Humana monoklonska antitela iz predmetnog pronalaska mogu takođe biti proizvedena pomoću različitih drugih tehnika, uključujući konvencionalnu metodologiju monoklonskog antitela, npr standardnom tehnikom somatske hibridizacije ćelija prema Kohler and Milstein, Nature 256, 495
(1975). Druge tehnike za proizvodnju monoklonskih antitela mogu takođe biti korišćene, npr tehnike displeja faga koriste biblioteke gena humanog antitela. U jednoj realizaciji, anti-CD38 antitela iz sadašnjeg pronalaska su proizvedena korišćenjem hibridoma generisanih u mišjem sistemu. Proizvodnja hibridoma u mišu je veoma dobro uspostavljena procedura. Protokoli imunizacije i tehnike za izolaciju imunizovanih splenocita za fuziju su poznati u tehnici. Fuzioni partneri (npr, ćelije mišjeg mijeloma) i postupci fuzije su takođe poznati.
[0534]Za generisanje potpuno humanih monoklonskih antitela za CD38, transgeni ili transhromozomalni miševi koji sadrže humane imunoglobulinske gene (npr HCol2, HCo7 ili KM miševi) mogu biti imunizovani sa obogaćenim preparatom CD38 antigena i/ili ćelijama koje eksprimiraju CD38, kao što je opisano, na primer, prema Lonberg et al., (1994), supra, Fishvvild et al.,
(1996), supra, i WO 98/24884. Alternativno, miševi mogu biti imunizovani sa DNK koja kodira humani CD38. Miševi mogu biti 6-16 nedelja starosti nakon prve infuzije. Na primer, obogaćeni preparat (5-50 ug) CD38 antigena može se koristiti za imunizaciju HuMAb miševa intraperitonealno. U slučaju da imunizacija korišćenjem prečišćenog ili obogaćenog preparata CD38 antigena ne prouzrokuje stvaranje antitela, miševi mogu takođe biti imunizovani sa ćelijama koje eksprimiraju CD38, npr ćelijskim linijama, da promovišu imune odgovore.
[0535]Kumulativno iskustvo sa različitim antigenima jc pokazalo da HuMAb transgeni miševi najbolje reaguju kada su inicijalno imunizovani intraperitonealno (i.p.) ili subkutano (s.c.) sa ćelijama koje eksprimiraju CD38 u kompletnom Freund-ovom adjuvansu, praćeno svake druge nedelje i.p. imunizacijama (do ukupno 10) sa ćelijama koje eksprimiraju CD38 u PBS. Imuni odgovor se može pratiti tokom protokola imunizacije sa uzorcima plazme koji su dobijeni retroorbitalnim krvarenjima. Plazma se može pregledati FACS analizom, a miševi sa dovoljnim titrom anti-CD38 humanog imunoglobulina se mogu koristiti za fuzije. Miševi mogu biti pojačani intravenski sa ćelijama koje eksprimiraju CD38 na primerima 4 i 3 dana pre žrtvovanja i uklanjanja slezine.
[0536]Za generisanje hibridoma koji proizvode humana monoklonska antitela za humani CD38, splenociti i ćelije limfnih čvorova iz imunizovanih miševa mogu biti izolovane i fuzionisane sa odgovarajućom imortalizovanom ćelijskom linijom, kao što je ćelijska linija mišjeg mijeloma. Dobijeni hibridomi se zatim mogu testirati na proizvodnju antigen-specifičnih antitela. Na primer, suspenzije pojedinačnih ćelija limfocita slezine iz imunizovanih miševa mogu biti fuzionisane sa SP2/0 nesekretornim ćelijama mišjeg mijeloma (ATCC, CRL 1581) sa 50% PEG-a (m/v). Ćelije mogu biti postavljene u približno 1 x 105 po bazenčiću u mikrotitarskoj ploči sa ravnim dnom, što je praćeno dvonedeljnom inkubacijom u selektivnom medijumu koji sadrži pored uobičajenih reagenasa 10% fetalnog serumskog klona, 5-10% origen hibridoma klonirajućeg faktora (IGEN) i lx HAT (Sigma). Nakon otprilike dve nedelje, ćelije mogu biti kultivisane u podlozi u kojoj je HAT zamenjen sa HT. Individualni bazenčići se zatim mogu skenirati ELISA tehnikom na humani kappa-laki lanac koji sadrži antitela i FACS analizom korišćenjem ćelija koje eksprimiraju CD38 za CD38 specifičnost. Jednom kada nastane obiman rast hibridoma, medijum se može posmatrati obično nakon 10-14 dana. Antitelo koje luče hibridomi može biti obloženo, ponovo pregledano, i ako je jos uvek pozitivno na humani IgG, anti-CD38 monoklonska antitela mogu biti subklonirana najmanje dva puta ograničavanjem razblaženja. Stabilni subklonovi mogu zatim biti kultivisaniin vitroda generišu antitelo u medijumu za kulturu tkiva radi karakterizacije.
[0537]Humana antitela iz predmetnog pronalaska mogu takođe biti proizvedena u transfektomu ćelije domaćina korišćenjem, na primer, kombinacije tehnika rekombinantne DNK i postupaka genske transfekcije kao što jc dobro poznato u tehnici, videti na primer Morrison, S., Science 229, 1202 (1985).
[0538]Na primer, za ekspresiju antitela, ili njegovih fragmenata, DNK koje kodiraju delove ili cele dužine lakih i teških lanaca, mogu se dobiti standardnim tehnikama molekularne biologije (naprimer PCR amplifikacijom, mestom usmerene mutageneze) i mogu se ubaciti u ekspresione vektore tako da su geni operativno vezani za transkripcione i translacione kontrolne sekvence. U ovom kontekstu, izraz "operativno vezan" namerava da označi da je gen za antitelo vezan u vektoru tako da transkripcione i translacione kontolne sekvence unutar vektora služe svoju namenjenu funkciju regulisanja transkripcije i translacije gena za antitelo. Ekspresioni vektor i sekvence za kontrolu ekspresije su odabrane tako da budu kompatibilne sa korišćenom ekspresionom ćelijom domaćina. Gen za laki lanac antitela i gen za teški lanac antitela mogu biti ubačeni u odvojene vektore ili, tipičnije, oba gena su ubačena u isti ekspresioni vektor. Geni za antitela se mogu ubaciti u ekspresioni vektor standardnim postupcima (npr, vezivanjem komplementarnih restrikcionih mesta na fragmentu gena antitela i vektora, ili vezivanjem tupim krajem ukoliko nisu prisutna restrikciona mesta). Varijabilni regioni lakih i teških lanaca antitela koji su ovde opisani mogu da se koriste za kreiranje pune-dužine gena za antitela bilo kog izotipa antitela njihovim ubacivanjem u ekspresione vektore već kodiranih konstantnih regiona teškog lanca i lakog lanca željenog izotipa tako da je VHsegment operativno vezan sa CHsegmentom (-ima) unutar vektora i VLsegment je operativno vezan sa CLsegmentom unutar vektora. Dodatno ili alternativno, rekombinantni ekspresioni vektor može da kodira signalni peptid koji olakšava sekreciju lanca antitela iz ćelije domaćina. Gen za lanac antitela može da se klonira u vektor tako da je signalni peptid vezan u okviru prema amino završetku gena za lanac antitela. Signalni peptid može biti imunoglobulinski signalni peptid ili heterologni signalni peptid (tj, signalni peptid iz ne-imunoglobulinskog proteina).
[0539]Pored gena za lance antitela, rekombinantni ekspresioni vektori iz sadašnjeg pronalaska nose regulatorne sekvence koje omogućavaju i kontrolišu ekspresiju gena za lance antitela u ćeliji domaćina.
[0540]Pored gena za lanac antitela i regulatornih sekvenci, rekombinantni ekspresioni vektori iz pronalaska mogu da nose dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćina (npr, počeci replikacije) i selektivni marker gena. Selektivni marker gen olakšava selekciju ćelija domaćina u koju je uveden vektor (videti na primer US 4,399,216, US 4,634,665 i US 5,179,017). Na primer, tipično selektivni marker gen daje otpornost na lekove, kao što su G418, higromicin ili metotreksat, na ćeliji domaćina u koju je vektor uveden. Primeri selektivnih marker gena uključuju dihidrofolat reduktaze (DHFR) gen (za upotrebu u ćelijama domaćinima-dhfr sa selekcijom/amplifikacijom metotreksata) i neo gen (za selekciju G418).
[0541]Za ekspresiju lakih i teških lanaca, ekspresioni vektor (i) koji kodira teške i lake lance je transfektovan u ćeliju domaćina standardnim tehnikama. Ćelije domaćina mogu biti prokariotske ili eukariotske, kao što su ćelije domaćina sisara. Na primer fragmenti za vezivanje antigena mogu biti eksprimirani u prokariotskim ćelijama domaćina i antitela cele dužine mogu biti eksprimirana u eukariotskim ćelijama domaćina.
[0542]U jednoj realizaciji antitela su eksprimirana u eukariotskim ćelijama, kao što su ćelije domaćina sisara. Primeri ćelija domaćina sisara za ekspresiju rekombinantnih antitela prema predmetnom pronalasku obuhvataju CHO ćelije (uključujući DHFR-CHO ćelije, opisane u Urlaub and Chasin, PNAS USA 77, 4216-4220 (1980), korišćene sa selektivnim markerom DHFR, na primer kao što je opisano u RJ. Kaufman and P.A. Sharp, Mol. Biol. 159, 601-621 (1982)), NS/0 mijeloma ćelije, COS ćelije, HEK293 ćelije i SP2.0 ćelije. Posebno za upotrebu sa NS/0 ćelijama mijeloma, još jedan primer sistema ekspresije je GS (glutamin sintetaze) sistem ekspresije gena otkriven u WO87/04462, WO89/01036 i EP338841.
[0543]Takvi CD38BP geni mogu biti izraženi u drugim ekspresionim sistemima, uključujući prokariotske ćelije, kao što su mikroorganizmi, npr E. coli za proizvodnju scFv antitela, algi, kao i ćelije insekata. Štaviše, CD38BPs mogu biti proizvedeni u transgenim ne-humanim životinjama, kao što su u mleku od ovaca i zečeva ili kokošijim jajima ili u transgenim biljkama. Videti na primer Verma, R. et al., J.Immunol. Meth. 216, 165-181 (1998), Pollock et al, J.Immunol. Meth. 231, 147-157 (1999) i Fischcr, R. ct al, Biol. Chem. 380, 825-839 (1999).
[0544]Bispecifični i multispecifični CD38BPs predmetnog pronalaska se mogu izraditi korišćenjem hemijskih tehnika (videti na primer D.M. Kranz et al., PNAS USA 78, 5807 (1981)), "polidoma" tehnika (videti US 4,474,893) ili tehnika rekombinantne DNK.
[0545]Bispecifična antitela iz predmetnog pronalaska se mogu proizvesti pomoću različitih poznatih postupaka, uključujući fuziju hibridoma ili vezivanje Fab' fragmenata (videti na primer Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79, 315-321 (1990) i Kostelni et al, J. Immunol. 148, 1547-1553
(1992)). Tradicionalno, rekombinantna proizvodnja bispecifičnih antitela se zasniva na ko-ekspresiji dva imunoglobulinska para teškog lanca-lakog lanca, gde dva teška lanca imaju različite specifičnosti (videti na primer Milstein and Cuello, Nature 305, 537 (1983)). Zbog nasumičnog asortimana imunoglobulinskih teških i lakih lanaca, ovi hibridomi (kvadromi) proizvode potencijalnu smešu 10 različitih molekula antitela, od kojih samo jedan ima ispravnu bispecifičnu strukturu. Slične procedure su otkrivene u WO 93/08829 i Traunecker et al, EMBO J. 10, 3655 (1991).
[0546]Prema drugom pristupu, varijabilni domeni antitela sa željenim specifičnostima vezivanja (antitelo-antigen kombinujuća mesta) su spojeni sa konstantnim domenom imunoglobulinske sekvence rekombinantnim ili sintetskim postupcima. Varijabilni domen sekvence se obično fuzioniše sa imunoglobulinskim teškim lancem konstantnog domena, koji sadrži najmanje deo zglobnih, CH2, i CH3 regiona. Takođe tipično, konstantni region prvog teškog lanca (CH1), koji sadrži mesto neophodno za vezivanje lakog lanca, je takođe prisutan u najmanje jednom od fuzionih peptida. U specifičnijem primeru ovakvog pristupa, bispecifično antitelo koje je proizvedeno sadrži hibridni teški lanac imunoglobulina sa prvom specifičnošću vezivanja u jednom kraku, a hibridni par od teškog lanca i lakog lanca imunoglobulina (obezbeđuje drugu specifičnost vezivanja) u drugom kraku. Takva asimetrična struktura može da olakša odvajanje željenog bispecifičnog jedinjenja od neželjenih kombinacija lanaca imunoglobulina (takav pristup je opisan u WO 94/04690). Za više detalja oko generisanja bispecifičnih antitela videti, na primer, Suresh et al, Methods in Enzimologv 121, 210 (1986).
[0547]U drugom pristupu, može se konstruisati međupovršina između para molekula antitela da se maksimizira procenat heterodimera koji su oporavljeni iz rekombinantne ćelijske kulture tako da formiraju populaciju bispecifičnih molekula antitela. Tipično, takva međupovršina sadrži najmanje deo CH3 domena jednog konstantnog regiona antitela. Normalno u takvom postupku jedan ili više aminokiselinskih ostataka sa manjim bočnim lancima sa međupovršine prvog molekula antitela je zamenjeno sa aminokiselinskim ostacima sa većim bočnim lancima (kao što je tirozin ili triptofan). Kompenzatorne "šupljine" identične ili slične veličine prema velikom bočnom lancu aminokiselinskog ostatka (-aka) se kreiraju na međupovršini drugog molekula antitela zamenom ostataka velikog bočnog lanca aminokiseline sa manjim (kao što su alanin ili treonin). Ovo može obezbediti mehanizam za povećanje prinosa heterodimera nad drugim neželjenim krajnjim proizvodima kao što su homodimeri.
[0548]Bispecifični i multispecifični molekuli predmetnog pronalaska mogu biti pripremljeni konjugacijom bitnih vezivnih specifičnosti, npr anti-FcR i anti-CD38 vezujuće specifičnosti, korišćenjem postupaka poznatih u tehnici. Na primer, svaka specifičnost vezivanja bispecifičnog i multispecifičnog molekula može biti generisana odvojeno i zatim konjugovane jedna sa drugom. Kada su specifičnosti vezivanja proteini ili peptidi, razni agensi kuplovanja ili unakrsnog vezivanja mogu biti korišćeni za kovalentno vezivanje. Primeri unakrsno vezujućih agenasa obuhvataju protein A, karbodiimid, N-sukcinimidil-S-acetil-tioacetat (SATA), 5,5'-ditiobis (2-nitro-benzojeva kiselina)
(DTNB), o-fenilenedimaleimid (oPDM), N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP) i sulfosukcinimidil 4-(N-maleimidometil) cikloheksan-l-karboksilat (sulfo-SMCC), videti na primer Karpovsky et al, J. Exp. Med. 160, 1686 (1984), Liu, M. A. et al, PNAS USA 82, 8648 (1985). U drugom primeru, Brennan et al., Science 229, 81 (1985) opisuju postupak u kojem se intaktna antitela proteolitički cepaju da generišu F(ab')2fragmente. Ovi fragmenti su redukovani u prisustvu ditiol kompleksirajućeg agensa natrijum arsenita koji stabiliše susedne ditiole i sprečava intermolekularno formiranje disulfida. Generisani Fab' fragmenti zatim mogu biti konvertovani do tionitrobenzoat (TNB) derivata. Jedan od derivata Fab'-TNB se zatim može rekonvertovati do Fab'-tiola redukcijom sa merkaptoetilaminom i mešanjem sa ekvimolarnom količinom drugog Fab'-TNB derivata da formira bispecifično antitelo. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217-225 (1992) opisuje proizvodnju potpuno humanizovanog bispecifičnog antitela F(ab')2molekula, prema povezanoj tehnici. Drugi postupci uključuju one koji su opisani prema Paulus (Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132 (1985)) i Glennie et al., J. Immunol. 139, 2367-2375 (1987). Primeri konjugacionih agenasa su SATA i sulfo-SMCC, oba dostupna od Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
[0549]Kada su antitela vezujuće specifičnosti, mogu biti konjugovana preko sulfhidrilnog vezivanja C-terminalnih zglobnih regiona od dva teška lanca. U jednom aspektu, zglobni region je modifikovan da sadrži neparan broj sulfhidrilnih ostataka, na primer jedan, pre konjugacije.
[0550]Alternativno, obe specifičnosti vezivanja mogu biti kodirane u istom vektoru i eksprimirane i montirane u istoj ćeliji domaćina. Ovaj postupak je naročito koristan kada je bispecifičan i multispecifičan molekul mAt x mAt, mAt x Fab, Fab x F (ab')2ili ligand x Fab fuzioni protein. Bispecifičan i multispecifičan molekul iz predmetnog pronalaska, npr bispecifičan molekul može biti jednolančani molekul, kao što je jedan lanac bispecifičnog antitela, jednolančani bispecifičan molekul sadrži jedan lanac antitela i vezujuću determinantu ili jednolančani bispecifičan molekul sadrži dva vezujuće determinante. Bispecifični i multispecifični molekuli mogu takođe biti pojedinačni molekuli lanca ili mogu sadržati najmanje dva pojedinačna molekula lanca. Postupci za pripremanje bi- i multispecifičnih molekula su opisani na primer u US 5,260,203, US 5,455,030, US 4,881, 175, US 5,132,405, US 5,091,513, US 5,476,786, US 5,013,653, US 5.258.498 i US 5,482,858.
[0551]Različite tehnike za izradu i izolovanje bispecifičnih fragmenata antitela direktno iz rekombinantne ćelijske kulture su takođe opisane. Na primer, bispecifična antitela su proizvedena upotrebom leucinskih patent zatvarača (videti na primer Kostelny et al., J. Immunol. 148(5), 1547-1553
(1992)). Leucinski patent zatvarač peptidi iz Fos i Jun proteina mogu biti vezani sa Fab' delovima dva različita antitela genskom fuzijom i dobijena homodimerna antitela su redukovana na zglobnom regionu da formiraju monomere koji mogu biti ponovo oksidovani da se formiraju heterodimerna antitela. Takva "dvojno antitelo" tehnologija opisana prema Hollingcr ct al, PNAS USA 90, 6444-6448 (1993) jc takođe obezbedila alternativni mehanizam za izradu fragmenata bispecifičnog antitela. Druga strategija za izradu fragmenata bispecifičnog antitela korišćenjem jednolančanih Fv (sFv) dimera takođe je prijavljena. Videti na primer Gruber et al, J. Immunol. 152, 5368 (1994).[0552]Pored toga, bispecifična antitela mogu biti formirana kao "dvojna antitela" (Holliger et al., PNAS USA, 90, 6444-6448 (1993)) ili "Janusins" (Traunecker et al., EMBO J 10, 3655-3659 (1991) i Traunecker et al., Int J Cancer Suppl 7, 51-52 (1992)). Bispecifična antitela, po definiciji, ne postoje u obliku fragmenata koji imaju jedno mesto vezivanja (npr Fab, Fab' i Fv fragmenti, koji su takođe obezbeđeni sadašnjim pronalaskom).
[0553]Vezivanje bispecifičnih i multispecifičnih molekula za njihove specifične ciljeve može biti potvrđeno pomoću enzimski-povezanog imunosorbentnog testa (ELISA), jednog radioimuno testa (RIA), FACS analizama, jednog biološkog testa (npr inhibicija rasta), ili Western blot analizom. Svako od ovih ispitivanja generalno detektuje prisustvo kompleksa protein-antitelo od posebnog interesa korišćenjem obeleženog reagensa (npr antitela) specifičnog za kompleks od interesa. Na primer, kompleksi FCR-antitela mogu biti detektovani korišćenjem npr, antitela ili fragmenta antitela enzimski povezanog koje prepoznaje i specifično se vezuje za antitelo-FCR kompleksa. Alternativno, kompleksi se mogu detektovati korišćenjem bilo kojih od različitih drugih imunotestova. Na primer, antitelo može biti radioaktivno obeleženo i korišćeno u radioimuno testu (RIA) (videti, na primer, VVeintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March 1986). Radioaktivni izotop se može detektovati takvim sredstvima kao što je upotreba y brojača ili scintilacionog brojača ili autoradiografijom.
[0554]Kao što je ranije navedeno, antitela stupaju u interakciju sa ciljnim antigenima, prvenstveno preko aminokiselinskih ostataka koji se nalaze u šest teških i lakih lanaca hipervarijabilnih regiona ili regiona koji određuju komplementarnost (CDRs). Ovde su obezbeđena antitela koja imaju CDR regione identične sa ili na drugi način izvedene iz CDR regiona od -003 ili -024. Takva antitela mogu biti generisana konstrukcijom ekspresionih vektora koji uključuju CDR sekvence iz -003 ili -024 nakalemljene na okvirne sekvence iz različitih antitela sa različitim svojstvima.
[0555]Antitela u skladu sa pronalaskom mogu imati CDR regione identične sa ili na drugi način izvedene iz CDR regiona od -005. Takva antitela mogu biti generisana konstrukcijom ekspresionih vektora koji uključuju CDR sekvence iz -005 nakalemljene na okvirne sekvence iz različitih antitela sa različitim svojstvima.
[0556]Takve okvirne sekvence se mogu dobiti iz javnih DNK baza podataka koje uključuju gensku sekvencu embrionskih antitela. Ove sekvence matične linije će se razlikovati od genskih sekvenci zrelih antitela jer neće uključivati u potpunosti okupljene varijabilne gene, koji nastaju V (D) J pridruživanjem tokom sazrevanja B ćelija. Embrionske genske sekvence će se takođe razlikovati od sekvenci jednog visoko afinitetnog antitela sekundarnog repertoara koje sadrže mutacije preko celog varijabilnog gena ali su obično grupisane u CDR regionima. Na primer, somatske mutacije su relativno retke u amino terminalnom delu okvirnog regiona 1 i karboksi-terminalnom delu okvirnog regiona 4. Iz tog razloga, nije potrebno da sc dobije cela DNK sekvenca određenog antitela da bi sc ponovo stvorilo netaknuto rekombinantno antitelo koje ima svojstva vezivanja slična onima kod originalnog antitela (videti WO 99/45962). Delimična sekvenca teškog i lakog lanca koja obuhvata CDR regione je obično dovoljna za ovu svrhu. Delimična sekvenca je korišćena da se odredi koja embrionska promenjiva i spajanje genskih segmenata doprinose varijabilnim genima rekombinovanog antitela. Embrionska sekvenca se zatim koristi da popuni nedostajuće delove varijabilnih regiona. Lider sekvence teškog i lakog lanca se cepaju tokom proteinskog sazrevanja i ne doprinose svojstvima finalnog antitela. Da se dodaju nedostajuće sekvence, klonirane cDNK sekvence mogu biti kombinovane sa sintetskim oligonukleotidima vezivanjem ili PCR amplifikacijom. Alternativno, ceo varijabilni region može biti sintetizovan kao skup kratkih, preklapajućih, oligonukleotida i kombinovanih PCR amplifikacijom da se kreira potpuno sintetski klon varijabilnog regiona. Ovaj proces ima određene prednosti kao što su eliminacija ili uključivanje ili posebno ograničena mesta, ili optimizacija posebnih kodona.
[0557]Transkripti nukleotidnih sekvenci teškog i lakog lanca iz hibridoma su korišćeni za dizajniranje preklapajućeg kompleta sintetskih oligonukleotida da stvore sintetske V sekvence sa identičnim aminokiselinskim kapacitetima kodiranja kao prirodne sekvence. Sintetske sekvence teškog i kapa lanca se mogu razlikovati od prirodnih sekvenci na tri načina: nizovi ponovljenih nukleotidnih baza su prekinuti da olakšaju sintezu oligonukleotida i PCR amplifikaciju; optimalna mesta početka translacije su inkorporirana prema Kozak-ovim pravilima (Kozak, J. Biol. Chem. 266, 19867-19870 (1991); iHinćlllmesta su projektovana ushodno od mesta početka translacije.
[0558]Za oba teškog i lakog lanca varijabilne regione, optimizovano kodiranje i odgovarajuće ne-kodiranje, lančane sekvence se prekidaju u 30-50 nukleotida otprilike na sredini odgovarajućeg ne-kodirajućeg oligonukleotida. Tako, za svaki lanac, oligonukleotidi mogu da se sklope u preklapajuće dvolančane komplete koji obuhvataju segmente od 150-400 nukleotida. Bazeni se zatim koriste kao templejti za proizvodnju PCR amplifikacionih proizvoda od 150-400 nukleotida. Tipično, jedan varijabilni region oligonukleotidnog kompleta će biti prekinut u dva bazena koji se posebno amplificiraju da generišu dva preklapajuća PCR proizvoda. Ovi preklapajući proizvodi se zatim kombinuju pomoću PCR amplifikacije da formiraju kompletan varijabilni region. Takođe može biti poželjno uključivanje preklapajućeg fragmenta konstantnog regiona teškog ili lakog lanca (uključivanjemBbslmesta od lakog lanca kapa iliAgelmesta od teškog lanca gama) u PCR amplifikaciji da se generišu fragmenti koji se mogu lako klonirati u konstmktima ekspresionog vektora.
[0559]Rekonstruisani varijabilni regioni teškog i lakog lanca se zatim kombinuju sa kloniranim promoterom, liderom, inicijacijom translacije, konstantnim regionom, 3' ne-translancionim, poliadenilacijom, i završetkom transkripcije, sekvencama koje formiraju konstrukte ekspresionog vektora. Ekspresioni konstrukti teškog i lakog lanca mogu biti kombinovani u jedan vektor, ko-transficirani, serijski transficirani ili odvojeno transficirani u ćelijama domaćina koje su zatim fuzionisane tako da formiraju ćeliju domaćina koja eksprimira oba lanca.
[0560]Sličan postupak može se pratiti na grafitu nove antigenske-specifičnosti u postojećem zrelom antitelu. Tipično, akceptorsko antitelo je izabrano tako da potiče iz iste promenljive germinativne linije gena kao CDR-donorsko antitelo, ali druga akccptorska antitela mogu takođe mogu biti izabrana. Jedan ili više CDR regiona iz donorskog antitela se zatim prenose korišćenjem tehnika gore opisanih.
[0561]U jednoj realizaciji kao što je ovde opisano, strukturne karakteristike -003 i -005 i -024 su korišćene za kreiranje strukturno srodnih anti-CD38 antitela, na primer humanih anti-CD38 antitela, koja zadržavaju najmanje jednu funkcionalnu karakteristiku od -003 i -005 i -024, odnosno vezivanje za CD38. Preciznije, jedan ili više CDR regiona iz -003 ili -005 i -024 može biti kombinovan rekombinantno sa poznatim humanim okvirnim regionima i CDR regionima da se kreiraju dodatna, rekombinantno-konstruisana, humana anti-CD38 antitela.
[0562]Primeri plazmida za upotrebu u konstrukciji ekspresionih vektora za humani IgGksu opisani u nastavku. Ovi plazmidi su konstruisani tako da se PCR pojačane cDNK sekvence V kapa teškog i V kapa lakog lanca mogu koristiti za rekonstrukciju kompletnih minigena teškog i lakog lanca. Ovi plazmidi mogu biti korišćeni da eksprimiraju potpuno humana IgGl,kili IgG4,kantitela. Slični plazmidi mogu biti konstruisani za ekspresiju drugih izotipova teškog lanca, ili za ekspresiju antitela koje sadrže lambda lake lance.
[0563]CD38BP antitela predmetnog pronalaska, kao što su humana anti-CD38 antitela iz predmetnog pronalaska, mogu biti izolovana i okarakterisana određenim brojem različitih načina. Na primer, odabrani hibridomi mogu biti uzgajani u odgovarajućim posudama za monoklonsko prečišćavanje antitela. Supernatanti zatim mogu biti filtrirani i koncentrovani pre afinitetne hromatografije sa protein A-sefarozom (za antitela IgGl izotipa) (Pharmacia, Piscataway, NJ) ili obloženom sefarozom anti-humanim IgG ili protein G-sefarozom u slučaju antitela IgG3 izotipa. Eluiran IgG može biti proveren gel elektroforezom i tečnom hromatografijom visoke performanse da se osigura čistoća. Rastvor pufera se može zameniti u PBS, a koncentracija može biti određena pomoću OD2gokorišćenjem 1,43 koeficijenta ekstinkcije. Monoklonska antitela mogu biti alikvotirana i čuvana na -80° C.
[0564]Da bi se odredilo da li se izabrani CD38BPs, kao što su humana anti-CD38 monoklonska antitela, vezuju za jedinstvene epitope, mestom usmerena ili na više mesta usmerena mutageneza može biti korišćena.
[0565]Da bi se odredio izotip prečišćenih antitela, može se izvesti ELISA izotipa. Bazenčići mikrotitarskih ploča mogu biti obloženi sa 10 ug/ml anti-humanog Ig preko noći na 4°C. Nakon blokiranja sa 5% BSA (goveđim serumskim albuminom), ploče su reagovale sa 10 ug/ml monoklonskih antitela ili prečišćenih kontolnih izotipa, na sobnoj temperaturi tokom dva sata. Bazenčići mogu zatim da reaguju bilo sa humanim IgGl, IgG2, IgG3 ili IgG4, IgE, IgAl, IgA2 ili humanim IgM-specifičnom alkalnom fosfatazom-konjugovanim probama. Nakon ispiranja, ploče su razvijene sa pNPP supstratom (1 mg/ml) i analizirane pomoću OD na 405 nm.
[0566]Da bi se pokazalo prisustvo anti-CD38 antitela u serumima imunizovanih miševa ili vezivanje CD38BP-a (uključujući anti-CD38 antitela) za žive ćelije koje eksprimiraju CD38, može se koristiti protočna citometrija. Ukratko, ćelijske linije koje eksprimiraju CD38 (gajen pod standardnim uslovima rasta) su pomešane sa različitim koncentracijama CD38BP-a u PBS-u koji sadrži 0,1% BSA i 0,02% natrijum-azida, i inkubirane na 4° C tokom 30 minuta. Nakon ispiranja, ćelije reaguju sa fluorescein obclcžcnim anti-humanim IgG antitelom pod istim uslovima kao primarno bojenje antitela. Uzorci mogu biti analizirani protočnom citometrijom sa protočnim citometrom (npr, Becton Dickinson FACS instrument) koristeći svojstva rasejavanja svetlosti i pod pravim uglom za prolaz ka pojedinačnim, živim ćelijama. Alternativni test korišćenjem fluorescentnog mikroskopa se može koristiti (kao dodatak ili umesto) testa protočne citometrije. Ćelije mogu biti obojene tačno kako je gore opisano i ispitane fluorescentnom mikroskopijom. Ovaj metod omogućava vizualizaciju pojedinačnih ćelija, ali može imati umanjenu osetljivost u zavisnosti od gustine antigena.
[0567]CD38BPs, kao što su anti-CD38 humani IgG-i, mogu dalje biti testirani za reaktivnost sa CD38 antigenom putem Western blotting-a. Ukratko, ćelijski ekstrakti iz ćelija koje eksprimiraju CD38 se mogu dobiti i podvrgnuti natrijum dodecil sulfat (SDS) poliakrilamidnoj gel elektroforezi. Nakon elektroforeze, razdvojeni antigeni će biti prebačeni na nitrocelulozne membrane, blokirane sa 20% nemasnog mleka, i ispitivani sa CD38BP-ima koji se testiraju. Vezivanje humanog IgG se može detektovati korišćenjem anti4iumanog IgG alkalne fosfataze i razvijene sa BCIP/NBT substratnim tabletama (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO), ali detektujući agensi usmereni na druge specifične delove CD38BP-a se takođe mogu koristiti.
[0568]Dodatno specifičnom vezivanju za CD38, CD38BPs (uključujući humana anti-CD38 antitela) mogu biti testirani na njihovu sposobnost da inhibiraju različite aktivnosti ćelija koje eksprimiraju CD38, kao što su, ali nisu ograničene na proizvodnju insulina, oslobađanje Ca<2+>, proizvodnju citokina, indukciju lize, diferencijaciju i proliferaciju.
[0569]U jednoj realizaciji, ovde su obezbeđene transgene i transhromozomske nehumane životinje, kao što su transgeni ili transhromozomski miševi, koji su sposobni da eksprimiraju humana antitela koja se specifično vezuju za CD38. U posebnoj realizaciji, ovde je obezbeđen transgeni ili transhromozomski miš koji ima genom koji sadrži humani teški lanac transgena, tako da miš proizvodi humana anti-CD38 antitela kada je imunizovan sa ćelijama koje eksprimiraju CD38. Transgeni humanog teškog lanca mogu biti integrisati u hromozomalnu DNK miša, kao što je slučaj za transgene, npr HuMAb miševa, kao što je detaljno opisano ovde. Alternativno, transgeni humanog teškog lanca se mogu održavati ekstrahromozomalno, kao što je slučaj za transhromozomalne (npr KM) miševe kao što je opisano u WO 02/43478. Takve transgene i transhromozomalne životinje su sposobne da proizvedu višestruke izotipove humanih monoklonskih antitela za CD38 (npr, IgG, IgA i/ili IgE) podvrgavanjem V-D-J/V-J rekombinaciji i promeni izotipa. Dizajn transgene ili transhromozomske nehumane životinje koja odgovara na stimulaciju stranim antigenom sa heterolognim repertoarom antitela, zahteva da heterologni imunoglobulinski transgeni sadržani unutar transgene životinje pravilno fukcionišu od početka do kraja razvojnog puta B ćelija. Ovo uključuje, na primer, zamenu izotipa heterolognog teškog lanca transgena. Shodno tome, transgeni su konstruisani tako da zamena izotipa može biti indukovana i jedna ili više od sledećih karakteristika od gena antitela: (1) na visokom nivou i ćelijskog tipa specifična ekspresija, (2) funkcionalno preuređenje gena, (3) aktivacija i odgovor do alelnog isključenja, (4) ekspresija dovoljnog primarnog repertoara, (5) transdukcija signala, (6) somatska hipermutacija, i (7) dominacija lokusa transgenog antitela tokom imunog odgovora.
[0570]Nc moraju svi od navedenih kriterijuma da budu ispunjeni. Na primer, u onim varijantama gde su endogeni imunoglobulinski lokusi transgene životinje funkcionalno narušeni, transgen ne mora aktivirati alelno isključivanje. Dalje, u onim realizacijama gde transgen sadrži funkcionalno preuređen gen teškog i/ili lakog lanca imunoglobulina, drugi kriterijum funkcionalnog preuređenja gena je nepotreban, bar za taj transgen koji je već preuređen. Za pozadinu molekularne imunologije, videti, Osnovna imunologija, drugo izdanje (1989), Paul William E., izd. Raven Press, N.Y.
[0571]U izvesnim realizacijama, transgene ili transhromozomske nehumane životinje korišćene za generisanje humanih monoklonskih antitela iz sadašnjeg pronalaska sadrže preuređene, nepreuređene ili kombinaciju preuređenih i nepreuređenih heterolognih transgena imunoglobulinskog teškog i lakog lanca u embrionu transgene životinje. Svaki od teških lanaca transgena sadrži najmanje jedan CHgen. Pored toga, teški lanac transgena može sadržati funkcionalne sekvence izotipske zamene, koje su sposobne da podrže izotipsko prebacivanje heterolognog transgena koji kodira višestruke CHgene u B ćelijama transgene životinje. Takve sekvence zamene mogu biti one koje se prirodno javljaju u embrionskom imunoglobulinskom lokusu iz vrsta koje služe kao izvor transgena CHgena ili takve sekvence zamene mogu biti izvedene od onih koje se dešavaju u vrstama koje treba da prime transgeni konstrukt (transgena životinja). Na primer, humani transgeni konstrukt koji se koristi za proizvodnju transgenog miša može proizvesti veću frekvenciju događaja izotipske zamene ako inkorporira sekvence zamene slične onima koje se prirodno javljaju u lokusu mišjeg teškog lanca, jer su verovatno mišje sekvence zamene optimizovane da funkcionišu sa mišjim rekombinaza enzimskim sistemom zamene, dok humane sekvence zamene to nisu. Sekvence zamene mogu biti izolovane i klonirane konvencionalnim postupcima kloniranja, ili mogu biti sintetizovanede novoiz preklapanja sintetskih oligonukleotida dizajniranih na osnovu objavljenih informacija sekvenci koje se odnose na sekvence zamene imunoglobulinskog regiona (Mills et al, Nucl. Acids Res. 15, 7305-7316 (1991) Sideras et al., Tntl. Immunol. 1, 631-642 (1989)). Za svaku od navedenih transgenih životinja, funkcionalno preuređeni transgeni heterolognog imunoglobulinskog teškog i lakog lanca mogu se naći u značajnoj frakciji B ćelija iz transgene životinje (najmanje 10%).
[0572]Transgeni korišćeni za generisanje transgenih nehumanih životinja kao što je ovde opisano uključuju transgen teškog lanca koji sadrži DNK koja kodira najmanje jedan varijabilni genski segment, jedan genski segment različitosti, jedan spojni genski segment i najmanje jedan konstantni region genskog segmenta. Transgen imunoglobulinskog lakog lanca sadrži DNK koja kodira najmanje jedan varijabilni segment gena, jedan spojni segment gena i najmanje jedan konstantni region segmenta gena. Segmenti gena koji kodiraju segmente gena lakog i teškog lanca su heterologni u transgenoj životinji u tome da su izvedeni iz, ili odgovaraju, DNK koja kodira imunoglobulinske teškog i lakog lanca segmente gena od vrsta koje se ne sastoje od transgene nehumane životinje. U jednoj realizaciji kao što je ovde opisano, transgen je konstruisan tako da su pojedinačni segmenti gena nepreuređeni, tj, nisu preuređeni tako da kodiraju funkcionalni imunoglobulinski laki ili teški lanac. Ovakvi nepreuređeni transgeni podržavaju rekombinaciju V, D i J genskih segmenata (funkcionalna preuređivanja) i mogu da podrže inkorporiranje svih ili dela D regiona segmenta gena u rezultanti preuređenog imunoglobulinskog teškog lanca unutar transgene životinje kada sc izloži CD38 antigenu.
[0573] U alternativnom rešenju, transgeni sadrže jedan nepreuređeni "mini-lokus". Takvi transgeni tipično sadrže značajan deo C, D i J segmenata kao i podskup V segmenata gena. U takvim transgenim konstruktima, različite regulatorne sekvence, npr promoteri, pojačivači, klase regionskih zamena, spojene-donorske i spojene-akceptorske sekvence za obradu RNK, rekombinaciju signala i slično, obuhvataju odgovarajuće sekvence izvedene iz heterologne DNK. Ovakve regulatorne sekvence mogu biti inkorporirane u transgenu od istih ili srodnih vrsta nehumane životinje korišćenih u predmetnom pronalasku. Na primer, genski segmenti humanih imunoglobulina se mogu kombinovati u transgen sa inhenser sekvencom glodara imunoglobulina za primenu u transgenom mišu. Alternativno, sintetske regulatorne sekvence mogu biti uključene u transgene, pri čemu takvi sintetske regulatorne sekvence nisu homologne sa funkcionalnom sekvencom DNK za koju se zna da se prirodno javlja u genomima sisara. Sintetske regulatorne sekvence su dizajnirane prema pravilima konsenzusa, kao što su, na primer, one koje određuju dozvoljene sekvence spojenog-akceptorskog mesta ili promotera/pojačivača motiva. Na primer, minilokus sadrži deo genomskog imunoglobulinskog lokusa koji ima najmanje jedno interno (tj ne na delu završetka) brisanje ne-esencijalnog DNK dela (npr intervenišuća sekvenca; intron ili njegov deo) u poređenju sa prirodnim embrionskim Ig lokusom.
[0574] Primeri transgenih i transhromozomskih nehumanih životinja, kao što su miševi, ispoljiće proizvodnju imunoglobulina sa značajnim repertoarom, idealno suštinski sličnu onoj kod čoveka nakon podešavanja zapremine.
[0575] Repertoar će idealno biti približan onom prikazanom kod čoveka kada je prilagođen zapremini, obično sa raznolikošću najmanje oko 10% kao velikom, kao što je 25 do 50% ili više. Generalno, najmanje oko hiljadu različitih imunoglobulina (idealno IgG) kao što je IO<4>do IO<6>ili više, biće proizvedeno, u zavisnosti od broja različitih V, J i D regiona uvedenih u mišji genom i vođenih dodatnim različitostima generisanim V(-D-)J genskim segmentom preraspodele i slučajnim nukleotidnim dodacima na regionima spajanja. Tipično, imunoglobulini će ispoljiti afinitet (KD) za izabrane antigene od ispod 10"<8>M, kao što je od ispod 10"<9>M, 10"10M ili 10"11 M ili čak i niži. Transgene i transhromozomske nehumane životinje, npr miševi, kao što je gore opisano, mogu biti imunizovani sa, na primer, ćelijama koje eksprimiraju CD38. Alternativno, transgene životinje mogu biti imunizovanc sa DNK koja kodira humani CD38. Životinje će tada proizvoditi B ćelije koje prolaze kroz promenu klase putem svvitch (prekidač) rekombinacije (cis-promena) i izražavaju imunoglobuline koji reaguju sa CD38. Imunoglobulini će biti humana antitela (takođe se nazivaju "antitela humane sekvence"), pri čemu su polipeptidi teškog i lakog lanca kodirani pomoću humanih sekvenci transgena koje mogu da uključuju sekvence izvedene putem somatske mutacije i V regiona rekombinatornih zglobova, kao i embrionske-kodirajuće sekvence; ova humana antitela mogu biti označena kao suštinski identična sa polipeptidnom sekvencom kodiranom od strane humanih VLi JLili VH, DHi Jhgenskih segmenata, iako druge sekvence koje nisu matične linije mogu biti prisutne kao rezultat somatske mutacije i diferencijalne V-J i V-D-J rekombinacije zglobova. Varijabilni regioni svakog lanca antitela su tipično najmanje 80 procenata slični sa humanim embrionskim V i J genskim segmentima, a, u slučaju teških lanaca, humani cmbrionski V, D i J genski segmenti; često najmanje 85 procenata slični sa sekvencama humane matične linije prisutnih na transgenu; često 90 ili 95 procenata ili više slični sa humanim sekvencama matične linije prisutnih na transgenu. Međutim, pošto su sekvence bez matične linije uvedene putem somatske mutacije i VJ i VDJ spajanja, humane sekvence antitela će često imati neke sekvence varijabilnog regiona koje nisu kodirane od strane humanih V, D ili J segmenata gena kao što je nađeno u humanom transgenu (-ima) u embrionu miševa. Tipično, takve sekvence koje nisu od matične linije (ili pojedinačne nukleotidne pozicije) će se sakupiti u ili blizu CDRs, ili u regionima gde je poznato da se somatske mutacije skupljaju.
[0576] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje B ćelije izvedene iz transgenih ili transhromozomskih nehumanih životinja kao što je ovde opisano. B ćelije mogu biti korišćene za generisanje hibridoma koji eksprimira humana monoklonska antitela koja se vezuju sa visokim afinitetom (npr sa konstantom ravnoteže disocijacije (KD) manjom od 10"<8>M) za humani CD38. Prema tome, u jednom aspektu, ovde je obezbeđen hibridom koji proizvodi humano antitelo sa afinitetom (KD) od ispod IO"<8>M, kao što je ispod IO"<9>M, 10"<10>M ili IO"<8>M, ili čak nižim, kada se određuje Scatchard analizom CD38 eksprimirajućih ćelija pomoću radioaktivno obeleženog monoklonskog antitela ili određivanjem polu-maksimalnih koncentracija vezivanja korišćenjem FACS analiza, ili analiza koje koriste površinske plazmonske rezonance merene na BIAcore instrumentu.
[0577] Anti-CD38 antitelo u skladu sa predmetnim pronalaskom može da sadrži humanu sekvencu lakog lanca sastavljenu od (1) varijabilnog regiona lakog lanca koji ima polipeptidnu sekvencu koja je suštinski identična sa polipeptidnom sekvencom kodiranom od strane genskog segmenta humanog VLi segmenta humanog Ji., i (2) konstantnog regiona lakog lanca kodiranog od strane humanog Ci. segmenta gena; i humanu sekvencu teškog lanca sastavljenu od (1) varijabilnog regiona teškog lanca koji ima polipeptidnu sekvencu koja je suštinski identična sa polipeptidnom sekvencom kodiranom od strane humanog VHsegmenta gena, D regiona, i humanog JHsegmenta, i (2) konstantnog regiona kodiranog od strane humanog CHsegmenta gena. Treba napomenuti da humani D geni mogu biti suštinski izmenjeni rekombinacijom i somatskom mutacijom događaja tako da originalna humana sekvenca germinativne linije možda neće biti lako prepoznata.
[0578] Razvoj humanih monoklonskih antitela visokog afiniteta protiv CD38 može biti olakšan pomoću postupka za proširenje repertoara humanih genskih segmenata varijabilnog regiona u transgenoj nehumanoj životinji koja ima genom koji sadrži integrisani transgen humanog imunoglobulina, navedeni postupak obuhvata uvođenje u genom jednog V gena transgena koji obuhvata V region genskih segmenata koji nisu prisutni u pomenutom integrisanom humanom transgenu imunoglobulina. Često, V region transgena je neki veštački hromozom kvasca (YAC) koji sadrži deo humanog VHili red VL(VK) segmenta gena, kao što se prirodno može naći u humanom genomu ili kao što mogu biti spojena zajedno odvojenim rekombinantnim metodama, koje mogu uključivati van reda ili izostaviti V genske segmente. Često su najmanje pet ili više funkcionalnih segmenata V gena sadržana na YAC. U ovoj varijaciji, moguće je napraviti transgenu životinju proizvedenu od strane V repertoara metoda ekspanzije, gde životinja eksprimira imunoglobulinski lanac koji sadrži sekvence varijabilnog regiona kodirane od strane V regiona genskog segmenta prisutnog na V regionu transgena i nekog C regiona kodiranog na humanom Ig transgenu. Pomoću metoda V repertoar ekspanzije, transgene životinje koje imaju najmanje 5 različitih V gena mogu se generisati; kao što mogu životinje koje sadrže najmanje oko 24 V gena ili više. Neki segmenti V gena mogu biti ne-funkcionalni (npr pseudogeni i slično); ovi segmenti mogu biti zadržani ili mogu biti selektivno izbrisani rekombinantnim metodama dostupnim stručnjacima, ako je to poželjno.
[0579] Kada je embrion miša projektovan da sadrži funkcionalni YAC koji ima prošireni V segmentni repertoar, koji značajno nije prisutan u humanom Ig transgenu koji sadrži genske segmente J i C, ležište se može propagirati i odgajiti u drugim genskim podlogama, uključujući podloge gde se funkcionalni YAC koji ima prošireni V segmentni repertoar gaji u nehumanim embrionima životinja koje imaju drugačiji humani Ig transgen. Spojeni funkcionalni YACs imaju proširene V segmentne repertoare koji mogu biti uzgajani u embrionu da rade sa humanim Ig transgenom (ili višestrukim humanim Ig transgenima). Iako su ovde označeni kao YAC transgeni, takvi transgeni kada su integrisani u genom njima suštinski mogu nedostajati sekvence kvasca, kao što su sekvence neophodne za autonomnu replikaciju u kvascu; takve sekvence mogu biti eventualno uklonjene genetskim inženjeringom (npr restrikcionom digestijom i pulsed-field gel elektroforezom ili drugim pogodnim postupkom) nakon što replikacija u kvascu više nije potrebna (tj pre uvođenja u mišje ES ćelije ili prozigot miša). Metode propagiranja osobina ekspresije humane imunoglobulinske sekvence, uključuju uzgajanje transgenih životinja koje imaju humani Ig transgen (e), i opciono takođe imaju funkcionalni YAC koji ima prošireni repertoar V segmenta. Oba VHi VLsegmenta gena mogu biti prisutna na YAC-u. Transgena životinja može da se uzgaja u bilo kojoj željenoj podlozi od strane lekara, uključujući podloge koje skrivaju druge humane transgene, uključujući humane Ig transgene i/ili transgene koji kodiraju druge proteine humanih limfocita. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje humane imunoglobulinske sekvence visokog afiniteta proizvedene od strane transgenog miša koji ima prošireni repertoar V regiona YAC transgena. Iako je gornji opis specifična varijanta transgene životinje predmetnog pronalaska, druga rešenja su razmatrana koja su klasifikovana u tri kategorije: I. transgene životinje koje sadrže jedan nepreuređeni teški i preuređeni laki lanac imunoglobulinskog transgena; II. Transgene životinje koje sadrže jedan nepreuređeni teški i nepreuređeni laki lanac imunoglobulinskog transgena; i III. Transgene životinje koje sadrže preuređeni teški i jedan nepreuređeni laki lanac imunoglobulinskog transgena;
[0580] U jednoj realizaciji, sadašnji pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži terapeutski efikasnu količinu CD38BP iz predmetnog pronalaska. Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane sa farmaceutski prihvatljivim nosačima ili razblaživačima kao i bilo kojim drugim poznatim adjuvansima i ekscipijensima u skladu sa uobičajenim tehnikama kao što su one opisane u Remington: The Science and Practicc of Pharmacv, 19th Edition, Gcnnaro, Ed., Mack Publishing. Co., Easton, PA, 1995.
[0581]Farmaceutski prihvatljivi nosači ili razblaživači kao i bilo koji drugi poznati adjuvansi i ekscipijensi treba da budu pogodni za odabrano jedinjenje iz predmetnog pronalaska i odabrani način primene. Pogodnost za nosače i druge komponente farmaceutskih kompozicija se određuje na osnovu odsustva značajnog negativnog uticaja na željena biološka svojstva izabranog jedinjenja ili farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska (npr manje od značajnog uticaja (10% ili manje relativne inhibicije, 5% ili manje relativne inhibicije itd) za vezivanje antigena.
[0582]Farmaceutska kompozicija iz predmetnog pronalaska može takođe da sadrži razblaživače, punioce, soli, pufere, detrdžente (npr nejonski deterdžent, kao što je Tween- 80), stabilizatore (npr šećere ili bez proteina aminokiseline), konzervanse, tkivne fiksatore, solubilizatore, i/ili druge materijale pogodne za uključenje u farmaceutsku kompoziciju.
[0583]Stvarne dozne količine aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama iz predmetnog pronalaska mogu da variraju tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna za postizanje željenog terapeutskog odgovora za određenog pacijenta, sastav i način primene, tako da one nisu toksične za pacijenta. Odabrani dozni nivo zavisiće od različitih faimakokinetičkih faktora uključujući aktivnost određenih kompozicija predmetnog pronalaska koje se koriste, ili estra, soli ili njegovog amida, načina primene, vremena primene, brzine izlučivanja posebnih jedinjenja koja se koriste, trajanja lečenja, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala koji se koriste u kombinaciji sa određenim kompozicijama koje se koriste, starosti, pola, težine, stanja, opšteg zdravlja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji se leči, i sličnih faktora dobro poznatih u medicinskoj struci.
[0584]Farmaceutska kompozicija može biti primenjena bilo kojim pogodnim putem i načinom. Pogodni putevi primene jedinjenja iz predmetnog pronalaskain vivoiin vitrosu dobro poznati u tehnici i mogu biti odabrani od strane onih koji su verzirani u tehnici.
[0585]Jedinjenja iz sadašnjeg pronalaska se mogu primeniti bilo kojim pogodnim putem, kao što je oralnim, nazalnim, inhalacionim, topikalnim (uključujući bukalnim, transdermalnim i sublingvalnim), rektalnim, vaginalnim i/ili parenteralnim putem.
[0586]U jednoj realizaciji, farmaceutska kompozicija iz predmetnog pronalaska sc primenjuje oralno, na primer, sa inertnim razblaživačem ili jestivim apsorbljivim nosačem. Aktivni sastojak može biti zatvoren u omotu tvrde ili meke želatinske kapsule, komprimovan u tablete ili inkorporiran direktno u hranu subjekta. Farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska koje su pogodne za oralnu primenu uključuju tablete za gutanje, bukalne tablete, lozenge, kapsule, eliksire, suspenzije, sirupe, vafere i slično koji sadrže takve nosače koji su poznati u tehnici kao odgovarajući. Za primenu jedinjenja predmetnog pronalaska oralnom primenom, može biti neophodno oblaganje jedinjenja sa ili ko-administracija jedinjenja sa, materijalom za sprečavanje njegove inaktivacije.
[0587]U jednoj realizaciji, jedna farmaceutska kompozicija iz sadašnjeg pronalaska se primenjuje nazalno. Farmaceutske kompozicije iz sadašnjeg pronalaska koje su pogodne za nazalnu primenu su poznate u tehnici i tipično uključuju sprejeve, kapi za nos i preparate za inhalaciju.
[0588]U jednoj realizaciji, jedna farmaceutska kompozicija iz sadašnjeg pronalaska se primenjuje topikalno. Farmaceutske kompozicije iz sadašnjeg pronalaska koje su pogodne za topikalnu ili transdermalnu primenu uključuju praškove, sprejeve, masti, paste, kremove, losione, gelove, rastvore, flastere i preparate za inhalaciju koji sadrže takve nosače koji su poznati u tehnici kao odgovarajući.
[0589]U jednoj realizaciji, jedna farmaceutska kompozicija iz sadašnjeg pronalaska se primenjuje rektalno. Farmaceutske kompozicije iz sadašnjeg pronalaska koje su pogodne za rektalnu primenu su poznate u struci i obuhvataju gelove, paste, sprej formulacije, supozitorije.
[0590]U jednoj realizaciji, jedna farmaceutska kompozicija iz sadašnjeg pronalaska se primenjuje vaginalno. Farmaceutske kompozicije iz sadašnjeg pronalaska koje su pogodne za vaginalnu primenu uključuju vaginalne supozitorije, tampone, kremove, gelove, paste, pene ili sprej formulacije koje sadrže takve nosače koji su poznati u tehnici kao odgovarajući.
[0591]U jednoj realizaciji, jedna farmaceutska kompozicija iz sadašnjeg pronalaska se primenjuje parenteralno.
[0592]Izrazi "parenteralna primena" i "primenjivati parenteralno", kako se ovde koristi, označava način primene drugačiji od intestinalne i topikalne primene, obično putem injekcije, i uključuju epidermalnu, intravenoznu, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, intratendinoznu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, intrakranijalnu, intratorakalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.
[0593]U jednoj realizaciji taj farmaceutski preparat se primenjuje intravenoznim ili subkutanom injekcijom ili infuzijom.
[0594]U jednoj realizaciji jedinjenja iz sadašnjeg pronalaska se primenjuju u kristalnom obliku subkutanom injekcijom, cf. Yang et al., PNAS USA 100 (12), 6934-6939 (2003).
[0595]Farmaceutske kompozicije mogu biti primenjivane sa medicinskim uređajima koji su poznati u tehnici. Na primer, u jednom aspektu, jedna farmaceutska kompozicija iz sadašnjeg pronalaska se može primeniti hipodermičkim injekcionim uređajem sa iglama, kao što su uređaji opisani u US 5,399,163, US 5,383,851, US 5,312,335, US 5,064,413, US 4,941,880, US 4,790,824, ili US 4,596,556. Primeri poznatih implantanata i modula korisnih u predstavljenom pronalasku uključujuju: US 4,487,603, koji opisuje implantabihiu mikro-infuzionu pumpu za doziranje lekova kontrolisanom brzinom; US 4,486,194, koji opisuje terapeutski uređaj za primenu lekova kroz kožu; US 4,447,233, koji opisuje jednu infuzionu pumpu leka za isporuku lekova sa preciznom brzinom infuzije; US 4,447,224, koji opisuje promenljivog protoka implantabilni infuzioni aparat za kontinuiranu isporuku leka; US 4,439,196, koji opisuje osmotski sistem isporuke leka koji ima višekomorne odeljke; i US 4,475,196, koji opisuje osmotski sistem isporuke leka. Mnogi drugi takvi implanti, sistemi za isporuku i moduli su poznati stručnjacima u tehnici.
[0595]Farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska mogu biti formulisane za posebne puteve primene, kao što su oralna, nazalna, topikalna (uključujući bukalnu, transdermalnu i sublingvalnu), rcktalna, vaginalna i/ili parcntcralna primene. Farmaceutske kompozicije mogu pogodno biti predstavljene u obliku jedinične doze i mogu biti pripremljene bilo kojim postupcima koji su poznati u stanju farmaceutske tehnike. Količina aktivnog sastojka koja se može kombinovati sa materijalom nosača za proizvodnju pojedinačnog doznog oblika će varirati u zavisnosti od subjekta koji se tretira, a naročito od načina primene. Količina aktivnog sastojka koja se može kombinovati sa materijalom nosača za proizvodnju pojedinačnog doznog oblika biće generalno ona količina kompozicije koja proizvodi terapeutski efekat. Generalno, od stotinu procenata, ovaj iznos biće u opsegu od oko 0,01% do oko 99% aktivnog sastojka, kao što je od oko 0,1% do oko 70%, na primer od oko 1%> do oko 30%>.
[0597]Bez obzira na izabrani put primene, jedinjenja iz sadašnjeg pronalaska, koja se mogu koristiti u obliku farmaceutski prihvatljive soli ili u pogodnom hidratisanom obliku, i/ili farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska, su formulisane u farmaceutski prihvatljive dozne oblike uobičajenim postupcima koji su poznati stručnjaku iz struke. "Farmaceutski prihvatljiva so" se odnosi na so koja zadržava željenu biološku aktivnost matičnog jedinjenja i ne daje bilo koje neželjene toksikološke efekte (videti na primer Berge, S.M. et al., J. Pharm. Sci. 66, 1-19 (1977)). Primeri takvih soli uključuju kisele adicione soli i bazne adicione soli. Kisele adicione soli uključuju one izvedene iz netoksičnih neorganskih kiselina, kao što su hlorovodonična, azotna, fosforna, sumporna, bromovodonična, jodovodonična, fosfornih kiselina i slično, kao i iz netoksičnih organskih kiselina kao što su alifatične mono- i dikarboksilne kiseline, fenil-supstituisane alkanoinske kiseline, hidroksi alkanoinske kiseline, aromatične kiseline, alifatične i aromatične sulfonske kiseline i slično. Bazne adicione soli uključuju one izvedene iz zemnoalkalnih metala, kao što su natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum i slično, kao i iz netoksičnih organskih amina, poput N.N'-dibenziletilendiamin, N-metilglukamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilendiamin, prokain i slično.
[0598]Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju bilo koje i sve pogodne rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonične agense, antioksidanse i sredstva za odlaganje apsorpcije, i slično koja su fiziološki kompatibilna sa jedinjenjem iz sadašnjeg pronalaska.
[0599]Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji se mogu koristiti u farmaceutskim kompozicijama iz sadašnjeg pronalaska uključuju vodu, slani rastvor, fosfatni pufer, etanol, dekstrozu, poliolc (kao što su gliccrol, propilen glikol, polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, kukuruzno ulje, kikirikijevo ulje, pamučno ulje, sezamovo ulje i, karboksimetil celuloze koloidne rastvore, tragakant gumu i injekcione organske estre, kao što je etil oleat, i / ili različitim puferi. Ostali nosači su dobro poznati u farmaceutskoj tehnici.
[0600]Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za pripremu ex tempore sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je poznata u tehnici. Osim ukoliko je bilo koji uobičajeni medijum ili agens inkompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, njihova pmrimena u farmaceutskoj kompoziciji predmetnog pronalaska se tada razmatra.
[0601]Odgovarajuća fluidnost može biti zadržana, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom surfaktanata.
[0602]Farmaceutske kompozicije iz sadašnjeg pronalaska mogu takođe da sadrže farmaceutski prihvatljive antioksidanse na primer (1) u vodi rastvorljive antioksidanse kao što je askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i slično; (2) u ulju rastvorljive antioksidanse, kao što je askorbil palmitat, butilovani hidroksianizol (BFfA), butilovani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propil galat, alfa-tokoferol, i slično; i (3) metal helirajuće agense, kao što je limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina, i slično.
[0603]Farmaceutske kompozicije iz sadašnjeg pronalaska mogu takođe da sadrže izotonične agense, kao što su šećeri, polialkoholi kao što su manitol, sorbitol, glicerol ili natrijum hloridom u kompozicijama.
[0604]Farmaceutski prihvatljivi razblaživači uključuju slani rastvor i vodene puferske rastvore.
[0605]Farmaceutske kompozicije iz sadašnjeg pronalaska mogu takođe da sadrže jedan ili više pomoćnih sredstava koja su odgovarajuća za izabrani put primene kao što su konzervansi, sredstva za vlaženje, emulgatori, sredstva za dispergovanje, konzervansi ili puferi, koji mogu poboljšati trajnost ili efikasnost farmaceutske kompozicije. Jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu na primer biti pomešana sa laktozom, saharozom, praškovima (npr, škrobom u prahu), celuloznim estrima alkanoinskih kiselina, stearinskom kiselinom, talkom, magnezijum stearatom, magnezijum oksidom, natrijumovim i kalcijumovim solima fosfornih i sumpornih kiselina, akacijom, želatinom, natrijum alginatom, polivinilpirolidinom i/ili polivinil alkoholom. Drugi primeri pomoćnih sredstava su QS21, GM-CSF, SRL-172, histamin dihidrohlorid, timokartin, Tio-TEPA, monofosforil-lipid A/ mikobakterija kompozicije, alum, nekompletan Freund-ov adjuvans, Montanide ISA, Ribi adjuvans sistem, TiterMax adjuvans, sinteks adjuvans formulacije, imunski-stimulisani kompleksi (ISCOMs), gerbu adjuvans, CpG oligodeoksinukleotidi, lipopolisaharid i poliinozinska: policitidilna kiselina.
[0606]Sprečavanje prisustva mikroorganizama može se obezbediti i procedurama sterilizacije i uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih sredstava, na primer, parabena, hlorobutanola, fenola, sorbinske kiseline, i slično. Pored toga, produžena apsorpcija injektabilnog farmaceutskog oblika može da se postigne uključivanjem agenasa koji odlažu apsorpciju, kao što su aluminijum monostearat i želatin.
[0607]Farmaceutske kompozicije iz sadašnjeg pronalaska koje sadrže jedinjenje iz sadašnjeg pronalaska mogu takođe uključivati njihove pogodne soli. Bilo koja pogodna so, kao što je so zemnoalkalnih metala u bilo kom pogodnom obliku (npr puferska so), može se koristiti u stabilizaciji jedinjenja predmetnog pronalaska. Pogodne soli tipično uključuju natrijum hlorid, natrijum sukcinat, natrijum sulfat, kalijum hlorid, magnezijum hlorid, magnezijum sulfat, i kalcijum hlorid. U jednom aspektu, aluminijumske soli se koriste za stabilizaciju jedinjenja predmetnog pronalaska u farmaceutskoj kompoziciji predmetnog pronalaska, takva aluminijumska so takođe može da posluži kao adjuvans kada se takva kompozicija primenjuje kod pacijenta.
[0608]Farmaceutske kompozicije prema predstavljenom pronalasku mogu biti u različitim pogodnim oblicima. Takvi oblici uključuju, na primer, tečne, polučvrste i čvrste dozne oblike, kao što su tečni rastvori (npr injcktabilni i infuzioni rastvori), disperzije ili suspenzije, emulzije, mikroemulzije, gelovi, kremovi, granule, praškovi, tablete, pilule, praškovi, lipozomi, dendrimeri i drugi nanočestice (videti na primer Baek et al, Methods Enzvmol. 362, 240-9 (2003), Nigavekar et al., Pharm Res. 21 (3), 476-83
(2004), mikročestice, i supozitorije.
[0609]Optimalni oblik zavisi od odabranog načina primene, prirode sastava, i terapeutske primene. Formulacije mogu uključivati, na primer, praškove, paste, masti, želee, voskove, ulja, lipide, vezikule koje sadže lipide (katjonske ili anjonske), DNK konjugate, anhidrovane apsorpcione paste, ulje-u-vodi i voda-u-ulju emulzije, emulzione Carbowax-e (polietilen glikole različitih molekulskih težina), polučvrste gelove, i polučvrste mešavine koje sadrže Carbowax. Bilo koji od prethodno navedenih oblika može biti prikladan u tretmanima i terapijama u skladu sa sadašnjim pronalaskom, pod uslovom da aktivni sastojak u farmaceutskoj kompoziciji nije inaktiviran formulacijom i da je formulacija fiziološki kompatibilna i podnošljiva u skladu sa putem primene. Videti takođe na primer Powell et al., "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52, 238-311 (1998) i tamošnje citate za dodatne informacije u vezi sa ekscipijensima i nosačima koji su dobro poznati farmaceutskim hemičarima.
[0610]Jedinjenja iz sadašnjeg pronalaska mogu biti pripremljena sa nosačima koji će štititi jedinjenje od brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante, transdermalne flastere i mikroinkapsulirane sisteme isporuke. Ovakvi nosači mogu da uključuju želatin, gliceril monostearat, gliceril distearat, biorazgradive, biokompatibilne polimere kao što je etilen vinil acetat, polianhidride, poliglikolnu kiselinu, kolagen, poliortoestre i polimlečnu kiselinu samu ili sa voskom ili druge materijale dobro poznate u tehnici. Postupci za izradu takvih formulacija su generalno poznati prosečnom stručnjaku u tehnici. Videti npr, Sustained and Controlled Release Drug Deliverv Sistems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
[0611]Za primenu kompozicije prema prikazanom pronalasku pojedinim putevima primene, može biti neophodno oblaganje jedinjenja sa ili ko-primena jedinjenja sa, materijalom za sprečavanje njegove inaktivacije. Na primer, jedinjenje predmetnog pronalaska se može primeniti na subjektu u odgovarajućem nosaču, na primer, lipozomima, ili razblaživaču. Lipozomi uključuju voda-u-ulju-u-vodi CGF emulzije kao konvencionalne lipozomc (Strcjan ct al, J. Ncuroimmunol. 7,27 (1984)).
[0612]U zavisnosti od puta primene, aktivno jedinjenje može biti obloženo materijalom da zaštiti jedinjenje od dejstva kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu da inaktiviraju jedinjenje. Na primer, jedinjenje se može primeniti kod subjekta u odgovarajućem nosaču, na primer, lipozomu. Lipozomi uključuju voda-u-ulju-u-vodi CGF emulzije kao konvencionalne lipozome (Strejan et al., J. Neuroimmunol. 7, 27 (1984)).
[0613]U jednoj realizaciji, jedinjenja sadašnjeg pronalaska mogu biti formulisana tako da obezbede pravilnu raspodeluin vivo.Na primer, krvno-moždana barijera (BBB) isključuje mnoga visoko hidrofilna jedinjenja. Kako bi se osiguralo da terapeutska jedinjenja predmetnog pronalaska prolaze BBB (ako se želi), mogu se formulisati, na primer u lipozomima. Za metode za proizvodnju lipozoma, videti na primer US 4,522,811, US 5,374,548 i US 5,399,331. Lipozomi mogu da sadrže jedan ili više ostataka koji sc selektivno transportuju u specifične ćelije ili organe, čime sc poboljšava ciljna isporuka leka (videti na primer V. V. Ranade J. Clin. Pharmacol. 29, 685 (1989)). Primeri ciljnih grupa uključuju folat ili biotin (videti na primer US 5,416,016), manozide (Umezawa et al, Biochem. Biophvs. Res. Commun. 153, 1038 (1988)), antitela (P.G. Bloeman et al, FEBS Lett. 357, 140 (1995), M. Owais et al., Antimicrob. Agents Chemother. 39, 180 (1995)), surfaktant protein A receptor (Briscoe et al., Am. J. Phvsiol. 1233, 134 (1995)), različite vrste koje mogu da sadrže farmaceutske kompozicije prema predstavljenom pronalasku, kao i komponente otkrivenih molekula, P120 (Schreier et al., J. Biol. Chem. 269, 9090 (1994)), videti takođe K. Keinanen, M.L. Laukkanen, FEBS Lett. 346, 123 (1994) i J.J. Killion, I.J. Fidler, Immunomethods 4, 273 (1994).
[0614]Anti-CD38 antitela iz predmetnog pronalaska mogu biti formulisana u lipozomima. U daljem ostvarenju, takvi lipozomi uključuju ciljnu grupu. U sledećoj varijanti, jedinjenja u lipozomima se isporučuju bolus injekcijom na mestu koje je proksimalno sa željenom površinom, npr mestu inflamacije ili infekcije, ili mestu tumora. Preparat mora biti tečan do stepena da postoji laka primena iz šprica. Mora biti stabilan pod uslovima proizvodnje i skladištenja i mora biti zaštićen od kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama kao što su bakterije i gljivice.
[0615]U jednoj realizaciji, jedinjenja sadašnjeg pronalaska mogu biti formulisana za sprečavanje ili smanjenje njihovog transporta preko placente. Ovo se može izvršiti pomoću metoda poznatih u struci, npr pegilacijom jedinjenja ili upotrebom F(ab')2fragmenata. Dalje reference mogu se vršiti prema Cunningham-Rundles C et al, J Immunol Methods. 152, 177-190 (1992) i prema Landor M., Ann Allergy Asthma Immunol 74, 279-283 (1995).
[0616]Farmaceutski prihvatljivi nosači za parenteralnu primenu uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za izradu ex tempore sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je poznata u tehnici. Osim ukoliko je bilo koji uobičajeni medijum ili agens inkompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, njihova primena u farmaceutskim kompozicijama iz predmetnog pronalaska se tada razmatra. Dodatna aktivna jedinjenja se takođe mogu inkorporirati u kompozicije.
[0617]Farmaceutske kompozicije za injekcionu primenu moraju obično biti sterilne i stabilne pod uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija može biti formulisana u obliku rastvora, mikroemulzije, lipozoma ili neke druge uređene strukture pogodne za visoku koncentraciju leka. Nosač može da bude vodeni ili ne-vodeni rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži na primer vodu, etanol, poliole (kao što je glicerol, propilen glikol, polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, i injektabilne organske estre, kao što je etil oleat. Odgovarajuća fluidnost može da se održava, na primer, upotrebom sredstva za oblaganje kao što je lecitin, održavanjem zahtevane veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima, biće poželjno da se uključe izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi kao što su glicerol, manitol, sorbitol, ili natrijum hlorid u kompoziciju. Produžena apsorpcija injekcionih preparata se može postići uključivanjem u kompoziciju nekog sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer, monostearatne soli i želatina. Sterilni rastvori za injekcije mogu biti pripremljeni inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom sastojaka npr kao gore nabrojanih, po potrebi, nakon čega sledi sterilizacija mikrofiltriranjem. Generalno, disperzije se dobijaju inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i druge potrebne sastojke npr od onih gore nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za izradu sterilnih rastvora za injekcije, primeri metoda izrade su vakuumsko sušenje i sušenje zamrzavanjem (liofilizacijom) tako da se dobije prašak aktivnog sastojka sa bilo kojim dodatnim željenim sastojkom iz njegovog rastvora koji je prethodno sterilno-ifltriran.
[0618] Sterilni rastvori za injekcije mogu biti pripremljeni inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom sastojaka koji su gore nabrojani, po potrebi, nakon čega sledi sterilizacija mikrofiltracijom. Generalno, disperzije se izrađuju inkorporiranjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i druge potrebne sastojke od onih gore nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za izradu sterilnih rastvora za injekcije, primeri metoda izrade su vakuumsko sušenje i sušenje zamrzavanjem (liofilizacijom) kojima se dobija prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilnog-filtriranog rastvora.
[0619] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može da sadrži jedno jedinjenje iz predmetnog pronalaska ili kombinaciju jedinjenja iz predmetnog pronalaska. Stoga, u jednom aspektu, farmaceutska kompozicija iz sadašnjeg pronalaska uključuje višestruku kombinaciju (npr dva ili više) jedinjenja iz predmetnog pronalaska koja deluju različitim mehanizmima, npr jedno jedinjenje koje pretežno deluje indukcijom CDC u kombinaciji sa drugim jedinjenjem koje pretežno deluje indukcijom apoptoze.
[0620] CD38BPs (uključujući anti-CD38 antitela, imunokonjugate, bispecifične/-multispecifične molekule, kompozicije i druge derivati ovde opisane) iz predmetnog pronalaska imaju brojnein vitroiin vivodijagnostičke i terapeutske primene uključuju dijagnozu i tretman poremećaja koji uključuju ćelije koje eksprimiraju CD38. Na primer, antitela mogu biti primenjivana na ćelije u kulturi, npr,in vitroili ex vivo, ili na humanim subjektima, nprin vivo,za lečenje, prevenciju i za dijagnozu različitih poremećaja. Kako se ovde koristi, izraz "subjekat" je određen tako da obuhvata humane i ne-humane životinje koje odgovaraju na CD38BP. Subjekti mogu na primer da uključuju humane pacijente koji imaju poremećaje koji se mogu ispraviti ili poboljšati inhibiranjem funkcije CD38, kao što je enzimska aktivnost, signalna transdukcija, indukcija ekspresije citokina, indukcija proliferacije ili diferencijacije, i/ili indukcija lize i/ili eliminisanje/smanjenje broja ćelija koje eksprimiraju CD38.
[0621] Na primer, CD38BPs se mogu koristiti za indukcijuin vivoiliin vitrojedne ili više od sledećih bioloških aktivnosti: funkcionalna inhibicija CD38 (kao što je enzimska aktivnost, signalna transdukcija, indukcija ekspresije citokina, indukcija proliferacije ili diferencijacije, i /ili indukcija lize), ubijanje neke ćelije koja eksprimira CD38, posredovanju fagocitoze ili ADCC neke ćelije koja eksprimira CD38 u prisustvu humanih efektorskih ćelija, kao i posredovanju CDC-a neke ćelije koja eksprimira CD38 u prisustvu komplementa ili ubijanjem ćelija koje eksprimiraju CD38 apoptozom.
[0622] Svaka kompozicija koja sadrži CD38BPs predmetnog pronalaska ima vezujuća mesta za komplement, kao što su delovi od IgGl, -2, ili -3 ili IgM koji vezuju komplement, koji se mogu takođe koristiti u prisustvu komplementa. U jednoj realizaciji, ex vivo tretman jedne populacije ćelija koje sadrže ciljne ćelije sa CD38BP antitelom iz predmetnog pronalaska i odgovarajuće efektorske ćelije može biti dopunjen dodavanjem komplementa ili seruma koji sadrži komplement. Fagocitoza ili liza ciljnih ćelija obloženih sa CD38BP antitelom iz predmetnog pronalaska može biti poboljšana vezivanjem proteina komplementa. U jednom ostvarenju ciljne ćelije obložene sa CD38BP antitelima iz predmetnog pronalaska mogu takođe biti lizirane od strane komplementa. U jednom izvođenju, CD38BP antitela predmetnog pronalaska ne aktiviraju komplement.
[0623] Antitela CD38BP-a iz predmetnog pronalaska mogu se takođe primenjivati zajedno sa komplementom. Shodno tome, u okviru predmetnog pronalaska su kompozicije koje sadrže CD38BP-e sa serumom ili komplementom. U ovim kompozicijama komplement se nalazi u neposrednoj blizini sa CD38BP-ima, na primer konjugacijom ili može biti prilagođen za istovremenu primenu. Alternativno, CD38BPi i komplement ili serum se mogu primenjivati odvojeno.
[0624] Antitela CD38BP-a iz predmetnog pronalaska mogu takođe biti korišćena za ciljanje ćelija koje eksprimiraju FcyR ili CD38, na primer za obeležavanje takvih ćelija. Za takvu upotrebu, CD38BP može biti povezan sa molekulom koji se može detektovati. Tako, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za lokalizacijuex vivoiliin vitroćelija koje eksprimiraju Fc receptore, kao što su FcyR, ili CD38. Marker za detektovanje može da bude, npr jedan radioizotop, jedno fluorescentno jedinjenje, jedan enzim ili jedan enzimski ko-faktor.
[0625] Ciljno specifične efektorske ćelije, npr efektorske ćelije povezane sa antitelima CD38BP-a iz predmetnog pronalaska takođe se mogu koristiti kao terapeutska sredstva. Ciljne efektorske ćelije mogu biti humani leukociti kao što su makrofage, neutrofili ili monociti. Druge ćelije uključuju eozinofile, ćelije prirodne ubice i ostale ćelije koje nose IgG- ili TgA-receptor. Ukoliko je poželjno, efektorske ćelije se mogu dobiti od subjekta koji se tretira. Ciljno specifične efektorske ćelije, mogu biti primenjivane kao ćelijske suspenzije u fiziološki prihvatljivom rastvoru. Broj primenjivanih ćelija može biti reda veličine 108 do IO9 ali će varirati u zavisnosti od terapeutske svrhe. Generalno, količina će biti dovoljna da sc postigne lokalizacija na ciljnoj ćeliji, npr jednoj tumorskoj ćeliji koja eksprimira CD38, i da sc efikasno ubije takva ćelija npr fagocitozom ili lizom.
[0626] Terapija sa ciljno specifičnim efektorskim ćelijama može biti izvedena zajedno sa drugim tehnikama za uklanjanje ciljnih ćelija. Na primer, anti-tumorska terapija koja koristi antitela CD38BP-a iz predmetnog pronalaska i/ili efektorske ćelije naoružane sa ovim kompozicijama mogu da se koriste u kombinaciji sa hemoterapijom. Dodatno, kombinovana imunoterapija može da se koristi za usmeravanje dve različite citotoksične efektorske populacije prema tumorskom ćelijskom odbacivanju. Na primer, CD38BP povezani sa anti-FcyRI ili anti-CD3 se mogu koristiti u kombinaciji sa IgG- ili IgA-receptor specifičnim vezujućim agensima. Bispecifični i multispecifični molekuli predmetnog pronalaska takođe se mogu koristiti za modulaciju nivoa FcotR ili FcyR na efektorskim ćelijama, kao što je zatvaranje i eliminacija receptora na površini ćelije. Mešavine anti-Fc receptora se takođe mogu koristiti za ovu svrhu.
[0627] U jednoj realizaciji, antitela iz sadašnjeg pronalaska obezbeđuju postupke za detekciju prisustva CD38 antigena u uzorku ili merenjem količine CD38 antigena, koji sadrži dovođenje u kontakt uzorka i kontrolnog uzorka, sa CD38BP-om koji se specifično vezuje za CD38, pod uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa između CD38BP-a ili njegovog dela i CD38 antigena. Formiranje kompleksa se zatim detektuje, gde razlika u formiranju kompleksa između uzorka u odnosu na kontrolni uzorak ukazuje na prisustvo CD38 antigena u uzorku. Primeri metoda imunoloških testova za detekciju uključuju, bez ograničenja, ELISA, RIA, FACS testove, testove plazmonske rezonance, hromatografske testove, imunohistohemiju tkiva, Western blot, i/ili imunoprecipitaciju.
[0628] Ujednoj realizaciji, CD38BP antitela iz predmetnog pronalaska mogu se koristiti za detekciju nivoa cirkulišućih CD38 ili nivoa ćelija koje sadrže CD38 na njihovoj membranskoj površini, takvi nivoi mogu onda biti povezani sa određenim simptomima bolesti. Alternativno, CD38BP-i mogu biti korišćeni da oštećuju ili stupaju u interakciju sa funkcijom ćelija koje eksprimiraju CD38, čime impliciraju ove ćelije kao važne medijatore bolesti. Ovo se može postići dovođenjem u kontakt uzorka i kontrolnog uzorka sa anti-CD38 antitelom pod uslovima koji dozvoljavaju formiranje kompleksa između antitela i CD38. Bilo koji kompleksi formirani između antitela i CD38 se detektuju i upoređuju u uzorku i kontroli. [0629] CD38BP-i predmetnog pronalaska mogu biti inicijalno testirani na aktivnost vezivanja povezanu sa njihovom terapeutskom ili dijagnostičkom upotrebomin vitro.Na primer, CD38BP-i se mogu ispitivati korišćenjem testova protočne citometrije. Staviše, može se testirati aktivnost CD38BP-a u pokretanju najmanje jedne aktivnosti efektorske ćelije posredovane efektorom. Na primer, sposobnost anti-CD38 antitela iz sadašnjeg pronalaska da pokrenu CDC i / ili apoptozu može biti testirana. Protokoli za testiranje za CDC, homotipičnu adheziju, molekularna grupisanja ili apoptoze su dobro poznati u tehnici.
[0630] U jednoj realizaciji, sadašnji pronalazak obezbeđuje postupak za detekciju prisustva ili kvantifikovanje količine ćelija koje eksprimiraju CD38in vivoiliin vitro.Postupak obuhvata (i) primenu na subjektu CD38BP-a iz predmetnog pronalaska konjugovanog sa markerom za detekciju; (ii) izlaganje subjekta sredstvima za detekciju navedenog detektibilnog markera za identifikaciju oblasti koje sadrže ćelije koje eksprimiraju CD38.
[0631] U jednom aspektu, imunokonjugati sadašnjeg pronalaska mogu biti korišćeni za ciljanje jedinjenja (npr, terapeutski agensi, markeri, citotoksini, imunosupresanti, itd) prema ćelijama koje imaju vezani CD38 na njihovoj površini korišćenjem takvih ciljanih jedinjenja kao terapeutskih ostataka u imunokonjugatima iz predmetnog pronalaska.
[0632] Anti-CD38 antitela iz sadašnjeg pronalaska takođe obezbeđuju postupke za lokalizacijuex vivoiliin vitroćelija koje eksprimiraju CD38 (na primer, sa detektibilnim markerom, kao što je jedan radioaktivni izotop, jedno fluorescentno jedinjenje, jedan enzim ili jedan enzimski ko-faktor).
[0633]Anti-CD38 antitela iz sadašnjeg pronalaska obezbeđuju postupak za ubijanje ćelija koje imaju vezan CD38 na njihovoj površini primenom imunotoksina iz predmetnog pronalaska.
[0634]Anti-CD38 antitela iz sadašnjeg pronalaska obezbeđuju postupke za lcčcnjc ili prevenciju poremećaja koji uključuju ćelije koje eksprimiraju CD38 u subjektu, pri čemu taj postupak obuhvata primenu terapeutski efikasne količine CD38BP antitela iz predmetnog pronalaska subjektu kome je to potrebno. Takva CD38BP-na antitela se koriste za inhibiranje CD38 indukovane aktivnosti povezane sa određenim poremećajima ili za eliminicaju ili redukciju broja ćelija koje eksprimiraju CD38.
[0635]Takav postupak obuhvata primenu na subjektu kompozicije CD38BP-a sadašnjeg pronalaska u količini koja je efikasna za lečenje ili prevenciju tog poremećaja. Kompozicija CD38BP-a se može primeniti sama ili zajedno sa drugim terapeutskim agensom, kao što je opisano na drugom mestu ovde koji deluju zajedno sa ili sinergistički sa kompozicijom CD38BP-a za lečenje ili prevenciju oboljenja koja uključuju ćelije koje eksprimiraju CD38. Alternativno, imunokonjugati se mogu koristiti da ubiju ćelije koje imaju eksprimiran CD38 na njihovoj površini ciljanim delovanjem citotoksinima ili radiotoksinima na CD38.
[0636]Poremećaj koji uključuje ćelije koje eksprimiraju CD38 koji može biti tretiran sa antitelima iz sadašnjeg pronalaska je kancerogeni poremećaj, kao što je poremećaj okarakterisan prisustvom tumorskih ćelija koje eksprimiraju CD38, uključujući, na primer, B ćelijski limfom, plazma ćelijske malignitete, T/NK ćelijski limfom i mijeloidne malignitete.
[0637]Primeri takvih kancerogenih bolesti uključuju B ćelijske limfome/leukemije uključujući prekursornu B ćelijsku limfoblastnu leukemiju/limfom i B ćelijske ne-Hočkinske limfome; akutnu promijelocitnu leukemiju; akutnu limfoblastnu leukemiju i neoplazme odraslih B ćelija, kao što su B ćelijska hronična limfocitna leukemija (CLL)/sitnoćelijski limfocitni limfom (SLL), B ćelijska akutna limfocitna leukemija, B ćelijska prolimfocitna leukemija, limfoplazmacitni limfom, mantle ćelijski limfom (MCL), folikularni limfom (FL) uključujući niskog stepena, srednjeg-stepena i visokog stepena FL, folikularni centralni limfom kože, marginalno zonalni B ćelijski limfom (MALT tip, nodalni i splenični tip), leukemiju dlakastih ćelija, difuzni krupno ćelijski B limfom, Burkitt-ov limfom, plazmacitom, plazma ćelijski mijelom, plazma ćelijska leukemija, post-transplatacioni limfoproliferativni poremećaj, Valdenstrom makroglobulinemija, plazma ćelijske leukemije i anaplastični krupnoćelijski limfom (ALCL).
[0638]U jednom aspektu, poremećaj koji uključuje ćelije koje eksprimiraju CD38 jc multipli mijelom.
[0639]Primeri B ćelijskih ne-Hočkinskih limfoma su limfomatoidni granulomatosis; primarni efuzioni limfom; intravaskularni krupnoćelijski B limfom, medijastinalni krupnoćelijski B limfom; bolesti teškog lanca (uključujuy,u i a bolesti), limfom uzrokovan terapijom sa imunosupresivnim agensima kao što su ciklosporinom indukovan limfom i metotreksatom indukovan limfom.
[0640]U jednoj realizaciji sadašnjeg pronalaska, poremećaj koji uključuje ćelije koje eksprimiraju CD38 može biti Hočkinov limfom.
[0641]Primeri poremećaja koji uključuju ćelije koje eksprimiraju CD38 mogu biti malignitet izveden iz T i NK ćelija uključujući: odrasle T ćelijske i NK ćelijske neoplazme uključujući T ćelijsku prolimfocitnu leukemiju, T ćelijsku krupnogranularnu limfocitnu leukemiju, agresivnu NK ćelijsku leukemiju, adultnu T ćelijsku leukemiju/limfom, ekstranodalni NK/T ćelijski limfom, nazalni tip, cntcropatijski-tip T ćclijskog limfoma, hcpatosplcnični T ćelijski limfom, subkutani panikulitisu-sličan T ćelijski limfom, blastni NK ćelijski limfom, Mvcosis Fungoides/Sezarv sindrom, primarni kutani CD30 pozitivni T ćelijski limfoproliferativni poremećaji (primarni kutani anaplastični krupnoćelijski limfom C-ALCL, limfomatoidna papuloza, granične lezije), angioimunoblastni T ćelijski limfom, periferni T ćelijski limfom nespecifikovan, anaplastični krupnoćelijski limfom.
[0642] Primeri maligniteta izvedeni iz mijeloidnih ćelija uključuju akutnu mijeloidnu leukemiju, uključujući akutnu promijelocitnu leukemiju i hronične mijeloproliferativne bolesti, uključujući hroničnu mijeloidnu leukemiju.
[0643] U jednoj realizaciji sadašnjeg pronalaska, poremećaji koji uključuju ćelije koje eksprimiraju CD38 mogu biti imuni poremećaji u kojima su uključene B ćelije koje eksprimiraju CD38, plazma ćelije, monociti i T ćelije.
[0644] Primeri imunih poremećaja u kojima su uključene B ćelije koje eksprimiraju CD38, plazma ćelije, monociti i T ćelije uključuju autoimune poremećaje, kao što su psorijaza, psorijatični artritis, dermatitis, sistemska skleroderma i skleroza, inflamatorna bolest creva (IBD), Kronova bolest, ulcerativni kolitis, respiratorni distres sindrom, meningitis, eneefalitis, uveitis, glomerulonefritis, ekcem, astma, ateroskleroza, adhezivni nedostak leukocita, multipla skleroza, Rejnodov sindrom, Sjogrenov sindrom, juvenilni početni dijabetes, Reiterova bolest, Beketova bolest, imuno kompleksni nefritis, IgA nefropatija, IgM polineuropatije, imuno posredovane trombocitopenije, kao što je akutna idiopatska trombocitopenična purpura i hronična idiopatska trombocitopenična purpura, hemolitička anemija, mijastenija gravis, lupus nefritis, sistemski lupus eritematozus, reumatoidni artritis (RA), atopični dermatitis, pemfigus, Gravesova bolest, Hašimotov tiroiditis, Vegenerova granulomatoza, Omenov sindrom, hronična bubrežna insuficijencija, akutna infektivna mononukleoza, multipla skleroza, HIV i herpes virus povezane bolesti. Dalji primeri su teški akutni respiratorni distres sindrom i horeoretinitis. Osim toga, druge bolesti i poremećaji su uključeni kao što su one izazvane ili posredovane infekcijom B-ćelija sa virusom, kao što je Epštajn-Barov virus (EBV).
[0645] U jednom aspektu, poremećaj koji uključuje ćelije koje eksprimiraju CD38 je reumatoidni artritis.
[0646] Dalji primeri inflamatornih, imunih i/ili autoimunih poremećaja u kojima su autoantitela i/ili prekomerna aktivnost B i T limfocita istaknute i koje se mogu lečiti u skladu sa sadašnjim pronalaskom uključuju sledeće: vaskulitise i druge poremećaje krvnih sudova, kao što su mikroskopski poliangiitis, Churg-Straussov sindrom i drugi ANCA-povezani vaskulitisi, poliarteritis nodosa, esencijalni krioglobulinemični vaskulitis, kožni leukocitoklastični angitis, Kavvasakijeva bolest, Takavasu arteritis, artritis džinovskih ćelija, Henoch-Schonlein purpura, primarni ili izolovani cerebralni angitiis, eritema nodozum, thrombangiitis obliterans, trombotička trombocitopenična purpura
(uključujući hemolitički uremični sindrom), i sekundarni vaskulitisi, uključujući kožni leukocitoklastični vaskulitis (npr sekundaran hepatitisu B, hepatitisu C, Valdenstrom makroglobulincmiji, B-ćclijskoj ncoplaziji, rcumatoidnom artritisu, Sjogrcn sindromu, ili sistemskom lupusu eritematozusu); dalji primeri su eritema nodosum, alergijski vaskulitis, panikulitis, Weber-Christianova bolest, purpura hvperglobulinaemica i Buergerova bolest;
kožni poremećaji, kao što su kontaktni dermatitis, linearna IgA dermatoza, vitiligo, pvoderma gangrenosum, epidermolvsis bullosa acquisita, pemfigus vulgaris (uključujući cikatricijalni pemfigoid i bulozni pemfigoid), alopecija areata (uključujući alopeciju universalis i alopeciju totalis), dermatitis herpetiformis, eritema multiforme, i hroničnu autoimunu urtikariju (uključujući angioneurotični edem i urtikarijalni vaskulitis);
immuno posredovane citopenije, kao što su autoimuna neutropenija i čista eritrocitna aplazija;
poremećaje vezivnog tkiva, kao što su CNS lupus, diskoidni eritematozni lupus, CREST sindrom, mešane bolesti vezivnog tkiva, polimiozitis/dermatomiozitis, inkluzioni miozitis tela, sekundarna amiloidoza, krioglobulinemija tip I i tip II, fibromijalgija, fosfolipidni sindrom antitela, sekundarna hemofilija, relapsni polihondritis, sarkoidoza, sindrom stiff man i reumatska groznica; dalji primer je eozinofilni fasciitis;
artritisi, kao što su ankilozni spondilitis, juvenilni hronični artritis, adult Stihova bolest, i SAPHO sindrom;
dalji primeri su sacroileitis, reaktivni artritis, Stillova bolest, i giht;
hematološki poremećaji, kao što aplastična anemija, primarna hemolitička anemija (uključujući sindrom hladnog aglutinina), hemolitičke anemije sekundarne CLL ili sistemskom eritematoznom lupusu; POEMS sindrom, perniciozna anemija, i Waldemstromova purpura hiperglobulinaemica; dalji primeri su agranulocitoza, autoimuna neutropenija, Franklinova bolest, Seligmanova bolest, bolesti gama teškog lanca, paraneoplastični sindrom sekundaran timomu i limfomima, kao, paraneoplastični sindroma sekundaran sa timomom i limfomima, i formiranje inhibitora faktora VIT;
endokrinopatije, kao što su poliendokrinopatija i Adisonove bolesti; dalji primeri su autoimuna hipoglikemija, autoimuni hipotiroidizam, autoimuni insulinski sindrom, de Quervain tiroiditis, i insulinski receptor antitelom-posredovane insulinske rezistencije; hepato-gastrointestinalni poremećaji, kao što su celijakije, Viplova bolest, primarna bilijarna ciroza, hronični aktivni hepatitis, i primarni sklerozirajući holangitis; jedan dalji primer je autoimuni gastritis;
nefropatije, kao što su rapidni progresivni glomerulonefritis, post-streptokokalni nefritis, Gudpasterov sindrom, membranozni glomerulonefritis, i krioglobulinemički nefritis; još jedan primer je bolest minimalne promene;
neurološki poremećaji, kao što su autoimune neuropatije, mononeuritis multipleks, Lambert-Eaton mijastenični sindrom, Sidenhamova horeja, tabes dorsalis i Guillain-Barrov sindrom; dalji primeri su rrhjelopatija/tropikalna spastična parapareza, mijastenija gravis, akutna inflamatorna
demijelinaciona polineuropatija, i hronična infiamatorna demijelinaciona polineuropatija;
multipla skleroza;
srčani i plućni poremećaji, kao što su COPD, fibrozni alvcolitis, bronhiolitis oblitcrans, alergijske aspergiloze, cistične fibroze, Leflerov sindrom, miokarditis i perikarditis; dalji primeri su hipersenzitivni pneumonitis i paraneoplastični sindrom sekundaran kanceru pluća;
alergijski poremećaji, kao što su bronhijalna astma i hiper-IGE sindrom; još jedan primer je amaurosis fugax;
oftalmološki poremećaji, kao što je idiopatski horioretinitis;
infektivne bolesti, kao što su parvovirus B infekcija (uključujući hands-and-socks sindrom);
ginekološki-akušerski poremećaji, kao što su povratni abortus, povratni gubitak fetusa, i intrauterinski zastoj u rastu; još jedan primer je paraneoplastični sindrom sekundaran ginekološkim neoplazmama;
muški reproduktivni poremećaji, kao što je paraneoplastični sindrom sekundaran neoplazmima testisa; i
poremećaji nakon transplatacije, kao što su alograft i ksenograft odbacivanja i bolest graft protiv domaćina.
[0647] Antitelo se takođe može primeniti profilaktički kako bi se smanjio rizik od pojave kancera, kao što je kancerogeni poremećaj kao što je gore opisano, da se odloži početak nastanka događaja u takvoj progresiji kancera, i/ili smanji rizik od ponavljanja kada je takav kancer u remisiji. Ovo može biti posebno korisno kod pacijenata kada je teško locirati tumor za koji je zna da je prisutan usled drugih bioloških faktora.
[0648] Kompozicije prema prikazanom pronalasku mogu da uključuju "terapeutski efikasnu količinu" ili "profilaktički efikasnu količinu" jednog CD38BP. Izvesna "terapeutski efikasna količina" se odnosi na količinu efikasnu, u dozama i vremenskim periodima neophodnim da bi se postigao željeni terapijski rezultat. Terapeutski efikasna količina jednog CD38BP može varirati u skladu sa faktorima kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina pojedinca, i sposobnosti CD38BP da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Terapeutski efikasna količina je takođe ona u kojoj su bilo koji toksični ili štetni efekti antitela ili dela antitela prevagnuti pomoću terapeutski korisnih efekata. Izvesna "profilaktički efikasna količina" sc odnosi na količinu efikasnu, u dozama i vremenskim periodima neophodnu da bi sc postigao željeni profilaktički rezultat (na primer, smanjenje verovatnoće razvoja poremećaja, smanjenje intenziteta ili širenje poremećaja, povećanje verovatnoće preživljavanja tokom neposrednog poremećaja, kašnjenje u početku stanja bolesti, itd). Tipično, pošto se profilaktička doza koristi kod subjekata pre ili u ranijem stupnju bolesti, profilaktički efikasna količina će biti manja od terapeutski efikasne količine.
[0649] Izvesna "terapeutski efikasna količina" za terapiju tumora se takođe može meriti svojom sposobnošću da stabilizuje napredovanje bolesti. Sposobnost jedinjenja da inhibira kancer može se proceniti na životinjskom modelu sistema prognoze efikasnosti u humanim tumorima. Alternativno, ovo svojstvo preparata može se proceniti ispitivanjem sposobnosti jedinjenja da inhibira rast ćelija ili da indukuje apoptozuin vitrotestovima koji su poznati iskusnom stručnjaku. Terapeutski efikasna količina terapeutskog jedinjenja može smanjiti veličinu tumora, ili na drugi način poboljšati simptome kod subjekta. Onaj ko jc uobičajeno verziran u stanju tehnike može da odredi ove količine na osnovu faktora kao što su veličina subjekta, ozbiljnosti simptoma kod subjekta, neke određene kompozicije ili odabranog puta primene.
[0650]Izvesna "terapeutski efikasna količina" za reumatoidni artritis može rezultirati u izvesnoj najmanje ACR2opreliminarnoj definiciji poboljšanja kod bolesnika, kao što je u izvesnoj najmanje ACR50preliminarnoj definiciji poboljšanja, na primer nekoj najmanje ARC70preliminarnoj definiciji poboljšanja.
[0651]ACR20preliminarna definicija poboljšanja se defmiše kao: poboljšanje<>>20% u: broju mekih zglobova (TJC) i broju otečenih zglobova (SJC) i > 20 % poboljšanje u 3 od sledećih 5 ocena: Procena bola pacijenta (VAS), Globalna procena pacijenta (VAS), Globalna procena lekara (VAS), pacijentova samoprocena nesposobnosti (HAQ), Akutna reakciona faza (CRP ili ESR).
[0652]ACR5oi ACR70se definišu na isti način sa > 50%> i > 70% poboljšanja, respektivno. Za više informacija videti Felson et al., u Američkom koledžu za reumatologiju Preliminarna definicija poboljšanja kod reumatoidnog artritisa.; Arthritis Rheumatism 38, 727-735 (1995).
[0653]Alternativno, izvesna terapeutski efikasna količina za reumatoidni artritis može biti izmerena pomoću DAS (rezultata aktivnosti oboljenja), uključujući DAS28 i/ili DAS56, kao što je definisano od strane EULAR-a.
[0654]Režimi doziranja su podešeni tako da obezbede optimalni željeni odgovor (npr, terapeutski odgovor). Na primer, jedna pojedinačna bolus injekcija može biti primenjena, nekoliko podeljenih doza može biti primenjivano tokom vremena ili doza može biti proporcionalno smanjena ili povećana kao što je indikovano hitnošću u terapijskoj situaciji. Parenteralne kompozicije se mogu fonnulisati u jediničnom doznom obliku, radi lakše primene i uniformnosti doziranja. Jediničan dozni oblik kako se ovde koristi odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne kao jedinične doze za subjekte koji se tretiraju; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da proizvede željeni terapeutski efekat zajedno sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija za jedinične dozne oblike koji uključuju antitela iz sadašnjeg pronalaska je diktirana i direktno zavisna od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i posebnog terapeutskog efekta koji se postiže, i (b) prisutnih ograničenja u tehnici izrade takvog aktivnog jedinjenje za lečenje osetljivosti kod pojedinaca.
[0655]Efikasne doze i dozni režimi za CD38BP antitela iz sadašnjeg pronalaska zavise od oboljenja ili stanja koje se tretira i mogu se odrediti od strane stručnjaka iz tehnike. Primer, neograničavajući opseg za terapeutski efikasne količine jedinjenja iz ovog pronalaska je oko 0,1-100 mg/kg, kao što je oko 0,1-50 mg/kg, na primer oko 0,1-20 mg/kg, kao što je oko 0,1-10 mg/kg, na primer oko 0,5, oko poput 0,3, oko 1, ili oko 3 mg/kg.
[0656]Lekar ili veterinar sa uobičajenim iskustvom u tehnici može lako da odredi i prepiše efikasnu količinu potrebnog farmaceutskog preparata. Na primer, lekar ili veterinar može početi sa dozama CD38BPs iz predmetnog pronalaska korišćenim u farmaceutskoj kompoziciji u nižim nivoima nego što je potrebno da bi se postigao željeni terapeutski efekat i postepeno povećavati dozu sve dok se ne postigne željeni efekat. Uopšteno, pogodna dnevna doza kompozicije prema predmetnom pronalasku biće ona količina jedinjenja koja je najniža doza efikasna da proizvede terapeutski efekat. Takva efikasna doza će generalno zavisiti od faktora koji su gore opisani. Primena može biti intravenski, intramuskularno, intraperitonealno, ili subkutano i na primer primenjuje se proksimalno ciljanom mestu. Ako je poželjno, efikasna dnevna doza farmaceutske kompozicije može se primenjivati kao dve, tri, četiri, pet, šest ili više pod-doza koje se primenjuju odvojeno u odgovarajućim intervalima tokom dana, opciono, u jediničnim doznim oblicima. Iako je moguće da se jedinjenje iz sadašnjeg pronalaska primenjuje samostalno, poželjno je da se primeni jedinjenje u obliku farmaceutske kompozicije kao što je gore opisano.
[0657]U jednom izvođenju, CD38BP-i predmetnog pronalaska mogu se primenjivati infuzijom u nedeljnoj dozi od 10 do 500 mg/m2, kao što je od 200 do 400 mg/m<2>. Takva primena se može ponoviti, npr 1 do 8 puta, kao što je 3 do 5 puta. Primena se može izvesti kontinuiranom infuzijom tokom perioda od 2 do 24 sata, kao što je od 2 do 12 sati.
[0658]U jednom izvođenju, CD38BP-i predmetnog pronalaska mogu se primenjivati sporom kontinuiranom infuzijom tokom dugog vremenskog perioda, kao što je više od 24 sata, u cilju smanjenja toksičnih neželjenih efekata.
[0659]Ujednoj realizaciji CD38BP-i predmetnog pronalaska mogu se primenjivati u nedeljnoj dozi od 250 mg do 2000 mg, kao što je na primer 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg ili 2000 mg, za primenu do 8 puta, kao što je od 4 do 6 puta. Primena se može obaviti kontinuiranom infuzijom tokom perioda od 2 do 24 sata, kao što od 2 do 12 sati. Takav režim može biti ponovljen jednom ili više puta kada je neophodno, na primer, nakon 6 meseci ili 12 meseci. Doza se može odrediti ili podesiti merenjem količine jedinjenja iz sadašnjeg pronalaska u krvi nakon primene na primer uzimanjem biološkog uzorka i korišćenjem anti-idiotipskih antitela koja ciljaju antigen vezujući region na CD38BP-ima iz predmetnog pronalaska.
[0660]U jednom izvođenju, CD38BP-i predmetnog pronalaska se mogu primenjivati terapijom održavanja, kao što su, na primer, jednom nedeljno u trajanju od 6 meseci ili duže.[0661]U jednom izvođenju, CD38BP-i predmetnog pronalaska se mogu primeniti režimom koji uključuje jednu infuziju od jednog CD38BP predmetnog pronalaska praćenu infuzijom CD38BP predmetnog pronalaska konjugovanog sa radioizotopom. Režim se može ponoviti, npr 7 do 9 dana kasnije.
[0662]Kao neograničavajući primeri, tretmani u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu biti obezbeđeni kao dnevno doziranje jedinjenja iz ovog pronalaska u količini od oko 0,1-100 mg/ kg, kao Stoje 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2,3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20,21,22, 23,24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ili 100 mg/kg, dnevno, u najmanje jednom od dana 1, 2, 3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22, 23,24, 25, 26, 27,28,29, 30,31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ili 40, ili alternativno, najmanje jednom od nedelja 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 nakon početka tretmana, ili bilo koja njihova kombinacija korišćenjem pojedinačnih ili podcljcnih doza na svakih 24, 12, 8, 6, 4 ili 2 sata, ili bilo koje njihove kombinacije.
[0663]Farmaceutske kompozicije iz sadašnjeg pronalaska mogu se takođe primenjivati u kombinovanoj terapiji, tj, u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensima od značaja za bolesti ili stanje koje se tretira. Takva primena može biti istovremena, odvojena ili sekvencijalna. Za istovremenu primenu sredstva mogu biti primenjivana kao jedna kompozicija ili kao odvojene kompozicije, prema potrebi.
[0664]Prema tome, antitela iz predmetnog pronalaska obezbeđuju postupke za lečenje poremećaja koji uključuju ćelije koje eksprimiraju CD38 kao što je gore opisano, pri čemu takav postupak obuhvata primenu izvesnog CD38BP-a prema predmetnom pronalasku u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa kao što je opisano u nastavku.
[0665]Antitela iz predmetnog pronalaska se mogu takođe koristiti za dobijanje farmaceutske kompozicije koja će se primenjivati sa najmanje jednim hemoterapeutskim sredstvom za poremećaj koji uključuje ćelije koje eksprimiraju CD38 kao što je prethodno opisano.
[0666]U jednoj realizaciji, kombinovana terapija može uključivati primenu kompozicije prema predmetnom pronalasku zajedno sa najmanje jednim hemoterapeutskim sredstvom, najmanje jednim anti-inflamatornim sredstvom, ili najmanje jednim imunosupresivnim i/ili imunomodulatornim sredstvom.
[0667]Ujednoj realizaciji, antitela iz sadašnjeg pronalaska obezbeđuju postupak za lečenje poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimiraju CD38 u subjektu, pri čemu taj postupak obuhvata primenu terapeutski efikasne količine CD38BP predmetnog pronalaska i najmanje jednog hemoterapeutskog agensa kod subjekta kome je to potrebno.
[0668]U jednoj realizaciji, antitela iz sadašnjeg pronalaska obezbeđuju postupak za lečenje multiplog mijeloma, pri čemu taj postupak obuhvata primenu terapeutski efikasne količine izvesnog CD38BP-a iz predmetnog pronalaska i najmanje jednog hemoterapeutskog sredstva kod subjekta kome je to potrebno.
[0669]U jednoj realizaciji, antitela iz sadašnjeg pronalaska su korišćena u pripremi farmaceutske kompozicije koja će biti primenjivana sa najmanje jednim hemoterapeutskim sredstvom za lečenje multiplog mijeloma.
[0670]U jednoj realizaciji, takav jedan hemoterapcutski agens može biti odabran od nekog antimetabolita, kao što su metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, fludarabin, 5-fluorouracil, dekarbazin, hidroksiurea, asparaginaza, gemcitabin, kladribin i sličnih agenasa.
[0671]U jednoj realizaciji, takav jedan hemoterapeutski agens može biti odabran od nekog agensa za alkilovanje, kao što su mehloretamin, tioepa, hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU), lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, dakarbazin (DTIC), prokarbazin, mitomicin C, cisplatin i drugi derivati platine, kao što je karboplatin, i sličnih agenasa.
[0672]Ujednoj realizaciji, takav jedan hemoterapeutski agens može biti odabran od nekog antibiotika, kao što su daktinomicin (bivši aktinomicin), bleomicin, daunorubicin (nekada daunomicin), doksorubicin, idarubicin, mitramicin, mitomicin, mitoksantron, plikamicin, antramicin (AMC) i sličnih agenasa.
[0673]U jednoj realizaciji, takav jedan hemoterapeutski agens može biti odabran od nekog antimitotičnog sredstva, kao što su taksani, na primer docetaksel, paklitaksel i vinka alkaloidi, na primer vindezin, vinkristin, vinblastin, i vinorelbin.
[0674]U jednoj realizaciji, takav jedan hemoterapeutski agens može biti odabran od nekog inhibitora topoizomeraze, kao što je topotekan.
[0675]U jednoj realizaciji, takav jedan hemoterapeutski agens može biti odabran od nekog inhibitora faktora rasta, kao što su inhibitor za ErbBl (EGFR) (kao što su gefitinib (Iressa<®>), cetuksimab (Erbitux<®>), erlotinib (Tarceva<®>), HuMax-EGFr (2F8 opisan u WO 2002/100348) i slični agensi), neki inhibitor za ErbB2 (Her2/neu) (kao što su trastuzumab (Herceptin<®>) i slični agenasi ) i sličnih agenasa. U jednom ostvarenju, takav inhibitor faktora rasta može biti inhibitor farnezil transferaze, kao što su SCH-66336 i Rl 15777. U jednom ostvarenju, takav inhibitor faktora rasta može biti vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF) inhibitor, kao što je bevacizumab (Avastin<®>).
[0676]U jednoj realizaciji, takav jedan hemoterapeutski agens može biti neki od inhibitora tirozin kinaze, kao što su imatinib (Glivec, Gleevec STI571), lapatinib PTK787/ZK222584 i slični agensi.
[0677]U jednoj realizaciji, takav jedan hemoterapeutski agens može biti neki od inhibitora histonske deacetilaze. Primeri takvih inhibitora histon deacetilaze uključuju hibridna polarna jedinjenja na bazi hidroksamične kiseline, poput SAHA (suberoilanilid hidroksamična kiselina).
[0678]Ujednoj realizaciji, takav jedan hemoterapeutski agens može biti neki od inhibitora P38a MAP kinaze, poput SCIO-469.
[0679]Ujednoj realizaciji, antitela iz sadašnjeg pronalaska obezbeđuju postupak za lečenje poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimiraju CD38 u subjektu, pri čemu taj postupak obuhvata primenu terapeutski efikasne količine jednog CD38BP antitela iz predmetnog pronalaska i najmanje jednog inhibitora angiogeneze, neovaskularizacije i/ili druge vaskularizacije kod subjekta kome je to potrebno.
[0680]U jednoj realizaciji, antitela iz sadašnjeg pronalaska obezbeđuju postupak za lečenje multiplog mijeloma, pri čemu taj postupak obuhvata primenu terapeutski efikasne količine jednog CD38BP antitela iz predmetnog pronalaska i najmanje jednog inhibitora angiogeneze, neovaskularizacije, i / ili druge vaskularizacije na subjektu kome je to potrebno.
[0681]Ujednoj realizaciji, antitela iz sadašnjeg pronalaska mogu biti korišćena u izradi
jedne farmaceutske kompozicije koja će se primenjivati sa najmanje jednim inhibitorom angiogeneze, neovaskularizacije, i / ili druge vaskularizacije za lečenje multiplog mijeloma.
[0682]Primeri takvih inhibitora angiogeneze su inhibitori urokinaze, inhibitori matriksne proteaze (kao što su marimastat, neovastat, BAY 12-9566, AG 3340, BMS-275291 i slični agensi), inhibitori migracije i proliferacije endotelnih ćelija (kao što su TNP-470, skvalamin, 2-metoksiestradiol, kombretastatini, endostatin, angiostatin, penicilamin, SCH66336 (Schering-Plough Corp, Madison, NJ), Rl 15777 (Janssen Pharmaceutica, Ine, Titusville, NJ) i slični agensi), antagonisti angiogenih faktora rasta (kao što su ZD6474, SU6668, antitela protiv angiogenih agenasa i / ili njihovih receptora (kao što su VEGF, bFGF i angiopoetin-1), talidomid (Thalomid<®>), analozi talidomida (kao što su CC-5013 (lenalidomid, Revlimid™) i CC4047 (Actimid™), Sugen 5416, SU5402, antiangiogeni ribozim (kao što je angiozim), intcrfcron a (kao što jc intcrfcron a2a), suramin i slični agensi), inhibitori VEGF-R kinaze i drugi antiangiogenski inhibitori tirozin kinaze (kao što je SU011248), inhibitori endotelne specifične integrin/preživljavanja signalizacije (kao što je vitaksin i slični agensi), antagoniste bakra/helatore (kao što su tetratiomolibdat, kaptopril i slični agensi), karboksiamido-triazol (CAI), ABT-627, CM 101, interleukin-12 (IL-12), IM862, PNU145156E kao i nukleotidne molekule koji inhibiraju angiogenezu (kao što su antisens-VEGF-cDNK, cDNK koja kodira angiostatin, cDNK koja kodira p53 i cDNK koja kodira nepotpuni VEGF receptor-2) i slični agensi.
[0683]Drugi primeri takvih inhibitora angiogeneze, neovaskularizacije, i/ili druge vaskularizacije su antiangiogenski heparinski derivati i srodne molekule (npr heperinaze III), temozolomid, NK4, faktor inhibicije migracije makrofaga (MIF), inhibitori ciklooksigenaze-2, inhibitori hipoksijom indukovanog faktora 1, antiangiogenski izoflavoni soje, oltipraz, fumagilin i njihovi analozi, analozi somatostatina, pentozan polisulfat, natrijum tekogalan, dalteparin, tumstatin, trombospondin, NM-3, kombrestatin, kanstatin, avastatin, antitela protiv drugih relevantnih ciljeva (kao što su anti-alfa-v/beta-3 integrin i anti-kininostatin mAt-a) i slični agensi.
[0684]U jednoj realizaciji, antitela iz predmetnog pronalaska mogu biti korišćena za pripremu jedne farmaceutske kompozicije koja će biti primenjivana sa talidomidom (Thalomid<®>), analozima talidomida (kao što su CC-5013 (lenalidomid, Revlimid™) i / ili CC4047 (Actimid™). U daljem ostvarenju, antitela iz predmetnog pronalaska mogu biti korišćena za pripremu jedne farmaceutske kompozicije koja će biti primenjivana sa talidomidom.
[0685]U jednoj realizaciji, antitela iz predmetnog pronalaska mogu biti korišćena za pripremu jedne farmaceutske kompozicije koja će biti primenjivana sa nekim anti-CD20 antitelom, kao što je rituksimab (Rituxan<®>, MabThera<®>), jednim humanim monoklonskim anti-CD20 antitelom kao što je opisano u WO 2004/035607, kao što su 11B8, 2F2 ili 7D8.
[0686]U jednoj realizaciji, jedan terapeutski agens za upotrebu u kombinaciji sa CD38BP-ima iz predmetnog pronalaska za lečenje poremećaja kao što je gore opisano može biti inhibitor proteazoma, kao što je bortezomib (Velcade<®>).
[0687]U jednoj realizaciji, jedan terapeutski agens za upotrebu u kombinaciji sa CD38BP-ima iz predmetnog pronalaska za lečenje poremećaja kao što jc gore opisano može biti neki kortikosteroid, kao što je prednizon, prednizolon, deksametazon itd.
[0688]U jednoj realizaciji, jedan terapeutski agens za upotrebu u kombinaciji sa CD38BP-ima iz predmetnog pronalaska za lečenje poremećaja kao što je gore opisano može biti neki kortikosteroid, kao što je prednizon, prednizolon, deksametazon itd.
[0689]U jednoj realizaciji, jedan terapeutski agens za upotrebu u kombinaciji sa CD38BP-ima iz predmetnog pronalaska za lečenje poremećaja kao što je gore opisano može biti neki imunogen protiv kancera, kao što je neki kancerski antigen/tumorski povezan antigen (npr adhezioni molekul epitelnih ćelija (EpCAM/TACSTDI mucin 1 (MUCI), karcinoembrionski antigen (CEA), tumorski povezan glikoprotein 72 (TAG-72), gplOO, Melan-A, MART-1, KDR, RCAS1, MDA7, kancerom povezane virusne vakcine (npr, vakcine humanog papiloma virusa), tumor-izvedeni proteini toplotnog šoka, i slična sredstva. Izvcstan broj drugih pogodnih kancerskih antigena/antigena povezanih sa tumorom opisanih na drugom mestu ovde i sličnih molekula poznatih u tehnici se mogu takođe, ili alternativno koristiti u takvom rešenju. Imunogeni peptidi protiv kancera uključuju antiidiotipske "vakcine" poput BEC2 antiidiotipskih antitela, Mitumomab, CeaVac i srodna anti-idiotipska antitela, anti-idiotipska antitela za MG7 antitelo i druga anti-idiotipska antitela protiv kancera (videti na primer Birebent et al., Vaccine. 21. (15), 1601-12 (2003), Li et al., Chin Med J (Engl). 114(9), 962-6 (2001), Schmitt et al, Hvbridoma. 13(5), 389-96 (1994), Maloney et al, Hybridoma. 4(3), 191-209 (1985), Raychardhuri et al, J. Immunol. 137(5), 1743-9 (1986), Pohl et al., Int J Cancer. 50(6), 958-67 (1992), Bolen et al., Cytokines Mol Ther. 2(4), 231-8 (1996) i Maruyama, J Immunol Methods. 264(1-2), 121-33 (2002)). Takva anti-idiotipska At mogu opciono biti konjugovana sa nosačem, koji može biti neki sintetički (obično inertni) molekul nosača, neki protein (na primer hemocijanin iz prilepka (KLH) (videti na primer Ochi et al, Eur J Immunol. 17(11), 1645-8 (1987)), ili neka ćelija (na primer neki eritrocit - videti na primer Wi et al., J Immunol Methods. 122(2), 227-34 (1989)).
[0690]U jednoj realizaciji, jedan terapeutski agens za upotrebu u kombinaciji sa CD38BP-ima iz predmetnog pronalaska za lečenje poremećaja kao što je gore opisano može biti neki bisfosfonat. Primeri potencijalno pogodnih bifosfonata su pamidronat (Aredia<®>), zoledronska kiselina (Zometa<®>), klodronat (Bonefos<®>), risendronat (Actonel<®>), ibandronat (Boniva<®>), etidronat (Didronel<®>), alendronat (Fosamax<®>), tiludronat (Skelid<®>), inkadronat (Yamanouchi Pharmaceutical) i minodronat (YM529, Yamanouchi).
[0691]U jednoj realizaciji, jedan terapeutski agens za upotrebu u kombinaciji sa CD38BP-ima iz predmetnog pronalaska za lečenje poremećaja kao što je gore opisano može biti neki faktor stimulacije kolonija. Primeri pogodnih faktora stimulacije kolonija su stimulirajući faktor granulocitne kolonije (G-CSF), kao što su filgrastim (Neupogen<®>) i pegfilgrastim (Neulasta<®>), i stimulirajući faktori granulocitne makrofagne kolonije (GM-CSF) kao što su sargramostim (Leukine<®>).
[0692]U jednoj realizaciji, jedan terapeutski agens za upotrebu u kombinaciji sa CD38BP-ima iz predmetnog pronalaska za lečenje poremećaja kao što je gore opisano može biti neki agens za eritropoezu. Primeri pogodnih eritropoetičnih agenasa su eritropoetin (EPO), kao što su epoetin alfa (na primer Procrit<®>, Epogcn<®>i Eprcx<®>) i epoctin beta (npr NcoRccormon<®>) i proteini stimulacije eritropoeze (na primer Aranesp<®>).
[0693]U jednoj realizaciji, jedan terapeutski agens za upotrebu u kombinaciji sa CD38BP-ima iz predmetnog pronalaska za lečenje poremećaja kao što je gore opisano mogu biti neki anti-kancer citokin, hemokin, ili njihova kombinacija. Primeri pogodnih citokina i faktora rasta uključuju IFNy, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL -23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNa (npr INFa2b), IFNp, GM-CSF, CD40L, FIT3 ligand, faktor matične ćelije, ancestim i TNFa. Pogodni hemokini mogu da uključuju Glu-Leu-Arg (ELR)-negativne hemokine kao što su IP-10, MCP-3, MIG, i SDF-la iz humanog CXC i C-C porodica hemokina. Pogodni citokini uključuju derivate citokina, varijante citokina, fragmente citokina i fuzione proteine citokina.
[0694]Ovi i drugi postupci ili upotrebe uključuju prirodne nukleinske kiseline koje kodiraju peptide ovde mogu alternativno ili dodatno vršiti "aktivacije gena" i homologne rekombinatne tehnike ushodne regulacije gena, kao što su one opisane u US 5,968,502, US 6,063,630 i US 6,187,305 i EP 0505500.
[0695]U jednoj realizaciji, jedan terapeutski agens za upotrebu u kombinaciji sa CD38BP-ima iz predmetnog pronalaska za lečenje poremećaja kao što je gore opisano može biti neki agens koji modulira, npr poboljšava ili inhibira, ekspresiju ili aktivnost Fca ili Fcy receptora. Primeri agenasa pogodnih za ovu upotrebu uključuju interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), interIeukin-6 (IL-6), stimulirajući faktor granulocitne kolonije (G-CSF), kao što su filgrastim (Neupogen<®>) i pegfilgrastim (Neulasta<®>), i stimulirajuće faktore granulocitne makrofagne kolonije (GM-CSF) kao što su sargramostim (Leukine<®>), interferon-y (IFN-y), i faktor nekroze tumora (TNF).
[0696]U jednoj realizaciji, jedan terapeutski agens za upotrebu u kombinaciji sa CD38BP-ima iz predmetnog pronalaska za lečenje poremećaja kao što je gore opisano može biti neki regulator kontrole ćelijskog ciklusa/apoptoza (ili "regulatorni agens"). Jedan regulator kontrole ćelijskog ciklusa/apoptoza može da uključuje molekule (i) koji ciljaju i moduliraju regulatore kontrole ćelijskog ciklusa/apoptoza kao što su cdc-25 (kao što je NSC 663284), (ii) ciklin-zavisne kinaze koji prekomerno stimulišu ćelijski ciklus (kao što su flavopiridol (L868275, HMR1275), 7-hidrokistaurosporin (UCN-01, KW-2401) i roskovitin (R-roskovitin, CYC202)), i (iii) modulatore telomeraze (kao što su BIBR1532, SOT-095, GRN163 i kompozicijama opisanim u na primer US 6,440,735 i US 6,713,055). Neograničavajući primeri molekula koji ometaju puteve apoptoze uključuju TNF-povezani apoptoza-indukujući ligand (TRAIL)/apoptoza-2 ligand (Apo-2L), agense za indukciju NF-kB blokade što dovodi do inhibicije proizvodnje IL-6, antitela koja aktiviraju TRAIL receptore, IFNs, anti-sens Bcl-2, i AsiO^(arsen trioksid, Trisenox<®>).
[0697]U jednoj realizaciji, jedan terapeutski agens za upotrebu u kombinaciji sa CD38BP-ima iz predmetnog pronalaska za lečenje poremećaja kao što je gore opisano može biti neki hormonski regulatorni agens, kao što su agensi korisni za anti-androgenu i anti-estrogenu terapiju. Primeri takvih hormonskih regulatornih agenasa su tamoksifen, idoksifen, fulvestrant, droloksifen, toremifen, raloksifen, dietilstilbestrol, etinil estradiol/estinil, jedan anti-androgen (kao što su flutamind/euleksin), jedan progestin (kao što su hidroksi- progesteron kaproat, mcdroksiprogcstcron/provcra, mcgcstrol acepat/megace), jedan adrenokortikosteroid (kao što su hidrokortizon, prednizon), hormon koji oslobađa lutenizirajući hormon (i njegovi analozi i drugi LHRH agonisti kao što su buserelin i gozerelin), neki inhibitor aromataze (kao što su anastrazol/arimideks, aminoglutetimid/ citraden, eksemestan), jedan hormonski inhibitor (poput oktreotid/- sandostatina) i slični agensi.
[0698]U jednoj realizaciji, jedan terapeutski agens za upotrebu u kombinaciji sa CD38BP-ima iz predmetnog pronalaska za lečenje poremećaja kao što je gore opisano mogu biti neki anti-anergični agensi (na primer mala jedinjenja molekule, proteini, glikoproteini, ili antitela koja ukidaju toleranciju na tumor i antigene kancera). Primeri takvih jedinjenja su molekuli koji blokiraju aktivnost CTLA-4, kao što su MDX-010 (Phan et al., PNAS USA 100, 8372 (2003)).
[0699]U jednoj realizaciji, jedan terapeutski agens za upotrebu u kombinaciji sa CD38BP-ima iz predmetnog pronalaska za lečenje poremećaja kao što je gore opisano može biti neka nukleinska kiselina koja sadrži supresorni gen tumora ili vektor kao što je jedan replikaciono-defektan adenovirus koji kodira humani rekombinantni divljeg tipa p53/SCH58500, itd.; antisens nukleinske kiseline za ciljanje onkogena, mutiranih ili deregulisanih gena; ili siRNK usmerena na mutirane ili deregulisane gene. Primeri tumor supresornih ciljeva uključuju, na primer, BRCA1, RB1, BRCA2, DPC4 (Smad4), MSH2, MLH1 i DCC.
[0700]U jednoj realizaciji, jedan terapeutski agens za upotrebu u kombinaciji sa CD38BP-ima iz predmetnog pronalaska za lečenje poremećaja kao što je gore opisano može biti neka nukleinska kiselina protiv kancera, kao što su genasens (augmerosen/G3139), LY900003 (ISIS 3521), ISIS 2503, OGKS-011 (ISIS 112989), LE-AON/LEraf-AON (lipozom inkapsulirani c-raf antisens oligonukleotid/ISIS-5132), MG98 i druge antisens nukleinske kiseline koje ciljaju PKCa, klusterin, IGFBP-e, protein kinazu A, ciklinDl ili Bcl-2h.
[0701]U jednoj realizaciji, jedan terapeutski agens za upotrebu u kombinaciji sa CD38BP-ima iz predmetnog pronalaska za lečenje poremećaja kao što je gore opisano može biti neki antikancer inhibitorni RNK molekul (videti na primer Lin et al., Curr Cancer Drug Targets. 1(3), 241-7 (2001), Erratum in: Current Cancer Drug Targets. 3(3), 237 (2003), Lima et al., Cancer Gene Ther. 11(5), 309-16 (2004), Grzmil et al., Int J Oncol. 4(1), 97-105 (2004), Collis et al, Int J Radiat Oncol Biol Phys. 57(2 Suppl), S144 (2003), Yang et al., Oncogene. 22 (36), 5694-701 (2003) i Zhang et al., Biochem Biophys Res Commun. 303(4), 1169-78 (2003)).
[0702]Kompozicije i postupci kombinovane primene prema predmetnom pronalasku takođe uključuju primenu vakcina nukleinskih kiselina, kao što su gole DNK vakcine koje kodiraju takve antigene kancera/antigene povezane sa tumorom (videti na primer US 5,589,466, US 5,593,972, US 5,703,057, US 5,879,687, US 6,235,523 , i SAD 6,387,888). U jednoj realizaciji, postupak kombinovane primene i/ili kombinacija kompozicija sadrže izvesne autologne kompozicije vakcina. U jednoj realizaciji, pomenuta kombinovana kompozicija i/ili postupak kombinovane primene obuhvata neku celu ćelijsku vakcinu ili ćeliju koja eksprimira citokin (na primer jedan rekombinantni fibroblast koji eksprimira IL-2, rekombinantne dendritske ćelije koje eksprimiraju citokin i slično) (videti na primer Kowalczyk ct al., Acta Biochim Pol. 50(3), 613-24 (2003), Reilly et al., Methods Mol Med. 69, 233-57 (2002) i Tirapu et al., Curr Gene Ther. 2(1), 79-89 (2002). Drugi primer takvog jednog autolognog ćelijskog pristupa koji može biti koristan u kombinovanim postupcima prema predmetnom pronalasku je MyVax<®>Personalized Immunotherapy method (ranije označen kao GTOP-99) (Genitope Corporation - Redvvood City, CA,
USA).
[0703]U jednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje kombinacije kompozicija i postupke kombinovane primene u kojima se CD38BP kombinuje ili ko-primenjuje sa virusom, virusnim proteinima, i slično. Replikacioni-deficitarni virusi, koji su generalno sposobni za jednu ili samo nekoliko rundi replikacijain vivo,a koji ciljaju ćelije tumora, mogu na primer biti korisne komponente takvih kompozicija i metoda. Takvi virusni agensi mogu sadržati ili biti povezani sa nukleinskim kiselinama koje kodiraju imunostimulansc, poput GM-CSF i/ili IL-2. I prirodni onkolitički i takvi rekombinantni onkolitički virusi (na primer HSV-1 virusi, reovirusi, adenovirusi replikaciono-deficitarni i osetljivi na replikaciju, itd) mogi biti korisne komponente takvih postupaka i kompozicija. Prema tome, u jednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje kombinovane kompozicije i postupke kombinovane primene u kojima se jedan CD38BP kombinuje ili ko-primenjuje sa nekim onkolitičkim virusom. Primeri takvih virusa uključuju onkolitičke adenoviruse i viruse herpesa, koji mogu ili ne moraju biti modifikovani virusi (videti na primer Shah et al., J Neurooncol. 65(3), 203-26 (2003), Stiles et al., Surgerv. 134(2), 357-64 (2003), Sunarmura et al., Pancreas. 28(3), 326-9 (2004), Teshigahara et al., J Surg Oncol. 85(1), 42-7 (2004), Varghese et al, Cancer Gene Ther. 9(12), 967-78 (2002), Wildner et al., Cancer Res. 59(2), 410-3 (1999), Yamanaka, Int J Oncol. 24 (4), 919-23 (2004) i Zvviebel et al., Semin Oncol. 28(4), 336-43 (2001).
[0704]Kombinacije kompozicija i postupci kombinovane primene koji uključuju antitela prema predmetnom pronalasku mogu takođe da uključuju "celoćelijske i" adoptivne "metode imunoterapije. Na primer, takvi postupci mogu sadržati infuziju ili ponovnu infuziju ćelija imunog sistema (na primer limfocita koji infiltriraju tumor (TILs), kao što su CD4<+>i/ili CD8<+>T ćelije (na primer T ćelije proširene sa antigenima koji su tumorski specifični i/ili genetskim poboljšanjima), B ćelije koje eksprimiraju antitelo ili druge ćelije koje proizvode antitelo /predstavljajuće ćelije, dendritske ćelije (npr, rekombinantne dendritske ćelije koje eksprimiraju anti-citokin, dendritske ćelije kultivisane sa agensom koji ekspandira DC poput GM-CSF i/ili Flt3-L, i/ili dendritske ćelije napunjene sa tumorski povezanim antigenom), anti-tumorske NK ćelije, takozvane hibridne ćelije ili njihove kombinacije. Ćelijski lizati mogu takođe biti korisni u takvim postupcima i kompozicijama. Celularne "vakcine" u kliničkim ispitivanjima koje mogu biti korisne u takvim aspektima uključuju Canvaxin™, APC-8015 (Dendreon), HSPPC-96 (Antigenics), i Melacine<®>ćelijske lizate. Antigeni rasuti iz ćelija kancera, i njihove smeše (videti na primer Bystryn et al., Clinical Cancer Research Vol. 7, 1882-1887, jul 2001), opciono pomešan sa adjuvansima poput stipse, mogu takođe biti komponente u takvim postupcima i kombinacijama kompozicija.
[0705]U jednoj realizaciji, jedan CD38BP iz predmetnog pronalaska može biti isporučen pacijentu u kombinaciji sa primenom jednog internog metoda vakcinacijc. Interna vakcinacija sc odnosi na indukovanu smrt tumora ili kancer ćelije, kao što je ćelijska smrt tumorskih ćelija koja je indukovana lekom ili indukovana radijacijom, kod pacijenta, koja obično dovodi do izazivanja imunog odgovora usmerenog ka (i) tumorskim ćelijama kao celini ili (ii) delovima tumorskih ćelija uključujući (a) sekretovane proteine, glikoproteine i druge proizvode, (b) membranski-povezane proteine ili glikoproteine ili druge komponente povezane sa ili umetnuti u membranama, i/ili (c) intracelularne proteine ili druge intracelularne komponente. Indukovani imuni odgovor izazvan nekom internom vakcinacijom može biti humoralni (tj antitelo-komplement-posredovan) ili ćelijski posredovan (npr razvoj i/ili povećanje endogenih citotoksičnih T limfocita koji prepoznaju interno ubijene ćelije tumora ili njihove delove). Pored radioterapije, neograničavajući primeri lekova i agenasa koji se mogu koristiti za indukciju smrti navedenih ćelija tumora i internu vakcinaciju su konvencionalni hemoterapeutski agensi, inhibitori ćelijskog ciklusa, lekovi protiv angiogeneze, monoklonska antitela, agensi za indukciju apoptoze i inhibitori signalne transdukcije.
[0706]Primeri drugih agenasa protiv kancera, koji mogu biti relevantni kao terapeutski agensi za upotrebu u kombinaciji sa CD38BP-ima iz predmetnog pronalaska za lečenje poremećaja kao što je gore opisano su agensi za indukciju diferencijacije, retinoinska kiselina i analozi retinoinske kiseline (kao što su svi trans oblici retinoinske kiseline, 13-cis retinoinska kiselina i slični agensi), analozi vitamina D (kao seokalcitol i slični agensi), inhibitori ErbB3, ErbB4, IGF-IR, insulinskog receptora, PDGFRa, PDGFRbeta, Flk2, Flt4, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, TRKA, TRKC, c-met, Ron, Sea, Tie, Tie2, Eph, Ret, Ros, A1K, LTK, PTK7 i slični agensi.
[0707]Primeri drugih agenasa protiv kancera, koji mogu biti relevantni kao terapeutski agensi za upotrebu u kombinaciji sa CD38BP-ima iz predmetnog pronalaska za lečenje poremećaja kao što je gore opisano su katepsin B, modulatori katepsin D dehidrogenazne aktivnosti, glutation-S-transferaze (kao što su glutacilcisteinske sintetaze i laktatne dehidrogenaze) i slični agensi.
[0708]Primeri drugih agenasa protiv kancera, koji mogu biti relevantni kao terapeutski agensi za upotrebu u kombinaciji sa CD38BP-ima iz sadašnjeg pronalaska za lečenje poremećaja kao što je gore opisano su estramustin i epirubicin.
[0709]Primeri drugih agenasa protiv kancera, koji mogu biti relevantni kao terapeutski agensi za upotrebu u kombinaciji sa CD38BP-ima iz sadašnjeg pronalaska za lečenje poremećaja kao što je gore opisano su jedan inhibitor HSP90 poput 17-alil amino geld-anamicina, antitela usmerena protiv nekog tumorskog antigena kao što su PSA, CA125, KSA, itd, integrina kao integrin [31, inhibitori VCAM i slični agensi.
[0710]Primeri drugih agenasa protiv kancera, koji mogu biti relevantni kao terapeutski agensi za upotrebu u kombinaciji sa CD38BP-ima iz sadašnjeg pronalaska za lečenje poremećaja kao što je gore opisano su inhibitori kalcineurina (kao što su valspodar, PSC 833 i drugi MDR-1 ili p-glikoproteinski inhibitori), TOR-inhibitori (kao što su sirolimus, everolimus i rapamciin) i inhibitori mehanizma " udomljavanja limfocita" (kao što je FTY720) i agensi sa efektima na ćelijsku signalizaciju kao što su inhibitori adhezije molekula (npr anti-LFA, itd).
[0711]U jednoj realizaciji, antitela iz predmetnog pronalaska obezbeđuju jedan postupak za lečenje poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimiraju CD38 u subjektu, pri čemu taj postupak obuhvata primenu neke terapeutski efikasne količine jednog CD38BP-og antitela iz predmetnog pronalaska i radioterapiju na subjektu kome je to potrebno.
[0712]U jednoj realizaciji, antitela iz predmetnog pronalaska obezbeđuju jedan postupak za lečenje multiplog mijeloma, pri čemu taj postupak sadrži primenu neke terapeutski efikasne količine jednog CD38BP antitela iz predmetnog pronalaska i radioterapiju na subjektu kome je to potrebno.
[0713]U jednoj realizaciji, antitela iz predmetnog pronalaska mogu biti korišćena za pripremu farmaceutske kompozicije koja će biti primenjena sa radioterapijom za lečenje multiplog mijeloma.
[0714]Radioterapija može sadržati radijaciju i udruženu primenu radiofarmaceutika koja je obezbeđena pacijentu. Izvor zračenja može biti ili eksterni ili interni na pacijentu koji se tretira (tretman zračenjem može, na primer, biti u obliku terapije eksternog snopa zračenja (EBRT), brahiterapije (BT) ili skeletne ciljane radioterapije). Radioaktivni elementi koji se mogu koristiti u praktikovanju takve metode obuhvataju, npr radijum, cezijum-137, iridijum-192, americijum-241, gold-198, kobalt-57, bakar-67, tehnecijum-99, jodid-123, jodid-131, i indijum-111.
[0715]U jednoj realizaciji, antitela iz predmetnog pronalaska obezbeđuju jedan postupak za lečenje nekog poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimiraju CD38 u subjektu, pri čemu taj postupak obuhvata primenu neke terapeutski efikasne količine nekog CD38BP antitela iz predmetnog pronalaska na subjektu kome je to potrebno kombinovanih sa autolognim perifernim matičnim ćelijama ili transplatacijom koštane srži.
[0716]U jednoj realizaciji, antitela iz predmetnog pronalaska obezbeđuju jedan postupak za lečenje multiplog mijeloma, pri čemu taj postupak sadrži primenu terapeutski efikasne količine nekog CD38BP antitela iz predmetnog pronalaska na subjektu kome je to potrebno kombinovanih sa autolognim perifernim matičnim ćelijama ili transplantacijom koštane srži.
[0717]U jednoj realizaciji, antitela iz predmetnog pronalaska mogu biti korišćena za pripremu jedne farmaceutske kompozicije koja će biti primenjena sa autolognim perifernim matičnim ćelijama ili transplantacijom koštane srži za lečenje multiplog mijeloma
[0718]U jednoj realizaciji, antitela iz predmetnog pronalaska obezbeđuju jedan postupak za lečenje nekog poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimiraju CD38 u subjektu, pri čemu taj postupak obuhvata primenu neke terapeutski efikasne količine nekog CD38BP antitela iz predmetnog pronalaska na subjektu kome je to potrebno u kombinaciji sa ortopedskim intervencijom.
[0719]U jednoj realizaciji, antitela iz predmetnog pronalaska mogu biti korišćena za pripremu jedne farmaceutske kompozicije koja će biti primenjena sa autolognim perifernim matičnim ćelijama ili transplantacijom koštane srži za lečenje multiplog mijeloma.
[0720]Ortopedske intervencije mogu da se koriste u lečenju poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimiraju CD38, kao što su multipli mijelom, da pomognu u kontroli bola ili zadrže funkciju ili mobilnost. Takve intervencije mogu da uključuju fizikalnu terapiju, splinting kostiju za prevenciju ili lečenje preloma, ili hirurške procedure (manje ili veće) za popravku preloma.
[0721]U jednoj realizaciji, jedan CD38BP predmetnog pronalaska sc može primeniti u vezi sa isporukom jednog ili više agenasa koji promovišu pristup CD38BP-a ili kombinovanog preparata do unutrašnjosti tumora. Takvi postupci mogu na primer biti izvedeni u saradnji sa isporukom relaksina, koji je u stanju da oslabi tumor (videti na primer US 6,719,977). U jednom izvođenju, jedan CD38BP predmetnog pronalaska može biti vezan za ćeliju penetrirajućeg peptida (CPP). Peptidi koji prodiruju u ćelije i srodni peptidi (kao što konstruisana antitela koja prodiru u ćeliju) su opisana u npr Zhao et al., J Immunol Methods. 254(1-2), 137-45 (2001), Hong et al., Cancer Res. 60(23), 6551-6 (2000). Lindgren et al, Biochem J 377 (Pt 1), 69-76 (2004), Buerger et al, J Cancer Res Clin Oncol. 129(12), 669-75
(2003), Pooga et al, FASEB J. 12 (1), 67-77 (1998) i Tseng et al., Mol Pharmacol. 62(4), 864-72
(2002).
[0722]U jednoj realizaciji, antitela iz predmetnog pronalaska obezbeđuju jedan postupak za lečenje nekog poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimiraju CD38 u subjektu, pri čemu taj postupak obuhvata primenu neke terapeutski efikasne količine nekog CD38BP antitela iz predmetnog pronalaska i najmanje jednog anti-inflamatornog agensa subjektu kome je to potrebno.
[0723] U jednoj realizaciji, antitela iz predmetnog pronalaska obezbeđuju jedan postupak za lečenje multiplog mijeloma, pri čemu taj postupak obuhvata primenu neke terapeutski efikasne količine nekog CD38BP antitela iz predmetnog pronalaska i najmanje jednog anti-inflamatornog agensa subjektu kome je to potrebno.
[0724]U jednoj realizaciji, antitela iz predmetnog pronalaska mogu biti korišćena za pripremu jedne farmaceutske kompozicije koja će biti primenjena sa sa najmanje jednim anti-inflamatornim agensom za lečenje multiplog mijeloma.
[0725]U jednoj realizaciji, takav jedan anti-inflamatorni agens može biti odabran od steroidnog leka i jednog NSAID (nesteroidnog anti-inflamatornog leka).
[0726]U jednoj realizaciji, takav jedan anti-inflamatorni agens može biti odabran od aspirina i drugih salicilata, Cox-2 inhibitora (kao što su rofekoksib i celekoksib), NSAIL-ova (kao što su ibuprofen, fenoprofen, naproksen, sulindak, diklofenak, piroksikam, ketoprofen, diflunisal, nabumeton, etodolak, oksaprozin i indometacin), anti-IL6R antitela, anti-IL8 antitela, anti-IL15 antitela, anti-IL15R antitela, anti-CD4 antitela, anti-CDlla antitela (npr efalizumab), anti-alfa-4/beta-l integrin (VLA4) antitela (npr natalizumab), CTLA4-Ig za lečenje inflamatornih bolesti, prednizolon, prednizon, antireumatski lekovi koji modifikuju bolest (DMARD-ovi) kao što su metotreksat, hidroksihlorokin, sulfasalazin, inhibitori sinteze pirimidina (kao što leflunomid), agensi koji blokiraju IL-1 receptor (kao što je anakinra), agensi koji blokiraju TNF-a (kao što su etanercept, infliksimab i adalimumab) i slični agensi.
[0727]U jednoj realizaciji, antitela iz predmetnog pronalaska obezbeđuju jedan postupak za lečenje nekog poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimiraju CD38 u nekom subjektu, pri čemu taj postupak obuhvata primenu jedne terapeutski efikasne količine jednog CD38BP antitela iz predmetnog pronalaska i najmanje jednog imunosupresivnog i/ili imunomodulatornog agensa subjektu kome je to potrebno.
[0728]U jednoj realizaciji, antitela iz predmetnog pronalaska obezbeđuju jedan postupak za lečenje multiplog mijeloma, pri čemu taj postupak obuhvata primenu jedne terapeutski efikasne količine jednog CD38BP antitela iz predmetnog pronalaska i najmanje jednog imunosupresivnog i/ili imunomodulatornog agensa subjektu kome je to potrebno.
[0729]U jednoj realizaciji, antitela iz predmetnog pronalaska mogu biti korišćena za pripremu jedne farmaceutske kompozicije koja će biti primenjena sa najmanje jednim imunosupresivnim i/ili imunomodulatornim agensom za lečenje multiplog mijeloma.
[0730] Ujednoj realizaciji, takav jedan imunosupresivni i/ili imunomodulatorni agens može biti odabran od ciklosporina, azatioprina, mikofenolne kiseline, mukofenolat mofetila, kortikosteroida kao što su prednizon, metotreksat, soli zlata, sulfasalazin, antimalarici, brehinar, leflunomid, mizoribin, 15-deokispergualin, 6-merkaptopurin, ciklofosfamid, rapamicin, takrolimus (FK-506), OKT3, anti-timocitni globulin, timopentin, timozin-a i si agensi.
[0731]Ujednoj realizaciji, takav jedan imunosupresivni i/ili imunomodulatorni agens može biti odabran od imunosupresivnih antitela, kao što su antitela koja se vezuju za p75 IL-2 receptora, ili antitela koja se vezuju za npr MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD28, B7, CD40, CD45, IFNy, TNF-a, IL-4, IL-5, IL-6R, IL-6; IGF, IGFR1, IL-7, IL-8, IL-10, CD1 la ili CD58, ili antitela koja se vezuju za njihove ligande.
[0732] Ujednoj realizaciji, takav jedan imunosupresivni i/ili imunomodulatorni agens može biti odabran od rastvorljivog IL-15R, IL-10, B7 molekula (B7-1, B7-2, njegovih varijanti i fragmenata), ICOS i OX40, jednog inhibitora jednog negativnog regulatora T ćelija (kao što je jedno antitelo protiv CTLA4) i slični agensi.
[0733]Ujednoj realizaciji, CD38BP-i predmetnog pronalaska se mogu primenjivati u kombinaciji sa dva ili više imunosupresivnih i/ili imunomodulatornih agenasa, kao što su u kombinaciji sa prednizonom i ciklosporinom; prednizonom, ciklosporinom i azatioprinom; ili prednizonom, ciklosporinom i mikofenolat mofetilom.
[0734]U jednoj realizaciji, antitela iz predmetnog pronalaska obezbeđuju jedan postupak za lečenje nekog poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimiraju CD38 u subjektu, pri čemu taj postupak obuhvata primenu jedne terapeutski efikasne količine jednog CD38BP antitela iz predmetnog pronalaska i izvesnih anti-C3b (i) antitela subjektu je to potrebno.
[0735]U jednoj realizaciji, antitela iz predmetnog pronalaska obezbeđuju jedan postupak za lečenje multiplog mijeloma, pri čemu taj postupak obuhvata primenu jedne terapeutski efikasne količine jednog CD38BP antitela iz predmetnog pronalaska i izvesnih anti-C3b (i) antitela subjektu kome je to potrebno.
[0736]U jednoj realizaciji, antitela iz predmetnog pronalaska mogu biti korišćena za pripremu jedne farmaceutske kompozicije koja će biti primenjena sa izvesnim anti-C3b (i) antitelima za lečenje multiplog mijeloma.
[0737]U jednoj realizaciji, jedan terapeutski agens za upotrebu u kombinaciji sa CD38BP antitelima iz predmetnog pronalaska za lečenje poremećaja kao što je gore opisano može biti odabran od inhibitora histonske deacetilaze (na primer fenilbutirat) i/ili agenasa za popravku DNK (na primer enzimi koji popravljaju DNK i srodne kompozicije poput dimericina).
[0738] Postupci koji uključuju antitela iz predmetnog pronalaska za lečenje poremećaja kao što je gore opisano obuhvataju primenu jedne terapeutski efikasne količine jednog CD38BP antitela iz predmetnog pronalaska, a koji mogu takođe da sadrže anti-kancer usmerenu fotodinamičku terapiju (na primer lasersku terapiju protiv kancera - koja opciono može biti praktikovana sa upotrebom fotosenzitivnog agensa, videti, na primer Zhang et al., J. Control Release. 93 (2), 141-50 (2003)), anti-kancer zvučnih talasa i šok-talasne terapije (videti na primer Kambe et al., Hum Cell. 10 (1), 87-94 (1997)), i / ili anti-kancer nutraceutikalna terapija (videti na primer Roudebush et al., Vet Clin North Am Small Anim Pract. 34(1) 249-69, viii (2004) i Rafi, Nutrition. 20(1), 78-82 (2004). Isto tako, jedan CD38BP predmetnog pronalaska može biti korišćen za pripremu jedne farmaceutske kompozicije za lečenje jednog poremećaja kao što je gore opisano koja će biti primenjivana sa usmerenom fotodinamičkom terapijom protiv kancera (na primer laserskom terapijom protiv kancera - koja opciono može biti praktikovana sa upotrebom fotosenzitivnog agensa, zvučnih talasa protiv kancera i šok-talasnom terapijom, i /ili nutraccutikalnom terapijom protiv kancera.
[0739]Kao što je gore opisano, jedna farmaceutska kompozicija iz predmetnog pronalaska se može primeniti u kombinovanoj terapiji, tj kombinaciji sa jednim ili više agenasa koji su relevantni za bolesti ili stanja koja se leče ili kao odvojene farmaceutske kompozicije ili sa jedinjenjem iz sadašnjeg pronalaska koformulisanog sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa kao što je gore opisano. Takve kombinovane terapije mogu zahtevati niže doze jedinjenja sadašnjeg pronalaska i/ili ko-primenjenih agenasa, čime se izbegavaju moguće toksičnosti ili komplikacije povezane sa raznim monoterapij ama.
[0740]U jednoj realizaciji, predmetni pronalazak obezbeđuje jedan CD38BP koji je konjugovan sa jednim imunomodulatorom, kao što je jedan imunomodulator citokina, faktor rasta matičnih ćelija, limfotoksin (kao što je jedan TNF poput TNFa), ili jednim faktorom hematopoeze. Primeri takvih molekula koji mogu biti korisni kao konjugati obuhvataju IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18 i IL-21, faktore stimulacije kolonije (kao što su faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF) i faktor stimulacije kolonija granulocita makrofaga (GM-CSF)), interferone (kao što su IFNa, IFN0, i IFNy), faktore rasta matičnih ćelija određen "SI faktor," eritropoetin i trombopoetin, njihove aktivne fragmente, njihove derivate, njihove varijante, ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0741]Ujednoj realizaciji, CD38BP-i predmetnog pronalaska mogu biti korišćeniin vivoiliin vitroza dijagnostiku oboljenja u kojima aktivirane ćelije koje eksprimiraju CD38 igraju aktivnu ulogu u patogenezama detektovanjem nivoa CD38, ili nivoa ćelija koje sadrže CD38 na njihovoj površini membrane. Ovo se može postići, na primer, dovođenjem u kontakt nekog uzorka koji se testira, opciono zajedno sa kontrolnim uzorkom, sa CD38BP pod uslovima koji dozvoljavaju formiranje jednog kompleksa između antitela i CD38. Formacija kompleksa se zatim detektuje (npr korišćenjem ELISA). Kada se koristi neki kontrolni uzorak zajedno sa test uzorkom, kompleks se detektuje u oba uzorka i svaka statistički značajna razlika u formiranju kompleksa između uzoraka ukazuje na prisustvo CD38 u testiranom uzorku.
[0742]Preciznije, antitela iz predmetnog pronalaska obezbeđuju postupke za identifikaciju i dijagnozu invazivnih ćelija i tkiva i druge ćelije ciljane od strane CD38BP antitela iz predmetnog pronalaska, kao i za praćenje napretka terapeutskih tretmana, statusa nakon tretmana, rizika od razvoja kancera, progresiju kancera, i slično.
[0743]U jednom primeru takvog jednog dijagnostičkog testa, antitela iz predmetnog pronalaska obezbeđuju jedan postupak za dijagnostikovanje nivoa invazivnih ćelija u tkivu koji sadrži formirajući imunokompleks između jednog CD38BP antitela i potencijalnih tkiva koje sadrže CD38, i detektovanje formiranja imunokompleksa, pri čemu je formiranje imunokompleksa u korelaciji sa prisustvom invazivnih ćelija u tkivu. Kontaktiranje može biti izvedenoin vivo,korišćenjem označenih izolovanih antitela i standardnih tehnika snimanja, ili može biti izvedenain vitrona uzorcima tkiva.
[0744]CD38BP-i mogu biti korišćeni za detekciju peptida koji sadrže CD38 i peptidnih fragmenata u bilo kom pogodnom biološkom uzorku bilo kojom pogodnim tehnikom. Primeri konvencionalnih imunoloških testiranja obezbeđeni antitelima iz sadašnjeg pronalaska uključuju, bez ograničenja, ELISA, RIA, FACS testove, test plazmonske rezonance, hromatografske analize, imunohistohemiju tkiva, Western blot, i/ili imunoprecipitaciju korišćenjem jednog CD38BP. Anti-CD38 antitela iz ovog pronalaska mogu se koristiti za detekciju humanih CD38 i CD38 fragmenata. Pogodni obeleživači za CD38BP i/ili sekundarna antitela koja se koriste u takvim tehnikama uključuju, bez ograničenja, različite enzime, prostetičke grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale i radioaktivne materijale. Primeri pogodnih enzima uključuju peroksidazu rena, alkalne fosfataze, p-galaktozidazu, ili acetilholinesterazu; primeri pogodnih kompleksa prostetičkih grupa uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri pogodnih fluorescentnih materijala uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, dansil hlorid ili fikoeritrin; primeri luminescentnog materijala uključuju luminol; i primeri pogodnih radioaktivnih materijala uključuju<125>I, mI, 35S i 3H.
[0745]CD38BP-i se mogu takođe testirati u biološkom uzorku kompeticionim imunotestom koristeći CD38 peptidne standarde označene detektibilnom supstancom i neki neobeleženi CD38BP, kao što je neko neobeleženo anti-CD38 antitelo, na primer. U takvom jednom testu, biološki uzorak, obeleženi CD38 peptidni standard (i) i CD38BP se kombinuju i određuje se količina obeleženog CD38 standarda vezanog za neobeleženi CD38BP. Količina CD38 peptida u biološkom uzorku je obrnuto proporcionalna količini obeleženog CD38 standarda vezanog za CD38BP.
[0746]CD38BP-i su posebno korisni uin vivosnimanju tumora.In vivosnimanje tumora povezanih sa CD38 može biti izvedeno bilo kojom pogodnim tehnikom. Na primer,<99>Tc-obeležavanje i obeležavanje sa drugim izotopom koji emituje gama zrake može biti korišćeno za obeležavanje anti-CD38 antitela u tumorima ili sekundarno obeleženih (npr obeleženog FITC) CD38BP: CD38 kompleksi tumora i snimljeni sa gama scintilacionom kamerom (npr, jedan Elscint Apekx 409ECT uređaj), obično korišćenjem niske energije, visoke rezolucije kolimatora ili nisko-energetska kolimatore za sve namene. Obojena tkiva se zatim mogu proceniti za radioaktivno brojanje kao indikator količine peptida koji su povezani sa CD38 u tumoru. Slike dobijene korišćenjem takvih tehnika mogu se koristiti za procenu biodistribucije CD38 u jednom pacijentu, sisani ili tkivu, na primer, u kontekstu korišćenja CD38 ili CD38 fragmenata kao jednog biomarkera za prisustvo invazivnih ćelija karcinoma. Varijacije na ovu tehniku mogu uključivati upotrebu magnetne rezonance (MRI) da bi se poboljšalo snimanje preko tehnika gama kamere. Slične metode i principi imunoscintigrafije su opisani u, na primer, Srivastava, (ed.), Radioaktivno obeležena monoklonska antitela za snimanje i terapiju (Plenum Press 1988), Chase, "Medicinska primena radioizotopa," u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Gennaro et al., (eds.), pp. 624-652 (Mack Publishing Co., 1990), i Brown, "Klinička upotreba monoklonskih antitela," u Biotehnologiji i Farmaciji 227-49, Pezzuto et al., (eds.) (Chapman and Hali 1993). Takve slike se takođe mogu koristiti za ciljanu isporuku drugih agenasa protiv kancera, čiji primeri su ovde opisani (npr apoptotički agensi, toksini ili CHOP hemoterapijske kompozicije). Osim toga, takvi snimci mogu takođe, ili alternativno da služe kao osnova za hirurške tehnike za uklanjanje tumora. Osim toga, takvein vivotehnike snimanja mogu omogućiti identifikaciju i lokalizaciju tumora u situaciji gde je utvrđeno da pacijent ima tumor (zbog prisustva drugih biomarkera, metastaza, itd), ali sc tumor nc može identifikovati tradicionalnim analitičkim tehnikama. Sve ove metode su karakteristike u skladu sa predmetnim pronalaskom.
[0747]In vivosnimanje i druge dijagnostičke metode koje su obezbeđene predmetnim pronalaskom su posebno korisne u otkrivanju mikrometastaza kod humanog pacijenta (na primer, nekog pacijenta kome nije prethodno dijagnostikovan kancer ili nekog pacijenta u periodu oporavka/remisije od kancera). Ćelije karcinoma kancera, koji može dati do 90% svih ćelija kancera, na primer, su pokazale vrlo dobru obojenost sa kompozicijama koje imaju konjugovano anti-CD38 antitelo. Detekcija sa monoklonskim anti-CD38 antitelima i drugim CD38BP-ima ovde opisanim može da ukazuje na prisustvo karcinoma koji su agresivni/ invazivni i takođe, ili alternativno ukazuje na mogućnosti korišćenja srodnih monoklonskih anti-CD38 antitela, CD38BP, ili srodnih kompozicijskih tretmana protiv takvih mikrometastaza. Staviše, monoklonska anti-CD38 antitela koja su povezana sa ćelijama kancera su prednosno u stanju da razlikuju takva tkiva i ćelije koje su povezana sa kancerom od normalnih ćelija sa kojima drugi oblici CD38 mogu biti povezani.
[0748]U jednoj realizaciji, ovde je obezbeđen jedanin vivopostupak snimanja u kome je jedan CD38BP, kao što je neko anti-CD38 antitelo iz predmetnog pronalaska konjugovano sa radio-neprozirnim agensom koji promoviše detekciju, konjugovano antitelo se primenjuje u domaćinu, kao što je injekcijom u krvotok i prisustvo i lokacija obeleženog antitela u domaćinu se analizira. Kroz ovu tehniku i bilo koje druge dijagnostičke metode koje su ovde opisane, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak skrininga na prisustvo ćelija povezanih sa bolešću kod humanog pacijenta ili nekog biološkog uzorka uzetog od humanog pacijenta.[0749]Za dijagnostičko snimanje, radioizotopi mogu da budu vezani za CD38BP bilo direktno ili indirektno upotrebom intermedijerne funkcionalne grupe. Korisne posredničke funkcionalne grupe uključuju helatore, kao što je etilendiamintetrasirćetna kiselina i dietilentriaminpentasirćetna kiselina (videti na primer US 5,057,313). U takvim dijagnostičkim testovima koji uključuju CD38BP-e konjugovane sa radioizotopima, doza konjugovanog peptida koja se isporučuje pacijentu se obično održava na tako niskom nivou kao mogućem putem izbora izotopa za najbolju kombinaciju minimalnog poluraspada, minimalnog zadržavanja u organizmu, kao i minimalne količine izotopa, koja će omogućiti otkrivanje i precizno mercnjc.
[0750]Pored radioizotopa i radio-neprozirnih agenasa, dijagnostičke metode se mogu izvršiti upotrebom CD38BP-a koji su konjugovani sa bojama (kao što je sa biotin-streptavidin kompleksom), kontrastnim sredstvima, fluorescentnim jedinjenjima ili molekulima i inhenser agensima (npr paramagnetski joni) za snimanje magnetnom rezonancom (MRI) (videti, npr, US patent br. 6,331,175, koji opisuje MRI tehnike i pripremu antitela konjugovanih sa agensom za pojačavanje MRI). Takva dijagnostička/detekciona sredstva mogu biti odabrana od sredstava koje se koriste u snimanju magnetnom rezonancom, i fluorescentnih jedinjenja. U cilju punjenja jednog CD38BP, kao što je antitelo, komponente sa radioaktivnim metalima ili paramagnetnim jonima, kada može biti neophodno da ono reaguje sa reagensom koji ima dugačak rep za koji su spojene mnogostruke helatne grupe za vezivanje jona. Takav jedan rep može biti polimer poput jednog polilizina, polisaharida, ili drugih izvedenih ili derivatizovanih lanaca sa visećim grupama za koji sc mogu vezati helatne grupe kao što su, npr porfirini, poliamini, korona etri, bistiosemikarbazoni, polioksimi i slične grupe koje su poznate kao korisne za ovu svrhu. Helati mogu biti kuplovani sa CD38BP-ima korišćenjem standardnih hemijskih tehnika. Jedan helat je tipično vezan sa CD38BP-om, kao što je izvesno anti-CD38 mAt, pomoću jedne grupe, koja omogućava formiranje veze sa molekulom sa minimalnim gubitkom imunoreaktivnosti i minimalnom agregacijom i/ili unutrašnjim umrežavanjem. Druge, neobičniji, postupci i reagensi za konjugaciju helata sa antitelom su opisani u na primer US 4,824,659. Primeri potencijalno korisnih metala-helatnih kombinacija uključuju 2-benzil-DTPA i njene monometil i cikloheksil analoge, korišćene sa dijagnostičkim izotopima u generalnom opsegu energije od 60 do 4,000 keV, poput<12>5I,123I,12<4>1,<62>Cu,<64>Cu,<18>F,<in>In,<67>Ga,<67>Ga,<99>Tc,<94>Tc,<n>C,<13>N, 150 i 76Br, za radio-snimanje. Ovi i slični helati kada su kompleksirani sa neradioaktivnim metalima, poput mangana, gvožđa, i gadolinijumi mogu biti korisni za MRI dijagnostičke metode u vezi sa CD38BP-ima. Makrociklični helati kao što su NOTA, DOTA, i TETA su od koristi sa različitim metalima i radiometalima, većina je naročito sa radionuklidima galijuma, itrijuma i bakra, respektivno. Takvi metalno helatni kompleksi mogu biti veoma stabilni za prilagođavanje veličine prstena za metal od interesa. Ostali helati tipa prstenova poput makrocikličkih polietara, koji su od interesa za stabilno vezivanje nuklida, poput<223>Ra za RAIT takođe mogu biti pogodni u dijagnostičkim postupcima.
[0751]Stoga, ovde su obezbeđeni dijagnostički CD38BP-ni konjugati, gde je CD38BP konjugovan sa jednim kontrastnim sredstvom (kao što je za snimanje magnetnom rezonancom, kompjuterizovanom tomografijom ili ultrazvučnim kontrast-poboljšavajućim sredstvom) ili nekim radionuklidom koji može biti, na primer, jedan gama, beta-, alpfa-, Auger elektron-, ili pozitron-emitujući izotop. Dodatno korisni konjugovani CD38BP-i su opisani na drugom mestu ovde, koji takođe mogu biti korisni u dijagnostičkim postupcima i kompozicijama (npr dijagnostički setovi) predviđeni ovim pronalaskom.
[0752]U jednoj realizaciji, ovde je obezbeđen komplet za dijagnozu karcinoma koji sadrži jedan kontejner koji sadrži jedan CD38BP, kao što je anti-CD38 antitelo, ijedan ili više reagenasa za detekciju vezivanja CD38BP za jedan CD38 peptida. Reagensi mogu uključiti, na primer, fluorescentne oznake, enzimske oznake ili druge detektovane oznake. Reagensi mogu takođe da uključuju sekundarna ili tercijarna antitela ili reagense za enzimske reakcije, pri čemu enzimske reakcije daju proizvod koji može biti vizualizovan. Ujednoj realizaciji, ovde je obezbeđen dijagnostički komplet koji sadrži jedan ili više CD38BP-a, kao što su anti-CD38 antitela iz predmetnog pronalaska, u obeleženom ili neobeleženom obliku u odgovarajućoj ambalaži (-ama), inkubacione reagense za posredni test, i podloge ili derivatizacione agense za detekciju u takvom jednom testu, u zavisnosti od prirode oznake. Kontrolni reagens(i) i uputstva za upotrebu takođe mogu biti uključena.
[0753]Dijagnostički kompleti mogu se isporučivati za korišćenje sa jednim CD38BP-om, kao što je jedno konjugovano/obeleženo anti-CD38 antitelo, za detekciju ćelijske aktivnosti ili detekciju prisustva CD38 peptida u uzorku tkiva ili domaćina. U takvim dijagnostičkim kompletima, kao i u kompletima za terapeutsku upotrebu opisanim na drugom mestu ovde, jedan CD38BP tipično može biti obezbeđen u nekom liofilizovanom obliku u kontejneru, ili sam ili u kombinaciji sa dodatnim antitelima specifičnim za neke ciljne ćelije ili peptid. Tipično, jedan farmaceutski prihvatljiv nosač (npr jedan inertni razblaživač) i/ili njihove komponente, kao što su jedan Tris, fosfatni, ili karbonatni pufer, stabilizatori, konzervansi, biocidi, inertni proteini, npr, serumski albumin, ili slično, su takođe uključeni (obično u jednom posebnom kontejneru za mešanje) i dodatni reagensi (takođe tipično u odvojenom kontejneru(ima)). U nekim kompletima, jedno sekundarno antitelo sposobno za vezivanje za anti-CD38 antitelo ili drugi CD38BP, koje je obično prisutno u nekom odvojenom kontejneru, je takođe uključeno. Drugo antitelo je tipično konjugovano sa oznakom i formulisano na način sličan prema anti-CD38 antitelu iz predmetnog pronalaska.
[0754]Koristeći metode gore opisane i na drugom mestu ovde CD38BP-i se mogu koristiti za definisanje podskupova kancerskih/tumorskih ćelija i karakterišu takve ćelije i tkiva/izrasline vezane za njih.
[0755]U jednom primeru, jedan CD38BP ili anti-CD38 antitelo, mogu biti dodati na nitrocelulozu, ili drugu čvrstu podlogu koja je sposobna za imobilizaciju ćelija, čestica ćelija ili rastvorljivih proteina. Podloga može biti isprana sa pogodnim puferima što je praćeno tretmanom sa detektibilno obeleženim CD38 peptidom ili antitelom. Podloga čvrste faze se zatim može isprati sa puferom drugi put da se odstrani nevezani peptid ili antitelo. Količina vezanog markera na čvrstoj podlozi može zatim biti detektovana pomoću poznatih koraka metode.
[0756]Povezani enzimi koji reaguju sa izloženim supstratom mogu biti korišćeni za generisanje neke hemijske grupe koja se može detektovati, na primer, spektrofotometrijski, fluorometrijskim ili vizuelnim sredstvima, u kontekstu jednog CD38BP-nog konjugata i/ili fuzionog proteina. Enzimi koji se mogu koristiti za detektabilno obeležavanje CD38BP-a i anti-CD38 antitela uključuju malat dehidrogenazu, stafilokoknu nukleazu, delta-5-steroid izomeraze, alkohola kvasca dehidrogenaze, alfa-glicerofosfat dehidrogenaze, triozafosfat izomeraze, peroksidaza rena, alkalnu fosfatazu, asparaginazu, glukozne oksidaze, beta-galaktozidazu, ribonukleazu, ureazu, katalazu, glukoza-6-fosfat dehidrogenazu, glukoamilazu i acetilholinesterazu. Takođe je moguće obeležavanje jednog CD38BP sa jednim fluorescentnim jedinjenjem. Kada se fluorescentno obeleženo antitelo izloži svetlu propisne talasne dužine, njegovo prisustvo može biti detektovano zahvaljujući fluorescenciji. Među najčešće korišćenim fluorescentnim jedinjenjima za obeležavanja su fluorescein izotiocijanat, rodamin, fikocritrin, fikocijanin, alofikocijanin, o-ftaldehid i fiuorescamin.
[0757]CD38BP-i, kao što su anti-CD38 antitela, mogu takođe biti detektabilno obeležena korišćenjem metala koji emituju fluorescenciju kao što su<l52>Eu, ili drugi iz serije lantanida. Ovi metali mogu biti vezani zajedno anti-CD38 antitelo, na primer, korišćenjem takvih helirajućih grupa za metale kao što su dietilentriaminpentasirćetna kiselina (DTPA) ili ethilenediaminetetrasirćetna kiselina (EDTA).
[0758]CD38BP-i i anti-CD38 antitela mogu takođe biti detektabilno markirana kupiovanj em sa hemiluminiscentnim jedinjenjem. Prisustvo hemiluminescentno obeleženog CD38-BP se zatim određuje detekcijom prisustva svetlosti nastale tokom hemijske reakcije. Primeri naročito korisnih hermlurniniscentnih marker jedinjenja su luminol, izoluminol, teromatik akridinijum estar, imidazol, akridinijum soli i oksalatni estar.
[0759] Slično, jedno biolumincsccntno jedinjenje može da sc koristi za obeležavanje jednog CD38BP. Bioluminescencija je vrsta liemiluminescencije nađene u biološkim sistemima u kojima jedan katalitički protein povećava efikasnost hemiluminiscentne reakcije. Prisustvo jednog bioluminescentnog proteina se određuje detekcijom prisustva svetlosti. Važna bioluminescentna jedinjenja za potrebe obeležavanja su luciferin, luciferaza i ekvorin.
[0760] Detekcija jednog obeleženog peptida ili antitela, fragmenta antitela ili derivata može biti postignuta scintilacionim brojačem, na primer, ako je detektovani marker radioaktivni gama emiter, ili pomoću fiuorometra, na primer, ako je marker neki fluorescentni materijal. U slučaju jednog enzimskog markera, detekcija može biti postignuta kolorimetrijskim metodama koje angažuju jedan supstrat za enzim. Detekcija može takođe biti postignuta vizuelnim poređenjem stepena enzimske reakcije supstrata u poređenju sa slično pripremljenim standardima.
[0761] Ove i druge dijagnostičke tehnike se mogu koristiti za skrining bilo kog pogodnog materijala za peptide CD38 ili CD38-fragmenata. Primeri materijala koji se mogu koristiti za skrining uključuju, na primer, krv, serum, limfu, urin, inflamatorni eksudat, cerebrospinalnu tečnost, amnionsku tečnost, jedan ekstrakt tkiva ili homogenat, i slično. Međutim, predmetni opis nije ograničen testovima koji koriste samo ove uzorke, moguće je da neki stručnjak sa uobičajenim iskustvom u tehnici odredi pogodne uslove koji omogućavaju korišćenje drugih uzoraka.
[0762]In situdetekcija se može postići uklanjanjem jednog histološkog uzorka uzetog od jednog pacijenta, i obezbeđujući kombinaciju obeleženih CD38BP-a, kao što su anti-CD38 antitela, prema predmetnom pronalasku u takvom jednom uzorku. CD38BP, anti-CD38- antitelo (ili fragment) iz sadašnjeg pronalaska može se obezbediti primenom ili postavljanjem obeleženog CD38BP, kao što je jedno obeleženo anti-CD38 antitelo (ili fragment), iz predmetnog pronalaska u biološkom uzorku. Kroz upotrebu takve procedure, moguće je utvrditi ne samo prisustvo CD38 ili CD38-fragmenta nego i distribuciju takvih peptida u ispitivanom tkivu (npr, u kontekstu procene širenja ćelija kancera). Koristeći sadašnji pronalazak, oni koji su prosečni stručnjaci će lako uočiti da li bilo koja od širokog spektra histoloških metoda (kao što su procedure za bojenje) može biti modifikovana da bi se postigla takva detekcijain situ.
[0763] Sadašnji pronalazak dalje obezbeđuje postupak unapređenja prodaje i/ili korišćenje jednog CD38BP kao što je ovde opisano, koji obuhvata distribuciju informacija (kao što je putem štampanog materijala koji se deli, šalje, itd reklamne signalizacije, televizijskih programa i reklama, radio-programa i reklama, internet sajt postova, putem e-mejla, telemarketinga, od vrata do vrata ili licem-u-lice marketinga, finansiranjem i/ili hosting konferencija, panela, foruma, itd, zapošljavanjem i/ili ugovaranjem za usluge prodavača i/ili medicinskih/naučnih veza, finansiranjem i/ili hosting naučnih istraživanja i publikacija vezanih za ove svrhe, itd) koje se odnose na upotrebu jedinjenja u prevenciji ili lečenju bilo kakvog stanja ili kombinacije uslova kao što je opisano na drugom mestu ovde na bilo kojim osobama ili entitetima od potencijalnog interesa (kao što su farmaceutske lanci, formularni menadžeri, osiguravajuća društva, HMO-e, bolnice i bolnički lanci, druge kompanije zdravstvene zaštite, menadžeri farmaceutskog benefita, potencijalni pacijenti, oboleli od kancera, bivši bolesnici od kancera, pacijenti u remisiji, lekari u primarnoj zdravstvenoj zaštiti, medicinske sestre, doktori farmacije, i/ili ključni lideri u mišljenju).
[0764] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje komplete koji sadrže jednu farmaceutsku kompoziciju jednog jedinjenja iz predmetnog pronalaska i uputstva za upotrebu. Komplet dalje može da sadrži jedan ili više dodatnih agenasa, kao što su jedan imunosupresivni reagens, jedan hemoterapeutski reagens, jedan anti-inflamatorni agens ili jedan radiotoksični agens kao što je gore opisano, ili jedan ili više dodatnih CD38BP-a kao što je ovde opisano (kao što je jedan CD38BP koji ima komplementarnu aktivnost). Komplet kao što je ovde opisano može takođe da uključi dijagnostičke agense i/ili druge terapeutske agense. Ujednoj varijanti, jedan komplet uključuje jedan CD38BP kako je ovde opisano i jedan dijagnostički agens koji se može koristiti u dijagnostičkom postupku za dijagnostiku stanja ili postojanja poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimiraju CD38 u subjektu. U jednoj realizaciji, komplet uključuje jedan CD38BP kao što je ovde opisano u veoma stabilnom obliku (kao što je u jednom liofilizovanom obliku) u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem(ima) koji se mogu mešati sa visoko stabilnom kompozicijom da formiraju jednu injekcionu kompoziciju.
[0765] Svi naslovi i podnaslovi su ovde korišćeni samo radi pogodnosti i ne treba ih tumačiti kao ograničavajuće za predmetni pronalazak na bilo koji način.
[0766] Upotrebu izraza "jedan, neki" i "izvesni" i "taj" i sličnih referenata u kontekstu opisivanja predmetnog pronalaska treba tumačiti da pokrivaju i jedninu i množinu, osim ako nije drugačije naznačeno ovde ili jasno kontradiktorno kontekstu.
[0767] Navođenje vrednosti opsega su ovde samo namenjene da služe kao skraćeni metod pozivanja pojedinačno svake posebne vrednosti koja spada unutar opsega, osim ako nije drugačije naznačeno ovde, kao i svaka odvojena vrednost inkorporirana u specifikaciji kao daje individualno ovde navedena. Ukoliko nije drugačije navedeno, sve tačne vrednosti koje su ovde obezbeđene predstavljaju odgovarajuće približne vrednosti (npr sve tačne vrednosti primera su obezbeđene u odnosu na neki određeni faktor ili merenje mogu se smatrati da takođe obezbeđuju odgovarajuće približno merenje, modifikovano sa "oko" gde je prikladno).
[0768] Svi postupci ovde opisani mogu se izvesti u bilo kom pogodnom redu ukoliko nije ovde drugačije naznačeno ili na drugi način jasno kontradiktorno kontekstu.
[0769] Upotreba bilo kog i svih primera, ili jezika iz primera (npr "kao") obezbeđenih ovde, je u nameri samo da bolje osvetli sadašnji pronalazak i ne predstavlja ograničenje obima pronalaska ukoliko nije drugačije naznačeno. Navođenje koje nije jezično u specifikaciji treba tumačiti kao pokazatelj bilo kog elementa od suštinskog značaja za praksu iz predmetnog pronalaska osim kao koliko je izričito navedeno.
[0770] Citiranje i inkorporiranje patentnih dokumenata ovde je urađeno samo radi pogodnosti i ona ne odražavaju bilo kakav pogled na validnost, patentibilnost, i/ili primenljivost takvih patentnih dokumenata.
[0771]Opis ovde bilo koje realizacije iz predmetnog pronalaska korišćenjem izraza kao što su "obuhvata", "ima", "uključuje," ili "sadrži" u odnosu na element ili elemente treba da obezbedi podršku za slično izvođenje iz predmetnog pronalaska, da "sastoji od" u suštini sastoji od, ili "suštinski obuhvata" taj određeni element ili elemente, ukoliko nije drugačije naznačeno ili jasno kontradiktorno kontekstu (na primer, ovde opisana kompozicija tako da obuhvata određeni element treba biti shvaćena takođe kao da opisuje preparat koji se sastoji od tog elementa, ukoliko nije drugačije naznačeno ili jasno kontradiktorno kontekstu).
[0772]Ovaj pronalazak je dalje ilustrovan sledećim primerima koje ne treba tumačiti kao dalje ograničavajuće.
PRIMERI
PRIMER 1
Primer 1 Proizvodnja luciferazom- transfektovanih ( Daudi- Luc) ćelija
[0773]Kultura Daudi ćelija (poreklom iz Burkitovog limfoma) je kultivisana u RPMI 1640 medijumu kulture sa dodatkom 10% FCS (Optimum C241, Wisent Inc., St. Bruno, QC, Kanada), 2 mM L-glutamina, 100 IJ/ml penicilina, 100 mg/ml streptomicina, 1 mM natrijum piruvata (svi izvedeni iz Gibco BRL, Life Technologies, Paislev, Scotland). Medijum je osvežen dvaput nedeljno. Pre transfekcije, ćelije su razdvojene i zasejane vani pri 1-1,5
x IO6 ćelija/ml kako bi se osigurala održivost i optimalan rast.
Luciferaza transfekcija
[0774]8,2 x 10<6>CD38<+>Daudi ćelija su preuzete u 350 ul RPMI (sa dodatkom 10% dFCS, Gibco BRL) i prebačene u elektorporacionu kivetu (Biorad, Hemel Hempstead, Herts, UK). Zatim su dodati, 40 ug gWIZ luciferaze iz GTS (Aldevron, Fargo, ND, USA) i 10 ug pPur vektora (BD Biosciences, Alphen a/d Rijn, Holandija), koji daje otpornost na puromicin. Nakon odmaranja ćelija na ledu tokom 10 minuta, ćelije su elektroporisane (250 V, 950 uF; Gene Pulscr II Biorad Laboratories GmbH, Minhcn, Nemačka). Ćelije su ponovo ostavljene na ledu i preuzete u 40 ml RPMI (sa dodatkom 10% FCS). Zatim su ćelije postavljene u 96-bazenčića ploča za kulturu tkiva (100 ul po bazenčiću). Nakon 48 sati, dodat je puromicin (završna koncentracija: 1 ug/ml; Sigma-Aldrich Chemie BV, Zwijndrecht, Holandija). Puromicin otporni klonovi su dalje uzgajani u 24-bazenčića ploče za kulturu tkiva.
Određivanje aktivnosti luciferaze
[0775]Luciferazna aktivnost ćelija se utvrđuje korišćenjem testa Luciferaze sistema (# E4030, Promega, Madison, WI, SAD). Ixl0<5>ćelija je centrifugirano (13,500 rpm, 1 min) u Eppendorf centrifugi, a pelet jc opran u 100 ul PBS. Nakon centrifugiranja (13,500 rpm, 1 min), pelet jc liziran sa 20 ul Reporter lizirajućim puferom (Promega), zamrznut i odmrznut. Nakon centrifugiranja (13,500 rpm, 1 min), 20 ul supernatanta je odbačeno i dodato je 100 ul luciferaze test reagensa (u specijalnim luminometarskim cevima, Promega). Luminescencija je merena (10 sec) u luminometru (LB9507, Berthold, Vilvoorde, Belgija).
PRIMER 2
Imunizacija miševa i stvaranje og hibridoma
Imunizacioni protokol za - 003
[0776]HCol2 miševi su bili imunizovani svake 2 nedelje sa 20 ug prečišćenog HA-CD38. Prva imunizacija je izvršena i.p. u prisustvu 100 ul PBS-a, koji je pomešan sa 100 ul kompletnog Freundovog adjuvansa (CFA). Nakon ove prve imunizacije, naknadna podsticanja (13x) sa prečišćenim HA-CD38 su izvedena u prisustvu 100 ul PBS-a, pomešanog sa 100 ul nekompletnog Freundovog adjuvansa (IFA) naizmenično s.c. i i.p. Nakon razvoja titra, miševi su podsticani sa 20 ug HA-CD38 u PBS-u, i.v.
Imunizacioni protokol za - 005 i - 024
[0777]HCol2 miševi su bili imunizovani svake dve nedelje sa 20 ug prečišćenog HA-CD38 naizmenično sa NIH-3T3-CD38 transfektovanim ćelijama. Prva imunizacija je obavljena sa 5 x IO<6>ćelija u 100 jal PBS-a, pomešanog sa 100 ul CFA, i.p., druga i sledeće vakcinacije sa HA-CD38 s.c, u prisustvu 100 ul PBS-a, pomešanog sa 100 ul IFA. Sledeće imunizacije sa transfektovanim ćelijama su izvedene u prisustvu 200 ul PBS-a. Nakon razvoja titra, miševi su podsticani sa 20 ug HA-CD38 u PBS-u, i.v.
Generisanje hibridoma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela za CD38
[0778]Splenociti miša su bili izolovani iz HCol2 miševa i fuzionisani sa PEG-om za ćelijsku liniju mišjeg mijeloma na osnovu standardnih protokola. Dobijeni hibridomi su zatim skenirani za proizvodnju humanih antitela pomoću ELISA i za CD38 specifičnost korišćenjem humanih CD38-transfektovanih NS/0 ćelija pomoću FACS analize i rekombinantnog HA-CD38 vezujućeg proteina pomoću tehnike ELISA. Tri ćelijske linije hibridoma su bile odabrane koje eksprimiraju humana monoklonska anti-CD38 antitela, -003, -005 i -024, respektivno.
PRIMER 3
Transfckcija NIH ćelija sa CD38
[0779]Vektor (pclpuroCD38) za proizvodnju NIH-3T3-CD38 ćelija je dobijen od prof. M Glennie (Tenovus Research Laboratory, Southampton General Hospital, Southampton, Velika Britanija). NIH-3T3 ćelije (DSMZ, ACC 59; 150,000 ćelija/bazenčiću; 0,5 ml; 96-bazenčića ploča sa ravnim dnom, Greiner) su bile kultivisane u DMEM-u (dopunjenom sa glukozom [4,5 g/l], 10% FCS, L-glutamina, Na-piruvata, BioWhittaker) tokom 24 h. Zatim su, DNK (0,8 ug) i lipofektamin (Invitrogen, Breda, Holandija) razblaženi u DMEM-u i mešani (20 min, RT). Nakon toga, smeša (100 jal) je dodata svakom bazenčiću i inkubirana (na, 37 C).
Skrining za ekspresiju CD38
[0780]NIH-3T3-CD38 ćelije su isprane (u 1 ml PBS-a) i tripsinizovane (200 ul, tripsin- EDTA, BioWhittaker). Zatim je dodat 1 ml DMEM i smeša je pipetirana u FACS cevi Nakon centrifugiranja (1200 rpm, 5 min), ćelije su isprane u FACS puferu (FB; PBS, 0,05% BSA, 0,02% NaN3) i resuspendovane u 1 mL FB. Nakon centrifugiranja (1200 rpm, 5 min), supernatant je uklonjen i mišji anti-humani CD38-PE je dodat (1/50 razblaženje, Sanquin, Amsterdam, Holandija). Nakon ispiranja ćelija dvaput u FB-u, ćelije su resuspendovane u FB-u radi akvizicije protočnom citometrijom.
Ekspanzija i selekcija
[0781]Nakon tretmana tripsinom, ćelije su prenete u T25 boce (Greiner) u DMEM-u (dopunjenom sa glukozom 4,5 g/l, 2 mM L-glutamina i puromicina (2 ug/mL) BioWhittaker). Puromicin rezistentne ćelije su testirane na stabilnu ekspresiju CD38 protočnom citometrijom nakon dve nedelje na medijumu koji sadrži puromicin. NIH-3T3-CD38 odabrane ćelije su subklonirane ograničavanjem razblaženja. Nakon širenja ovih ćelija, svih 15 NIH-3T3-CD38 klonova su bili ispitivani za ekspresiju CD38. VisokoCD38 NIH-3T3-CD38 ćelije su bile zamrznute u tečnom azotu (-80 °C) do upotrebe.
Kultura NIH- 3T3- CD38 ćelija
[0782]Ćelije su kultivisane u DMEM-u (obogaćenom sa glukozom (4,5 g/l), 10% FCS, 2 mM L-glutamina, Na-piruvata, penicilina, streptomicina). Ćelije su pasažirane dva puta nedeljno upotrebom tripsin/EDTA i zasejane u koncentraciji od lxl0<6>ćelija/T75 posudi. VisokoCD38 NIH-3T3-CD38 ćelije su bile zamrznute u tečnom azotu (-80° C) do upotrebe.
Prečišćavanje HA- CD38 antigena
[0783]Scpharoza 4B (Amcrsham Bioscicncc, Uppsala, Švedska) jc spojena sa anti-CD38 antitelom (Serotec, Oxford, UK). Kolona (kolona tube HR5/20 je pakovana na 12 cm visine osnove, zapremina kolone 2,4 ml; maksimalna brzina protoka 0,5 inL/min) je uravnotežena sa najmanje 5 zapremina kolone (CV) PBS-a. Uzorak je filtriran i napunjen u kolonu. Kolona je ispirana sa PBS-om sve dok se signal nije vratio na bazalni (oko 3 CV). Elucija je izvedena sa 0,1 M glicinom na pH 2. Eluirane frakcije su neutralizovane sa 1% (v/v) 2 M Tris-HCI, pH 9.
Prečišćavanje anti- CD38 antitela
[0784]Humana anti-CD38 antitela su prečišćena iz supernatanata kulture tkiva. Prvo, supernatanti su bili filtrirani preko 0,20 uM filtera slepog kraja. Zatim je supernant napunjen u 5 ml proteinske A kolone (rProtein A FF, Amersham Bioscience) i eluiran sa 0,1 M limunskom kiselinom-NaOH, pH 3. Eluat je odmah neutralizovan sa 2 M Tris-HCI, pH 9 i dijalizovan O/N sa 12,6 mM natrijum fosfata, 140 mM NaCl, pH 7,4 (B. Braun, Oss, Holandija). Nakon toga uzorci za dijalizu su sterilno filtrirani preko 0,20 uM slepog filtera.
Prečišćavanje His- CD38 serija
[0785]Protein je prisutan u supernatantu ćelijske kulture ćelija koje eksprimiraju His-CD38, sa DNK konstruktom koji sadrži sekvencu ekstracelularnog domena iz CD38. Dodatna poli-His-označena sekvenca je uključena u konstruktima i prisutna na N-završetku proteina. Ova oznaka omogućava prečišćavanje stacionarnom metalo afinitetnom hromatografijom. U tom procesu jedan helator fiksiran na hromatografskoj smoli je naelektrisan sa Co<2+>katjonima. Posebno, sekvenca koja uključuje 6 histidin aminokiseline snažno vezuje Co<2+>. Stoga Hi s-označeni CD38 proteini se vezuju snažno za takvu kolonu, dok će ostali proteini prisutni u supernatantu kulture proticati kroz kolonu ili će biti isprani. Izrazito vezani His-označeni CD38 proteini su zatim eluirani sa puferom koji sadrži imidazol, koji se takmiči u vezivanju His za Co<2+>. Kada je dovoljno prečišćen His-CD38, eluent se uklanja iz proteina putem izmene pufera na desalinizacionoj koloni.
PRIMER 4
Vezivanje - 003. - 005. i - 024 za CHO ćelije koje su transfektovane sa CD38 ( CHO- CD38). za Daudi- luc
ćelije i za sveže tumorske ćelije multiplog mijeloma HvlM)
[0786]Nakon sakupljanja i brojanja, Daudi-luc ćelije, CHO ćelije transfektovane sa CD38 i kontrolne CHO ćelije su bile resuspendovane u PBS-u (1 x IO<6>ćelija/ml). Zatim, ćelije su stavljene u 96 bazenčića ploča sa V-dnom (100 joi/bazenčiću) i isprane dva puta u PBS-BSA (PBS sa dodatkom 0,1% BSA i 0,02% Na-azida). Nakon toga, 50 ul rastvora antitela u PBS-BSA je dodato ćelijama (4°C, 30 min). Nakon ispiranja tri puta u PBS- BSA, dodato jc 50 ul (1: 400 razblažcnjc) zcčijcg anti-humanog IgG-FITC u PBS-BSA (4°C u mraku, 30 min). Ćelije su isprane tri puta i specifično vezivanje CD38-antitela za CHO-CD38 i Daudi-Luc ćelije je detektovano protočnom citometrijom. HuMab-KLH (jedno humano monoklonsko antitelo protiv KLH (hemocijanina iz zubaca prilepka) generisano od strane Genmab B.V., Utrecht, Holandija upotrebom imunizacijskih protokola koji su opisani na drugom mestu ovde) je korišćeno kao kontrola. Slike 1 i 2 pokazuju da se -003, -005 i -024 vezuju za CHO-CD38 ćelije i za Daudi-luc ćelije, mada sa različitim EC50(Tabela 1). Nije primećeno vezivanje za kontrolne CHO ćelije (podaci nisu prikazani).
[0787]Sveže tumorske ćelije MM su dobijene od dr Lokhorsta (Universitv Medical Center Utrecht, Utrecht, Holandija. Tumorske ćelije su izolovane iz koštane srži pacijenata sa multiplim mijelomom od strane Ficoll (Bio Whittaker; medijuma za odvajanje limfocita, kat 17-829E) gradijentnim centrifugiranjem. Nakon sakupljanja i brojanja, MM ćelije (100,000 ćelija/bazenčiću) su bile ponovo suspendovane sa 25 ul CD38-specifičnih antitela obeleženih sa FITC i 25 jal CD138. Nakon inkubacije (4°C, 30 min), ćelije su isprane u PBS-BSA i dodat je PE-obeleženi kozji-anti-mišji IgG (1:200; Jackson ImmunoResearch Europe Ltd. Soham, UK). Nakon inkubacije (4°C, 30 min) i ispiranja ćelija u PBS-BSA, fluorescencija je merena protočnom citometrijom.
[0788]Slika 3 pokazuje da se -003, -005 i -024 vezuju za MM ćelije.
PRIMER 5
Antitelo- zavisna ćelijski- posredovana citotoksičnost
[0789]Daudi-luc ćelije, sveže tumorske ćelije multiplog mijeloma, sveže tumorske ćelije plazma ćelijske leukemije i JK6L i AMO-1 ćelije multiplog mijeloma su sakupljene (5xl0<6>
ćelija) u RPMI11 (RPMI 1640 medijum kulture sa dodatkom 10% univerzalnog telećeg seruma (HvClone, Logan, UT, USA)), kome je dodato 100 pCi<51>Cr (Hrom-51; Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, Holandija) i smeša je inkubirana u vodenom kupatilu na 37°C tokom 1 sata. Nakon
ispiranja ćelija (dva puta u PBS-u, 1500 rpm, 5 min), ćelije su resuspendovane u RPMI<++>i izbrojane pomoću isključivanja tripan plavog. Ćelije su dovedene u koncentraciju od lxl0<5>ćelija/ml.
Priprema efektorskih ćelija
[0790]Sveže mononuklearne ćelije periferne krvi (zdravih dobrovoljaca, UMC Utreht,
Utreht, Holandija) su izolovane iz 40 mL heparinske krvi pomoću Ficoll-a (Bio Whittaker; medijuma za razdvajanje limfocita, kat 17-829E) u skladu sa instrukcijama proizvođača. Nakon resuspenzije ćelija u RPMI<11>, ćelije su izbrojane isključivanjem tripan plavog i dovedene u koncentraciju od lxl0<7>ćelija/ml.
ADCC postavka
[0791]50 ul 51Cr-obeleženih ciljnih ćelija je pipetirano u 96 bazenčića ploča i dodato je 50 (al antitela, razblaženo u RPMI^ (finalne koncentracije 10, 1, 0,1, 0,01 ug/ml). Ćelije su bile inkubirane (RT, 15 min) i dodato je 50 jal efektorskih ćelija, što rezultira odnosom efektora prema cilju od 100:1 (za određivanje maksimalne lize, 100 ul 5% Triton-X100 je dodato umesto efektorskih ćelija; za određivanje spontane lize, korišćeno je 50 ul ciljnih ćelija i 100 jal RPMI ++). Ćelije su centrifugirane (500 rpm, 5 min), i inkubirane (37°C, 5% C02, 4 sati). Nakon centrifugiranja ćelija (1500 RPM, 5 min), 100 ul supernatanta je sakupljeno u mikronskim epruvetama i izbrojano u gama brojaču. Procenat specifične lize je bio izračunat na sledeći način: (cpm uzorka- cpm samo ciljnih ćelija)/(cpm maksimalne lize - cpm samo ciljnih ćelija), gde je cpm brojanje u minuti.
U Daudi-Luc ćelijama (slika 4 i Tabela 2) -003, -005, -024 izazivaju lizu pomoću ADCC, a
-003, i -005 se ponašaju malo bolje nego rituksimab (anti-CD20 mAt). Interesantno je i kada se sveže tumorske ćelije multiplog mijeloma (dobijene od Dr. H. Lokhorst, UMCU,
Holandija) koriste kao ciljne ćelije, ADCC je izazvan od strane -003, -005 i -024 (Slika 5A
i Tabela 2).
Obogaćivanje ljudskih mononuklearnih ćelija periferne krvi Erlangen
[0792]Ljudska krv dobijena od humanih volontera (univerzitet Erlangen, Erlangen, Nemačka) je razblažena dva puta u RPMI 1640 i krvne ćelije su slojevito postavljene na Ficoll-u ( medijumu za razdvajanje limfocita 1077 g/ml, 710 g, RT, 20 min; BioWhittakcr, Cambrcx Bio Science Vcrvicrs, Verviers, Belgija, kat.l7-829E, lot.br. 0148 32). Mononuklearne ćelije periferne krvi (MNCs) su sakupljene od interfaze, isprane i resuspendovane u RPMI 1640 medijumu kulture sa dodatkom 10% FCS, 2 mM L-glutamina, 5 U/ml penicilina, 50 ug/ml streptomicina (svi dobijeni od BioWhittaker) u koji je dodat 25 mM HEPES (BioWhittaker).
ADCC postavka II
[0793]Ciljne B-ćelije (sveže tumorske ćelije plazma ćelijske leukemije, JK6L i AMO-1 B-ćelijske linije, dobijene od dr T. Valerijusa, Univerzitet u Erlangenu, Erlangen, Nemačka) su označene sa 20 uCi<51>Cr (Amersham Biosciences, Uppsala, Švedska) tokom 2 sata. Nakon ekstenzivnog ispiranja u RPMI-10, ćelije su podešene na lxl0<5>ćelija/ml. MNCs (50 ul), antitela za senzibilizaciju (50 jal) i RPMI-10 (50 jal) se dodaju u mikrotitarske ploče sa okruglim dnom (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Nemačka). Testovi su započeti dodavanjem svežih tumorskih ćelija plazma ćelijske leukemije, JK6L ili AMO-1 ćelija (50 pl) dajući konačnu zapreminu od 200 pl. Korišćeni odnos efektora prema cilju (E:T) je bio 40:1. Nakon inkubacije (3 sata, 37 °C), testovi su bili zaustavljeni centrifugiranjem i mereno je oslobađanje<51>Cr iz triplikata brojanjima u minuti (cpm) u scintilacionom brojaču. Procenat ćelijske citotoksičnosti je izračunat pomoću sledeće formule:
% Specifične lize = (eksperimentalni cpm - bazalni cpm) / (maksimalni cpm - bazalni cpm) x 100
sa maksimalnim oslobađanjem<51>Cr određenog dodavanjem perhlorne kiseline (3% finalna koncentracija) za ciljanje ćelija i bazalno oslobađanje je mereno u odsustvu senzibilišućih antitela i efektorskih ćelija.
[0794]U obe ćelijske linije multiplog mijeloma (tj JK6L i AMO-1), liza je indukovana sa oba) -003 i - 005 (Slike 6 i 7), čak i kada je ekspresija CD38 niska (AMO-1 ćelijska linija).
[0795]-003, -005 i -024 indukuju ADCC primarnih tumorskih ćelija plazma ćelijske leukemije (Slika 5B).
PRIMER 6
Komplement- zavisna citotoksičnost
[0796]Nakon sakupljanja i brojanja Daudi-Luc ćelija, održivost ćelija treba da bude > 90%. Nakon ispiranja (PBS), ćelije su resuspendovane pri 2,0x10<6>ćelija/ml u RPMI-B (RPMI dopunjenog sa 1% BSA). Zatim su ćelije postavljene u 96-bazenčića ploča sa okruglim dnom pri lxl0<5>ćelija/bazenčiću (50 ul/ bazenčiću). Zatim se dodaje 50 jal antitela u bazenčiće (finalne koncentracije su u rasponu između 0-100 ug/ml (trostruka razblaženja u RPMI-B)). Nakon inkubacije (RT, 15 min), 11 ul udruženog humanog seruma (ukupno od 18 zdravih donora) je dodato svakom bezenčiću (37°C, 45 min). Bazenčići su resuspendovani jednom i 120 ul je prebačeno u FACS epruvete (Greiner). Zatim je dodato 10 pl propidijum jodida (PI; Sigma-Aldrich Chcmic B.V.) (10 pg/ml rastvora) ovoj suspenziji. Liza jc detektovana protočnom citometrijom (FACScalibur™, Becton Dickinson, San Diego, CA, USA) merenjem procenta mrtvih ćelija (odgovara Pl-pozitivnim ćelijama).
[0797]Slika 8 i Tabela 2 pokazuju da liza Daudi-Luc ćelija izazvana od strane -005 (~ 60% maksimuma lize) i da se liza od strane -003 vidi samo pri veoma visokim koncentracijama antitela. -024 ne indukuje CDC u Daudi ćelijama (podaci nisu prikazani). U CHO-CD38 ćelijama, liza je indukovana od strane oba
-003, -005 i -024 (Slika 9 i Tabela 3). Liza od strane -003 je indukovana pri višim koncentracijama. U ćelijama tumora (sve dobijene od Dr. Lokhorst i Dr. Bloem, Universitv Medical Center Utreht, Holandija), dobijene od različitih pacijenata sa MM-om (A: 3% refraktornih tumorskih ćelija, B: 9% refraktornih ćelija tumora, C: 30-40% tumorskih ćelija, i D: 70% tumorskih ćelija), CDC-posredovana liza je posmatrana u prisustvu -005, ali ne u prisustvu -003 (Slika 10). -024 takođe indukuju lizu tumorskih ćelija MM (Slika 10E).
PRIMER 7
Studije unakrsnog blokiranja koje koriste FACS
[0798]CHO-CD38 ćelije su inkubirane sa viškom neobeleženog antitela specifičnog za CD38 (4°C, 15 min). Zatim, ćelije su inkubirane sa FITC-obeleženim CD38-specifičnim antitelima (koncentracija približna EC90, 4°C, 45 min). Nakon dva ispiranja ćelija sa PBS-BSA, fluorescencija je izmerena protočnom citometrijom. Slika 11 pokazuje da neobeležena -003 blokiraju vezivanje FITC-obeleženih - 003, dok vezivanje FITC-obclcžcnih -005 nije blokirano. Takođe neobeležena -005 blokiraju vezivanje FITC-obeleženih -005, dok vezivanje FITC-obeleženih -003 nije blokirano. -003 i -005 se vezuju za različite epitope, jer se ne takmiče za vezivanje.
PRIMER 8
Studije unakrsnog- blokiranja koje koriste ELISA tehniku
[0799]Rastvoreni humani CD38 je obložen na površini ELISA ploče. Obloženi CD38 se inkubira sa viškom neobeleženih CD38 specifičnih antitela oko 15 minuta i naknadno se dodaju biotinilovana antitela CD38-specifična (koncentracija približna EC90, RT, 1 sat). Nakon ispiranja tri puta sa PBS/Tween, dodat je peroksidaze rena (HRP)-konjugovani streptavidin i smeša je inkubirana tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Kompleks može biti detektovan dodavanjem ABTS-rastvora i HRP posredovana konverzija supstrata je izmerena upotrebom ELISA čitača na OD 405 nm.
PRIMER 9
Studije unakrsnog- blokiranja koje koriste sendvič- ELISA tehniku
[0800]CD38 specifična antitela su obložena na površini ELISA ploče. Pločom-vezana antitela su inkubirana sa biotinilovanim rastvorljivim CD38 u prisustvu viška CD38 specifičnih antitela u tečnoj fazi. Nakon ispiranja sa PBS/Tween-om, vezani biotinilovani CD38 je detektovan sa HRP-konjugovanim streptavidinom tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ovaj kompleks se može detektovati dodavanjem ABTS-rastvora (nakon ispiranja sa PBS/Tween-om) i HRP posredovana konverzija supstrata je izmerena upotrebom ELISA čitača na OD 405 nm.
PRIMER 10
Reaktivnost sa panelom humanih tkiva i unakrsna reaktivnost sa tkivom cvnomolgusa
imunohistohemij ski
[0801]Sekcije iz zamrznutog ljudskog tkiva (dobijenog od dr H. Niessen, Free Universitv Medical Center, Amsterdam, Holandija) ili tkiva majmuna (Inveresk research, Glazgov, Škotska ) su prekinute na 6 pm i sušene na vazduhu preko noći. Ove kriostatske sekcije su bili fiksirane u acetonu (sobna temperatura, 10 min) i sušene na vazduhu (pribl. 5 min). Nakon toga, sekcije su inkubirane lx sa limunskom kiselinom/fosfatnim puferom koji sadrži 0,1% H2O2(pH 5,8; Sigma), da blokiraju endogene peroksidaze. Nakon 20 min na sobnoj temperaturi, sekcije su isprane dva puta sa PBS i 0,05% Tween-20 (PBST, RT, 5 min; Riedel de Haen, Nemačka). Zatim su sekcije inkubirane sa avidinom (RT, 15 min; DAKO, Glostrup, Danska), oprane dva puta sa PBST i inkubirane sa biotinom (RT, 15 min; DAKO) da blokiraju endogeni biotin. Nakon ispiranja sekcija dva puta sa PBST-om, isečci su preinkubirani sa PBST^ (PBST obogaćen sa 10%> normalnog humanog seruma (NHS, CLB, Amsterdam, Holandija) i 10% normalnog kozjeg seruma (NGS; DAKO) (RT, 20 min). Nakon blotting-off pre-inkubacije seruma, sekcije su inkubirane sa FITC-obeleženim primarnim antitelom razblaženo u 2% PBST ? pri naznačenim koncentracijama (RT, 60 min). Nakon toga, isečci su inkubirani sa zečjim-anti-FITC (1: 1000; DAKO) u 2% PBST^ (RT, 30 min). Nakon ispiranja isečaka sa PBST-om, isečci su inkubirani sa kozjim-anti-zečjim-biotinom (1: 400; DAKO) u 2% PBST<++>(RT, 30 min). Zatim, sekcije su isprane i inkubirane sa SABC-HRP (1: 100; DAKO) u 2% PBST<++>(RT, 30 min). Nakon ispiranja isečaka dva puta u PBST-u, oni su inkubirani (RT, 10 min) sa amino-ctil-karbazol (AEC)-razvojnim rastvorom (50 mM acetatnog pufera, pH 4,9, 0,01% H202; Riedel-de Haen). Konačno, sekcije su isprane u milipor H20 (5 min) i kontra bojene sa hematoksilinom (DAKO). Upotrebom glicergela (37 °C), isečci su fiksirani sa pokrivajućim prevlakama i ispitivani pomoću svetlosnog mikroskopa (Axiovision-2, Zeiss, Thormvood,
NY, USA).
[0802]Bronhijalni epitel je obojen sa -003 i -005 (Slike 12B and 13B) kao i prugasti mišići (miocita, Slike 12C i 13C), makrofaga, limfocita i plazma B ćelija (Slike 12A i 13A). -024 ima slično bojenje prugastih mišića i bronhijalnog epitela, ali je bojenje bilo manje intenzivno. Nije zapaženo bojenje endotelnih ćelija, ni sa -003 (Slika 14D) -005 (14E), niti sa -024 (podaci nisu prikazani), dok je jasno bojenje primećeno sa pozitivnim kontrolnim antitelima protiv endotelnih ćelijskih markera CD31 (Slika 14A) i vWF (14B). Anti-KLH je korišćen kao negativno kontrolno antitelo (Slika 14C). -003 (Slika 12D) i -024 (podaci nisu prikazani), ali ne -005 (Slika 13D) unakrsno reaguju sa limfnim tkivom cinomolgus majmuna.
PRIMER 11
Unakrsna reaktivnost sa mononuklearnim ćelijama periferne krvi cinomolgus ili rezus majmuna
( PBMCs) protočnom citometrijom
[0803]5ml periferne krvi cinomolgus majmuna (Inveresk Research) je lizirano dodavanjem 4,5 ml šok pufera (1,7 mM NH4CI, 1 mM EDTA), 40 ml H20 i 450 ul 10% KHC03. Nakon hemolize ćelije su centrifugirane (1200 rpm, 10 min) i isprane tri puta u PBS-u. Nakon prebrojavanja ćelija sa tripsan plavim, ćelije su resuspendovane u PBS-BSA (lxl0<6>ćelija/ml).
[0804]17,5 ml periferne krvi rezus majmuna (BPRC, Rijsvvijk, Holandija) je razblaženo 1: 1 sa RPMT 1640 i naneto na Ficoll (1,077 g/ml; BioWhittaker, kat. 17-829E, lot.br. 0148 32). Nakon centrifugiranja (710 g, RT, 20 min), interfaza je sakupljena i isprana dva puta u RPMI. Nakon poslednjeg ispiranja ćelije su resuspendovane u RPMI 1640 pri koncentraciji od lxl0<5>ćelija/50 ul.
[0805]Ćelije su prcnete na ploču sa 96 bazenčića (100,000 PBMC-a/bazcnčiću), isprane u puferu FACS (PBS, 0,05%) BSA, 0,02% NaN3) i inkubirane sa primarnim antitelima (4°C, 30 min). Nakon pranja u PBS-BSA, dodato je 50 ul FITC-obeleženim rb-anti-hlgG (DAKO, Glostrup, Danska) (4° C, 30 min). Konačno, ćelije su sakupljene u FACS epruvete u ukupnoj zapremini od 150 ul. Uzorci su izmereni i analizirani upotrebom FACScalibura™(Becton Dickinson, San Diego, CA, SAD).
[0806]Sa protočnom citometrijom unakrsna reaktivnost -003 na makakijevim limfocitima (Slika 15A) i monocitima (Slika 15B) je pokazana, ali ne i -005. Takođe kod rezus majmuna, unakrsna reaktivnost - 003 je primećena na mononuklearnim ćelijama, ali ne i -005 (Slika 15C).
PRIMER 12
Eksperimenti intcrnalizacija
[0807]CHO-CD38 ćelije su obojene sa koncentracijom zasićenja od FITC-obeleženih CD38-specifičnih antitela (na ledu, 30 min). Nakon ispiranja ćelija (u RPMI1640 dopunjenom sa 10% FCS), jedan ćelijski bazen je ugrejan do 37°C da se omogući internalizacija, a drugi bazen je ostavljen na ledu. U nekoliko vremenskih intervala (0-120 min) ćelijski alikvoti su uzeti i prebačeni u ledeno hladni PBS-BSA da bi se zaustavila internalizacija. Nakon ispiranja uzoraka dva puta sa PBS-BSA, EtBr (razblažen u PBS-BSA, konačna koncentracija 2 mg/ml) je dodat uzorcima da suzbije membranski vezan FITC. Fluorescencija je merena protočnom citometrijom.
[0808]Slika 16A i 16B pokazuju da su -003 i -005 internalizovana od strane CHO-CD38 ćelija u toku 5 minuta na 37°C.
PRIMER 13
In vivo eksperimenti SCID- luciferaze
[0809]U ovom modelu tumorske ćelije su transfektovane sa luciferazom svica. Nakon primene luciferina (Molecular Probes, Leiden, Holandija) kod miševa obeležene ćelije se mogu detektovati in vivo Bioluminescentnim snimanjima koristeći visoko osetljivu CCD kameru, cf. Wettervald et al., American Journal of Pathologv 160 (3), 1143-1153 (2002).[0810]Daudi ćelije su transfektovane sa gWIZ luciferazom iz Sistema genske terapije (San Dijego, CA) i gajene u RPMI sa 10%> FCS, Pen/Strep, natrijum piruvata i 1 pg/ml piromicina (Sigma). Ćelije su analizirane na ekspresiju luciferaze (izražene u RLU/1 x 105 ćelija) u luminometru i na CD38 ekspresiju pomoću FACS. 2,5 x IO<6>luciferazom-transfektovanih Daudi ćelija/mišu je injektovano i.v. u SCID miševe. Miševi su tretirani sa - 003, -005, kontrolnim izotipskim antitelima (HuMAb-KLH) ili rituksimabom (anti-CD20 antitelima). Antitela su injektovana intraperitonealno. Korišćena su četiri podešavanja tretmana (videti tabelu 4). U preventivnoj postavci, antitelo (100 ug/mišu) i ćelije su primenjivane simultano. U terapcutskoj postavci I, antitelo (300 ug/mišu) jc primenjivano 7 dana nakon primene ćelija. U terapeutskoj postavci II, antitelo (10 ug/mišu) je primenjivano 14 dana nakon primene ćelija. U terapeutskoj postavci III, antitelo (100 ug/mišu) je primenjivano 7 dana nakon primene ćelija. Za snimanje, miševi su anestezirani i.p. ubrizgavanjem smeše ketamina/ ksilazina/atropina. Sintetički D-Luciferin (natrijumova so, Molecular Probes) je dat i.p. u dozi od 25 mg/ml. Miševi su zatim stavljeni u svetlu uzanu kutiju i nakon 3 min, snimanje je započelo korišćenjem VersArrav 1300B tečnog azota ohlađenog CCD detektora (Roper Scientific). Fotoni emitovani iz luciferaze su izbrojani tokom perioda izlaganja od 5 minuta. Pod osvetljenjem su napravljene crne i bele slike za referencu. MetaVue softver (Universal Imaging Corp.) je korišćen za prikupljanje podataka i analizu slike. Statistički značaj razlika između grupa je uspostavljen korišćenjem jednosmerne analize varijanse sa Nevvman-Keuls post testom korišćenjem GraphPad PPJSM verzije 3.02 (GraphPad Software Ine).
[0811]Slike 17A i 17B pokazuju da -003 i -005 inhibiraju rast ćelija tumora u preventivnom okruženju i u terapeutskoj postavci I, slično inhibiciji posmatranom za anti-CD20 antitela. Oba antitela se ponašaju značajno bolje od kontrolnog izotipskog antitela. Takođe, u terapeutskoj postavci II CD38-antitela usporavaju rast Daudi-Luc tumorskih ćelija (Slika 17C). U terapeutskoj postavci III, -003 i -024 pokazuju jasnu inhibiciju rasta Daudi-luc ćelija tumora (Slika 17D).
PRIMER 14
Apoptoza
[0812]Apoptoza Test je sproveden u skladu sa uputstvima proizvođača (Annexin-V Apoptosis kit, BD Biosciences, Alphen a.d. Rijn, Holandija). Ukratko, CD38 mAt su dodata u 2,5 x IO<3>ćelija (luciferaza-transficirane Daudi ćelije, u 0,5 ml RPMF^ u 24-bazenčića ploče), u koncentraciji od 5 pg/ml - 003 ili - 005 ili anti-CD20 antitela sama ili u prisustvu unakrsnog blokiranja rb-anti-hlgG (50 pg/ml).
[0813]Nakon inkubacije (37°C, 5% C02, 20 sati), ćelije su pažljivo sakupljene i isprane sa vezivnim puferom (1200 rpm, 4°C, 5 min, BD Biosciences). Pelete su resuspendovane u 100 pl pufera za vezivanje. Zatim je dodato 5ul Annexin-V-FITC (BD Biosciences) i 10 pl PI (BD Biosciences) u suspenziju i inkubirano tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. 400 pl vezivnog pufera je dodato i uzorci su izmcrcni (PI očitavanje u FL2). Za analizu apoptotskih ćelija, sve Anncxin-V-pozitivnc ćelije su izbrojane protočnom citometrijom upotrebom FACScalibura protočnog citometra sa CellQuest pro softverom (BD Biosciences). Najmanje 10,000 događaja je bilo sakupljeno za analizu. Ova populacija obuhvata i PI pozitivne kao i Pl-negativne ćelije.
[0814]Slika 18 pokazuje da -003 i -005 ne izazivaju apoptozu. Međutim, nakon umrežavanja, uočava se apoptoza ciljnih ćelija. -003 indukuje apoptozu nakon unakrsnog-vezivanja koja je slična apoptozi indukovanoj od strane anti-CD20 antitela (rituksimabom). -005 je manje sposoban da indukuje apoptozu nakon unakrsnog vezivanja. Slični rezultati su dobijeni sa RAMOS ćelijama kao ciljnim ćelijama (podaci nisu prikazani).
PRIMER 15
Efekat - 005 na B ćelije tkivnog grafta u RA- SCID mišjem modelu
Implantacija sinovijalnog tkiva
[0815]SCID-miševi, soja C.B.-17/ lcrCrl SCID-bg, mužjaci/ženke, 4-12 nedelja, nabavljeni od Charles River Laboratories Nederland (Maastricht, Holandija) su držani u IVC kavezima pod standardnim uslovima temperature i svetlosti i hranjeni su laboratorijskom hranom i vodom ad libitum. Pre implantacije, miševi (tri miša u svakoj eksperimentalnoj grupi, dan 0) su anestezirani intraperitonealno injekcijom ketamina (NIMATEK, EuroVet) i ksilazina (Rompun, Bayer) u odnosu 1:1. Mala incizija kože je napravljena uz pomoć hirurških makaza. Inflamirano sinovijalno tkivo od pacijenta sa reumatoidnim artritisom podvrgnutog operaciji zamene zgloba je implantirano subkutano kao klaster od šest malih fragmenata (ukupno 2-3 mm<3>) na svakom boku miša. Rana je zatvorena pomoću Permakol cijanoakrilatnog lepka. Na dan 1 eksperimenta, preostalo sinovijalno tkivo je analizirano kako bi se proverilo na B ćelije u inflamiranim sinovijalnim transplantima. -005 (12 mg/kg) ili kontrolno antitelo (anti-KLH, 30 mg/kg) je injektirano (i.v.), u zapremini od 200 pl na dan 8 eksperimenta. Na kraju eksperimenta (dan 14) miševi su žrtvovani C02inhalacijom i sinovijalni graftovi su eksplantirani. Jedan od graftova je bio brzo-zamrznut u OCT jedinjenju (TissueTek, Sacura Finetek Evropa) za dalju imunohistohemijsku analizu, a drugi je bio zamrznut potapanjem u tečnom azotu za dalju analizu RNK.
Imunohistohemij a
[0816]5 pM kriosekcija na SuperFrost (Menzel GmbH, Braunschvveig) slajdovima su pripremljene korišćenjem LETCA CM1900 kriostata i čuvane na -80°C. Odmrznuti isečci su fiksirani u acetonu tokom 10 min, osušeni na sobnoj temperaturi i isprani 3x5 min u PBS-u. Svi koraci su izvedeni na sobnoj temperaturi. Endogena aktivnost peroksidaze je blokirana inkubacijom sa PBS-om sa dodatkom 0,3% vodonik peroksida i 0,1% natrijum-azida tokom 20 min. Slajdovi su isprani 3x5 min u PBS-u i inkubirani sa 10% normalnim humanim serumom (NHS)/10% normalnim zečjim serumom (NRbS) u PBS/1%) BSA tokom 30 min. Sledeće, primarno antitelo (mAt miša) razblaženo u PBS-u sa dodatkom 1% BSA/10% NHS/ 10% NRbS je inkubirano tokom 60 min. Nakon ispiranja 3x2 min u PBS-u, HRP-konjugat (kozji anti-mišji Ig-HRP; DAKO P0447) razblažen 1:50 u PBS-u (sa dodatkom 1% BSA/ 10% NHS/10% NRbS) je bio dodat tokom 30 min. Signal peroksidaze je bio pojačan korišćenjem TSA™ Biotin sistema (Perkin Elmer Life Sciences, NEL700). Slajdovi su isprani 3x2 min u PBS-u i inkubirani sa biotinil tiramidom razblaženom u odnosu 1:1600 u amplifikacionom puferu tokom 30 min. Nakon ispiranja 3x2 min u PBS-u, streptavidin-HRP razblažen 1: 400 u PBS-u (sa dodatkom 1% BSA) je dodat u toku 30 min. Slajdovi su isprani 3x2 min u PBS-u i inkubirane sa DAB rastvorom (DAKO Cvtomation K3465) tokom 5 min. Bojena reakcija je zaustavljena sa destilovanom vodom. Konačno, pločice su kontra bojene sa hematoksilinom (MERCK), isprane tekućom vodom i pokrivene sa Kaiser-ovim glicerinom i pokrivnim omotima.
Bodovanje intenziteta bojenja
[0817]Bodovanje obojenih sinovijalnih ksenograftova tkiva je izvedeno na slepi način od strane dve obučene osobe. Prvo najjači deo je izabran iz serija sekcija i ova referentna sekcija je osvojila maksimalni rezultat 8. Intenzitet bojenja u drugim odeljcima je zatim ocenjen na skali od 0 do 8, u odnosu na referentnu sekciju.
Statistička analiza
[0818]Ocena intenziteta bojenja je analizirana Kruskal-VVallis jednofaktorskom ANOVA, praćeno Dunn-ovim testom višestrukog poređenja korišćenjem programa Graph Pad Prism version 4.01 (Graph Pad softver, Inc., San Diego, CA, USA).
[0819]Slika 19 i Slika 21 pokazuju da su brojevi anti-CD38-pozitivnih ćelija plazme redukovani nakon tretmana sa -005. Bojenje plazma ćelija sa anti-CD138 potvrđuju da -005 rezultiraju u smanjenom broju plazma ćelija (Slike 20 i 22).
PRIMER 16
Sekvenciranie kodiraiuće seguence humanih antitela protiv CD38 RNK preparata
[0820]Ukupna RNK je pripremljena od 5xl0<6>ćelija hibridoma ćelijskih linija koje eksprimiraju monoklonsko antitelo -003, -005 i -024, respektivno, sa RNeasv kompletom (Qiagen, Westburg, Leusden, Holandija) u skladu sa protokolom proizvođača.
Priprema cDNK - 003, - 005 i - 024
[0821]5'-RACE-Komplcmcntarna DNK (cDNK) od RNK jc pripremljena iz 100 ng ukupne RNK, korišćenjem SMART RACE cDNK amplifikacijskog kompleta (Clontech), sledeći protokol proizvođača.
[0822]Oligonukleotidni prajmeri su sintetisani i kvantifikovani pomoću Isogen Bioscience (Maarssen, Holandija). Prajmeri su rastvoreni u H20 do 100 pmol/pl i čuvani na -20°C. Pregled svih PCR i sekvenciranje prajmera je tabelarno (Tabela 5). Za PCR PfuTurbo<®>Hotstart DNK polimeraza (Stratagene, Amsterdam, Holandija, proizvod # 600322) je korišćen u skladu sa uputstvima proizvođača. Svaka reakciona mešavina sadrži 200 pM mešovitih dNTPs (Roche Diagnostics, Almere, Holandija; proizvod # 1814362), 12 pmol reverznog prajmera (RACEG1A1 za VH3003-005, RACEVHApal za VH3003-003 i RACEVLBsiWI za VL3003-003 i 005), 7,2 pmol UPM-mix (UPM-mix: 2 pM ShortUPMH3 i 0,4 pM LongUPMH3), 0,6 pl od 5'RACE cDNK matrice, i 1,5 jedinica PfuTurbo<®>Hotstart DNK polimcraza u PCR rcakcionom pufcru (snabdcvcnog sa polimcrazom) u ukupnoj zapremini od 30 pl. PCR reakcije su bile izvedene sa TGradient Thermocvcler 96 (Whatman Biometra, Getingen, Nemačka; proizvod # 050-801), korišćenjem programa 35 ciklusa: denaturisanja na 95°C tokom 2 min; 35 ciklusa od 95°C tokom 30 sekundi, 55°C tokom 30 sekundi, i 72°C tokom 1,5 min; konačni nastavak na 72°C tokom 10 min. Ukoliko je potrebno, PCR mešavine su čuvane na 4 °C do dalje analize ili procesovanja.
Kloniranje - 003- 2F5 VH i VL i - 005 VLi - 024 VH i VL u pGEMT- Vektorskom sistemu II
[0823]Reakcioni proizvodi su razdvojeni elektroforezom na 1% TAE agaroznom gelu i obojeni sa etidijum bromidom. Trake odgovarajuće veličine su isečene iz gelova i DNK je izolovana iz agaroze korišćenjem Qiaexll gel kompleta za ekstrakciju (Qiagen, kat 20021).
[0824]Gelom izolovani PCR fragmenti su bili sa A repom pomoću inkubacije od 10 min 72° C sa 200 pM dATP i 2,5 jedinica Amplitaq (Perkin Elmer) i prečišćeni korišćenjem minielute kolona (Qiagen). A-repati PCR fragmenti su klonirani u pGEMTeasv vektor (Promega) korišćenjem kompleta pGEMT easy vektorskog sistema II i protokola (LJ270, strana 3/4). 2 pl smeše za povezivanje je transformisano u OneShotDH5aTlR kompetentnu E.Coli (Invitrogen) i postavljeno na LB/Amp/IPTG/Xgal pločama.
Sekvenciranje
[0825]V-regioni -003 i -024 i V, region -005 su sekvencirani pomoću AGOWA (Berlin, Nemačka) nakon biranja respektivno 20 (VH-003), 16 (VL-003), 15 (VL-005) i 6 (VHi VL-024) belih kolonija, izolovanja plazmida i sekvenciranja sa M13 reverznim prajmerom. -005 VHregion je sekvenciran direktno na PCR proizvodu korišćenjem prajmera Hcsek5. Sekvence su analizirane pomoću Vector NTI advanced suite (Invitrogen).
Generisanje ekspresionih vektora za antitelo - 003, - 005. - 024 i Morphosvs antitela 3079
[0826]VHkodirajući region -003 je umnožen pomoću PCR iz pGemT plazmidskog klona koji sadrži VHregion -003, korišćenjem prajmera VH3003-O03for i RACEVHApal, uvođenjem pogodnih restrikcionih mesta (Hindlll i Apal) za kloniranje u pConGlf0.4 (Lonza Biologics, Slough, Velika Britanija) i idealnu Kozak sekvencu (GCCGCCACC). PConGlf0.4 vektor sadrži konstantni region teškog lanca humanog IgGl. VHPCR fragment je ubačen, u okvir, u pConGlf0.4 vektor, korišćenjem Hindlll i Apal. Konstrukt je proveren analizom sekvence.
[0827]VHkodirajući region -005 je umnožen sa PCR-om iz pGemT plazmidskog klona koji sadrži VHregion -005, korišćenjem prajmera VH3003-5for i RACEVHApal, uvođenjem pogodnih restrikcionih mesta (Hindlll i Apal) za kloniranje u pConGlf0.4 i jednu idealnu Kozak sekvencu. VHPCR fragment je ubačen u okvir, u pConGlf0.4 vektor, korišćenjem Hindlll i Apal. Konstrukt je proveren analizom sekvence.
[0828]VHkodirajući region -024 je umnožen pomoću PCR iz pGemT plazmida klona koji sadrži VHregion -024, upotrebom prajmera VH300324exfor i RACEVHApal, uvođenjem pogodnih restrikcionih mesta (Hindlll i Apal) za kloniranje u pConGlf0.4 i idealnu Kozak sekvencu. VHPCR fragment je ubačen u okvir, u pConGlf0.4 vektor, korišćenjem Hindlll i Apal. Konstrukt je proveren analizom sekvence.
[0829]VHkodirajući region za Morphosvs antitela 3079 je sintetisan od strane GeneArt (Regensburg, Nemačka), na osnovu podataka objavljenih u patentu WO 2005/103083 A2. Kodirajući region je kodonom optimizovan za ekspresiju u HEK ćelijama da bi sc povećali nivoi ekspresije i pogodna restrikciona mesta (Hindlll i Apal) za kloniranje u pConGlf0.4 i uvedena je idealna Kozak sekvenca. Plazmid koji sadrži sintetički VHregion je svaren sa Apal i Hindlll i VHfragment je umetnut u okvir, u pConGlf0.4 vektor.
[0830]VLkodirajući region -005 je umnožen pomoću PCR iz pGEMT plazmida klona koji sadrži VLregion -005, upotrebom prajmera VL3003-5exfor i RACEVLBsiWI, uvođenjem pogodnih restrikcionih mesta (Hindlll i Pfl23II) za kloniranje u pConKappa0.4 (Lonza biologija) i idealnu Kozak sekvencu. PConKappa0.4 vektor sadrži kappa lakog lanca konstantni region. VLPCR fragment je ubačen u okvir, u pConKappa0.4 vektor, korišćenjem Hindlll i Pfl23II. Konstrukt je proveren analizom sekvence.
[0831]VLkodirajući region -003 je umnožen pomoću PCR iz pGEMT plazmida klona koji sadrži VLregion -003, upotrebom prajmera VL3003-003for i RACEVLBsiWI, uvođenjem pogodnih restrikcionih mesta (Hindlll i Pfl23II) za kloniranje u pConKappa0.4 i jednu idealnu Kozak sekvencu. VLPCR fragment je ubačen u okvir, u pConKappa0.4 vektor, korišćenjem Hindlll i Pfl23II. Konstrukt je proveren analizom sekvence.
[0832]VLkodirajući region -024 je umnožen pomoću PCR iz pGEMT plazmida klona koji sadrži VLregion -024, upotrebom prajmera VL3003-24-5exfor i RACEVLBsiWI, uvođenjem pogodnih restrikcionih mesta (Hindlll i Pfl23II) za kloniranje u pConKappa0.4 i idealnu Kozak sekvencu. VLPCR fragment je ubačen u okvir, u pConKappa0.4 vektor, korišćenjem Hindlll i Pfl23II. Konstrukt je proveren analizom sekvence.
[0833]VLkodirajući region Morphosvs antitela 3079 je sintetisan pomoću GeneArt, na osnovu podataka objavljenih u WO 2005/103083. Kodirajući region je kodonom optimizovan za ekspresiju u HEK ćelijama; da poboljša nivo ekspresije i odgovarajuća mesta ograničenja (Hindlll i Pfl23II) za kloniranje u pConKappa0.4 i idealne Kozak sekvence su uvedene. Plazmid koji sadrži sintetički VLregion, je digestiran sa Pfl23TT i HindTTT i VHfragment je ubačen u okvir, u pConKappa0.4 vektor.
[0834]Antitela su prolazno eksprimirana u HEK-293F ćelijama, kao što je opisano u Primeru 17, pomoću kotransfekcije njihovih vektora teškog lanca i lakog lanca.
Generisanje stabilnih ćelijskih linija u CHO- K1SV ćelijama
[0835]Za generisanje stabilnih ćelijskih linija, vektori -003 ili -005 teškog i lakog lanca su bili kombinovani u pojedinačnom dvostrukom genskom vektoru pomoću standardnih tehnika kloniranja.
[0836]Vektori dvostruki genski od -003 ili -005 su linearizovani i transfektovani u CHO-K1SV (Lonza Biologies) ćelijama, suštinski kao što je opisano od strane proizvođača. Stabilne ćelijske linije su odabrane selekcijom sa 25 pM L-metionin sulfoksiminom (MSX) kako je opisano od strane Lonza Biologies. Glavni proizvodni klonovi su odabrani i propagirani u CD-CHO (Invitrogen) medijumu i antitela su prečišćena iz supernatanta ćelijske kulture kao što je opisano u Primeru 3.
PRIMER 17
Mapiranje epitopa korišćenjem mutageneze usmercne na određeno mesto
[0837]Oligonukleotidni prajmeri su sintetisani i kvantifikovani pomoću Isogen Bioscience (Maarssen, Holandija). Prajmeri su rastvoreni u H20 do 100 pmol/pl i čuvani na -20°C. Rezime svih PCR i sekvenciranja prajmerima je prikazano u Tabeli 6. Za PCR, PfuTurbo<®>Hotstart DNK polimeraza (Stratagene, Amsterdam, Holandija) je korišćena u skladu sa uputstvima proizvođača. Svaki reakciona mešavina je sadržala 200 pM mešovite dNTPs (Roche Diagnostics, Almere, Holandija), 10 pmol oba i prednjeg i reverznog prajmera, 100 ng genomske DNK ili 1 ng plazmida DNK i 1 jedinicu PfuTurbo<®>Hotstart DNK polimeraze u PCR reakcionom puferu (nabavljenog sa polimerazom) u ukupnoj zapremini od 20 pl. PCR reakcije su izvedene sa TGradient Thermocvcler 96 (Whatman Biometra, Getingen, Nemačka), koristeći program od 32 ciklusa: denaturisanja na 95°C tokom 2 min; 30 ciklusa od 95°C tokom 30 sekundi, 60-70°C gradijent (ili drugu specifičnu temperaturu žarenja) tokom 30 sekundi, i 72°C tokom 3 min; konačni nastavak na 72°C tokom 10 min. Ukoliko je potrebno, PCR mešavine su čuvane na 4° C do daljeg analize ili prerade.
[0838]Agaroza gel elektroforeza je izvedena prema Sambrook (Sambrook, Russell et al., 2000) korišćenjem gelova od 50 ml, u 1 x Tris acetatnom EDTA puferu. DNK je vizualizovan uključivanjem etidijum bromida u gelu i posmatranje pod UV lampom. Slike gela su snimljene CCD kamerom i sistema analize slike (GeneGnome; Svngene, via Westburg B.V., Leusden, Holandija).
[0839]Prečišćavanje željenih PCR fragmenata je izvedeno korišćenjem MinElute PCR Purification Kit (Qiagen, via Westburg, Leusden, Holandija; proizvod# 28006), prema uputstvima proizvođača. Izolovana DNK je kvantifikovana pomoću UV spektroskopije (videti dole), a kvalitet je procenjen elektroforezom na agaroza gelu.
[0840]Alternativno, PCR ili digestioni proizvodi su razdvojeni elektroforezom na agaroza gelu (na primer kada je bilo prisutno više fragmenata) korišćenjem 1% Tris Acetat EDTA agaroznog gela. Željeni fragment je isečen sa gela i oporavljen korišćenjem QIAEX II Gel Kompleta za ekstrakciju (Qiagen; oroizvod # 20051), prema uputstvima proizvođača.
[0841]Optička gustina nukleinskih kiselina je određivana korišćenjem NanoDrop ND-1000 spektrofotometra (Isogen Life Science, Maarssen, Holandija) prema uputstvima proizvođača. Koncentracija DNK je merena analizom optičke gustine (OD) na 260 nm (jedna OD260nm jedinica = 50 pg/ml). Za sve uzorke, pufer u kome su rastvorene nukleinske kiseline je korišćen kao referentan.
[0842]Restrikcioni enzimi i suplementi su nabavljeni iz New England Biolabs (Beverlv, MA, USA) ili Fermetas (Vilnius, Litvanija) i korišćeni prema uputstvima proizvođača. DNK (100 ng) je digestirana sa 5 jedinica enzima (a) u odgovarajućem puferu u konačnoj zapremini od 10 pl (reakcione količine su srazmerno podešene prema potrebi). Digestije su inkubirane na preporučenoj temperaturi u toku minimuma od 60 min. Za fragmente koji zahtevaju duple digestije sa restrikcionim enzimima koji uključuju inkompatibilne pufere i temperaturne zahteve, digestije su izvršene redom. Ukoliko je potrebno digestioni proizvodi su prečišćeni elektroforezom na agaroza gelu i gel ekstrakcijom.
[0843]Ligacije DNK fragmenata su izvedene sa Quick Ligation Kit (New England Biolabs) prema uputstvima proizvođača. Za svaku ligaciju, vektor DNK je pomešan sa približno tro-strukim molarnim viškom umetka DNK.
[0844]Plazmidska DNK (1-5 pl DNK rastvora, obično 2 pl DNK smeše vezivanja ) je pretvorena u One Shot DH5a-Tl<R>E. coli ćelije (Invitrogen, Breda, Holandija; proizvod # 12297-016) korišćenjem metode toplotnog šoka, u skladu sa uputstvima proizvođača. Zatim su ćelije postavljene na Luria-Bertani (LB) agar ploče koje sadrže 50 pg/ml ampicilina. Ploče su inkubirane tokom 16-18 h na 37°C dok bakterijske kolonije nisu postale vidljive.
[0845]Bakterijske kolonije su skenirane na prisustvo vektora koji sadrže željene sekvence preko kolonija PCR korišćenjem ThermoStart PCR Master Mix-a (Abgene, via Wetsburg, Leusden, Holandija; proizvod # AB-938-DC15/b) i prajmera pConGlsekl i pEE13.4sekrev2 (Tabela 6). Izabrane kolonije su lagano dodirnute sa 20 pl vrha pipete i dodirnute nakratko u 2 ml LB za kulturu manjeg obima, a zatim ponovo suspendovane u PCR mešavini. PCR se izvodi sa TGradient Thermocvcler 96 korišćenjem 35-ciklusnog program: denaturacija na 95 C tokom 15 min; 35 ciklusa od 94°C tokom 30 s, 55°C tokom 30 sekundi i 72°C tokom 2 min; praćena konačnim ekstenzionim korakom od 10 min na 72°C. Ukoliko je potrebno, PCR smeše su čuvani na 4°C do analize elektroforezom na agaroza gelu.
[0846]Plazmidska DNK je izolovana iz kultura E. coli korišćenjem sledećih kompleta od Qiagen (via Westburg, Leusden, Holandija), prema uputstvima proizvođača. Za pripremu plazmida u balku (50-150 mL kulture), bilo daje korišćen HiSpeed Plazmid Maxi Kit (proizvod# 12663) ili HiSpeed Plazmid Midi Kit (proizvod # 12643). Za pripremu plazmida u manjem obimu (± 2 mL kulture) korišćenje Qiaprep spin Miniprep Kit (proizvod # 27106) i DNK je eluirana u 50pl pufera za eluaciju (nabavljenog sa kompletom).
Konstrukcija HA- CD38 ekspresionog vektora pEE13. 4HACD38
[0847]Ekstracelularni domen humanog CD38 je umnožen iz plazmida pClpuroCD38 (dobijenog od prof. M. Glennie, Tenovus Research Laboratorv, Southampton Opšta bolnica, Southampton, Velika Britanija) korišćenjem prajmera cd38forha i cd38exrev. Ovom PCR reakcijom uvedena je HA-oznaka. Ovaj PCR proizvod je korišćen kao templejt za drugu PCR reakciju sa prajmerima SPHMM38ex i cd38cxrcv. Ovom PCR reakcijom, signalni peptid SPHMM, restrikciona mesta i idealna Kozak sekvenca (GCCGCCACC) za optimalnu ekspresiju su uvedeni. Nakon prečišćavanja, ovaj PCR fragment je kloniran u ekspresioni vektor pEE13.4 (Lonza Biologies) i kompletna sekvenca kodiranja je potvrđena sekvenciranjem sa prajmerima pConKsekl, pEE13.4sekrev, cd38seklfor i cd38sek2rev (tabela 6). Ova konstrukcija je nazvana pEE13.4HACD38 .
Mestom- usmerena mutageneza
[0848]Tri pojedinačna mutant proteina od huCD38 su konstruisana, u kojima je T mutiran do A na položaju 237 (T237A, SEK ID Br: 32), Q je mutiran do R na položaju 272 (Q272R, SEK ID Br: 33), ili S je mutiran do F na položaju 274 (S274F, SEK ID Br: 34). Usmerena mutageneza je izvedena korišćenjem QuickChange II XL mesto-usmerenog mutageneze Kompleta (Stratagene, Amsterdam, Holandija) prema uputstvima proizvođača. Ova metoda uključuje uvođenje tihog ekstra ograničavajućeg mesta ili gubitka ograničavajućeg mesta za skrining za uspešnu mutagenezu (ekstraXbalmesta za T237A mutanta, ekstraBcglmesta za Q272R mutanta i gubitakSsplmesta za S274F mutanta). Ukratko, 5pl 10x reakcionog pufera, 1 pl oligonukleotida HACD38T237Afor2, HACD38Q272Rfor ili HACD38S274Ffor (100 pmol/pl), 1 pl oligonukleotida HACD38T237Arev2, HACD38Q272Rrev ili HACD38S274Frev (100 pmol/pl), 1 pl dNTP mixa, 3 pl Quicksolution, 1 pl plazmidapEEl3.4HACD38 (50 ng/pl) i 1 pl PfuUltra HF DNK polimeraze su pomešani u ukupnoj zapremini od 50 pl i pojačani sa TGradient Thermocvcler 96 (Whatman Biometra, Getingen, Nemačka; proizvod # 050-801) pomoću programa od 18 ciklusa: denaturisanja na 95°C tokom 1 min; 18 ciklusa od 95°C tokom 50 sekundi, 60°C tokom 50 sekundi, i 68°C tokom 10 min. PCR smeše su čuvane na 4°C do dalje prerade. Sledeće, PCR mešavine su inkubirane sa 1 plDpNltokom 60 min na 37°C za digestiju pEE13.4HACD38 WT vektora i čuvane na 4 °C do dalje prerade. Reakciona smeša je precipitirana sa 5 pL 3 M NaAc i 125 pl etanola, inkubirana tokom 20 minuta na -20°C i centrifugirana tokom 20 minuta na 4°C na 14000xg. DNK peleta je oprana sa 70% etanolom, osušena i rastvorena u 4 pl vode. Ukupna reakciona zapremina 4 pl je transformisana u One Shot top 10DH5aTl<R>kompetentne ćelije E. coli (Invitrogen, Breda, Holandija), prema uputstvima proizvođača (Invitrogen). Zatim su ćelije postavljene na Luria-Bertani (LB) agar ploče koje sadrže 50 pg/ml ampicilina. Ploče su inkubirane 16-18 h na 37°C dok bakterijske kolonije ne postanu očevidne. Kolonije su pregledane PCR-om kolonija korišćenjem prajmera pConGlsekl i pEE13.4sekrev2 (Tabela 5) i digestirane sa relevantnim restrikcionim enzimima za skrining za ugradnju mutagenih oligonukleotida. 2 pozitivna klona za svakog mutanta su gajena i plazmidska DNK je izolovana. Kompletna HACD38 kodirajuća sekvenca je određena korišćenjem prajmera cd38seklfor, pConGlsekl i pEE13.4sekrev2 da se potvrdi prisustvo mutacija i odsustvo dodatnih neželjenih mutacija.
DNK sekvenciranje
[0849]Plazmidski DNK uzorci su poslati u AGOWA (Berlin, Germani) za analizu sekvence. Sekvence su analizirane pomoću Vektor NTI naprednog softvera (Informax, Oxford, Velika Britanija).
Prolazna ekspresija u HEK- 293F ćelijama
[0850]Freestvle™ 293-F (jedan subklon HEK-293 prilagođen rastu suspenzije i hemijski defmisani Freestvle medijum, (HEK-293F)) ćelije su dobijene od Invitrogena i transficirane sa pEE13.4HACD38 i trima konstruktima koji nose mutacije T237A, Q272R i S274F, u skladu sa protokolom proizvođača koristeći 293fectin (Invitrogen). Supernatanti kultura transficiranih ćelija su korišćeni u ELISA za anti-CD38 studije vezivanja.
Vezivanje anti- CD38 antitela
[0851]ELISA ploče (Greiner, # 655092) su obložene O/N na 4°C sa 1 pg anti-HA antitela (Sigma, # H-9658) i zatim su blokirane sa 2% pilećeg seruma. Supernatanti kultura transfektovanih HEK293F ćelija su razblaženi, primenjeni na ELISA ploče i inkubirani tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja, dodata su serijska razblaženja HuMabs -003 i -005 i inkubirana 1 hr na sobnoj temperaturi. Vezana antitela su detektovana sa HRP- konjugovanim kozjim-anti-humanim IgG antitelima. Test je razvijen sa ABTS (Roche, # 1112597) i apsorpcija je merena na 405 nm korišćenjem spektrofotometra.
[0852]Kao što se može videti iz Slika 23A-23C, oba -003 i -005 se vezuju za wt humanog CD38. Vezivanje -003 nije pogođeno uvođenjem mutacija T237A (Slika 23A), Q272R (Slika 23B) ili S274F (Slika 23C). -005 je bilo u stanju da veže CD38 skrivanja mutaciju T237A (Slika 23A). Vezivanje -005 za CD38 sa mutacijom Q272R je ozbiljno narušeno (Slika 23B), oba u vezi sa EC50i maksimalnim kapacitetom vezivanja. -005 nije sposobno da se veže za mutanta CD38 gde je serin na položaju 274 zamenjen sa fenilalaninom (Slika 23C).
[0853]Ovi podaci pokazuju da se -003 i -005 vezuju za različite epitope. Osim toga, ove studije su otkrile daje vezivanje -005 za CD38 osetljivo prema mutacijama na položajima 272 i 274. Posebno S274 je neophodan za -005 vezivanja za CD38.
PRIMER 18
Indukcija proliferacije PBMC
[0854]-003, -005 i -024 su bili testirani u određivanju u suštini kao što je opisano u Ausiello et al., Tissue antigens 56, 538-547 (2000). Ukratko, PBMC-e iz zdravih donora su kultivisane na lxl0<5>ćelija/bazenčiću u 96-bazenčića ploča ravnog dna u prisustvu antitela (konačna koncentracija: 1,1 - 3,3 - 10 - 30 pg/mL) u 200 pl RPMf~\ Stimulacija ćelija sa IL-15 (pri 333 ng/ml; Amgen Inc., Thousand Oaks, CA, USA) korišćenog kao pozitivna kontrola. Posle 4 dana inkubacije na 37°C, 30 pl<3>H-timidina (16.7 pCi / ml) je dodato, i kultura je bila nastavljena O/N.<3>H-timidina ugradnja je procenjena korišćenjem Packard Cobra gama brojača (Packard Instruments, Meriden, DT, USA), prema uputstvima proizvođača. Podaci su prikazani kao srednji cpm (± SEM) od PBMC-a dobijenih od 10 donora. Rezultati pokazuju da -003 i -005 ne izazivaju značajnu proliferaciju PBMC-a (Slika 24A). Takođe -024 ne indukuje značajno proliferaciju PBMC-a (podaci nisu prikazani).
PRIMER 19
Indukcija IL- 6
[0855]-003, -005 i -024 su testirani u određivanju koje je opisano u Ausiello et al., Tissue antigens 56, 538-547 (2000). Ukratko, PBMC-e su kultivisane na lxl0<6>ćelija/ležištu u 48-bazenčića ploča u prisustvu 20 pg/ml antitela i 10 ng/ml LPS (Sigma-Aldrich Chemie, Zwijndrecht, Holandija) u 500 pl RPMI<++>. Nakon izvesne O/N inkubacije na 37°C, supernatant je sakupljen i čuvan na -20°C. Koncentracija IL-6 jc procenjena pomoću tehnike ELISA (IL-6 ELISA kit, U-Cytcch Biosciences, Utrecht, Holandija) u skladu sa uputstvima proizvođača. Podaci su prikazali srednju koncentraciju u pg/ml (± SEM) iz 7 donora. Rezultati pokazuju da -003 i -005 ne izazivaju oslobađanje značajnih nivoa IL-6 (Slika 24B). Takođe -024 ne indukuje oslobađanje značajnih nivoa IL-6 (podaci nisu prikazani).
PRIMER 20
Indukcija oslobađanja IFN- y
[0856]-003, -005 i -024 su testirani u eseju koji je opisan u Ausiello et al., Tissue antigens 56, 538-547
(2000). Ukratko, PBMC ćelije su kultivisane pri lxl0<6>ćelija/bazenčiću u 48-bazenčića ploča u prisustvu 20 pg/ml antitela i 1 pg/ml OKT-3 (Sanquin, Amsterdam, Holandija) u 500 pl RPMr<+>. Nakon O/N inkubacije na 37°C, supernatant je sakupljen i čuvan na -20°C. Koncentracija IFN-y je procenjena pomoću tehnike ELISA (IFN-y ELISA kit, U-CyTech Biosciences, Utreht, Holandija) u skladu sa uputstvima proizvođača. Podaci su prikazali srednju koncentraciju u pg/ml (± SEM) od 9 donora. Rezultati pokazuju da -003 i -005 ne izazivaju oslobađanje detektibilnih nivoa IFN-y (Slika 24C). Takođe -024 ne indukuje oslobađanje značajnih nivoa IFN-y (podaci nisu prikazani).
PRIMER 21
Afinitet vezivanja - 003 i - 005 na rekombinantni CD38
[0857]Vezivanje -003 i -005 do CD38 je testirano korišćenjem površinske plazmonske rezonance. Ukratko, prečišćena antitela su imobilizovana na jednom CM-5 senzorskom čipu (Biacore, Uppsala, Švedska) preko anime kuplovanja. HA-obeleženi CD38 (videti Primer 3) je tekao preko, a vezivanje antigena za mAt je detektovano pramenom indeksa prelamanja na površini čipa korišćenjem Biacore 3000 (Biacore).Udružene i konstante brzina za -003 (Tabela 7) i -005 (Tabela 8) su sumirane niže, srednja vrednost 3 eksperimenta ± SD, pokazuje da oba -003 i -005 imaju visoki afinitet za CD38.
PRIMER 22
Mapiranje epitopa
Mapiranje epitopa korišćenjem metode PEPSCAN
[0858]Prema poznatim postupcima (Geysen et al. 1984. Korišćenje sinteze peptida za probe virusnih antigena za epitope sa rezolucijom od jedne aminokiseline. Proc Natl Acad Sci USA 81: 3998; Slootstra et al. 1996. Strukturni aspekti interakcije antitelo-antigen otkrivene kroz male nasumične peptidne biblioteke. Mol Divers 1:87; Puijk et al. 2001. Sinteza segmenta, u PCT, Holandija, str.l.), Preklapanjem 20-mer linearnih i 15-mer lančanih peptida su bili sintetisani pokrivajući 138 aminokiselina na C-završetku humanog CD38. Nadalje, na osnovu sekvence na C-završetku jednolančanih peptida različitih veličina su napravljeni pokrivajući region KNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI, region CVHNLQPEKVQTLEAWVIHGG i region CLESIISKRNIQFSAKNIYRC. Pored toga, dodatni setovi su dizajnirani za rekonstrukciju dvostrukolančanih regiona koji su sastavljeni od SKRNIQFSCKNIYR i EKVQTLEAWVIHGG. Prirodni cisteini su bili zamenjeni sa alaninima. Peptidi su ispitivani u ELISA-testu pomoću kreditne kartice formata mini-PEPSCAN kartica.
Sinteza peptida
[0859]Peptidi su sintetisani primenom standardne Fmoc-hemije i deprotektovani korišćenjem smeše TFA sa hvatačima nečistoća. Nakon toga, deprotektovani peptidi su reagovali u mikro matrici (biočipu) sa 0,5 mM rastvora 2,6-bis (bromometil) piridina ili 2,4,6 tris (bromometil) mezitilena u amonijum bikarbonatu (20 mM, pH 7,9), sa dodatkom acetonitril (1:1 [zapremina/zapremina]). Biočipovi su nežno mućkani u rastvoru tokom 30-60 min, dok nisu potpuno bili pokriveni u rastvoru. Konačno, biočipovi se isperu intenzivno sa viškom Millipor H20 i izvodi se sonikacija u ometajućem-puferu koji sadrži 1% natrijum dodecilsulfata, 0,1% 3-merkaptoetanola, u PBS-u (pH 7,2) na 70°C tokom 30 min, a zatim sonikacijom u milipor H20 još 45 min.
PEPSCAN ELISA- test
[0860]455-bazenčića kreditne kartice formata polietilenskih kartica, koje sadrže kovalentno vezane peptide, inkubirane su sa serumom (npr razblaženom 1: 1000 u rastvoru za blokiranje koji sadrži 5% konjskog seruma [zapremina/zapremina] i 5% ovalbumina [težina/zapremina] ) (4°C, preko noći). Nakon ispiranja, peptidi su inkubirani sa zečjom-anti-humanom Ig peroksidazom (razblaženje 1: 1000, 25°C, 1 sat), i nakon pranja dodat je peroksidazni supstrat (2,2'-azino-di-3-etilbenztiazolin sulfonat i 2 pl/mL 3% H202). Nakon jednog sata, mereno je razvijanje boje sa jednom CCD kamerom i izvesnim sistemom za obradu slike. Podešavanje se sastoji od jedne CCD-kamere sa objektivom od 55 mm (SONY CCD video kamera XC-77RR, Nikon micro-nikkor 55 mm f/2.8 objektiv), adaptera kamere (Sony Kamera adapter DC-77RR) i Softverskog paketa za obradu slike Optimas, verzija 6.5 (Medija Kibernetika, Silver Spring, MD 20910, SAD; Optimas radi na pentium II kompjuterskom sistemu).
Metoda za predstavljanje epitopa
[0861]Pojedinačne aminokiseline su identifikovane pomoću dipeptidnih motiva koji predstavljaju najmanje jedinstvene jedinice u humanoj CD38 aminokiselinskoj sekvenci. Svi dipeptidni motivi prisutni u svakom od 1164 testiranih peptida nagrađeni su ELISA vrednošću dobijenoj za odgovarajuću ceo peptid. Za rangiranje dipeptidnih motiva od jakog do slabog vezivanja, jedan relativni signal je izračunat tako što je ELISA vrednost dobijena za svaki pojedinačni motiv podeljena sa prosečnom ELISA vrednošću od svih 1164 testiranih linearnih i savijenih peptida, a one su sortirane za smanjenje vrednosti. Na ovaj način, razmatrani su doprinosi aminokiselina za konformacione epitope. Za svako od testiranih mAt, svi motivi dipeptida postavljajući bodovanje iznad 2,5 su izabrani (tj ELISA vrednosti za peptide koji sadrže ove motive su bile najmanje 2,5 puta prosečne ELISA vrednosti onih koje su dobijene sa svim peptidima-1164). Podaci su de-konvolutovani u doprinose pojedinačnih aminokiselina predstavljenih na linearnoj CD38 sekvenci pomoću sistema bodovanja. Šetnjom duž linearne CD38 sekvence i pomoću jedinstvenih dipeptidnih jedinica kao referentne tačke, jedna tačkaje dodeljena svaki put kada je prisutna jedna CD38 aminokiselina u ovom setu peptida visokog bodovanja.
[0862]Nađeno je da se -003, 005 i -024 vezuju za regione SKRNIQFSCKNIYR i EKVQTLEAWVIHGG humanog CD38. -003 posebno prepoznaju motive RNIOF i WVIH, -005 posebno prepoznaju motive KRN i VQTL.
PRIMER 23
Enzimska aktivnost
[0863]Enzimska aktivnost humanog CD38 je merena u testu, u suštini kao što je opisano u Graeff et al., J. Biol. Chem. 269,30260-30267 (1994). Ukratko, supstrat NGD<+>(80 pM) je inkubiran sa CD38 (0.6 pg/ml His-obeleženog ekstracelularnog domena humanog CD38, videti Primer 3 u vezi prečišćavanja His-CD38) u puferu koji sadrži 20 mM Tris-HCI, pH 7,0. Proizvodnja cGDPR-a se može pratiti spektrofotometrijski na talasnoj dužini emisije 410 nm (ekscitacija na 300 nm). U ovom primeru je korišćen ekscitacioni filtcr od 340 ± 60 nm i cmisioni filter 430 ± 8 nm.
[0864]Da bi testirali efekat -003, -005 i -024 na enzimsku aktivnost CD38, rekombinantni His-CD38 protein je prethodno inkubiran 15 min na sobnoj temperaturi sa različitim koncentracijama (30, 3, 0,3 i 0,03 pg/ml) različitih antitela pre dodavanja supstrata NGD<+>. Proizvodnja ciklične GDP-riboze (cGDPR) je zabeležena u različitim vremenskim tačkama nakon dodavanja antitela (3, 6, 9, 12, 30, 45, 60, 75 i 90 min).
[0865]Slika 25B pokazuje da -005 ima izražen inhibitorni efekat na proizvodnju cGDPR. Nakon 90 minuta, dodavanjem 30 i 3 pg/ml -005 rezultiralo je u 32% i 34% smanjenju proizvodnje cGDPR (Tabela 9). Slični rezultati su primećeni u nezavisnim eksperimentima korišćenjem različitih serija -005.
[0866]Nije zabeležen inhibitorni efekat na proizvodnju cGPDR nakon dodavanja -003 (Slika 25B, Tabela 9), -024 (Slika 25D, Tabela 9) ili anti-KLH (slika 25A, Tabela 9).
[0867]Na osnovu ovih nalaza za -005 se takođe očekuje da inhibiraju sintezu cikličnih ADP-riboza (cADPR) od NAD<+>. Inhibicija sinteze cADPR se može odrediti prema HPLC metodu opisanom u Munshi et al, J. Biol. Chem. 275. 21566-21571 (2000).
PRIMER 24
Poređenje - 003 i - 005 sa Morphosvs antitelima 3079.
[0868]-003 i -005 antitela su funkcionalno poređena u odnosu na Morphosvs antitela 3079 (TH-3079). Metode za kloniranje i ekspresiju Morphosvs antitela TH-3079 opisane su u Primeru 16. Postupci za CDC su opisani u Primeru 6. Postupci za ADCC su opisani u primeru 5. Slika 26A pokazuje da -005 i - 003 i TH-3079 indukuju CDC-posredovanu lizu CD38 transficiranih CHO ćelija, sa sličnom maksimalnom lizom. Kada se uporede EC5ovrednosti, -005 antitelo je bolje nego TH3079 u indukciji lize CHO-CD38 ćelija, sa 2-puta nižom EC5o(videti Tabelu 10).
[0869]Slika 26B pokazuje da je -005 superiorno u odnosu na TH-3079 u izazivanju CDC posredovane lize Daudi-luciferaze ćelija, sa maksimalnom lizom od strane -005 koja je 2-3 puta veća nego TH3079. Kada se uporede EC50vrednosti, -005 antitelo je slično sa TH-3079 u indukciji lize Daudi-luciferaza ćelija (videti Tabelu 10). -003 ne izaziva značajnu lizu Daudi-luciferaza ćelija koja je CDC-posredovana.
[0870] Slika 26C pokazuje da u ovom eksperimentu -005, -003 i TH-3079 posreduju u lizi Daudi ciljnih ćelija putem ADCC. Nije nađena razlika u (log) EC50 i maksimalnoj lizi (Tabela 11, N = 5).

Claims (25)

1. Antitelo koje se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br:31), a koje se ne vezuje za mutanta humanog CD38 gde je ostatak serina na položaju 274 supstituisan sa ostatkom fenilalanina (SEK ID Br:34) u istom stepenu u kome se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br:31) i koje se ne vezuje za mutanta humanog CD38 gde je ostatak glutamina na položaju 272 supstituisan sa ostatkom arginina (SEK ID Br:33), u istom stepenu u kome se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br:31); pri čemu antitelo prepoznaje motive KRN i VQTL humanog CD38 (SEK ID Br:31).
2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što se navedeno antitelo vezuje za mutanta humanog CD38 gde je ostatak treonina na položaju 237 supstituisan sa ostatkom alanina (SEK ID Br:32), u istom stepenu u kome se vezuje za humani CD38 (SEK ID Br:31).
3. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što antitelo sadrži jedan VHCDR3 koji ima sekvencu kao stoje dalje izneto u SEK ID Br:20.
4. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, što je ono humano monoklonsko antitelo.
5. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva,naznačeno timešto je ono pune dužine IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ili IgM antitelo, kao što je IgGl antitelo, poželjno jedno IgGl,Kantitelo ili IgM antitelo, poželjno jedno IgM,kantitelo.
6. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, što je ono jedan fragment antitela ili jedan lanac antitela.
7. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, dalje sadrži jedan linker helator za vezivanje radioizotopa.
8. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, što je ono u suštinski izolovanom obliku.
9. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8.
10. Ekspresioni vektor koji sadrži jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8.
11. Ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 10, dalje sadrži jednu nukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni region lakog lanca, teškog lanca ili oba i lakih i teških lanaca jednog humanog antitela.
12.Eukariotska ili prokariotska ćelija domaćina koja proizvodi antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8.
13. Imunokonjugat koji sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8 vezano za jedan citotoksični agens, jedan radioizotop, ili jedan lek.
14. Bispecifičan ili multispecifičan molekul koji sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8 i ima vezujuće specifičnosti za jednu humanu efektorsku ćeliju.
15. Bispecifičan ili multispecifičan molekul prema patentnom zahtevu 14, koji sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8 i vezujućih je specifičnosti za CD3, CD4, CD138, IL-15R, membranski vezan ili receptorno vezan TNF-a, jedan humani Fc receptor, ili membranski vezan ili receptorno vezan IL-15.
16. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, imunokonjugat prema patentnom zahtevu 13, ili bispecifičan ili multispecifičan molekul prema patentnim zahtevima 14 ili 15 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
17. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 16 može dodatno da sadrži jedan ili više terapeutskih agenasa.
18. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, imunokonjugat prema patentnom zahtevu 13, bispecifičan ili multispecifičan molekul prema patentnim zahtevima 14 ili 15, farmaceutska kompozicija prema patentnim zahtevima 16 ili 17, ili ekspresioni vektor prema patentnim zahtevima 10 ili 11, za upotrebu kao lek.
19. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, imunokonjugat prema patentnom zahtevu 13, bispecifičan ili multispecifičan molekul prema patentnim zahtevima 14 ili 15, farmaceutska kompozicija prema patentnim zahtevima 16 ili 17, ili ekspresioni vektor prema patentnim zahtevima 10 ili 11, za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije bolesti ili poremećaja u kome učestvuju ćelije koje izražavaju CD38, pri čemu je bolest ili poremećaj izabran iz grupe koja se sastoji od B-ćelijskih limfoma/leukemija uključujući prekusornu B ćelijsku limfoblastnu leukemiju/limfome i B ćelijske nehočkinske limfome; akutnu limfoblastnu leukemiju; neoplazme odraslih B ćelija uključujući B ćelijsku hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL)/sitnoćelijski limfocitni limfom (SLL); B ćelijsku akutnu limfocitnu leukemiju; B ćelijsku prolimfocitnu leukemiju; limfoplazmacitni limfom; mantle ćelijski limfom (MCL); folikularni limfom (FL) uključujući niskog stepena, srednjeg-stepena i visokog stepena FL; folikularni centralni limfom kože; marginalno zonalni B ćelijski limfom uključujući MALT tip, nodalni i splenični tip; leukemiju dlakastih ćelija; difuzni krupno ćelijski B limfom; Burkitt-ov limfom; plazmacitom; plazma ćelijski mijelom; plazma ćelijsku leukemiju; post-transplatacioni limfoproliferativni poremećaj; Valdcnstromovu makroglobulincmiju; plazma ćelijske leukemije; anaplastični krupnoćelijski limfom (ALCL); multipli mijelom; Hočkinov limfom; odrasle T ćelijske i NK ćelijske neoplazme uključujući T ćelijsku prolimfocitnu leukemiju; T ćelijsku krupnogranularnu limfocitnu leukemiju, agresivnu NK ćelijsku leukemiju; adultnu T ćelijsku leukemiju/limfom; ekstranodalni NK/T ćelijski limfom; nazalni tip, enteropatijski-tip T ćelijskog limfoma; hepatosplenični T ćelijski limfom; subkutani panikulitisu-sličan T ćelijski limfom; blastni NK ćelijski limfom; Mvcosis Fungoides/Sezarv sindrom; primarni kutani CD30 pozitivni T ćelijski limfoproliferativni poremećaji uključujući kutani anaplastični krupnoćelijski limfom C-ALCL, limfomatoidnu papulozu i granične lezije; angioimunoblastni T ćelijski limfom, periferni T ćelijski limfom nespecifikovan; anaplastični krupnoćelijski limfom; akutnu mijeloidnu leukemiju uključujući akutnu promijelocitnu leukemiju; i hronične mijeloproliferativne bolesti uključujući hroničnu mijeloidnu leukemiju.
20. Antitelo, imunokonjugat, bispecifičan ili multispecifičan molekul, farmaceutska kompozicija ili ekspresioni vektor za upotrebu prema patentnom zahtevu 19, pri čemu je B ćelijski nehočkinski limfom izabran iz grupe koja se sastoji od limfomatoidnih granulomatosisa; primarnog efuzionog limfoma; intravaskularnog krupnoćelijskog B limfoma, medij astinalnog krupnoćelijskog B limfoma; bolesti teškog lanca koje uključuju y, p i a bolesti; limfome uzrokovane terapijom sa imunosupresivnim agensima uključujući ciklosporinom-indukovan limfom; i metotreksatom-indukovan limfom.
21. Antitelo, imunokonjugat, bispecifičan ili multispecifičan molekul, farmaceutska kompozicija ili ekspresioni vektor za upotrebu prema patentnom zahtevu 19, pri čemu je bolest ili poremećaj multipli mijelom.
22. Antitelo, imunokonjugat, bispecifičan ili multispecifičan molekul, farmaceutska kompozicija ili ekspresioni vektor za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 18 do 21, naznačen time da postupak obuhvata primenu jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa na subjektu.
23. Antitelo, imunokonjugat, bispecifičan ili multispecifičan molekul, farmaceutska kompozicija ili ekspresioni vektor za upotrebu prema patentnom zahtevu 22, pri čemu su jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa izabrani od jednog hemoterapeutskog agensa, jednog anti-inflamatornog agensa, ili jednog imunosupresivnog i/ili imunomodulatornog agensa.
24. Antitelo, imunokonjugat, bispecifičan ili multispecifičan molekul, farmaceutska kompozicija ili ekspresioni vektor za upotrebu prema patentnom zahtevu 22, pri čemu su jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa izabrani iz grupe koja se sastoji od cisplatina, gefitiniba, cetuksimaba, rituksimaba, bevacizumaba, erlotiniba, bortezomiba, talidomida, pamidronata, zolcdronatnc kiseline, klodronata, riscndronata, ibandronata, ctidronata, alendronata, tiludronata, arsen trioksida, lenalidomida, filgrastima, pegfilgrastima, sargramostima, suberoilanilid hidroksamične kiseline i SCIO-460.
25. In vitrometod za detekciju prisustva CD38 antigena, ili ćelije koja eksprimira CD38, u uzorku koji obuhvata: a) dovođenje u kontakt uzorka sa antitelom prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8 pod uslovima koji dozvoljavaju obrazovanje kompleksa između antitela i CD38; b) detekciju formiranja kompleksa.
RS20161147A 2005-03-23 2006-03-23 Antitela protiv cd38 za lečenje multiplog mijeloma RS55442B1 (sr)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200500429 2005-03-23
US66757905P 2005-04-01 2005-04-01
US69616305P 2005-07-01 2005-07-01
US72856105P 2005-10-20 2005-10-20
PCT/DK2006/000166 WO2006099875A1 (en) 2005-03-23 2006-03-23 Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma
EP06722861.9A EP1866338B1 (en) 2005-03-23 2006-03-23 Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55442B1 true RS55442B1 (sr) 2017-04-28

Family

ID=50644285

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20161147A RS55442B1 (sr) 2005-03-23 2006-03-23 Antitela protiv cd38 za lečenje multiplog mijeloma

Country Status (12)

Country Link
KR (1) KR20140033240A (sr)
BE (1) BE2017C062I2 (sr)
DK (1) DK1866338T3 (sr)
ES (2) ES2644982T3 (sr)
HU (2) HUE030783T2 (sr)
LT (2) LT2567976T (sr)
NZ (2) NZ600059A (sr)
PL (1) PL1866338T3 (sr)
PT (2) PT2567976T (sr)
RS (1) RS55442B1 (sr)
SG (1) SG10201610317VA (sr)
UA (2) UA98756C2 (sr)

Also Published As

Publication number Publication date
ES2606762T3 (es) 2017-03-27
LT2567976T (lt) 2017-12-11
KR20140033240A (ko) 2014-03-17
NZ625944A (en) 2016-01-29
UA98756C2 (ru) 2012-06-25
DK1866338T3 (da) 2017-01-02
HUE030783T2 (en) 2017-06-28
HUE034962T2 (en) 2018-03-28
BE2017C062I2 (sr) 2025-12-03
LT1866338T (lt) 2017-01-25
SG10201610317VA (en) 2017-02-27
PL1866338T3 (pl) 2017-04-28
UA116520C2 (uk) 2018-04-10
PT1866338T (pt) 2016-12-14
PT2567976T (pt) 2017-10-19
ES2644982T3 (es) 2017-12-01
NZ600059A (en) 2016-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240132620A1 (en) Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma
US20090076249A1 (en) Antibodies against CD38 for treatment of multiple myeloma
RS55442B1 (sr) Antitela protiv cd38 za lečenje multiplog mijeloma
HK1236545A1 (en) Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma
HK1179979B (en) Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma
HK1183047A (en) Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma
HK1183047B (en) Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma
HK1107826B (en) Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma
HK1179979A (en) Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma