PT2567976T - Anticorpos contra cd38 para tratamento do mieloma múltiplo - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"ANTICORPOS CONTRA CD38 PARA TRATAMENTO DO MIELOMA MÚLTIPLO"

ÁREA DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com anticorpos ligando-se a CD38, cujos anticorpos têm caracteristicas especificas e que são úteis para tratamento inter alia do mieloma múltiplo.

ANTECEDENTES 0 mieloma múltiplo é uma malignidade das células B caracterizada pela acumulação latente na medula óssea de células plasmáticas secretoras com um indice proliferativo baixo e um tempo de vida prolongado. A doença ataque em última instância os ossos e medula óssea, resultando em múltiplos tumores e lesões ao longo do sistema esquelético.

Aproximadamente 1% de todos os cancros, e ligeiramente mais do que 10% de todas as malignidades hematológicas, podem ser atribuídos ao mieloma múltiplo (MM). A incidência do MM aumenta na população envelhecida, com a idade mediana aquando do diagnóstico sendo cerca de 61 anos.

As terapias correntemente disponíveis para o mieloma múltiplo incluem quimioterapia, transplante de células estaminais, Thalomid® (talidomida), Velcade® (bortezomib), Aredia® (pamidronato) e Zometa® (ácido zoledrónico). Os protocolos de tratamento correntes, que incluem uma combinação de agentes quimioterapêuticos tais como vincristina, BCNU, melfalano, ciclofosfamida, adriamicina, e prednisona ou dexametasona, originam uma taxa de remissão completa de somente cerca de 5%, e a sobrevivência mediana é aproximadamente 36-48 meses a partir do momento de diagnóstico. Avanços recentes usando quimioterapia com dose elevada seguida por transplante autólogo de células da medula óssea ou mononucleares do sangue periférico têm aumentado a taxa de remissão completa e duração da remissão. Todavia, a sobrevivência global tem sido somente ligeiramente prolongada, e não foi obtida nenhuma evidência para uma cura. Em última instância, todos os pacientes com MM recaem, mesmo sob terapia de manutenção com interferão-alfa (IFN-α) sozinho ou em combinação com esteroides. A eficácia dos regimes de tratamento quimioterapêutico disponíveis para o MM é limitada pela baixa taxa de proliferação de células e desenvolvimento de resistência a múltiplos fármacos. Para mais do que 90% dos pacientes com MM, a doença torna-se quimiorresistente. Como resultando estão a ser procurados regimes de tratamento alternativos dirigidos à imunoterapia adotiva visando antigénios da superfície em células plasmáticas. CD38 é um exemplo de um antigénio expresso em tais células plasmáticas malignas, e é expresso numa variedade de doenças hematológicas malignas, incluindo mas não se restringindo a mieloma múltiplo, leucemia linfocítica crónica de células B, leucemia linfocítica aguda de células B, macroglobulinemia de Waldenstrõm, amiloidose sistémica primária, linfoma de células do manto, leucemia pró-linfocítica/mielocítica, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, linfoma folicular, leucemia de células NK e leucemia de células plasmáticas. A expressão de CD38 foi descrita em células epiteliais/endoteliais de origem diferente, incluindo epitélio glandular na próstata, células da ilhota no pâncreas, epitélio ductal nas glândulas, incluindo glândula parótida, células epiteliais bronquiais, células nos testículos e ovários e epitélio tumoral no adenocarcinoma colorretal. As doenças, onde a expressão de CD38 poderia estar envolvida, incluem mas não estão restringidas a carcinomas broncoepiteliais do pulmão, cancro da mama (evoluindo a partir da proliferação maligna de revestimento epitelial em duetos e lóbulos da mama), tumores pancreáticos, evoluindo a partir das células B (insulinomas), tumores evoluindo a partir do epitélio no intestino (p.ex., adenocarcinoma e carcinoma das células escamosas). No CNS, os neuroblastomas expressam CD38. Outras doenças incluem carcinoma na glândula prostática, seminomas nos testículos e cancros dos ovários.

Normalmente, CD38 é expresso por células hematopoiéticas e em tecidos sólidos. No que diz respeito às células hematopoiéticas, a maioria dos timócitos medulares é CD38+, as células T e B em repouso e circulação são CD38-, e as células ativadas são CD38+. CD38 é também expresso em aproximadamente 80% de células NK em repouso e monócitos, e em linfoblastos do centro germinal nos linfonodos, células B plasmáticas e algumas células intrafoliculares. CD38 pode ser também expresso por células dendríticas. Uma proporção significativa de células da medula óssea normais, células precursoras particulares, expressa CD38. Adicionalmente, 50-80% de células sanguíneas do cordão umbilical são CD38+ e permanecem assim em sangue humano durante os primeiros dois a três anos de vida. Adicionalmente às células precursoras linfoides, CD38 é também expresso em eritrócitos e em plaquetas.

No que diz respeito aos tecidos sólidos, CD38 é expresso no intestino por células intraepiteliais e linfócitos da lâmina própria, por células de Purkinje e emaranhados neurofibrilares no cérebro, por células epiteliais na próstata, células β no pâncreas, osteoclastos no osso, células da retina no olho, e sarcolema de músculo liso e estriado.

As funções atribuídas ao CD38 incluem tando mediação de recetores em eventos de adesão e sinalização e atividade (ecto-) enzimática. Como uma ectoenzima, CD38 usa NAD+ como substrato para a formação de ADP-ribose cíclica (cADPR) e ADPR, mas também de nicotinamida e ácido nicotínico-adenina dinucleótido fosfato (NAADP). Mostrou-se também que cADPR atua como segundo mensageiro para mobilização de Ca2+ a partir do retículo endoplasmático. Adicionalmente à sinalização através de Ca2+, a sinalização de CD38 ocorre através de conversa cruzada com complexos antigénio-recetor em células T e B ou outros tipos de complexos de recetores, p. ex., moléculas do MHC, e está deste modo envolvida em várias respostas celulares, mas também na operação e secreção de IgGl.

Anticorpos anti-CD38 estão descritos na literatura, por exemplo em Lande R, et al., Cell Immunol. 220 (1) 30-8 (2002), Ausiello CM, et al., Tissue Antigens. 56 (6), 539- 47 (2000), e Cotner T, et al., Int J Immunopharmacol. 3 (3), 255-68 (1981). Ellis, J. H. et al (J. Immunol., 1995, 155: 925-937) descrevem um mAb anti-CD38 de ratinho designado AT13/5 e uma forma humanizada de AT 13/5. CD38 tem um número de funções, que podem ou não ser ativadas por uma ligação de molécula a CD38. Por exemplo, o anticorpo anti-CD38 de ratinho IB4 tem propriedades antagonistas em relação ao CD38 (Ausiello CM, et al., supra). Mostra-se que IB4 induz ativação de células T como indicado por mobilização de Ca2+ em células de Jurkat (Zubiaur M, et al., J Immunol. 159 (1), 193-205 (1997), induz proliferação significativa de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), induz libertação de níveis de IL-6 significativos e induz libertação de niveis de IFN-γ detetáveis (Lande, Zubiaur Morra, Ausiello supra).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um anticorpo ligando-se a CD38 humano, em que o referido anticorpo compreende regiões variáveis de cadeia leve humana e cadeia pesada humana, em que a região variável de cadeia leve compreende uma CDR1 de Vl tendo a sequência como apresentada em SEQ ID No: 13, uma CDR2 de VL tendo a sequência como apresentada em SEQ ID No: 14 e uma CDR3 de VL tendo a sequência como apresentada em SEQ ID No: 15, e a região variável de cadeia pesada compreende uma CDR1 de VH tendo a sequência como apresentada em SEQ ID No: 18, uma CDR2 de VH tendo a sequência como apresentada em SEQ ID No: 19 e uma CDR3 de VH tendo a sequência como apresentada em SEQ ID No: 20.

Qualquer anticorpo da invenção pode ser um anticorpo monoclonal humano.

Qualquer anticorpo da invenção pode ser caracterizado por ser um anticorpo para IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, ou IgM de comprimento total. O anticorpo pode ser um anticorpo para IgGl,K de comprimento total ou um anticorpo para IgM,κ de comprimento total.

Um anticorpo da invenção pode compreender uma região VH tendo a sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID No: 17.

Um anticorpo da invenção pode compreender uma região VH tendo a sequência de aminoácidos abrangendo a região CDR1 de VH - CDR3 de VH de SEQ ID No: 17.

Um anticorpo da invenção pode compreender uma região VL tendo a sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID No: 12.

Um anticorpo da invenção pode ser codificado por: (i) ácidos nucleicos de cadeia leve humana e cadeia pesada humana compreendendo sequências de nucleótidos nas suas regiões variáveis como apresentadas em SEQ ID No: 11 e SEQ ID No: 16, respetivamente; ou (ii) ácidos nucleicos de cadeia leve humana e cadeia pesada humana compreendendo sequências de nucleótidos nas suas regiões variáveis, que são modificações de sequências conservativas das sequências como apresentadas em (i) .

Um anticorpo da invenção pode ser um fragmento de anticorpo ou um anticorpo de cadeia única.

Um anticorpo da invenção pode estar numa forma substancialmente isolada.

Um anticorpo da invenção pode compreender adicionalmente um ligante quelante para anexação de um radioisótopo. A presente invenção proporciona também um ácido nucleico isolado codificando um anticorpo da invenção. A presente invenção proporciona também um vetor de expressão compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificando um anticorpo da invenção. A presente invenção proporciona também uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica que produz um anticorpo da invenção. A presente invenção proporciona também um imunoconjugado compreendendo qualquer um dos anticorpos acima descritos ligado a um agente citotóxico, um radioisótopo, ou um fármaco. A presente invenção proporciona também uma molécula biespecifica ou multiespecifica compreendendo um anticorpo da invenção e uma especificidade de ligação quanto a uma célula efetora humana. A presente invenção proporciona também uma composição farmacêutica compreendendo anticorpos, imunoconjugados, ou moléculas biespecificas ou multiespecificas da invenção e um transportador farmaceuticamente aceitável. A presente invenção proporciona também anticorpos, imunoconjugados, moléculas biespecificas ou multiespecificas ou vetores de expressão para uso como um medicamento. A presente invenção proporciona também anticorpos, imunoconjugados, composições farmacêuticas, moléculas biespecificas ou multiespecificas ou vetores de expressão da invenção para uso num método de tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio envolvendo células expressando CD38, em que a doença ou distúrbio é selecionado do grupo consistindo em linfoma/leucemias de células B incluindo leucemia linfoblástica/linfoma de células B precursoras e linfomas de não Hodgkin de células B; leucemia linfoblástica aguda; neoplasmas de células B maduras incluindo leucemia linfocitica crónica (CLL)/linfoma linfocitico pequeno (SLL) de células B; leucemia linfocitica aguda de células B; leucemia pró-linfocitica de células B; linfoma linfoplasmacitico; linfoma de células do manto (MCL); linfoma folicular (FL) incluindo FL de grau baixo, grau intermédio e grau elevado; linfoma de centros foliculares cutâneos; linfoma de células B da zona marginal incluindo tipo MALT, tipo nodal e esplénico; leucemia de células pilosas; linfoma de células B grandes difusas; linfoma de Burkitt; plasmacitoma; mieloma de células plasmáticas; leucemia de células plasmáticas; distúrbio linfoproliferativo pós-transplante; macroglobulinemia de Waldenstrõm; leucemias de células plasmáticas; linfoma de células grandes anaplásicas (ALCL); mieloma múltiplo; linfoma de Hodgkin; neoplasmas de células T e células NK maduras incluindo leucemia pró-linfocitica de células 1; leucemia granular grande de células T; leucemia agressiva de células NK; leucemia/linforna de células T adultas; linfoma de células NK/T extranodais; linfoma de células T do tipo nasal, tipo enteropatia; linfoma de células T hepatoesplénicas; linfoma de células T tipo paniculite subcutânea; linfoma de células NK blásticas; Micose Fungoide/Sindrome de Sézary; distúrbios linfoproliferativos de células T positivos quanto a CD38 cutâneos primários incluindo linfoma de células grandes anaplásicas cutâneas C-ALCL, papulose linfomatoide e lesões limite; linfoma de células T angioimunoblásticas, linfoma de células T periféricas não especificado; linfoma de células grandes anaplásicas; leucemia mieloide aguda incluindo leucemia pró-mielocitica aguda; e doenças mieloproliferativas crónicas incluindo leucemia mieloide crónica. A doença pode ser linfoma de não Hodgkin de células B, mieloma múltiplo, leucemia linfoblástica aguda ou leucemia linfocitica crónica de células B. Qualquer tal método pode compreender administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais ao sujeito, tal como um agente quimioterapêutico, um agente anti-inflamatório, ou um agente imunossupressor e/ou imunomodulador. 0 um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem ser selecionados do grupo consistindo em cisplatina, gefitinib, cetuximab, rituximab, bevacizumab, erlotinib, bortezomib, talidomida, pamidronato, ácido zoledrónico, clodronato, risendronato, ibandronato, etidronato, alendronato, tiludronato, trióxido arsénico, lenalidomida, filgrastim, pegfilgrastim, sargramostim, ácido hidroxâmico de suberoílanilida, e SCIO-469. A invenção proporciona também um método in vitro para deteção da presença de antigénio CD38, ou uma célula expressando CD38, numa amostra compreendendo: a) contacto da amostra um anticorpo da invenção sob condições que permitem a formação de um complexo entre o péptido e CD38; e b) deteção da formação de um complexo. A invenção proporciona também ligação de um anticorpo anti-idiotípico a um anticorpo da invenção. A ligação de anticorpo a CD38 humano pode compreender uma região Vl tendo pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 95%, de identidade de sequências de aminoácidos com a sequência de acordo com SEQ ID No: 12. A ligação de anticorpo a CD38 humano pode compreender uma região VH tendo pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 95%, de identidade de sequências de aminoácidos com a sequência de acordo com SEQ ID No: 17. A ligação de anticorpo a CD38 humano pode compreender uma região Vh tendo 1-5, tal como 1-3, substituições, eliminações ou adições de aminoácidos em comparação com a sequência como apresentada em SEQ ID No: 17. A ligação de anticorpo a CD38 humano pode compreender uma região Vl como definida acima e uma região VH como definida acima. A ligação de anticorpo a CD38 humano pode ser uma que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31), e que não se liga a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído por um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), no mesmo grau que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31). A ECso da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído por um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), pode ser menor do que 50%, tal como menor do que 10%, menor do que 5% ou menor do que 1% da EC50 da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31) . A ligação de anticorpo a CD38 humano pode sr uma que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31), e que não se liga a CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído por um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33), no mesmo grau que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31). A EC50 da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído por um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33), pode ser menor do que 50%, tal como menor do que 10%, menor do que 5% ou menor do que 1% da EC50 da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31). O referido anticorpo pode ser um que se liga a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído por um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32), no mesmo grau que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31) . A EC50 da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído por um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32), pode corresponder a 75% - 125% da EC50 da ligação do péptido a CD38 humano (SEQ ID No: 31). É descrito aqui um anticorpo que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31) pode ser um que possui as seguintes características de ligação: (i) liga-se a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído por um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), no mesmo grau que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31), (ii) liga-se a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído por um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33), no mesmo grau que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31), e (iii) liga-se a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído por um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32), no mesmo grau que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31). 0 anticorpo que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31) pode ser um que possui as seguintes características de ligação: (i) não se liga a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído por um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), no mesmo grau que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31), (ii) não se liga a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído por um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33), no mesmo grau que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31), (iii) liga-se a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído por um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32), no mesmo grau que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31). A EC50 pode ser determinada por uso de um ELISA como descrito no Exemplo 17 da especificação. 0 anticorpo pode ligar-se especificamente à região SKRNIQFSCKNIYR e à região EKVQTLEAWVIHGG de CD38 humano (SEQ ID No: 31). A ligação de anticorpo a CD38 humano pode possuir uma ou mais das seguintes características: (i) atua como um antagonista de CD38; (ii) não induz proliferação significativa de células mononucleares do sangue periférico como determinada pelo método descrito no Exemplo 18 da especificação; (iii) não induz libertação significativa de IL-6 por monócitos humanos ou células mononucleares do sangue periférico como determinada pelo método descrito no Exemplo 19 da especificação; (iv) não induz libertação detetável de IFN-γ por células T humanas ou células mononucleares do sangue periférico como determinada pelo método descrito no Exemplo 20 da especificação; (v) é internalizado por células expressando CD38; tal como internalizado por células CHO-CD38 no espaço de 5 a 15 minutos a 37°C pelo método como descrito no Exemplo 12 da especificação; (vi) induz ADCC; tal como com um valor de EC50 de abaixo de 15 ng/mL, tal como abaixo de 10 ng/mL em células Daudi-luc e com um valor de EC50 de abaixo de 75 ng/mL, tal como abaixo de 50 ng/mL, 30 ng/mL ou 10 ng/mL em células de MM como determinado pelo método descrito no exemplo 5 da especificação; (vii) induz CDC na presença de complemento; tal como com um valor de EC50 de abaixo de 5 yg/mL, tal como abaixo de 1 yg/mL em células Daudi-luc ou CD38-CHO pelo método descrito no Exemplo 6 da especificação; (viii) inibe a sintese de cGDPR; (ix) inibe a sintese de cADPR; (x) liga-se a CD38 humano com uma afinidade (KD) de abaixo de IO-8 M, tal como na gama de IO-8 M a lCh11 M, por exemplo na gama de 7 x IO-9 M a IO-10 M, como determinada por ressonância de plasmão de superfície como descrita no Exemplo 20 da especificação. O anticorpo pode inibir a síntese de cGDPR em pelo menos 25%, tal como pelo menos 30% após 90 minutos a uma concentração de 3 yg/mL como determinada por método espetrofotométrico descrito no Exemplo 23 da especificação. O anticorpo pode inibir a síntese de cADPR em pelo menos 25%, tal como pelo menos 30% após 90 minutos a uma concentração de 3 yg/mL como determinado pelo método de descrito em Munshi et al., J. Biol. Chem. 275, 21566-21571 (2000) . O anticorpo monoclonal humano pode compreender (i) uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada derivada de uma sequência da linha germinativa de Hvl253/3M28 (VHI) de humano e uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve derivada de uma sequência da linha germinativa de L15 (VkI) de humano; ou (ii) uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada derivada de uma sequência da linha germinativa de VH3-DP-47/V3-23 (VHIII) de humano e uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve derivada de uma sequência da linha germinativa de L6 (VkI) de humano. 0 anticorpo pode ser glicosilado numa célula eucariótica. 0 vetor de expressão pode compreender uma sequência de nucleótidos de VL de SEQ ID No: 11 e uma sequência de nucleótidos de VH de SEQ ID No: 16. A célula hospedeira eucariótica pode compreender um tal vetor de expressão, ou um vetor de expressão compreendendo uma sequência de nucleótidos de VL de SEQ ID No: 11 e um vetor de expressão codificando uma sequência de nucleótidos de VH de SEQ ID No: 16.

Os vetores de expressão podem compreender adicionalmente uma sequência de nucleótidos codificando a região constante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou ambas as cadeias leves e pesadas de um anticorpo humano. A sequência de nucleótidos codificando a região constante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou ambas as cadeias leves e pesadas de um anticorpo humano podem codificar um anticorpo para IgGl. A molécula biespecifica ou multiespecifica pode compreender um anticorpo da invenção e uma especificidade de ligação quanto a CD3, CD4, CD138, IL-15R, TNF-cx ligado à membrana ou ligado a recetores, um recetor de Fc humano, ou IL-15 ligada à membrana ou ligada a recetores. A composição farmacêutica pode compreender um ou mais agentes terapêuticos adicionais. 0 um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem ser selecionados de um agente quimioterapêutico, um agente anti-inflamatório, ou um agente imunossupressor e/ou imunomodulador. 0 um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem ser selecionados de um grupo consistindo em cisplatina, gefitinib, cetuximab, rituximab, bevacizumab, erlotinib, bortezomib, talidomida, pamidronato, ácido zoledrónico, clodronato, risendronato, ibandronato, etidronato, alendronato, tiludronato, trióxido arsénico, lenalidomida, filgrastim, pegfilgrastim, sargramostim, ácido hidroxâmico de suberoilanilida, e SCIO-469. 0 anticorpo pode estar compreendido num estojo para deteção da presença de antigénio CD38, ou uma célula expressando CD38, numa amostra. 0 anticorpo anti-idiotípico pode ser usado para deteção do nivel de um anticorpo da invenção numa amostra. 0 anti anti-idiotipico pode ser usado para deteção do nivel de anticorpo monoclonal humano contra CD38 numa amostra.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura IA mostra a ligação de -003, -005 e do anticorpo de controlo de isotipo HuMab-KLH a células CHO transfectadas com CD38 (CHO-CD38) como medida por citometria de fluxo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 4. A Figura 1B mostra a ligação de -024 e HuMab-KLH a células CHO transfectadas com CD38 (CHO-CD38) como medida por citometria de fluxo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 4. A Figura 2A mostra a ligação de -003, -005 e HuMab-KLH a células Daudi como medida por citometria de fluxo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 4. A Figura 2B mostra a ligação de -024 e HuMab-KLH a células Daudi como medida por citometria de fluxo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 4. A Figura 3 mostra a ligação de -003, -005, -024 e HuMab-KLH a células de mieloma múltiplo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 4. A Figura 4A mostra a capacidade de -003 e -005 de induzir lise de células Daudi por ADCC em comparação com rituximab e HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 5. A Figura 4B mostra a capacidade de -024 de induzir lise de células por ADCC em comparação com HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 5. A Figura 5A mostra a capacidade de -003, -005 e -024 de induzir lise de células tumorais de mieloma múltiplo frescas por ADCC em comparação com HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 5. A Figura 5B mostra a capacidade de -003, -005 e -024 de induzir lise de células tumorais de leucemia de células plasmáticas frescas por ADCC em comparação com HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 5. A Figura 6 mostra a capacidade de -003 e -005 de induzir lise de JK6L (uma linha de células de mieloma múltiplo) por ADCC em comparação com HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 5. A Figura 7 mostra a capacidade de -003 e -005 de induzir lise de AMO-1 (uma linha de células de mieloma múltiplo) por ADCC em comparação com HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 5. A Figura 8 mostra a lise mediada por CDC de células Daudi-luc induzida por -003 e -005 em comparação com

HuMab-KLH. 0 cenário experimental está descrito no Exemplo 6. A Figura 9A mostra a lise mediada por CDC de células CHO-CD38 induzida por -003 e -005 em comparação com HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 6. A Figura 9B mostra a lise mediada por CDC de células CHO-CD38 induzida por -024 em comparação com HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 6. A Figura 10A mostra a lise mediada por CDC de células tumorais refratárias a 3% na presença de -003, -005 e HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 6. A Figura 10B mostra a lise mediada por CDC de células tumorais refratárias a 9% na presença de -003, -005 e HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 6. A Figura 10C mostra a lise mediada por CDC de células tumorais a 30-40% na presença de -003, -005 e HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 6. A Figura 10D mostra a lise mediada por CDC de células tumorais a 70% na presença de -003, -005 e HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 6. A Figura 10E mostra a lise mediada por CDC de células de mieloma múltiplo na presença de -024 e HuMab-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 6. A Figura 11 mostra que -003 e -005 não bloqueiam de modo cruzado a ligação a CD38. O cenário experimental está descrito no Exemplo 7. A Figura 12A mostra a coloração imunohistológica de macrófagos, linfócitos e células B plasmáticas com -003. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10. A Figura 12B mostra a coloração imunohistológica de epitélio bronquial com -003. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10. A Figura 12C mostra a coloração imunohistológica de miócitos com -003. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10. A Figura 12D mostra a coloração imunohistológica de tecido linfoide de cinomolgo com -003. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10. A Figura 13A mostra a coloração imunohistológica de macrófagos, linfócitos e células B plasmáticas com -005. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10. A Figura 13B mostra a coloração imunohistológica de epitélio bronquial com -005. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10. A Figura 13C mostra a coloração imunohistológica de miócitos com -005. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10. A Figura 13D mostra a coloração imunohistológica de tecido linfoide de cinomolgo com -005. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10. A Figura 14A mostra coloração imunohistológica do endotélio de fígado com CD31. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10. A Figura 14B mostra coloração imunohistológica do endotélio de fígado com vWF. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10. A Figura 14C mostra coloração imunohistológica do endotélio de fígado com anti-KLH. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10. A Figura 14D mostra coloração imunohistológica do endotélio de fígado com -003. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10. A Figura 14E mostra coloração imunohistológica do endotélio de fígado com -005. O cenário experimental está descrito no Exemplo 10. A Figura 15A mostra a reatividade cruzada de -003 e -005 em comparação com HuMab-KLH em linfócitos de cinomolgo como medida por citometria de fluxo. 0 cenário experimental está descrito no Exemplo 11. A Figura 15B mostra a reatividade cruzada de -003 e -005 em comparação com HuMab-KLH em monócitos de cinomolgo como medida por citometria de fluxo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 11. A Figura 15C mostra a reatividade cruzada de -003 e -005 em comparação HuMab-KLH em PBMCs de macaco rhesus como medida por citometria de fluxo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 11. A Figura 16A mostra a internalização de -003 como medida por extinção de EtBr. O cenário experimental está descrito no Exemplo 12. A Figura 16B mostra a internalização de -005 como medida por extinção de EtBr. O cenário experimental está descrito no Exemplo 12. A Figura 17A mostra a inibição causada por -003 e -005 em comparação com um anticorpo anti-CD20 monoclonal (rituximab) e HuMab-KLH do crescimento de células tumorais num cenário preventivo como medida por imagiologia de luciferase por SCID in vivo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 13. A Figura 17B mostra a inibição causada por -003 e -005 em comparação com um anticorpo anti-CD20 monoclonal (rituximab) e HuMab-KLH do crescimento de células tumorais no cenário terapêutico I como medida por imagiologia de luciferase por SCID in vivo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 13. A Figura 17C mostra a inibição causada por -003 e -005 em comparação com um anticorpo anti-CD20 monoclonal (rituximab) e HuMab-KLH do crescimento de células tumorais no cenário terapêutico II como medida por imagiologia de luciferase por SCID in vivo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 13. A Figura 17D mostra a inibição do crescimento de células tumorais por -003 e -024 em comparação com HuMab-KLH no cenário terapêutico III como medida por imagiologia de luciferase por SCID in vivo. O cenário experimental está descrito no Exemplo 13. A Figura 18 mostra a indução de apoptose por -003 e -005 em comparação com um anticorpo anti-CD20 monoclonal (rituximab) e HuMab-KLH sem ou com reticulação. O cenário experimental está descrito no Exemplo 14. A Figura 19 mostra a pontuação histológica para células positivas quanto a CD38 em xenoenxertos de ratinho RA-SCID implantados ao dia 14, após tratamento com anti-KLH (HuMab-KLH) ou -005. Os métodos estão descritos no Exemplo 15. A Figura 20 mostra a pontuação histológica para células positivas quanto a CD138 em xenoenxertos de ratinho RA-SCID implantados ao dia 14, após tratamento com anti-KLH ou -005. Os métodos estão descritos no Exemplo 15. A Figura 21 mostra coloração de CD38 de células B em xenoenxertos antes da implantação (A), ou após tratamento com anti-KLH (B), ou -005 (C). Os métodos estão descritos no Exemplo 15. A Figura 22 mostra coloração de CD138 de células B em xenoenxertos antes da implantação (A), ou após tratamento com anti-KLH (B), ou -005 (C). Os métodos estão descritos no Exemplo 15. A Figura 23 mostra a ligação de -003 e -005 a CD38 de tipo selvagem e humano mutante como medida por ELISA. 23A: Ligação de -003 e -005 a CD38 humano mutante T237A. 23B: Ligação de -003 e -005 a CD38 humano mutante Q272R. 23C: Ligação de -003 e -005 a CD38 humano mutante S274F. Os métodos estão descritos no Exemplo 17. A Figura 24 mostra o efeito de -003 e -005 em comparação com HuMab-KLH na proliferação (A), produção de IL-6 (B) e produção de IFN-γ (C) de PBMCs humanas. Os métodos estão descritos no Exemplos 18, 19 e 20, respetivamente. A Figura 25 mostra a produção enzimática de cGDPribose na presença de várias concentrações de -003 (B), -005 (C), -024 (D) ou anti-KLH (A) . Os métodos estão descritos no

Exemplo 23. A Figura 26 mostra a comparação entre -003, -005 e anticorpo TH-3079 da Morphosys na CDC de células CHO-CD38 (26A), CDC de células Daudi (26B), e ADCC de células Daudi (26C). SEQ ID No: 1 é a sequência de nucleótidos da região Vl do anticorpo -003. SEQ ID No: 2 é a sequência de aminoácidos da região Vl do anticorpo -003. SEQ ID No: 3 é a sequência de aminoácidos da CDRl de VL do anticorpo -003 compreendendo os aa 24-34 de SEQ ID No: 2 . SEQ ID No: 4 é a sequência de aminoácidos da CDR2 de Vl do anticorpo -003 compreendendo os aa 50-56 de SEQ ID No: 2 . SEQ ID No: 5 é a sequência de aminoácidos da CDR3 de Vl do anticorpo -003 compreendendo os aa 89-97 de SEQ ID No: 2 . SEQ ID No: 6 é a sequência de nucleótidos da região Vh do anticorpo -003. SEQ ID No: 7 é a sequência de aminoácidos da região Vh do anticorpo -003. SEQ ID No: 8 é a sequência de aminoácidos da CDRl de Vh do anticorpo -003 compreendendo os aa 31-35 de SEQ ID No: 7. SEQ ID No: 9 é a sequência de aminoácidos da CDR2 de Vh do anticorpo -003 compreendendo os aa 50-66 de SEQ ID No: 7. SEQ ID No: 10 é a sequência de aminoácidos da CDR3 de Vh do anticorpo -003 compreendendo os aa 99-109 de SEQ ID No: 7. SEQ ID No: 11 é a sequência de nucleótidos da reqião Vl do anticorpo -005. SEQ ID No: 12 é a sequência de aminoácidos da região Vl do anticorpo -005. SEQ ID No: 13 é a sequência de aminoácidos da CDR1 de Vl do anticorpo -005 compreendendo os aa 24-34 de SEQ ID No: 12. SEQ ID No: 14 é a sequência de aminoácidos da CDR2 de Vl do anticorpo -005 compreendendo os aa 50-56 de SEQ ID No: 12.

SEQ ID No: 15 é a sequência de aminoácidos da CDR3 de Vl do anticorpo -005 compreendendo os aa 89-97 de SEQ ID No: 12. SEQ ID No: 16 é a sequência de nucleótidos da região Vh do anticorpo -005. SEQ ID No: 17 é a sequência de aminoácidos da região Vh do anticorpo -005. SEQ ID No: 18 é a sequência de aminoácidos da CDR1 de Vh do anticorpo -005 compreendendo os aa 31-35 de SEQ ID No: 17. SEQ ID No: 19 é a sequência de aminoácidos da CDR2 de Vh do anticorpo -005 compreendendo os aa 50-66 de SEQ ID No: 17. SEQ ID No: 20 é a sequência de aminoácidos da CDR3 de Vh do anticorpo -005 compreendendo os aa 99-111 de SEQ ID No: 17. SEQ ID No: 21 é a sequência de nucleótidos da região Vl do anticorpo -024. SEQ ID No: 22 é a sequência de aminoácidos da região Vl do anticorpo -024. SEQ ID No: 23 é a sequência de aminoácidos da CDR1 de Vl do anticorpo -024 compreendendo os aa 24-34 de SEQ ID No: 22. SEQ ID No: 24 é a sequência de aminoácidos da CDR2 de Vl do anticorpo -024 compreendendo os aa 50-56 de SEQ ID No: 22. SEQ ID No: 25 é a sequência de aminoácidos da CDR3 de Vl do anticorpo -024 compreendendo os aa 89-97 de SEQ ID No: 22. SEQ ID No: 26 é a sequência de nucleótidos da reqião VH do anticorpo -024. SEQ ID No: 27 é a sequência de aminoácidos da reqião Vh do anticorpo -024. SEQ ID No: 28 é a sequência de aminoácidos da CDR1 de Vh do anticorpo -024 compreendendo os aa 31-35 de SEQ ID No: 27. SEQ ID No: 29 é a sequência de aminoácidos da CDR2 de VH do anticorpo -024 compreendendo os aa 50-66 de SEQ ID No: 27. SEQ ID No: 30 é a sequência de aminoácidos da CDR3 de Vh do anticorpo -024 compreendendo os aa 99-111 de SEQ ID No: 27. SEQ ID No: 31 é a sequência de CD38 humano. SEQ ID No: 32 é a sequência de um CD38 humano mutante, em que o residuo de treonina na posição 237 foi substituído por um residuo de alanina. SEQ ID No: 33 é a sequência de um CD38 humano mutante, em que o residuo de glutamina na posição 272 foi substituído por um residuo de arginina. SEQ ID No: 34 é a sequência de um CD38 humano mutante, em que o residuo de serina na posição 274 foi substituído por um residuo de fenilalanina.

DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção proporciona anticorpos anti-CD38, que podem ser úteis no tratamento, diagnóstico e prevenção de uma variedade de distúrbios envolvendo células expressando CD38, tais como mieloma múltiplo. Uma forma de realização de acordo com a invenção é o anticorpo -005. -005 é um anticorpo para IgGl monoclonal humano tendo uma região Vl consistindo na sequência de SEQ ID No: 12, e uma região Vh consistindo na sequência de SEQ ID No: 17. São também descritos aqui péptidos de ligação a CD38 ("CD38BPs"), que podem ser úteis no tratamento, diagnóstico e prevenção de uma variedade de distúrbios envolvendo células expressando CD38, tais como mieloma múltiplo

Outros CD38BPs incluem o anticorpo -003 e o anticorpo -024. -003 é um anticorpo para IgGl monoclonal humano tendo uma região Vl consistindo na sequência de SEQ ID No: 2 e uma região Vh consistindo na sequência de SEQ ID No: 7. -024 é um anticorpo para IgGl monoclonal humano tendo uma região Vl consistindo na sequência de SEQ ID No: 22 e uma região VH consistindo na sequência de SEQ ID No: 27.

Os anticorpos interagem com antigénios alvo maioritariamente através de resíduos de aminoácidos que estão localizados nas seis regiões determinadoras da complementaridade (CDRs) de cadeia pesada e leve. Por esta razão, as sequências de aminoácidos dentro de CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que sequências fora de CDRs. Porque as sequências de CDR são responsáveis pela maioria das interações anticorpo-antigénio é possível expressar anticorpos recombinantes que mimetizem as propriedades de anticorpos que ocorrem naturalmente específicos por construção de vetores de expressão que incluem sequências de CDR do anticorpo que ocorrem naturalmente especifico enxertadas em sequências de framework de um anticorpo diferente com diferentes propriedades (ver por exemplo Riechmann, L. et al., Nature 332, 323-327 (1998), Jones, P. et al., Nature 321, 522-525 (1986) e Queen, C. et al., PNAS USA 86, 10029-10033 (1989)). É bem conhecido na técnica que os dominios CDRs de cadeia pesada de anticorpo desempenham um papel particularmente importante na especificidade/afinidade de ligação de anticorpos a um antigénio (Ditzel HJ, et al., J Immunol. 157 (2), 739-49 (1996), Barbas SM et al., J. Am. Chem. Soc. 116, 2161-2162 (1994), e Barbas SM et al., Proc Natl Acad

Sei USA 92 (7), 2529-33 (1995)). São descritos aqui CD38BPs que compreendem as CDR3s de cadeia pesada de -003, -005 ou -024, as CDR3s de cadeia pesada e leve de -003, -005 ou -024, as CDR2s de -003, -005 e -024, e/ou as CDRls de -003, -005 e -024. São também descritos aqui CD38BPs, que competem com -003, -005 ou -024 quanto à ligação a CD38. A competição pode ser determinada por uso de um ELISA ou uma FACS como descrito na secção dos Exemplos. É descrito aqui um CD38BP que se liga especificamente a um epitopo de CD38, cujo epítopo é também especificamente ligado por -003 ou -005 ou -024 e um CD38BP tendo substancialmente as mesmas características de ligação especificas para ligação de CD38 humano que -003 ou -005 ou -024 .

Os anticorpos da invenção compreendem uma CDR3 de Vh tendo a sequência apresentada em SEQ ID No: 20 e uma CDR2 de VH tendo a sequência apresentada em SEQ ID No: 19 e uma CDR1 de Vh tendo a sequência apresentada em SEQ ID No: 18.

Os anticorpos da invenção compreendem (a) uma primeira reqião VL compreendendo três CDRs de VL, que têm as sequências apresentadas em SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14, e SEQ ID No: 15; e (b) uma primeira reqião Vh compreendendo três CDRs de VH, que têm as sequências apresentadas em SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 19, e SEQ ID No: 20.

Numa forma de realização, a reqião Vl e a reqião Vh estão presentes na mesma cadeia no anticorpo.

Numa forma de realização adicional, a reqião VL e a região Vh são separadas por um ligante flexível.

Numa forma de realização, a região Vl e a região VH estão presentes nas cadeias separadas no anticorpo.

Numa forma de realização adicional, a região VL e a região Vh estão presentes nas cadeias separadas no anticorpo no contexto de uma proteína de dobragem de imunoglobulina.

Numa forma de realização, a primeira região Vl e a primeira região VH são orientadas tal que as três CDRs na região VL e as três CDRs na região VH se associem cooperativamente para contribuir na seletividade e/ou ligação específica de um determinante antigénio em CD38 humano.

Numa forma de realização adicional, o anticorpo compreende uma segunda região VL idêntica à primeira região VL e uma segunda região Vh idêntica à primeira região Vh, onde a segunda região Vl e a segunda região Vh se associam cooperativamente para contribuir na seletividade e/ou ligação especifica de um determinante antigénio em CD38 humano. 0 anticorpo da invenção pode compreender uma região Vl que é uma variante funcional da região VL de -005.

Numa forma de realização, a região VL do anticorpo consiste essencialmente numa sequência tendo pelo menos cerca de 50%, pelo menos 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% de identidade de sequências de aminoácidos com uma sequência de acordo com SEQ ID No: SEQ ID No: 12. O anticorpo da invenção pode compreender uma região VH que é uma variante funcional da região VH de -005.

Numa forma de realização, a região VH do anticorpo consiste essencialmente numa sequência tendo pelo menos cerca de 50%, pelo menos 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% de identidade de sequências de aminoácidos com uma sequência de acordo com SEQ ID No: 17 ou SEQ ID No: 17.

Os CD38BPs podem ligar-se a CD38 humano com maior afinidade do que -003 ou -005 ou -024 ou podem ter substancialmente as mesmas caracteristicas de ligação a CD38 especificas que -003 ou -005 ou -024. O CD38BP pode estar substancialmente isento de outros péptidos de ligação a CD38.

Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos, tais como anticorpos humanos, anticorpos humanizados ou anticorpos quiméricos.

Numa forma de realização, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo monoclonal.

Numa forma de realização, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo para IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, ou IgM. Numa forma de realização adicional, o anticorpo é um anticorpo para IgGl. Numa forma de realização adicional, o anticorpo é um anticorpo para IgGl,K. Noutra forma de realização adicional, o anticorpo é um anticorpo para IgM. Numa forma de realização adicional, o anticorpo é um anticorpo para IgM,k.

Numa forma de realização, o anticorpo da presente invenção é um fragmento de anticorpo ou um anticorpo de cadeia única.

Numa forma de realização, o anticorpo é glicosilado numa célula eucariótica.

Numa forma de realização, o anticorpo compreende adicionalmente um ligante quelante para anexação de um radioisótopo.

Numa forma de realização, o anticorpo está numa forma substancialmente isolada. A presente invenção proporciona um ácido nucleico isolado codificando um anticorpo para CD38 da presente invenção. A presente invenção proporciona um vetor de expressão compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificando um anticorpo para CD38 da presente invenção. É também divulgado aqui um vetor de expressão que compreende uma sequência de nucleótidos de VL de SEQ ID No: 1, uma sequência de nucleótidos de Vh de SEQ ID No: 6, ou uma sequência de nucleótidos de Vl de SEQ ID No: 1 e uma sequência de nucleótidos de VH de SEQ ID No: 6.

Um anticorpo da invenção pode ser produzido usando um vetor de expressão que compreende uma sequência de nucleótidos de Vl de SEQ ID No: 11 e/ou um vetor de expressão que compreende uma sequência de nucleótidos de Vh de SEQ ID No: 16. Numa forma de realização, um vetor de expressão da invenção compreende uma sequência de nucleótidos de Vl de SEQ ID No: 11 e uma sequência de nucleótidos de Vh de SEQ ID No: 16. É também descrito aqui um vetor de expressão que compreende uma sequência de nucleótidos de Vl de SEQ ID No: 21, uma sequência de nucleótidos de Vh de SEQ ID No: 26, ou uma sequência de nucleótidos de Vl de SEQ ID No: 21 e uma sequência de nucleótidos de Vh de SEQ ID No: 26.

Numa forma de realização adicional, o vetor de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleótidos codificando a região constante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou ambas as cadeias leves e pesadas de um anticorpo humano.

Numa forma de realização adicional, a sequência de nucleótidos codificando a região constante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou ambas as cadeias leves e pesadas de um anticorpo humano codificam um anticorpo para IgGl. É descrito aqui um hibridoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado por ácidos nucleicos de cadeia leve humana e cadeia pesada humana compreendendo sequências de nucleótidos na região de cadeia leve variável como apresentada em SEQ ID No: 1, ou suas modificações de sequências conservativas, e sequências de nucleótidos na região de cadeia pesada variável como apresentada em SEQ ID No: 6, ou suas modificações de sequências conservativas. Numa forma de realização, os ácidos nucleicos de cadeia leve humana compreendem uma sequência de nucleótidos como apresentada em SEQ ID No: 1, e os ácidos nucleicos de cadeia pesada humana compreendem uma sequência de nucleótidos como apresentada em SEQ ID No: 6. E descrito aqui um hibridoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve humanas que compreendem a sequência de aminoácidos variáveis de cadeia leve humana como apresentada em SEQ ID No: 2, ou suas modificações de sequências conservativas, e a sequência de amino variáveis de cadela leve humana como apresentada em SEQ ID No: 7, ou suas modificações de sequências conservativas. Numa forma de realização, a região variável de cadeia leve humana compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID No: 2, e a região variável de cadeia pesada humana compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID No: 7. É descrito aqui um transfectoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado por ácidos nucleicos de cadeia leve humana como apresentados em SEQ ID No: 1, ou suas modificações de sequências conservativas, e ácidos nucleicos de cadeia pesada humana como apresentados SEQ ID No: 6, ou suas modificações de sequências conservativas. Numa forma de realização, o anticorpo anti-CD38 monoclonal humano é codificado por ácidos nucleicos variáveis de cadeia leve humana como apresentados em SEQ ID No: 1, e ácidos nucleicos de cadeia pesada humana como apresentados SEQ ID No: 6. É descrito aqui um transfectoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada humanas que compreendem a sequência de aminoácidos variáveis de cadeia leve humana como apresentada em SEQ ID No: 2, ou suas modificações de sequências conservativas, e a sequência de amino variáveis de cadeia pesada humana como apresentada em SEQ ID No: 7, ou suas modificações de sequências conservativas. Numa forma de realização, a cadeia leve humana compreende a sequência de aminoácidos variáveis de cadeia leve humana como apresentada em SEQ ID No: 2, e a cadeia leve humana compreende a sequência de amino variáveis de cadeia pesada humana como apresentada em SEQ ID No: 7. 0 anticorpo da invenção pode ser produzido por um hibridoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano de acordo com a invenção e codificado por ácidos nucleicos de cadeia leve humana e cadeia pesada humana compreendendo sequências de nucleótidos na região de cadeia leve variável como apresentadas em SEQ ID No: 11, ou suas modificações de sequências conservativas, e sequências de nucleótidos na região de cadeia pesada variável como apresentadas em SEQ ID No: 16, ou suas modificações de sequências conservativas. Numa forma de realização, os ácidos nucleicos de cadeia leve humana compreendem uma sequência de nucleótidos como apresentada em SEQ ID No: 11, e os ácidos nucleicos de cadeia pesada humana compreendem uma sequência de nucleótidos como apresentada em SEQ ID No: 16. 0 anticorpo da invenção pode ser produzido por um hibridoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano de acordo com a invenção e tendo regiões variáveis de cadeia pesada e leve humanas que compreendem a sequência de aminoácidos variáveis de cadeia leve humana como apresentada em SEQ ID No: 12, ou suas modificações de sequências conservativas, e a sequência de amino variáveis de cadeia leve humana como apresentada em SEQ ID No: 17, ou suas modificações de sequências conservativas. Numa forma de realização, a região variável de cadeia leve humana compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID No: 12, e a região variável de cadeia pesada humana compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID No: 17. 0 anticorpo da invenção pode ser produzido por um transfectoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano de acordo com a invenção e codificado por ácidos nucleicos variáveis de cadeia leve humana como apresentados em SEQ ID No: 11, ou suas modificações de sequências conservativas, e ácidos nucleicos variáveis de cadeia pesada humana como apresentados SEQ ID No: 16, ou suas modificações de sequências conservativas. Numa forma de realização, o anticorpo anti-CD38 monoclonal humano é codificado por ácidos nucleicos variáveis de cadeia leve humana como apresentados em SEQ ID No: 11, e ácidos nucleicos de cadeia pesada humana como apresentados SEQ ID No: 16. 0 anticorpo da invenção pode ser produzido por um transfectoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano de acordo com a invenção tendo regiões variáveis de cadeia leve e pesada humanas que compreendem a sequência de aminoácidos variáveis de cadeia leve humana como apresentada em SEQ ID No: 12, ou suas modificações de sequências conservativas, e a sequência de amino variáveis de cadeia pesada humana como apresentada em SEQ ID No: 17, ou suas modificações de sequências conservativas. Numa forma de realização, a cadeia leve humana compreende a sequência de aminoácidos variáveis de cadeia leve humana como apresentada em SEQ ID No: 12, e a cadeia pesada humana compreende a sequência de amino variáveis de cadeia pesada humana como apresentada em SEQ ID No: 17. É descrito aqui um hibridoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado por ácidos nucleicos de cadeia leve humana e cadeia pesada humana compreendendo sequências de nucleótidos na região de cadeia leve variável como apresentadas em SEQ ID No: 21, ou suas modificações de sequências conservativas, e sequências de nucleótidos na região de cadeia pesada variável como apresentadas em SEQ ID No: 26, ou suas modificações de sequências conservativas. Numa forma de realização, os ácidos nucleicos de cadeia leve humana compreendem uma sequência de nucleótidos como apresentada em SEQ ID No: 21, e os ácidos nucleicos de cadeia pesada humana compreendem uma sequência de nucleótidos como apresentada em SEQ ID No: 26. É descrito aqui um hibridoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve humanas que compreendem a sequência de aminoácidos variáveis de cadeia leve humana como apresentada em SEQ ID No: 22, ou suas modificações de sequências conservativas, e a sequência de amino variáveis de cadeia leve humana como apresentada em SEQ ID No: 27, ou suas modificações de sequências conservativas. Numa forma de realização, a região variável de cadeia leve humana compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID No: 22, e a região variável de cadeia pesada humana compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID No: 27. É descrito aqui um transfectoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado por ácidos nucleicos variáveis de cadeia leve humana como apresentados em SEQ ID No: 21, ou suas modificações de sequências conservativas, e ácidos nucleicos variáveis de cadeia pesada humana como apresentados SEQ ID No: 26, ou suas modificações de sequências conservativas. Numa forma de realização, o anticorpo anti-CD38 monoclonal humano é codificado por ácidos nucleicos variáveis de cadeia leve humana como apresentados em SEQ ID No: 21, e ácidos nucleicos variáveis de cadeia pesada humana como apresentados EQ ID No: 26. É descrito aqui um transfectoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada humanas que compreendem a sequência de aminoácidos variáveis de cadeia leve humana como apresentada em SEQ ID No: 22, ou suas modificações de sequências conservativas, e a sequência de amino variáveis de cadeia pesada humana como apresentada em SEQ ID No: 27, ou suas modificações de sequências conservativas. Numa forma de realização, a cadeia leve humana compreende a sequência de aminoácidos variáveis de cadeia leve humana como apresentada em SEQ ID No: 22, e a cadeia pesada humana compreende a sequência de amino variáveis de cadeia pesada humana como apresentada em SEQ ID No: 27. A presente invenção proporciona uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica que produz um anticorpo anti-CD38 da presente invenção. A presente invenção proporciona uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica contendo em vetor de expressão da presente invenção. É descrito aqui um animal não humano ou planta transgénico compreendendo ácidos nucleicos codificando uma cadeia pesada humana e uma cadeia leve humana, em que o animal ou planta produz uma quantidade detetável de um CD38BP como descrito aqui. A presente invenção proporciona um imunoconjugado compreendendo um anticorpo anti-CD38 da presente invenção ligado a um agente citotóxico, um radioisótopo, ou um fármaco. Numa forma de realização, o anticorpo é um anticorpo para IgM monomérico ligado a um agente citotóxico, um radioisótopo, ou um fármaco. A presente invenção proporciona uma molécula biespecifica ou multiespecifica compreendendo um anticorpo anti-CD38 da presente invenção e uma especificidade de ligação quanto a uma célula efetora humana. Numa forma de realização, a especificidade de ligação quanto a uma célula efetora humana é uma especificidade de ligação quanto a CD3, CD4, CD138, IL-15R, TNF-α ligado à membrana ou ligado a recetores, um recetor de Fc humano, ou IL-15 ligada à membrana ou ligada a recetores. A presente invenção proporciona uma ligação de anticorpo anti-idiotipico a um anticorpo anti-CD38 da presente invenção. 0 anticorpo anti-idiotipico da presente invenção é útil para deteção do nivel de anticorpo monoclonal humano contra CD38 numa amostra. 0 que se segue é uma lista de formas de realização selecionadas.

Forma de realização 1: Uma ligação de anticorpo a CD38 humano codificado por ácidos nucleicos de cadeia leve humana e cadeia pesada humana compreendendo sequências de nucleótidos nas suas regiões variáveis como apresentadas em SEQ ID No: 11 e SEQ ID No: 16, respetivamente, ou suas modificações de sequências conservativas.

Forma de realização 2: Uma ligação de anticorpo a CD38 humano codificado por ácidos nucleicos de cadeia leve humana e cadeia pesada humana compreendendo sequências de nucleótidos nas suas regiões variáveis como apresentadas em SEQ ID No: 11 e SEQ ID No: 16, respetivamente.

Forma de realização 3: Um péptido compreendendo (a) uma primeira região Vl compreendendo três CDRs de Vl, que independentemente umas das outras consistem essencialmente em SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14, e SEQ ID No: 15; e (b) uma primeira região VH compreendendo três CDRs de Vh, que independentemente umas das outras consistem essencialmente em SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 19, e SEQ ID No: 20.

Forma de realização 4: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 3, em que a região VL e a região Vh estão presentes na mesma cadeia no anticorpo.

Forma de realização 5: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 4, em que a região VL e a região VH são separadas por um ligante flexível.

Forma de realização 6: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 3, em que a região VL e a região Vh estão presentes nas cadeias separadas no anticorpo.

Forma de realização 7: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 6, em que a região VL e a região VH estão presentes nas cadeias separadas no péptido no contexto de uma proteína de dobragem de imunoglobulina.

Forma de realização 8: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 3 a 7, em que a primeira região VL e a primeira região VH estão orientadas tal que as três CDRs na região Vl e as três CDRs na região VH se associem cooperativamente para contribuir na ligação seletiva e/ou específica de um determinante antigénio em CD38 humano.

Forma de realização 9: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 8, em que o anticorpo compreende uma segunda região Vl idêntica à primeira região Vl e uma segunda região Vh idêntica à primeira região Vh, onde a segunda região Vl e a segunda região Vh se associam cooperativamente para contribuir na ligação seletiva e/ou específica de um determinante antigénio em CD38 humano. Forma de realização 10: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 3 compreendendo uma região VL que é uma variante funcional da região Vl de um anticorpo da forma de realização 2.

Forma de realização 11: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 10, em que a região Vl do péptido consiste essencialmente numa sequência tendo pelo menos cerca de 50%, pelo menos 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% de identidade de sequências de aminoácidos com uma sequência de acordo com SEQ ID No: 12 .

Forma de realização 12: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 3 compreendendo uma região VH que é uma variante funcional de uma região Vh de um anticorpo da forma de realização 2.

Forma de realização 13: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 12, em que a região Vh do anticorpo consiste essencialmente numa sequência tendo pelo menos cerca de 50%, pelo menos 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% de identidade de sequências de aminoácidos com uma sequência de acordo com SEQ ID No: 17 .

Forma de realização 14: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 3 a 13, cujo anticorpo se liga especificamente a CD38 humano.

Forma de realização 15: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 3 a 14, que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31), e que não se liga a CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído por um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34) no mesmo grau que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31).

Forma de realização 16: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 15, em que a ECso da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído por um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 50% da ECso da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31). Forma de realização 17: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 16, em que a ECso da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído por um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 10% da ECso da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31). Forma de realização 18: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 17, em que a ECso da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído por um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 5% da EC50 da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31).

Forma de realização 19: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 18, em que a EC50 da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído por um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 1% da EC50 da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31).

Forma de realização 20: Um anticorpo que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31), e que não se liga a CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído por um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33) no mesmo grau que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31). Forma de realização 21: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 20, em que a EC50 da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído por um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 50% da EC50 da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31). Forma de realização 22: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 21, em que a EC50 da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído por um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 10% da EC50 da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31). Forma de realização 23: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 15 a 19 que não se liga a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído por um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33) no mesmo grau que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31).

Forma de realização 24: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 23, em que a EC50 da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído por um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 50% da EC50 da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31). Forma de realização 25: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 24, em que a EC50 da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o residuo de serina na posição 274 foi substituído por um residuo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 10% da EC50 da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31). Forma de realização 26: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 15 a 25, em que o referido anticorpo se liga a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído por um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) no mesmo grau que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31).

Forma de realização 27: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 26, em que a EC50 da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído por um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32), é maior do que 75% da EC50 da ligação do péptido a CD38 humano (SEQ ID No: 31).

Forma de realização 28: Um péptido de acordo com a forma de realização 27 em que a EC50 da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído por um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32), é maior do que 85% da EC50 da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31).

Forma de realização 29: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 28, em que a EC50 da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído por um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32), é maior do que 90% da EC50 da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31).

Forma de realização 30: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 29, em que a EC50 da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído por um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32), é maior do que 95% da EC50 da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31).

Forma de realização 31: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 30, em que o anticorpo não é um agonista de CD38.

Forma de realização 32: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 30, em que o anticorpo não induz proliferação significativa de células mononucleares do sangue periférico.

Forma de realização 33: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 32, em que o anticorpo não induz libertação significativa de IL-6 por monócitos ou células mononucleares do sangue periférico humanos.

Forma de realização 34: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 33, em que o anticorpo não induz libertação detetável de IFN-γ por células T ou células mononucleares do sangue periférico humanas.

Forma de realização 35: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 3, cujo anticorpo é um anticorpo humano.

Forma de realização 36: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 34, cujo anticorpo é um anticorpo humanizado ou quimérico.

Forma de realização 37: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 36, cujo anticorpo é um anticorpo monoclonal.

Forma de realização 38: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 37, caracterizado por ser um anticorpo para IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, ou IgM.

Forma de realização 39: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 38, caracterizado por ser um anticorpo para IgGl.

Forma de realização 40: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 39, em que o anticorpo é um anticorpo para IgGl,K.

Forma de realização 41: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 38, caracterizado por ser um anticorpo para IgM.

Forma de realização 42: Um anticorpo de acordo com a forma de realização 41, em que o anticorpo é um anticorpo para IgM,k.

Forma de realização 43: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 42, em que o anticorpo é glicosilado numa célula eucariótica.

Forma de realização 44: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 43, que é um fragmento de anticorpo ou um anticorpo de cadeia única. Forma de realização 45: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 44, compreendendo adicionalmente um quelante para anexação de um radioisótopo.

Forma de realização 46: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 45, que está numa forma substancialmente isolada.

Forma de realização 47: Um ácido nucleico isolado codificando um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 45.

Forma de realização 48: Um vetor de expressão compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificando um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 45.

Forma de realização 49: Um vetor de expressão

compreendendo uma sequência de nucleótidos de VL de SEQ ID No: 11, uma sequência de nucleótidos de VH de SEQ ID

No: 16, ou uma sequência de nucleótidos de Vl de SEQ ID No: 11 e uma sequência de nucleótidos de Vh de SEQ ID No: 16.

Forma de realização 50: Um vetor de expressão de acordo com a forma de realização 49, compreendendo adicionalmente uma sequência de nucleótidos codificando a região constante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou ambas as cadeias leve e pesada de um anticorpo humano. Forma de realização 51: Um vetor de expressão de acordo com a forma de realização 50, em que a sequência de nucleótidos codificando a região constante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou ambas as cadeias leve e pesada de um anticorpo humano codifica um anticorpo para IgGl. Forma de realização 52: Um hibridoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado por ácidos nucleicos de cadeia leve humana e cadeia pesada humana compreendendo sequências de nucleótidos na região de cadeia leve variável como apresentadas em SEQ ID No: 11, ou suas modificações de sequências conservativas, e sequências de nucleótidos na região de cadeia pesada variável como apresentadas em SEQ ID No: 16, ou suas modificações de sequências conservativas.

Forma de realização 53: Um hibridoma de acordo com a forma de realização 54, em que os ácidos nucleicos de cadeia leve humana compreendem uma sequência de nucleótidos como apresentada em SEQ ID No: 11, e os ácidos nucleicos de cadeia pesada humana compreendem uma sequência de nucleótidos como apresentada em SEQ ID No: 16.

Forma de realização 54: Um hibridoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve humanas que compreendem a sequência de aminoácidos variáveis de cadeia leve humana como apresentada em SEQ ID No: 12, ou suas modificações de sequências conservativas, e a sequência de amino variáveis de cadeia pesada humana como apresentada em SEQ ID No: 17, ou suas modificações de sequências conservativas.

Forma de realização 55: Um hibridoma de acordo com a forma de realização 54, em que a região variável de cadeia leve humana compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID No: 12, e a região variável de cadeia pesada humana compreende uma sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID No: 17.

Forma de realização 56: Um transfectoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano codificado por ácidos nucleicos variáveis de cadeia leve humana como apresentados em SEQ ID No: 11, ou suas modificações de sequências conservativas, e ácidos nucleicos variáveis de cadeia pesada humana como apresentados SEQ ID No: 16, ou suas modificações de sequências conservativas.

Forma de realização 57: Um transfectoma de acordo com a forma de realização 56, em que o anticorpo anti-CD38 monoclonal humano é codificado por ácidos nucleicos variáveis de cadeia leve humana como apresentados em SEQ ID No: 11, e ácidos nucleicos variáveis de cadeia pesada humana como apresentados SEQ ID No: 16.

Forma de realização 58: Um transfectoma que produz um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano tendo regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada humanas que compreendem a sequência de aminoácidos variáveis de cadeia leve humana como apresentada em SEQ ID No: 12, ou suas modificações de sequências conservativas, e a sequência de amino variáveis de cadeia pesada humana como apresentada em SEQ ID No: 17, ou suas modificações de sequências conservativas.

Forma de realização 59: Um transfectoma de acordo com a forma de realização 58, em que a cadeia leve humana compreende a sequência de aminoácidos variáveis de cadeia leve humana como apresentada em SEQ ID No: 12, e a cadeia pesada humana compreende a sequência de amino variáveis de cadeia pesada humana como apresentada em SEQ ID No: 17.

Forma de realização 60: Uma célula eucariótica ou procariótica que produz um péptido de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 14.

Forma de realização 61: Uma célula eucariótica ou procariótica contendo um vetor de expressão de acordo com a forma de realização 48.

Forma de realização 62: Um animal não humano ou planta transgénico compreendendo ácidos nucleicos codificando uma cadeia pesada humana e uma cadeia leve humana, em que o animal ou planta produz uma quantidade detetável de um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 45.

Forma de realização 63: Um imunoconjugado compreendendo um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 44 ligado a um agente citotóxico, um radioisótopo, ou um fármaco.

Forma de realização 64: Um imunoconjugado compreendendo um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 38 ou formas de realização 41 a 44, em que o anticorpo é um anticorpo para IgM monomérico ligado a um agente citotóxico, um radioisótopo, ou um fármaco. Forma de realização 65: Uma molécula biespecífica ou multiespecifica compreendendo um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 45 e uma especificidade de ligação quanto a uma célula efetora humana.

Forma de realização 66: Uma molécula biespecifica ou multiespecifica compreendendo um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 45 e uma especificidade de ligação quanto a CD3, CD4, IL-15R, TNF-oí ligado à membrana ou ligado a recetores, um recetor de

Fc humano, ou IL-15 ligada à membrana ou ligada a recetores.

Forma de realização 67: Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 46 ou um imunoconjugado de acordo com qualquer uma das formas de realização 63 a 66 e um transportador farmaceuticamente aceitável.

Forma de realização 68: Uma composição farmacêutica de acordo com a forma de realização 67 compreendendo um ou mais agentes terapêuticos adicionais.

Forma de realização 69: Um método de inibição in vitro do crescimento e/ou proliferação de uma célula expressando CD38, compreendendo administração de um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 46, um imunoconjugado de acordo com qualquer uma das formas de realização 63 a 66, uma composição farmacêutica de acordo com a forma de realização 67 ou 68, ou um vetor de expressão de acordo com qualquer uma das formas de realização 50 a 53, tal que o crescimento e/ou proliferação da célula seja inibida.

Forma de realização 70: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 48, um imunoconjugado de acordo com qualquer uma das formas de realização 65 a 68, uma composição farmacêutica de acordo com a forma de realização 69 ou 70, ou um vetor de expressão de acordo com qualquer uma das formas de realização 50 a 53 para uso num método de tratamento de uma doença ou distúrbio envolvendo células expressando CD38 .

Forma de realização 71: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 48, um imunoconjugado de acordo com qualquer uma das formas de realização 63 a 66, uma composição farmacêutica de acordo com a forma de realização 67 ou 68, ou um vetor de expressão de acordo com qualquer uma das formas de realização 48 a 51 para uso num método de prevenção de uma doença ou distúrbio envolvendo células expressando CD38 num sujeito.

Forma de realização 72: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 46, um imunoconjugado de acordo com qualquer uma das formas de realização 63 a 66, uma composição farmacêutica de acordo com a forma de realização 67 ou 68, ou um vetor de expressão de acordo com qualquer uma das formas de realização 48 a 51 para uso de acordo com a forma de realização 70 ou forma de realização 71, em que a doença ou distúrbio é artrite reumatoide.

Forma de realização 73: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 46, um imunoconjugado de acordo com qualquer uma das formas de realização 63 a 66, uma composição farmacêutica de acordo com a forma de realização 67 ou 68, ou um vetor de expressão de acordo com qualquer uma das formas de realização 48 a 51 para uso de acordo com a forma de realização 70 ou forma de realização 71, em que a doença ou distúrbio é mieloma múltiplo.

Forma de realização 74: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 46, um imunoconjugado de acordo com qualquer uma das formas de realização 63 a 66, uma composição farmacêutica de acordo com a forma de realização 67 ou 68, ou um vetor de expressão de acordo com qualquer uma das formas de realização 48 a 51 para uso de acordo com qualquer uma das formas de realização 70 a 73, em que o método compreende administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais ao sujeito.

Forma de realização 75: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 46, um imunoconjugado de acordo com qualquer uma das formas de realização 63 a 66, uma composição farmacêutica de acordo com a forma de realização 67 ou 68, ou um vetor de expressão de acordo com qualquer uma das formas de realização 48 a 51 para uso de acordo com a forma de realização 74, em que o um ou mais agentes terapêuticos adicionais são selecionados de um agente quimioterapêutico, um agente anti-inflamatório, ou um agente imunossupressor e/ou imunomodulador.

Forma de realização 76: Um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 46, um imunoconjugado de acordo com qualquer uma das formas de realização 63 a 66, uma composição farmacêutica de acordo com a forma de realização 67 ou 68, ou um vetor de expressão de acordo com qualquer uma das formas de realização 48 a 51 para uso de acordo com a forma de realização 74, em que o um ou mais agentes terapêuticos adicionais são selecionados de um grupo consistindo em cisplatina, gefitinib, cetuximab, rituximab, bevacizumab, erlotinib, bortezomib, talidomida, pamidronato, ácido zoledrónico, clodronato, risendronato, ibandronato, etidronato, alendronato, tiludronato, trióxido arsénico, lenalidomida, filgrastim, pegfilgrastim, sargramostim, ácido hidroxâmico de suberoílanilida, e SCIO-469.

Forma de realização 77: Um método in vitro para deteção da presença de antigénio CD38, ou uma célula expressando CD38, numa amostra compreendendo: (a) contacto da amostra com um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 46 sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e CD38; e (b) deteção da formação de um complexo.

Forma de realização 78: Um estojo para deteção da presença de antigénio CD38, ou uma célula expressando CD38, numa amostra compreendendo um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 46.

Forma de realização 79: Uma ligação de anticorpo anti-idiotipico a um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 44.

Forma de realização 80. Uso de um anticorpo anti-idiotipico de acordo com a forma de realização 79 para deteção do nivel de um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 44 numa amostra.

Os termos "CD38" e "antigénio CD38" são usados indistintamente aqui, e incluem quaisquer variantes, isoformas e homólogos de espécies de CD38 humano, que são naturalmente expressos por células ou são expressos em células transfectadas com o gene CD38. Sinónimos de CD38, como reconhecidos na técnica, incluem ADP ribosil ciclase 1, cADPr hidrolase 1, Cd38-rsl, ADP-ribose hidrolase Ciclica 1, 1-19, antigénio NIM-R5. O termo péptido no que diz respeito tanto a péptidos de ligação a CD38 como a péptidos não de CD37 descritos aqui inclui qualquer péptido adequado e pode ser usado sinonimamente com os termos polipéptido e proteína, a não ser que de outro modo afirmado ou contradito pelo contexto; contanto que o leitor reconheça que cada tipo de molécula contendo polimero de aminoácidos respetiva possa estar associada a diferenças significativas e formar deste modo formas de realização individuais (por exemplo, um péptido tal como um anticorpo, que é composto por múltiplas cadeias de polipéptidos, é significativamente diferente de, por exemplo, um anticorpo de cadeia única, uma imunoadesina de péptido, ou péptido imunogénico de cadeia única). Portanto, o termo péptido aqui deve ser geralmente entendido como referindo-se a qualquer péptido adequado de qualquer tamanho e composição adequados (no que diz respeito ao número de aminoácidos e número de cadeias associadas numa molécula de proteína). Além do mais, os péptidos no contexto dos métodos e composições inventivos descritos aqui podem compreender resíduos de aminoácidos não ocorrendo naturalmente e/ou não L, a não ser que de outro modo afirmado ou contradito pelo contexto.

Como será discutido adicionalmente aqui, a não ser que de outro modo afirmado ou contradito pelo contexto, o termo péptido (e se discutido como formas de realização individuais do(s) termo(s) polipéptido e/ou proteína) engloba também moléculas de péptido derivatizadas. Brevemente, um derivado é um péptido no qual um ou mais dos resíduos de aminoácidos do péptido foram quimicamente modificados (por exemplo por alquilação, acilação, formação de éster, ou formação de amida) ou associados a um ou mais substituintes atómicos ou moleculares orgânicos e/ou inorgânicos de não aminoácidos (por exemplo um grupo polietileno glicol (EPG) , um substituinte lipofílico (que pode estar opcionalmente ligado à sequência de aminoácidos do péptido por um resíduo espaçador ou grupo tal como β-alanina, ácido γ-aminobutírico (GABA), L/D-ácido glutâmico, ácido succínico, e similares), um fluoróforo, biotina, um radionuclídeo, etc.) e pode também ou alternativamente compreender resíduos de aminoácidos não essenciais, não ocorrendo naturalmente, e/ou não L, a não ser que de outro modo afirmado ou contradito pelo contexto (no entanto deve ser novamente reconhecido que tais derivados podem, em si mesmos, ser considerados características independentes e a inclusão de tais moléculas dentro do significado de péptido é feita por motivos de conveniência na descrição da presente divulgação ao invés de implicar qualquer tipo de equivalência entre péptidos nus e tais derivados). Exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácidos incluem por exemplo ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, 3- alanina, ácido β-aminopropiónico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 6-aminocaproico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, ácido 2,4-diaminobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilasparagina, hidroxilisina, aloidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, aloisoleucina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, 6-N-metillisina, N-metilvalina, norvalina, norleucina, ornitina, e aminoácidos halogenados com estatina. Péptidos de ligação a antigénio referem-se a gualguer péptido que se liga especificamente a uma porção de um dado antigénio sob condições celulares e/ou fisiológicas durante um período de tempo suficiente para induzir, promover, intensificar, e/ou de outro modo modular um efeito fisiológico associado ao antigénio; para permitir deteção por ELISA, transferência de Western, ou outra técnica de ligação a proteína similarmente adequada descrita aqui e/ou conhecida na técnica e/ou para ser de outro modo detetavelmente ligado aí após um período de tempo relevante (por exemplo pelo menos cerca de 15 minutos, pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de 1 hora, pelo menos cerca de 2 horas, pelo menos cerca de 4 horas, pelo menos cerca de 6 horas, pelo menos cerca de 12 horas, cerca de 1-24 horas, cerca de 1-36 horas, cerca de 1-48 horas, cerca de 1-72 horas, cerca de uma semana, ou mais longo).

Um péptido de ligação a CD38, ou CD38BP, é um péptido de ligação a antigénio que se liga especificamente ao antigénio CD38. A ligação do CD38BP a CD38 pode ser medida por uso do método descrito no Exemplo 4. 0 termo imunoglobulina refere-se a uma classe de glicoproteinas estruturalmente relacionadas consistindo em dois pares de cadeias de polipéptidos, um par de cadeias de baixo peso molecular leves (L) e um par de cadeias pesadas (H), todas as quatro interconectadas por ligações de dissulfeto. A estrutura de imunoglobulinas foi bem caracterizada. Ver por exemplo Fundamental Immunology Cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.I. (1989)). Brevemente, cada cadeia pesada é tipicamente compreendida por uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como Vh) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é tipicamente compreendida por três dominios, ChI, Ch2 e Ch3 . Cada cadeia leve é tipicamente compreendida por uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como Vl) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é tipicamente compreendida por um dominio, Cl. As regiões Vh e Vl podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade (ou regiões hipervariáveis que podem ser hipervariáveis na sequência e/ou forma de alças estruturalmente definidas) , também denominadas regiões determinadoras da complementaridade (CDRs), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de framework (FRs).

Cada Vh e VL é tipicamente composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino para o terminal carboxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (ver também Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)). Tipicamente, a numeração de residuos de aminoácidos nesta região é realizada pelo método descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) (frases tais como numeração de resíduos de domínio variável como em Kabat ou de acordo com Kabat aqui referem-se a este sistema de numeração para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve). Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoácidos linear real pode conter menos ou mais aminoácidos correspondendo a um encurtamento de uma, ou inserção numa, FR ou CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir uma única inserção de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de CDR2 de Vh e resíduos inseridos (por exemplo resíduos 82a, 82b, e 82c, etc. de acordo com Kabat) após o resíduo de FR de cadeia pesada 82. A numeração de Kabat de resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo por alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada por Kabat "padrão". 0 termo anticorpo (Ab) no contexto da presente invenção refere-se a uma molécula de imunoglobulina, um fragmento de uma molécula de imunoglobulina, ou um seu derivado de qualquer um deles, que tem a capacidade de se ligar especificamente a um antigénio sob condições fisiológicas típicas durante períodos de tempo significativos tais como pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de uma hora, pelo menos cerca de duas horas, pelo menos cerca de quatro horas, pelo menos cerca de 8 horas, pelo menos cerca de 12 horas, cerca de 24 horas ou mais, cerca de 48 horas ou mais, cerca de 3, 4, 5, 6, 7 ou mais dias, etc., ou qualquer outro período funcionalmente definido relevante (tal como um tempo suficiente para induzir, promover, intensificar, e/ou modular uma resposta fisiológica associada à ligação do anticorpo ao antigénio).

As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves da molécula de imunoglobulina contêm um domínio de ligação que interagem com um antigénio. As regiões constantes dos anticorpos (Abs) podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imune (tais como células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema complemento clássico.

Um anticorpo anti-CD38 pode ser um anticorpo biespecífico, diacorpo, ou molécula similar (ver por exemplo PNAS USA 90 (14), 6444-8 (1993) para uma descrição de diacorpos) . De facto, os anticorpos biespecíficos, diacorpos, e similares, proporcionados pela presente invenção podem ligar-se a qualquer alvo adequado adicionalmente a uma porção de CD38.

Como indicado acima, o termo anticorpo aqui, a não ser que de outro modo afirmado ou claramente contradito pelo contexto, inclui fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligarem a um antigénio. Foi mostrado que a função de ligação a antigénio de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Exemplos de fragmentos de ligação englobados dentro do termo "anticorpo" incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios Vl, Vh, Cl e ChI; (ii) fragmentos F(ab)2 e F(ab')2, fragmentos bivalentes compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de charneira; (iii) um fragmento Fd consistindo essencialmente nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv consistindo essencialmente nos domínios Vl e Vh de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al.r Nature 341, 544-546 (1989)), que consiste essencialmente num domínio Vh; (vi) uma região determinadora da complementaridade (CDR) isolada, e (vii) uma combinação de duas ou mais CDRs isoladas que podem estar opcionalmente unidas por um ligante sintético. Além do mais, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por gene separados podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que eles sejam preparados como uma única cadeia de proteína na qual as regiões Vl e Vh emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como anticorpos de cadeia única ou Fv de cadeia única (scFv), ver por exemplo Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) e Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)). Tais anticorpos de cadeia única estão englobados dentro do termo anticorpo a não ser que de outro modo notado ou claramente indicado pelo contexto. Outras formas de anticorpos de cadeia única, tais como diacorpos, estão incluídas dentro do termo anticorpo. Embora tais fragmentos estejam geralmente incluídos dentro do significado de anticorpo são coletivamente e, cada um independentemente, características únicas da presente invenção, exibindo diferentes propriedades biológicas e utilidade. Estes e outros fragmentos de anticorpo úteis no contexto da presente invenção são adicionalmente descritos aqui.

Deve ser também entendido que o termo anticorpo inclui também geralmente anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (mAbs), polipéptidos tipo anticorpo, tais como anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados, anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) para anticorpos, e fragmentos de anticorpo retendo a capacidade de se ligarem especificamente ao antigénio (fragmentos de ligação a antigénio) proporcionados por qualquer técnica conhecida, tal como clivagem enzimática, síntese de péptidos, e técnicas recombinantes. Um anticorpo como gerado pode possuir qualquer isotipo.

Os termos "anticorpo anti-CD38" e "anticorpo para CD38" são usados indistintamente aqui. Um anticorpo anti-CD38, ou um anticorpo para CD38, é um anticorpo como descrito acima, que se liga especificamente ao antigénio CD38. 0 termo "epítopo" significa um determinante de proteina capaz de ligação especifica a um anticorpo. Os epitopos consistem usualmente em agrupamentos com superfície quimicamente ativa de moléculas tais como cadeias de aminoácidos ou açúcar laterais e têm usualmente características estruturais tridimensionais especificas, bem como caracteristicas de carga especificas. Os epitopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos por a ligação aos primeiros, mas não aos últimos ser perdida na presença de solventes desnaturantes. 0 epítopo pode compreender resíduos de aminoácidos diretamente envolvidos na ligação (também chamados componentes imunodominante do epítopo) e outros resíduos de aminoácidos, que não estão diretamente envolvidos na ligação, tais como resíduos de aminoácidos que são efetivamente bloqueados pelo péptido de ligação específica ao antigénio (por outras palavras, o resíduo de aminoácido está dentro da pegada do péptido de ligação específica ao antigénio). 0 termo "molécula biespecífica" destina-se a incluir qualquer agente, tal como uma proteína, péptido, ou complexo de proteína ou péptido, que tem duas especificidades de ligação diferentes. Por exemplo, a molécula pode ligar-se a, ou interagir com, (a) um antigénio da superfície da célula e (b) um recetor de Fc na superfície de uma célula efetora. 0 termo "molécula multiespecífica" destina-se a incluir qualquer agente, por exemplo uma proteína, péptido, ou complexo de proteína ou péptido, que tem mais do que duas especificidades de ligação diferentes. Por exemplo, a molécula pode ligar-se a, ou interagir com, (a) um antigénio da superfície da célula, (b) um recetor de Fc na superfície de uma célula efetora, e (c) pelo menos um outro componente. Conformemente, a presente invenção inclui, mas não está limitada a, moléculas biespecíficas, triespecificas, tetraespecíficas, e outras multiespecíficas que são dirigidas a CD38, e a outros antigénios ou alvos da superfície da célula, tais como recetores de Fc em células efetoras. 0 termo "anticorpos biespecíficos" destina-se a incluir qualquer anticorpo anti-CD38, que é uma molécula biespecífica. 0 termo "anticorpos biespecíficos" inclui também diacorpos. Os diacorpos são anticorpos biespecíficos, bivalentes nos quais os domínios Vh e Vl são expressos numa única cadeia de polipéptidos, mas usando um ligante para seja demasiado curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando deste modo os domínios a emparelharem com domínios complementares de outra cadeia e criando dois locais de ligação ao antigénio (ver por exemplo Holliger, P. et al., PNAS USA 90, 6444-6448 (1993), Poljak, R. J. et al., Structure 2, 1121-1123 (1994)).

Como usado aqui, o termo "célula efetora" refere-se a uma célula imune que está envolvida na fase efetora de uma resposta imune, em oposição às fases cognitivas e de ativação de uma resposta imune. Células imunes exemplares incluem uma célula de uma origem mieloide ou linfoide, por exemplo linfócitos (tais como células B e células T incluindo células T citotóxicas (CTLs)), células matadoras, células matadoras naturais, macrófagos, monócitos, eosinófilos, neutrófilos, células polimorfonucleares, granulócitos, mastócitos e basófilos. Algumas células efetoras expressam recetores de Fc específicos e levam a cabo funções imunes específicas. Em algumas formas de realização, uma célula efetora é capaz de induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), tal como um neutrófilo capaz de induzir ADCC. Por exemplo, monócitos, macrófagos, que expressam FcR, estão envolvidos na morte específica de células alvo e apresentação de antigénios a outros componentes do sistema imune, ou ligação a células que apresentam antigénios. Em algumas formas de realização, uma célula efetora pode fagocitar um antigénio alvo, célula alvo, ou microrganismo. A expressão de um FcR particular numa célula efetora pode ser regulada por fatores humorais tais como citocinas. Por exemplo descobriu-se que a expressão de FcyRI era sobrerregulada pelo interferão γ (IFN-γ) e/ou G-CSF. Esta expressão intensificada aumenta a atividade citotóxica de células transportando FcyRI contra alvos. Uma célula efetora pode fagocitar ou lisar um antigénio alvo ou uma célula alvo. 0 termo "anticorpo humano", como usado aqui, destina-se a incluir anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulinas da linha germinativa de humanos. Os anticorpos humanos da presente invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulinas da linha germinativa de humanos (por exemplo mutações introduzidas por mutagénese aleatória ou sítio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo). No entanto, o termo "anticorpo humano", como usado aqui, não se destina a incluir anticorpos nos quais sequências de CDR derivadas da linha germinativa de outras espécies de mamíferos, tais como um ratinho, foram enxertadas em sequências de framework humanas.

Como usado aqui, um anticorpo humano é "derivado de" uma sequência de linha germinativa particular se o anticorpo for obtido de um sistema usando sequências de imunoglobulinas humanas, por exemplo por imunização de um ratinho transgénico transportando genes de imunoglobulinas humanas ou por rastreio de uma biblioteca de genes de imunoglobulinas humanas, e em que o anticorpo humano selecionado é pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, por exemplo pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, por exemplo pelo menos 98%, ou tal como pelo menos 99% idêntico na sequência de aminoácidos à sequência de aminoácidos codificada pelo segmento de gene da região variável VH ou Vl da linha germinativa. Tipicamente, um anticorpo humano derivado de uma sequência de segmento de gene da região variável Vh ou Vl da linha germinativa de humanos exibirá não mais do que 10 diferenças de aminoácidos, tal como não mais do que 5, por exemplo não mais do que 4, 3, 2, ou 1 diferença de aminoácidos da sequência de aminoácidos codificada pelo gene das imunoglobulinas da linha germinativa.

Um anticorpo quimérico é um anticorpo que contém uma ou mais regiões de um anticorpo e uma ou mais regiões de um ou mais outros anticorpos, derivados de outras espécies. Um anticorpo quimérico monovalente é um dimero (HL) formado por uma cadeia H quimérica associada através de pontes de dissulfeto a uma cadeia L quimérica. Um anticorpo quimérico divalente é tetrâmero (H2L2) formado por dois dimeros HL associados através de pelo menos uma ponte de dissulfeto. Um anticorpo quimérico polivalente pode ser também produzido, por exemplo, por emprego de uma região Ch que oligomeriza (por exemplo de uma cadeia H de IgM, ou cadeia μ). Tipicamente, um anticorpo quimérico refere-se a um anticorpo no qual uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica a ou homóloga com sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencendo a um classe ou subclasse de anticorpos particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico a ou homólogo com sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (ver por exemplo US 4, 816, 567 e Morrison et al., PNAS USA 81, 6851-6855 (1984)). Os anticorpos quiméricos são produzidos por processos recombinantes bem conhecidos na técnica (ver por exemplo Cabilly et al., PNAS USA 81, 3273-3277 (1984), Morrison et al., PNAS USA 81, 6851-6855 (1984), Boulianne et al., Nature 312, 643-646 (1984), EP125023, Neuberger et al., Nature 314, 268-270 (1985), EP171496, EP173494, WO86/01533, EP184187, Shagan et al., J. Immunol. 137, 1066-1074 (1986), WO87/02671, Liu et al., PNAS USA 84, 3439-3443 (1987), Sun et al., PNAS USA 84, 214-218 (1987), Better et al., Science 240, 1041-1043 (1988) e Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I., (1988)).

Um anticorpo humanizado é um anticorpo que é derivado de uma espécie não humana, no qual certos aminoácidos nos dominios de framework e constantes das cadeias pesadas e leves foram mutados de modo a evitar ou abrogar uma resposta imune em humanos. As formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo de murino) são anticorpos quiméricos que contêm sequência minima derivada de imunoglobulina não humanas. Pela maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) nas quais residuos de uma região hipervariável do recipiente são substituídos por residuos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato, coelho ou primata não humano tendo as caracteristicas de ligação ao antigénio desejadas tais como especificidade, e afinidade. Em alguns casos, os residuos da região de framework (FR) de Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além do mais, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo dador. Estas modificações são feitas para otimizar adicionalmente o desempenho do anticorpo. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos os de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. Um anticorpo humanizado compreenderá também opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) de imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais ver Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986), Riechmann et al.r Nature 332, 323-329 (1988) e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596 (1992).

Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" como usados aqui referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal exibe uma especificidade e afinidade de ligação únicas para um epítopo particular. Conformemente, o termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos exibindo uma especificidade de ligação única que têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa de humanos. Os anticorpos monoclonais humanos podem ser gerados por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano transgénico ou transcromossomal, tal como um ratinho transgénico, tendo um genoma compreendendo um transgenes de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve humanas, fundida com uma célula imortalizada. Um anticorpo monoclonal pode ser abreviado como mAb. 0 termo "anticorpo humano recombinante", como usado aqui, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados de um animal (tal como um ratinho) que é transgénico ou transcromossomal quanto aos genes de imunoglobulinas humanas ou um hibridoma preparado a partir deles (descrito noutro lugar aqui), (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, tal como de um transfectoma, (c) anticorpos isolados de uma biblioteca combinatorial, recombinante de anticorpos humanos, e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva processamento de sequências de genes de imunoglobulinas humanas com outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulinas da linha germinativa de humanos. Em certas formas de realização, no entanto, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser sujeitos a mutagénese in vitro (ou, quando é usado um animal transgénico para sequências para Ig humanas, mutagénese somática in vivo) e assim as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas com sequências de Vh e Vl da linha germinativa, podem não existir naturalmente dentro do repertório da linha germinativa de anticorpos humanos in vi vo.

Como usado aqui, um "anticorpo heterólogo" é definido em relação ao organismo não humano transgénico produzindo um tal anticorpo. Este termo refere-se a um anticorpo tendo uma sequência de aminoácidos correspondendo àquela encontrada num organismo não consistindo no animal não humano, e geralmente de uma espécie sem ser aquela do animal não humano transgénico.

Um "anticorpo isolado", como usado aqui, destina-se a se referir a um anticorpo que está substancialmente isento de outros anticorpos tendo diferentes especificidades antigénicas (por exemplo um anticorpo isolado que se liga especificamente a CD38 está substancialmente isento de anticorpos que se ligam especificamente a antigénios sem ser CD38). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a um epitopo, isoforma ou variante de CD38 humano pode, no entanto, ter reatividade cruzada com outros antigénios relacionados, por exemplo de outras espécies (tais como homólogos de espécies de CD38). Além do mais, um anticorpo isolado pode estar substancialmente isento de outro material celular e/ou quimicos. Numa forma de realização da presente invenção, uma combinação de anticorpos monoclonais "isolados" tendo diferentes especificidades é combinada numa composição bem definida.

Como usada aqui, "ligação especifica" refere-se a um péptido de ligação a antigénio, tal como um anticorpo, ligando-se a um antigénio pré-determinado. Tipicamente, um péptido de ligação a antigénio, tal como um anticorpo, liga-se com uma afinidade correspondendo a uma Kd de cerca de IO-7 M ou menor, tal como cerca de IO-8 M ou menor, tal como cerca de IO-9 M ou menor, cerca de 10~10 M ou menor, ou cerca de IO-11 M ou mesmo menor quando determinada por tecnologia de ressonância de plasmão de superfície (SPR) num instrumento BIAcore 3000 usando CD38 recombinante como o ligando e o anticorpo como o analito. O péptido de ligação a antigénio pode ligar-se ao antigénio pré-determinado com uma afinidade correspondendo a uma Kd que é pelo menos dez vezes menor, tal como pelo menos 100 vezes menor, por exemplo pelo menos 1000 vezes menor, tal como pelo menos 10.000 vezes menor, por exemplo pelo menos 100.000 vezes menor do que a sua afinidade para ligação a um antigénio não especifico (p.ex., BSA, caseína) sem ser o antigénio pré-determinado ou um antigénio intimamente relacionado. A quantidade com a qual a afinidade é menor está dependente da Kd do péptido de ligação a antigénio, tal que, quando a KD do péptido de ligação a antigénio é muito baixa (isto é, o péptido de ligação a antigénio é altamente específico), então a quantidade com a qual a afinidade para o antigénio é menor do que a afinidade para um antigénio não específico pode ser pelo menos 10.000 vezes. As frases "um péptido de ligação a antigénio reconhecendo um antigénio" e "um péptido de ligação a antigénio específico para um antigénio" são usadas indistintamente aqui com o termo "um péptido de ligação a antigénio que se liga especificamente a um antigénio". Do mesmo modo, as frases "um anticorpo reconhecendo um antigénio" e "um anticorpo específico para um antigénio" são usados indistintamente aqui com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antigénio". O termo "kd" (seg-1) , como usado aqui, destina-se a referir à constante da taxa de equilíbrio de dissociação de uma interação anticorpo-antigénio particular. O referido valor é também referido como o valor k0ff. O termo "ka" (M_1 x seg-1) , como usado aqui, destina-se a referir à constante da taxa de equilíbrio de associação de uma interação anticorpo-antigénio particular. O termo "KD" (M), como usado aqui, destina-se a referir à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação anticorpo-antigénio particular. 0 termo "Κα" (Μ-1) , como usado aqui, destina-se a referir à constante de equilíbrio de associação de uma interação anticorpo-antigénio particular e é obtida por divisão da ka pela kd.

Como usado aqui, "isotipo" refere-se à classe de anticorpos (por exemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM) que é codificada por genes da região constante de cadeia pesada.

Como usada aqui, "troca de isotipos" refere-se ao fenómeno pelo qual a classe, ou isotipo, de um anticorpo muda de uma classe de imunoglobulinas para uma das outras classes de imunoglobulinas.

Como usado aqui, "isotipo não trocado" refere-se à classe isotípica de cadeia pesada que é produzida quando não teve lugar nenhuma troca de isotipos; o gene CH codificando o isotipo não trocado é tipicamente o primeiro gene CH imediatamente a jusante do gene VDJ funcionalmente rearranjado. A troca de isotipos foi classificada como troca de isotipos clássica ou não clássica. A troca de isotipos clássica ocorre por eventos de recombinação que envolvem pelo menos uma região de sequência de troca no transgene. A troca de isotipos não clássica pode ocorrer por, por exemplo, recombinação homóloga entre σμ humana e Σμ humana (eliminação associada a δ) . Mecanismos de troca não clássica alternativos, tais como recombinação intertransgenes e/ou intercromossomal, entre outros, podem ocorrer e efetuar troca de isotipos.

Como usado aqui, o termo "sequência de troca" refere-se àquelas sequências de DNA responsáveis por recombinação de troca. Uma sequência "dadora de troca", tipicamente uma região de troca μ, estará a 5" (i.e., a montante) da região de constructo a ser eliminada durante a recombinação de troca. A região "aceitadora de troca" estará entre a região de constructo a ser eliminada e a região constante de substituição (por exemplo γ, ε, etc.). Como não existe nenhum local específico onde a recombinação ocorra sempre, a sequência de gene final não será tipicamente previsível a partir do constructo.

Como usado aqui, "padrão de glicosilação" é definido como o padrão de unidades de carboidrato que estão covalentemente anexadas a uma proteína, mais especificamente a uma proteína de imunoglobulina (anticorpo). Um padrão de glicosilação de um anticorpo heterólogo pode ser caracterizado como sendo substancialmente similar a padrões de glicosilação que ocorrem naturalmente em anticorpos produzido pela espécie do animal transgénico não humano, quando um com perícia ordinária na técnica reconheceria o padrão de glicosilação do anticorpo heterólogo como sendo mais similar ao referido padrão de glicosilação na espécie do animal transgénico não humano do que a espécie da qual os genes CH do transgenes foram derivados. 0 termo "ocorrendo naturalmente" como usado aqui como aplicado a um objeto refere-se ao facto de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, um polipéptido ou sequência de polinucleótidos que está presente num organismo (incluindo vírus) que pode ser isolado de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado pelo homem no laboratório ocorre naturalmente. 0 termo "rearranjado" como usado aqui refere-se a uma configuração de um lócus de imunoglobulina de cadeia pesada ou cadeia leve em que um segmento V está posicionado imediatamente adjacente a um segmento D-J ou J numa conformação codificando essencialmente um domínio Vh ou Vl completo, respetivamente. Um lócus de gene de imunoglobulina (anticorpo) rearranjado pode ser identificado por comparação com DNA da linha germinativa; um lócus rearranjado terá pelo menos um elemento de homologia de heptâmero/nonâmero. 0 termo "não rearranjado" ou "configuração da linha germinativa" como usado aqui em referência a um segmento V refere-se à configuração em que o segmento V não é recombinado de modo a estar imediatamente adjacente a um segmento D ou J. 0 termo "molécula de ácido nucleico", como usado aqui, destina-se a incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ter cadeia única ou cadeia dupla, mas é preferencialmente DNA de cadeia dupla. Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, num lisato de células, ou numa forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando purificado de outros componentes celulares ou outros contaminantes, tais como outros ácidos nucleicos ou proteínas celulares, por técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, obtenção de bandas com CsCl, cromatografia em coluna, eletroforese em gel de agarose e outras bem conhecidas na técnica. Ver, F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience Nova Iorque (1987).

Um ácido nucleico está "operacionalmente ligado" quando está colocado numa relação funcional com outra sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, um promotor ou intensificador está operacionalmente ligado a uma sequência codificante se afetar a transcrição da sequência. No que diz respeito à transcrição de sequências reguladoras, operacionalmente ligado significa que as sequências de DNA estando ligadas são contíguas e, onde necessário para unir duas regiões codificantes de proteínas, contíguas e em grelha de leitura. Para sequências de troca, operacionalmente ligado indica que as sequências são capazes de efetuar recombinação de troca.

Como usado aqui, o termo "inibe o crescimento" (por exemplo quando se refere a células) destina-se a inclui qualquer diminuição mensurável no crescimento de células quando contactadas com um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38, em comparação com o crescimento das mesmas células não em contacto com um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38, por exemplo uma inibição do crescimento de uma cultura de células em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ou 100%.

Como usados aqui, os termos "inibe a ligação" e "bloqueia a ligação" (por exemplo quando se referem à inibição/bloqueio da ligação a um parceiro de ligação de CD38 a CD38) são usados indistintamente e englobam inibição/bloqueio tanto parcial como completo. A inibição/bloqueio de um parceiro de ligação de CD38 a CD38 pode reduzir ou alterar o nível ou tipo de sinalização celular normal que ocorre quando um parceiro de ligação de CD38 se liga a CD38 sem inibição ou bloqueio. A inibição e bloqueio destinam-se também a incluir qualquer diminuição mensurável na afinidade de ligação de um parceiro de ligação de CD38 a CD38 quando em contacto com um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38, em comparação com o ligando não em contacto com um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38, por exemplo um bloqueio da ligação de um parceiro de ligação de CD38 a CD38 em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99%, ou 100%. "Célula alvo" deverá significar qualquer célula indesejável num sujeito (por exemplo um humano ou animal) que possa ser visada por uma composição (compreendendo por exemplo um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38 monoclonal humano, e/ou uma molécula biespecífica ou multiespecifica dirigida contra CD38) da presente invenção. Em algumas formas de realização, a célula alvo é uma célula expressando ou sobre-expressando CD38. As células expressando CD38 incluem tipicamente células hematopoiéticas, tais como timócitos medulares, células T e B ativadas, 80% de células NK e monócitos em repouso, linfoblastos dos centros germinais de linfonodos, células B plasmáticas e algumas células intrafoliculares, células dendriticas, células normais da medula óssea, células precursoras particulares, 50-80% das células sanguíneas do cordão umbilical, eritrócitos e plaquetas. CD38 pode ser também expresso por células não hematopoiéticas, tais como células intraepiteliais e linfócitos da lâmina própria no intestino, por células de Purkinje e emaranhados fibrilares no cérebro, por células epiteliais na próstata, células β no pâncreas, osteoclastos no osso, células da retina no olho, e sarcolema de músculo liso e estriado. Em células malignas, CDR38 é expresso numa variedade de doenças hematológicas malignas, incluindo mas não se restringindo a mieloma múltiplo, leucemia de células plasmáticas primárias ou secundárias, leucemia linfocítica crónica de células B, leucemia linfocítica aguda de células B, macroglobulinemia de Waldenstrõm, amiloidose sistémica primária, linfoma das células do manto, leucemia pró-linfocítica/mielocítica, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, linfoma folicular e leucemia de células NK. O termo "vetor", como usado aqui, destina-se a se referir a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a um laço de DNA de cadeia dupla circular no qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor virai, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma virai. Certos vetores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo vetores bacterianos tendo uma origem de replicação bacteriana e vetores epissomais de mamifero) . Outros vetores (tais como vetores não epissomais de mamífero) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após introdução na célula hospedeira, e são deste modo incorporados em conjunto com o genoma hospedeiro. Além do mais, certos vetores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais estão operacionalmente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão recombinantes" (ou, simplesmente, "vetores de expressão"). Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmideos. Na presente especificação, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados indistintamente pois o plasmídeo é a forma de vetor mais comummente usada. No entanto, a presente invenção destina-se a incluir tais outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (tais como retrovírus, adenovírus e vírus adenoassociados defeituosos na replicação), que servem funções equivalentes. 0 termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira"), como usado aqui, destina-se a se referir a uma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido. Deve ser entendido que tais termos destinam-se a se referirem não só à célula em questão particular mas à descendência de uma tal célula. Porque podem ocorrer certas modificações em gerações sucessivas devido a mutação ou influências ambientais, tal descendência pode, de facto, não ser idêntica à célula progenitora, mas está ainda incluida dentro do âmbito do termo "célula hospedeira" como usado aqui. As células hospedeiras recombinantes incluem, por exemplo, transfectomas, tais como células CHO, células NS/0, e células linfociticas. O termo "sequência reguladora" destina-se a incluir promotores, intensificadores e outros elementos de controlo da expressão (por exemplo sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes de cadeia de anticorpos. Tais sequências reguladoras estão descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Será apreciado por aqueles peritos na técnica que a conceção do vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências reguladoras, pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nivel de expressão de proteína desejado, etc. Exemplos de sequências reguladoras para expressão em células hospedeiras de mamífero incluem elementos virais que dirigem elevados níveis de expressão de proteína em células de mamífero, tais como promotores e/ou intensificadores derivados do citomegalovírus (CMV), Vírus Símio 40 (SV4 0), adenovírus (p.ex., o grande promotor tardio de adenovírus (AdMLP)) e polioma. Alternativamente podem ser usadas sequências reguladoras não virais, tais como o promotor da ubiquitina ou promotor da β-globina.

Como usado aqui, o termo "sujeito" inclui qualquer humano ou animal não humano. O termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, por exemplo mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelha, cão, vaca, galinhas, anfíbios, répteis, etc.

As várias formas do termo "transfecção" destinam-se a englobar uma ampla variedade de técnicas comummente usadas para a introdução de DNA exógeno numa célula hospedeira procariótica ou eucariótica, p.ex., eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextrano, transfecção com lipofectina e similares. 0 termo "transfectoma", como usado aqui, inclui células hospedeiras eucarióticas recombinantes expressando o anticorpo, tais como células CHO, células NS/0, células HEK293, células vegetais, ou fungos, incluindo células de levedura. 0 termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelha, cão, vaca, galinhas, anfíbios, répteis, etc.

Os termos "animal não humano, transgénico" refere-se a um animal não humano tendo um genoma compreendendo um ou mais transgenes ou transcromossomas de cadeia pesada e/ou leve humana (integrados ou não integrados no DNA genómico natural do animal) e que é capaz de expressar anticorpos totalmente humanos. Por exemplo, um ratinho transgénico pode ter um transgene de cadeia leve humana e um transgene de cadeia pesada humana ou transcromossoma de cadeia pesada humana, tal que o ratinho produza anticorpos anti-CD38 de humano quando imunizado quando antigénio CD38 e/ou células expressando CD38. 0 transgene de cadeia pesada humana pode ser integrado no DNA cromossomal do ratinho, como é o cas para ratinhos transgénicos, por exemplo ratinhos HuMAb, tais como ratinhos HCo7 ou HCol2, ou o transgene de cadeia pesada humana pode ser mantido extracromossomalmente, como é o caso para ratinhos KM transcromossomais como descritos em WO02/43478. Tais ratinhos transgénicos e transcromossomais (coletivamente referidos como "ratinhos transgénicos") são capazes de produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais humanos para um dado antigénio (tais como IgG, IgA, IgM, IgD e/ou IgE) por submissão a recombinação V-D-J e troca de isotipos. Animal não humano, transgénico pode ser também usado para produção de anticorpos contra um antigénio especifico por introdução de genes codificando tal anticorpo especifico, por exemplo por ligação operacional dos genes a um gene que é expresso no leite do animal. 0 termo especificidade aqui refere-se à capacidade de um péptido de ligação a CD38, tal como um anticorpo anti-CD38, de reconhecer um epítopo dentro de CD38, enquanto tem somente pouca ou nenhuma reatividade detetável com outras porções de CD38 (incluindo outros epitopos que são ligados por outros CD38BPs, tais como anticorpos anti-CD38). A especificidade pode ser relativamente determinada por ensaios de competição como descritos aqui. A especificidade pode ser mais particularmente determinada por qualquer uma das técnicas de identificação/caracterização de epitopos descritas aqui ou seus equivalentes conhecidos na técnica.

Um anticorpo especifico quanto a um determinante antigénio particular pode, não obstante, reagir de modo cruzado com outras biomoléculas que podem estar presentes em algum contexto biológico com CD38. Mais tipicamente, um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38, pode reagir de modo cruzado com homólogos de CD38 de outras espécies. Em qualquer um dos ou ambos os contextos, tipicamente tais anticorpos reativos de modo cruzados são seletivos quanto a CD38 humano no que diz respeito à estrutura e/ou fatores ambientais relevantes. 0 termo seletividade aqui refere-se à ligação preferencial de um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38, quanto a uma região, alvo, ou péptido particular; tipicamente uma região ou epitopo em CD38, em oposição a uma ou mais outras biomoléculas biológicas, estruturas, células, tecidos, etc. Numa forma de realização, um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38 da presente invenção, é seletivo quanto a uma porção de CD38 no contexto de células cancerígenas do cólon (i.e., o anticorpo anti-CD38 ligar-se-á seletivamente à porção de CD38 em relação a outros componentes de uma célula cancerígena do cólon).

Os anticorpos para CD38 da presente invenção são tipicamente usados numa e proporcionados numa forma pelo menos substancialmente isolada. Uma molécula substancialmente isolada é uma molécula que é a espécie predominante na composição em que é encontrada no que diz respeito à classe de moléculas à qual pertence (i.e., constitui até pelo menos cerca de 50% do tipo de molécula na composição e constituirá tipicamente até pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou mais da espécie de molécula, p.ex., péptido, na composição (p.ex., a composição exibirá pelo menos cerca de 98%, 98%, ou 99% de homogeneidade para o CD38BP no contexto de todas as espécies de péptido presentes)).

Uma molécula isolada refere-se a uma molécula que não está associada a níveis significativos (tais como maiores do que cerca de 1%, maiores do que cerca de 2%, maiores do que cerca de 3%, ou maiores do que cerca de 55) de quaisquer fatores exteriores e fisiológicos indesejáveis, tais como biomoléculas não de ligação a CD38 (ou moléculas de ligação a CD38 que podem interferir com a ligação e/ou atividade um anticorpo para CD38 da presente invenção) contidas dentro de uma célula ou animal no qual o anticorpo é produzido. Uma molécula isolada refere-se também a qualquer molécula que passou através de uma etapa de pureza devido a intervenção humana (quer automática, manual ou ambas). Em muitas das várias composições proporcionadas pela presente invenção, tal como numa composição compreendendo um ou mais transportadores farmaceuticamente aceitáveis, um anticorpo para CD38 pode estar presente em quantidades relativamente pequenas em termos de números de espécies moleculares totais na composição (por exemplo no caso de uma composição compreendendo uma grande quantidade de um transportador farmaceuticamente aceitável, estabilizante e/ou conservante). Em alguns casos, péptidos adicionais, tais como BSA, podem ser incluídos numa tal composição com um anticorpo previamente purificado. No entanto, contanto que tais constituintes adicionais da composição sejam aceitáveis para a aplicação pretendida do anticorpo, uma tal composição pode ser ainda descrita como compreendendo um anticorpo isolado.

Os anticorpos para CD38 da presente invenção estão tipicamente substancialmente isentos de outros CD38BPs, tais como CD38BPs tendo especificidades antigénicas diferentes. No entanto, a presente invenção proporciona também uma composição compreendendo um número de anticorpos para CD38BP com especificidades e caracteristicas diferentes (por exemplo a presente invenção proporciona um "cocktail" de CD38BPs tendo caracteristicas de especificidade e/ou seletividade diferentes). "Tratamento" significa a administração de uma quantidade eficaz de um composto terapeuticamente ativo da presente invenção com o propósito de facilitar, melhorar ou erradicar (curar) sintomas ou estados de doença. São descritos aqui: um CD38BP compreendendo uma região Vl consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 2; um CD38BP compreendendo uma região Vh consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 6; um CD38BP compreendendo uma região Vl consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 2 e uma região Vh consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 6; um CD38BP compreendendo uma CDRl de Vl consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 3; um CD38BP compreendendo uma CDR2 de Vl consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 4; um CD38BP compreendendo uma CDR3 de Vl consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 5; um CD38BP compreendendo uma CDRl de Vh consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 8; um CD38BP compreendendo uma CDR2 de VH consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 9; um CD38BP compreendendo uma CDR3 de Vh consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 10; - um CD38BP compreendendo CDRs de Vl (CDRl, CDR2, e CDR3 de VL) consistindo essencialmente em SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4 e SEQ ID No: 5, respetivamente; - um CD38BP que compreende CDRs de Vh (CDRl, CDR2, e CDR3 de VH) consistindo essencialmente em SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9 e SEQ ID No: 10, respetivamente; um CD38BP que compreende (a) três CDRs de Vl, que independentemente consistem essencialmente em SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4 e SEQ ID No: 5 em proximidade intima umas com as outras (p.ex., próximo do espaçamento de CDRs de VL num anticorpo anti-CD38 de tipo selvagem) no CD38BP e (b) três CDRs de Vh que independentemente consistem essencialmente em SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9 e SEQ ID No: 10 em proximidade intima umas com as outras (p.ex., próximo do espaçamento de CDRs de VH num anticorpo anti-CD38 de tipo selvagem) no CD38BP; - um CD38BP que compreende um ligante flexivel posicionado entre a região Vl e região Vh do CD38BP; - um CD38BP, em que as regiões VL e VH são apresentadas em cadeias separadas no contexto de uma proteína de dobragem de imunoglobulina e orientadas tal que as CDR1, CDR2, CDR3 de VL e CDR1, CDR2, e CDR3 de VH se associem cooperativamente para contribuir na ligação seletiva e/ou específica de um determinante antigénico em CD38. um CD38BP que compreende dois conjuntos de domínios variáveis (conjuntos de domínios VL e Vh associados em cadeias separadas associadas), tal que o CD38BP compreenda dois locais de ligação de determinantes antigénicos idênticos.

Espera-se que qualquer um de tais CD38BPs descrito neste parágrafo, pelo menos em parte, tenha especificidade de epítopo, seletividade, e outras características que um

anticorpo tendo região VL compreendendo a sequência de SEQ

ID No: 2 e uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID No: 7, e, conformemente, pode ser útil no tratamento do mieloma múltiplo.

Numa forma de realização, o anticorpo para CD37 da invenção compreende uma região VL consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 12.

Numa forma de realização, o anticorpo para CD37 da invenção compreende uma região VH consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 17.

Numa forma de realização, o anticorpo para CD37 da invenção compreende uma região VL consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 12 e uma região Vh consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 17. São descritos aqui: um CD38BP compreendendo uma CDR1 de VL consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 13; um CD38BP compreendendo uma CDR2 de Vl consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 14; um CD38BP compreendendo uma CDR3 de Vl consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 15; um CD38BP compreendendo uma CDR1 de Vh consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 18; um CD38BP compreendendo uma CDR2 de Vh consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 19; um CD38BP compreendendo uma CDR3 de VH consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 20; - um CD38BP compreendendo CDRs de Vl (CDR1, CDR2, e CDR3 de Vl) consistindo essencialmente em SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14 e SEQ ID No: 15, respetivamente; e - um CD38BP que compreende CDRs de Vh (CDR1, CDR2, e CDR3 de VH) consistindo essencialmente em SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 19 e SEQ ID No: 20, respetivamente.

Numa forma de realização, o anticorpo para CD37 da invenção compreende (a) três CDRs de VL, que independentemente consistem essencialmente em SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14 e SEQ ID No: 15 em proximidade intima umas com as outras (p.ex., próximo do espaçamento de CDRs de Vl num anticorpo anti-CD38 de tipo selvagem) no CD38BP e (b) três CDRs de Vh que independentemente consistem essencialmente em SEQ ID No: 18, SEQ ID No: 19 e SEQ ID No: 20 em proximidade intima umas com as outras (p.ex., próximo do espaçamento de CDRs de Vh num anticorpo anti-CD38 de tipo selvagem) no anticorpo.

Os anticorpos para CD38 da invenção podem compreender um ligante flexível posicionado entre a região Vl e região Vh do CD38BP. As regiões Vl e VH podem ser apresentadas em cadeias separadas no contexto de uma proteína de dobragem de imunoglobulina e orientadas tal que as CDR1, CDR2, CDR3 de VL e CDR1, CDR2, e CDR3 de VH se associem cooperativamente para contribuir na ligação seletiva e/ou específica de um determinante antigénico em CD38. 0 anticorpo pode compreender dois conjuntos de domínios variáveis (conjuntos de domínios Vl e VH associados em cadeias separadas associadas), tal que o anticorpo compreenda dois locais de ligação de determinantes antigénicos idênticos.

Espera-se que qualquer um de tais CD38BPs e anticorpos descrito neste parágrafo, pelo menos em parte, tenha especificidade de epítopo, seletividade, e outras características que um anticorpo tendo região Vl compreendendo a sequência de SEQ ID No: 12 e uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID No: 17, e, conformemente, pode ser útil no tratamento do mieloma múltiplo. São descritos aqui: um CD38BP compreendendo um região Vl consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 22; um CD38BP compreendendo uma região Vh consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 27; um CD38BP compreendendo uma região Vl consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 22 e uma região Vh consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 27; um CD38BP compreendendo uma CDRl de Vl consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 23; um CD38BP compreendendo uma CDR2 de Vl consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 24; um CD38BP compreendendo uma CDR3 de Vl consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 25; um CD38BP compreendendo uma CDR1 de Vh consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 28; um CD38BP compreendendo uma CDR2 de Vh consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 29; um CD38BP compreendendo uma CDR3 de VH consistindo essencialmente na sequência de SEQ ID No: 30; - um CD38BP compreendendo CDRs de Vl (CDR1, CDR2, e CDR3 de Vl) consistindo essencialmente em SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 24 e SEQ ID No: 25, respetivamente; - um CD38BP que compreende CDRs de VH (CDRl, CDR2, e CDR3 de VH) consistindo essencialmente em SEQ ID No: 28, SEQ ID No: 29 e SEQ ID No: 30, respetivamente; um CD38BP que compreende (a) três CDRs de Vl, que independentemente consistem essencialmente em SEQ ID No: 23, SEQ ID No: 24 e SEQ ID No: 25 em proximidade intima umas com as outras (p.ex., próximo do espaçamento de CDRs de Vl num anticorpo anti-CD38 de tipo selvagem) no CD38BP e (b) três CDRs de VH que independentemente consistem essencialmente em SEQ ID No: 28, SEQ ID No: 29 e SEQ ID No: 30 em proximidade intima umas com as outras (p.ex., próximo do espaçamento de CDRs de Vh num anticorpo anti-CD38 de tipo selvagem) no CD38BP; - um CD38BP que compreende um ligante flexível posicionado entre a região VL e região Vh do CD38BP; um CD38BP, em que as regiões VL e VH podem ser apresentadas em cadeias separadas no contexto de uma proteína de dobragem de imunoglobulina e orientadas tal que as CDRl, CDR2, CDR3 de VL e CDRl, CDR2, e CDR3 de VH se associem cooperativamente para contribuir na ligação seletiva e/ou específica de um determinante antigénico em CD38 ; - um CD38BP que compreende dois conjuntos de domínios variáveis (conjuntos de domínios Vl e Vh associados em cadeias separadas associadas) , tal que o CD38BP compreenda dois locais de ligação de determinantes antigénicos idênticos.

Espera-se que qualquer um de tais CD38BPs descrito neste parágrafo, pelo menos em parte, tenha especificidade de epítopo, seletividade, e outras características que um

anticorpo tendo região VL compreendendo a sequência de SEQ

ID No: 22 e uma região Vh compreendendo a sequência de SEQ ID No: 27, e, conformemente, pode ser útil no tratamento do mieloma múltiplo. São descritos aqui: um CD38BP compreendendo uma CDR1 de Vl consistindo essencialmente numa sequência de acordo com SEQ ID No: 3 ou SEQ ID No: 13 ou SEQ ID No: 23, em que o resíduo N-terminal e/ou um, dois, ou três dos resíduos de aminoácidos C-terminais estão em falta; um CD38BP compreendendo uma CDR2 de Vl consistindo essencialmente numa sequência de acordo com SEQ ID No: 4 ou SEQ ID No: 14 ou SEQ ID No: 24, em que um ou dois dos resíduos N-terminais e/ou um, dois, ou três dos resíduos de aminoácidos C-terminais estão em falta; um CD38BP compreendendo uma CDR3 de Vl consistindo essencialmente numa sequência de acordo com SEQ ID No: 5 ou SEQ ID No: 15 ou SEQ ID No: 25, em que o resíduo N-terminal e/ou um, dois, três, ou quatro dos resíduos de aminoácidos C-terminais estão em falta; um CD38BP compreendendo uma CDR1 de Vh consistindo essencialmente numa sequência de acordo com SEQ ID No: 8 ou SEQ ID No: 18 ou SEQ ID No: 28, em que um, dois, três, ou quatro dos resíduos N-terminais e/ou um, dois, três, ou quatro dos resíduos de aminoácidos C-terminais estão em falta; um CD38BP compreendendo uma CDR2 de Vh consistindo essencialmente numa sequência de acordo com SEQ ID No: 9 ou SEQ ID No: 19 ou SEQ ID No: 29, em que um, dois, três, quatro, ou cinco dos seus aminoácidos N-terminais e/ou um, dois, três, quatro, cinco, ou seis dos seus aminoácidos C-terminais estão em falta; um CD38BP compreendendo uma CDR3 de Vh consistindo essencialmente numa sequência de acordo com SEQ ID No: 10 ou SEQ ID No: 20 ou SEQ ID No: 30, em que o um, dois, ou três resíduos de aminoácidos N-terminais e/ou o um, dois, três, ou quatro resíduos de aminoácidos C-terminais estão em falta. São também descritos CD38BPs compreendendo variantes funcionais da região Vl, região Vh, ou uma ou mais CDRs dos anticorpos dos exemplos. Uma variante funcional de um Vl, Vh, ou CDR usada no contexto de um CD38BP permite ainda que o CD38BP retenha pelo menos uma proporção substancial (pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais) da afinidade/avidez e/ou especificidade/seletividade do anticorpo progenitor e em alguns casos um tal CD38BP pode estar associado com maior afinidade, seletividade, e/ou especificidade do que o anticorpo progenitor.

Numa forma de realização é proporcionado aqui uma ligação de anticorpo a CD38 humano compreendendo uma Vl variante consistindo essencialmente numa sequência tendo pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos 60%, por exemplo pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 75%, por exemplo pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 85%, por exemplo pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 95% de identidade de sequências de aminoácidos com uma sequência de acordo com SEQ ID No: 12, em que o CD38BP tem pelo menos uma proporção substancial (pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais) das caracteristicas de ligação de epitopo de um anticorpo tendo uma sequência de VL variante de SEQ ID No: 12, tal como um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 12 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 17. É descrito aqui um CD38BP compreendendo uma CDR1 de VL variante consistindo essencialmente numa sequência tendo pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos 60%, por exemplo pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 75%, por exemplo pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 85%, por exemplo pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 95% de identidade de sequências de aminoácidos com uma sequência de acordo com qualquer uma de SEQ ID No: 3 ou SEQ ID No: 13 ou SEQ ID No: 23, em que o CD38BP tem pelo menos uma proporção substancial (pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais) das caracteristicas de ligação de epitopo de um anticorpo tendo uma sequência de CDR1 de Vl variante de SEQ ID No: 3 ou SEQ ID No: 13 ou SEQ ID No: 23, respetivamente, tal como um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 2 ou SEQ ID No: 12 ou SEQ ID No: 22, respetivamente, tal como um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 2 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 7, ou um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 12 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 17, ou um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 22 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 27, respetivamente. É descrito aqui um CD38BP compreendendo uma CDR2 de VL variante consistindo essencialmente numa sequência tendo pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos 60%, por exemplo pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 75%, por exemplo pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 85%, por exemplo pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 95% de identidade de sequências de aminoácidos com uma sequência de acordo com qualquer uma de SEQ ID Nos: 4 ou 14, em que o CD38BP tem pelo menos uma proporção substancial (pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais) das caracteristicas de ligação de epítopo de um anticorpo tendo uma sequência de CDR2 de Vl variante de SEQ ID No: 4 ou SEQ ID No: 14 ou SEQ ID No: 24, respetivamente, tal como um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 2 ou SEQ ID No: 12 ou SEQ ID No: 22, respetivamente, tal como um anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 2 e uma sequência de Vh de SEQ ID No: 7, ou um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 12 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 17, ou um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 22 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 27, respetivamente. É descrito aqui um CD38BP compreendendo uma CDR3 de VL variante consistindo essencialmente numa sequência tendo pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos 60%, por exemplo pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 75%, por exemplo pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 85%, por exemplo pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 95% de identidade de sequências de aminoácidos com uma sequência de acordo com qualquer uma de SEQ ID No: 5 ou SEQ ID No: 15 ou SEQ ID No: 25, em que o CD38BP tem pelo menos uma proporção substancial (pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais) das caracteristicas de ligação de epítopo de um anticorpo tendo uma sequência de CDR3 de VL variante de SEQ ID No: 5 ou SEQ ID No: 15 ou SEQ ID No: 25, respetivamente, tal como um anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 2 ou SEQ ID No: 12 ou SEQ ID No: 22, respetivamente, tal como um anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 2 e uma sequência de Vh de SEQ ID No: 7, ou um anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 12 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 17, ou um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 22 e uma sequência de Vh de SEQ ID No: 27, respetivamente.

Numa forma de realização é proporcionado aqui uma ligação de anticorpo a CD38 humano compreendendo uma VH variante consistindo essencialmente numa sequência tendo pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos 60%, por exemplo pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 75%, por exemplo pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 85%, por exemplo pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 95% de identidade de sequências de aminoácidos com uma sequência de acordo com SEQ ID No: 17, em que o CD38BP tem pelo menos uma proporção substancial (pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais) das características de ligação de epítopo de um anticorpo tendo uma sequência de VH variante de SEQ ID No: 17, tal como um anticorpo tendo uma sequência de VH de SEQ ID No: 17 e uma sequência de VL de SEQ ID No: 12. É descrito aqui um CD38BP compreendendo uma CDR1 de VH variante consistindo essencialmente numa sequência tendo pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos 60%, por exemplo pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 75%, por exemplo pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 85%, por exemplo pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 95% de identidade de sequências de aminoácidos com uma sequência de acordo com qualquer uma de SEQ ID No: 8 ou SEQ ID No: 18 ou SEQ ID No: 28, em que o CD38BP tem pelo menos uma proporção substancial (pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais) das características de ligação de epítopo de um anticorpo tendo uma sequência de CDR1 de VH variante de SEQ ID No: 8 ou SEQ ID No: 18 ou SEQ ID No: 28, respetivamente, tal como um anticorpo tendo uma sequência de VH de SEQ ID No: 7 ou SEQ ID No: 17 ou SEQ ID No: 27, respetivamente, tal como um anticorpo tendo uma sequência de VH de SEQ ID No: 7 e uma sequência de VL de SEQ ID No: 2, ou um anticorpo tendo uma sequência de VH de SEQ ID No: 17 e uma sequência de VL de SEQ ID No: 12, ou um anticorpo tendo uma sequência de VH de SEQ ID No: 27 e uma sequência de Vl de SEQ ID No: 22, respetivamente. É descrito aqui um CD38BP compreendendo uma CDR2 de VH variante consistindo essencialmente numa sequência tendo pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos 60%, por exemplo pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 75%, por exemplo pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 85%, por exemplo pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 95% de identidade de sequências de aminoácidos com uma sequência de acordo com qualquer uma de SEQ ID No: 9 ou SEQ ID No: 19 ou SEQ ID No: 2 9, em que o CD38BP tem pelo menos uma proporção substancial (pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais) das caracteristicas de ligação de epitopo de um anticorpo tendo uma sequência de CDR2 de VH variante de SEQ ID No: 9 ou SEQ ID No: 19 ou SEQ ID No: 29, respetivamente, tal como um anticorpo tendo uma sequência de VH de SEQ ID No: 7 ou SEQ ID No: 17 ou SEQ ID No: 27, respetivamente, tal como um anticorpo tendo uma sequência de VH de SEQ ID No: 7 e uma sequência de VL de SEQ ID No: 2, ou um anticorpo tendo uma sequência de VH de SEQ ID No: 17 e uma sequência de VL de SEQ ID No: 12, ou um anticorpo tendo uma sequência de VH de SEQ ID No: 27 e uma sequência de Vl de SEQ ID No: 22, respetivamente. É descrito aqui um CD38BP compreendendo uma CDR3 de VH variante consistindo essencialmente numa sequência tendo pelo menos cerca de 50%, tal como pelo menos 60%, por exemplo pelo menos cerca de 70%, tal como pelo menos cerca de 75%, por exemplo pelo menos cerca de 80%, tal como pelo menos cerca de 85%, por exemplo pelo menos cerca de 90%, tal como pelo menos cerca de 95% de identidade de sequências de aminoácidos com uma sequência de acordo com qualquer uma de SEQ ID No: 10 ou SEQ ID No: 20 ou SEQ ID No: 30, em que o CD38BP tem pelo menos uma proporção substancial (pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais) das caracteristicas de ligação de epítopo de um anticorpo tendo uma sequência de CDR3 de VH variante de SEQ ID No: 10 ou SEQ ID No: 20 ou SEQ ID No: 30, respetivamente, tal como um anticorpo tendo uma sequência de VH de SEQ ID No: 7 ou SEQ ID No: 17 ou SEQ ID No: 27, respetivamente, tal como um anticorpo tendo uma sequência de VH de SEQ ID No: 7 e uma sequência de VL de SEQ ID No: 2, ou um anticorpo tendo uma sequência de VH de SEQ ID No: 17 e uma sequência de Vl de SEQ ID No: 12, ou um anticorpo tendo uma sequência de Vh de SEQ ID No: 27 e uma sequência de Vl de SEQ ID No: 22, respetivamente. A percentagem de identidade entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências (i.e., % de homologia = # de posições idênticas/# total de posições x 100), tomando em consideração o número de intervalos, e o comprimento de cada intervalo, que necessita de ser introduzido para alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação de sequências e determinação da percentagem de identidade entre duas sequências podem ser alcançadas usando um algoritmo matemático, como descrito nos exemplos não limitantes em baixo. A percentagem de identidade entre duas sequências de nucleótidos pode ser determinada usando o programa GAP no pacote de software GCG (disponível m http://www.gcg.com), usando uma matriz NWSgapdna. CMP e um peso de intervalo de 40, 50, 60, 70, ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. A percentagem de identidade entre duas sequências de nucleótidos ou aminoácidos pode ser também determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de intervalo de 12 e uma penalidade de intervalo de 4. Adicionalmente, a percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970) que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.

As sequências de ácidos nucleicos e proteínas como descritas aqui podem ser adicionalmente usadas como uma "sequência query" para realizar uma pesquisa contra bases de dados públicas para, por exemplo, identificar sequências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas usando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-10 (1990). As pesquisas de nucleótidos BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12 para se obterem sequências de nucleótidos homólogas com as moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção. As pesquisas de proteínas BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para se obterem sequências de aminoácidos homólogas com as moléculas de proteína da presente invenção. Para se obterem alinhamentos intervalados para propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et ai., Nucleic Acids Res. 25 (17), 3389-3402 (1997) .

Quando se utilizam os programas BLAST e Gapped BLAST podem ser usados os parâmetros default dos respetivos programas (p.ex., XBLAST e NBLAST). Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov. A sequência de variantes de CDR pode diferir da sequência da CDR das sequências de anticorpos progenitores através de substituições maioritariamente conservativas; por exemplo pelo menos cerca de 35%, cerca de 50% ou mais, cerca de 60% ou mais, cerca de 70% ou mais, cerca de 75% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 85% ou mais, cerca de 90% ou mais, cerca de 95% ou mais (p.ex., cerca de 65-99%) das substituições na variante são substituições de resíduos de aminoácidos conservativas. No contexto da presente invenção, as substituições conservativas podem ser definidas por substituições dentro das classes de aminoácidos refletidas numa ou mais das seguintes três tabelas:

Classes de resíduos de aminoácidos para substituições conservativas

Classes de substituição de resíduos de aminoácidos conservativas alternativas

Classificações Físicas e Funcionais Alternativas de Resíduos de Aminoácidos

Mais agrupamentos de substituições conservativas incluem: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina. Grupos adicionais de aminoácidos podem ser também formulados usando os princípios descritos em, p.ex., Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties (2a Ed. 1993), W. H. Freeman and Company.

Numa forma de realização, a conservação em termos de propriedades hidropáticas/hidrofilicas e peso/tamanho de resíduos é também substancialmente retida numa CDR variante em comparação com uma CDR de um anticorpo dos exemplos (p.ex., a classe de pesos, pontuação hidropática, ou ambas das sequências são pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou mais (p.ex., cerca de 65-99%) retidas). Por exemplo, as substituições de resíduos conservativas podem também ou alternativamente ser baseadas na substituição de grupos de conservação à base de peso fortes ou fracos, que são conhecidos na técnica. A retenção de resíduos similares pode também ou alternativamente ser medida por uma pontuação de similaridade, como determinada por uso de um programa BLAST (p.ex., BLAST 2.2.8 disponível através do NCBI). As variantes adequadas exibem tipicamente pelo menos cerca de 45%, tal como pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou mais (p.ex., cerca de 70-99%) similaridade com o péptido progenitor.

Mudanças substanciais na função podem ser feitas por seleção de substituições que são menos conservativas do que aquelas mostradas nos grupos definidos, acima. Por exemplo podem ser feitas substituições não conservativas que afetam mais significativamente a estrutura do péptido na área da alteração, por exemplo, a estrutura em hélice alfa, ou folha beta; a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo; ou a maior parte da cadeia lateral. As substituições que são se espera geralmente que produzam as maiores mudanças nas propriedades do péptido são aquelas onde 1) um residuo hidrofilico, p.ex., serilo ou treonilo, é substituído por (ou com) um residuo hidrofóbico, p.ex., leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo, ou alanilo; 2) uma cisteina ou prolina é substituída por (ou com) qualquer outro resíduo; 3) um resíduo tendo uma cadeia lateral eletropositiva, p.ex., lisilo, arginilo, ou histidilo, é substituído por (ou com) um resíduo eletronegativo, p.ex., glutamilo ou aspartilo; ou 4) um resíduo tendo uma cadeia lateral volumosa, p.ex., fenilalanina, é substituído por (ou com) um resíduo que não tem uma cadeia lateral, p.ex., glicina. Conformemente, estas e outras substituições não conservativas podem ser introduzidas em variantes de péptido onde são desejadas mudanças significativas na função/estrutura e tais mudanças são evitadas onde é desejada a conservação de estrutura/função.

Um modo conveniente para geração de variantes de substituição é maturação de afinidade usando fago usando métodos conhecidos na técnica. De modo a se identificarem locais de região hipervariável candidatos para modificação pode ser também realizada mutagénese de rastreio de alanina para se identificarem resíduos da região hipervariável contribuindo significativamente para a ligação ao antigénio. Alternativamente ou adicionalmente pode ser benéfico analisar uma estrutura de cristal do complexo antigénio-anticorpo para se identificarem pontos de contacto entre o anticorpo e antigénio. Tais resíduos de contacto e resíduos da vizinhança são candidatos provavelmente adequados para substituição.

Onde são feitas inserções de região hipervariável para gerar um anticorpo variante, a gama típica de comprimentos da região hipervariável em questão em anticorpos conhecidos deve ser tomada em consideração. Por exemplo, para a primeira região hipervariável de um domínio variável de cadeia leve, as inserções podem ser introduzidas na sequência de CDR1 de Vl de um anticorpo progenitor enquanto retêm um tamanho apropriado substancialmente similar e deste modo esperado, o qual, de acordo com Kabat et al., supra, p.ex., tem tipicamente um total de cerca de 9-20 (p.ex., cerca de 10-17) resíduos. Similarmente, CDR2 de Vl tem tipicamente um comprimento total de cerca de 5-10 resíduos; CDR3 de Vl tem tipicamente um comprimento de cerca de 7-20 resíduos; CDR1 de Vh tem tipicamente um comprimento de cerca de 10-15 resíduos; CDR2 de Vh tem tipicamente um comprimento de cerca de 15-20 resíduos; e CDR3 de Vh tem tipicamente um comprimento de cerca de 6-30 resíduos (p.ex., 3-25 resíduos). Inserções na região Vh são tipicamente feitas na CDR3 de VH e tipicamente próximas do terminal C do domínio, tal como cerca dos resíduos 97-102 da CDR3 de Vh progenitora (por exemplo adjacente ao, ou exterminai em sequência com o, número de resíduo 100 da sequência de CDR3 de Vh progenitora) usando o alinhamento e numeração como descritos em Kabat. Variantes de anticorpo com resíduos(s) de aminoácido(s) inserido(s) numa sua região hipervariável podem ser preparados aleatoriamente, especialmente onde a afinidade de ligação de partida do anticorpo progenitor para o antigénio alvo é tal que as variantes de anticorpo aleatoriamente produzidas possam ser prontamente rastreadas. Por exemplo, a exibição em fagos proporciona um método conveniente de rastreio de tais variantes aleatórias.

Na conceção, construção, e/ou avaliação de variantes de CDR tem de ser tomada atenção ao facto de que as regiões CDR podem ser alteradas para permitir uma melhor ligação ao epítopo. As CDRs de anticorpo operam tipicamente proporcionando uma superfície complementar, incluindo possivelmente dedos que podem sobressair para a superfície de proteína do antigénio, ou outra estrutura de parátopo, na qual o epítopo se ajusta. Se o epítopo não estiver estreitamente ajustado, o anticorpo pode não oferecer a melhor afinidade. No entanto, como com epítopos, existem frequentemente alguns resíduos-chave numa estrutura de parátopo que é responsável pela maioria desta ligação. Assim sendo, as sequências de CDR podem variar em comprimento e composição significativamente entre anticorpos para o mesmo péptido. 0 especialista perito reconhecerá que certos resíduos, tais como resíduos de tirosina (p.ex., no contexto de sequências de CDR3 de Vh) , que são frequentemente contribuidores significativos para tal ligação a epítopos, são tipicamente retidos numa variante de CDR.

As variantes da região CDR podem também aumentar os contactos de aminoácidos entre o antigénio e uma variante de anticorpo, em comparação com os contactos de aminoácidos entre o antigénio e o anticorpo progenitor, por introdução de um ou mais resíduos de aminoácidos (por substituição ou inserções) que aumentam os contactos ou interações energeticamente favoráveis entre um ou mais resíduos de aminoácidos presentes num antigénio e um ou mais resíduos de aminoácidos presentes no anticorpo. As interações de aminoácidos de interesse podem ser selecionadas de interações de ligação de hidrogénio, interações de van der Waals, e interações iónicas.

Aqueles peritos na técnica estarão cientes de princípios adicionais úteis na conceção e seleção de CD38BP compreendendo variantes de CDR dos anticorpos da presente invenção.

No contexto de variantes de CDR, que são variantes das CDRs dos anticorpos dos exemplos, particularmente no contexto de CDR variante em anticorpos anti-CD38 ou seus fragmentos, os resíduos requeridos para suportar e/ou orientar a(s) estrutura(s) em alça de CDR podem ser tipicamente retidos; resíduos que estão no espaço de cerca de 10 angstrõms de uma alça estrutural de CDR (mas opcionalmente somente resíduos nesta área que possuem também uma superfície acessível a solvente de água de cerca de 5 angstrõms2 ou maior) podem ser tipicamente não modificados ou modificados somente por substituições de resíduos de aminoácidos conservativas; e/ou a sequência de aminoácidos pode ser tipicamente sujeita somente a um número limitado de inserções e/ou eliminações (se algumas), tal que estruturas tipo alça estrutural de CDR sejam retidas na variante (uma descrição de técnicas e princípios relevantes relacionados é proporcionada em por exemplo Schiweck et al., J Mol Biol. 268 (5), 934-51 (1997), Morea, Biophys Chem. 68 (1-3), 9-16 (1997), Shirai et al., FEBS Lett. 399 (1-2), 1-8 (1996), Shirai et al., FEBS Lett. 455 (1-2), 188-97 (1999), Reckzo et al., Protein Eng. 8 (4), 389-95 (1995) e Eigenbrot et al., J Mol Biol. 229 (4), 969-95 (1993)). Ver também WO 03/048185, WO 03/070747 e WO 03/027246. Técnicas adicionais que podem ser usadas para gerar anticorpos variantes incluem a evolução direta e outras técnicas de geração de variantes descritas em por exemplo US20040009498, Marks et al., Methods Mol Biol. 248, 327-43 (2004), Azriel-Rosenfeld et al., J Mol Biol. 335 (1), 177- 92 (2004), Park et al., Biochem Biophys Res Commun. 275 (2), 553-7 (2000), Kang et al., Proc Natl Acad Sei USA. 88 (24), 11120-3 (1991), Zahnd et al., J Biol Chem. 279 (18), 18870-7 (2004), Xu et al., Chem Biol. 9 (8), 933-42 (2002), Border et al., Proc Natl Acad Sei USA. 97 (20), 10701-5 (2000), Crameri et al., Nat Med. 2 (1), 100-2 (1996) e como mais geralmente descrito em por exemplo WO 03/048185.

As variantes de anticorpo geradas podem ser sujeitas a qualquer técnica de rastreio adequada e anticorpos com propriedades adequadas e desejavelmente superiores num ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.

Os CD38BPs compreendendo sequências de CDR como descritas podem compreender qualquer número e combinação adequados de tais CDRs de VL e VH enquanto retêm pelo menos uma proporção substancial (pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais) da af inidade/avidez e/ou especificidade/seletividade de um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 2 e uma sequência de Vh de SEQ ID No: 7, e/ou um anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 12 e uma sequência de Vh de SEQ ID No: 17 e/ou um anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 22 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 27, mas diferindo opcionalmente em outras características, tais como imunogenicidade num paciente humano, afinidade quanto ao epitopo, meia-vida aumentada, etc. Em alguns casos, um tal CD38BP pode ser associado com maior afinidade, seletividade, e/ou especificidade do que o anticorpo progenitor. Numa forma de realização, menos do que um conjunto total de CDRs de Vl e/ou CDRs de Vh está presente num CD38BP. Nos anticorpos da presente invenção, todas as CDRs de Vl e CDRs de Vh estão presentes.

Exemplos de outras propriedades funcionais de anticorpos, que podem ser alteradas ou retidas em CD38BPs variantes em comparação com -003 e -005 e -024, são: (1) ligação de elevada afinidade a CD38; (2) baixa taxa de dissociação de CD38 (3) inibição ou bloqueio de ligação de CD38 a alvo de CD3 8; (4) eliminação de células T ou células B expressando CD3 8; (5) indução de um elevado nivel de CDC em células negativas quanto a CD55/59 ou positivas quanto a CD55/59; (6) translocação em jangadas de lipidos após ligação a CD38 ; (7) tolerização de células T; (8) inibição da proliferação de células T ou B expressando CD38; (9) internalização de CD38; (10) inibição ou indução de atividade enzimática de CD38; (11) inibição ou indução de transdução de sinal induzida por CD38; (12) indução ou inibição da produção de citocinas; (13) indução ou bloqueio da diferenciação de células T ou células B; (14) indução de ou resgate a partir da apoptose; (15) atenuação ou aumento da indução da lise por células NK; (16) indução ou inibição da produção de insulina por células β no pâncreas; (17) sobrevivência prolongada de um sujeito tendo células tumorais que expressam; e/ou (18) indução de ADCC de alvos de CD38 quando misturados com células efetoras apropriadas. A presente divulgação proporciona também CD38BPs que são caracterizados no que diz respeito à sua capacidade de competirem (inibirem competitivamente) ou competirem de modo cruzado (i.e., inibirem relativamente parcialmente a ligação a epitopo) com um anticorpo tendo uma sequência de

Vl de SEQ ID No: 2 e uma sequência de Vh de SEQ ID No: 7 (tal como anticorpo -003), ou um anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 12 e uma sequência de Vh de SEQ ID No: 17 (tal como anticorpo -005) ou um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 22 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 27 (tal como anticorpo -024), quanto à ligação a CD38.

Um tal CD38BP pode ser, por exemplo, um fragmento Fab, derivado de um anticorpo que se liga a um epitopo idêntico a ou sobrepondo-se com um epitopo ligado por um anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 2 e uma sequência de Vh de SEQ ID No: 7, ou um anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 12 e uma sequência de Vh de SEQ ID No: 17 ou um anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 22 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 27. Um tal fragmento Fab, devido ao seu tamanho relativamente pequeno em comparação com as moléculas de mAb, pode não competir significativamente com os referidos anticorpos quanto à ligação a CD38 embora o anticorpo do qual é derivado sim. Não obstante, um tal CD38BP pode ser útil em regiões próximas similarmente dirigidas de CD38 (p.ex., no contexto de direcionamento de uma citotoxina, radionuclideo, ou similares no contexto de um CD38BP imunoconjugado).

Portanto, tais CD38BPs podem ser úteis no contexto dos métodos como descritos aqui. A competição quanto à ligação a CD38 ou uma porção de CD38 por dois ou mais CD38BPs pode ser determinada por qualquer técnica adequada. Numa forma de realização, a competição é determinada por exemplo como descrita nos Exemplos 7, 8 e 9. A competição refere-se a qualquer redução detetavelmente significativa na propensão de uma molécula particular para se ligar a um parceiro de ligação particular na presença de outra molécula que se liga ao parceiro de ligação. Tipicamente, a competição significa uma redução de pelo menos cerca de 10%, tal como uma de pelo menos cerca de 15%, ou uma redução de pelo menos cerca de 20% na ligação entre um CD38BP e (a) uma forma de CD38 (p.ex., CD38 "processado", "maduro", "não processado, "não processado" ou "imaturo"); (b) uma forma de CD38 livre (p.ex., um fragmento de CD38 produzido por processamento in vivo) ; (c) um péptido heterodimérico composto por outro péptido associado a CD38, tal como um CD31, e CD38; (d) um complexo de CD38 e um ou mais substratos, tais como cAMP, NAD+ e/ou cADPR; (e) um dímero dimerizado, associado e/ou processado de CD38 com um ligando solúvel, tal como CD31; ou (f) uma porção de CD38, causada pela presença de outro CD38BP como determinada por, p.ex., análise ELISA ou análise FACS (como descrita na secção dos exemplos) usando quantidades suficientes das duas ou mais moléculas de CD38BPs e CD38 em competição.

Pode ser também o caso de que possa existir competição entre CD38BPs no que diz respeito a mais do que um de CD38, e/ou uma porção de CD38, p.ex., num contexto onde as propriedades de ligação ao anticorpo de uma região particular de CD38 são retidas em seus fragmentos, tal como no caso de um epítopo linear bem apresentado localizado em vários fragmentos testados ou um epitopo conformacional que é apresentado em fragmentos de CD38 suficientemente grandes bem como em CD38. A avaliação da competição envolve tipicamente uma avaliação da ligação inibidora relativa usando uma primeira quantidade de uma primeira molécula; uma segunda quantidade de uma segunda molécula; e uma terceira quantidade de uma terceira molécula (ou um padrão determinado por estudos de ligação que possam ser razoavelmente comparados com novos dados de ligação no que diz respeito às primeira e segunda moléculas como um substituinte de dados contemporâneos reais), em que as primeira, segunda, e terceira quantidades são todas suficientes para fazer uma comparação que fornece informação sobre a seletividade e/ou especificidade das moléculas em questão no que diz respeito às outras moléculas presentes. As primeira, segunda e terceira quantidades podem variar com a natureza do CD38BP e alvos potenciais dele em questão. Por exemplo, para avaliações por ELISA, similares àquelas descritas na secção dos Exemplos, cerca de 5-50 yg (p.ex., cerca de 10-50 yg, cerca de 20-50 yg, cerca de 5-20 yg, cerca de 10-20 yg, etc.) de CD38BP e/ou alvos de CD38 são requeridos para avaliar se existe competição. As condições devem ser também adequadas para ligação. Tipicamente, condições fisiológicas ou quase-fisiológicas (p.ex., temperaturas de cerca de 20-40°C, pH de cerca de 7-8, etc.) são adequadas para ligação CD38BP:CD38.

Frequentemente, a competição é marcada por uma inibição relativa significativamente maior do que cerca de 5% como determinada por análise ELISA e/ou FACS. Pode ser desejável definir um limiar superior de inibição relativa como um critério/determinante de o que é um nivel adequado de competição num contexto particular (p.ex., onde a análise de competição é usada para selecionar ou rastrear novos anticorpos concebidos com a função pretendida de bloqueio da ligação de outro péptido ou ligação de molécula a CD38 (p.ex., os parceiros de ligação naturais de CD38 tais como CD31, também chamado antigénio CD31, EndoCAM, GPIIA', PECAM-1, molécula de adesão de plaquetas/células endoteliais ou anticorpo anti-CD38 ocorrendo naturalmente)). Assim sendo, por exemplo, é possível definir um critério para a competitividade em que pelo menos cerca de 10% de inibição relativa é detetada; pelo menos cerca de 15% de inibição relativa é detetada; ou pelo menos cerca de 20% de inibição relativa é detetada antes de um anticorpo ser considerado suficientemente competitivo. Em casos onde epítopos pertencendo a anticorpos de competição estarem localizados proximamente num antigénio, a competição pode ser marcada por mais do que cerca de 40% de inibição relativa da ligação a CD38 (p.ex., pelo menos cerca de 45% de inibição, tal como pelo menos cerca de 50% de inibição, por exemplo pelo menos cerca de 55% de inibição, tal como pelo menos cerca de 60% de inibição, por exemplo pelo menos cerca de 65% de inibição, tal como pelo menos cerca de 70% de inibição, por exemplo pelo menos cerca de 75% de inibição, tal como pelo menos cerca de 80% de inibição, por exemplo pelo menos cerca de 85% de inibição, tal como pelo menos cerca de 90% de inibição, por exemplo pelo menos cerca de 95% de inibição, ou nível mais elevado de inibição relativa). A competição pode ser considerada o inverso da reatividade cruzada entre uma molécula e dois potenciais parceiros de ligação. Em certas formas de realização, um anticorpo para CD38BP da presente invenção pode ligar-se especificamente a um ou mais residuos ou regiões em CD38 mas também não reage de modo cruzado com outros péptidos, regiões de péptidos, ou moléculas, p.ex., um anticorpo anti-CD38 de acordo com a presente invenção pode não reagir de modo cruzado com proteínas com homologia com CD38, tais como BST-1 (antigénio das células estromais da medula óssea 1) e Mo5, também chamado CD157; ou os anticorpos anti-CD38 podem não reagir de modo cruzado com CD38 no contexto de tecido normal, tal como tecidos não envolvidos no mieloma múltiplo. Tipicamente, uma falta de reatividade cruzada significa menos do que cerca de 5% de inibição competitiva relativa entre as moléculas quando avaliadas por análise ELISA e/ou FACS usando quantidades suficientes das moléculas sob condições de ensaio adequadas. São descritos aqui: um CD38BP que compete com um anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 2 e uma sequência de Vh de SEQ ID No: 7, tal como o anticorpo -003, quanto à ligação a CD38 ou uma sua porção; um CD38BP que compete com um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 12 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 17, tal como o anticorpo -005, quanto à ligação a CD38 ou uma sua porção; e um CD38BP que compete com um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 22 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 27, tal como o anticorpo -024, quanto à ligação a CD38 ou uma sua porção.

Como discutido noutro lugar aqui, a não ser que de outro modo afirmado ou claramente contradito pelo contexto, as referências a ligação de um CD38BP a CD38 destinam-se a se referirem à ligação em qualquer contexto, tal como num contexto conformacional onde a estrutura de CD38 está presente; ou num contexto de epítopo linear. Obviamente, a ligação num subconjunto limitado de tal (ais) contexto(s) pode ser uma característica importante no que diz respeito a qualquer CD38BP. Métodos adicionais para determinação da especificidade quanto a CD38BP por inibição competitiva podem ser encontrados em por exemplo Harlow et ai., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I., (1988), Colligan et ai., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoe, and Wiley InterScience N.I., (1992, 1993), e Muller, Meth. Enzymol. 92, 589-601 (1983). CD38 humano compreende um número de diferente epitopos, que pode incluir (1) determinantes antigénicos de péptido que estão compreendidos dentro de cadeias únicas de péptido dentro de CD38 humano; (2) determinantes antigénicos conformacionais que consistem um ou mais aminoácidos não contíguos numa cadeia particular e/ou aminoácidos presentes em cadeias de péptido espacialmente contíguas mas separadas (tipicamente onde as respetivas sequências de aminoácidos das cadeias estão localizadas desarticuladamente ao longo da sequência de polipéptidos de CD38 humana); (3) determinantes antigénicos pós-translacionais que consistem, na totalidade ou parte, de estruturas moleculares covalentemente anexadas a CD38 humano, tais como grupos carboidrato; ou (4) combinações de (1)-(3).

Um epítopo no contexto da presente invenção inclui qualquer determinante de péptido ou derivado de péptido capaz de ligação especifica a uma imunoglobulina. Um epítopo pode compreender qualquer número adequado de aminoácidos, em qualquer posição adequada (no que diz respeito à sequência linear de CD38) orientação (no que diz respeito a CD38 dobrado, ou um seu fragmento), composição de aminoácidos (e, consequentemente, pelo menos em parte, carga). Assim sendo, por exemplo, um epítopo pode ser composto por cerca de 3-10 aminoácidos, tipicamente 3-8 aminoácidos, numa ou mais localizações contíguas ou não contíguas no que diz respeito à sequência primária de CD38 (por exemplo em epítopo pode consistir essencialmente em 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 resíduos de aminoácidos distribuídos em 1, 2, 3, 4, ou 5 localizações não contíguas em CD38). Alternativamente, por exemplo, um epítopo pode ser considerado como sendo definido por uma região de cerca de 5-10 resíduos de aminoácidos contíguos (p.ex., cerca de 7-30 resíduos de aminoácidos, cerca de 5-20 resíduos de aminoácidos, ou cerca de 3-15 resíduos de aminoácidos) em CD38 (sozinhos ou em combinação com uma porção de um domínio CD38 adjacente). Em alguns epítopos pode ser o caso que somente um resíduo de aminoácido ou somente alguns resíduos de aminoácidos são críticos para reconhecimento de CDR ou CDR(s) (e deste modo mais importante para a afinidade e avidez de CD38BP:antigénio CD38). Como tal, um epítopo pode ser caracterizado com base num ou mais de tais resíduos críticos, com o reconhecimento de que outros resíduos podem fazer também alguma contribuição menor ao epítopo. No caso de um epítopo definido por uma região de aminoácidos pode ser que um ou mais aminoácidos na região façam somente uma contribuição mínima ou mesmo contribuição negligenciável à ligação de anticorpo, tal que o resíduo possa ser sujeito a contribuição com um resíduo diferente apropriado sem resultar numa "perda" do epítopo de pelo menos alguns CD38BPs específicos para ele. É descrito aqui um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38, que se liga especif icamente a um epítopo de CD38 que é também especificamente ligado por um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 2 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 7 (tal como anticorpo -003), ou um anticorpo de acordo com a invenção tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 12 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 17 (tal como anticorpo -005) ou um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 22 e uma sequência de Vh de SEQ ID No: 27 (tal como anticorpo -024) . É possível que CD38BPs tendo uma ou mais CDRs que difiram das CDRs de um anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 2 e uma sequência de Vh de SEQ ID No: 7, ou das CDRs de um anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 12 e uma sequência de Vh de SEQ ID No: 17, ou das CDRs de um anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 22 e uma sequência de Vh de SEQ ID No: 27, possam ser ainda específicos quanto ao mesmo epítopo que um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 2 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 7, e um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 12 e uma sequência de Vh de SEQ ID No: 17 e um anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 22 e uma sequência de Vh de SEQ ID No: 27, respetivamente. Em alguns tais casos, o CD38BP em questão pode reconhecer ou ser mais especifico/seletivo quanto a estruturas ou regiões particulares do epítopo do que o anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 2 e uma sequência de Vh de SEQ ID No: 7, e o anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 12 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 17, e o anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 22 e uma sequência de VH e SEQ ID No: 27, respetivamente.

Um epítopo de CD38 ligado por um anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 2 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 7 (tal como o anticorpo -003), ou um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 12 e uma sequência de Vh de SEQ ID No: 17 (tal como o anticorpo -005) ou um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 22 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 27 (tal como o anticorpo -024), pode ser identificado através de técnicas de mapeamento e caracterização padrão, refinação adicional das quais pode ser identificada por qualquer técnica adequada, exemplos numerosos das quais estão disponíveis ao especialista perito. Estas técnicas podem ser também usadas para identificar e/ou caracterizar epítopos para CD38BPs em geral. Como um exemplo de tais métodos de mapeamento/caracterização, um epítopo para um anticorpo anti-CD38 pode ser determinado por "foot-printing" de epítopos usando modificação química das aminas/carboxilos expostos na proteína CD38. Um exemplo específico de uma tal técnica de foot-printing é o uso de HXMS (permuta de hidrogénio-deutério detetada por espetrometria de massa) em que ocorre uma troca de hidrogénio/deutério de protões de amida de proteína recetora e ligando, ligação, e permuta de volta, em que os grupos amida da estrutura principal participando na ligação de proteína são protegidos da permuta de volta e, portanto, permanecerão deuterados. As regiões relevantes podem ser identificadas neste momento por proteólise péptica, separação por cromatografia líquida de elevado desempenho Microbore rápida, e/ou espetrometria de massa com ionização por eletropulverização. Ver, p.ex., Ehring H, Analytical Biochemistry, 267 (2) 252-259 (1999) e/ou Engen, J. R. e Smith, D. L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A. Outro exemplo de uma técnica de identificação de epítopos adequada é mapeamento de epítopos por ressonância magnética nuclear (NMR), onde tipicamente a posição dos sinais em espetros de NMR bidimensionais do antigénio livre e do antigénio complexado com o péptido de ligação ao antigénio, tal como um anticorpo, é comparada. 0 antigénio é tipicamente seletivamente isotopicamente marcado com 15N tal que somente sinais correspondendo ao antigénio e nenhuns sinais do péptido de ligação ao antigénio sejam vistos no espetro de NMR. Os sinais de antigénio tendo origem em aminoácidos envolvidos na interação com o péptido de ligação ao antigénio trocarão tipicamente de posição nos espetros do complexo em comparação com os espetros do antigénio livre, e os aminoácidos envolvidos na ligação podem ser identificados deste modo. Ver por exemplo Ernst Schering Res Found Workshop. (44), 149-67 (2004), Huang et al., Journal of Molecular Biology 281 (1). 61-67 (1998) e Saito e Patterson, Methods. 9 (3), 516-24 (1996). O mapeamento/caracterização de epítopos pode ser também realizado usando métodos de espetrometria de massa. Ver por exemplo Downward, J Mass Spectrom. 35 (4), 493-503 (2000) e Kiselar e Downard, Anal Chem. 71 (9), 1792-801 (1999). Técnicas de digestão com proteases podem ser também úteis no contexto de mapeamento e identificação de epítopos. Regiões/sequências relevantes para determinantes antigénios podem ser determinadas por digestão com proteases, p.ex., por uso de tripsina numa razão de cerca de 1:50 em relação à digestão de CD38 durante a noite (O/N) a 37°C e pH 7-8, seguido por análise por espetrometria de massa (MS) para identificação de péptidos. Os péptidos protegidos de clivagem por tripsina pelo CD38BP podem ser subsequentemente identificados por comparação de amostras sujeitas a digestão com tripsina e amostras incubadas com CD38BP e depois sujeitas a digestão por, p.ex., tripsina (relevando deste modo uma pegada para o ligante). Outras enzimas como quimiomotripsina, pepsina, etc. podem ser também ou alternativamente usadas num método de caracterização de epítopos similar. Um CD38BP que dá significativamente o mesmo resultado que um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 2 e uma sequência de Vh de SEQ ID No: 7 (tal como o anticorpo -003), ou um anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 12 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 17 (tal como o anticorpo -005) ou um anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 22 e uma sequência de Vh de SEQ ID No: 27 (tal como o anticorpo -024) nestas medições é considerado como sendo um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo que um anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 2 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 7 (tal como o anticorpo -003), ou um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 12 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 17 (tal como o anticorpo -0 05) ou um anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 22 e uma sequência de Vh de SEQ ID No: 27 (tal como o anticorpo -024), respetivamente. Ver por exemplo Manca, Ann Ist Super Sanita. 27 (1), 15-9 (1991) para uma discussão de técnicas similares. O mapeamento de epítopos por ligação competitiva a CD38 com dois anticorpos onde um é biotinilado é outro método para identificação de regiões determinantes antigénicas relevantes. A ligação de anticorpos a péptidos lineares e enrolados de CD38 por um ensaio imune ligado a enzimas à base de PEPSCAN é outro método para identificação de regiões determinantes antigénicas relevantes, ver por exemplo Slootstra-JW et al. Mol-Divers. 1, 87-96 (1996). A mutagénese sítio-dirigida é outro método para identificação de regiões determinantes antigénicas relevantes, ver por exemplo Polyak e Deans, Blood 99, 3956-3962 (2002). Várias técnicas de exibição em fagos podem ser também usadas para identificar epítopos. Ver por exemplo Wang e Yu, Curr Drug Targets. 5 (1), 1-15 (2004), Burton, Immunotechnology. 1 (2) , 87-94 (agosto de 1995), Cortese et al., Immunotechnology. 1 (2), 87-94 (1995) e Irving et al., Curr Opin Chem Biol. 5 (3), 314-24 (2001). Epitopos de consenso podem ser também identificados através de técnicas relacionadas com exibição em fagos modificadas (ver, http://www.cs.montana.edu/~mumey/papers/j cb03.pdf) para discussão.

Outros métodos potencialmente úteis no mapeamento de epitopos incluem técnicas de cristalografia, técnica de difração de raios X (tais como as técnicas de difração de raios x/estudo de sequências de Poljak e outros nos 1970s-1980s), e a aplicação de Tecnologia de Síntese de Péptidos Multiplin. Métodos à base de computador tais como análise de sequências e análise de estrutura tridimensional e docking podem ser também usados para de identificarem determinantes antigénicos. Por exemplo, um epítopo pode ser também determinado por modelação molecular usando uma estrutura de CD38 com docking da estrutura do fragmento Fab do anticorpo monoclonal individual. Estes e outros métodos de mapeamento estão discutidos em Epítope Mapping A Practical Approach (Westwood and Hay Eds.) 2001 Oxford University Press. É descrito aqui um CD38BP tendo substancialmente as mesmas características de ligação a CD38 específicas de um ou mais mAbs selecionadas de um anticorpo tendo uma sequência de Vl de SEQ ID No: 2 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 7 (tal como o anticorpo -003), um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 12 e uma sequência de Vh de SEQ ID No: 17 (tal como o anticorpo -005) , e um anticorpo tendo uma sequência de VL de SEQ ID No: 22 e uma sequência de VH de SEQ ID No: 27 (tal como o anticorpo -024).

Os estudos de mapeamento indicaram que vários anticorpos monoclonais criados contra CD38 humano se ligam a epitopos na região C-terminal de CD38 (220-296) (Hoshino et al. J. Immunol., 1997, 158: 741-747, e Ferrero et al., BMC Immunology, 2004, 5: 21). Dentro desta região foram descobertas três diferenças de aminoácidos entre a sequência de CD38 humano e de cinomolgo: T237, Q272 e S274 em humanos correspondem a A238, R273 e F275 em cinomolgos. -005 não se liga a tecido de cinomolgo (mostrado nos exemplos 10 e 11). Existe um número limitado de diferenças de aminoácidos entre a sequência de CD38 humano e de macaco, por exemplo na parte carboxiterminal da proteina, por exemplo as seguintes três diferenças de aminoácidos entre a sequência de CD38 humano e de cinomolgo: T237, Q272 e S274 em CD38s humanos correspondem a A238, R273 e F275 em CD38 de macaco cinomolgo (comparar SEQ ID No. 21 e SEQ ID No. 22). -005 não se liga a uma proteina huCD38 humana, em que o residuo de glutamina na posição 272 de SEQ ID No: 31 foi substituído por um residuo de arginina (Q272R), ou a uma proteina huCD38 mutante, em que o residuo de serina da posição 274 de SEQ ID No: 31 foi substituído por um residuo de fenilalanina (S274F) (mostrado no Exemplo 17) no mesmo grau que se liga a CD38 humano de tipo selvagem. A ligação de -005 é particularmente abrogada pela substituição de aminoácido na posição S274F.

Consequentemente, um anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31), e que não se ligam a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído por um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33) no mesmo grau que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31).

Um anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo que também se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31), e que não se ligam a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído por um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34) no mesmo grau que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31). 0 termo "no mesmo grau" deve ser interpretado tal que a ligação do péptido ao CD38 humano mutante é significativamente mais baixa do que a ligação do péptido ao CD38 humano de tipo selvagem. A ligação de um péptido às moléculas de CD38 (tipo selvagem e mutantes) pode ser determinada num número de modos e está dentro do conhecimento geral comum de uma pessoa perita na técnica determinar se a ligação ao mutante é "significativamente mais baixa" do que a ligação do tipo selvagem. Um grande número de diferentes técnicas para determinação da ligação de um péptido a outro péptido está disponível à pessoa perita na técnica, por exemplo ELISA, radioimunoensaio, BIAcore ou citometria de fluxo.

Um método de determinação da ligação é por determinação da ECso da ligação do péptido à proteína mutante e à proteína de tipo selvagem e depois comparação com os valores obtidos. Outro método de determinação da ligação é por exame da magnitude de ligação à concentração saturante (por exemplo o patamar do sinal de ligação), ou por determinação de constantes de taxa cinética kon e k0ff por exemplo por BIAcore.

Numa forma de realização, a ligação do anticorpo em questão às proteínas CD38 (mutantes ou de tipo selvagem) é por uso de um ELISA como descrito no Exemplo 17.

Numa forma de realização, a EC50 da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído por um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 50% da EC50 da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31) . Numa forma de realização, a EC50 da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído por um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 10% da EC50 da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31). Numa forma de realização, a EC50 da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído por um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 5% da EC50 da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31) . Numa forma de realização, a EC50 da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de serina na posição 274 foi substituído por um resíduo de fenilalanina (SEQ ID No: 34), é menor do que 1% da EC50 da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31) .

Numa forma de realização, a EC50 da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído por um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33), é menor do que 50% da EC50 da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31) . Numa forma de realização, a EC50 da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de glutamina na posição 272 foi substituído por um resíduo de arginina (SEQ ID No: 33), é menor do que 10% da EC50 da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31).

Numa forma de realização, um anticorpo da invenção pode ser um anticorpo que também se liga a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído por um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32) no mesmo grau que se liga a CD38 humano (SEQ ID No: 31) . Numa forma de realização, a EC50 da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído por um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32), é maior do que 75% da EC50 da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31). Numa forma de realização, a EC50 da ligação do anticorpo o a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído por um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32), é maior do que 85% da EC50 da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31). Numa forma de realização, a EC50 da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído por um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32), é maior do que 90% da EC50 da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31) . Numa forma de realização, a EC50 da ligação do anticorpo a um CD38 humano mutante, em que o resíduo de treonina na posição 237 foi substituído por um resíduo de alanina (SEQ ID No: 32), é maior do que 95% da EC50 da ligação do anticorpo a CD38 humano (SEQ ID No: 31) .

Para se identificarem regiões determinantes antigénicas prováveis mais específicas em CD38 podem ser aplicados vários métodos analíticos preditores. Numa primeira abordagem analítica, o CD38 pode ser analisado quanto a (1) regiões altamente hidropáticas (usando o método de Kyte-Doolittle); (2) antigenicidade como medida pelo método de índice de Protrusão; (3) antigenicidade como determinada pelo método de Parker; (4) antigenicidade como determinada pelo método de Hopp/Woods; e (5) hidrofilicidade como medida pelos métodos de Goldman, Engleman e Steitz. As sequências variando de 10-40 aminoácidos em comprimento podem ser selecionadas com base na exibição de uma ou mais destas propriedades. A explicação por esta abordagem é o consenso geral de que muitos epítopos ideais de células B são sequências hidrofilicas, orientadas para a superficie, e flexíveis de cerca de 8-10 aminoácidos em comprimento. São proporcionados aqui CD38BPs específicos quanto a regiões de CD38 de CD38 identificadas de um tal modo. Além do mais, os terminais destas sequências podem ser comparados com regiões determinantes antigénicas previstas localizadas através das outras análises descritas aqui para proporcionar regiões contendo determinantes antigénicos prováveis específicas adicionais. Outras comparações similares podem ser prontamente feitas para proporcionar regiões determinantes antigénicas prováveis adicionais, onde a ligação de CD38BPs a estas regiões determinantes antigénicas pode ser considerada outra característica da presente divulgação.

Os CD38BPs da presente invenção são anticorpos. Exemplos não limitantes de anticorpos de ligação a CD38 proporcionadas pela presente invenção incluem (a) uma molécula de imunoglobulina, funcional completa compreendendo: (i) duas cadeias pesadas quiméricas idênticas compreendendo uma região variável com especificidade quanto a antigénio da superfície de células B humanas e região constante humana e (ii) duas cadeias leves todas humanas (í.e., não quiméricas) idênticas; (b) uma molécula de imunoglobulina, funcional, completa compreendendo: (i) duas cadeias pesadas quiméricas idênticas compreendendo uma região variável como indicada, e uma região constante humana, e (ii) duas cadeias leves todas não humanas (i.e., não quiméricas) idênticas; (c) um anticorpo monovalente, i.e., uma molécula de imunoglobulina completa, funcional compreendendo: (i) duas cadeias pesadas quiméricas idênticas compreendendo uma região variável como indicada, e uma região constante humana, e (ii) duas cadeias leves diferentes, somente uma das quais tem a mesma especificidade que a região variável das cadeias pesadas. A molécula de anticorpo resultante liga-se somente a uma sua extremidade e é, portanto, incapaz de ligação divalente. Como outra ilustração pode dizer-se que os anticorpos proporcionados pela presente invenção incluem os seguintes: (a) uma molécula de imunoglobulina inteira; (b) um scFv; (c) um anticorpo monoclonal; (d) um anticorpo humano; (e) um anticorpo quimérico; (f) um anticorpo humanizado; (g) um fragmento Fab; (h) um fragmento Fab'; (i) um fragmento F(ab')2; (j) uma molécula de Fv; e (k) uma molécula de Fv ligada por dissulfeto.

Numa forma de realização, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo policlonal. Numa forma de realização, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo monoclonal. Numa forma de realização adicional, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo monoclonal humano. Noutra forma de realização adicional, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo humanizado. Noutra forma de realização adicional, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo quimérico. Noutra forma de realização adicional, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo monoclonal tendo origem inteiramente de uma espécie de mamífero diferente de humanos. Numa forma de realização adicional, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo monoclonal totalmente de murino.

Um anticorpo monoclonal refere-se a uma composição compreendendo uma população de anticorpos homogéneos tendo uma estrutura e especificidade uniformes. Tipicamente, um anticorpo monoclonal é um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i.e., os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto quanto a possíveis mutações ocorrendo naturalmente que possam estar presentes em quantidades mínimas. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos e cada anticorpo monoclonal é tipicamente dirigido contra um único epítopo, o que é em contraste com preparações de anticorpos policlonais que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes epítopos. Que o anticorpo é monoclonal não é para ser interpretado como requerendo produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser produzidos pelo método de hibridoma descrito em primeiro lugar por Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante. Os anticorpos monoclonais podem ser também isolados a partir de bibliotecas de anticorpos em fagos usando as técnicas descritas em, por exemplo, Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991).

Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos de qualquer fonte adequada. Assim sendo, por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser obtidos de hibridomas preparados a partir de células B esplénicas de murino obtidas de ratinhos imunizados com um antigénio de interesse, por exemplo na forma de células expressando o antigénio na superfície, ou um ácido nucleico codificando um antigénio de interesse. Os anticorpos monoclonais podem ser também obtidos de hibridomas derivados de células expressando anticorpos de humanos ou mamíferos não humanos imunizados tais como ratos, cães, primatas, etc.

Alternativamente, os genes de anticorpos clonados podem ser expressos noutros sistemas de expressão, incluindo células procarióticas, tais como microrganismos, tais como E. coli, para a produção de anticorpos Fv de cadeia única, algas, bem como células de inseto. Além do mais, os anticorpos podem ser produzidos em animais não humanos transgénicos, tal como no leite de ovelhas e coelhos ou em ovos de galinhas, ou em plantas transgénicas. Ver por exemplo Verma, R., et al., J. Immunol. Meth. 216, 165-181 (1998); Pollock, et al., J. Immunol. Meth. 231, 147-157 (1999); e Fischer, R., et al., Biol. Chem. 380, 825-839 (1999).

Numa forma de realização, anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra CD38 podem se gerados usando ratinhos transgénicos ou transcromossomais transportando partes do sistema imune humano ao invés do sistema de ratinho. Tais ratinhos transgénicos e transcromossomais incluem ratinhos referidos aqui como ratinhos HuMAb e ratinhos KM, respetivamente, e são coletivamente referidos aqui como "ratinhos transgénicos". Um anticorpo monoclonal humano gerado em tais ratinhos pode ser abreviado como HuMab. O ratinho HuMAb contém um minilócus do gene da imunoglobulina humana que codifica sequências de imunoglobulina de cadeias pesada (μ e y) e leve κ humanas não rearranjadas, em conjunto com mutações dirigidas que inativam os lócus de cadeia μ e κ endógenas (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). Conformemente, os ratinhos exibiram expressão reduzida de IgM ou κ de ratinho e, em resposta à imunização, os transgenes de cadeias pesada e leve humanas introduzidos são submetidos a troca de classes e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais IgG,κ humanos de elevada afinidade (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisto em Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. e Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65-93 (1995) e Harding, F. e Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sei 764 536-546 (1995)). A preparação de ratinhos HuMAb está descrita em detalhe em Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Ver também US 5,545,806, US 5,569,825, US 5, 625, 126, US 5, 633,425, US 5, 789, 650, US 5, 877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 e WO 01/09187.

Os ratinhos HCo7 têm uma disrupção JKD nos seus genes de cadeia leve (kappa) endógena (como descrita em Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), uma disrupção CMD nos seus genes de cadeia pesada endógena (como descrita no Exemplo 1 de WO 01/14424), um transgene de cadeia leve kappa humana KCo5 (como descrito em Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), e um transgene de cadeia pesada humana HCo7 (como descrito em US 5,770,429).

Os ratinhos HCol2 têm uma disrupção JKD nos seus genes de cadeia leve (kappa) endógena (como descrita em Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), uma disrupção CMD nos seus genes de cadeia pesada endógena (como descrita no Exemplo 1 de WO 01/14424), um transgene de cadeia leve kappa humana KCo5 (como descrito em Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), e um transgene de cadeia pesada humana HCol2 (como descrito no Exemplo 2 de WO 01/14424). Na estirpe de ratinho KM, o gene de cadeia leve kappa de ratinho endógena foi homozigotamente desagregado como descrito em Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993) e o gene de cadeia pesada de ratinho endógena foi homozigotamente desagregado como descrito no Exemplo 1 de WO 01/09187. Esta estirpe de ratinho transporta um transgene de cadeia leve kappa humana, KCo5, como descrito em Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Esta estirpe de ratinho transporta também um transcromossoma de cadeia pesada humana composto por fragmento de cromossoma 14 hCF (SC20) como descrito em WO 02/43478. O ratinho KM contém um transcromossoma de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve kappa humana. Os genes de cadeias pesada e leve de ratinhos endógenas podem ter sido também desagregados nos ratinhos KM tal que a imunização dos ratinhos leve à produção de imunoglobulinas humanas ao invés de imunoglobulinas de ratinho. A construção de ratinhos KM e seu uso para criar imunoglobulinas humanas estão descritos em detalhe em WO 02/43478.

Os esplenócitos destes ratinhos transgénicos podem ser usados para gerar hibridomas que secretam anticorpos monoclonais humanos de acordo com técnicas bem conhecidas. Tais mamíferos transgénicos, mamíferos compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos operacional codificando a expressão de um CD38BP, tal como um anticorpo da presente invenção, mamíferos estavelmente transfectados com uma ou mais sequências de ácidos nucleicos codificando CD38, e similares, são características adicionais envolvendo anticorpos da presente invenção.

Os anticorpos monoclonais ou policlonais humanos da presente invenção, ou anticorpos da presente invenção tendo origem em outras espécies, podem ser também gerados transgenicamente através da geração de outro mamífero não humano ou planta que é transgénico quanto às sequências de cadeias pesada e leve de imunoglobulina da interesse e produção do anticorpo numa forma recuperável a partir delas. Em conexão com a produção transgénica em mamíferos, os anticorpos podem ser produzidos no, e recuperados do, leite de cabras, vacas, ou outros mamíferos. Ver por exemplo US 5,827,690, US 5,756,687, US 5,750,172 e US 5,741,957.

Adicionalmente, os anticorpos humanos da presente invenção ou anticorpos da presente invenção de outras espécies podem ser gerados através de tecnologias do tipo exibição, incluindo, sem limitação, exibição em fagos, exibição retroviral, exibição ribossomal, e outras técnicas, usando técnicas bem conhecidas na técnica e as moléculas resultantes podem ser sujeitas a maturação adicional, tal como maturação por afinidade, pois tais técnicas são bem conhecidas na técnica (ver por exemplo Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991) (exibição em fagos), Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996) (exibição em fagos), Hanes e Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997) (exibição ribossomal), Parmley e Smith, Gene 73, 305-318 (1988) (exibição em fagos), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hoogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992), Chiswell e McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992), e US 5,733,743). Se forem utilizadas tecnologias de exibição para produzir anticorpos que não são humanos, tais anticorpos podem ser humanizados, por exemplo como descrito noutro lugar aqui.

Os anticorpos monoclonais humanizados da presente invenção podem ser gerados por fusão dos dominios constantes de um anticorpo humano com os dominios variáveis de uma espécie não humana. Exemplos de como preparar anticorpos humanizados podem ser encontrados em por exemplo US 6,054,297, US 5,886,152 e US 5,877,293. Um anticorpo humanizado é concebido para ter maior homologia com uma imunoglobulina humana que anticorpos monoclonais derivados de animais. Resíduos de aminoácidos não humanos de um domínio variável "importado" (animal) são tipicamente transfectados numa "estrutura principal" humana. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e cotrabalhadores (Jones et ai., Nature 321, 522-525 (1986), Riechmann et al., Nature 332, 323-327 (1988), Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)), por substituição de regiões determinadoras da complementaridade ("CDRs") ou sequências de CDR de roedor pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Conformemente, em tais anticorpos "humanizados", as porções de CDR do domínio variável humano foram substituídas pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Assim sendo, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de framework são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedor. A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves como pesados, a serem usados na preparação dos anticorpos humanizados é importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o assim chamado método do "melhor ajuste", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é rastreado contra a biblioteca inteira de sequências de domínio variável humano conhecidas. A sequência humana que está mais próxima daquela do roedor é depois aceite como o framework (FR) humano para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151, 2296 (1993), Chothia et al., J. Mol. Biol. 196, 901 (1987)). Outro método usa um framework particular derivado da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. O mesmo framework pode ser usado para vários anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al., PNAS USA 89, 4285 (1992), Presta et al. , J. Immunol. 151, 2623 (1993)). É também tipicamente importante que os anticorpos humanizados retenham elevada afinidade quanto ao antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Para se alcançar este objetivo, os anticorpos humanizados podem ser preparados por um processo de análise das sequências progenitoras e vários produtos humanizados conceituais usando modelos tridimensionais das sequências progenitoras e humanizadas. Modelos de imunoglobulinas tridimensionais estão comummente disponíveis e são familiares àqueles peritos na técnica. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulinas candidatas selecionadas. A inspeção destas exibições permite a análise do papel provável de certos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, i.e., a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata de ligar ao seu antigénio. Deste modo, resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir das sequências recipientes e importadas tal que a característica de anticorpo desejada, tal como afinidade aumentada quanto ao(s) antigénio(s) alvo, seja maximizada, embora sejam os resíduos de CDR que influenciem diretamente e o mais substancialmente a ligação ao antigénio.

Os anticorpos de murino ou anticorpos de outras espécies podem ser humanizados ou primatizados usando quaisquer técnicas adequadas, sendo um número de técnicas adequadas já bem conhecido na técnica (ver por exemplo Winter e Harris Immunol Today 14, 43-46 (1993) e Wright et al., Crit. Reviews in Immunol. 125-168 (1992)). 0 anticorpo de

interesse pode ser manipulado por técnicas de DNA recombinante para substituir os ChI, Ch2, Ch3, dominios de charneira, e/ou o domínio de framework pela sequência humana correspondente (ver WO 92/02190 e US 5,530,101, US 5,585,089, US 5,693,761, US 5,693,792, US 5,714,350, e US 5,777,085). A humanização de anticorpos pode ser também realizada seguindo o método de Winter e cotrabalhadores (Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986), Riechmann et al., Nature 332, 323-327 (1988), Verhoeyen et al., Science 239, 1534- 1536 (1988)), por substituição de CDRs ou sequências de CDR de roedor pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Conformemente, tais anticorpos "humanizados" são, num sentido, anticorpo quiméricos (US 4,816,567), em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de framework são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedor.

Igualmente, o uso de cDNA de Ig para a construção de genes da imunoglobulina quiméricos é conhecido na técnica (ver por exemplo Liu et al., PNAS USA 84, 3439 (1987) e J.

Immunol. 139, 3521 (1987)). mRNA é isolado de um hibridoma ou outra célula produzindo o anticorpo e usado para produzir cDNA: 0 cDNA de interesse pode ser amplificado pela reação em cadeia da polimerase usando iniciadores específicos (US 4,683,195 e US 4,683,202). Alternativamente, uma biblioteca é preparada e rastreada para isolar a sequência de interesse. A sequência de DNA codificando a região variável do anticorpo é depois fundida com sequências de regiões constantes humanas. As sequências de regiões constantes (bem como regiões variáveis) humanas podem ser encontradas em Kabat et al.r (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, no. de publicação dos N.I.H. 91-3242 e dados mais recentes e relacionados podem ser acedidos em http://www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abs/GeneralInfo.html. A escolha de isotipo será tipicamente guiada pelas funções efetoras desejadas, tais como fixação do complemento, ou atividade na citotoxicidade celular dependente de anticorpos. Isotipos exemplares são IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Pode ser usada qualquer uma das regiões constante de cadeia leve humana, kappa ou lambda. O anticorpo humanizado, quimérico pode ser depois expresso por métodos convencionais.

Os anticorpos da presente invenção podem estar em qualquer forma adequada no que diz respeito à multimerização. Os anticorpos anti-CD38 e fragmentos de anticorpos podem estar pelo menos na forma heterotrimérica se não em formas multiméricas superiores tais como aquelas associadas a anticorpos para IgM. Noutras formas de realização, o anticorpo pode ser apresentado como um dimero ou monómero. Os anticorpos monoméricos da presente invenção podem ser, por exemplo, modificados por qualquer técnica adequada de modo a se formarem composições multiméricas.

Se desejado, a classe de um anticorpo anti-CD38 da presente invenção pode ser trocada por métodos conhecidos. Por exemplo, um anticorpo da presente invenção que era originalmente IgM pode ser submetido a troca de classes para um anticorpo para IgG da presente invenção. Adicionalmente podem ser usadas técnicas de troca de classes para converter uma subclasse de IgG noutra, por exemplo de IgGl em IgG2. Assim sendo, a função efetora dos anticorpos da presente invenção pode ser mudada por troca de isotipos para, p.ex., um anticorpo para IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, ou IgM para vários usos terapêuticos.

Numa forma de realização, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo para IgGl, por exemplo um isotipo IgGl,K ou IgGl,λ. Noutra forma de realização, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo para IgG3, por exemplo um isotipo IgG3,x ou IgG3,X. Noutra forma de realização, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo para IgG4, por exemplo um isotipo IgG4,K ou IgG4,À. Noutra forma de realização, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo para IgAl ou IgA2. Noutra forma de realização, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo para IgM.

Os anticorpos anti-CD38 podem ser recuperados a partir de bibliotecas combinatoriais recombinantes de anticorpos, tais como uma biblioteca de exibição em fagos de scFv, que pode ser preparada com cDNAs de Vl e Vh humanos preparados a partir de mRNA derivado de linfócitos humanos. Métodos para preparação e rastreio de tais bibliotecas são conhecidos na técnica. Existe um número de estojos comercialmente disponíveis para geração de bibliotecas de exibição em fagos. Existem também outros métodos e reagentes que podem ser usados na geração e rastreio de bibliotecas de exibição em fagos (ver por exemplo US 5,223,409, WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690, Fuchs et al., Bio/Technology 9, 1370-1372 (1991), Hay et al., Hum.

Antibod. Hybridomas 3, 81-85 (1992), Huse et al., Science 246, 1275-1281 (1989), McCafferty et al., Nature 348, 552- 554 (1990), Griffiths et al., EMBO J 12, 725-734 (1993),

Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889-896 (1992), Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991), Gram et al., PNAS USA 89, 3576-3580 (1992), Garrad et al., Bio/Technology 9, 1373-1377 (1991), Hoogenboom et al., Nuc Acid Res 19, 4133-4137 (1991) e Barbas et al., PNAS [7SA 88, 7978-7982 (1991)) . Sequências de ácidos nucleicos de Vl e Vh adequadas podem ser selecionadas usando qualquer método apropriado. Por exemplo, ácidos nucleicos de Vl e Vh podem ser selecionados por emprego dos métodos de imprinting de epitopos descritos em WO 93/06213. As bibliotecas de anticorpos, tais como bibliotecas de scFv, podem ser preparadas e rastreadas usando métodos conhecidos e adequados (com péptidos contendo CD38 como antigénio(s)), tais como aqueles descritos em por exemplo W092/01047, McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990) e Griffiths et al., EMBO J 12, 725-734 (1993). Tais bibliotecas de anticorpos e outras combinações de CD38BPs (bibliotecas, agrupamentos, etc.) são caracteristicas envolvendo anticorpos da presente invenção que podem ser usados terapeuticamente para proporcionar uma resposta imune mais completa; como ferramentas em métodos de rastreio para péptidos imunogénicos, pequenas moléculas, outros anticorpos anti-CD38 (p.ex., por meio de ensaios de competição), e similares; e/ou em métodos e composições de diagnóstico (p.ex., um chip de imunoensaio compreendendo um painel de tais anticorpos opcionalmente em associação a outros anticorpos pode ser preparado por técnicas padrão). Logo que os segmentos de Vl e VH humanos iniciais sejam selecionados, experiências "misturar e corresponder", nas quais diferentes pares dos segmentos de Vl e Vh inicialmente selecionados são rastreadas quanto à ligação de péptido contendo CD38, podem ser realizadas para selecionar combinações de pares VL/VH desejáveis. Por exemplo, a reatividade dos péptidos pode ser determinada por ELISA ou outros métodos de análise de epítopos adequados (ver por exemplo Scott, J. K. e Smith, G. P. Science 249, 386-390 (1990), Cwirla et ai., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Felici et ai., J. Mol. Biol. 222, 301-310 (1991) e Kuwabara et ai., Nature Biotechnology 15, 74-78 (1997) para discussão de tais técnicas e princípios). Os anticorpos podem ser selecionados pela sua afinidade quanto ao antigénio e/ou pela sua cinética de dissociação (off-rate) do antigénio (ver por exemplo Hawkins et ai., J. Mol. Biol. 226, 889-896 (1992)).

Para melhorar adicionalmente a qualidade e/ou diversidade de anticorpos anti-CD38, os segmentos Vl e VH de par(es) Vl/Vh podem ser aleatoriamente mutados, por exemplo dentro da região CDR3 de Vh e/ou VL, num processo análogo ao processo de mutação somático in vivo responsável pela maturação por afinidade de anticorpos durante uma resposta imune natural. Esta maturação por afinidade in vitro pode ser alcançada por amplificação de regiões Vh e Vl usando iniciadores de PCR complementares com a CDR3 de Vh ou CDR3 de Vl, respetivamente, cujos iniciadores são tipicamente "enriquecidos" com uma mistura aleatória das quatro bases de nucleótidos em certas posições, tal que os produtos de PCR resultantes codifiquem segmentos Vh e Vl nos quais mutações aleatórias foram introduzidas nas regiões CDR3 de Vh e/ou Vl. Estes segmentos Vh e Vl aleatoriamente mutados podem ser rerrastreados quanto à ligação a péptidos contendo CD38.

Após rastreio, o ácido nucleico codificando um anticorpo selecionado pode ser recuperado do pacote de exibição (p.ex., do genoma de fago) e subclonado num vetor apropriado por técnicas de DNA recombinante padrão. Se desejado, um tal ácido nucleico codificando anticorpos pode ser adicionalmente manipulado para criar outras formas de anticorpos ou CD38BPs. Para expressar um anticorpo recombinante isolado por rastreio de uma biblioteca combinatorial, tipicamente um ácido nucleico compreendendo uma sequência codificando o anticorpo é clonado num vetor de expressão recombinante e introduzido em células hospedeiras apropriadas (células de mamifero, células de levedura, etc.) sob condições adequadas para expressão do ácido nucleico e produção do anticorpo. Péptidos de anticorpo de elevada afinidade, tais como fragmentos de anticorpo Fv de cadeia única (scFv) e Fab humanos, podem ser também isolados de tais bibliotecas usando uma técnica de panning na qual o antigénio de interesse é imobilizado numa superficie sólida, tal como placas de microtitulação ou esférulas (ver por exemplo Barbas e Burton, Trends. Biotechnol. 14, 230-234 (1996) e Aujame et al., Hum. Antibodies 8, 155-68 (1997). A exibição em fagos de grandes bibliotecas ingénuas torna também possivel isolar anticorpos humanos diretamente sem imunização (ver por exemplo de Haard et al., J. Biol. Chem. 274 (26), 18218-18230 (1999)).

Um anticorpo anti-CD38 "variante" é um anticorpo que difere de um anticorpo progenitor (tipicamente gerado por imunização) por uma ou mais alterações de resíduos de aminoácidos adequadas, isto é, substituições, eliminações, inserções, ou adições às sequências terminais, nas CDRs ou outras sequências de Vh e/ou Vl (contanto que pelo menos uma quantidade substancial das caracteristicas de ligação de epitopo do anticorpo progenitor seja retida, se não melhorada, por tais mudanças).

Variações numa variante de anticorpo podem ser feitas em cada uma das regiões de framework, do domínio constante, e/ou das regiões variáveis (ou qualquer uma ou mais suas CDRs) numa única variante de anticorpo. Alternativamente podem ser feitas variações somente numa região de framework, das regiões variáveis (ou sua CDR única) , ou do domínio constante num anticorpo. Técnicas de mutagénese por rastreio de alanina, tais como descritas por Cunningham e Wells, Science 244, 1081-1085 (1989), podem ser usadas para se identificarem resíduos adequados para substituição ou eliminação na geração de CD38BPs compreendendo sequências de VL, VH, ou CDR particulares variantes, embora outras técnicas de mutagénese adequadas possam ser também aplicadas. Substituições de múltiplos aminoácidos podem ser também feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagénese e rastreio, tais como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, Science 241, 53-57 (1988) ou Bowie e Sauer, PNAS USA 86, 2152-2156 (1989).

Assim sendo, por exemplo, numa variante de anticorpo, um ou mais resíduos de aminoácidos podem ser introduzidos ou inseridos numa ou adjacente a uma ou mais das regiões hipervariáveis de um anticorpo progenitor, tal como numa ou adjacente a uma ou mais CDRs. Uma variante de anticorpo anti-CD38 pode compreender qualquer número de resíduos de aminoácidos inseridos, contanto novamente que pelo menos uma quantidade substancial das caracteristicas de ligação de epitopo do anticorpo progenitor seja retida. Uma variante de anticorpo anti-CD38 pode por exemplo compreender de cerca de 1-30 resíduos de aminoácidos inseridos, por exemplo de cerca de 1-10, tal como por exemplo de cerca de 2-10, por exemplo de 2-5 ou tal como de cerca de 1-5 resíduos de aminoácidos inseridos. Do mesmo modo, uma variante de anticorpo anti-CD38 pode por exemplo compreender de cerca de 1-30 resíduos de aminoácidos eliminados, por exemplo de cerca de 1-10, tal como por exemplo de cerca de 2-10, por exemplo de 2-5 ou tal como de cerca de 1-5 resíduos de aminoácidos eliminados. Do mesmo modo, uma variante de anticorpo anti-CD38 pode por exemplo compreender de cerca de 1-30 resíduos de aminoácidos substituídos, por exemplo de cerca de 1-10, tal como por exemplo de cerca de 2-10, por exemplo de 2-5 ou tal como de cerca de 1-5 resíduos de aminoácidos substituídos. Do mesmo modo, uma variante de anticorpo anti-CD38 pode por exemplo compreender de cerca de 1-30 adições de resíduos de aminoácidos de sequências terminais, por exemplo de cerca de 1-10, tal como por exemplo de cerca de 2-10, por exemplo de 2-5 ou tal como de cerca de 1-5 adições de resíduos de aminoácidos de sequências terminais. Uma variante de anticorpo pode também compreender uma combinação de duas ou mais de tais inserções, eliminações, substituições e adições de resíduos de aminoácidos das sequências terminais, contanto que a variante possua pelo menos uma proporção substancial da afinidade, especificidade, e/ou seletividade dos anticorpos progenitores no que diz respeito a um ou mais epítopos de CD38.

Considerações na seleção de variantes de anticorpos (p.ex., conservação das características funcionais de resíduos de aminoácidos, conservação de resíduos de aminoácidos com base em características hidrofílicas, e/ou conservação de resíduos de aminoácidos com base no peso/tamanho) estão descritas noutro lugar aqui. Tipicamente, as alterações de sequências de aminoácidos, tais como variações de substituições conservativas, não alteram desejavelmente substancialmente as características estruturais da sequência progenitora (p.ex., um aminoácido de substituição não deve tender a desagregar a estrutura secundária que caracteriza a função da sequência progenitora). Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipéptidos reconhecidas na técnica estão descritos em, p.ex., Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nova Iorque (1984)), Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nova Iorque, N.I. (1991)) e Thornton et al., Nature 354, 105 (1991). Princípios adicionais relevantes para a conceção e construção de variantes de péptido estão discutidos em por exemplo Collinet et al., J Biol Chem 275 (23), 17428-33 (2000).

Variantes de sequências de aminoácidos de um anticorpo podem ser obtidas por introdução de mudanças de nucleótidos apropriadas no ácido nucleico codificando anticorpo (p.ex., por mutagénese sítio-dirigida) ou por síntese química de péptidos. Tais variantes incluem, por exemplo, eliminações das, e/ou inserções nas e/ou substituições das e/ou adições às sequências terminais de resíduos dentro das sequências de aminoácidos dos anticorpos dos exemplos aqui. Qualquer combinação de eliminações, inserções, e substituições pode ser feita para se chegar a uma variante desejada, contanto que a variante possua pelo menos uma proporção substancial de características de ligação de epítopo do anticorpo progenitor. As mudanças de sequências de aminoácidos, no que diz respeito a um anticorpo progenitor, podem também alterar processos pós-translacionais do anticorpo variante no que diz respeito a um anticorpo progenitor, tal como por mudança do número ou posição de locais de glicosilação.

Os anticorpos variantes podem compreender alterações na região hipervariável, tal como nas CDRs. Exemplos de CD38BPs compreendendo tais variantes de CDR estão descritos noutro lugar aqui, e, como descrito acima, tais CD38BPs podem ser anticorpos.

Os anticorpos variantes da presente invenção podem compreender alterações de framework (FR) , isto é, fora da região hipervariável, por exemplo na região Fc, cujas alterações podem estar associadas a propriedades vantajosas, tais como mudança das propriedades funcionais ou farmacocinéticas dos anticorpos. Por exemplo, uma substituição ou outra modificação (inserção, eliminação, adições às sequências terminais ou combinação de qualquer uma das mesmas) numa região de framework ou domínio constante pode estar associada a um aumento na meia-vida do anticorpo variante no que diz respeito ao anticorpo progenitor, ou pode ser feita para alterar a imunogenicidade do anticorpo variante no que diz respeito ao anticorpo progenitor, para proporcionar um local para ligação covalente ou não covalente a outra molécula, ou para alterar tais propriedades como fixação do complemento, por exemplo resultando numa diminuição ou aumento da ligação a Clq e CDC ou de ligação a FcyR e citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). As substituições podem por exemplo ser feitas num ou mais dos resíduos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 da região constante de cadeia pesada, causando deste modo uma alteração na função efetora enquanto retêm ligação ao antigénio em comparação com o anticorpo não modificado, cf. US 5,624,821 e US 5,648,260. Pode ser feita referência adicional a WO 00/42072 divulgando anticorpos com regiões Fc alteradas que aumentam a ADCC, e WO 94/29351 divulgando anticorpos tendo mutações na região N-terminal do domínio Ch2 que alteram a capacidade dos anticorpos de se ligarem a

FcRI e deste modo diminuem a capacidade dos anticorpos de se ligarem a Clq o que por seu turno diminui a capacidade dos anticorpos de fixarem o complemento. Além do mais, Shields et al., J. Biol. Chem. 276, 6591-6604 (2001) ensinam variantes de combinação, que melhoram a ligação a FcyRIII, por exemplo T256A/S298A, S298A/E333A, e S298A/E333A/K334A. A meia-vida in vivo dos anticorpos pode ser também melhorada por modificação do epitopo de recetor de resgate do dominio constante de Ig ou um domínio constante do tipo Ig tal que a molécula não compreenda um domínio Ch2 intacto ou uma região Fc de Ig intacta, cf. US 6, 121,022 e US 6, 194,551. A meia-vida in vivo pode ser além do mais aumentada por realização de mutações na região Fc, p.ex., por substituição de treonina por leucina na posição 252, treonina por serina na posição 254, ou treonina por fenilalanina na posição 256, cf. US 6,277,375.

Os anticorpos anti-CD38 da invenção podem ser anticorpos anti-CD38 variantes em que os potenciais epítopos de células T no anticorpo foram reduzidos ou eliminados através de conceção racional. Assim sendo, por exemplo, numa forma de realização, a presente invenção proporciona um anticorpo anti-CD38 "desimunizado" no qual os potenciais epítopos de células T foram eliminados. A conceção e construção de anticorpos anti-CD38 desimunizados podem ser alcançadas por qualquer técnica conhecida adequada (ver por exemplo W09852976 no que diz respeito a métodos para preparação de anticorpos desimunizados) . Espera-se que a imunogenicidade em humanos seja eliminada ou substancialmente reduzida quando tais CD38BPS (p.ex., anticorpos anti-CD38 variantes) são administrados.

Outras mutações de framework podem incluir mudanças de sequências que podem reduzir a suscetibilidade à proteólise, reduzir a suscetibilidade à oxidação, e/ou conferir ou modificar outras propriedades fisico-quimicas ou funcionais no anticorpo variante associado.

As variações de sequências de aminoácidos no framework podem também resultar num padrão de glicosilação alterado no anticorpo variante no que diz respeito a um anticorpo progenitor. Por alteração entende-se eliminação de uma ou mais frações de carboidrato encontradas no anticorpo progenitor, e/ou adição de um ou mais locais de glicosilação que não estão presentes no anticorpo progenitor. A glicosilação de anticorpos é tipicamente ligada em N ou ligada em 0. Ligado em N refere-se à anexação da fração de carboidrato à cadeia lateral de um residuo de asparagina. As sequências de tripéptido asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são sequências de reconhecimento comuns para anexação enzimática da fração de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim sendo, a presença de qualquer uma destas sequências de tripéptido num polipéptido pode criar um potencial local de glicosilação. Glicosilação ligada em 0 refere-se à anexação de açúcares tais como N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxiaminoácido, o mais comummente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina possa ser também usada. A adição de locais de glicosilação ao anticorpo pode ser convenientemente alcançada por alteração das sequências de aminoácidos tal que contenham uma ou mais das sequências de tripéptido acima descritas (para locais de glicosilação ligados em N). A alteração pode ser também feita pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para locais de glicosilação ligados em 0).

Os anticorpos podem ser também expressos num transfectoma que não adiciona a unidade de fucose normalmente anexada ao carboidrato anexado a Asn na posição 297 de Fc de modo a intensificar a atividade de Fc quanto a FcyRIII o que por seu turno resultará numa ADCC aumentada dos anticorpos na presença de células NK, cf. Shield et al.r J. Biol. Chem. 277, 26733 (2002). Outros métodos de modificação da glicosilação com foco na fucosilação estão descritos em WO 00/61739 em nome de Kyowa. Além do mais pode ser feita modificação de galactosilação de modo a modificar a CDC. Pode ser feita referência adicional a WO 99/54342 e Umana et al., Nat. Biotechnol. 17, 176 (1999) divulgando uma linha de células CHO manipulada para expressar GntIII resultando na expressão de anticorpos monoclonais com glicoformas alteradas e atividade de ADCC melhorada.

Outras técnicas potencialmente adequadas para preparação de novos anticorpos anti-CD38 incluem mutagénese por walking de CDR, baralhação de cadeias de anticorpos, "mutagénese parcimoniosa" (Balint e Larrick, Gene 137, 109-118 (1993)), e outras técnicas de maturação por afinidade (ver por exemplo Wu et al., PNAS USA 95, 6037-42 (1998)).

Procedimentos de clonagem de repertório podem ser também úteis na produção de anticorpos variantes (ver por exemplo WO 96/33279).

Existe um número de técnicas conhecidas para geração de variantes de CDR, qualquer técnica ou combinação das quais adequada pode ser usada no contexto da presente invenção para geração de variantes de CDR das CDRs dos anticorpos dos exemplos. Exemplos de tais técnicas incluem a remoção de resíduos não essenciais como descrito em Studnicka et al., Protein Engineering 7, 805-814 (1994) (ver também

Soderlind et al., Immunotechnology. 4 (3-4), 279-85 (1999)), mutagénese por walking de CDR e outras técnicas de maturação por afinidade artificiais (ver por exemplo Yang et al., Journal of Molecular Blology 254 (3), 392-403 (1995)), técnicas de baralhação de CDR em gue tipicamente as CDRs são amplificadas a partir de um conjunto diverso de moldes de gene opcionalmente compreendendo oligonucleótidos sintéticos, as regiões constantes do Vl, Vh, e/ou CDRs são amplificadas, e os vários fragmentos misturados (em formato de cadeia única ou cadeia dupla) e montados por reação em cadeia da polimerase (PCR) para produzir um conjunto de produtos de gene codificando fragmentos de anticorpos transportando CDR baralhadas introduzidas para assegurar produção de produtos de comprimento total, que são inseridos num vetor de escolha e usados para expressar proteínas contendo CDR variantes. A estrutura apropriada pode ser determinada por superimposição das estruturas variantes/miméticas e aquelas das sequências progenitoras, p.ex., por comparação de estruturas em solução de NMR. Métodos úteis para conceção racional de variantes de sequências de CDR estão descritos em por exemplo WO 91/09967 e WO 93/16184. Exemplos adicionais de tais métodos são proporcionados noutro lugar aqui.

Os anticorpos da presente invenção incluem fragmentos de anticorpos (incluindo anticorpos variantes) da presente invenção, cujos fragmentos têm a capacidade de se ligarem a CD38 (fragmentos de ligação a CD38) . Os anticorpos da invenção incluem assim moléculas do tipo anticorpo que compreendem menos do que a estrutura tetramérica total associada a anticorpos ocorrendo naturalmente. Um fragmento de anticorpo pode ser qualquer péptido que compreende uma porção de um anticorpo de comprimento total, geralmente a sua região de ligação ao antigénio ou variável (isto inclui, por exemplo, fragmentos de anticorpos humanizados compreendendo s CDRs de um anticorpo da presente invenção).

Numa forma de realização, um fragmento de anticorpo refere-se a um péptido que consiste essencialmente ou consiste somente numa porção de uma molécula de anticorpo. Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um fragmento de anticorpo compreendendo pelo menos uma porção de um domínio variável de cadeia pesada contendo as três CDRs de Vh de um anticorpo da presente invenção e também um domínio variável de cadeia leve compreendendo as três CDRs de VL de um anticorpo da presente invenção, em que o domínio variável de cadeia pesada, e opcionalmente o domínio variável de cadeia leve, está (estão) opcionalmente fundido(s) com uma fração adicional, tal como um domínio constante de imunoglobulina. Sequências de domínios constantes podem ser adicionadas à(s) sequência(s) de cadeia pesada e/ou cadeia leve para formar espécies com cadeia(s) pesada(s) e/ou leve(s) com comprimento parcial. As regiões constantes, ou suas porções, de qualquer isotipo de anticorpo podem ser usadas para este propósito, incluindo regiões constantes de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE.

Exemplos de fragmentos de anticorpo de ligação a CD38 incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv. Um fragmento de anticorpo no contexto da presente invenção pode também incluir um péptido compreendendo as CDRs de um anticorpo da invenção, e similares. Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um fragmento de anticorpo compreendendo uma primeira cadeia de polipéptidos que compreende as CDRs de cadeia pesada de um anticorpo da invenção e uma segunda cadeia de polipéptidos que compreende as CDRs de cadeia leve de um anticorpo da invenção, em que as duas cadeias de polipéptidos estão covalentemente ligadas por uma ou mais ligações de dissulfeto intercadeias. Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um fragmento de anticorpo de duas cadeias tendo tais características em que o fragmento de anticorpo é selecionado de fragmentos Fab, Fab", Fab"-SH, Fv e/ou F(ab')2.

Os anticorpos podem ser fragmentos usando técnicas convencionais, e os fragmentos rastreados quanto à utilidade do mesmo modo como descrito acima para anticorpos inteiros. Por exemplo podem ser gerados fragmentos F(ab")2 por tratamento de anticorpo com pepsina. 0 fragmento F(ab')2 resultante pode ser tratado para reduzir as pontes de dissulfeto para produzir fragmentos Fab". Podem ser obtidos fragmentos Fab por tratamento de um anticorpo para IgG com papaina; podem ser obtidos fragmentos Fab" com digestão com pepsina de anticorpo para IgG. Um fragmento Fab" pode ser também produzido por ligação de Fab" descrito em baixo através de uma ligação de tioéter ou uma ponte de dissulfeto. Um fragmento Fab" é um fragmento de anticorpo obtido por corte de uma ponte de dissulfeto da região de charneira do F(ab")2. Um fragmento Fab" pode ser obtido por tratamento de um fragmento F(ab")2 com um agente redutor, tal como ditiotreitol. Péptidos de fragmento de anticorpo podem ser também gerados por expressão de ácidos nucleicos codificando tais péptidos em células recombinantes (ver por exemplo Evans et al., J. Immunol. Meth. 184, 123-38 (1995)). Por exemplo, um gene quimérico codificando uma porção de um fragmento F(ab")2 poderia incluir sequências de DNA codificando o dominio ChI e região de charneira da cadeia H, seguido por um codão de terminação translacional para originar uma molécula de fragmento de anticorpo truncada.

Os anticorpos da invenção incluem também anticorpos univalentes e anticorpos de cadeia única. Os anticorpos de cadeia única são péptidos nos quais as regiões Fv de cadeia pesada e leve estão conectadas. Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um Fv de cadeia única (scFV) em que as cadeias pesada e leve no Fv de um anticorpo anti-CD38 da presente invenção estão unidas com um ligante de péptido flexível (tipicamente de cerca de 10, 12, 15 ou mais resíduos de aminoácidos) numa única cadeia de péptidos. Métodos de produção de tais anticorpos estão descritos em por exemplo US 4,946,778, Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antihodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994), Bird et al., Science 242, 423-426 (1988), Huston et ai., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) e McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990). O anticorpo de cadeia única pode ser monovalente, se forem usados Vh e Vl de cadeia única, bivalente, se foram usados dois Vh e VL, ou polivalente, se forem usados mais do que dois Vh e VL.

Numa forma de realização da presente invenção, o anticorpo pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula funcional, por exemplo outro péptido ou proteína (tal como um fragmento Fab') para gerar uma molécula biespecífica ou multiespecífica que se liga a múltiplos locais de ligação ou epítopos alvo. Por exemplo, um anticorpo da presente invenção pode estar funcionalmente ligado (por exemplo por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras moléculas de ligação, tais como outro anticorpo, péptido ou mimético de ligação. Conformemente, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas e multiespecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação quanto a CD38 e uma segunda especificidade de ligação quanto a um segundo epítopo alvo. Numa forma de realização da presente invenção, o segundo epítopo alvo é um recetor Fc, p.ex., recetor FcyRI humano (CD64) ou Fca humano (CD89) , ou um recetor de células T, p.ex., CD3. Numa forma de realização, a presente invenção proporciona moléculas biespecíficas e multiespecíficas capazes de ligação a células efetoras expressando FcyR, FcaR ou FcsR (p.ex., monócitos, macrófagos ou células polimorfonucleares (PMNs)), e a células alvo expressando CD38. Estas moléculas biespecificas e multiespecificas visam células expressando CD38 a célula efetora e desencadeiam atividades de células efetoras mediadas por recetor Fc, tais como fagocitose de células expressando CD38, citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), libertação de citocinas, ou geração de anião de superóxido.

As moléculas biespecificas e multiespecificas da presente invenção podem adicionalmente incluir uma terceira especificidade de ligação, adicionalmente a uma especificidade de ligação anti-Fc e uma especificidade de ligação anti-CD38. Numa forma de realização, a terceira especificidade de ligação é uma porção de antifator de intensificação (EF), p.ex., uma molécula que se liga a uma proteína da superfície envolvida na atividade citotóxica e deste modo aumenta a resposta imune contra a célula alvo. A "porção antifator de intensificação" pode ser um anticorpo, fragmento de anticorpo funcional ou um ligando que se liga a uma dada molécula, p.ex., um antigénio ou um recetor, e deste modo resulta numa intensificação do efeito dos determinantes de ligação para o recetor Fc ou antigénio de célula alvo. A "porção antifator de intensificação" pode ligar-se a um recetor Fc ou um antigénio de célula alvo. Alternativamente, a porção antifator de intensificação pode ligar-se a uma entidade que é diferente da entidade à qual as primeira e segunda especificidades de ligação se ligam. Por exemplo, a porção antifator de intensificação pode ligar-se a uma célula T citotóxica (p.ex., através de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ou outra célula imune que resulta numa resposta imune aumentada contra a célula alvo).

Numa forma de realização, as moléculas biespecíficas e multiespecíficas da presente invenção compreendem como uma especificidade de ligação pelo menos um anticorpo adicional, incluindo, p.ex., um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ou um scFv. 0 anticorpo adicional pode ser também um dimero de cadeia leve ou cadeia pesada, ou qualquer seu fragmento minimo tal como um Fv ou um constructo de cadeia única como descrito em Ladner et al., e, US 4, 946, 778. 0 anticorpo pode ser também uma proteína de fusão de imunoglobulina com domínio de ligação US 2003/0118592 e US 2003/0133939.

Numa forma de realização, a especificidade de ligação quanto a um recetor Fc é proporcionada por um anticorpo monoclonal humano, a ligação do qual não é bloqueada por imunoglobulina G (IgG) humana. Como usado aqui, o termo "recetor de IgG" refere-se a qualquer um dos oito genes de cadeia γ localizados no cromossoma 1. Estes genes codificam um total de doze isoformas de recetor transmembranares ou solúveis que são agrupados em três classes de recetores Fc*: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), e FcyRIII (CD16). Numa forma de realização, o recetor Fcy é um FcyRI de elevada afinidade humano. A produção e caracterização destes anticorpos monoclonais estão descritas por Fanger et al., em WO 88/00052 e em US 4,954,617. Estes anticorpos ligam-se a um epítopo de FcyRI, FcyRII ou FcyRIII num local que é distinto do local de ligação de Fcy do recetor e, assim sendo, a sua ligação não é bloqueada substancialmente por níveis fisiológicos de IgG. Anticorpos anti-FcYRI específicos úteis na presente invenção são mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 e mAb 197. Noutras formas de realização, o anticorpo antirrecetor Fcy é uma forma humanizada de mAb 22 (H22). A produção e caracterização do anticorpo H22 estão descritas em Graziano, R. F. et al., J. Immunol. 155 (10), 4996-5002 (1995) e WO 94/10332. A linha de células produtoras de anticorpos H22 foi depositada no American

Type Culture Collection em 4 de novembro, 1992 sob a designação HA022CL1 e tem o No. de acesso CRL 11177.

Numa forma de realização, a especificidade de ligação quanto a um recetor Fc é proporcionada por um anticorpo que se liga a um recetor de IgA humano, p.ex., um recetor Fca (Fcal (CD89)), a ligação do qual numa forma de realização não é bloqueada por imunoglobulina A (IgA) humana. 0 termo "recetor de IgA" destina-se a incluir o produto de gene de um gene α (FcaRI) localizado no cromossoma 19. Sabe-se que este gene codifica várias isoformas transmembranares alternativamente processadas de 55 a 110 kDa. FcaRI (CD89) é constitutivamente expresso em monócitos/macrófagos, granulócitos eosinofilicos e neutrofilicos, mas não em populações de células não efetoras. FcaRI tem afinidade média quanto a IgAl e IgA2, que é aumentada após exposição a citocinas tais como G-CSF ou GM-CSF (Morton, H. C. et al., Criticai Reviews in Immunology 16, 423-440 (1996)). Quatro anticorpos monoclonais específicos quanto a FcaRI, identificados como A3, A59, A62 e A77, que se ligam a FcaRI fora do domínio de ligação ao ligando de IgA, foram descritos (Monteiro, R. C. et al., J. Immunol. 148, 1764 (1992)) .

FcaRI, FcyRI, FcyRII e FcyRIII, especialmente FcyRII e FcyRIII, são exemplos de recetores desencadeantes para uso na presente invenção porque (1) são expressos maioritariamente em células efetoras imunes, p.ex., monócitos, PMNs, macrófagos e células dendríticas; (2) são expressos a níveis elevados (por exemplo 5.000-100.000 por célula); (3) são mediadores de atividades citotóxicas (por exemplo ADCC, fagocitose); e (4) medeiam apresentação de antigénios intensificada, incluindo autoantigénios, dirigidos a eles.

Numa forma de realização, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo anti-CD38 multiespecifico como molécula do tipo anticorpo, um exemplo particular do qual é um anticorpo biespecifico compreendendo pelo menos um par de cadeias de sequência de VH e sequência de Vl especifico quanto a um epitopo compreendido pelo menos em parte em CD38 e um segundo pelo menos um par de cadeias de sequências de Vh e Vl especifico quanto a um segundo epitopo. As sequências de VH e VL num anticorpo biespecifico podem compreender sequências de Vh e VL completas correspondendo a sequências de VH e Vl anti-CD38, sequências de Vh e/ou VL variantes, ou porções adequadas de regiões Vh e/ou Vl, tais como uma combinação adequada de sequências de CDR e outras sequências suficientes para proporcionar ligação aos epitopos de interesse.

Moléculas de anticorpos biespecificos exemplares

compreendem (i) dois anticorpos, um com uma especificidade quanto a CD38 e outro quanto a um segundo alvo que estão conjugados em conjunto, (ii) um único anticorpo que tem uma cadeia especifica quanto a CD38 e uma segunda cadeia especifica quanto a uma segunda molécula, e (iii) um anticorpo de cadeia única que tem especificidade quanto a CD38 e uma segunda molécula. Tipicamente, o segundo alvo/segunda molécula é uma molécula sem ser CD38. Numa forma de realização, a segunda molécula é um antigénio do cancro/antigénio associado a tumores tal como antigénio carcinoembriónico (CEA), antigénio especifico da próstata (PSA), RAGE (antigénio renal), α-fetoproteina, CAMEL (antigénio reconhecido por CTL em melanoma), antigénios CT (tais como MAGE-B5, -B6, -C2, -C3, e D; Mage-12; CT10; NY-ESO-1, SSX-2, GAGE, BAGE, MAGE, e SAGE), antigénios de mucina (p.ex., MUC1, mucin-CA125, etc.), antigénios de gangliosideo, tirosinase, gp75, C-myc, Marti, MelanA, MUM-1, MUM-2, MUM-3, HLA-B7, e Ep-CAM. Numa forma de realização, a segunda molécula é uma integrina associada a cancros, tais como integrina α5β3. Numa forma de realização, a segunda molécula é um fator angiogénico ou outro fator de crescimento associado a cancros, tais como um fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), um fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), recetor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), angiogenina, e seus recetores, particularmente recetores associados à progressão de cancros (por exemplo um dos recetores HER1-HER4). Outras proteinas associadas à progressão de cancros discutidas aqui podem ser também segundas moléculas adequadas. Numa forma de realização, a segunda molécula é uma molécula expressa na superfície de células de mieloma múltiplo tais como CD138.

Numa forma de realização, um anticorpo biespecífico da presente invenção é um diacorpo.

Os anticorpos biespecificos incluem também anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos num heteroconjugado pode ser acoplado à avidina e o outro à biotina. Foi proposto que tais anticorpos, por exemplo, visassem células do sistema imune a células indesejadas (ver por exemplo US 4,676,980). Os anticorpos heteroconjugados podem ser preparados usando quaisquer métodos de reticulação convenientes. Agentes e técnicas de reticulação de péptidos adequados são bem conhecidos na técnica, e exemplos de tais agentes e técnicas são divulgados em por exemplo US 4,676,980.

Assim, embora a discussão aqui possa focar-se em anticorpos, deve ser entendido que as formas de realização e caracteristicas dos anticorpos podem ser igualmente aplicadas a fragmentos de anticorpos, tais como fragmentos

Fab, fragmentos Fab', e péptidos scFv, péptidos do tipo anticorpos (péptidos compreendendo uma CDR), anticorpos bi-e multiespecificos e outros CD38BPs, como apropriado, contanto que o anticorpo da presente invenção retenha pelo menos uma proporção substancial das propriedades de ligação ao antigénio do correspondente anticorpo completo. Em alguns casos, os fragmentos de anticorpos podem estar associados a afinidade de ligação ao antigénio mais baixa, mas podem oferecer outras características vantajosas que podem compensar qualquer tal perda na afinidade.

Os anticorpos anti-CD38 de acordo com a presente invenção podem ser selecionados com base na sua capacidade de proporcionarem a capacidade de fixação do complemento, ou não. Existe um número de isotipos de anticorpos que são capazes de fixação do complemento e CDC, incluindo, sem limitação, os seguintes: IgM de murino, IgG2a de murino, IgG2b de murino, IgG3 de murino, IgM humana, IgGl humana, e IgG3 humana. Aqueles isotipos que não incluem, sem limitação, IgG2 humana e IgG4 humana. A determinação de isotipos e outros métodos para modificação da fixação do complemento e características funcionais de CDC de anticorpos são conhecidos na técnica.

Os CD38BPs como descritos aqui incluem também imunoadesinas, que são moléculas em que uma ou mais CDRs de um anticorpo anti-CD38 estão covalentemente ou não covalentemente associadas à molécula. Uma imunoadesina pode incorporar a(s) CDR(s) como parte de uma cadeia de polipéptidos maior, pode ligar covalentemente a(s) CDR(s) a outra cadeia de polipéptidos, ou pode incorporar a(s) CDR(s) não covalentemente. As CDRs permitem que a imunoadesina se ligue especificamente a um CD38.

Os anticorpos da presente invenção podem ser também proporcionados como proteínas de fusão de CD38BP. As proteínas de fusão de CD38BP podem compreender qualquer sequência de aminoácidos adequada ou combinação de sequências que são especificas e/ou seletivas quanto a pelo menos um dominio que é pelo menos parcialmente compreendido dentro de CD38 (p.ex., um dominio Vh dominio Vl de um anticorpo anti-CD38, ou suas CDRs particulares) e pelo menos uma sequência de aminoácidos tipicamente substancialmente não similar (p.ex., menos do que cerca de 40%, menos do que cerca 35%, menos do que cerca 30%, menos do que cerca 25%, ou menos do que cerca 20% de identidade de sequências de aminoácidos com a sequência especifica/seletiva quanto a CD38) que fornece uma função biológica detetável e/ou característica à proteína de fusão que não pode ser atribuída unicamente à sequência especifica/seletiva quanto a CD38 (p.ex., meia-vida in vivo aumentada, fluorescência, direcionamento aumentado para um tipo particular de célula, etc.). As sequências funcionais de uma tal proteína de fusão podem estar separadas por ligante(s) flexível(eis) . A(s) sequência(s) secundária(s) podem ser também derivada(s) de péptidos citotóxicos ou apoptóticos. As sequências secundárias podem também conferir propriedades de diagnóstico. Exemplos de tais sequências incluem aquelas derivadas de enzimas facilmente visualizadas tais como peroxidase do rábano-silvestre.

As proteínas de fusão de CD38BP podem ser também caracterizadas por compreender um marcador de epítopo. Uma sequência de marcador de epítopo é uma sequência de aminoácidos tendo resíduos suficientes para proporcionar um epítopo contra o qual um anticorpo pode ser preparado, no contexto do CD38BP, todavia é curta o suficiente tal que não interfira substancialmente com a atividade (seletividade, especificidade, afinidade, e/ou atividade biológica) do CD38BP (em comparação com um CD38BP progenitor não tendo o marcador de epitopo). Um marcador de epitopo é desejavelmente suficientemente único tal que o anticorpo antimarcador de epitopo não reaja substancialmente de modo cruzado com outros epitopos. Os polipéptidos marcadores adequados têm geralmente pelo menos cerca de 6 resíduos de aminoácidos e usualmente entre cerca de 8-50 resíduos de aminoácidos (p.ex., cerca de 9-30 resíduos). Exemplos de marcadores de epitopo incluem o polipéptido marcador HA da gripe e o seu anticorpo 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159-2165 (1988)); o marcador c-myc e os anticorpos para ele 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 (Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5 (12), 3610-3616 (1985)) e o marcador da glicoproteína D (gD) do vírus da Herpes Simplex e o seu anticorpo (Paborsky et al., Protein Engineerlng 3 (6), 547-553 (1990)). Em certas formas de realização, o marcador de epitopo é um "epitopo de ligação a recetor de resgate". Como usado aqui, o termo "epitopo de ligação a recetor de resgate" refere-se a um epitopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável pelo aumento da meia-vida no soro in vivo da molécula de IgG.

Os anticorpos anti-CD38 da presente invenção podem ser também usados para produzir derivados de anticorpos anti-CD38. Um derivado de anticorpo compreende um anticorpo no qual um ou mais dos resíduos de aminoácidos do anticorpo foram quimicamente modificados (p.ex., por alquilação, acilação, formação de éster, ou formação de amida) ou covalentemente associados a um ou mais substituintes heterólogos (p.ex., um substituinte lipofílico, uma fração de PEG, uma cadeia lateral de péptido ligada por um ligante de fração orgânica adequado, etc.). O anticorpo pode ser também conjugado a uma fração terapêutica, tal como um citotoxina, um fármaco quimioterapêutico, um imunossupressor, ou um radioisótopo (um assim chamado imunoconjugado). Em general, os CD38BPs descritos aqui, tais como anticorpos anti-CD38 da invenção, podem ser modificados por inclusão de qualquer número adequado de tais aminoácidos modificados e/ou associações a tais substituintes conjugados. A adequabilidade neste contexto geral é determinada pela capacidade de pelo menos substancialmente reter a seletividade e/ou especificidade de CD38 associada ao CD38BP progenitor não derivatizado. A inclusão de um ou mais aminoácidos modificados pode ser vantajosa em, por exemplo, (a) aumento da meia-vida no soro do polipéptido, (b) redução da antigenicidade de polipéptido, ou (c) aumento da estabilidade no armazenamento de polipéptido. 0(s) aminoácido(s) são modificados, por exemplo, cotranslacionamente ou pós-translacionalmente durante a produção recombinante (p.ex., glicosilação ligada em N nos motivos N-X-S/T durante a expressão em células de mamífero) ou modificados por meios sintéticos. Exemplos não limitantes de um aminoácido modificado incluem um aminoácido glicosilado, um aminoácido sulfatado, um aminoácido prenliado (p.ex., farnesilado, geranilgeranilado), um aminoácido acetilado, um aminoácido acilatado, um aminoácido PEGuilado, um aminoácido biotinilado, um aminoácido carboxilado, um aminoácido fosforilado, e similares. Referências adequadas para orientar um com perícia na modificação de aminoácidos são repletas através da literatura. Protocolos exemplares são encontrados em Walker (1998) Protein Protocols On Cd-Rom, Humana Press, Towata, NJ., 0 aminoácido modificado pode ser selecionado de um aminoácido glicosilado, um aminoácido PEGuilado, um aminoácido farnesilado, um aminoácido acetilado, um aminoácido biotinilado, um aminoácido conjugado a uma fração de lípido, e um aminoácido conjugado a um agente derivatizante orgânico.

Adicionalmente, os anticorpos podem ser quimicamente modificados por conjugação covalente a um polimero para por exemplo aumentar a sua meia-vida em circulação. Polímeros, e métodos de os anexar a péptidos, exemplares estão ilustrados em por exemplo US 4,766,106, US 4,179,337, US 4,495,285 e US 4,609,546. Polímeros ilustrativos adicionais incluem polióis polioxietilados e polietileno glicol (PEG) (p.ex., um PEG com um peso molecular de entre cerca de 1.000 e cerca de 40.000, tal como entre cerca de 2000 e cerca de 20.000, p.ex., cerca de 3.000-12.000).

Os anticorpos da presente invenção podem ser conjugados a uma segunda molécula que é selecionada de um radionuclídeo, uma enzima, um substrato de enzima, um cofator, um marcador fluorescente, um marcador quimioluminescente, um marcador de péptido, ou uma partícula magnética. Numa forma de realização, um anticorpo pode ser conjugado a um ou mais fragmentos de anticorpos, ácidos nucleicos (oligonucleótidos), nucleases, hormonas, imunomoduladores, quelantes, compostos de boro, agentes fotoativos, corantes e similares. Estes e outros agentes adequados podem ser acoplados diretamente ou indiretamente a anticorpos da presente invenção. Um exemplo de acoplamento indireto de um segundo agente é acoplamento por uma fração espaçadora. Estes espaçadores, por seu turno, podem ser insolúveis ou solúveis (ver por exemplo Diener et al., Science 231, 148 (1986)) e podem ser selecionados para permitir libertação de fármacos a partir do anticorpo num local alvo e/ou sob condições particulares. Exemplos adicionais de agentes terapêuticos que podem ser acoplados a anticorpos incluem lectinas e péptidos fluorescentes.

Numa forma de realização são proporcionados derivados de anticorpos compreendendo um ou mais aminoácidos radiomarcados. Um anticorpo radiomarcado pode ser usado para propósitos de diagnóstico e terapêuticos (conjugação a moléculas radiomarcadas é outra caracteristica possivel). Exemplos não limitantes de marcadores para polipéptidos incluem, mas não estão limitados a, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, "Tc, 1251, 131I e 186Re. Métodos para preparação de aminoácidos radiomarcados e derivados de péptidos relacionados são conhecidos na técnica (ver por exemplo Junghans et al., em Câncer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2a edição, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) e US 4,681,581, US 4,735,210, US 5,101,827, US 5, 102, 990 (US RE35,50 0) , US 5, 648,471 e US 5, 697, 902. Por exemplo, um radioisótopo pode ser conjugado por um método de cloramina T.

Radionuclideos vantajosos em contextos de diagnóstico são isótopos de indio e no contexto de aplicações terapêutica isótopos de itrio, que são citotóxicos. Os radioisótopos emissores de fotões, em geral, são vantajosos em métodos de diagnóstico (radioimunocintigrafia (RIS)). Os eletrões de Auger têm um comprimento de caminho muito curo (5-10 nm) e necessitam de ser internalizados para serem citotóxicos (ver por exemplo Adelstein et al., Nucl. Med. Biol. 14, 165-169 (1987)). Conformemente, os anticorpos conjugados a tais isótopos podem ser úteis em métodos de diagnóstico, mas somente anticorpos que são internalizados devem ser considerados para radioisótopos que emitem eletrões de Auger em contextos terapêuticos. As partículas alfa necessitam de estar próximas de uma célula (no espaço de 3-4 diâmetros da célula) para serem eficazes como agentes terapêuticos (Vriesendorp et al., "Radioimmunoglobulin therapy", em High Dose Câncer Therapy Armitage et al., (eds). (Williams & Wilkins, Baltimore, Md. 1992)). Tanto eletrões de Auger como emissores alfa podem ser considerados como tendo elevada seletividade porque a sua emissão de curto alcance não irradiará tipicamente células normais da vizinhança.

Os radiometais inIn e 90Y são, respetivamente, um γ-emissor puro e um β-emissor puro. 0 iodo-125, o emissor mais comummente usado de eletrões de Auger, tem uma meia-vida de cerca de 60 dias e é frequentemente liberto por imunoconjugados in vivo (devido à desalogenação). Os emissores alfa mais comummente considerados para uso clinico, astatina-211 e bismuto-212, têm meias-vidas relativamente curtas (7,2 h e 1,0 h, respetivamente) e decaem em isótopos radioativos que podem não ser retidos pelo imunoconjugado após a primeira emissão de alfa (Wilbur, Antibiot. Immunoconjug. Radiopharm. 4, 5-97 (1991)). Para aplicações de diagnóstico podem ser usados CD38BPs, tais como anticorpos anti-CD38 da invenção, marcados com índio-11 ou tecnécio-99m. Ambos estes isótopos emitem raios gama dentro da gama de energias apropriada para imagiologia (100-250 keV) . As energias abaixo desta gama não são tipicamente penetrantes o suficiente para alcançaram um dispositivo de imagiologia externa. Niveis de energia mais elevados são dificeis de colimar e proporcionam imagens de diagnóstico com fraca resolução. A curta meia-vida de "Tc restringe tipicamente o seu uso a imunoconjugados com rápida captação tumoral.

Numa forma de realização são proporcionados primeiro e segundo anticorpos para CD38 conjugados com primeiro e segundo radioisótopos. Noutra forma de realização é proporcionado um único anticorpo para CD38 conjugado com dois radioisótopos. Uma vantagem do uso de dois radioisótopos separados, p.ex., um para imagiologia e um para terapia, é que facilita o tratamento externo. A baixa quantidade de radioatividade usada diagnosticamente não representa um perigo de radiação, enquanto a radiação emitida por um isótopo terapêutico, tal como um β-emissor puro, será tipicamente largamente absorvida na vizinhança das células visadas.

Os radioisótopos podem ser anexados diretamente ou indiretamente a um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38 da invenção. Os radioisótopos 125I, 1311, "Tc, 186Re, e 188Re podem ser, por exemplo, covalentemente ligados a proteinas (incluindo anticorpos) através de grupos funcionais de aminoácidos. Para iodo radioativo é usualmente através do grupo fenólico encontrado na tirosina. Existem numerosos métodos para alcançar isto: cloramina-T (ver por exemplo Greenwood et al., Biochem J. 89, 114-123 (1963) e Iodogénio (Salacinski et al., Anal. Biochem. 117, 136-146 (1981)). Os isótopos Tc e Re podem ser covalentemente ligados através do grupo sulfidrilo da cisteina (ver por exemplo Griffiths et al., Câncer Res. 51, 4594-4602 (1991)). No entanto, tais composições podem ser relativamente mais bem adequadas para propósitos de diagnóstico pois o corpo pode frequentemente quebrar estas ligações covalentes, libertando os radioisótopos no sistema circulatório.

Um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38 da invenção, pode ser também marcado com enzimas que são úteis para deteção, tais como peroxidase do rábano-silvestre, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina, glucose oxidase, e similares. Um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38 da invenção, pode ser também marcado com biotina, e conformemente através de medição indireta da ligação de avidina ou estreptavidina. Um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38 da invenção, pode ser também marcado com um epitopo de polipéptido pré-determinado reconhecido por um repórter secundário (p.ex., sequências de pares de fechos de leucina, locais de ligação para anticorpos secundários, dominios de ligação a metais, marcadores de epitopos, etc.). Exemplos adicionais de candidatos de conjugados de enzima incluem malato desidrogenase, nuclease estafilocóccica, delta-V-esteroide isomerase, álcool desidrogenase da levedura, α-glicerofosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, asparaginase, glucose oxidase, ribonuclease, urease, catalase, glucose-6-fosfato desidrogenase, glucoamilase e acetilcolinesterase.

Frações de marcação exemplares adicionais incluem geralmente, mas não estão limitados a, moléculas marcadas por spin e outras frações de marcação de valor diagnóstico.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona derivados de anticorpos para CD38 reticulados. Por exemplo, um tal derivado de anticorpo para CD38 pode ser produzido por reticulação de dois ou mais anticorpos, pelo menos um dos quais é especifico/seletivo quanto a um anticorpo da invenção (do mesmo tipo ou de diferentes tipos, p.ex., para criar anticorpos biespecificos). Reticulantes adequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, tendo dois grupos distintamente reativos separados por um espaçador apropriado (p.ex., éster de m-maleimidobenzoí1-N-hidroxissuccinimida) ou homobifuncional (p.ex., suberato de dissuccinimidilo). Tais ligantes estão disponíveis da Pierce Chemical Company, Rockford, III.

Os anticorpos para CD38 podem ser também conjugados com qualquer tipo adequado de grupo químico, tal como polietileno glicol (PEG), um grupo metilo ou etilo, ou um grupo carboidrato. Estes e outros grupos conjugados adequados podem ser usados para melhorar as caracteristicas biológicas do anticorpo, p.ex., para aumentar a meia-vida no soro, solubilidade, e/ou ligação em tecidos.

Os derivados de anticorpos para CD38 podem ser produzidos por conjugação quimica de um radioisótopo, proteina, ou outro agente/fração/composto (a) ao lado N-terminal ou lado C-terminal do anticorpo ou sua subunidade (p.ex., uma cadeia H, cadeia L de anticorpo anti-CD38, ou seu fragmento especifico/seletivo quanto a anti-CD38) um grupo substituinte ou cadeia lateral apropriado ou (b) uma cadeia de açúcar no CD38BP (ver, p.ex., Antibody Engineering Handbook, editado por Osamu Kanemitsu, publicado por Chijin Shokan (1994)). Os derivados podem ser também gerados por conjugação em residuos internos ou açúcares, onde apropriado.

Os anticorpos para CD38 podem ser também derivatizados com um agente de deteção, por exemplo compostos fluorescentes, incluindo fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, cloreto de 5-dimetilamina-l-naftalenossulfonila, fósforos de lantanideo, e similares. Exemplos adicionais de marcadores fluorescentes adequados incluem um marcador de 125Eu, um marcador de isotiocianato, um marcador de ficoeritrina, um marcador de ficocianina, um marcador de aloficocianina, um marcador de o-ftaldeído, um marcador de fluorescamina, etc. Exemplos de marcadores quimioluminescentes incluem marcadores luminais, marcadores isoluminais, marcadores de ésteres de acridinio aromátios, marcadores de imidazol, marcadores de sais de acridinio, marcadores de ésteres de oxalato, um marcador de luciferina, marcadores de luciferase, marcadores de aequorina, etc.

Numa forma de realização, um derivado de anticorpo para CD38 compreende um ácido nucleico conjugado ou molécula associada a ácido nucleico. Numa tal faceta da invenção, o ácido nucleico conjugado é uma ribonuclease citotóxica.

Numa forma de realização, o ácido nucleico conjugado é um ácido nucleico antissenso (por exemplo uma molécula antissenso dirigida para S100A10, que pode ser também um componente independente numa composição de combinação ou método de administração de combinação como descrito aqui -ver por exemplo Zhang et al., J Biol Chem. 279 (3), 2053-62 (2004)). Numa forma de realização, o ácido nucleico conjugado é uma molécula de RNA inibidora (p.ex., uma molécula de siRNA) . Numa forma de realização, o ácido nucleico conjugado é um ácido nucleico imunoestimulador (p.ex., uma molécula de DNA contendo motivo CpG imunoestimuladora). Numa forma de realização, o ácido nucleico conjugado é uma cassete de expressão codificando a expressão de um gene supressor de tumores, vacina anticancro, citocina anticancro, ou agente apoptótico. Tais derivados podem também compreender conjugação de um ácido nucleico codificando a expressão de uma ou mais proteínas citotóxicas, tais como toxinas vegetais e bacterianas.

Numa forma de realização, o anticorpo é conjugado a uma molécula de ácido nucleico funcional. Ácidos nucleicos funcionais incluem moléculas antissenso, moléculas de ácido nucleico interferentes (p.ex., moléculas de siRNA), aptâmeros, ribozimas, moléculas formadoras de triplexes, e sequências guia externas. As moléculas de ácido nucleico funcionais podem aturar como afetores, inibidores, moduladores, e estimuladores de uma atividade especifica possuida por uma molécula alvo, ou as moléculas de ácido nucleico funcionais podem possuir uma atividade de novo independente de quaisquer outras moléculas. Uma amostra representativa de métodos e técnicas que auxiliam na conceção e uso de moléculas antissenso pode ser encontrada na seguinte lista não limitante de patentes dos EUA: US 5,135,917, US 5,294,533, US 5,627,158, US 5,641,754, US 5,691,317, US 5,780,607, US 5,786,138, US 5,849,903, US

5,856,103, US 5,919,772, US 5,955,590, US 5,990,088, US

5, 994,320, US 5, 998, 602, US 6, 005, 095, US 6, 007, 995, US

6,013,522, US 6,017,898, US 6,018,042, US 6,025,198, US 6, 033, 910, US 6, 040,296, US 6, 046, 004, US 6, 046, 319 e US 6,057,437.

Numa forma de realização, o anticorpo é conjugado a um aptâmero. Os aptâmeros são moléculas que interagem com uma molécula alvo, por exemplo de um modo especifico.

Tipicamente, os aptâmeros são pequenos ácidos nucleicos variando de 15-50 bases em comprimento que se dobram em estruturas secundárias e terciárias definidas, tais como

haste-alças ou quartetos em G. Os aptâmeros podem ligar-se a pequenas moléculas, tais como ATP (US 5,631,146) e teofilina (US 5,580,737), bem como moléculas grandes, tais como transcriptase reversa (US 5,786,463) e trombina (US 5,543,293). Exemplos representativos de como preparar e usar aptâmeros para se ligarem a uma variedade de diferentes moléculas alvo podem ser encontrados na seguinte lista não limitante de patentes dos EUA: US 5,476, 766, US 5,503,978, US 5,631,146, US 5,731,424, US 5,780,228, US

5,792,613, US 5,795,721, US 5,846,713, US 5,858,660, US

5, 861,254, US 5, 864,026, US 5, 869, 641, US 5, 958, 691, US

6,001,988, US 6,011,020, US 6,013,443, US 6,020,130, US 6, 028,186, US 6, 030,776 e US 6, 051, 698.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um anticorpo para CD38 que é conjugado a uma ribozima. As ribozimas são moléculas de ácido nucleico que são capazes de catalisar uma reação química, ou intramolecularmente ou intermolecularmente. As ribozimas são assim ácidos nucleicos catalíticos. Existem um número de diferentes tipos de ribozimas que catalisam reações do tipo nucleasse ou ácido nucleico polimerase que são baseadas em ribozimas encontradas em sistemas naturais, tais como (a) ribozimas

em cabeça de martelo (descritas em por exemplo US 5,334,711, US 5,436,330, US 5,616,466, US 5,633,133, US

5,646,020, US 5,652,094, US 5,712,384, US 5,770,715, US

5,856,463, US 5,861,288, US 5,891,683, US 5,891,684, US

5, 985, 621, US 5, 989, 908, US 5, 998, 193, US 5, 998,203, WO 9858058, WO 9858057 e WO 9718312), (b) ribozimas em gancho

(descritas em por exemplo US 5,631,115, US 5,646,031, US 5,683,902, US 5,712,384, US 5,856,188, US 5,866,701, US 5,869,339 e US 6,022,962), e (c) ribozimas em tetrahimena (descritas em por exemplo US 5,595,873 e US 5,652,107). Existe também um número de ribozimas que não são encontradas em sistemas naturais, mas que foram manipuladas para catalisarem reações especificas de novo (exemplos das quais estão descritas em por exemplo US 5,580,967, US 5,688,670, US 5,807,718 e US 5,910,408). As ribozimas clivam tipicamente substratos de RNA ou DNA, e mais comummente clivam substratos de RNA. As ribozimas clivam tipicamente substratos de ácido nucleico através do reconhecimento e ligação do substrato alvo com clivagem subsequente. Este reconhecimento é frequentemente baseado maioritariamente em interações de pares de bases canónicas ou não canónicas. Esta propriedade torna os ribozimas candidatos particularmente bons para clivagem especifica do alvo de ácido nucleicos porque o reconhecimento do substrato alvo é baseado na sequência do substrato alvo. Exemplos representativos de como preparar e usar ribozimas para catalisarem uma variedade de diferentes reações podem ser encontrados na seguinte lista não limitante de patentes dos EUA: US 5,646,042, US 5,693,535, US 5,731,295, US 5,811,300, US 5,837,855, US 5,869,253, US 5,877,021, US 5,877,022, US 5,972,699, US 5,972,704, US 5,989,906 e US 6,017,756.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um anticorpo para CD38 que é conjugado a um ácido nucleico com função formada de triplexes. Tais moléculas de ácido nucleico podem interagir com ácido nucleico de cadeia dupla ou cadeia única. Quando as moléculas de triplex interagem com uma região alvo é formada uma estrutura chamada um triplex, no qual três cadeias de DNA formam um complexo dependente de emparelhamento de bases de Watson-Crick e Hoogsteen. As moléculas de triplex podem ligar-se a regiões alvo com elevadas afinidade e especificidade. Exemplos representativos de como preparar e usar moléculas formadoras de triplexes para se ligarem a uma variedade de diferentes moléculas alvo podem ser encontrados na seguinte lista não limitante de patentes dos EUA: US 5,176,996, US 5,645,985, US 5,650,316, US 5,683,874, US 5,693,773, US 5,834,185, US 5,869,246, US 5,874,566 e US 5,962,426.

Numa forma de realização, um anticorpo para CD38 é conjugado a uma sequência guia externa. As sequências guia externas (EGSs) são moléculas que se ligam a uma molécula de ácido nucleico alvo formando um complexo que é reconhecido por RNase P, que cliva a molécula alvo. As EGSs podem ser concebidas para visarem especificamente uma molécula de RNA de escolha. A RNase P auxilia no processamento de RNA de transferência (tRNA) dentro de uma célula. A RNase P bacteriana pode ser recrutada para clivar virtualmente qualquer sequência de RNA por uso de uma EGS que faz com que o complexo RNA:EGS alvo mimetize o substrato de tRNA natural, (ver por exemplo WO 92/03566 e Forster e Altman, Science 238, 407-409 (1990) para discussão). Exemplos representativos de como preparar e usar moléculas de EGS para facilitarem a clivagem de uma variedade de diferentes moléculas alvo são proporcionados na seguinte lista não limitante de patentes dos EUA: US 5,168,053, US 5,624,824, US 5,683,873, US 5,728,521, US 5,869,248 e US 5,877,162.

Numa forma de realização, um anticorpo para CD38 é conjugado a uma molécula de ácido nucleico interferente, tal como uma siRNA ou outra molécula de RNAi (p.ex., uma molécula de RNA de cadeia dupla (ds) inibidora de cerca de 20-25 nucleótidos), que é dirigida para interferir com a ação de um produto de expressão de gene alvo, tal como um produto de expressão de gene envolvido numa doença ou condição mediada por CD38. Métodos para a produção e uso de moléculas de ácido nucleico interferentes são proporcionados em por exemplo Nishikura, Cell. 107 (4), 415-8 (2001), Fjose et al., Biotechnol Annu Rev. 7, 31-57 (2001), Hanon, Nature 418, 244-51 (2002), Brantl, Biochim

Biophys Acta. 1575 (1-3), 15-25 (2002), Tuschl,

Chembiochem. 2 (4), 239-45 (2001), Caplen, Expert Opin Biol Ther. 3 (4), 575-86 (2003), Lu et al., Curr Opin Mol Ther. 5 (3), 225-34 (2003), Shuey et al., Drug Discov Today. 1 (20), 1040-6 (2002), Shi, Trends Genet. 19 (1), 9-12 (2003), Kovar et al., Semin Câncer Biol. 13 (4), 275-81 (2003) , Lavrey et al., Curr Opin Drug Discov Devei. 6 (4), 561-9 (2003), Clewey, Commun Dis Public Health. 6 (2), 162-3 (2003), Duxbury et al., J Surg Res. 117 (2), 339-44 (2004) , Caplen et al., Ann N Y Acad Sei. 1002, 56-62

(2003), WO 01/75164, US 6,506,559, US 20040086884, US 20040077574, US 20040063654, US 20040033602, US

20030167490, US 20030157030, US 20030114409, US 20030108923, US 20040014113 e US 20020132788.

Numa forma de realização, um anticorpo para CD38 é conjugado a um péptido ou molécula de domínio de direcionamento tumoral. Numa forma de realização, um anticorpo para CD38 é conjugado a uma sequência de fator de direcionamento VII tumoral. Pode ser empregue qualquer método conhecido na técnica para conjugação do anticorpo para CD38BP à(s) molécula(s) conjugada(s) , tais como aquelas descritas acima, incluindo aqueles métodos descritos por Hunter et al., Nature 144, 945 (1962), David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain et al., J.

Immunol. Meth. 40, 219 (1981) e Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982). A ligação/conjugação pode ser alcançada de qualquer modo adequado. Por exemplo, uma ligação covalente pode tomar a forma de uma ligação de dissulfeto (se necessário e adequado, um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38 da invenção, poderia ser manipulado para conter um codão de cisteina extra, que não interfere desejavelmente com a atividade de ligação de CD38BP da molécula). Uma molécula de toxina, derivatizada com um grupo sulfidrilo reativo com a cisteina do CD38BP modificado, pode formar um imunoconjugado com o CD38BP. Alternativamente, um grupo sulfidrilo pode ser introduzido diretamente num CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38 da invenção, usando técnicas de polipéptidos em fase sólida. Por exemplo, a introdução de grupos sulfidrilo em péptidos está descrita por Hiskey, Peptides 3, 137 (1981). A introdução de grupos sulfidrilo em proteinas está descrita em Maasen et al., Eur. J. Biochem. 134, 32 (1983). Logo que os grupos sulfidrilo corretos estiverem presentes, a citotoxina e CD38BP podem ser purificados, ambos os grupos enxofre reduzidos; citotoxina e ligando misturados (por exemplo numa razão de cerca de 1:5 a 1:20; e permitiu-se que a formação de ligação de dissulfeto procedesse até à completação (geralmente cerca de 20 a 30 minutos) à temperatura ambiente. A mistura pode ser depois dialisada contra salino tamponado com fosfato ou cromatografada numa resina tal como Sephadex para remover moléculas de ligando e toxina não reagidas.

Numerosos tipos de compostos citotóxicos podem ser unidos a proteinas através do uso de um grupo reativo no composto citotóxico ou através do uso de um agente reticulante. Um grupo reativo comum que formará uma ligação covalente estável in vivo com uma amina é isotiocianato (Means et al., Chemical modifications of proteins (Holden-Day, São Francisco 1971) pp. 105-110). Este grupo reage preferencialmente com o grupo ε-amina da lisina. A maleimida é um grupo reativo comummente usado para formar uma ligação covalente in vivo estável com o grupo sulfidrilo na cisteina (Ji, Methods Enzymol 91, 580-609 (1983)). Os anticorpos monoclonais são tipicamente incapazes de formar ligações covalentes com iões de radiometal, mas podem estar anexados ao anticorpo indiretamente através do uso de agentes quelantes que estão covalentemente ligados aos anticorpos. Os agentes quelantes podem ser anexados através de aminas (Meares et al., Anal. Biochem. 142, 68-78 (1984)) e grupos sulfidrilo (Koyama, Chem. Abstr. 120, 217262t (1994)) de resíduos de aminoácidos e também através de grupos carboidrato (Rodwell et ai., PNAS USA 83, 2632-2636 (1986), Quadri et al., Nucl. Med. Biol. 20, 559-570 (1993)). Uma vez que estes agentes quelantes contêm dois tipos de grupos funcionais, um para se ligar a iões de metal e o outro para unir o quelato ao anticorpo, são comummente referidos como agentes quelantes bifuncionais (Sundberg et al., Nature 250, 587-588 (1974)).

Os agentes reticulantes que têm dois grupos funcionais reativos são classificados como sendo homo ou heterobifuncionais. Exemplos de agentes reticulantes homobifuncionais incluem bismaleimidohexano (BMH) que é reativo com grupos sulfidrilo (Chen et al., J Biol Chem 266, 18237-18243 (1991)) e glicolbis[succinimidilsuccinato] de etileno (EGS) que é reativo com grupos amino (Browning et al., J. Immunol. 143, 1859-1867 (1989)). Um exemplo de um reticulante heterobifuncional é éster de m- maleimidobenzoí1-N-hidroxissuccinimida (MBS) (Myers et al., J. Immunol. Meth. 121, 129-142 (1989)). Estas metodologias são simples e são comummente empregues.

Um agente terapêutico ou de diagnóstico pode também ou alternativamente ser anexado na região de charneira de um componente de anticorpo reduzido através da formação de ligações de dissulfeto. Como alternativa, tais péptidos podem ser anexados ao componente de anticorpo usando um reticulante heterobifuncional, tal como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinilo (SPDP). Yu et al., Int. J. Câncer 56, 244 (1994). Técnicas gerais para tal conjugação são bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Wong, Chemistry Of Protein Conj ugation And Cross-Linking (CRC Press 1991), Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods", Em Monoclonal Antibodies: Principies And Applications, Birch et al., (eds.) (Wiley-Liss, Inc. 1995), Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", em Monoclonal Antibodies: Production, Engineering And Clinicai Application, Ritter et al., (eds.) (Cambridge University Press 1995).

Em algumas formas de realização, marcadores ou outros substituintes conjugados são anexados à sequência de aminoácidos do anticorpo anti-CD38 por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial. CD38BP(s), tais como os anticorpos da invenção, não marcado(s) pode(m) ser usado(s) em combinação com outros anticorpos marcados (segundos anticorpos) que são reativos com o(s) CD38BP(s), tais como anticorpos específicos quanto às regiões constantes de imunoglobulina humana que se ligam a mAbs anti-CD38. Alternativamente, um CD38BP, tal como um anticorpo da invenção, pode ser diretamente marcado. Uma ampla variedade de marcadores pode ser empregue para marcação direta ou indireta de CD38BPs, tais como marcação com radionuclideos, flúores, enzimas, substratos de enzima, cofatores de enzima, inibidores de enzima, ligandos (particularmente haptenos), etc.

As inserções de sequências de aminoácidos incluem fusões amino- e/ou carboxi-terminais variando em comprimento de um resíduo a polipéptidos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intrassequência de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionilo N-terminal ou o anticorpo fundido com um marcador de epítopo. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao terminal N ou C do anticorpo de uma enzima ou um polipéptido ou PEG que aumenta a meia-vida no soro do anticorpo. Tais proteínas de fusão de anticorpos anti-CD38 compreendendo um anticorpo da invenção são outra característica da presente invenção.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona moléculas compreendendo um anticorpo para CD38, tal como um anticorpo anti-CD38 humano, da presente invenção conjugado a uma fração terapêutica, tal como uma citotoxina, um fármaco quimioterapêutico, um imunossupressor, ou um radioisótopo. Tais conjugados são referidos aqui como "imunoconjugados". Os imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são referidos como "imunotoxinas".

Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja prejudicial para (p.ex., mate) células. Para uma descrição destas classes de fármacos que são bem conhecidos na técnica, e seus mecanismos de ação, ver Goodman et al.,

Goodman and Gilman 's The Pharmacological Basis Of Therapeutics, 8a Ed., Macmillan Publishing Co., 1990. Técnicas adicionais relevantes para a preparação de imunotoxinas de anticorpos são proporcionadas em por exemplo Vitetta, Immunol. Today 14, 252 (1993) e US 5,194,594.

Agentes terapêuticos adequados para a formação de imunoconjugados da presente invenção incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etidio, emetina, mitomicina, etoposideo, tenoposideo, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, di-idroxi antracina diona, mitoxantrona, actinomicina D, 1-deidro-testosterona, glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol, e puromicina, antimetabolitos (tais como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo, decarbazina, hidroxiureia, asparaginase, gemcitabina, cladribina), agentes alquilantes (tais como mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, bussulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatina e outros derivados de platina, tais como carboplatina), antibióticos (tais como dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, daunorrubicina (anteriormente daunomicina), doxorrubicina, idarrubicina, mitramicina, calicheamicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC)) , toxina da difteria e moléculas relacionadas (tais como cadeia A da difteria e seus fragmentos ativos e moléculas hibridas) , toxina da ricina (tal como ricina A ou uma toxina de cadeia A da ricina desglicosilada), toxina da cólera, uma toxina do tipo Shiga (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), toxina LT, toxina C3, toxina Shiga, toxina da pertussis, toxina do tétano, inibidor da protease Bowman-Birk da soja, exotoxina de Pseudomonas, alorina, saporina, modecina, gelanina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, e toxinas de enomicina. Os agentes terapêuticos, que podem ser administrados em combinação com um anticorpo anti-CD38 da presente invenção como descrito noutro lugar aqui, podem ser também candidatos a frações terapêuticas úteis para conjugação a um anticorpo da presente invenção. Por exemplo, a fração de fármaco pode ser uma proteína ou polipéptido possuindo uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa, ou seu fragmento ativo, tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas, ou toxina da difteria; uma proteína tal como fator de necrose tumoral ou interferão-γ; ou modificadores da resposta biológica tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), fator estimulador de colónicas de granulócitos macrófagos (GM-CSF), fator estimulador de colónicas de granulócitos (G-CSF) , ou outros fatores de crescimento e proteína indutora apoptótica isolada da mitocôndria.

Numa forma de realização, o agente citotóxico é calicheamicina, 90Y, 125I e 1311.

Outros exemplos de citotoxinas terapêuticas que podem ser conjugadas a um anticorpo para CD38 da presente invenção incluem calicheamicinas e duocarmicinas. Como indicado acima, a fração de fármaco não necessita de ser interpretada como limitada a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a fração de fármaco pode ser uma proteína ou polipéptido possuindo uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, um agente ativo na superfície das células, tal como enzimas fosfolipases, p.ex., fosfatase C. A porção de lise de uma toxina pode ser prontamente unida ao fragmento Fab de um anticorpo ou fragmento de anticorpo da presente invenção. Outras moléculas conjugadas adequadas incluem ribonuclease (RNase), DNase I, enterotoxina-A estafilocóccica, proteína antiviral da uva-de-rato, toxina da difteria, e endotoxina Pseudomonas. Ver, por exemplo, Pastan et al., Cell 47, 641 (1986) e Goldenberg, Calif. Ά Câncer Journal for Clinicians 44, 43 (1994). Toxinas adicionais adequadas para uso na presente invenção são conhecidas daqueles com perícia na técnica (ver por exemplo US 6, 077,499) .

Os conjugados de CD38BPs, tais como anticorpos da invenção, e tais frações citotóxicas podem ser preparados usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais. Exemplos de tais reagentes incluem SPDP, IT, derivados bifuncionais de imidoésteres tais como um adipimidato de dimetilo HC1, ésteres ativos tais como suberato de dissuccinimidilo, aldeídos tais como glutaraldeído, compostos de bis-azido tais como bis(p-azidobenzoí1)hexanodiamina, derivados de bis-diazónio tais como bis-(p-diazóniobenzoí1)-etilenodiamina, di-isocianatos tais como 2,6-di-isocianato de tolileno, e compostos de flúor bis-ativos tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno e agentes antimitóticos (p.ex., vincristina, vinblastina, docetaxel, paclitaxel e vinorelbina). Técnicas para conjugação de tais frações terapêuticas a CD38BPs, tais como anticorpos, são bem conhecidas, ver por exemplo Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Reisfeld et al., (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985), Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al., (eds.), pp. 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987), Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinicai Applications, Pinchera et al., (eds.), pp. 475-506 (1985), "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, Baldwin et al., (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985) e Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62, 119-58 (1982).

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um anticorpo para CD38 que é conjugado a uma toxina mista. Uma molécula de toxina mista é uma molécula derivada de duas toxinas diferentes (tipicamente polipéptidos). Geralmente, as toxinas de péptido compreendem um ou mais domínios responsáveis pela ligação generalizada a células eucarióticas, pelo menos um domínio enzimaticamente ativo, e pelo menos um domínio de translocalização. Os domínios de ligação e translocalização são requeridas para reconhecimento das células e entrada da toxina, respetivamente. As proteínas ocorrendo naturalmente que se sabe que têm um domínio de translocalização incluem toxina da difteria, exotoxina A da Pseudomonas, e possivelmente outras toxinas de péptido. Os domínios de translocalização da toxina de difteria e exotoxina A de Pseudomonas estão bem caracterizados (ver por exemplo Hoch et al., PNAS USA 82, 1692 (1985), Colombatti et al., J. Biol. Chem. 261, 3030 (1986) e Deleers et al., FEBS Lett. 160, 82 (1983)), e a existência e localização de um tal dominio noutras moléculas podem ser determinadas por métodos tais como aqueles empregues por Hwang et al., Cell 48, 129 (1987) e Gray et al., PNAS USA 81 2645 (1984). Tendo em vista estas técnicas, pode ser formada uma molécula hibrida de toxina mista útil, por exemplo, por fusão da subunidade A enzimaticamente ativa da toxina do tipo Shiga de E. coli (Calderwood et al., PNAS USA 84, 4364 (1987)) com o dominio de translocalização (residuos de aminoácidos 202 até 460) da toxina da difteria, e com uma molécula visando um tipo de células particular, como descrito em US 5,906,820. A porção de direcionamento do hibrido com três partes pode fazer com que a molécula se anexe especificamente às células visadas, e a porção de translocalização da toxina da difteria pode atuar para inserir a subunidade A enzimaticamente ativa da toxina do tipo Shiga numa célula visada. A porção enzimaticamente ativa de toxina do tipo Shiga, como a toxina da difteria, atua na maquinaria de síntese de proteínas da célula para prevenir a síntese de proteínas, matando assim a célula visada.

Os imunoconjugados de acordo com a presente invenção podem também compreender um radioisótopo, p.ex., iodo-131, ítrio-90 ou índio-111, para gerar radiofarmacêuticos citotóxicos para tratamento de um distúrbio relacionado com CD38, tal como mieloma múltiplo.

Numa forma de realização, os anticorpos para CD38, tais como os anticorpos humanos da presente invenção, estão anexados a um ligante quelante, p.ex., tiuxetan, que permite que o anticorpo seja conjugado a um radioisótopo.

Substituintes de conjugados adicionalmente úteis incluem retinoides anticancro. Os conjugados de taxano (ver por exemplo Jaime et al., Anticancer Res. 21 (2A), 1119-28 (2001), conjugados de cisplatina, conjugados de tapsigargina, conjugados de ácido linoleico, conjugados de calicheamicina (ver por exemplo Damle et al., Curr Opin Pharmacol. 3 (4), 386-90 (2003)), conjugados de doxorrubicina, conjugados de geldanamicina, e similares, podem ser também úteis na promoção do tratamento do cancro (ver, geralmente, Trail et al., Câncer Immunol Immunother. 52 (5), 328-37 (2003)).

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona anticorpos secundários e anti-idiotipicos criados contra anticorpos anti-CD38 da presente invenção. Anticorpos secundários criados contra anticorpos anti-CD38 da presente invenção são também descritos. Um anticorpo secundário refere-se a um anticorpo especifico quanto a, e tipicamente criado contra, um anticorpo anti-CD38. UM anticorpo anti-idiotípico (Id) é um anticorpo que reconhece determinantes únicos geralmente associados ao local de ligação ao antigénio de um anticorpo. Um anticorpo Id pode ser preparado por imunização de um animal da mesma espécie e tipo genético como a fonte de um mAb anti-CD38 com o mAb para o qual um anti-Id está a ser preparado. 0 animal imunizado pode tipicamente reconhecer e responder aos determinantes idiotipicos do anticorpo imunizante por produção de um anticorpo para estes determinantes idiotipicos (o anticorpo anti-Id). Tais anticorpos estão descritos em por exemplo US 4,699,880. Tais anticorpos são caracteristicas adicionais da presente invenção.

Um anticorpo anti-Id pode ser também usado como um "imunogénio" para induzir uma resposta imune ainda noutro animal, produzindo um assim chamado anticorpo anti-anti-Id. Um anti-anti-Id pode ser epitopicamente idêntico ao mAb original, que induziu o anti-Id. Assim sendo, por uso de anticorpos para os determinantes idiotipicos de um mAb, é possivel identificar outros clones expressando anticorpos de especificidade idêntica. Os anticorpos anti-Id podem ser variados (produzindo deste modo variantes de anticorpos anti-Id) e/ou derivatizados por qualquer técnica adequada, tal como aquelas descritas noutro lugar aqui no que diz respeito a anticorpos anti-CD38 e outros CD38BPs da presente divulgação. Por exemplo, os mAbs anti-Id podem ser acoplados a um transportador tal como hemocianina da lapa californiana (KLH) e usados para imunizar ratinhos BALB/c. Os soros destes ratinhos conterão tipicamente anticorpos anti-anti-Id que têm as propriedades de ligação similares se não idênticas a um anticorpo para CD38 original/progenitor.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um ácido nucleico codificando um anticorpo para CD38 da invenção. Um ácido nucleico codificando anticorpo para CD38 da invenção pode ter quaisquer caracteristicas adequadas e compreende quaisquer caracteristicas adequadas ou sua combinação. Assim sendo, por exemplo, um ácido nucleico codificando anticorpo para CD38 pode estar na forma de DNA, RNA, ou um seu híbrido, e pode incluir bases não ocorrendo naturalmente, uma estrutura principal modificada (p.ex., uma estrutura principal de fosfotioato que promove a estabilidade do ácido nucleico), ou ambos. 0 ácido nucleico compreende vantajosamente caracteristicas que promovem a expressão desejada em célula(s) hospedeira(s) alvo, replicação e/ou seleção. Exemplos de tais caracteristicas incluem um componente de origem de replicação, um componente de gene de seleção, um componente de promotor, um componente de elemento intensificador, um componente de sequência de poliadenilação, um componente de terminação, e similares.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um vetor compreendendo um ácido nucleico codificando anticorpo anti-CD38 da invenção. Um vetor refere-se a um veiculo de administração que promove a expressão de um ácido nucleico codificando anticorpo para CD38, a produção de um anticorpo para CD38, a transfecção/transformação de células alvo, a replicação do ácido nucleico codificando anticorpo para CD38, promove a estabilidade do ácido nucleico, promove a deteção do ácido nucleico e/ou células transformadas/transfectadas, ou de outro modo fornece função biológica vantajosa ao ácido nucleico codificando anticorpo para CD38. Um vetor no contexto da presente invenção pode ser qualquer vetor adequado, incluindo vetores de ácidos nucleicos cromossomais, não cromossomais, e sintéticos (uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo um conjunto adequado de elementos de controlo da expressão). Exemplos de tais vetores incluem derivados de SV40, plasmideos bacterianos, DNA de fago, baculovirus, plasmideos de levedura, vetores derivados de combinações de plasmideos e DNA de fago, e vetores de ácidos nucleicos virais (RNA ou DNA) . Numa forma de realização, um ácido nucleico codificando um CD38BP está compreendido num vetor de DNA ou RNA nu, incluindo, por exemplo, um elemento de expressão linear (como descrito em por exemplo Sykes e Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)), um vetor de ácido nucleico compactado (como descrito em por exemplo US 6,077,835 e/ou WO 00/70087), um vetor de plasmideo tal como pBR322, pUC 19/18, ou pUC 118/119, um vetor de ácido nucleico de tamanho minimo de mosquito (como descrito em por exemplo Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)), ou como um constructo de vetor de ácido nucleico precipitado, tal como um constructo precipitado com CaPCU (como descrito em por exemplo WO 00/46147, Benvenisty e Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al. , Cell 14, 725 (1978), e Coraro e Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981) ) . Tais vetores de ácidos nucleicos e o seu uso são bem conhecidos na técnica (ver por exemplo US 5, 589, 466, e US 5, 973, 972).

Numa forma de realização, o vetor é adequado para expressão do anticorpo para CD38 numa célula bacteriana. Exemplos de tais vetores incluem, por exemplo, vetores que dirigem a expressão de elevado nivel de proteínas de fusão que são prontamente purificadas (por exemplo vetores de clonagem e expressão em E. coli multifuncionais tais como BlueScript (Stratagene), vetores pIN (Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989), vetores pET (Novagen, Madison WI) e similares).

Um vetor de expressão pode também ou alternativamente ser um vetor adequado para expressão num sistema de levedura. Qualquer vetor adequado para expressão num sistema de expressão pode ser empregue. Vetores adequados para uso em por exemplo Saccharomyces cerevisiae incluem, por exemplo, vetores compreendendo promotores constitutivos ou induziveis tais como fator alfa, álcool oxidase e PGH (revistos em: F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience Nova Iorque (1987), e Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)).

Um ácido nucleico e/ou vetor pode também compreender uma sequência de ácidos nucleicos codificando uma sequência de secreção/localização, que pode dirigir um polipéptido, tal como uma cadeia de polipéptidos nascente, para um compartimento celular, membrana, ou organelo desejado, ou que dirige a secreção de polipéptidos para o espaço periplasmático ou em meios de cultura de células. Tais sequências são conhecidas na técnica, e incluem péptidos lider ou sinal de secreção, sequências visando organelos (p.ex., sequências de localização nuclear, sinais de retenção do ER, sequências de trânsito mitocondrial, sequências de trânsito de cloroplastos), sequências de localização/âncora das membranas (p.ex., sequências de transferência de terminação, sequências de âncora de GPI), e similares

Os ácidos nucleicos codificando anticorpo para CD38BP podem compreender ou estar associados a qualquer promotor, intensificador, e outros elementos facilitadores da expressão adequados. Exemplos de tais elementos incluem promotores de expressão forte (p.ex., promotor/intensificador de IE de CMV humano bem como promotores de RSV, SV40, SL3-3, MMTV, e LTR de HIV) , sequências de terminação de poli(A) eficazes, uma origem de replicação para produto de plasmídeo em E. coli, um gene de resistência a antibióticos como marcador selecionável, e/ou um local de clonagem conveniente (p.ex., um poliligante). Os ácidos nucleicos podem também compreender um promotor induzivel em oposição a um promotor constitutivo tal como IE de CMV (o especialista perito reconhecerá que tais termos são na realidade descritores de um grau de expressão de genes sob certas condições).

Numa forma de realização, o ácido nucleico pode ser posicionado na e/ou administrado à célula hospedeira ou animal hospedeiro através de um vetor virai. Qualquer vetor virai adequado pode ser usado a este respeito, e vários são conhecidos na técnica. Um vetor virai pode compreender qualquer número de polinucleótidos virais, sozinhos ou em combinação com uma ou mais proteínas virais, que facilitam a administração, replicação, e/ou expressão do ácido nucleico da presente invenção numa célula hospedeira desejada. 0 vetor virai pode ser um polinucleótido compreendendo todo o ou parte de um genoma virai, um conjugado proteina/ácido nucleico virai, uma partícula do tipo virus (VLP), um vetor similar àqueles descritos em US 5,849,586 e WO 97/04748, ou uma particula de virus intacta compreendendo ácidos nucleicos virais e o ácido nucleico da presente invenção. Um vetor virai de particula virai pode compreender uma particula virai de tipo selvagem ou uma particula virai modificada. O vetor virai pode ser um vetor que requer a presença de outro vetor ou virus de tipo selvagem para replicação e/ou expressão (i.e., pode ser um virus dependente de ajudante) , tal como um amplicão de vetor adenoviral. Tipicamente, tais vetores virais consistem essencialmente numa particula virai de tipo selvagem, ou uma particula modificada no seu conteúdo de proteina e/ou ácido nucleico para aumentar a capacidade de transgenes ou auxiliar na transfecção e/ou expressão do ácido nucleico (exemplos de tais vetores incluem os amplicões de virus da herpes/AAV). Tipicamente, um vetor virai é similar a e/ou derivado de um virus que infeta normalmente humanos. Partículas de vetores virais adequadas a este respeito incluem, por exemplo, partículas de vetores adenovirais (incluindo qualquer vírus de ou derivado de um vírus dos Adenoviridae) , partículas de vetores virais adenoassociados (partículas de vetores AAV) ou outros parvovírus e partículas de vetores parvovirais, partículas de vetores papilomavirais, vetores flavivirais, vetores alfavirais, vetores virais da herpes, vetores do vírus da varíola, vetores retrovirais, incluindo vetores lentivirais. Exemplos de tais vírus e vetores virais estão em por exemplo Fields et al., eds., Virology Raven Press, Ltd., Nova Iorque (3a ed., 1996 e 4a ed., 2001), Encyclopedia of Virology, R. G. Webster et al., eds.,

Academic Press (2a ed., 1999), Fundamental Virology, Fields et al.r eds., Lippincott-Raven (3a ed., 1995), Levine, "Viruses", Scientific American Library No. 37 (1992),

Medicai Virology, D. 0. White et al., eds., Acad. Press (2a ed. 1994) , e Introduction to Modern Virology, Dimock, N. J. et al., eds., Blackwell Scientific Publications, Ltd. (1994).

Os vetores virais que podem ser empregues com polinucleótidos da presente invenção e os métodos descritos aqui incluem vetores de adenovirus e adenoassociados, como em por exemplo Cárter, Curr Opinion Biotech 3, 533-539 (1992) e Muzcyzka, Curr Top Microbiol Immunol 158, 97-129 (1992). Tipos e aspetos adicionais de vetores AAV estão descritos em por exemplo Cárter, Contrib. Microbiol. 4, 85-86 (2000), Smith-Arica, Curr. Cardiol. Rep. 3 (1), 41-49 (2001), Taj, J. Biomed. Sei. 1 (4), 279-91 (2000), Vigna et al., J. Gene Med. 2 (5), 308-16 (2000), Klimatcheva et al., Front. Biosci. 4, D481-96 (1999), Lever et al., Biochem.

Soc. Trans. 27 (6), 841-47 (1999), Snyder, J Gene Med. 1 (3), 166-75 (1999), Gerich et al., Knee Surg. Sports

Traumatol. Arthrosc. 5 (2), 118-23 (1998), e During, Adv.

Drug Deliv. Review 21 (1), 83-94 (1997) e US 4,797,368, US

5,139,941, US 5,173, 414, US 5,614,404, US 5,658,785, US 5,858,775 e US 5,994,136. Os vetores virais adenoassociados podem ser construídos e/ou purificados usando os métodos apresentados, por exemplo, em US 4,797,368 e Laughlin et al., Gene 23, 65-73 (1983).

Outro tipo de vetor virai que pode ser empregue com polinucleótidos e métodos da presente invenção é um vetor papilomaviral. Vetores papilomavirais adequados são conhecidos na técnica e descritos em, p.ex., Hewson, Mol Med Today 5 (1), 8 (1999), Stephens, Biochem J. 248 (1), 1- 11 (1987) e US 5,719,054. Exemplos de vetores papilomavirais são proporcionados em por exemplo WO 99/21979. Vetores de alfavírus podem se vetores de administração de genes noutros contextos. Os vetores alfavírus são conhecidos na técnica e descritos em por exemplo Cárter, Curr Opinion Biotech 3, 533-539 (1992),

Muzcyzka, Curr Top Microbiol Immunol. 158, 97-129 (1992),

Schlesinger, Expert Opin Biol Ther. 1 (2) , 177-91 (2001),

Polo et ai., Dev Biol (Basel). 104, 181-5 (2000), Wahlfors et ai., Gene Ther. 7 (6), 472-80 (2000), Colombage et ai.,

Virology. 250 (1), 151-63 (1998) e WO 01/81609, WO 00/39318, WO 01/81553, WO 95/07994 e WO 92/10578.

Outro grupo de vetores virais é vetores virais do herpes. Exemplos de vetores virais da herpes estão descritos em por exemplo Lachmann et ai., Curr Opin Mol Ther 1 (5), 622-32 (1999), Fraefel et ai., Adv Virus Res. 55, 425-51 (2000),

Huard et ai., Neuromuscul 7 (5), 299-313 (1997), Glorioso et ai., Annu JRev Microbiol. 49, 675-710 (1995), Latchman,

Mol Biotechnol. 2 (2), 179-95 (1994), e Frenkel et ai.,

Gene Ther. 1 (Supl 1), S40-6 (1994), bem como US 6,261,552 e US 5,599,691.

Vetores retrovirais, incluindo vetores lentivirais, podem ser também veículos de administração de genes vantajosos em contextos particulares. Existem numerosos vetores retrovirais conhecidos na técnica. Exemplos de vetores retrovirais estão descritos em por exemplo Miller, Curr Top Microbiol Immunol 158, 1-24 (1992), Salmons e Gunzburg,

Human Gene Therapy 4, 129-141 (1993), Miller et ai., Methods in Enzymology 217, 581-599 (1994), Weber et ai.,

Curr Opin Mol Ther. 3 (5), 439-53 (2001), Hu et ai., Pharmacol Rev. 52 (4), 493-511 (2000), Kim et ai., Adv

Virus Res. 55, 545-63 (2000), Palu et ai., Rev Med Virol. 10 (3), 185-202 (2000) e Takeuchi et al., Adv Exp Med Biol. 465, 23-35 (2000), bem como US 6,326,195, US 5,888,502, US 5,580,766, e US 5,672, 510.

Os vetores adenovirais podem ser também vetores virais adequados para transferência de genes. Os vetores adenovirais são bem conhecidos na técnica e descritos em por exemplo Graham et ai., Mol Biotechnol 33 (3), 207-220 (1995), Stephenson, Clin Diagn Virol 10 (2-3), 187-94 (1998), Jacobs, Clin Sei (Lond). 85 (2), 117-22 (1993), US 5,922, 576, US 5,965,358 e US 6,168, 941, e W098/22588, W098/56937, W099/15686, W099/54441, WOOO/32754. Vetores adenovirais, vetores virais da herpes e vetores virais de Sindbis, úteis na prática da presente invenção, estão descritos em por exemplo Jolly Câncer Gene Therapy 1, 51-64 (1994), Latchman Molec Biotechnol 2, 179-195 (1994) e Johanning et ai., Nucl Acids Res 23, 1495-1501 (1995).

Outros vetores virais adequados incluem vetores virais da variola. Exemplos de tais vetores estão discutidos em por exemplo Berencsi et ai., J Infect Dis 183 (8), 1171-9 (2001), Rosenwirth et ai., Vaccine 19 (13-14), 1661-70 (2001), Kittlesen et ai., J Immunol 164 (8), 4204-11 (2000), Brown et ai., Gene Ther 7 (19), 1680-9 (2000),

Kanesathasan et al., Vaccine 19 (4-5), 483-91 (2000), Sten, Drugs 60 (2), 249-71 (2000). Os vetores de virus vaccinia podem ser vetores de virus da variola. Exemplos de tais vetores e seus usos são proporcionados em por exemplo Venugopal et al., Res Vet Sei 57 (2), 188-193 (1994), Moss

Dev Biol Stand 82, 55-63 (1994), Weisz et al., Mol Cell

Biol 43, 137-159 (1994), Mahr e Payne, Immunohiology 184 (2-3), 125-146 (1992), Hruby, Clin Microhiol Rev 3 (2), 153-170 (1990) e WO92/07944, W098/13500 e WO89/08716.

Outras características da presente invenção incluem células recombinantes, tais como células de levedura, bacterianas, e de mamífero (p.ex., células de mamífero imortalizadas) compreendendo um ácido nucleico da invenção, um vetor da invenção, ou combinações de qualquer um deles ou ambos. Por exemplo, uma forma de realização é uma célula compreendendo um ácido nucleico estavelmente inteqrado no genoma celular que compreende uma sequência codificando a expressão de um anticorpo para CD38 da presente invenção. Uma forma de realização é uma célula compreendendo um ácido nucleico não integrado, tal como um plasmídeo, cosmídeo, fagemídeo, ou elemento de expressão linear, que compreende uma sequência codificando um anticorpo para CD38. São também descritos aqui péptidos imunogénicos compreendendo qualquer uma das porções determinantes antigénicas acima descritas de CD38 específicos quanto aos CD38BPs como descritos aqui tal como as porções determinantes antigénicas de CD38 específicos quanto a -003 e -005 e -024. Tais imunogénicos podem ser usados para provocar uma resposta imune direta num método compreendendo um regime de imunoterapia ativa. Δ presente divulgação proporciona adicionalmente uma proteína de fusão compreendendo um tal imunogénio de CD38 e uma sequência de parceiro de fusão que melhora a meia-vida da proteína de fusão (p.ex., por inclusão de uma sequência de domínio de imunoglobulina); facilita a deteção e/ou purificação da proteína de fusão (compreendendo, p.ex., uma sequência de péptido fluorescente, uma sequência de enzima repórter, um marcador de epítopo, uma sequência de hexa-histidina, ou similares); promove o direcionamento da proteína de fusão (p.ex., compreendendo um ligando ou porção de um ligando específico quanto a um recetor numa célula alvo); promove a indução de uma resposta imune distinta (p.ex., corresponde a um antigénio do cancro ou um seu fragmento imunogénico); é um agente citotóxico; ou alcança qualquer sua combinação (p.ex., um parceiro de proteina de fusão de choque térmico pode aumentar uma resposta imune gerada contra uma porção de antigénio heteróloga, não similar de uma proteina de fusão, enquanto aumenta também a meia-vida in vivo de uma proteina de fusão). As proteínas de fusão podem também compreender um ou mais locais de clivagem, particularmente entre domínios.

Variantes de tais péptidos, e derivados de tais péptidos imunogénicos ou variantes de péptidos imunogénicos, são características adicionais como descritas aqui (p.ex., tais derivados de péptidos imunogénicos de CD38 podem ser modificados por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente, e similares, a outras entidades moleculares tais como anticorpos, toxinas, radioisótopo, agentes citotóxicos, ou agentes citostáticos) . Mimítopos de péptido, compreendendo sequências de epítopo de CD38, podem ser também, por exemplo, úteis como candidatos a vacinas. Tais péptidos podem ser também úteis na purificação de anticorpos anti-CD38. Adicionalmente às sequências de epítopo de células B descritas aqui, tais péptidos podem ser manipulados ou selecionados para também ou alternativamente compreenderam um ou mais epítopos de células T anti-CD38. Tais epítopos podem ser identificados por qualquer técnica adequada conhecida na técnica (p.ex., por aplicações de software de previsão de epítopos de células T) . É descrito aqui um ácido nucleico codificando um tal péptido imunogénico. Um tal ácido nucleico pode ser administrado a um hospedeiro num vetor adequado, tal como um vetor dirigido deficiente na replicação (p.ex., um vetor de ácido nucleico dirigido ou um vetor de adenovírus dirigido, deficiente na replicação). A presente divulgação proporciona também composições de um ou mais de tais péptidos imunogénicos e/ou ácidos nucleicos codificando péptidos imunogénicos.

Os anticorpos para CD38 da presente invenção incluem anticorpos "neutralizantes". 0 termo "anticorpo neutralizante" refere-se a um anticorpo para CD38 que é capaz de substancialmente inibir ou eliminar uma atividade biológica de um péptido associado a CD38. Tipicamente, um anticorpo para CD38 neutralizante pode inibir, diretamente ou indiretamente, a função de CD38, tal como atividade enzimática, transdução de sinais, indução da expressão de citocinas, indução da proliferação ou diferenciação, ou indução da lise, num grau que é cerca de igual à ou maior do que a inibição de tais células devido à administração de uma quantidade aproximadamente igual de -003 ou -005 ou -024 .

Um anticorpo para CD38 da presente invenção pode ter qualquer afinidade e/ou avidez adequadas quanto a um ou mais epitopos contidos pelo menos parcialmente em CD38. A afinidade refere-se à força de ligação do anticorpo para CD38 a um tal epitopo. Tipicamente, a afinidade é medida pela constante de dissociação Kd, definida como [Ab] x [Ag]/[Ab-Ag] onde [Ab-Ag] é a concentração molar do complexo anticorpo-antigénio (ou do complexo CD38BP-antigénio), [Ab] é a concentração molar do anticorpo não ligado (ou CD38BP) e [Ag] é a concentração molar do antigénio não ligado. A constante de afinidade Ka é definida por 1/Kd. Métodos adequados para determinação da especificidade e afinidade por inibição competitiva podem ser encontrados em por exemplo Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I., 1988), Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoe, e

Wiley InterScience N.I., (1992, 1993) e Muller, Meth. Enzymol. 92, 589-601 (1983).

Um CD38BP, e particularmente anticorpos anti-CD38 da presente invenção, pode ter uma afinidade quanto a pelo menos um epítopo pelo menos parcialmente compreendido em CD38 na gama de cerca de 104 a cerca de 1010 M_1. O termo imunorreage aqui refere-se tipicamente à ligação de um CD38BP a um epitopo de CD38 com uma constante de dissociação Kd menor do que cerca de 10-4 M.

Um CD38BP pode ter uma afinidade que é pelo menos tão grande quanto a CD38 como -003 e -005 e -024, e em algumas formas de realização ter uma afinidade que é pelo menos tão grande quanto -003 e -005 e -024. Em particular, os anticorpos anti-CD38 da presente invenção podem ter uma afinidade que é pelo menos tão grande quanto a CD38 como -005, e em algumas formas de realização ter uma afinidade que é pelo menos cerca de tão grande como -005. A afinidade pode ser determinada por qualquer um dos métodos descritos noutro lugar aqui ou seus equivalentes conhecidos na técnica. Um exemplo de um método que pode ser usado para se determinar a afinidade é proporcionado na análise de Scatchard de Munson & Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980). A afinidade de ligação pode ser também determinada por métodos de equilíbrio (por exemplo ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) ou radioimunoensaio (RIA)) ou análise cinética (por exemplo análise BIACORE™).

Tipicamente, a constante de dissociação para CD38BPs, tais como anticorpos anti-CD38, da presente invenção é menor do que cerca de 100 nM, menor do que cerca de 5 0 nM, menor do que cerca de 10 nM, cerca de 5 nM ou menor, cerca de 1 nM ou menor, cerca de 0,5 nM ou menor, cerca de 0,1 nM ou menor, cerca de 0,01 nM ou menor, ou mesmo cerca de 0,001 nM ou menor.

Os CD38BPs, tais como anticorpos anti-CD38 da presente invenção, podem exibir caracteristicas funcionais similares a -003 e -005 e -024, tais como podem ser determinadas por ensaios de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e citotoxicidade mediada pelo complemento (CDC) (ver por exemplo US 5500362).

Numa forma de realização, um anticorpo anti-CD38 de acordo com a presente invenção não atua como um agonista de CD38, mas como um antagonista de CD38. Um agonista de CD38 é uma molécula, que ativa uma ou mais das funções atribuídas a CD38. Tais funções podem incluir mediação de recetores na adesão e eventos de sinalização e atividade (ecto-)enzimática. Além do mais, como um ectoenzima, CD38 usa NAD+ como substrato para a formação de ADP-ribose cíclica (cADPR) e ADPR, mas também de nicotinamida e ácido nicotínico-adenina dinucleótido fosfato (NAADP). Mostrou-se que cADPR atua como segundo mensageiro para mobilização de Ca2+ a partir do retículo endoplasmático. Adicionalmente à sinalização através de Ca2+, a sinalização de CD38 ocorre através de diálogo cruzado com complexos antigénio-recetor em células T e B ou outros tipos de complexos recetores, p.ex., moléculas MHC, e está deste modo envolvida em várias respostas celulares, mas também na troca e secreção de IgGl.

Numa forma de realização, um anticorpo anti-CD38 de acordo com a presente invenção não induz proliferação significativa de PBMCs. Numa forma de realização, um anticorpo anti-CD38 de acordo com a presente invenção não induz libertação de níveis significativos de IL-6. Numa forma de realização, um anticorpo anti-CD38 de acordo com a presente invenção não induz libertação de niveis significativos de IFN-γ. Tais ensaios podem ser medidos como descritos em Ausiello et al., Tissue antigens 56, 538-547 (2000).

Os anticorpos anti-CD38 da presente invenção, bem como outros CD38BPs como descritos aqui, podem ser preparados por expressão recombinante em qualquer tipo adequado de células ou animais.

Os CD38BPs recombinantes, tais como anticorpos recombinantes, tais como anticorpos humanos recombinantes, incluem CD38BPs, tais como anticorpos, tais como anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como CD38BPs, tais como anticorpos, tais como anticorpos humanos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado numa célula hospedeira.

Os anticorpos recombinantes, tais como anticorpos humanos recombinantes, incluem também anticorpos isolados de uma biblioteca combinatorial, recombinante de anticorpos humanos, anticorpos isolados de um animal, tal como um animal transgénico, ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva processamento de sequências de ácidos nucleicos codificando imunoglobulinas humanas em outras sequências de ácidos nucleicos exógenas aos ácidos nucleicos codificando imunoglobulinas humanas e genes codificando imunoglobulinas humanas. Os anticorpos humanos recombinantes têm tipicamente regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa de humano. Em certas formas de realização, no entanto, tais anticorpos humanos recombinantes são sujeitos a mutagénese in vitro (ou, quando é usado um animal transgénico para sequências de Ig humana, mutagénese somática in vivo) e, assim sendo, as sequências de aminoácidos das regiões Vh e Vl dos anticorpos recombinantes podem ser sequências que, embora derivadas de e relacionadas com sequências de Vh e VL da linha germinativa de humano, podem não existir naturalmente dentro do repertório de linha germinativa de anticorpos humanos in vivo. Ambos os tipos de anticorpos humanos são proporcionados de acordo com a presente invenção. Métodos adequados para produção de proteínas recombinantes são conhecidos na técnica, ver por exemplo (Sambrook e Russell (eds.), Molecular cloning, terceira edição, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, EUA.

Do mesmo modo, métodos adequados para produção de anticorpos são conhecidos na técnica e incluem aqueles descritos em por exemplo Harlow et ai., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I., (1988), Harlow e Lane: Using Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor

Laboratory Press (1999)), US 4,376,110 e Ausubel et al., eds., Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Assoe. and Wiley InterScience N.I., (1987, 1992). Os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando o método de hibridoma descrito em primeiro lugar por Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), ou por outros métodos subsequentemente desenvolvidos, bem conhecidos (ver, p.ex., Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Hibridomas úteis na produção de anticorpos anti-CD38 da presente invenção são também proporcionados pela presente invenção. Tais hibridomas podem ser formados por fusão quimica, fusão elétrica, ou qualquer outra técnica adequada, com qualquer tipo adequado de mieloma, heteromieloma, célula foblastoide, plasmacitoma ou outro seu equivalente e qualquer tipo adequado de célula expressando anticorpos. Células B imortalizadas transformadas podem ser também usadas para produzir eficazmente anticorpos da presente invenção e são também proporcionadas de acordo com a presente invenção. Tais células podem ser produzidas por técnicas padrão, tais como transformação com um Virus de Epstein-Barr, ou um gene de transformação. (Ver, p.ex., "Continuously Proliferating Human Cell Lines Synthesizing Antibody of Predetermined Specificity", Zurawaki, V. R. et al., em Monoclonal Antibodies, ed. por Kennett R. H. et al., Plenum Press, N.I. 1980, pp 19-33.). Assim sendo, células e linhas de células expressando anticorpos anti-CD38 estáveis e continuas e/ou imortalizadas são uma caracteristica de acordo com a presente invenção. Células eucarióticas e procarióticas (p.ex., células de levedura, linhas de células de mamífero contínuas e/ou imortalizadas (p.ex., linhas de células derivadas de células produtoras de anticorpos linfoides), células vegetais, células de insetos, e células bacterianas tais como células de E. coli, etc.) compreendendo ácidos nucleicos codificando CD38BP ou codificando fragmentos de CD38BP são proporcionadas de acordo com a presente invenção. Animais transgénicos, tais como primatas não humanos, roedores (p.ex., hamsters, porquinhos-da-índia, e ratos - incluindo suas estirpes modificadas tais como ratinhos imunodeficientes combinados graves (SCID) e outras estirpes de animais imunocomprometidos), cães, etc., expressando anticorpos anti-CD38 humanos da presente invenção são também proporcionados de acordo com a presente invenção. Células recombinantes compreendendo ácidos nucleicos exógenos codificando CD38BPs podem ser preparadas por qualquer técnica adequada (p.ex., transfecção/transformação com um vetor de plasmídeo de DNA nu, vetor virai, vetor de células bacterianas invasivo ou outro vetor de células inteiras, etc., compreendendo uma sequência (ou sequências) codificando CD38BP administrada à célula por transfecção facilitada por precipitação de fosfato de cálcio, direcionamento e transfecção mediados por recetores, administração biolistica, eletroporação, transfecção mediada por dextrano, transformação mediada por lipossomas, fusão de protoplastos, microinjeção direta, etc.). Métodos de transformação/transfecção de células são bem conhecidos na técnica (ver, p.ex., Sambrook et al.r Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2a Edição, 1989 e 3a Edição, 2001) e F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing e Wiley InterScience Nova Iorque (1987)). Tais células recombinantes que expressam um anticorpo da invenção são uma caracteristica da presente invenção.

Linhas de células disponíveis como hospedeiros para a expressão de proteínas recombinantes são bem conhecidas na técnica e incluem muitas linhas de células imortalizadas disponíveis da American Type Culture Collection (ATCC). Estas incluem, inter alia, células de ovários de hamster chinês, NSO, células SP2, células HeLa, células do rim de hamster bebé, células do rim de macaco (COS) , células de carcinoma hepatocelular humano (p.ex., Hep G2), células A549, e um número de outras linhas de células. Outras linhas de células que podem ser usadas são linhas de células de insetos, tais como células Sf9. Quando ácidos nucleicos (ou vetores contendo ácidos nucleicos) codificando proteínas, tais como CD38BPS (incluindo anticorpos anti-CD38), são introduzidos em células hospedeiras de mamífero podem ser produzidas proteínas, tais como CD38BPS, por cultivo das células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir expressão da proteína, tal como um CD38BP, nas células hospedeiras ou por secreção da proteína, tal como um CD38BP, no meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Os CD38BPs podem ser recuperados do meio de cultura usando métodos de purificação de proteínas padrão. Os CD38BPs podem ser também recuperados de lisatos de células hospedeiras quando diretamente expressos sem um sinal secretor.

Os CD38BPs, tais como anticorpos anti-CD38, podem ser também produzidos em células bacterianas e microrganismos unicelulares eucarióticos, tais como levedura. Os CD38BPs, tais como anticorpos anti-CD38, produzidos em células bacterianas não têm tipicamente glicosilação normal e os anticorpos anti-CD38 produzidos em células bacterianas podem assim ser mais ou menos deficientes em termos de funções de ADCC e outros aspetos da resposta imune associados a anticorpos anti-CD38 produzidos em células de mamífero e/ou animais (p.ex., o recrutamento de células NK). Os CD38BPs, tais como anticorpos anti-CD38, produzidos em células de levedura exibem normalmente diferentes tipos de padrões de glicosilação do que anticorpos produzidos em células de mamífero. No entanto, métodos para produção de anticorpos com glicosilação eficaz em levedura são correntemente a ser desenvolvidos por empresas tais como Glycofi, Inc. (Lebanon, NH, EUA) . Ver também Wildt S et al., Nat Rev Microbiol. 3 (2), 119-28 (2005).

Quando vetores de expressão recombinantes codificando genes CD38BP (incluindo genes de anticorpos anti-CD38) são introduzidos em células hospedeiras de mamífero, os CD38BPs são produzidos por cultivo das células hospedeiras durante um periodo de tempo suficiente para permitir a expressão do CD38BP nas células hospedeiras ou a secreção do anticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. A purificação de anticorpos e outros CD38BPs a partir de culturas de células, lisatos de células, e animais (p.ex., a partir do fluido ascitico de um animal transgénico produzindo anticorpos anti-CD38) pode ser alcançada por aplicação de qualquer número de técnicas adequadas conhecidas na técnica incluindo, p.ex., purificação em coluna de imunoafinidade; precipitação de sulfato; cromatofocagem; SDS-PAGE preparativa e similares.

Os anticorpos monoclonais humanos da presente invenção podem ser também produzidos por uma variedade de outras técnicas, incluindo metodologia de anticorpos monoclonais padrão, p.ex., a técnica de hibridação de células somáticas padrão de Kohler e Milstein, Nature 256, 495 (1975). Outras técnicas para produção de anticorpo monoclonal podem ser também empregues, p.ex., técnicas de exibição em fagos usando bibliotecas de genes de anticorpos humanos. Numa forma de realização, os anticorpos anti-CD38 da presente invenção produzidos por uso de hibridomas gerados num sistema de murino. A produção de hibridoma no ratinho é um procedimento muito bem estabelecido. Protocolos de imunização e técnicas para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Parceiros de fusão (p.ex., células de mieloma de murino) e procedimentos de fusão são também conhecidos.

Para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos para CD38, ratinhos transgénicos ou transcromossomais contendo genes de imunoglobulina humana (p.ex., ratinhos HCol2, HCo7 ou KM) podem ser imunizados com uma preparação enriquecida de antigénio CD38 e/ou células expressando CD38, como descrito, por exemplo, por Lonberg et al., (1994), supra, Fishwild et ai., (1996), supra, e WO 98/24884. Alternativamente, os ratinhos podem ser imunizados com DNA codificando CD38 humano. Os ratinhos podem ter 6-16 semanas de idade após a primeira infusão. Por exemplo, uma preparação enriquecida (5-50 yg) do antigénio CD38 pode ser usada para imunizar os ratinhos HuMAb intraperitonealmente. No caso de as imunizações usando uma preparação purificada ou enriquecida do antigénio CD38 não resultarem em anticorpos, os ratinhos podem ser também imunizados co células expressando CD38, p.ex., uma linha de células, para promover respostas imunes. A experiência cumulativa com vários antigénios tem mostrado que os ratinhos transgénicos HuMAb respondem melhor quando inicialmente imunizados intraperitonealmente (i.p.) ou subcutaneamente (s.c.) com células expressando CD38 em adjuvante de Freund completo, seguido por imunizações i.p. a cada duas semanas (até um total de 10) com células expressando CD38 em PBS. A resposta imune pode ser monitorizada ao longo do ciclo do protocolo de imunização com amostras de plasma sendo obtidas por hemorragias retro-orbitais. O plasma pode ser rastreado por análise de FACS, e os ratinhos com títulos suficientes de imunoglobulina humana anti-CD38 podem ser usados para fusões. Os ratinhos podem ser reforçados intravenosamente com células expressando CD38 para os Exemplos 4 e 3 dias antes do sacrifício e remoção do baço.

Para gerar hibridomas produzindo anticorpo monoclonais humanos para CD38 humano, esplenócitos e células de linfonodos de ratinhos imunizados podem ser isolados e fundidos com uma linha de células imortalizadas apropriada, tal como uma linha de células de mieloma de ratinho. Os hibridomas resultantes podem ser depois rastreados quanto à produção de anticorpos específicos quanto a antigénios. Por exemplo, suspensões de célula única de linfócitos esplénicos de ratinhos imunizados podem ser fundidas com células de mieloma de ratinho não secretoras SP2/0 (ATCC, CRL 1581) com PEG a 50% (p/v). As células podem ser plaqueadas a aproximadamente 1 x 105 por poço em placa de microtitulação de fundo plano, seguido por uma incubação de duas semanas em meio seletivo contendo para além de reagentes usuais Soro Clono fetal a 10%, fator de clonagem de hibridoma origen (IGEN) a 5-10% e IX HAT (Sigma) . Após aproximadamente duas semanas, as células podem ser cultivadas em meio no qual o HAT é substituído por HT. Os poços individuais podem ser depois rastreados por ELISA quanto a anticorpos contendo cadeia kappa-leve humana e por análise FACS usando células expressando CD38 quanto à especificidade de CD38. Logo que ocorra crescimento extensivo de hibridoma, o meio pode ser observado usualmente após 10-14 dias. Os hibridomas secretando anticorpos podem ser replaqueados, rastreados novamente, e se ainda positivos quanto a IgG humana, os anticorpos monoclonais anti-CD38 podem ser subclonados pelo menos duas vezes por diluição limitante. Os subclones estáveis podem ser depois cultivados in vitro para gerar anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização.

Os anticorpos da presente invenção podem ser também produzidos num transfectoma de células hospedeiras usando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção de genes como é bem conhecido na técnica, ver por exemplo Morrison, S., Science 229, 1202 (1985) .

Por exemplo, para expressar os anticorpos, ou seus fragmentos de anticorpos, DNAs codificando cadeias leves e pesadas parciais ou de comprimento total podem ser obtidos por técnicas de biologia molecular padrão (por exemplo amplificação por PCR, mutagénese sitio-dirigida) e podem ser inseridos em vetores de expressão tal que os genes estejam operacionalmente ligados a sequências de controlo transcricional e translacional. Neste contexto, o termo "operacionalmente ligado" destina-se a significar que um gene de anticorpo está ligado num vetor tal que sequências de controlo transcricional e translacionais dentro do vetor sirvam a sua função pretendida de regulação da transcrição e tradução do gene de anticorpo. 0 vetor de expressão e sequências de controlo da expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. 0 gene da cadeia leve do anticorpo e o gene da cadeia humana do anticorpo podem ser inseridos em vetores separados ou, mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpo podem ser inseridos no vetor de expressão por métodos padrão (p.ex., ligação de locais de restrição complementares no fragmento de gene de anticorpo e vetor, ou ligação de extremidade cega se não estiverem presentes nenhuns locais de restrição). As regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos descritos aqui podem ser usadas para criar genes de anticorpo de comprimento toral de qualquer isotipo de anticorpo por sua inserção em vetores de expressão já codificando regiões constantes de cadeia pesada e constantes de cadeia leve do isotipo desejado tal que o segmento Vh esteja operacionalmente ligado ao(s) segmento(s) CH dentro do vetor e o segmento VL esteja operacionalmente ligado ao segmento CL dentro do vetor. Adicionalmente ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um péptido sinal que facilite a secreção da cadeia de anticorpo a partir de uma célula hospedeira. 0 gene de cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor tal que o péptido sinal esteja ligado em grelha com o terminal amino do gene de cadeia de anticorpo. 0 péptido sinal pode ser um péptido sinal de imunoglobulina ou um péptido sinal heterólogo (i.e., um péptido sinal de uma proteina não imunoglobulina).

Adicionalmente aos genes de cadeia de anticorpo, os vetores de expressão recombinantes da presente invenção transportam sequências reguladoras que permitem e controlam a expressão dos genes de cadeia de anticorpo numa célula hospedeira.

Adicionalmente aos genes de cadeia de anticorpo e sequências reguladoras, os vetores de expressão recombinantes da presente invenção podem transportar sequências adicionais (p.ex., origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. 0 gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (ver por exemplo US 4,399,216, US 4,634,665 e US 5,179,017). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, numa célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Exemplos de genes marcadores selecionáveis incluem o gene da di-idrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr com seleção/amplificação de metotrexato) e o gene neo (para seleção de G418).

Para expressão das cadeias leves e pesadas, o(s) vetor(es) de expressão codificando as cadeias leves e pesadas é(são) transfectado(s) numa célula hospedeira por técnicas padrão. As células hospedeiras podem ser procarióticas ou eucarióticas, tais como células hospedeiras de mamífero. Por exemplo, fragmentos de ligação ao antigénio podem ser expressos em células hospedeiras eucarióticas e anticorpos de comprimento total podem ser expressos em células hospedeiras eucarióticas.

Numa forma de realização, os anticorpos são expressos em células eucarióticas, tais como células hospedeiras de mamifero. Exemplos de células hospedeiras de mamífero para expressão dos anticorpos recombinantes da presente invenção incluem células CHO (incluindo células dhfr-CHO, descritas em Urlaub e Chasin, PNAS USA 77, 4216-4220 (1980), usadas com um marcador selecionável de DHFR, por exemplo como descrito em R. J. Kaufman e P. A. Sharp, Mol. Biol. 159, 601-621 (1982)), células de mieloma NS/0, células COS, células HEK293 e células SP2.0. Em particular para uso com células de mieloma NS/0, outro exemplo de um sistema de expressão é o sistema de expressão do gene GS (glutamina sintetase) divulgado em WO87/04462, WO89/01036 e EP338 841.

Os genes de CD38BP podem ser expressos em outros sistemas de expressão, incluindo células procarióticas, tais como microrganismos, p.ex., E. coli para a produção de anticorpos scFv, algas, bem como células de inseto. Além do mais, os CD38BPs podem ser produzidos em animais não humanos transgénicos, tais como em leite de ovelha e coelhos ou ovos de galinhas, ou em plantas transgénicas. Ver por exemplo Verma, R. et al., J. Immunol. Meth. 216, 165-181 (1998), Pollock et al., J. Immunol. Meth. 231, 147-157 (1999) e Fischer, R. et al., Biol. Chem. 380, 825-839 (1999).

Os CD38BPs biespecíficos e multiespecíficos, tais como anticorpos, da presente invenção podem ser preparados usando técnicas químicas (ver por exemplo D. M. Kranz et al., PNAS USA 78, 5807 (1981)), técnicas de "polioma" (Ver US 4,474,893) ou técnicas de DNA recombinante.

Os anticorpos biespecíficos da presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de métodos conhecidos incluindo fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab' (ver por exemplo Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79, 315-321 (1990) e Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)). Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecificos é baseado na coexpressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias pesadas têm diferentes especificidades (ver por exemplo Milstein e Cuello, Nature 305, 537 (1983)). Devido à seleção aleatória de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais somente uma tem a estrutura biespecifica correta. Procedimentos similares são divulgados em WO 93/08829 e Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655 (1991).

De acordo com uma abordagem diferente, os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação anticorpo-antigénio) são fundidos com sequências de domínio constante de imunoglobulina por métodos recombinantes ou sintéticos. A sequência de domínio variável é tipicamente fundida com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo pelo menos parte das regiões de charneira, Ch2 e Ch3 . Também tipicamente, uma primeira região constante de cadeia pesada (ChI) , contendo o local necessário para ligação da cadeia leve, está também presente em pelo menos um dos péptidos de fusão. Num exemplo mais específico deste tipo de abordagem é produzido um anticorpo biespecífico compreendendo uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação num braço, e um par de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina híbrida (proporcionando uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Uma tal estrutura assimétrica pode facilitar a separação do composto biespecifico desejado de combinações de cadeias de imunoglobulina indesejadas (uma tal abordagem está descrita em WO 94/04690). Para detalhes adicionais de geração de anticorpos biespecificos ver, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).

Noutra abordagem, a interface entre um par de moléculas de anticorpos pode ser manipulada para maximizar a percentagem de heterodímeros que são recuperados da cultura de células recombinantes de modo a formar uma população de moléculas de anticorpos biespecificos. Tipicamente, uma tal interface compreende pelo menos uma parte do domínio de uma região constante de anticorpo. Normalmente num tal método, um ou mais resíduos de aminoácidos com cadeias laterais mais pequenas da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídos por resíduos de aminoácidos com cadeias laterais maiores (tais como tirosina ou triptofano). São criadas "cavidades" compensadoras de tamanho idêntico ou similar no(s) resíduo(s) de aminoácido(s) de cadeia lateral grande na interface da segunda molécula de anticorpo por substituição de resíduos de cadeia lateral de aminoácidos grande por mais pequenos (tais como alanina ou treonina). Isto pode proporcionar um mecanismo para aumento do rendimento do heterodímero em relação a outros produtos finais indesejados tais como homodímeros.

As moléculas biespecificas e multiespecíficas da presente invenção podem ser preparadas por conjugação das especificidades de ligação constituintes, p.ex., as especificidades de ligação anti-FcR e anti-CD38, usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica e multiespecífica pode ser gerada separadamente e depois conjugada uma com a outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou péptidos, uma variedade de agentes de acoplamento ou reticulantes pode ser usada para conjugação covalente. Exemplos de agentes reticulantes incluem proteína A, carbodi-imida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) e 4-(N- maleimidometil)ciclohexano-l-carboxilato de sulfossuccinimidilo (sulfo-SMCC), ver por exemplo Karpovsky et al., J. Exp. Med. 160, 1686 (1984), Liu, Μ. A. et al., PNAS USA 82, 8648 (1985). Noutro exemplo, Brennan et al.,

Science 229, 81 (1985) descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar fragmentos F(ab')2- Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente de complexação de ditiol arsenito de sódio para estabilizar ditióis vicinais e prevenir a formação de dissulfetos intermoleculares. Os fragmentos Fab' gerados podem depois convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab'-TNB pode ser depois reconvertido no Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado de Fab"-TNB para formar um anticorpo biespecí f ico. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula de F(ab')2 de anticorpo biespecífico totalmente humanizado, de acordo com uma técnica relacionada. Outros métodos incluem aqueles descritos por Paulus (Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132 (1985)) e Glennie et al., J. Immunol. 139, 2367-2375 (1987) . Exemplos de agentes de conjugação são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis da Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) .

Quando as especificidades de ligação são anticorpos podem ser conjugadas através de ligação de sulfidrilo das regiões de charneira do terminal C das duas cadeias pesadas. Numa forma de realização, a região de charneira é modificada para conter um número impar de resíduos de sulfidrilo, por exemplo um, antes da conjugação.

Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil onde a molécula biespecífica e multiespecífica é uma proteína de fusão mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ou ligando x Fab. Uma molécula biespecífica e multiespecífica da presente invenção, p.ex., uma molécula biespecífica pode ser uma molécula de cadeia única, tal como um anticorpo biespecífico de cadeia única, uma molécula biespecífica de cadeia única compreendendo um anticorpo de cadeia única e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia única compreendendo dois determinantes de ligação. As moléculas biespecíficas e multiespecíficas podem ser também moléculas de cadeia única ou podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia única. Métodos para preparação de moléculas bi- e multiespecíficas estão descritos por exemplo em US 5,260,203, US 5,455,030, US 4,881,175, US 5,132,405, US 5,091,513, US 5,476,786, US 5,013,653, US 5,258,498 e US 5,482,858. Várias técnicas para preparação e isolamento de fragmentos de anticorpos biespecíficos diretamente de cultura de células recombinantes foram também descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos usando fechos de leucina (ver por exemplo Kostelny et al., J. Immunol. 148 (5), 1547-1553 (1992)). Os péptidos de fechos de leucina das proteínas Fos e Jun podem ser ligados às porções Fab" de dois anticorpos diferentes por fusão de genes e os homodímeros de anticorpos resultantes reduzidos na região de charneira para formar monómeros que podem ser reoxidados para formar os heterodímeros de anticorpos. A tecnologia de "diacorpos" descrita por Hollinger et al., PNAS USA 90, 6444-6448 (1993) proporcionou também um mecanismo alternativo para preparação de fragmentos de anticorpos biespecificos. Outra estratégia para preparação de fragmentos de anticorpos biespecificos pelo uso de dimeros de Fv de cadeia única (sFv) foi também relatada. Ver por exemplo Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994).

Adicionalmente, os anticorpos biespecificos podem ser formados como "diacorpos" (Holliger et al., PNAS USA, 90, 6444-6448 (1993)) ou "Janusinas" (Traunecker et al., EMBO J 10, 3655-3659 (1991) e Traunecker et al., Int J Câncer Supl 7, 51-52 (1992)). Os anticorpos biespecificos, por definição, não existem na forma de fragmentos tendo um único local de ligação (p.ex., fragmentos Fab, Fab', e Fv, que são também proporcionados pela presente invenção). A ligação das moléculas biespecificas e multiespecificas aos seus alvos específicos pode ser confirmada por ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA), um radioimunoensaio (RIA), análise FACS, um bioensaio (p.ex., inibição do crescimento), ou um Ensaio de Transferência de Western. Cada um destes ensaios deteta geralmente a presença de complexos proteina-anticorpo de interesse particular por emprego de um reagente marcado (p.ex., um anticorpo) especifico quanto ao complexo de interesse. Por exemplo, os complexos FcR-anticorpo podem ser detetados usando, p.ex., um anticorpo ou fragmento de anticorpo ligado a enzimas que reconhece e se liga especificamente aos complexos anticorpo-FcR. Alternativamente, os complexos podem ser detetados usando qualquer um de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser radioativamente marcado num radioimunoensaio (RIA) (ver, por exemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, março, 1986). 0 isótopo radioativo pode ser detetado por tais meios como o uso de um contador γ ou um contador de cintilação ou por autorradiografia.

Como indicado anteriormente, os anticorpos interagem com antigénios alvo maioritariamente através de resíduos de aminoácidos que estão localizados nas seis regiões determinadoras da complementaridade (CDRs) de cadeia pesada e leve. São descritos aqui anticorpos tendo regiões CDR idênticas às ou de outro modo derivadas das regiões CDR de -003 ou -024. Tais anticorpos podem ser gerados por construção de vetores de expressão que incluem sequências de CDR de -003 ou -024 enxertadas em sequências de framework de um anticorpo diferente com propriedades diferentes.

Os anticorpos da invenção têm regiões CDR idênticas às ou de outro modo derivadas das regiões CDR de -005 . Tais anticorpos podem ser gerados por construção de vetores de expressão que incluem sequências de CDR de -005 enxertadas em sequências de framework de um anticorpo diferente com propriedades diferentes.

Tais sequências de framework podem ser obtidas de bases de dados de DNA públicas que incluem sequências de genes de anticorpos da linha germinativa. Estas sequências da linha germinativa diferirão de sequências de genes de anticorpos maduras porque não incluirão genes variáveis completamente montados, que são formados por união V(D)J durante a maturação de células B. As sequências de genes da linha germinativa diferirão também das sequências de um anticorpo de repertório secundário de elevada afinidade que contém mutações ao longo do gene variável, mas agrupado tipicamente nas CDRs. Por exemplo, as mutações somáticas são relativamente infrequentes na porção de terminal amino da região de framework 1 e na porção do terminal carboxi da região de framework 4. Por esta razão, não é necessário obter-se a sequência de DNA inteira de um anticorpo particular de modo a se recriar um anticorpo recombinante intacto tendo propriedades de ligação similares àquelas do anticorpo oriqinal (ver WO 95/45962). A sequência de cadeia pesada e leve parcial abrangendo as regiões CDR é tipicamente suficiente para este propósito. A sequência parcial é usada para se determinar que segmentos de genes variáveis e de união da linha germinativa contribuíram para os genes variáveis de anticorpos recombinantes. A sequência da linha germinativa é depois usada para preencher porções em falta das regiões variáveis. As sequências lider de cadeia pesada e leve são clivadas durante a maturação de proteínas e não contribuem para as propriedades do anticorpo final. Para adicionar sequências em falta, as sequências de cDNA clonadas podem ser combinadas com oligonucleótidos sintéticos por ligação ou amplificação por PCR. Alternativamente, a região variável inteira pode ser sintetizada como um conjunto de curtos oligonucleótidos, sobrepostos e combinados por amplificação por PCR para criar um clone da região variável inteiramente sintético. Este processo tem certas vantagens tais como eliminação ou inclusão de locais de restrição particulares, ou otimização de codões particulares.

As sequências de nucleótidos de transcritos de cadeia pesada e leve de hibridomas são usadas para conceber um conjunto sobreposto de oligonucleótidos sintéticos para criar sequências V sintéticas com capacidades de codificação de aminoácidos idênticas às sequências naturais. As sequências de cadeia pesada e kappa sintéticas podem diferir das sequências naturais de três modos: cadeias de bases de nucleótidos repetidas estão interrompidas para facilitar a síntese e amplificação por PCR de oligonucleótidos; locais de inicio da tradução ótimos são incorporados de acordo com as regras de Kozak (Kozak, J. Biol. Chem. 266, 19867-19870 (1991)); e locais HindiII são manipulados a montante dos locais de inicio de tradução.

Para ambas as regiões variáveis de cadeia pesada e leve, as sequências de cadeia codificante otimizada e não codificante correspondente são desagregadas em 30-50 nucleótidos aproximadamente no ponto médio do oligonucleótido não codificante correspondente. Assim sendo, para cada cadeia, os oligonucleótidos podem ser montados como moldes para produzir produtos de amplificação de PCR de 150-400 nucleótidos. Tipicamente, um conjunto de oligonucleótidos de região variável única será desagregado em dois agrupamentos que são separadamente amplificados para gerar dois produtos de PCR sobrepostos. Estes produtos sobrepostos são depois combinados por amplificação por PCR para formar a região variável completa. Pode ser também desejável inclui um fragmento sobreposto da região constante de cadeia pesada ou leve (incluindo o local BbsI da cadeia leve kappa, ou o local Age I da cadeia pesada gama) na amplificação por PCR para gerar fragmentos de PCR que possam ser facilmente clonados nos constructos de vetor de expressão.

As regiões variáveis de cadeia pesada e leve reconstruídas são depois combinadas com sequências promotoras, líder, de início da tradução, da região constante, não traduzida 3', de poliadenilação, e de terminação da transcrição para formar constructos de vetor de expressão. Os constructos de cadeia pesada e leve podem se combinados num vetor único, cotransfectados, transfectados em série, ou separadamente transfectados em células hospedeiras que são depois fundidas para formar uma célula hospedeira expressando ambas as cadeias.

Um procedimento similar pode ser seguido para enxertar nova especificidade quanto ao antigénio num anticorpo maduro existente. Tipicamente é escolhido um anticorpo aceitador que tem origem no mesmo gene da linha germinativa que o anticorpo dador de CDR, mas podem ser também escolhidos outros anticorpos aceitadores. Uma ou mais CDRs do anticorpo dador são depois transferidos usando as técnicas descritas acima.

As caracteristicas estruturais de -003 e -005 e -024 podem ser usadas para criar anticorpos anti-CD38 estruturalmente relacionados, por exemplo anticorpos anti-CD38 humanos, que retêm pelo menos uma propriedade funcional de -003 e -005 e -024, nomeadamente ligação a CD38. Mais especificamente, uma ou mais regiões CDR de -003 ou -005 e -024 podem ser combinadas recombinantemente com regiões de framework e CDRs humanas conhecidas para criar anticorpos anti-CD38 humanos, recombinantemente manipulados, adicionais.

Plasmideos exemplares para uso na construção de vetores de expressão para IgGx humana estão descritos em baixo. Os plasmideos foram construídos tal que as sequências de cDNA de cadeia pesada kappa V e leve kappa V amplificadas por PCR pudessem ser usadas para reconstruir minigenes de cadeia pesada e leve completos. Estes plasmideos podem ser usados para expressar anticorpos para IgGl,K ou IgG4,K completamente humanas. Plasmideos similares podem ser construídos para expressão de outros isotipos de cadeia pesada, ou para expressão de anticorpos compreendendo cadeias leve lambda.

Os anticorpos para CD38 da presente invenção, tais como anticorpos anti-CD38 humanos da presente invenção, podem ser isolados e caracterizados num número de modos diferentes. Por exemplo, hibridomas selecionados podem ser cultivados em frascos adequados para purificação de anticorpos monoclonais. Os sobrenadantes podem ser depois filtrados e concentrados antes de cromatografia de afinidade com proteína A-sefarose (para anticorpos de isotipo IgGl) (Pharmacia, Piscataway, NJ) ou sefarose ou proteína G-sefarose revestida com anti-IgG humana no caso de anticorpos de isotipo IgG3. A IgG eluída pode ser verificada por eletroforese em gel e cromatografia líquida de elevado desempenho para assegurar a pureza. A solução tampão pode ser trocada para PBS, e a concentração pode ser determinada por OD280 usando coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80°C.

Para se determinar se os CD38BPs selecionados, tais como anticorpos anti-CD38 monoclonais humanos, se ligam a epítopos únicos pode ser usada mutagénese sitio-dirigida ou dirigida a múltiplos sítios.

Para se determinar o isotipo de anticorpos purificados podem ser realizados ELISAs de isotipo. Poços de placas de microtitulação podem ser revestidos com 10 yg/mL de anti-IgG humana durante a noite a 4°C. Após bloqueio com BSA (albumina do soro bovino) a 5%, as placas são reagidas com 10 yg/mL de anticorpos monoclonais ou controlos de isotipo purificados, à temperatura ambiente durante duas horas. Os poços podem ser depois reagidos com sondas conjugadas com fosfatase alcalina específicas quanto a IgGl, IgG2, IgG3 ou

IgG4, IgE, IgAl, IgA2 humana, ou IgM humana. Após lavagem, as placas são desenvolvidas com substrato pNPP (1 mg/mL) e analisadas por OD a 405 nm.

De modo a se demonstrar a presença de anticorpos anti-CD38 em soros de ratinhos imunizados ou a ligação de CD38BPs (incluindo anticorpos anti-CD38) a células vivas expressando CD38 pode ser usada citometria de fluxo. Brevemente, linhas de células expressando CD38 (cultivadas sob condições de cultivo padrão) são misturadas com várias concentrações de CD38BP em PBS contendo BSA a 0,1% e azida de sódio a 0,02%, e incubadas a 4°C durante 30 minutos. Após lavagem, as células são reagidas com anticorpos anti-Ig humana marcado com fluoresceina sob as mesmas condições que a coloração de anticorpos primários. As amostras podem ser analisadas por citometria de fluxo com um citómetro de fluxo (p.ex., instrumento FACS da Becton Dickinson) usando propriedades de dispersão de luz e lateral para se focar em células vivas, únicas. Um ensaio alternativo usando microscopia de fluorescência pode ser usado (adicionalmente ao ou em vez do) ensaio de citometria de fluxo. As células podem ser coloridas exatamente como descrito acima e examinadas por microscopia de fluorescência. Este método permite visualização de células individuais, mas pode ter sensibilidade diminuída dependendo da densidade do antigénio.

Os CD38BPs, tais como IgGs humanas anti-CD38, podem ser adicionalmente testados quanto à reatividade com antigénio CD38 por transferência de Western. Brevemente, extratos de células de células expressando CD38 podem ser preparados e sujeitos a eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio (SDS). Após eletroforese, os antigénios separados serão transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados com leite desnatados a 20%, e sondados com os CD38BPs a serem testados. A ligação de IgG humana pode ser detetada usando anti-IgG humana fosfatase alcalina e desenvolvida com comprimidos de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO), mas podem ser também usados agentes de deteção dirigidos a outras porções específicas do CD38BP.

Adicionalmente à ligação específica a CD38, os CD38BPs (incluindo anticorpos anti-CD38 humanos) podem ser testados quanto à sua capacidade de inibirem várias atividades de células expressando CD38, tais como, mas não restringidas a produção de insulina, libertação de Ca2+, produção de citocinas, indução da lise, diferenciação, e proliferação. São descritos aqui animais não humanos transgénicos e transcromossomais, tais como ratinhos transgénicos ou transcromossomais, que são capazes de expressar anticorpos humanos que se ligam especificamente a CD38. Em particular é descrito aqui um ratinho transgénico ou transcromossomal tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana, tal que o ratinho produza anticorpos anti-CD38 humanos quando imunizado com células expressando CD38. 0 transgene de cadeia pesada humana pode ser integrado no DNA cromossomal do ratinho, como é o caso de ratinhos HuMAb, p.ex., transgénicos, como descritos em detalhe aqui. Alternativamente, o transgene de cadeia pesada humana pode ser mantido extracromossomalmente, como é o caso de ratinhos transcromossomais (p.ex., KM) como descritos em WO 02/43478. Tais animais transgénicos e transcromossomais são capazes de produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais humanos para CD38 (p.ex., IgG, IgA e/ou IgE) por submissão a recombinação V-D-J/V-J e troca de isotipos. A conceção de um animal não humano transgénico ou transcromossomal que resposta a estimulação de antigénios estranhos com um repertório de anticorpos heterólogos requer que os transgenes de imunoglobulina heterólogos contidos dentro do animal transgénico funcionem corretamente através da via de desenvolvimento de células B. Isto inclui, por exemplo, troca de isotipos do transgenes de cadeia pesada heterólogos. Conformemente, os transgenes são construídos tal que a troca de isotipos possa ser induzida e uma ou mais das seguintes características de genes de anticorpo: (1) expressão de elevado nível e específica quanto ao tipo de células, (2) rearranjo de genes funcionais, (3) ativação de e resposta a exclusão alélica, (4) expressão de um repertório primário suficiente, (5) transdução de sinal, (6) hipermutação somática, e (7) dominação do lócus de anticorpo de transgene durante a resposta imune.

Nem todos os critérios anteriores necessitam de ser cumpridos. Por exemplo, onde os lócus de imunoglobulina endógenos do animal transgénico sejam funcionalmente desagregados, o transgene não necessita de ativar a exclusão alélica. Adicionalmente, em que o transgenes compreende um gene da imunoglobulina de cadeia pesada e/ou leve funcionalmente rearranjado, o segundo critério de rearranjo de genes funcionais é desnecessário, pelo menos para aquele transgene que já está rearranjado. Para antecedentes sobre imunologia molecular ver, Fundamental Immunology, 2a edição (1989), Paul William E., ed. Raven Press, N.I.

Em certas formas de realização, os animais não humanos transgénicos ou transcromossomais usados para gerar os anticorpos monoclonais humanos da presente invenção contêm transgenes de cadeia pesada e leve de imunoglobulina heterólogos rearranjados, não rearranjados ou uma combinação de rearranjados e não rearranjados na linha germinativa do animal transgénico. Cada um dos transgenes de cadeia pesada compreende pelo menos um gene Ch. Adicionalmente, o transgene de cadeia pesada pode conter sequências funcionais de troca de isotipos, que são capazes de suportar troca de isotipos de um transgenes heterólogo codificando múltiplos genes Ch nas células B do animal transgénico. Tais sequências de troca podem ser aquelas que ocorrem naturalmente no lócus de imunoglobulina da linha germinativa da espécie que serve como a fonte dos genes Ch transgenes, ou tais sequências de troca podem ser derivadas daquelas que ocorrem na espécie que irá receber o constructo de transgene (o animal transgénico). Por exemplo, um constructo de transgene humano que é usado para produzir um ratinho transgénico pode produzir uma frequência mais elevada de eventos de troca de isotipos se incorporar sequências de troca similares àquelas que ocorrem naturalmente no lócus de cadeia pesada de ratinho, pois presumivelmente as sequências de troca de ratinho estão otimizadas para funcionarem com o sistema de enzima recombinase de troca de ratinho, ao passo que as sequências de troca humanas não. As sequências de troca podem ser isoladas e clonadas por métodos de clonagem convencionais, ou podem ser sintetizadas de novo a partir de oligonucleótidos sintéticos sobrepostos concebidos com base em informação publicada de sequências relacionada com sequências de região de troca de imunoglobulinas (Mills et al., Nucl. Acids Res. 15, 7305-7316 (1991), Sideras et al., Intl. Immunol. 1, 631-642 (1989)). Para cada um dos animais transgénicos anteriores, transgenes de imunoglobulina de cadeia pesada e leve heterólogos funcionalmente rearranjados são encontrados numa fração significativa das células B do animal transgénico (pelo menos 10%).

Os transgenes usados para gerar os animais não humanos transgénicos como descritos aqui incluem um transgene de cadeia pesada compreendendo DNA codificando pelo menos um segmento de gene variável, um segmento de gene de diversidade, um segmento de gene de união e pelo menos um segmento de gene de região constante. 0 transgene de cadeia leve de imunoglobulina compreende DNA codificando pelo menos um segmento de gene variável, um segmento de gene de união e pelo menos um segmento de gene de região constante. Os segmentos de gene codificando os segmentos de gene de cadeia leve e pesada são heterólogos em relação ao animal transgénico na medida em que são derivados de, ou correspondem a, DNA codificando segmentos de gene de cadeia pesada e leve de imunoglobulina de uma espécie não consistindo no animal não humano transgénico. 0 transgene pode ser construído tal que os segmentos de genes individuais não sejam rearranjados, i.e., não rearranjados de modo a codificarem uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina funcional. Tais transgenes não rearranjados suportam a recombinação dos segmentos de genes V, D e J (rearranjo funcional) e podem suportar a incorporação de todo ou uma porção de um segmento de gene da região D na cadeia pesada de imunoglobulina rearranjada resultante dentro do animal transgénico quando exposto ao antigénio CD38 .

Numa forma de realização alternativa, os transgenes compreendem um "minilócus" não rearranjado. Tais transgenes compreendem tipicamente uma porção substancial dos segmentos C, D, e J bem como um subconjunto dos segmentos de genes V. Em tais constructos de transgenes, as várias sequências reguladoras, p.ex., promotores, intensificadores, regiões de troca de classes, sequências dadores de processamento e aceitadoras de processamento para processamento de RNA, sinais de recombinação e similares, compreendem sequências correspondentes derivadas do DNA heterólogo. Tais sequências reguladoras podem ser incorporadas no transgenes da mesma ou uma espécie relacionada do animal não humano usado. Por exemplo, os segmentos de genes de imunoglobulina humana podem ser combinados num transgenes com uma sequência intensificadora de imunoglobulina de roedor para uso num ratinho transgénico. Alternativamente, sequências reguladoras sintéticas podem ser incorporadas no transgenes, em que tais sequências reguladoras sintéticas não são homólogas de uma sequência de DNA funcional que se sabe que ocorre naturalmente nos genomas de mamíferos. As sequências reguladoras sintéticas são concebidas de acordo com regras de consenso, tais como, por exemplo, aquelas especificando as sequências permissíveis de um local aceitador de processamento ou um motivo promotor/intensificador. Por exemplo, um minilócus compreende uma porção do lócus genómico de imunoglobulina tendo pelo menos uma eliminação interna (i.e., não num terminal da porção) de uma porção de DNA não essencial (p.ex., sequência interveniente; intrão ou sua porção) em comparação com o lócus de Ig da linha germinativa ocorrendo naturalmente.

Exemplos de animais não humanos transgénicos e transcromossomais, tais como ratinhos, exibirão produção de imunoglobulinas com um repertório significativo, idealmente substancialmente similar àquele de um humano após ajuste quanto ao volume. 0 repertório aproximar-se-á idealmente daquele mostrado num humano quando ajustado quanto ao volume, usualmente com uma diversidade pelo menos cerca de 10% tão grande, tal como 25 a 50% ou maior. Geralmente, pelo menos cerca de mil imunoglobulinas diferentes (idealmente IgG), tais como 104 a 106 ou mais, serão produzidas, dependendo do número de regiões V, J e D diferentes introduzidas no genoma de ratinho e dirigidas pela diversidade adicional gerada por rearranjos de segmentos de genes V(-D-)J e adições de nucleótidos aleatórios nas regiões de união. Tipicamente, as imunoglobulinas exibirão uma afinidade (Kd) quanto a antigénios pré-selecionados de abaixo de IO-8 M, tal como de abaixo de ΙΟ-9 Μ, IO-10 M ou IO-11 M ou mesmo mais baixa. Os animais não humanos transgénicos e transcromossomais, p.ex., ratinhos, como descritos acima, podem ser imunizados com, por exemplo, células expressando CD38. Alternativamente, os animais transgénicos podem ser imunizados com DNA codificando CD38 humano. Os animais produzirão depois células B que sofrem troca de classes através de recombinação de troca (troca cis) e expressam imunoglobulinas reativas com CD38. As imunoglobulinas serão anticorpos humanos (também referidos com "anticorpos com sequências humanas"), em que os polipéptidos de cadeia pesada e leve são codificados por sequências de transgenes humanos, que podem incluir sequências derivadas por mutação somática e uniões recombinatoriais da região V, bem como sequências codificadas pela linha germinativa; estes anticorpos humanos podem ser referidos como sendo substancialmente idênticos a uma sequência de polipéptidos codificada por um segmento de gene VL e Jl ou VH, Dh e Jh humano, embora outras sequências não da linha germinativa possam estar presentes como resultado de mutação somática e diferentes uniões de recombinação diferencial de V-J e V-D-J. As regiões variáveis de cada cadeia de anticorpo são tipicamente pelo menos 80 por cento similares aos segmentos de genes V, e J da linha germinativa de humano, e, no caso de cadeias pesadas, segmentos de genes V, D, e J da linha germinativa de humano; frequentemente pelo menos 85 por cento similares às sequências da linha germinativa de humano presentes no transgene; frequentemente 90 ou 95 por cento ou mais similares às sequências da linha germinativa de humano presentes no transgene. No entanto, uma vez que sequências não da linha germinativa são introduzidas por mutação somática e união VJ e VDJ, os anticorpos com sequências humanas terão frequentemente alqumas sequências de região variável que não são codificadas por segmentos de genes V, D, ou J humanos como encontrados no(s) transgene(s) humano(s) na linha germinativa dos ratinhos. Tipicamente, tais sequências não da linha germinativa (ou posições de nucleótidos individuais) se aglomerarão em ou próximo de CDRs, ou em regiões onde se sabe que mutações somáticas de aglomeram. A presente divulgação descreve também células B derivadas de animais não humanos transgénicos ou transcromossomais como descritos aqui. As células B podem ser usadas para gerar hibridomas expressando anticorpos monoclonais humanos que se ligam com afinidade elevada (por exemplo com uma constante de equilíbrio de dissociação (Kd) de menos do que IO-8 M) com CD38 humano. Assim sendo, numa forma de realização, é proporcionado aqui um hibridoma que produz um anticorpo humano tendo uma afinidade (KD) de abaixo de IO-8 M, tal como de abaixo de ΙΟ-9 Μ, IO-10 M ou IO-11 M ou mesmo mais baixa quando determinada por análise de Scatchard de células expressando CD38 usando um anticorpo monoclonal radioativamente marcado ou por determinação da concentração de ligação semimáxima usando análise FACS, ou por análise usando ressonância de plasmão de superfície como medida num instrumento BIAcore.

Um anticorpo anti-CD38 da presente invenção pode compreender uma cadeia leve de sequência humana composta por (1) uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipéptidos que é substancialmente idêntica a uma sequência de polipéptidos codificada por um segmento de gene Vl humano e um segmento de Jl humano, e (2) uma região constante de cadeia leve codificada por um segmento de gene Cl humano; e uma cadeia pesada de sequência humana composta por (1) uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipéptidos que é substancialmente idêntica a uma sequência de polipéptidos codificada por um segmento de gene VH humano, uma região D, e um segmento de Jh humano, e (2) uma região constante codificada por um segmento de gene Ch humano. Deve ser notado que os genes D humanos podem ser substancialmente alterados por eventos de recombinação e mutação somática tal que a sequência da linha germinativa de humano original possa não ser prontamente reconhecida. 0 desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos de afinidade elevada contra CD38 pode ser facilitado por um método para expansão do repertório de segmentos de genes de região variável humanos num animal não humano transgénico tendo um genoma compreendendo um transgene de imunoglobulina humana integrado, compreendendo o referido método introdução no genoma de um transgene de gene V compreendendo segmentos de genes de região V que não estão presentes no referido transgene de imunoglobulina humana integrado. Frequentemente, o transgene de região V é um cromossoma artificial de levedura (YAC) compreendendo uma porção de uma rede de segmentos de genes Vh ou Vl (Vk) humanos, como pode naturalmente ocorrer num genoma humano ou como pode ser processada em conjunto separadamente por métodos recombinantes, que podem incluir segmentos de genes V fora de ordem ou omitidos. Frequentemente, pelo menos cinco ou mais segmentos de genes V funcionais estão contidos no YAC. Nesta variação é possível fazer um animal transgénico produzido pelo método de expansão do repertório de V, em que o animal expressa uma cadeia de imunoglobulina compreendendo uma sequência de região variável codificada por um segmento de gene da região V presente no transgene de região V e uma região C codificada no transgene e Ig humana. Por meio do método de expansão do repertório de V podem ser gerados animais transgénicos tendo pelo menos 5 genes V distintos; como o podem animais contendo pelo menos cerca de 24 genes V ou mais. Alguns fragmentos de genes V podem ser não funcionais (p.ex., pseudogenes e similares); estes segmentos podem ser retidos ou podem ser seletivamente eliminados por métodos recombinantes disponíveis ao especialista perito, se desejado.

Logo que a linha germinativa de ratinho tenha sido manipulada para conter um YAC funcional tendo um repertório de segmentos V expandido, substancialmente não presente no transgene de Ig humana contendo os segmentos de genes J e C, o traço pode ser propagado e introduzido noutros fundos genéticos, incluindo fundos onde o YAC funcional tendo um repertório de segmentos V expandido é introduzido numa linha germinativa de animal não humano tendo um transgene de Ig humana. Múltiplos YACs funcionais tendo um repertório de segmentos V expandido podem ser introduzidos numa linha germinativa para trabalharem com um transgene de Ig humana (ou múltiplos transgenes de Ig humana). Embora referidos aqui como transgenes de YAC, tais transgenes quando integrados no genoma podem não ter substancialmente sequências de levedura, tais como sequências requeridas para replicação autónoma em levedura; tais sequências podem ser opcionalmente removidas por manipulação genética (p.ex., digestão por restrição e eletroforese em gel com campo pulsado ou outro método adequado) após a replicação em levedura já não ser necessária (i.e., antes da introdução numa célula ES de ratinho ou prozigota de ratinho). Métodos de propagação do traço de expressão de imunoglobulinas com sequências humanas incluem melhoramento de um animal transgénico tendo o(s) transgene(s) de Ig humana, e opcionalmente tendo também uma YAC funcional tendo um repertório de segmentos V expandido. Ambos os segmentos de genes VH e VL podem estar presentes no YAC. 0 animal transgénico pode ser introduzido em qualquer fundo desejado pelo praticante, incluindo fundos abrigando outros transgenes humanos, incluindo transgenes de Ig humana e/ou transgenes codificando outras proteínas de linfócitos humanos. A presente divulgação descreve também uma imunoglobulina de sequência humana de afinidade elevada produzida por um ratinho transgénico tendo um transgenes de YAC de repertório de regiões V expandido. Embora o anterior descreva uma forma de realização específica do animal transgénico estão contempladas outras formas de realização que foram classificadas em três categorias: I. Animais transgénicos contendo um transgene de imunoglobulina de cadeia pesada não rearranjada e leve rearranj ada; II. Animais transgénicos contendo um transgene de imunoglobulina de cadeia pesada não rearranjada e leve não rearranjada; e III. Animal transgénico contendo transgene de imunoglobulina de cadeia pesada rearranjada e leve não rearranj ada.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente aceitável de um anticorpo para CD38 da presente invenção. As composições farmacêuticas podem ser formuladas com transportadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis bem como quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos de acordo com técnicas convencionais tais como aquelas divulgadas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a Edição, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995.

Os transportadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis bem como quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos devem ser adequados para o composto escolhido da presente invenção e o modo de administração escolhido. A adequabilidade para transportadores e outros componentes de composições farmacêuticas é determinada com base na falta de impacto negativo significativo nas propriedades biológicas desejadas do composto escolhido ou composição farmacêutica da presente invenção (p.ex., menos do que um impacto significativo (10% ou menos inibição relativa, 5% ou menos inibição relativa, etc.)) na ligação ao antigénio.

Uma composição farmacêutica da presente invenção pode também incluir diluentes, enchimentos, sais, tampões, detergentes (p.ex., um detergente não iónico, tal como Tween-80), estabilizantes (p.ex., açúcares ou aminoácidos isentos de proteínas), conservantes, fixadores de tecidos, solubilizantes, e/ou outros materiais adequados para inclusão numa composição farmacêutica.

Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a se obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para se alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição, e modo de administração particulares, sem ser tóxica para o paciente. 0 nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção empregues, ou do seu éster, sal ou amida, a rota de administração, o momento de administração, a taxa de excreção do composto particular sendo empregue, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregues, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e historial médico prévio do paciente sendo tratado, e fatores similares bem conhecidos nas técnicas médicas. A composição farmacêutica pode ser administrada por qualquer rota e modo adequados. Rotas de administração adequadas de administração de um composto da presente invenção in vivo e in vitro são bem conhecidas na técnica e podem ser selecionadas por aqueles com pericia ordinária na técnica.

Os compostos da presente invenção podem ser administrados através de qualquer rota adequada, tal como uma rota oral, nasal, inalável, tópica (incluindo bucal, transdérmica e sublingual), retal, vaginal e/ou parenteral.

Numa forma de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção é administrada oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou um transportador comestivel assimilável. 0 ingrediente ativo pode ser encerrado numa cápsula de gelatina de núcleo duro ou mole, comprimido em comprimidos, ou incorporado diretamente no regime alimentar de um sujeito. As composições farmacêuticas da presente invenção que são adequadas para administração oral incluem comprimidos ingestiveis, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, bolachas, e similares contendo tais transportadores como são conhecidos na técnica como sendo apropriados. Para administrar um composto da presente invenção administração oral pode ser necessário revestir o composto com, ou coadministrar o composto com, um material para prevenir a sua inativação.

Numa forma de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção é administrada nasalmente. Composições farmacêuticas da presente invenção que são adequadas para administração nasal são conhecidas na técnica e incluem tipicamente pulverizações, gotas nasais e inalantes.

Numa forma de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção é administrada topicamente. Composições farmacêuticas da presente invenção que são adequadas para administração tópica ou transdérmica incluem pós, pulverizações, pomadas, pastas, cremes, loções, géis, soluções, pensos e inalantes contendo tais transportadores como são conhecidos na técnica como sendo apropriado.

Numa forma de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção é administrada retalmente. Composições farmacêuticas que são adequadas para administração retal são conhecidas na técnica e incluem géis, pastas, formulações de pulverização, supositórios.

Numa forma de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção é administrada vaginalmente. Composições farmacêuticas da presente invenção que são adequadas para administração vaginal incluem pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações de pulverização contendo tais transportadores como são conhecidos na técnica como sendo apropriados.

Numa forma de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção é administrada parenteralmente.

As frases "administração parenteral" e "administrado parenteralmente" como usadas aqui significam modos de administração sem ser administração enteral e tópica, usualmente por injeção, e incluem injeção ou infusão epidérmica, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, intratendinosa, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, intracraniana, intratorácica, epidural e intrasternal.

Numa forma de realização, essa composição farmacêutica é administrada por injeção ou infusão intravenosa ou subcutânea.

Numa forma de realização, os compostos da presente invenção são administrados em forma cristalina por injeção subcutânea, cf. Yang et ai., PNAS USA 100 (12), 6934-6939 (2003).

As composições farmacêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, numa forma de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tal como os dispositivos divulgados em US 5,399,163, US 5,383,851, US 5,312,335, US 5,064,413, US 4,941,880, US 4,790,824, ou US 4,596,556. Exemplos de implantes e módulos bem conhecidos úteis na presente invenção incluem: US 4,487,603, que divulga uma bomba de microinfusão implantável para administração de medicação a uma taxa controlada; US 4,486,194, que divulga um dispositivo terapêutico para administração de medicamentos através da pele; US 4,447,233, que divulga uma bomba de infusão de medicação para administração de medicação a uma taxa de infusão precisa; US 4,447,224, que divulga um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para administração continua de fármacos; US 4,439,196, que divulga um sistema de administração de fármacos osmóticos tendo compartimentos com múltiplas câmaras; e US 4,475,196, que divulga um sistema de administração de fármacos osmóticos. Muitos outros tais implantes, sistemas de administração, e módulos são conhecidos daqueles peritos na técnica.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas para rotas de administração particulares, tais como administração oral, nasal, tópica (incluindo bucal, transdérmica e sublingual), retal, vaginal e/ou parenteral. As composições farmacêuticas podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por quaisquer métodos conhecidos na técnica de farmácia. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do sujeito sendo tratado, e do modo de administração particular. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única será geralmente aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Geralmente, de cem por cento, esta quantidade variará de cerca de 0,01% a cerca de 99% de ingrediente ativo, tal como de cerca de 0,1% a cerca de 70%, por exemplo de cerca de 1% a cerca de 30%.

Independentemente da rota de administração selecionada, os compostos da presente invenção, que podem ser usados na forma de um sal farmaceuticamente aceitável ou numa forma hidratada adequada, e/ou as composições farmacêuticas da presente invenção, são formulados em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por métodos convencionais conhecidos daqueles com perícia na técnica. Um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto progenitor e não confere quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (ver por exemplo Berge, S. M. et al.r J. Pharm. Sei. 66, 1-19 (1977)). Exemplos de tais sais incluem sais de adição ácida e sais de adição básica. Os sais de adição ácida incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como ácidos clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídico, fosforoso e similares, bem como de ácidos orgânicos não tóxicos tais como ácidos mono- e dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos substituídos por fenilo, ácidos hidroxi alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos e aromáticos e similares. Os sais de adição básica incluem aqueles derivados de metais alcalinoterrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e similares, bem como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'-dibenzil-etilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etileno-diamina, procaína e similares.

Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem qualquer um dos e todo os solventes adequados, meios de dispersão, agentes de isotonicidade, antioxidantes e agentes de atraso da absorção, e similares que são fisiologicamente compatíveis com um composto da presente invenção.

Exemplos de transportadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregues nas composições farmacêuticas da presente invenção incluem água, salino, salino tamponado com fosfato, etanol, dextrose, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e similares), e suas misturas adequadas, óleos vegetais, tais como azeite, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, e óleo de sésamo, soluções coloidais de celulose de carboximetilo, goma-tragacanto e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etilo, e/ou vários tampões. Outros transportadores são bem conhecidos nas técnicas farmacêuticas

Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersão injetáveis estéreis. 0 uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto na medida em que quaisquer meios ou agente convencionais sejam incompatíveis com o composto ativo, o seu uso nas composições farmacêuticas da presente invenção está contemplado. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho das partículas requerido no caso de dispersões, e pelo uso de tensioativos.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem também compreender antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis por exemplo (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, hidrocloreto de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e similares; (2) antioxidantes solúveis em água, tais como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propilo, alfa-tocoferol, e similares; e (3) agentes quelantes de metais, tais como ácido cítrico, ácido tetra-acético de etilenodiamina (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e similares.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem também compreender agentes de isotonicidade, tais como açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, glicerol ou cloreto de sódio nas composições.

Diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem salino e soluções tampão aquosas.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem também conter um ou mais adjuvantes apropriados para a rota de administração escolha tais como conservantes, agentes molhantes, agentes emulsificantes, agentes dispersantes, conservantes ou tampões, que podem intensificar a vida de prateleira ou eficácia da composição farmacêutica. Os compostos da presente invenção podem por exemplo ser misturados com lactose, sacarose, pós (p.ex., amido em pó), ésteres de celulose de ácidos alcanoicos, ácido esteárico, talco, estearato de magnésio, óxido de magnésio, sais de sódio e cálcio de ácidos fosfóricos e sulfúricos, acácia, gelatina, alginato de sódio, polivinilpirrolidina, e/ou álcool de polivinilo. Outros exemplos de adjuvantes são QS21, GM-CSF, SRL-172, di-idrocloreto de histamina, timocartina, Tio-TEPA, composições de monofosforil-lipido A/micobactérias, alúmen, adjuvante de Freund incompleto, ISA montanideo, sistema adjuvante ribi, adjuvante TiterMax, formulações adjuvantes syntex, complexos estimuladores imunes (ISCOMs), adjuvante gerbu, oligodeoxinucleótidos CpG, lipopolissaccarideos, e ácido poli-inosínico:policitidílico. A prevenção da presença de microrganismos pode ser assegurada tanto por procedimentos de esterilização como pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, e similares. Adicionalmente, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pela inclusão de agentes que atrasam a absorção de tais como monoestearato de alumínio e gelatina.

As composições farmacêuticas da presente invenção compreendendo um composto da presente invenção podem também incluir um sal para o mesmo adequado. Qualquer sal adequado, tal como um sal de metal alcalinoterroso em qualquer forma adequada (p.ex., um sal de tampão), pode ser usado na estabilização do composto da presente invenção. Sais adequados incluem tipicamente cloreto de sódio, sucinato de sódio, sulfato de sódio, cloreto de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, e cloreto de cálcio. Numa forma de realização, um sal de aluminio é usado para estabilizar um composto da presente invenção numa composição farmacêutica da presente invenção, cujo sal de aluminio pode também servir como um adjuvante quando uma tal composição é administrada a um paciente.

As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem estar numa variedade de formas adequadas. Tais formas incluem, por exemplo, formas de dosagem liquidas, semissólidas e sólidas, tais como soluções liquidas (p.ex., soluções injetáveis e infusiveis), dispersões ou suspensões, emulsões, microemulsões, géis, cremes, grânulos, pós, comprimidos, pílulas, pós, lipossomas, dendrimeros e outras nanopartículas (ver por exemplo Baek et al., Methods Enzymol. 362, 240-9 (2003), Nigavekar et al., Pharm Res. 21 (3), 476-83 (2004)), micropartícuias, e supositórios. A forma ótima depende do modo de administração escolhido, da natureza da composição, e da aplicação terapêutica. As formulações podem incluir, por exemplo, pós, pastas, pomadas, geleias, ceras, óleos, lípidos, vesículas contendo lípidos (catiónicos ou aniónicos), conjugados de DNA, pastas de absorção anidras, emulsões óleo-em-água e água-em-óleo, carbowax em emulsão (polietileno glicóis de vários pesos moleculares), géis semissólidos, e misturas semissólidas contendo carbowax. Qualquer um dos anteriores pode ser apropriado em tratamentos e terapias de acordo com a presente invenção, contanto que o ingrediente ativo na composição farmacêutica não seja inativado pela formulação e a formulação seja fisiologicamente compatível e tolerável com a rota de administração. Ver também por exemplo Powell et al., "Compendium of excípíents for parenteral formulations" PDA J Pharm Sei Technol. 52, 238-311 (1998) e as citações aí para informação adicional relacionada com excipientes e transportadores bem conhecidos de químicos farmacêuticos.

Os compostos da presente invenção podem ser preparados com transportadores que protegerão o composto contra libertação rápida, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, pensos transdérmicos, e sistemas de administração microencapsulados. Tais transportadores podem incluir gelatina, monoestearato de glicerilo, diestearato de glicerilo, polímeros biocompatíveis, biodegradáveis tais como acetato de etileno de vinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres, e ácido poliláctico sozinho ou com uma cera, ou outras matérias bem conhecidas na técnica. Métodos para a preparação de tais formulações são geralmente conhecidos daqueles peritos na técnica. Ver, p.ex., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978.

Para administrar as composições da presente invenção por certas rotas de administração pode ser necessário revestir o composto com, ou coadministrar o composto com, um material para prevenir a sua inativação. Por exemplo, o composto da presente invenção pode ser administrado a um sujeito num transportador adequado, por exemplo, lipossomas, ou um diluente. Os lipossomas incluem emulsões CGF água-em-óleo-em-água bem como lipossomas convencionais (Strejan et al., J. Neuroimmunol. 7, 27 (1984)).

Dependendo da rota de administração, o composto ativo pode ser revestido num material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto. Por exemplo, o composto pode ser administrado a um sujeito num transportador adequado, por exemplo, lipossomas. Os lipossomas incluem emulsões CGF água-em-óleo-em-água bem como lipossomas convencionais (Strejan et al., J. Neuroimmunol. 7, 27 (1984)).

Numa forma de realização, os compostos da presente invenção podem ser formulados para assegurar distribuição in vivo apropriada. Por exemplo, a barreira hematoencefálica (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofilicos. Para assegurar que os compostos terapêuticos da presente invenção atravessam a BBB (se desejado) podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos de administração de lipossomas, ver por exemplo US 4,522,811, US 5,374,548 e US 5,399,331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais frações que são seletivamente transportadas em células ou órgãos específicos, logo intensificam a administração dirigida de fármacos (ver por exemplo V. V. Ranade J. Clin. Pharmacol. 29, 685 (1989)). Frações de direcionamento exemplares incluem folato ou biotina (ver por exemplo US 5,416,016), manosideos (Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 153, 1038 (1988)), anticorpos (P. G. Bloeman et al., FEBS Lett. 357, 140 (1995), M. Owais et al., Antimicrob. Agents Chemother. 39, 180 (1995)), recetor da proteína A de tensioativos (Briscoe et al., Am. J. Physiol. 1233, 134 (1995)), diferentes espécies dos quais podem compreender as composições farmacêuticas da presente invenção, bem como componentes das moléculas inventadas, pl20 (Schreier et al., J. Biol. Chem. 269, 9090 (1994)), ver também K. Keinanen, M. L. Laukkanen, FEBS Lett. 346, 123 (1994) e J. J. Killion, I. J. Fidler, Immunomethods 4, 273 (1994).

Os anticorpos anti-CD38 da presente invenção podem ser formulados em lipossomas. Os lipossomas podem incluir uma fração de direcionamento. Os anticorpos nos lipossomas podem ser administrados por injeção bólus a um local próximo da área desejada, p.ex., o local de inflamação ou infeção, ou o local de um tumor. A composição tem de ser fluida na medida em que exista seringabilidade fácil. Tem de ser estável sob as condições de preparação e armazenamento e tem de ser conservada contra a ação contaminante de microrganismos tais como bactérias e fungos.

Numa forma de realização, os anticorpos da presente invenção podem ser formulados para prevenir ou reduzir o seu transporte através da placenta. Isto pode ser feito por métodos conhecidos na técnica, p.ex., por PEGuilação dos compostos ou por uso de fragmentos F(ab')2. Podem ser feitas referências adicionais a Cunningham-Rundles C et al. , J Immunol Methods. 152, 177-190 (1992) e a Landor M., Ann Allergy Asthma Immunol 74, 279-283 (1995).

Transportadores farmaceuticamente aceitáveis para administração parenteral incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto na medida em que quaisquer meios ou agente convencionais sejam incompatíveis com o composto ativo, o seu uso nas composições farmacêuticas da presente invenção está contemplado. Compostos ativos suplementares podem ser também incorporados nas composições.

As composições farmacêuticas para injeção têm tipicamente de ser estéreis e estáveis sob as condições de preparação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para elevada concentração de fármacos. O transportador pode ser um solvente aquoso ou não aquoso ou meio de dispersão contendo por exemplo água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e similares), e suas misturas adequadas, óleos vegetais, tais como azeite, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etilo. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partículas requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensioativos. Em muitos casos será preferencial incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como glicerol, manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada por inclusão na composição de um agente que atrasa a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina. Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorporação do composto ativo na quantidade requerida num solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes, p.ex., como enumerados acima, como requerido, seguido por microfiltração por esterilização. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação do composto ativo num veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos, p.ex., a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, exemplos de métodos de preparação são secagem em vácuo e criodessecação (liofilização) que originam um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma sua solução previamente filtrada por esterilização.

Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorporação do composto ativo na quantidade requerida num solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido por microfiltração por esterilização. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação do composto ativo num veiculo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, exemplos de métodos de preparação são secagem em vácuo e criodessecação (liofilização) que originam um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma sua solução previamente filtrada por esterilização. A composição farmacêutica da presente invenção pode conter um composto da presente invenção ou uma combinação de compostos da presente invenção. Assim sendo, numa forma de realização, uma composição farmacêutica da presente invenção inclui uma combinação de múltiplos (p.ex., dois ou mais) compostos da presente invenção que atuam por diferentes mecanismos, p.ex., um composto que atua predominantemente por indução de CDC em combinação com outro composto que atua predominantemente por indução da apoptose.

Os anticorpos anti-CD38 (e imunoconjugados, moléculas biespecificas/multiespecificas, composições e outros derivados descritos aqui) da presente invenção têm numerosas utilidades de diagnóstico e terapêuticas in vitro e in vivo envolvendo o diagnóstico e tratamento de distúrbios envolvendo células expressando CD38. Por exemplo, os anticorpos podem ser administrados a células em cultura, p.ex., in vitro ou ex vivo, ou a sujeitos humanos, p.ex., in vivo, para tratar, prevenir e para diagnosticar uma variedade de distúrbios. Como usado aqui, o termo "sujeito" destina-se a incluir animais humanos e não humanos que respondem ao anticorpo para CD38. Os sujeitos podem por exemplo incluir pacientes humanos tendo distúrbios que podem ser corrigidos ou melhorados por inibição da função de CD38, tal como atividade enzimática, transdução de sinal, indução da expressão de citocinas, indução da proliferação ou diferenciação, e/ou indução da lise e/ou eliminação/redução do número de células expressando CD38.

Por exemplo, os anticorpos para CD38 podem ser usados para provocar in vivo ou in vitro uma ou mais das seguintes atividades biológicas: inibição função de CD38 (tal como atividade enzimática, transdução de sinal, indução da expressão de citocinas, indução da proliferação ou diferenciação, e/ou indução da lise), morte de uma célula expressando CD38, mediação da fagocitose ou ADCC de uma célula expressando CD38 na presença de células efetoras humanas, e por mediação de CDC de uma célula expressando CD38 na presença de complemente, ou por morte de células expressando CD38 por apoptose.

Qualquer composição compreendendo anticorpos para CD38 da presente invenção tendo locais de ligação ao complemento, tais como porções de IgGl, -2, ou -3 ou IgM que se ligam ao complemento, pode ser também usada na presença de complemento. 0 tratamento ex vivo de uma população de células compreendendo células alvo com um anticorpo para CD38 da presente invenção e células efetoras humanas pode ser suplementado pela adição de complemento ou soro contendo complemento. A fagocitose ou lise de células alvo, revestidas com um anticorpo para CD38 da presente invenção pode ser melhorada por ligação de proteínas do complemento. As células alvo revestidas com um anticorpo para CD38 da presente invenção podem ser também lisadas pelo complemento. Numa forma de realização, os anticorpos para CD38 da presente invenção não ativam o complemento.

Os anticorpos para CD38 da presente invenção podem ser também administrados em conjunto com o complemento. Conformemente, dentro do âmbito da presente invenção estão composições compreendendo anticorpos para CD38 com soro ou complemento. Nestas composições, o complemento está localizado em proximidade intima com os anticorpos para CD38, por exemplo por conjugação ou pode ser adequado para administração simultânea. Alternativamente, os anticorpos para CD38 e o complemento ou soro podem ser administrados separadamente.

Os anticorpos para CD38 da presente invenção podem ser também usados para visar células expressando FcyR ou CD38, por exemplo para marcação de tais células. Para tal uso, o anticorpo para CD38 pode ser ligado a uma molécula que possa ser detetada. Assim sendo, a presente invenção proporciona métodos para localização de ex vivo ou in vitro de células expressando recetores Fc, tais como FcyR, ou CD38. 0 marcador detetável pode ser, p.ex., um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima, ou um cofator de enzima. Células efetoras especificas quanto ao alvo, p.ex., células efetoras ligadas a um anticorpo para CD38 da presente invenção podem ser também usadas como agentes terapêuticos. As células efetoras para direcionamento podem ser leucócitos humanos tais como macrófagos, neutrófilos ou monócitos. Outras células incluem eosinófilos, células matadoras naturais e outras células transportando recetores de IgG e IgA. Se desejado, as células efetoras podem ser obtidas do sujeito a ser tratado. As células efetoras especificas quanto ao alvo podem ser administradas como uma suspensão de células numa solução fisiologicamente aceitável. 0 número de células administradas pode ser na ordem de 108 a 109 mas variará dependendo do propósito terapêutico. Em geral, a quantidade será suficiente para se obter localização na célula alvo, p.ex., uma célula tumoral expressando CD38, e para matar eficazmente a célula por, p.ex., fagocitose ou lise. A terapia com células efetoras especificas quanto ao alvo pode ser realizada em conjunção com outras técnicas para remoção de células visadas. Por exemplo pode ser usada terapia antitumoral usando os anticorpos para CD38 da presente invenção e/ou células armadas com estes anticorpos em conjunção com quimioterapia. Adicionalmente pode ser usada imunoterapia de combinação para dirigir duas populações efetoras citotóxicas distintas na direção de rejeição de células tumorais. Por exemplo podem ser usados anticorpos para CD38 ligados a anti-FcYRI ou anti-CD3 em conjunção com agentes de ligação específicos quanto a IgG ou IgA. As moléculas biespecíficas e multiespecíficas da presente invenção podem ser também usadas para modular os níveis de FcaR ou FcyR em células efetoras, tal como por capping e eliminação de recetores na superfície das células. Misturas de recetores anti-Fc podem ser também usadas para este propósito.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona métodos para deteção da presença de antigénio CD38 numa amostra, ou medição da quantidade de antigénio CD38, compreendendo contacto da amostra, e uma amostra de controlo, com um anticorpo para CD38 da invenção que se liga especificamente a CD38, sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo para CD38 ou sua porção e CD38. A formação de um complexo é depois detetada, em que uma diferença na formação de complexo entre a amostra em comparação com a amostra de controlo é indicativa da presença de antigénio CD38 na amostra. Exemplos de métodos para deteção de imunoensaios incluem, sem limitação, um ELISA, um RIA, ensaios FACS, ensaios de ressonância de plasmão, ensaios cromatográficos, imunohistoquimica de tecidos, transferência de Western, e/ou imunoprecipitação.

Numa forma de realização, os anticorpos para CD38 da presente invenção podem ser usados para detetar níveis de CD38 em circulação ou níveis de células que contêm CD38 na sua superfície membranar, cujos níveis podem ser depois ligados a certos sintomas de doenças. Alternativamente, os anticorpos para CD38 podem ser usados para esgotar ou interagir com a função de células expressando CD38, implicando deste modo estas células como mediadores importantes da doença. Isto pode ser alcançado por contacto de uma amostra e uma amostra de controlo com o anticorpo anti-CD38 sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e CD38. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e CD38 são detetados e comparados na amostra e no controlo.

Os anticorpos para CD38 da presente invenção podem ser inicialmente testados quanto à atividade de ligação associada ao uso terapêutico ou de diagnóstico in vitro. Por exemplo, os anticorpos para CD38 podem ser testados usando ensaios de citometria de fluxo. Além do mais, a atividade dos anticorpos para CD38 no desencadeamento de pelo menos uma atividade de células efetoras mediada por efetores pode ser avaliada. Por exemplo, a capacidade de anticorpos anti-CD38 da presente invenção de desencadearem CDC e/ou apoptose pode ser avaliada. Protocolos para avaliação quanto à CDC, adesão homotípica, aglomeração molecular ou apoptose são bem conhecidos na técnica.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um método para deteção da presença ou quantificação da quantidade de células expressando CD38 in vivo ou in vitro. 0 método compreende (i) administração a um sujeito de um anticorpo para CD38 da presente invenção conjugado a um marcador detetável; (ii) exposição do sujeito a um meio para deteção do referido marcador detetável para se identificarem áreas contendo células expressando CD38.

Numa forma de realização, os imunoconjugados da presente invenção podem ser usados para dirigir compostos (p.ex., agentes terapêuticos, marcadores, citotoxinas, imunossupressores, etc.) para células que têm CD38 ligado à sua superfície por uso de tais compostos alvo como as frações terapêuticas em imunoconjugados da presente invenção.

Os anticorpos anti-CD38 da presente invenção podem se usados em métodos para localização ex vivo ou in vitro de células expressando CD38 (p.ex., com um marcador detetável, tal como um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima, ou um cofator de enzima).

Os anticorpos anti-CD38 da presente invenção podem ser usados em métodos para morte de células que têm CD38 ligado à sua superfície por administração de imunotoxinas da presente invenção.

Os anticorpos anti-CD38 da presente invenção podem ser usados em métodos para tratamento ou prevenção de um distúrbio envolvendo células expressando CD38 num sujeito, cujo método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente aceitável de um anticorpo para CD38 da presente invenção a um sujeito com sua necessidade. Tais anticorpos para CD38 são usados para inibir as atividades induzidas por CD38 associadas a certos distúrbios ou para eliminar ou reduzir o número de células expressando CD38.

Um tal método envolve administração a um sujeito de uma composição de anticorpo para CD38 da presente invenção numa quantidade eficaz para tratar ou prevenir o distúrbio. A composição de anticorpo para CD38 pode ser administrada sozinha ou em conjunto com outro agente terapêutico, tal como está descrito noutro lugar aqui, que atua em conjunção com ou sinergicamente com a composição de anticorpo para CD38 para tratar ou prevenir as doenças envolvendo células expressando CD38. Alternativamente podem ser usados imunoconjugados para matar células que têm CD38 expresso na sua superfície por direcionamento de citotoxinas ou radiotoxinas para CD38. 0 distúrbio envolvendo células expressando CD38 que pode ser tratado com anticorpos da invenção pode ser um distúrbio tumorigénico, tal como um distúrbio caracterizado pela presença de células tumorais expressando CD38 incluindo, por exemplo, linfoma de células B, malignidades de células plasmáticas, linfoma de células T/NK e malignidades mieloides.

Exemplos de tais doenças tumorigénicas incluem linfoma/leucemias de células B incluindo leucemia linfoblástica/linforna de células B precursoras e linfomas de não Hodgkin de células B; leucemia pró-mielocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda e neoplasmas de células B maduras, tais como leucemia linfocítica crónica (CLL)/linfoma linfocítico pequeno (SLL) de células B, leucemia linfocítica aguda de células B, leucemia pró-linfocítica de células B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células do manto (MCL) , linfoma folicular (FL), incluindo FL de grau baixo, grau intermédio e grau elevado, linfoma de centros foliculares cutâneos, linfoma de células B da zona marginal (tipo MALT, tipo nodal e esplénico), leucemia de células pilosas, linfoma de células B grandes difusas, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células plasmáticas, leucemia de células plasmáticas, distúrbio linfoproliferativo pós-transplante, macroglobulinemia de Waldenstrõm, leucemias de células plasmáticas e linfoma de células grandes anaplásicas (ALCL).

Numa forma de realização, o distúrbio envolvendo células expressando CD38 é mieloma múltiplo.

Exemplos de linfomas não de Hodgkin de células B são granulomatose linfomatoide, linfoma de efusão primária, linfoma de células B grandes intravasculares, linfoma de células B grandes mediastinais, doenças da cadeia pesada (incluindo doença de y, μ e a), linfomas induzidos por terapia com agentes imunossupressores, tais como linfoma induzido por ciclosporina, e linfoma induzido por metotrexato.

Numa forma de realização da presente invenção, o distúrbio envolvendo células expressando CD38 pode ser linfoma de Hodgkin.

Exemplos de um distúrbio envolvendo células expressando CD38 podem ser uma malignidade derivada de células T e NK incluindo: neoplasmas de células T e NK maduras incluindo leucemia pró-linfocitica de células T, leucemia linfocitica granular grande de células T, leucemia agressiva de células NK, leucemia/linforna de células T adultas, linfoma de células NK/T extranodais, linfoma de células T do tipo nasal, tipo enteropatia, linfoma de células T hepatoesplénicas, linfoma de células T tipo paniculite subcutânea, linfoma de células NK blásticas, Micose Fungoide/Sindrome de Sézary, distúrbios linfoproliferativos de células T positivos quanto a CD38 cutâneos primários (linfoma de células grandes anaplásicas cutâneas C-ALCL, papulose linfomatoide, lesões limite), linfoma de células T angioimunoblásticas, linfoma de células T periféricas não especificado, e linfoma de células grandes anaplásicas.

Exemplos de malignidades derivadas de células mieloides incluem leucemia mieloide aguda, incluindo leucemia pró-mielocítica aguda, e doenças mieloproliferativas crónicas, incluindo leucemia mieloide crónica.

Numa forma de realização da presente invenção, o distúrbio envolvendo células expressando CD38 pode ser distúrbios imunes nos quais células B, células plasmáticas, monócitos e células T expressando CD38 estão envolvidos.

Exemplos de distúrbios imunes nos quais células B, células plasmáticas, monócitos e células T expressando CD38 estão envolvidos incluem distúrbios autoimunes, tais como psoriase, artrite psoriática, dermatite, escleroderma e esclerose sistémicos, doença inflamatória do intestino (IBD), doença de Crohn, colite ulcerosa, sindrome de dificuldade respiratória, meningite, encefalite, uveite, glomerulonefrite, eczema, asma, aterosclerose, deficiência na adesão de leucócitos, esclerose múltipla, sindrome de Raynaud, sindrome de Sjõgren, diabetes de inicio juvenil, doença de Reiter, doença de Behçet, nefrite do complexo imune, nefropatia de IgA, polineuropatias de IgM, trombocitopenias mediadas imunes, tais como púrpura trombocitopénica idiopática aguda e púrpura trombocitopénica idiopática crónica, anemia hemolitica, miastenia grave, nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistémico, artrite reumatoide (RA), dermatite atópica, pênfigo, doença de Graves, tiroidite de Hashimoto, granulomatose de Wegener, sindrome de Omenn, insuficiência renal crónica, mononucleose infeciosa aguda, esclerose múltipla, HIV, e doenças associadas ao vírus da herpes. Exemplos adicionais são síndrome de dificuldade respiratória aguda grave e coreorretinite. Além do mais estão incluídas outras doenças e distúrbios tais como aqueles causados por ou mediados por infeção de células B com vírus, tais como o vírus de Epstein-Barr (EBV).

Numa forma de realização, o distúrbio envolvendo células expressando CD38 é artrite reumatoide.

Exemplos adicionais de distúrbios inflamatórios, imunes e/ou autoimunes nos quais autoanticorpos e/ou atividade excessiva de linfócitos B e T são proeminentes e que podem ser tratados de acordo com a presente invenção incluem os seguintes: vasculites e outros distúrbios de vasos, tais como poliangeíte microscópica, síndrome de Churg-Strauss, e outras vasculites associadas a ANCA, poliarterite nodosa, vasculite crioglobulinémica essencial, angeíte leucocitoclástica cutânea, doença de Kawasaki, arterite de Takayasu, artrite de células gigantes, púrpura de Henoch-Schõnlein, angeíte cerebral primária ou isolada, eritema nodoso, trombangeíte obliterante, púrpura trombocitopénica trombótica (incluindo síndrome urémica hemolítica), e vasculites secundárias, incluindo vasculite leucocitoclástica cutânea (p.ex., secundária à hepatite B, hepatite C, macroglobulinemia de Waldenstrõm, neoplasias de células B, artrite reumatoide, síndrome de Sjõgren, ou lúpus eritematoso sistémico); exemplos adicionais são eritema nodoso, vasculite alérgica, paniculite, doença de Weber-Christian, púrpura hiperglobulinémica, e doença de Buerger; distúrbios da pele, tais como dermatite de contacto, dermatose de IgA linear, vitiligo, pioderma gangrenoso, epidermólise bolhosa adquirida, pênfigo vulgar (incluindo penfigoide cicatricial e penfigoide bolhoso), alopecia areata (incluindo alopecia universal e alopecia total), dermatite herpetiforme, eritema multiforme, e urticária autoimune crónica (incluindo edema angioneurótico e vasculite urticária); citopenias mediadas imunes, tais como neutropenia autoimune, e aplasia de glóbulos vermelhos puros; distúrbios do tecido conectivo, tais como lúpus do CNS, lúpus eritematoso discoide, sindrome de CREST, doença mista do tecido conectivo, polimiosite/dermatomiosite, miosite de corpos de inclusão, amiloidose secundária, crioglobulinemia do tipo I e tipo II, f ibromialgia, sindrome de anticorpos antifosfolipidicos, hemofilia secundária, policondrite recidivante, sarcoidose, sindrome do homem de pedra, e febre reumática; um exemplo adicional é fasceite eosinofilica; artrites, tais como espondilite anquilosante, artrite crónica juvenil, doença de Still adulta, e sindrome de SAPHO; exemplos adicionais são sacroileite, artrite reativa, doença de Still, e gota; distúrbios hematológicos, tais como anemia aplásica, anemia hemolitica primária (incluindo sindrome de aglutinina fria), anemia hemolitica secundária de CLL ou lúpus eritematoso sistémico; sindrome de POEMS, anemia perniciosa, e púrpura hiperglobulinémica de Waldenstrõm; exemplos adicionais são agranulocitose, neutropenia autoimune, doença de Franklin, doença de Seligmann, doença de cadeia pesada gama, sindrome paraneoplásica secundária ao timoma e linfomas, uma sindrome paraneoplásica secundária ao timoma e linfomas, e formação de inibidores do fator VII; endocrinopatias, tais como poliendocrinopatia, e doença de Addison; exemplos adicionais são hipoglicemia autoimune, hipotiroidismo autoimune, sindrome de insulina autoimune, de tiroidite de Quervain, e resistência à insulina mediada por anticorpos para os recetores da insulina; distúrbios hepatogastrointestinais, tais como doença celíaca, doença de Whipple, cirrose biliar primária, hepatite ativa crónica, e colangeíte esclerosante primária; um exemplo adicional é gastrite autoimune; nefropatias, tais como glomerulonefrite progressiva rápida, nefrite pós-estreptocóccica, síndrome de Goodpasture, glomerulonefrite membranosa, e nefrite crioglobulinémica; um exemplo adicional é doença de mudança mínima; distúrbios neurológicos, tais como neuropatias autoimunes, mononeurite múltipla, síndrome de miasténico de Lambert-Eaton, coreia de Sydenham, ataxia motora, e síndrome de Guillain-Barré; exemplos adicionais são mielopatia/paraperese espástica tropical, miastenia grave, polineuropatia desmielinizante inflamatória aguda, e polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica; esclerose múltipla; distúrbios cardíacos e pulmonares, tais como COPD, alveolite fibrosante, bronquiolite obliterante, aspergilose alérgica, fibrose cística, síndrome de Lõffler, miocardite e pericardite; exemplos adicionais são pneumonite de hipersensibilidade, e síndrome paraneoplásica secundária ao cancro do pulmão; distúrbios alérgicos, tais como asma bronquial e síndrome de hiper-IgE; um exemplo adicional é amaurose fugaz; distúrbios oftalmológicos, tais como coriorretinite idiopática; doenças infeciosas, tais como infeção por parvovírus B (incluindo síndrome de luvas-e-meias); distúrbios ginecológicos-obstretícios, tais como aborto recorrente, perda fetal recorrente, e atraso de crescimento intrauterino; um exemplo adicional é sindrome paraneoplásico secundária aos neoplasmas ginecológicos; distúrbios reprodutores masculinos, tais como sindrome paraneoplásica secundária aos neoplasmas testiculares; e distúrbios derivados do transplante, tais como rejeição de aloenxerto e xenoenxerto, e doença do enxerto-versus-hospedeiro. 0 anticorpo pode ser também administrado profilaticamente de modo a se reduzir o risco de desenvolvimento de cancro, tal como um distúrbio tumorigénico como descrito acima, atrasar o inicio da ocorrência de um evento em tal progressão do cancro, e/ou reduzir o risco de recorrência quando um tal cancro está em remissão. Isto pode ser especialmente útil em pacientes em que é difícil localizar um tumor que se sabe que está presente devido a outros fatores biolóqicos.

As composições da presente invenção podem incluir uma "quantidade terapeuticamente aceitável" ou uma "quantidade profilaticamente eficaz" de um anticorpo para CD38 da invenção. Uma "quantidade terapeuticamente aceitável" refere-se a uma quantidade eficaz, a dosagens e durante períodos de tempo necessários, para se alcançar um resultado terapêutico. Uma quantidade terapeuticamente aceitável de um anticorpo para CD38 pode variar de acordo com fatores tais como o estado de doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo para CD38 de provocar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente aceitável é também uma na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo ou porção de anticorpo são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, a dosagens e durante períodos de tempo necessários, para se alcançar o resultado profilático desejado (p.ex., uma redução na probabilidade de desenvolvimento de um distúrbio, uma redução na intensidade ou disseminação de um distúrbio, um aumento na probabilidade de sobrevivência durante um distúrbio iminente, um atraso no inicio de uma condição de doença, etc.)· Tipicamente, porque uma dose profilática é usada em sujeitos antes de ou quando de uma etapa mais inicial da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor do que a quantidade terapeuticamente aceitável.

Uma "quantidade terapeuticamente aceitável" para terapia tumoral pode ser também medida pela sua capacidade de estabilizar a progressão da doença. A capacidade de um composto de inibir o cancro pode ser avaliada num sistema de modelo animal preditor da eficácia em tumores humanos. Alternativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada por exame da capacidade do composto de inibir o crescimento de células ou de induzir a apoptose por ensaios in vitro conhecidos do praticante perito. Uma quantidade terapeuticamente aceitável de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor, ou de outro modo melhorar sintomas num sujeito. Um com perícia ordinária seria capaz de determinar tais quantidades com base em tais fatores como o tamanho do sujeito, a gravidade dos sintomas do sujeito, e a composição ou rota de administração particular selecionada.

Uma "quantidade terapeuticamente aceitável" para a artrite reumatoide pode resultar numa Definição Preliminar de Melhoria de pelo menos ACR20 nos pacientes, tal como numa Definição Preliminar de Melhoria de pelo menos ACR50, por exemplo uma Definição Preliminar de Melhoria de ARC70. A Definição Preliminar de Melhoria ACR20 é definida como: ύ 20% de melhoria em: Contagem de Articulações Dolorosas (TJC) e Contagem de Articulações Inchadas (SJC) e ^ 20% de melhoria em 3 das seguintes 5 avaliações: Avaliação da Dor pelo Paciente (VAS), avaliação Global pelo Paciente (VAS), Avaliação Global pelo Médico (VAS), Deficiência Autoavaliada pelo Paciente (HAQ), Reagente de Fase Aguda (CRP ou ESR). ACRso e ACR70 são definidos do mesmo modo com > 50% e > 70% de melhorias, respetivamente. Para detalhes adicionais ver Felson et al., em American College of Rheumatology Preliminary Definition of Improvement in Rheumatoid Arthritis; Arthritis Rheumatism 38, 727-735 (1995).

Alternativamente, uma quantidade terapeuticamente aceitável para a artrite reumatoide pode ser medida por DAS (pontuação de atividade da doença), incluindo DAS2 8 e/ou DAS56, como definido por EULAR.

Os regimes de dosagem são ajustados para proporcionarem a resposta desejada ótima (p.ex., uma resposta terapêutica). Por exemplo pode ser administrado um único bólus, podem ser administradas várias doses divididas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. As composições parenterais podem ser formuladas em forma de unidade unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma de dosagem unitária como usada aqui refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os sujeitos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade pré-determinada de composto ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação ao transportador farmacêutico requerido. A especificação para as formas de dosagem unitária é ditada pelas e diretamente dependente das (a) características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a ser alcançado e (b) limitações inerentes na técnica de manipulação de um tal composto ativo para o tratamento da sensibilidade em indivíduos.

As dosagens e os regimes de dosagem eficazes para os anticorpos para CD38 da presente invenção dependem da doença ou condição a ser tratada e podem ser determinadas pelas pessoas peritas na técnica. Uma gama não limitante, exemplar para uma quantidade terapeuticamente aceitável de um composto da presente invenção é cerca de 0,1-100 mg/kg, tal como cerca de 0,1-50 mg/kg, por exemplo cerca de 0,1-20 mg/kg, tal como cerca de 0,1-10 mg/kg, por exemplo cerca de 0,5, tal como cerca de 0,3, cerca de 1, ou cerca de 3 mg/kg.

Um médico ou veterinário tendo perícia ordinária na técnica pode prontamente determinar e prescrever a quantidade eficaz da composição farmacêutica requerida. Por exemplo, o médico ou veterinário poderia iniciar doses dos anticorpos para CD38 da presente invenção empregues na composição farmacêutica a níveis mais baixos do que aqueles requeridos de modo a se alcançar o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até ser alcançado o efeito desejado. Em geral, uma dose diária adequada de uma composição da presente invenção será aquela quantidade do composto que é a dose mais baixa eficaz para produzir um efeito terapêutico. Uma tal dose eficaz dependerá geralmente dos fatores descritos acima. A administração pode ser intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, ou subcutânea, e por exemplo administrada próxima do local do alvo. Se desejado, a dose diária eficaz de uma composição farmacêutica pode ser administrada como duas, três, quatro, cinco, seis ou mais subdoses administradas separadamente a intervalos apropriados ao longo do dia, opcionalmente em formas de dosagem unitária. Embora seja possível que um composto da presente invenção seja administrado sozinho, é preferencial administrar o composto como uma composição farmacêutica como descrita acima.

Numa forma de realização, os anticorpos para CD38 da presente invenção podem ser administrados por infusão numa dosagem semanal de 10 a 500 mg/m2, tal como de 200 a 400 mg/m2. Tal administração pode ser repetida, p.ex., 1 a 8 vezes, tal como 3 a 5 vezes. A administração pode ser realizada por infusão contínua ao longo de um período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas.

Numa forma de realização, os anticorpos para CD38 da presente invenção podem ser administrados por infusão contínua lenta ao longo de um longo período, tal como mais do que 24 horas, de modo a se reduzirem os efeitos secundários tóxicos.

Numa forma de realização, os anticorpos para CD38 da presente invenção podem ser administrados numa dosagem semanal de 250 mg a 2000 mg, tal como por exemplo 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg ou 2000 mg, durante até 8 vezes, tal como de 4 a 6 vezes. A administração pode ser realizada por infusão contínua ao longo de um período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas. Tal regime pode ser repetido uma ou mais vezes como necessário, por exemplo, após 6 meses ou 12 meses. A dosagem pode ser determinada ou ajustada por medição da quantidade de composto da presente invenção no sangue após administração por por exemplo retirada de uma amostra biológica e usado de anticorpos anti-idiotípicos que visam a região de ligação ao antigénio dos anticorpos para CD38 da presente invenção.

Numa forma de realização, os anticorpos para CD38 da presente invenção podem ser administrados por terapia de manutenção, tal como, p.ex., uma vez por semana durante um periodo de 6 meses ou mais.

Numa forma de realização, os anticorpos para CD38 da presente invenção podem ser administrados por um regime incluindo uma infusão de um anticorpo para CD38 da presente invenção seguido por uma infusão de um anticorpo para CD38 da presente invenção conjugado a um radioisótopo. 0 regime pode ser repetido, p.ex., 7 a 9 dias mais tarde.

Como exemplos não limitantes, o tratamento de acordo com a presente invenção pode ser proporcionado como um dosagem diária de um anticorpo da presente invenção numa quantidade de cerca de 0,1-100 mg/kg, tal como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 mg/kg, por dia, em pelo menos um de dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40, ou, alternativamente, pelo menos uma de semana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 após inicio do tratamento, ou qualquer sua combinação, usando doses únicas ou divididas de a cada 24, 12, 8, 6, 4, ou 2 horas, ou qualquer sua combinação.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser também administradas em terapia de combinação, i.e., combinadas com outros agentes terapêuticos relevantes para a doença ou condição a ser tratada. Tal administração pode ser simultânea, separada ou sequencial. Para administração simultânea, os agentes podem ser administrados como uma composição ou como composições separadas, como apropriado.

Conformemente, a presente invenção proporciona anticorpos da presente invenção para uso em métodos para tratamento de um distúrbio envolvendo células expressando CD38 como descrito acima, cujos métodos compreendem administração de um CD38BP da presente invenção combinado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais como descritos em baixo.

Os anticorpos da presente invenção podem ser usados para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com pelo menos um agente quimioterapêutico para um distúrbio envolvendo células expressando CD38 como descrito acima. A terapia de combinação pode incluir administração de uma composição da presente invenção em conjunto com pelo menos um agente quimioterapêutico, pelo menos um agente anti-inflamatório, ou pelo menos um agente imunossupressor e/ou imunomodulador.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um anticorpo da invenção para uso num método para tratamento de um distúrbio envolvendo células expressando CD38 num sujeito, cujo método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente aceitável do anticorpo e pelo menos um agente quimioterapêutico a um sujeito com sua necessidade.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um anticorpo da invenção para uso num método para tratamento do mieloma múltiplo, cujo método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente aceitável do anticorpo e pelo menos um agente quimioterapêutico a um sujeito com sua necessidade.

Numa forma de realização, os anticorpos da presente invenção são usados para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com pelo menos um agente quimioterapêutico para tratamento do mieloma múltiplo.

Numa forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser selecionado de um antimetabolito, tal como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo, decarbazina, hidroxiureia, asparaginase, gemcitabina, cladribina e agentes similares.

Numa forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser selecionado de um agente alquilante, tal como mecloretamina, tioepa, clorambucil, mefalano, carmustina (BSNU), Iomustina (CCNU), ciclofosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatina e outros derivados de platina, tais como carboplatina, e agentes similares.

Numa forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser selecionado de um antibiótico, tal como dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, daunorrubicina (anteriormente daunomicina), doxorrubicina, idarrubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC) e agentes similares.

Numa forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser selecionado de um agente antimitótico, tal como taxanos, por exemplo docetaxel, e paclitaxel, e vinca alcaloides, por exemplo vindesina, vincristina, vinblastina e vinorelbina.

Numa forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser selecionado de um inibidor da topoisomerase, tal como topotecano.

Numa forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser selecionado de um inibidor de fatores de crescimento, tal como um inibidor de ErbBl (EGFR) (tal como gefitinib (Iressa®), cetuximab (Erbitux®) , erlotinib (Tarceva®) , HuMax-EGFr (2F8 divulgado em WO 2002/100348) e agentes similares), um inibidor de ErbB2 (Her2/neu) (tal como trastuzumab (Herceptin®) e agentes similares) e agentes similares. Numa forma de realização, um tal inibidor de fatores de crescimento pode ser um inibidor de farnesil transferase, tal como SCH-66336 e R115777. Numa forma de realização, um tal inibidor de fatores de crescimento pode ser um inibidor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), tal como bevacizumab (Avastin®) .

Numa forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser um inibidor da tirosina cinase, tal como imatinib (Glivec, Gleevec STI571), lapatinib, PTK787/ZK222584 e agentes similares.

Numa forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser um inibidor de histona deacetilase. Exemplos de tais inibidores de histona deacetilase incluem compostos polares híbridos à base de ácidos hidroxâmicos, tais como SAHA (ácido hidroxâmico de suberoílanilida).

Numa forma de realização, um tal agente quimioterapêutico pode ser um inibidor de P38a MAP cinase, tal como SCIO-469.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona anticorpos da invenção para uso num método para tratamento de um distúrbio envolvendo células expressando CD38 num sujeito, cujo método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente aceitável do anticorpo e pelo menos um inibidor da angiogénese, neovascularização, e/ou outra vascularização a um sujeito com sua necessidade

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona anticorpos da invenção para uso num método para tratamento do mieloma múltiplo, cujo método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente aceitável de um anticorpo para CD38 da presente invenção e pelo menos um inibidor da angiogénese, neovascularização, e/ou outra vascularização a um sujeito com sua necessidade.

Numa forma de realização, os anticorpos da presente invenção podem ser usados para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com pelo menos um inibidor da angiogénese, neovascularização, e/ou outra vascularização para tratamento do mieloma múltiplo.

Exemplos de tais inibidores da angiogénese são inibidores de urocinase, inibidores de metaloprotease de matriz (tais como marimastat, neovastat, BAY 12-9566, AG 3340, BMS-275291 e agentes similares), inibidores de migração e proliferação de células endoteliais (tais como TNP-470, esqualamina, 2-metoxiestradiol, combretastatinas, endostatina, angiostatina, penicilamina, SCH66336 (Schering-Plough Corp, Madison, NJ) , R115777 (Janssen Pharmaceutica, Inc, Titusville, NJ) e agentes similares), antagonistas de fatores de crescimento angiogénico (tais como ZD6474, SU6668, anticorpos contra agentes angiogénicos e/ou seus recetores (tais como VEGF, bFGF, e angiopoietina-1), talidomida (Thalomid®) , análogos de talidomida (tais como CC-5013 (lenalidomida, Revlimid™) e CC4047 (Actimid™), Sugen 5416, SU5402, ribozima antiangiogénica (tal como angiozima), interferão a (tal como interferão a2a) , suramina e agentes similares), inibidores de VEGF-R cinase e outros inibidores de tirosina cinase antiangiogénica (tais como SU011248), inibidores de integrina específica endotelial/sinalização de sobrevivência (tais como vitaxina e agentes similares), antagonistas/quelantes de cobre (tais como tetratiomolibdato, captopril e agentes similares), carboxiamido-triazol (CAI), ABT-627, CM101, interleucina-12 (IL-12), IM862, PNU145156E bem como moléculas de nucleótidos inibindo a angiogénese (tais como DNA antissenso de VEGF, cDNA codificando angiostatina, cDNA codificando p53 e cDNA codificando recetor de VEGF 2 recipiente) e agentes similares.

Outros exemplos de tais inibidores da angiogénese, neovascularização, e/ou outra vascularização são derivados de heparina antiangiogénica e moléculas relacionadas (p.ex., heperinase III), temozolomida, NK4, fator inibidor da migração de macrófagos (MIF), inibidores de ciclo-oxigenase-2, inibidores de fator induzível pela hipóxia 1, isoflavonas de soja antiangiogénicas, oltipraz, fumagilina e seus análogos, análogos de somatostatina, polissulfato de pentosano, tecogalano sódico, dalteparina, tumstatina, trombospondina, NM-3, combrestatina, canstatina, avastatina, anticorpos contra outros alvos relevantes (tais como mAbs anti-alfa-v/beta-3 integrina e antiquininostatina) e agentes similares.

Numa forma de realização, os anticorpos da presente invenção podem ser usados para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com talidomida (Thalomid®) , análogos da talidomida (tais como CC-5013 (lenalidomida, Revlimid™) e/ou CC4047 (Actimid™)). Numa forma de realização adicional, os anticorpos da presente invenção podem ser usados para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com talidomida.

Numa forma de realização, os anticorpos da presente invenção podem ser usados para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com um anticorpo anti-CD20, tal como rituximab (Rituxan®, Mabthera®) , um anticorpo anti-CD20 monoclonal humano como divulgado em WO 2004/035607, tal como 11B8, 2F2 ou 7D8.

Numa forma de realização, um agente terapêutico para uso em combinação com os anticorpos para CD38 da presente invenção para tratamento dos distúrbios como descritos acima pode ser um inibidor do proteassoma, tal como bortezomib (Velcade®) .

Numa forma de realização, um agente terapêutico para uso em combinação com os anticorpos para CD38 da presente invenção para tratamento dos distúrbios como descritos acima pode ser um corticosteroide, tal como prednisona, prednisolona, dexametasona, etc.

Numa forma de realização, um agente terapêutico para uso em combinação com os anticorpos para CD38 da presente invenção para tratamento dos distúrbios como descritos acima pode ser um imunogénio anticancerigeno, tal como um antigénio cancerigeno/antigénio associado a tumor (p.ex., molécula de adesão de células epiteliais (EpCAM/TACSTDl mucina 1 (MUC1), antigénio carcinoembriónico (CEA), glicoproteina associada a tumor 72 (TAG-72), gplOO, Melan-A, MART-1, KDR, RCAS1, MDA7, vacinas virais associadas a cancro (p.ex., vacinas contra o papilomavírus humano), proteinas de chogue térmico derivadas de tumor, e agentes similares. Um número de outros antigénios cancerígenos/antigénios associados a tumor adequados descrito noutro lugar aqui e moléculas similares conhecidas na técnica pode também ou alternativamente ser usado em tal forma de realização. Péptidos imunogénicos anticancerígenos incluem também "vacinas" anti-idiotípicas tais como anticorpos anti-idiotípicos BEC2, Mitumomab, CeaVac e anticorpos anti-idiotípicos relacionados, anticorpo anti-idiotípico para anticorpo MG7, e outros anticorpos anti-idiotipicos anticancerigenos (ver por exemplo Birebent et al., Vaccine. 21 (15), 1601-12 (2003), Li et al., Chin Med J (Engl). 114 (9), 962-6 (2001), Schmitt et al., Hybridoma. 13 (5), 389- 96 (1994), Maloney et al., Hybridoma. 4 (3), 191-209 (1985) , Raychardhuri et al., J Immunol. 137 (5), 1743-9 (1986) , Pohl et al., Int J Câncer. 50 (6), 958-67 (1992), Bohlen et al., Cytokines Mol Ther. 2 (4), 231-8 (1996) e Maruyama, J Immunol Methods. 264 (1-2), 121-33 (2002)).

Tais Abs anti-idiotipicos podem ser opcionalmente conjugados a um transportador, que pode ser um transportador de molécula sintética (tipicamente inerte), uma proteína (por exemplo hemocianina da lapa californiana (KLH) (ver por exemplo Ochi et al., Eur J Immunol. 17 (11), 1645-8 (1987)), ou uma célula (por exemplo um glóbulo vermelho - ver por exemplo Wi et al., J Immunol Methods. 122 (2), 227-34 (1989)).

Numa forma de realização, um agente terapêutico para uso em combinação com os anticorpos para CD38 da presente invenção para tratamento dos distúrbios como descritos acima pode ser um bisfosfonato. Exemplos de bifosfonatos potencialmente adequados são pamidronato (Aredia®) , ácido zoledrónico (Zometa®) , clodronato (Bonefos®) , risendronato (Actonel®) , ibandronato (Boniva®) , etidronato (Didronel®) , alendronato (Fosamax®) , tiludronato (Skelid®) , incadronato (Yamanouchi Pharmaceutical) e minodronato (YM529, Yamanouchi).

Numa forma de realização, um agente terapêutico para uso em combinação com os anticorpos para CD38 da presente invenção para tratamento dos distúrbios como descritos acima pode ser um fator estimulador de colónias. Exemplos de fatores estimuladores de colónias adequadas são fatores estimuladores de colónias de granulócitos (G-CSF), tais como filgrastim (Neupogen®) e pegfilgrastim (Neulasta®) , e fatores estimuladores de colónias de granulócitos macrófagos (GM-CSF) tais como sargramostim (Leukine®) .

Numa forma de realização, um agente terapêutico para uso em combinação com os anticorpos para CD38 da presente invenção para tratamento dos distúrbios como descritos acima pode ser um agente eritropoiético. Exemplos de agentes eritropoiéticos adequados são eritropoietina (EPO), tal como epoetina alfa (por exemplo Procrit®, Epogen®, e Eprex®) e epoetina beta (por exemplo NeoRecormon®) e proteínas estimuladoras da eritropoiese (por exemplo Aranesp®) .

Numa forma de realização, um agente terapêutico para uso em combinação com os anticorpos para CD38 da presente invenção para tratamento dos distúrbios como descritos acima pode ser uma citocina anticancerígena, quimiocina, ou sua combinação. Exemplos de citocinas e fatores de crescimento adequados incluem IFNy, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNa (p.ex., INFa2b), IFN3, GM-CSF, CD40L, ligando Flt3, fator de células estaminais, ancestim e TNFa. Quimiocinas adequadas incluem também quimiocinas negativas quanto a Glu-Leu-Arg (ELR) tais como IP-10, MCP-3, MIG, e SDF-Ια das famílias CXC e C-C humanas. Citocinas adequadas incluem derivados de citocina, variantes de citocina, fragmentos de citocina, e proteínas de fusão de citocina.

Estes e outros métodos ou usos envolvendo ácidos nucleicos codificando péptidos ocorrendo naturalmente aqui podem alternativamente ou adicionalmente ser realizados por técnicas de "ativação de genes" e sobrerregulação de genes de recombinação homóloga, tais como estão descritas em US 5,968,502, US 6,063,630 e US 6,187,305 e EP 0505500.

Numa forma de realização, um agente terapêutico para uso em combinação com os anticorpos para CD38 da presente invenção para tratamento dos distúrbios como descritos acima pode ser um agente que modula, p.ex., intensifica ou inibe, a expressão ou atividade de recetores Fca ou Fcy. Exemplos de agentes adequados para este uso incluem interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), fator estimulador de colónias de granulócitos (G-CSF), tal como filgrastim (Neupogen®) e pegfilgrastim (Neulasta®) , e fatores estimuladores de colónias de granulócitos macrófagos (GM-CSF) tais como sargramostim (Leukine®) , interferão-γ (IFN-γ), e fator de necrose tumoral (TNF).

Numa forma de realização, um agente terapêutico para uso em combinação com os anticorpos para CD38 da presente invenção para tratamento dos distúrbios como descritos acima pode ser um regulador de controlo do ciclo celular/apoptose (ou "agente regulador"). Um regulador do controlo do ciclo celular/apoptose pode incluir moléculas (i) que visam e modulam reguladores de controlo do ciclo celular/apoptose tais como cdc-25 (tal como NSC 663284), (ii) cinases dependentes de ciclina que sobre-estimulam o ciclo celular (tais como flavopiridol (L868275, HMR1275), 7-hidroxistaurosporina (UCN-01, KW-2401), e roscovitina (R-roscovitina, CYC202)), e (iii) moduladores da telomerase (tais como BIBR1532, SOT-095, GRN163 e composições descritas em por exemplo US 6,440,735 e US 6,713,055). Exemplos não limitantes de moléculas que interferem com vias apoptóticas incluem ligado indutor da apoptose relacionado com TNF (TRAIL)/ ligando de apoptose 2 (Apo-2L), agentes induzindo bloqueio de NF-κΒ levando à inibição de produção de IL-6, anticorpos que ativam recetores TRAIL, IFNs, Bcl-2 antissenso, e AS2O3 (trióxido arsénico, Trisenox®) .

Numa forma de realização, um agente terapêutico para uso em combinação com os anticorpos para CD38 da presente invenção para tratamento dos distúrbios como descritos acima pode ser um agente regulador hormonal, tal como agentes úteis para terapia antiandrogénica e antiestrogénica. Exemplos de tais agentes reguladores hormonais são tamoxifeno, idoxifeno, fulvestrant, droloxifeno, toremifeno, raloxifeno, dietilstilbestrol, estradiol de etinilo/estinilo, um antiandrogénio (tal como flutaminda/eulexina), uma progestina (tal como caproato de hidroxi-progesterona, medroxiprogesterona/provera, acepato de megestrol/megace), um adrenocorticosteroide (tal como hidrocortisona, prednisona), hormona luteinizante libertadora de hormonas (e seus análogos e outros agonistas de LHRH tais como buserelina e goserelina) , um inibidor da aromatase (tal como anastrazol/arimidex, aminoglutetimida/citradeno, exemestano), um inibidor de hormonas (tal como octreotideo/sandostatina) e agentes similares.

Numa forma de realização, um agente terapêutico para uso em combinação com os anticorpos para CD38 da presente invenção para tratamento dos distúrbios como descritos acima pode ser um agente antianérgico (por exemplo compostos de pequena molécula, proteínas, glicoproteínas, ou anticorpos que quebram a tolerância a antigénios tumorais e cancerígenos). Exemplos de tais compostos são moléculas que bloqueiam a atividade de CTLA-4, tais como MDX-010 (Phan et al., PNAS USA 100, 8372 (2003)).

Numa forma de realização, um agente terapêutico para uso em combinação com os anticorpos para CD38 da presente invenção para tratamento dos distúrbios como descritos acima pode ser um ácido nucleico ou vetor contendo genes supressores de tumor tais como um adenovirus deficiente em replicação codificando p53/SCH58500 de tipo selvagem recombinante humano, etc.; ácidos nucleicos antissenso dirigidos para oncogenes, genes mutados, ou desregulados; ou siRNA dirigidos para genes mutados ou desregulados. Exemplos de alvos supressores de tumor incluem, por exemplo, BRCA1, RB1, BRCA2, DPC4 (Smad4), MSH2, MLH1 e DCC.

Numa forma de realização, um agente terapêutico para uso em combinação com os anticorpos para CD38 da presente invenção para tratamento dos distúrbios como descritos acima pode ser um ácido nucleico anticancerigeno, tal como genassenso (augmeroseno/G3139), LY900003 (ISIS 3521), ISIS 2503, OGX-011 (ISIS 112989), LE-AON/LEraf-AON (oligonucleótido antissenso c-raf encapsulado em lipossomas/ISIS-5132), MG98, e outros ácidos nucleicos antissenso que visam PKCa, clusterina, IGFBPs, proteina cinase A, ciclina Dl, ou Bcl-2h.

Numa forma de realização, um agente terapêutico para uso em combinação com os anticorpos para CD38 da presente invenção para tratamento dos distúrbios como descritos acima pode ser uma molécula de RNA inibidora anticancerigena (ver por exemplo Lin et al., Curr Câncer Drug Targets. 1 (3), 241-7 (2001), Errata em: Curr Câncer Drug Targets. 3 (3), 237 (2003) , Lima et al., Câncer Gene Ther. 11 (5), 309-16 (2004) , Grzmil et al., Int J Oncol. 4 (1), 97-105 (2004), Collis et al., Int J Radiat Oncol Blol Phys. 57 (2 Supl) , S144 (2003), Yang et al., Oncogene. 22 (36), 5694-701 (2003) e Zhang et al., Biochem Biophys Res Commun. 303 (4), 1169-78 (2003)) .

As composições e métodos de administração de combinação da presente invenção incluem também a administração de vacinas de ácido nucleico, tais como vacinas de DNA nu codificando tais antigénios cancerigenos/antigénios associados a tumor (ver por exemplo US 5,589,466, US 5,593,972, US 5,703,057, US 5,879,687, US 6,235,523, e US 6,387,888). Numa forma de realização, o método de administração de combinação e/ou composição de combinação compreende uma composição de vacina autóloga. Numa forma de realização, a composição de combinação e/ou método de administração de combinação compreende uma vacina de células inteiras ou célula expressando citocinas (por exemplo um fibroblasto expressando IL-2 recombinante, célula dendritica expressando citocinas recombinantes, e similares) (ver por exemplo Kowalczyk et al., Acta Biochim Pol. 50 (3), 613-24 (2003), Reilly et al., Methods Mol Med. 69, 233-57 (2002) e Tirapu et al., Curr Gene Ther. 2 (1), 79-89 (2002)). Outro exemplo de uma abordagem de células autólogas que pode ser útil em métodos de combinação da presente invenção é o método de Imunoterapia Personalizada MyVax® (previamente referido como GTOP-99) (Genitope Corporation - Redwood City, CA, EUA).

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona composições de combinação e métodos de administração de combinação em que um anticorpo para CD38 da invenção é combinado ou coadministrado com um virus, proteínas virais, e similares. Vírus deficientes na replicação, que são geralmente capazes de uma ou somente algumas rondas de replicação in vivo, e que são dirigidos para células alvo, podem por exemplo ser componentes úteis de tais composições e métodos. Tais agentes virais podem compreender ou ser associados a ácidos nucleicos codificando imunoestimulantes, tais como GM-CSF e/ou IL-2. Tanto vírus naturalmente oncolíticos como tais oncolíticos recombinantes (por exemplo vírus HSV-1, reovírus, adenovírus deficiente na replicação e sensível à replicação, etc.) podem ser componentes úteis de tais métodos e composições. Conformemente, numa forma de realização, a presente invenção proporciona composições de combinação e métodos de administração de combinação em que um anticorpo para CD38 da invenção é combinado ou coadministrado com um vírus oncolítico. Exemplos de tais vírus incluem adenovírus oncolíticos e vírus da herpes, que podem ou não ser vírus modificados (ver por exemplo Shah et al., J Neurooncol. 65 (3), 203-26 (2003), Stiles et al., Surgery. 134 (2), 357-64 (2003), Sunarmura et al., Pancreas. 28 (3), 326-9 (2004), Teshigahara et al., J Surg Oncol. 85 (1), 42-7 (2004), Varghese et al., Câncer Gene Ther. 9 (12), 967-78 (2002), Wildner et al., Câncer Res. 59 (2), 410-3 (1999), Yamanaka, Int J Oncol. 24 (4), 919-23 (2004) e Zwiebel et al., Semin Oncol. 28 (4), 336-43 (2001)) .

As composições de combinação e métodos de administração de combinação envolvendo anticorpos da presente invenção podem também envolver métodos de imunoterapia de "células inteiras" e "adotiva". Por exemplo, tais métodos podem compreender infusão ou reinfusão de células do sistema imune (por exemplo linfócitos infiltrantes de tumores (TILs) , tais como células T CD4+ e/ou CD8+ (por exemplo células T expandidas com antigénios específicos quanto a tumor e/ou intensificações genéticas), células B expressando anticorpos ou outras células produtoras/apresentadoras de anticorpos, células dendriticas (p.ex., células dendríticas recombinantes expressando anticitocinas, células dendriticas cultivadas com um agente de expansão de DC tais como GM-CSF e/ou Flt3-L, e/ou células dendriticas carregadas com antigénios associados a tumor), células NK antitumorais, assim chamadas células híbridas, ou suas combinações. Lisatos de células podem ser também úteis em tais métodos e composições. "Vacinas" celulares em ensaios clínicos que podem ser úteis em tais aspetos incluem Canvaxin™, APC-8015 (Dendreon), HSPPC-96 (Antigenics) , e lisatos de células Melacine®. Antigénios derramados de células cancerígenas, e suas misturas (ver por exemplo Bystryn et ai., Clinicai Câncer Research Vol. 7, 1882-1887, julho 2001), opcionalmente misturados com adjuvantes tais como alúmen, podem ser também componentes em tais métodos e composições de combinação.

Numa forma de realização, um anticorpo para CD38 da presente invenção pode ser administrado a um paciente em combinação com a aplicação de um método de vacinação interna. Vacinação interna refere-se a morte induzida de células tumorais ou cancerígenas, tal como morte de células induzida por fármacos ou induzida por radiação de células tumorais, num paciente, que leva tipicamente à provocação de uma resposta imune dirigida contra (i) as células tumorais como um todo ou (ii) partes das células tumorais incluindo (a) proteínas, glicoproteínas ou outros produtos secretados, (b) proteínas ou glicoproteínas associadas à membrana ou outros componentes associados a ou inseridos em membranas, e/ou (c) proteínas intracelulares ou outros componentes intracelulares. Uma resposta imune induzida por vacinação interna pode ser humoral (i.e. anticorpo -mediada pelo complemento) ou mediada por células (p.ex., o desenvolvimento e/ou aumento de linfócitos T citotóxicos endógenos que reconhecem as células tumorais internamente mortas ou suas partes). Adicionalmente à radioterapia, exemplos não limitantes de fármacos e agentes que podem ser úteis para induzir a referida morte de células tumorais e vacinação interna são agentes quimioterapêuticos convencionais, inibidores do ciclo celular, fármacos antiangiogénese, anticorpos monoclonais, agentes indutores da apoptose, e inibidores da transdução de sinal.

Exemplos de outros agentes anticancerigenos, que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para uso em combinação com os anticorpos para CD38 da presente invenção para tratamento dos distúrbios como descritos acima, são agentes indutores da diferenciação, ácido retinoico e análogos de ácido retinoico (tais como ácido retinoico todo trans, ácido retinoico 13-cis e agentes similares), análogos de vitamina D (tais como seocalcitol e agentes similares), inibidores de ErbB3, ErbB4, IGF-IR, recetor de insulina, PDGFRa, PDGFRbeta, Flk2, Flt4, FGFRl, FGFR2, FGFR3, FGFR4, TRKA, TRKC, c-met, Ron, Sea, Tie, Tie2, Eph, Ret, Ros, Alk, LTK, PTK7 e agentes similares.

Exemplos de outros agentes anticancerigenos, que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para uso em combinação com os anticorpos para CD38 da presente invenção para tratamento dos distúrbios como descritos acima, são catepsina B, moduladores da atividade de catepsina D desidrogenase, glutationa-S-transferase (tal como glutacilcisteina sintetase e lactato desidrogenase), e agentes similares.

Exemplos de outros agentes anticancerigenos, que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para uso em combinação com os anticorpos para CD38 da presente invenção para tratamento dos distúrbios como descritos acima, são estramustina e epirrubicina.

Exemplos de outros agentes anticancerígenos, que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para uso em combinação com os anticorpos para CD38 da presente invenção para tratamento dos distúrbios como descritos acima, são um inibidor de HSP90 como geldanamicina de amino de 17-alilo, anticorpos dirigidos contra um antigénio tumoral tal como PSA, CA125, KSA, etc., integrinas como integrina βΐ, inibidores de VCAM e agentes similares.

Exemplos de outros agentes anticancerígenos, que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para uso em combinação com os anticorpos para CD38 da presente invenção para tratamento dos distúrbios como descritos acima, são inibidores de calcineurina (tais como valspodar, PSC 833 e outros inibidores de MDR-1 ou p-glicoproteína), inibidores de TOR (tais como sirolimus, everolimus e rapamicina), e inibidores de mecanismos de "homing de linfócitos" (tais como FTY720), e agentes com efeitos na sinalização de células tais como inibidores de moléculas de adesão (por exemplo anti-LFA, etc.).

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um anticorpo da invenção para uso num método para tratamento de um distúrbio envolvendo células expressando CD38 num sujeito, cujo método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente aceitável do anticorpo e radioterapia a um sujeito com sua necessidade.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um anticorpo da invenção para uso num método para tratamento do mieloma múltiplo, cujo método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente aceitável do anticorpo e radioterapia a um sujeito com sua necessidade.

Numa forma de realização, os anticorpos da presente invenção podem ser usados para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com radioterapia para tratamento do múltiplo. A radioterapia pode compreender radiação ou administração associada de radiofarmacêuticos a um paciente é proporcionada. A fonte de radiação pode ser externa ou interna ao paciente sendo tratado (o tratamento de radiação pode, por exemplo, ser na forma de terapia de radiação com feixes externos (EBRT), braquiterapia (BT) ou radioterapia dirigida esquelética). Elementos radioativos que podem ser usados na prática de tais métodos incluem, p.ex., rádio, césio-137, irídio-192, americio-241, ouro-198, cobalto-57, cobre-67, tecnécio-99, iodo-123, iodo-131, e índio-111.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um anticorpo da presente invenção para uso num método para tratamento de um distúrbio envolvendo células expressando CD38 num sujeito, cujo método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente aceitável do anticorpo a um sujeito com sua necessidade combinada com transplante de células estaminais periféricas autólogas ou medula óssea.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um anticorpo da presente invenção para uso num método para tratamento do mieloma múltiplo, cujo método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente aceitável do anticorpo a um sujeito com sua necessidade combinada com transplante de células estaminais periféricas autólogas ou medula óssea.

Numa forma de realização, os anticorpos da presente invenção podem ser usados para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com transplante de células estaminais periféricas autólogas ou medula óssea para tratamento do mieloma múltiplo.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um anticorpo da presente invenção para uso num método para tratamento de um distúrbio envolvendo células expressando CD38 num sujeito, cujo método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente aceitável do anticorpo a um sujeito com sua necessidade combinada com intervenção ortopédica.

Numa forma de realização, os anticorpos da presente invenção podem ser usados para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com transplante de células estaminais periféricas autólogas ou medula óssea para tratamento do mieloma múltiplo.

As intervenções ortopédicas podem ser usadas no tratamento de um distúrbio envolvendo células expressando CD38, tal como mieloma múltiplo, para ajudar a controlar a dor ou reter a função ou mobilidade. Tais intervenções podem incluir terapia fisica, talas de ossos para prevenir ou tratar fraturas, ou procedimentos cirúrgicos (grandes ou pequenos) para reparar fraturas.

Numa forma de realização, um anticorpo para CD38 da presente invenção pode ser administrado em conexão com a administração de um ou mais agentes que promovem o acesso ao anticorpo ou composição de combinação ao interior de um tumor. Tais métodos podem por exemplo ser realizados em associação à administração de uma relaxina, que é capaz de relaxar um tumor (ver por exemplo US 6,719,977). Numa forma de realização, um anticorpo para CD38 da presente invenção pode ser ligado a um péptido penetrante de células (CPP). Péptidos penetrantes de células e péptidos relacionados (tais como anticorpos penetrantes de células manipuladas) estão descritos em por exemplo Zhao et al., J Immunol Methods. 254 (1-2), 137-45 (2001), Hong et ai., Câncer Res. 60 (23), 6551-6 (2000), Lindgren et al., Biochem J. 377 (Pt 1), 69-76 (2004), Buerger et ai., J Câncer Res Clin Oncol. 129 (12), 669-75 (2003), Pooga et ai., FASEB J. 12 (1), 67-77 (1998) e Tseng et ai., Mol Pharmacol. 62 (4), 864-72 (2002).

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um anticorpo da presente invenção para uso num método para tratamento de um distúrbio envolvendo células expressando CD38 num sujeito, cujo método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente aceitável do anticorpo e pelo menos um agente anti-inflamatório a um sujeito com sua necessidade.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um anticorpo da presente invenção para uso num método para tratamento do mieloma múltiplo, cujo método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente aceitável do anticorpo e pelo menos um agente anti-inflamatório a um sujeito com sua necessidade.

Numa forma de realização, os anticorpos da presente invenção podem ser usados para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com pelo menos um agente anti-inflamatório para tratamento do mieloma múltiplo.

Numa forma de realização, um tal agente anti-inflamatório pode ser selecionado de um fármaco esteroide e um NSAID (fármaco anti-inflamatório não esteroide).

Numa forma de realização, um tal agente anti-inflamatório pode ser selecionado de aspirina e outros salicilatos, inibidores de Cox-2 (tais como rofecoxib e celecoxib), NSAIDs (tais como ibuprofeno, fenoprofeno, naproxeno, sulindac, diclofenac, piroxicam, cetoprofeno, diflunisal, nabumetona, etodolac, oxaprozina, e indometacina), anticorpos anti-IL6R, anticorpos anti-IL8, anticorpos anti-IL15, anticorpos anti-IL15R, anticorpos anti-CD4, anticorpos anti-CDlla (p.ex., efalizumab), anticorpos anti-alfa-4/beta-l integrina (VLA4) (p.ex., natalizumab), CTLA4-Ig para o tratamento de doenças inflamatórias, prednisolona, prednisona, fármacos antirreumáticos modificadores de doença (DMARDs) tais como metotrexato, hidroxicloroquina, sulfasalazina, inibidores da síntese de pirimidina (tais como leflunomida), agentes de bloqueio de recetores de IL-1 (tais como anakinra), agentes de bloqueio de TNF-α (tais como etanercept, infliximab, e adalimumab) e agentes similares.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um anticorpo da presente invenção para uso num método para tratamento de um distúrbio envolvendo células expressando CD38 num sujeito, cujo método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente aceitável do anticorpo e pelo menos um agente imunossupressor e/ou imunomodulador a um sujeito com sua necessidade.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um anticorpo da presente invenção para uso num método para tratamento do mieloma múltiplo, cujo método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente aceitável do anticorpo e pelo menos um agente imunossupressor e/ou imunomodulador a um sujeito com sua necessidade.

Numa forma de realização, os anticorpos da presente invenção podem ser usados para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com pelo menos um agente imunossupressor e/ou imunomodulador para tratamento do mieloma múltiplo.

Numa forma de realização, um tal agente imunossupressor e/ou imunomodulador pode ser selecionado de ciclosporina, azatioprina, ácido micofenólico, micofenolato de mofetil, corticosteroides tais como prednisona, metotrexato, sais de ouro, sulfassalazina, antimaláricos, brequinar, leflunomida, mizoribina, 15-deoxispergualina, 6-mercaptopurina, ciclofosfamida, rapamicina, tacrolimus (FK-506), OKT3, globulina antitimócitos, timopentina, timosina-oí e agentes similares.

Numa forma de realização, um tal agente imunossupressor e/ou imunomodulador pode ser selecionado de anticorpos imunossupressores, tais como anticorpos ligando-se a p75 do recetor de IL-2, ou anticorpos ligando-se a exemplo MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD28, B7, CD40, CD45, IFNy, TNF-α, IL-4, IL-5, IL-6R, IL-6; IGF, IGFR1, IL-7, IL-8, IL-10, CDlla, ou CD58, ou anticorpos ligando-se aos seus ligandos.

Numa forma de realização, um tal agente imunossupressor e/ou imunomodulador pode ser selecionado de IL-15R solúvel, IL-10, moléculas B7 (B7-1, B7-2, suas variantes, e seus fragmentos), ICOS, e 0X40, um inibidor de um regulador de células T negativas (tal como um anticorpo contra CTLA4) e agentes similares.

Os CD38BPs da presente invenção podem ser administrados em combinação com dois ou mais agentes imunossupressores e/ou imunomoduladores, tal como em combinação com prednisona e ciclosporina; prednisona, ciclosporina e azatioprina; ou prednisona, ciclosporina e micofenolato de mofetil.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um anticorpo da presente invenção para uso num método para tratamento de um distúrbio envolvendo células expressando CD38 num sujeito, cujo método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente aceitável do anticorpo e um anticorpo anti-C3b(i) a um sujeito com sua necessidade.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um anticorpo da presente invenção para uso num método para tratamento do mieloma múltiplo, cujo método compreende administração de uma quantidade terapeuticamente aceitável do anticorpo e um anticorpo anti-C3b(i) a um sujeito com sua necessidade.

Numa forma de realização, os anticorpos da presente invenção podem ser usados para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com um anticorpo anti-C3b(i) para tratamento do mieloma múltiplo.

Numa forma de realização, um aqente terapêutico pra uso em combinação com os anticorpos para CD38 da presente invenção para tratamento dos distúrbios como descritos acima pode ser selecionado de inibidores de histona deacetilase (por exemplo fenilbutirato) e/ou agentes de reparação de DNA (por exemplo enzimas de reparação de DNA e composições relacionadas tais como dimericina).

Os métodos envolvendo anticorpos da presente invenção para tratamento de um distúrbio como descrito acima compreendendo administração de uma quantidade terapeuticamente aceitável de um anticorpo para CD38 da presente invenção podem também compreender terapia fotodinâmica dirigida anticancerigena (por exemplo terapia a laser anticancerigena - que pode ser opcionalmente praticada com o uso de agente fotossensibilizante, ver, por exemplo Zhang et al., J Control Release. 93 (2), 141-50 (2003)) , terapias com ondas de som e ondas de choque anticancerigenas (ver por exemplo Kambe et al., Hum Cell. 10 (1), 87-94 (1997)), e/ou terapia nutracêutica anticancerigena (ver por exemplo Roudebush et al., Vet Clin North Am Small Anlm Pract. 34 (1), 249-69, viii (2004) e Rafi, Nutrition. 20 (1), 78-82 (2004)). Do mesmo modo, um anticorpo para CD38 da presente invenção pode ser usado para a preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de um distúrbio como descrito acima a ser administrada com terapia fotodinâmica dirigida anticancerigena (por exemplo terapia a laser anticancerigena - que pode ser opcionalmente praticada com o uso de agente fotossensibilizante, terapias com ondas de sonda e ondas de choque anticancerigenas, e/ou terapia nutracêutica anticancerigena.

Como descrita acima, uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada em terapia de combinação, i.e., combinada com um ou mais agentes relevantes para a doença ou condição a ser tratada como composições farmacêuticas separadas ou com um composto da presente invenção coformulado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais como descritos acima. Tais terapias de combinação podem requerer dosagens mais baixas do composto da presente invenção e/ou dos agentes coadministrados, evitando assim possíveis toxicidades ou complicações associadas às várias monoterapias.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um anticorpo para CD38 que é conjugado a um imunomodulador, tal como uma citocina imunomodulador, fator de crescimento de células estaminais, linfotoxina (tal como um TNF tal como TNFa), ou um fator hematopoiético. Exemplos de tais moléculas que podem ser úteis como conjugados incluem IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, e IL-21, fatores estimuladores de colónias (fator estimulador de colónias de granulócitos (G-CSF) e fator estimulador de colónias de granulócitos macrófagos (GM-CSF) ) , interferões (tais como IFNa, IFN3, e IFNy), o fator de crescimento de células estaminais designado "fator SI", eritropoietina, e trombopoietina, seus fragmentos ativos, seus derivados, suas variantes, ou uma combinação de qualquer um deles.

Numa forma de realização, os anticorpos para CD38 da presente invenção podem ser usados in vivo ou in vitro para diagnóstico de doenças em que as células ativadas expressando CD38 desempenham um papel ativo na patogénese por deteção de niveis de CD38, ou niveis de células que contêm CD28 na sua superfície da membrana. Isto pode ser alcançado, por exemplo, por contacto de uma amostra a ser testada, opcionalmente em conjunto com uma amostra de controlo, com o anticorpo sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e CD38. A formação de complexo é depois detetada (p.ex., usando um ELISA) . Quando se usa uma amostra de controlo em conjunto com a amostra de teste, o complexo é detetado em ambas as amostras e qualquer diferença estatisticamente significativa na formação de complexos entre as amostras é indicativa da presença de CD38 na amostra de teste.

Mais especificamente, os anticorpos da presente invenção proporcionam métodos para a identificação de, e diagnóstico de, células e tecidos invasores, e outras células visadas por anticorpos para CD38 da presente invenção, e para a monitorização do progresso de tratamentos terapêuticos, estado após tratamento, risco de desenvolvimento de cancro, progressão do cancro, e similares.

Num exemplo de um tal ensaio de diagnóstico, os anticorpos da presente invenção proporcionam um método de diagnóstico do nível de células invasoras num tecido compreendendo formação de um imunocomplexo entre um anticorpo para CD38 e potenciais tecidos contendo CD38, e deteção da formação do imunocomplexo, em que a formação do imunocomplexo se correlaciona com a presença de células invasoras no tecido. 0 contacto pode ser realizado in vivo, usando anticorpos isolados marcados e técnicas de imagiologia padrão, ou pode ser realizado in vitro em amostras de tecido.

Os CD38BPs, tais como anticorpos para CD38, podem ser usados para detetar péptidos e fragmentos de péptidos contendo CD38 em qualquer amostra biológica adequada por qualquer técnica adequada. Exemplos de imunoensaios convencionais proporcionados por anticorpos da presente invenção incluem, sem limitação, um ELISA, um RIA, ensaios FACS, ensaios de ressonância de plasmão, ensaios cromatográficos, imunohistoquímica de tecidos, transferência de Western, e/ou imunoprecipitação usando um CD38BP. Os anticorpos anti-CD38 da presente invenção podem ser usados para detetar CD38 e fragmentos de CD38 de humanos. Marcadores adequados para o CD38BP e/ou anticorpos secundários usados em tais técnicas incluem, sem limitação, várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, e materiais radioativos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase do rábano-silvestre, fosfatase alcalina, β-galactosidase, ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupos prostéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloreto de dansilo ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; e exemplos de material radioativo adequado incluem 125I, 131I, 35S e 3H.

Os CD38BPs, tais como anticorpos para CD38, podem ser também avaliados numa amostra biológica por um imunoensaio de competição utilizando padrões de péptido de CD38 marcados com uma substância detetável e um CD38BP não marcado, tal como um anticorpo anti-CD38 não marcado, por exemplo. Num tal ensaio, a amostra biológica, o(s) padrão (ões) de péptido de CD38 marcado (s) e o CD38BP são combinados e a quantidade de padrão de CD38 marcado ligado ao CD38BP não marcado é determinado. A quantidade de péptido de CD38 na amostra convertida é inversamente proporcional à quantidade de padrão de CD38 marcado ligado ao CD38BP.

Os anticorpos para CD38 são particularmente úteis na imagiologia in vivo de tumores. A imagiologia in vivo de tumores associada a CD38 pode ser realizada por qualquer técnica adequada. Por exemplo, a marcação com "Tc ou marcação com outro isótopo emissor de raios gama pode ser usada para marcar anticorpos anti-CD38 em tumores ou complexos anticorpo para CD38:CD38 marcados secundários (p.ex., marcados com FITC) de tumores e visualizada com uma câmara de cintilação de gama (p.ex., um dispositivo Apex 409ECT da Elscint), tipicamente usando colimador de elevada resolução, baixa energia ou um colimador para todos os propósitos de baixa energia. Os tecidos coloridos podem ser depois avaliados quanto à contagem de radioatividade como um indicador da quantidade de péptidos associados a CD38 no tumor. As imagens obtidas pelo uso de tais técnicas podem ser usadas para se avaliar a biodistribuição de CD38 num paciente, mamífero, ou tecido, por exemplo no contexto de uso de CD38 ou fragmentos de CD38 como um biomarcador quanto à presença de células cancerígenas invasivas. Variações nesta técnica podem incluir o uso de imagiologia de ressonância magnética (MRI) para melhorar a visualização em relação a técnicas com câmara de gama. Métodos e princípios de imunocintigrafia similares estão descritos em, p.ex., Srivastava (ed.), Radiolabeled Monoclonal Antibodies For Imaging And Therapy (Plenum Press 1988), Chase, "Medicai Applications of Radioisotopes", em Remington 's Pharmaceutical Sciences, 18a Edição, Gennaro et ai., (eds.), pp. 624-652 (Mack Publishing Co., 1990), e Brown, "Clinicai Use of Monoclonal Antibodies", in Biotechnology And Pharmacy 227-49, Pezzuto et al., (eds.) (Chapman & Hall 1993). Tais imagens podem ser também usadas para administração dirigida de outros agentes anticancerígenos, exemplos dos quais estão descritos aqui (p.ex., agentes apoptóticos, toxinas, ou composições de quimioterapia CHOP). Além do mais, tais imagens podem também ou alternativamente servir como a base para técnicas cirúrgicas para remover tumores. Além disso, tais técnicas de imagiologia in vivo podem permitir a identificação e localização de um tumor numa situação onde um paciente está identificado como tendo um tumor (devido à presença de outros biomarcadores, metástases, etc.), mas o tumor não pode ser identificado por técnicas analíticas tradicionais. Todos estes métodos são características de acordo com a presente invenção. A imagiologia in vivo e outros métodos de diagnóstico utilizando os anticorpos da presente invenção são particularmente úteis na deteção de micrometástases num paciente humano (p.ex., um paciente não previamente diagnosticado com cancro ou um paciente num período de recuperação/remissão de um cancro). Demonstrou-se que as células cancerígenas de carcinoma, que podem constituir até 90% de todas as células cancerígenas, por exemplo, coloram muito bem com composições de conjugado de anticorpo anti-CD38. A deteção com anticorpos anti-CD38 monoclonais e outros CD38BPs descritos aqui pode ser indicativa da presença de carcinomas que são agressivos/invasivos e também ou alternativamente proporcionar uma indicação da exequibilidade do uso de tratamentos com anticorpos anti-CD38 monoclonais relacionados, CD38BP, ou composições relacionadas contra tais micrometástases. Além do mais, os anticorpos anti-CD38 monoclonais que estão associados a células cancerígenas são vantajosamente capazes de distinguir tais tecidos e células associados a cancro de células normais com as quais outras formas de CD38 podem estar associadas.

Num método de imagiologia in vivo, um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38 da presente invenção, pode ser conjugado a um agente radio-opaco de promoção da deteção, o anticorpo conjugado é administrado a um hospedeiro, tal como por injeção na corrente sanguínea, e a presença e localização do anticorpo marcado no hospedeiro é avaliada. Através desta técnica e qualquer outro método de diagnóstico descrito aqui é proporcionado aqui um método para rastreio quanto à presença de células relacionadas com doença num paciente humano ou uma amostra biológica retirada de um paciente humano.

Para imagiologia de diagnóstico, radioisótopos podem ser ligados a um CD38BP, tal como anticorpos para CD38, tal como um anticorpo para CD38, diretamente, ou indiretamente por uso de um grupo funcional intermediário. Grupos funcionais intermediários úteis incluem quelantes, tais como ácido etilenodiaminatetra-acético e ácido dietilenotriaminapenta-acético (ver por exemplo US 5,057,313). Em tais ensaios de diagnóstico envolvendo CD38BPs conjugados a radioisótopos, a dosagem de péptido conjugado administrada ao paciente é tipicamente mantida a um nivel tão baixo quanto possivel através da escolha de isótopo para a melhor combinação de meia-vida minima, retenção minima no corpo, e quantidade de isótopo minima, que permitirá deteção e medição precisa.

Adicionalmente aos radioisótopos e agentes radio-opacos podem ser realizados métodos de diagnóstico usando CD38BPs que sejam conjugados com corantes (tal como com o complexo biotina-estreptavidina) , agentes de contraste, compostos fluorescentes ou moléculas e agentes intensificantes (p.ex., iões paramagnéticos) para imagiologia por ressonância magnética (MRI) (ver, p.ex., Pat dos EUA No. 6, 331,175, que descreve técnicas de MRI e a preparação de anticorpos conjugados a um agente intensificador de MRI). Tais agentes de diagnóstico/deteção podem ser selecionados de agentes para uso em imagiologia por ressonância magnética, e compostos fluorescentes. De modo a carregar um componente de CD38BP, tal como um anticorpo, com metais radioativos ou iões paramagnéticos pode ser necessário reagi-lo com um reagente tendo uma longa cauda à qual está anexada uma multiplicidade de grupos quelantes para ligação dos iões. Uma tal cauda pode ser um polímero tal como uma polilisina, polissacarideo, ou outra cadeia derivatizada ou derivatizável tendo grupos pendentes aos quais podem estar ligados grupos quelantes tais como, p.ex., porfirinas, poliaminas, éteres de coroa, bistiossemicarbazonas, polioximas, e grupos similares que se sabe que são úteis para este propósito. Os quelatos podem ser acoplados a CD38BPs usando químicas padrão. Um quelato é normalmente ligado a um CD38BP, tal como um mAb anti-CD38, por um grupo, que permite formação de uma ligação com a molécula com perda minima de imunorreatividade e agregação e/ou reticulação interna mínimas. Outros métodos e reagentes, mais incomuns, para conjugação de quelatos a anticorpos estão divulgados em por exemplo US 4,824,659. Exemplos de combinações metal-quelato potencialmente úteis incluem 2-benzil-DTPA e seus análogos de monometilo e ciclohexilo, usados com isótopos de diagnóstico na gama geral de energias de 60 a 4,000 keV, tais como 125I,123I, 1241 , 62Cu, 64Cu, 18F, inIn, 67Ga, 67Ga, "Tc, 94Tc, nC, 13N, 150 e 76BR, para radioimagiologia. Estes e quelatos similares, quando complexados com metais não radioativos, tais como manganês, ferro, e gadolínio podem ser úteis para métodos de diagnóstico por MRI em conexão com CD38BPs. Quelatos macrocíclicos tais como NOTA, DOTA, e TETA são de uso com uma variedade de metais e radiometais, o mais particularmente com radionuclídeos de gálio, ítrio, e cobre, respetivamente. Tais complexos metal-quelato podem ser tornados muito estáveis por customização do tamanho do anel ao metal de interesse. Outros quelatos do tipo anel tais como poliéteres macrocíclicos, que são de interesse para ligação estável de nuclídeos, tais como 223Ra para RAIT, podem ser também adequados em métodos de diagnóstico.

Assim sendo são proporcionados aqui conjugados de anticorpos para CD38 de diagnóstico, em que o anticorpospara CD38 é conjugado a um agente de contraste (tal como para imagiologia por ressonância magnética, tomografia computadorizada, ou agente intensificante de contraste por ultrassons) ou um radionuclídeo que pode ser, por exemplo, um isótopo emissor de gama, beta, alfa, eletrões Auger, ou positrões. CD38BPs conjugados úteis adicionais estão descritos noutro lugar aqui, que podem ser também úteis em métodos e composições de diagnóstico (p.ex., estojos de diagnóstico) proporcionados pela presente divulgação. É descrito aqui um estojo para diagnóstico de cancro compreendendo um recipiente compreendendo um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38, e um ou mais reagentes para deteção da ligação do CD38BP a um péptido de CD38. Os reagentes podem incluir, por exemplo, marcadores fluorescentes, marcadores enzimáticos, ou outros marcadores detetáveis. Os reagentes podem também incluir anticorpos secundários ou terciários ou reagentes para reações enzimáticas, em que as reações enzimáticas produzem um produto que pode ser visualizado. Numa forma de realização é proporcionado aqui um estojo de diagnóstico compreendendo um ou mais CD38BPs, tais como anticorpos anti-CD38 da presente invenção, em forma marcada ou não marcada em recipiente (s) adequado (s), reagentes para as incubações para um ensaio indireto, e substratos ou agentes de derivatização para deteção num tal ensaio, dependendo da natureza do marcador. Reagente (s) de controlo e instruções para uso podem ser também incluídos.

Os estojos de diagnóstico podem ser também fornecidos para uso com um CD38BP, tal como um anticorpo anti-CD38 conjugado/marcado, para a deteção de uma atividade celular ou para deteção da presença de péptidos de CD38 numa amostra de tecido ou hospedeiro. Em tais estojos de diagnóstico, bem como em estojos para usos terapêuticos descritos noutro lugar aqui, um CD38Bo pode ser tipicamente proporcionado numa forma liofilizada num recipiente, sozinho ou em conjunção com anticorpos adicionais específicos quanto a uma célula ou péptido alvo. Tipicamente, um transportador farmaceuticamente aceitável (p.ex., um diluente inerte) e/ou seus componentes, tais como um tampão Tris, fosfato, ou carbonato, estabilizantes, conservantes, biocidas, proteínas inertes, p.ex., albumina do soro, ou similares, estão também incluídos (tipicamente um recipiente separado para mistura) e reagentes adicionais (também tipicamente em recipiente(s) separado(s)). Em certos estojos está também incluído um anticorpo secundário capaz de ligação ao anticorpo anti-CD38 ou outro CD38BP, que está tipicamente presente num recipiente separado. 0 segundo anticorpo é tipicamente conjugado a um marcador e formulado de modo similar ao anticorpo anti-CD38 da presente invenção.

Usando os métodos descritos acima e noutro lugar aqui, os CD38BPs, tais como anticorpos, podem ser usados para definir subconjuntos de células cancerígenas/tumorais e caracterizar tais células e tecidos/crescimentos relacionados.

Num exemplo, um CD38BP ou anticorpo anti-CD38 pode ser adicionado a nitrocelulose, ou outro suporte sólido que seja capaz de imobilizar células, partículas de células, ou proteínas solúveis. 0 suporte pode ser depois lavado com tampões adequados seguido por tratamento com o péptido ou anticorpo para CD38 detetavelmente marcado. 0 suporte de fase sólida pode ser depois lavado com o tampão uma segunda vez para remover péptido ou anticorpo não ligado. A quantidade de marcador ligado no suporte sólido pode ser depois detetada por passos de métodos conhecidos.

As enzimas ligadas que reagem com um substrato exposto podem ser usadas para gerar uma fração química que pode ser detetada, por exemplo, por meios espetrofotométricos, fluorométricos ou visuais, no contexto de um conjugado e/ou proteína de fusão de CD38BP. Enzimas que podem ser usadas para marcar CD38BPs tais como anticorpos anti-CD38 detetavelmente marcados incluem malato desidrogenase, nuclease estafilóccico, delta-5-esteroid isomerase, álcool desidrogenase de levedura, alfa-glicerofosfato, triose fosfato isomerase, peroxidase de rábano-silvestre, fosfatase alcalina, asparaginase, glucose oxidase, beta-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glucose-6-fosfato desidrogenase, glucoamilase, e acetilcolinesterase. É também possível marcar um CD38BP, tal como um anticorpo para CD38, com um composto fluorescente. Quando o anticorpo marcado fluorescente é exposto à luz do comprimento de onda apropriado, a sua presença pode ser detetada devido à fluorescência. Entre os compostos de marcação fluorescente o mais comummente usados estão isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeído, e fluorescamina.

Os CD38BPs, tais como anticorpos anti-CD38, podem ser também detetavelmente marcados usando metais emissores de fluorescência tais como 152Eu, ou outros da série dos lantanídeos. Estes metais podem ser anexados a um anticorpo anti-CD38, por exemplo, usando tais grupos quelantes de metal como ácido dietilenotriaminapenta-acético (DTPA) ou ácido etilenodiaminatetra-acético (EDTA).

Os CD38BPs, tais como anticorpos anti-CD38, podem ser também detetavelmente marcados por acoplamento a um composto quimioluminescente. A presença do CD38BP quimioluminescentemente marcado é depois determinada por deteção da presença de luminescência que surge durante o ciclo de uma reação química. Exemplos de compostos de marcação quimioluminescente particularmente úteis são luminol, isoluminol, éter de acridínio teromático, imidazol, éster de acridínio, e éster de oxalato.

Do mesmo modo, um composto bioluminescente pode ser usado para marcar um CD38BP. A bioluminescência é um tipo de quimioluminescência encontrado em sistemas biológicos nos quais uma proteína catalítica aumenta a eficácia da reação quimioluminescente. A presença de uma proteína bioluminescente é determinada por deteção da presença de luminescência. Compostos bioluminescentes importantes para propósitos de marcação são luciferina, luciferase e aequorina. A deteção de um péptido ou anticorpo, fragmento ou derivado de anticorpo marcado pode ser alcançada por um contador de cintilação, por exemplo, se o marcador detetável for um emissor de gama radioativo, ou por um fluorómetro, por exemplo, se o marcador for um material fluorescente. No caso de um marcador de enzima, a deteção pode ser alcançada por métodos colorimétricos que empregam um substrato para a enzima. A deteção pode ser também alcançada por comparação visual da extensão da reação enzimática de um substrato em comparação com padrões similarmente preparados.

Estas e outras técnicas de diagnóstico podem ser usadas para rastrear qualquer material adequado para péptidos de CD38 ou fragmentos de CD38. Exemplos de materiais que podem ser rastreados incluem, por exemplo, sangue, soro, linfa, urina, exsudato inflamatório, fluido cerebroespinhal, fluido amniótico, um extrato ou homogenato de tecido, e similares. No entanto, a presente divulgação não está limitada a ensaios usando somente estas amostras, sendo possivel que um com pericia ordinária na técnica determine condições adequadas que permitam o uso de outras amostras. A deteção in situ pode ser alcançada por remoção de um espécimen histológico de um paciente, e proporcionar uma combinação de CD38BPs marcados, tais como anticorpos anti-CD38, da presente invenção a um tal espécimen. 0 CD38BP, anticorpo anti-CD38 (incluindo fragmento) da presente invenção pode ser proporcionado por aplicação ou por sobreposição do CD38BP marcado, tal como um anticorpo anti-CD38 marcado, da presente invenção a uma amostra biológica.

Através do uso de um tal procedimento é possível determinar não só a presença de CD38 ou fragmento de CD38 mas também a distribuição de tais péptidos no tecido examinado (p.ex., no contexto de avaliação da disseminação de células cancerígenas) . Usando a presente invenção, aqueles com perícia ordinária aperceber-se-á prontamente de que qualquer um de uma ampla variedade de métodos histológicos (tais como procedimentos de coloração) pode ser usado de modo a se alcançar tal deteção in situ. A presente divulgação inclui adicionalmente métodos de promoção da venda e/ou uso de um CD38BP como descrito aqui compreendendo distribuição de informação (tal como por materiais impressos que são distribuídos, enviados, etc., por sinalização publicitária, por programas e anúncios de televisão, por programas e anúncios de rádio, por colocações em sites da internet, por email, por telemarketing, por marketing porta-a-porta ou pessoa-a-pessoa, por financiamento e/ou acolhimento de conferências, painéis, fóruns, etc., por emprego e/ou contratação dos serviços de vendedores e/ou ligações médicas/científicas, por financiamento e/ou acolhimento de pesquisa científica e publicações relacionadas com tais usos, etc.) relacionada com o uso do composto na prevenção ou tratamento de qualquer condição ou combinação de condições como descritas noutro lugar aqui a quaisquer pessoas ou entidades de interesse potencial (tais como cadeias farmacêuticas, gestões de formulário, companhias de seguros, HMOs, hospitais e cadeias de hospitais, outras empresas de cuidados de saúde, gestores de benefício de farmácia, potenciais pacientes, pacientes com cancro, antigos pacientes com cancro, pacientes em remissão, médicos de cuidados primários, enfermeiros, médicos de farmácia, e/ou principais líderes de opiniões). A presente divulgação inclui também estojos compreendendo uma composição farmacêutica de um composto da presente invenção e instruções para uso. 0 estojo pode adicionalmente conter um ou mais agentes adicionais, tais como um reagente imunossupressor, um reagente quimioterapêutico, um agente anti-inflamatório ou um agente radiotóxico como descrito acima, e um ou mais CD38BPS adicionais como descritos aqui (tal como um CD38BP tendo uma atividade complementar). Um estojo como descrito aqui pode também incluir agentes de diagnóstico e/ou outros agentes terapêuticos. Numa forma de realização, um estojo inclui um CD38BP como descrito aqui e um agente de diagnóstico que pode ser usado num método de diagnóstico para diagnóstico do estado ou existência de um distúrbio envolvendo células expressando CD38 num sujeito. Numa forma de realização, o estojo inclui um CD38BP como descrito aqui numa forma altamente estável (tal como numa forma liofilizada) em combinação com transportador(s) farmaceuticamente aceitável(eis) que podem ser misturados com a composição altamente estável para formar uma composição injetável.

Todos os cabeçalhos e subcabeçalhos são usados aqui para conveniência somente e não devem ser interpretados como limitantes da presente invenção de qualquer modo. 0 uso dos termos "um" e "uma" e "o/a" e referentes similares no contexto de descrição da presente invenção é para ser interpretado como abrangendo tanto o singular como o plural, a não ser de outro modo indicado aqui ou claramente contradito pelo contexto. A recitação de gamas de valores aqui destina-se meramente a servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado estando dentro da gama, a não ser que de outro modo indicado aqui, e cada valor separado é incorporado na especificação como se fosse individualmente recitado aqui. A não ser que de outro modo indicado, todos os valores exatos proporcionados aqui são representativos de valores aproximados correspondentes (p.ex., todos os valores exemplares exatos proporcionados no que diz respeito a um fator ou medição particular podem ser considerados como também proporcionando uma medição aproximada correspondente, modificada por "cerca de", onde apropriado).

Todos os métodos descritos aqui podem ser realizados em qualquer ordem adequada a não ser que de outro modo indicado aqui ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. 0 uso de qualquer um dos e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (p.ex., "tal como"), proporcionados aqui destina-se meramente a melhor iluminar a presente invenção e não coloca uma limitação ao âmbito da presente invenção a não ser que de outro modo indicado. Nenhuma linguagem na especificação deve ser interpretada como indicando que qualquer elemento é essencial à prática da presente invenção a não ser que tanto seja explicitamente indicado. A citação e incorporação de documentos de patentes aqui são feitas por conveniência somente e não reflete qualquer visão da validade, patenteabilidade, e/ou executoriedade de tais documentos de patentes. A descrição aqui de qualquer forma de realização da presente invenção usando termos tais como "compreendendo", "tendo", "incluindo", ou "contendo" com referência a um elemento ou elementos destina-se a proporcionar apoio a uma forma de realização similar da presente invenção que "consiste em", "consiste essencialmente em", ou "substancialmente compreende" esse elemento ou elementos particulares, a não ser que de outro modo indicado ou claramente contradito pelo contexto (p.ex., uma composição descrita aqui como compreendendo um elemento particular deve ser entendida como descrevendo também uma composição consistindo nesse elemento, a não ser que de outro modo indicado ou claramente contradito pelo contexto). A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como adicionalmente limitantes.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

Fabrico de células transfectadas com luciferase (Daudi-luc)

Cultura de células Daudi (tendo origem em linfoma de Burkitt) foi cultivada em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com FCS a 10% (Optimum C241, Wisent Inc., St. Bruno, QC, Canadá) , L-glutamina a 2 mM, penicilina a 100 IU/mL, estreptomicina a 100 mg/mL, piruvato de sódio a 1 mM (todos derivados da Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, Escócia) . O meio foi refrescado duas vezes por semana. Antes da transfecção, as células foram divididas e inoculadas a 1-1,5 x 106 células/mL para assegurar viabilidade e crescimento ótimo.

Transfecção de luciferase 8,2 x 106 células Daudi CD38+ foram absorvidas em 350 pL de RPMI (suplementado com dFCS a 10%, Gibco BRL) e transferidos para uma cuvete de eletroporação (Biorad, Hemel Hempstead, Herts, RU) . Depois, 40 yg de luciferase gWIZ da GTS (Aldevron, Fargo, ND, EUA) e 10 yg de vetor pPur (BD Biosciences, Alphen a/d Rijn, Holanda), que confere resistência à puromicina, foram adicionados. Após repouso das células durante 10 minutos, as células foram eletroporadas (250 V, 950 yF; Gene Pulser II, Biorad Laboratories GmbH, Munique, Alemanha). As células foram novamente repousadas em gelo, e absorvidas em 40 mL de RPMI (suplementado com FCS a 10%) . Depois, as células foram plaqueadas em placas de cultivo de tecidos com 96 poços (100 yL por poço). Após 48 horas, puromicina (concentração final: 1 yg/mL; Sigma-Aldrich Chemie BV, Zwijndrecht,

Holanda) foi adicionada. Os clones resistentes à puromicina foram adicionalmente cultivados em placas de cultivo de tecidos com 24 poços.

Determinação da atividade de luciferase A atividade de luciferase de células foi determinada usando o Sistema de Ensaio de Luciferase (#E4030, Promega, Madison, WI, EUA) . 1 x 105 células foram centrifugadas (13,500 rpm, 1 min) numa centrífuga da Eppendorf, e o pélete foi lavado em 100 yL de PBS. Após centrifugação (13,500 rpm, 1 min), o pélete foi lisado com 20 yL de

Tampão de Lise Repórter (Promega), congelado e

descongelado. Após centrifugação (13.500 rpm, 1 min), 20 yL de sobrenadante foram descartados, e 100 yL de reagente de ensaio de luciferase foram adicionados (em especial tubos de luminómetro, Promega). A luminescência foi medida (10 seg) num luminómetro (LB9507, Berthold, Vilvoorde, Bélgica). EXEMPLO 2

Imunização de ratinhos e geração de hibridomas Protocolo de imunização para -003

Ratinhos HCol2 foram imunizados a cada duas semanas com 20 pg de HA-CD38 purificado. A primeira imunização foi realizada i.p. na presença de 100 pL de PBS, misturada com 100 pL de Adjuvante de Freund Completo (CFA) . Após esta primeira imunização, reforços subsequentes (13x) com HA-CD38 purificado foram realizados na presença de 100 pL de PBS, misturados com 100 pL de Adjuvante de Freund Incompleto (IFA) alternando s.c. e i.p. Após desenvolvimento do titulo, os ratinhos foram reforçados com 20 pg de HA-CD38 em PBS, i.v.

Protocolo de imunização para -005 e -024

Ratinhos HCol2 foram imunizados a cada duas semanas com 20 pg de HA-CD38 purificado alternando com células transfectadas com NIH-3T3-CD38. A primeira imunização foi realizada com 5 x 106 células em 100 pL de PBS, misturada com 100 pL de CFA, i.p., a segunda e seguintes imunizações com HA-CD38 s.c., na presença de 100 pL de PBS, misturada com 100 pL de IFA. As seguintes imunizações com células transfectadas foram realizadas na presença de 200 pL de PBS. Após desenvolvimento do titulo, os ratinhos foram reforçados com 20 pg de HA-CD38 em PBS, i.v.

Geração de Hibridomas Produzindo Anticorpos Monoclonais Humanos para CD38

Os esplenócitos de ratinho foram isolados de ratinhos HCol2 e fundidos com PEG a uma linha de células de mieloma múltiplo com base em protocolos padrão. Os hibridomas resultantes foram depois rastreados quanto à produção de anticorpos humanos por ELISA e quanto à especificidade de CD38 usando células NS/0 transfectadas com CD38 por análise FACS e liqação de proteina HA-CD38 recombinante. Foram selecionadas três linhas de células de hibridoma expressando os anticorpos anti-CD38 monoclonais humanos, -003, -005 e -024, respetivamente. EXEMPLO 3

Transfecção de células NIH com CD38 0 vetor (pclpuroCD38) para produção de células NIH-3T3-CD38 foi obtido do Prof. M. Glennie (Tenovus Research

Laboratory, Southampton General Hospital, Southampton, RU). Células NIH-3T3 (DSMZ, ACC 59; 150.000 células/poço; 0,5 mL; placas de fundo redondo com 96 poços, Greiner) foram cultivadas em DMEM (suplementado com glucose [4,5 g/L], FCS a 10%, L-glutamina, piruvato de Na; BioWhittaker) durante 24 h. Depois, DNA (0,8 yg) e lipofectamina (Invitrogen, Breda, Holanda) foram diluidos em DMEM, e misturados (20 min, RT) . Subsequentemente, a mistura (100 yL) foi adicionada a cada poço e incubada (ON, 37°C).

Rastreio quanto à expressão de CD38

As células NIH-3T3-CD38 foram lavadas (em 1 mL de PBS) e tripsinizadas (200 yL, tripsina-EDTA, BioWhittaker).

Depois, 1 mL de DMEM foi adicionado e a mistura pipetada em tubos de FACS. Após centrifugação (1200 rpm, 5 min) , as células foram lavadas em tampão de FACS (FB; PBS, BSA a 0,05%, NaN3 a 0,02%) e ressuspensas em 1 mL de FB. Após centrifugação (1200 rpm, 5 min), o sobrenadante foi removido e anti-CD38-PE humano de ratinho foi adicionado (diluição 1/50, Sanquin, Amesterdão, Holanda). Após lavagem das células duas vezes em FB, as células foram ressuspensas em FB para aquisição por citometria de fluxo.

Expansão e seleção

Após tratamento com tripsina, as células foram transferidas para frascos T25 (Greiner) em DMEM (suplementado com glucose 4,5 g/L, L-glutamina a 2 mM, e puromicina (2 yg/mL) BioWhittaker). As células resistentes à puromicina foram testadas quanto à expressão estável de CD38 por citometria de fluxo após duas semanas em meio contendo puromicina. As células NIH-3T3-CD38 selecionadas foram subclonadas por diluição limitante. Após expansão destas células, todos os 15 clones de NIH-3T3-CD38 foram rastreados quanto à expressão de CD38. As células NIH-3T3-CD38 ricas em CD38 foram congeladas em nitrogénio liquido (-80°C) até ao uso.

Cultivo de células NIH-3T3-CD38

As células são cultivadas em DMEM (suplementado com glucose (4,5 g/L), FCS a 10%, L-glutamina a 2 mM, piruvato de Na, penicilina, estreptomicina). As células são passadas duas vezes por semana por uso de tripsina/EDTA e inoculadas numa concentração de 1 x 106 células/frasco T75. As células NIH-3T3-CD38 ricas em CD38 foram congeladas em nitrogénio liquido (-80°C) até ao uso.

Purificação de antigénio HA-CD38

Sefarose 4B (Amersham Bioscience, Uppsala, Suécia) foi acoplada com anticorpo anti-CD38 (Serotec, Oxford, RU) . A coluna (o tubo da coluna HR5/20 foi empacotado com altura do leito de 12 cm, volume da coluna 2,4 mL; caudal máximo 0,5 mL/min) foi equilibrada com pelo menos 5 volumes da coluna (CV) de PBS. A amostra foi filtrada e carregada na coluna. A coluna foi lavada com PBS até o sinal ter regressado à linha de base (aproximadamente 3 CV). A eluição foi levada a cabo com glicina a 0,1 M a pH 2. As frações eluidas foram neutralizadas com Tris-HCl a 2 M e 1 % (v/v), pH 9.

Purificação de anticorpos anti-CD38

Os anticorpos anti-CD38 humanos foram purificados a partir de sobrenadantes de cultura de tecidos. Em primeiro lugar, os sobrenadantes foram filtrados sobre filtro convencional a 0,20 μΜ. Depois, o sobrenadante foi carregado numa coluna de Proteina A de 5 mL (rProtein A FF, Amersham Bioscience) e eluido com ácido cítrico-NaOH a 0,1 M, pH 3. O eluato foi imediatamente neutralizado com Tris-HCl a 2 M, pH 9 e dialisado O/N até fosfato de sódio a 12,6 mM, NaCl a 140 mM, pH 7,4 (B. Braun, Oss, Holanda). Após diálise, as amostras foram filtradas por esterilização sobre filtro convencional a 0,20 μΜ.

Purificação de lotes de His-CD38 A proteina está presente em sobrenadante de cultura de células de células expressando His-CD38, com um constructo de DNA contendo a sequência para o dominio extracelular de CD38. Uma sequência adicional de marcador de poli-His está incluida nos constructos e presente no terminal N da proteína. Este marcador permite a purificação com cromatografia de afinidade com metal imobilizado. Neste processo, um quelante fixo à resina cromatográfica é carregado com catiões Co2+. Particularmente, uma sequência que inclui 6 aminoácidos histidina liga-se fortemente a Co2+. Portanto, as proteínas CD38 marcadas com His ligam-se fortemente a uma tal coluna, enquanto as outras proteínas presentes no sobrenadante de cultura fluirão através da coluna ou serão separadas por lavagem. As proteínas CD38 marcadas com His fortemente ligadas são depois eluídas com um tampão contendo imidazol, que compete com a ligação de His a Co2+. Quando His-CD38 suficiente é purificado, o eluente é removido da proteína por troca de tampões numa coluna de dessalinização. EXEMPLO 4

Ligação de -003, -005, e -024 a células CHO transfectadas com CD38 (CHQ-CD38), a células Daudi-luc e a células tumorais de mieloma múltiplo (MM) frescas

Após colheita e contagem, células Daudi-luc, células de CHO transfectadas com CD38 e células de CHO de controlo foram ressuspensas em PBS (1 x 106 células/mL). Depois, as células foram colocadas em placas de fundo em V com 96 poços (100 pL/poço) e lavadas duas vezes em PBS-BSA (PBS suplementado com BSA a 0,1% e azida de Na a 0,02%). Subsequentemente, 50 pL de solução de anticorpo em PBS-BSA foram adicionados às células (4°C, 30 min) . Após lavagem três vezes em PBS-BSA, 50 pL (diluição 1:400) de anti-IgG-FITC humana de coelho em PBS-BSA foram adicionados (4°C no escuro, 30 min) . As células foram lavadas três vezes e a ligação específica de anticorpos para CD38 a células CHO-CD38 e Daudi-luc foi detetada por citometria de fluxo.

HuMab-KLH (um anticorpo monoclonal humano contra KLH (hemocianina da lapa californiana) gerado pela Genmab B.V., Utrecht, Holanda por uso dos protocolos de imunização descritos noutro lugar aqui) foi usado como um controlo. As Figuras 1 e 2 mostram que -003, -005, e -024 se ligam a células CHO-CD38 e a células Daudi-luc, não obstante com EC50 diferente (Tabela 1) . Não é observada nenhuma ligação a células de CHO de controlo (dados não mostrados). Células tumorais de MM frescas foram obtidas do Dr. Lokhorst (University Medicai Center Utrecht, Utrecht, Holanda). As células tumorais foram isoladas da medula óssea de pacientes com mieloma múltiplo por centrifugação com gradiente Ficoll (BioWhittaker; meio de separação de linfócitos, cat 17-829E). Após colheita e contagem, as células de MM (100.000 células/poço) foram ressuspensas com 25 pL de anticorpos específicos quanto a CD387 marcados com FITC e 25 pL de CD138. Após incubação (4°C, 30 min) , as células foram lavadas com PBS-BSA e anti-IgG de ratinho de cabra marcado com PE (1:200; Jackson ImmunoResearch Europe Ltd. Soham, RU) foi adicionado. Após incubação (4°C, 30 min) e lavagem das células em PBS-BSA, a fluorescência foi medida por citometria de fluxo. A Figura 3 mostra que -003, -005 e -024 se ligam a células de MM.

Tabela 1 - Valores de EC50 de ligação de anticorpos anti-CD38 em células CHO-CD38, células Daudi-luc e células tumorais de MM frescas. EC50 EC50 EC50

Anticorpos específicos

CHO-CD38 Daudi-luc células de MM quanto a CD38 (pg/mL) (pg/mL) (pg/mL) -003 0,54 0,26 0,56 EC50 EC50 EC50

Anticorpos específicos

CHO-CD38 Daudi-luc células de MM quanto a CD38 (yg/mL) (yg/mL) (yg/mL) -005 0,23 0,09 0,04 -024 0,08 0,05 0,02 EXEMPLO 5

Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos Células Daudi-luc, células tumorais de mieloma múltiplo frescas, células tumorais de Leucemia das Células Plasmáticas frescas e células de mieloma múltiplo JK6L e AMO-1 foram recolhidas (5 x 106 células) em RPMI++ (meio de cultura RPMI 1640 suplementado com soro de vitelo cósmico a 10% (HyClone, Logan, UT, EUA) ) , ao qual 100 yCi de 51Cr (Crómio-51; Amersham Biosciences Europe GmbH, Roosendaal, Holanda) foram adicionados, e a mistura foi incubada num banho de água a 37°C durante 1 hr. Após lavagem das células (duas vezes em PBS, 1500 rpm, 5 min) , as células foram ressuspensas em RPMI++ e contadas por exclusão de azul de tripano. As células foram levadas até à concentração de 1 x 105 células/mL.

Preparação de células efetoras Células mononucleares do sangue periférico frescas (voluntários saudáveis, UMC Utrecht, Utrecht, Holanda) foram isoladas a partir de 40 mL de sangue de heparina por Ficoll (BioWhittaker; meio de separação de linfócitos, cat 17-829E) de acordo com as instruções do fabricante. Após ressuspensão das células em RPMI++, as células foram contadas por exclusão de azul de tripano e levadas até à concentração de 1 x 107 células/mL.

Cenário de ADCC 50 pL de células alvo marcadas com 51Cr foram pipetados em placas com 96 poços, e 50 pL de anticorpo foram adicionados, diluídos em RPMI++ (concentrações finais 10, 1, 0,1, 0,01 pg/mL) . As células foram incubadas (RT, 15 min), e 50 pL de células efetoras foram adicionados, resultando numa razão de efetor em relação ao alvo de 100:1 (para determinação de lise máxima, 100 pL de Triton-X100 a 5% foram adicionados em vez de células efetoras; para determinação de lise espontânea, 50 pL de células alvo e 100 pL de RPMI++ foram usadas). As células foram giradas para baixo (500 rpm, 5 min), e incubadas (37°C, CO2 a 5%, 4 hr). Após giração para baixo das células (1500 rpm, 5 min), 100 pL de sobrenadante foram recolhidos em tubos micrónicos, e contados em contador gama. A percentagem de lise específica foi calculada como se segue: (cpm da amostra - cpm de células alvo somente) / (cpm de lise máxima - cpm de células alvo somente) em que cpm é contagens por minuto.

Em células Daudi-luc (Figura 4 e Tabela 2), -003, -005, e -024 induzem lise por ADCC, e -003, e -005 desempenham-se ligeiramente melhor do que rituximab (mAb anti-CD20). Interessantemente, também quando células tumorais de mieloma múltiplo frescas (obtidas do Dr. H. Lokhorst, UMCU, Holanda) são usadas como células alvo, a ADCC é induzida por -003, -005 e -024 (Figura 5A e Tabela 2).

Tabela 2 - Valores de EC50 de anticorpos específicos quanto

a CD38 em ADCC EC50 EC50

Anticorpos específicos

Daudi-luc células de MM quanto a CD28 (ng/mL) (ng/mL) -003 9,0 27 -005 4,5 5,7 -024 9,7 56

Enriquecimento de células mononucleares do sangue periférico Erlangen

Sangue humano de voluntários humanos (University Erlangen, Erlangen, Alemanha) foi diluído duas vezes em RPMI 1640 e as células sanguíneas foram colocadas em camadas em Ficoll (meio de Separação de Linfócitos 1077 g/mL, 710 g, RT, 20 min; BioWhittaker, Cambrex Bio Science Verviers, Verviers, Bélgica, cat. 17-829E, no. de lote 0148 32). As células mononucleares do sangue periférico (MNCs) foram recolhidas da interfase, lavadas e ressuspensas em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com FCS a 10%, L-glutamina a 2 mM, penicilina a 5 U/mL, estreptomicina a 50 yg/mL (todos derivados da BioWhittaker) ao qual HEPES a 25 mM (BioWhittaker) foi adicionado.

Cenário II de ADCC Células B alvo (células tumorais de leucemia de células plasmáticas frescas, linhas de células B JK6L e AMO-1, obtidas do Dr. T. Valerius, University of Erlangen, Erlangen, Alemanha) foram marcadas com 20 yCi de 51Cr (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia) durante 2 horas.

Após lavagem extensiva em RPMI-10, as células foram ajustadas até 1 x 105 células/mL. MNCs (50 yL) , anticorpos sensibilizantes (50 yL) , e RPMI-10 (50 yL) foram adicionados a placas de microtitulação de fundo redondo (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha). Os ensaios foram iniciados por adição de células tumorais de leucemia de células plasmáticas frescas, células JK6L ou AMO-1 (50 yL) dando um volume final de 200 yL. Foi usada uma razão de efetor em relação ao alvo (E:T) de 40:1. Após incubação (3 hr, 37°C), os ensaios foram parados por centrifugação, e a libertação de 51Cr de triplicados foi medida em contagens por minuto (cpm) num contador de cintilação. A percentagem de citotoxicidade celular foi calculada usando a seguinte fórmula: % de lise especifica = (cpm experimentais - cpm basais)/(cpm máximas - cpm basais) χ 100 com a libertação máxima de 51Cr determinada por adição de ácido perclórico (concentração final de 3%) às células alvo, e a libertação basal foi medida na ausência de anticorpos sensibilizantes e células efetoras.

Em ambas as linhas de mieloma múltiplo (i.e., JK6L e AMO-1), a lise é induzida com -003 e -005 (Figuras 6 e 7), mesmo quando a expressão de CD38 é baixa (linha de células AMO-1). -003, -005 e -024 induzem ADCC de células tumorais primárias de leucemia de células plasmáticas (Figura 5B). EXEMPLO 6

Citotoxicidade dependente do complemento

Após colheita e contagem de células Daudi-luc, a viabilidade das células deve ser ^ 90%. Após lavagem (PBS), as células são ressuspensas em 2,0 x 106 células/mL em RPMI-B (RPMI suplementado com BSA a 1%). Subsequentemente, as células são colocadas em placas de fundo redondo com 96 poços a 1 x 105 células/poço (50 pL/poço). Depois, 50 pL de anticorpos são adicionados aos poços (gama de concentrações finais entre 0-100 pg/mL (diluições de três vezes em RPMI-B) ) . Após incubação (RT, 15 min) , 11 pL de soro humano agrupado (agrupamento de 18 dadores saudáveis) foram adicionados a cada poço (37°C, 45 min) . Os poços foram ressuspensos uma vez e 120 pL foram transferidos para tubos de FACS (Greiner). Depois, 10 pL de iodeto de propídio (PI; Sigma-Aldrich Chemie B.V.) foram adicionados (solução a 10 pg/mL) a esta suspensão. A lise foi detetada por citometria de fluxo (FACScalibur™, Becton Dickinson, San Diego, CA, EUA) por medição da percentagem de células mortas (corresponde a células positivas quanto a PI). A Figura 8 e Tabela 2 mostram que a lise de células Daudi-luc é induzida por -005 (lise máxima de ~60%) e que a lise por -003 é somente vista a concentrações de anticorpo muito elevadas. -024 não induz CDC em células Daudi (dados não mostrados). Em células CHO-CD38, a lise é induzida por - 003, -005, e -024 (Figura 9 e Tabela 3). A lise por -003 é induzida a concentrações mais elevadas. Em células tumorais (todas obtidas do Dr. Lokhorst e Dr. Bloem, University Medicai Center Utrecht, Holanda), obtidas de diferentes pacientes com MM (A: células tumorais refratárias a 3%, B: células tumorais refratárias a 9%, C: células tumorais a 30-40%, e D: células tumorais a 70%), É observada lise mediada por CDC na presença de -005, mas não na presença de -003 (Figura 10). -024 induziu também lise de células tumorais de MM (Figura 10E).

Tabela 3 - Valores de ECso de anticorpos específicos quanto

a CD38 em CDC ECso EC50

Anticorpos específicos quanto

Daudi-luc CD38-CHO a CD3 8 (yg/mL) (pg/mL) -003 >90 3,14 -005 0,33 0,14 -024 >90 0,24 EXEMPLO 7

Estudos de bloqueio cruzado usando FACS Células CHO-CD38 foram incubadas com um excesso de anticorpo específico quanto a CD38 não marcado (4°C, 15 min) . Depois, as células foram incubadas com anticorpos específicos quanto a CD38 marcados com FITC (a concentração aproxima-se de EC90, 4°C, 45 min) . Após lavagem duas vezes das células com PBS-BSA, a fluorescência foi medida por citometria de fluxo. A Figura 11 mostra que -003 não marcado bloqueia a ligação de -003 marcado com FITC, ao passo que a ligação de -005 marcado com FITC não é bloqueada. Igualmente, -005 não marcado bloqueia a ligação de -005 marcado com FITC, ao passo que a ligação de -003 marcado com FITC não é bloqueada. -003 e -005 ligam-se a diferentes epítopos, porque não competem quanto à ligação. EXEMPLO 8

Estudos de bloqueio cruzado usando ELISA CD38 humano solúvel é revestido na superfície de uma placa de ELISA. 0 CD38 revestido é incubado com um excesso de anticorpos específicos quanto a CD38 não marcados durante cerca de 15 minutos e subsequentemente são adicionados anticorpos específicos quanto a CD38 biotinilados (a concentração aproxima-se de EC90, RT, 1 hora). Após lavagem três vezes com PBS/Tween, estreptovidina conjugada a peroxidase do rábano-silvestre (HRP) é adicionada e a mistura é incubada durante 1 hora à RT. 0 complexo pode ser detetado por adição de uma solução de ABTS e a conversão do substrato mediada por HRP é medida usando um leitor de ELISA a OD 405 nm. EXEMPLO 9

Estudos de bloqueio cruzado usando ELISA em sanduíche

Anticorpos específicos quanto a CD38 são revestidos na superfície de uma placa de ELISA. Os anticorpos ligados à placa são incubados com CD38 solúvel biotinilado na presença de um excesso de anticorpos específicos quanto a CD38 na fase fluída. Após lavagem com PBS/Tween, o CD38 biotinilado ligado é detetado com estreptavidina conjugada a HRP durante 1 hr à RT. Este complexo pode ser detetado por adição de uma solução de ABTS (após lavagem com PBS/Tween) e a conversão do substrato mediada por HRP é medida usando um leitor de ELISA a OD 405 nm. EXEMPLO 10

Reatividade com um painel de tecidos humanos e reatividade cruzada com tecido de cinomolgo por imunohistoguímica

Secções de tecido humano congelado (obtido do Dr. H. Niessen, Free University Medicai Center, Amesterdão, Holanda) ou tecido de macaco (Inveresk Research, Glasgow, Escócia) foram cortados a 6 ym e secos ao ar durante a noite. Estas secções por crióstato foram fixadas em acetona (RT, 10 min) e secas ao ar (aprox. 5 min).

Subsequentemente, as secções foram incubadas com lx tampão de ácido citrico/f osf ato contendo H2O2 a 0,1% (pH 5,8; Sigma), para bloquear a peroxidase endógena. Após 20 min à RT, as secções foram lavadas duas vezes com PBS e Tween-20 a 0,05% (PBST, RT, 5 min; Riedel-de-Haen, Alemanha).

Depois, as secções foram incubadas com avidina (RT, 15 min; DAKO, Glostrup, Dinamarca), lavadas duas vezes com PBST, e incubadas com biotina (RT, 15 min; DAKO) para bloquear a biotina endógena. Após lavagem das secções duas vezes com PBST, as secções foram pré-incubadas com PBST++ (PBST suplementado com soro humano normal a 10% (NHS, CLB, Amesterdão, Holanda) e soro de cabra normal a 10% (NGS; DAKO) (RT, 20 min) . Após separação por transferência do soro pré-incubação, as secções foram incubadas com anticorpo primário marcado com FITC diluido em PBST++ a 2% às concentrações indicadas (RT, 60 min) . Subsequentemente, as secções foram incubadas com anti-FITC de coelho (1:1000; DAKO) em PBST++ a 2% (RT, 30 min). Após lavagem das secções com PBST, as secções foram lavadas com antibiotina de coelho de cabra (1 :400; DAKO) em PBST++ a 2% (RT, 30 min). Depois, as secções foram lavadas e incubadas com SABC-HRP (1:100; DAKO) em PBST++ a 2% (RT, 30 min). Após lavagem das secções com PBST foram incubadas (RT, 10 min) com solução de desenvolvimento de amino-etil-carbazol (AEC) (tampão de acetato a 50 mM, pH 4,9, H2O2 a 0,01%; Riedel-de-Haen) . Finalmente, as secções foram lavadas em H2O Millipore (5 min) e contracoloridas com hematoxilina (DAKO). Por uso de glicergel (37°C) , as secções foram fixadas com lamelas cobreobjetos, e estudadas por microscopia de luz (Axiovision-2; Zeiss, Thornwood, NI, EUA). O epitélio bronquial é colorido com -003 e -005 (Figuras 12B e 13B) bem como músculo estriado (miócitos, Figuras 12C e 13C), macrófagos, linfócitos e células B plasmáticas (Figuras 12A e 13A) . -024 tem uma coloração similar de músculo estriado e epitélio bronquial, mas a coloração foi menos intensa. Não é observada nenhuma coloração de células endoteliais, nem com -003 (Fig 14D) , -005 (14E) nem -024 (dados não mostrados), ao passo que foi observada coloração clara com os anticorpos de controlo positivo contra os marcadores de células endoteliais CD31 (Fig 14A) e vWF (14B). Anti-KLH foi usado como anticorpo de controlo negativo (Fig 14C) . -003 (Figura 12D) e -024 (dados não mostrados) mas não -005 (Figura 13D) reagem de modo cruzado com tecido linfoide de macacos cinomolgos. EXEMPLO 11

Reatividade cruzada com células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de macaco cinomolgo ou rhesus por citometria de fluxo 5 mL de sangue periférico de macacos cinomolgos (Inveresk Research) foram lisados por adição de 4,5 mL de tampão de choque (NH4CI a 1,7 mM, EDTA a 1 mM) , 4 0 mL de H2O e 450 pL de KHCO3 a 10%. Após hemólise, as células foram centrifugadas (1200 rpm, 10 min) e lavadas três vezes em PBS. Após contagem das células com azul de tripano, as células foram ressuspensas em PBS-BSA (1 x 106 células/mL). 17,5 mL de sangue periférico de macacos rhesus (BPRC, Rijswijk, Holanda) foram diluídos 1:1 com RPMI 1640 e colocados em camadas em Ficoll (1,077 g/mL; BioWhittaker, cat. 17-829E, no. de lote 0148 32). Após centrifugação (710 g, RT, 20 min) , a interfase foi recolhida e lavada duas vezes em RPMI. Após a última lavagem, as células foram ressuspensas em RPMI 1640 a uma concentração de 1 x 105 células/50 pL.

As células foram transferidas para placa com 96 poços (100.000 PBMCs/poço), lavadas em tampão de FACS (PBS, BSA a 0,05%, NaN3 a 0,02%) e incubadas com os anticorpos primários (4°C, 30 min). Após lavagem em PBS-BSA, 50 pL de anti-hlgG de rb marcado com FITC (DAKO, Glostrup, Dinamarca) foram adicionados (4°C, 30 min). Finalmente, as células foram recolhidas em tubos de FACS num volume total de 150 pL. As amostras foram medidas e analisadas por uso de FACScalibur™ (Becton Dickinson, San Diego, CA, EUA).

Com citometria de fluxo foi mostrada a reatividade cruzada de -003 em linfócitos (Figura 15A) e monócitos (Figura 15B) de cinomolgo, mas não de -005. Também em macacos rhesus foi observada reatividade cruzada de -003 em células mononucleares, mas não de -005 (Figura 15C). EXEMPLO 12

Experiências de internalização Células CHO-CD38 foram coloridas com uma concentração saturante de anticorpos específicos quanto a CD38 marcados com FITC (em gelo, 30 min) . Após lavagem das células (em RPMI 1640 suplementado com FCS a 10%) , um agrupamento de células foi aquecido até 37°C para permitir a internalização, e o outro agrupamento foi deixado em gelo. A vários intervalos de tempo (0-120 min), aliquotas de células foram retiradas e transferidas para PBS-BSA gelado para parar a internalização. Após lavagem das amostras duas vezes com PBS-BSA, EtBr (diluído em PBS-BSA, concentração final 2 mg/mL) foi adicionado às amostras para extinguir o FITC ligado à membrana. A fluorescência foi medida por citometria de fluxo.

As Figuras 16A e 16B mostram que -003 e -005 são internalizados por células CHO-CD38 no espaço de 5 minutos a 37°C. EXEMPLO 13

Experiências de SCID-luciferase in vivo

Neste modelo, as células tumorais são transfectadas com luciferase do pirilampo. Após administração de luciferina (Molecular Probes, Leiden, Holanda) aos ratinhos, as células marcadas podem ser detetadas in vivo por visualização bioluminescente usando uma câmara CCD altamente sensível, cf. Wetterwald et ai., American Journal of Pathology 160 (3), 1143-1153 (2002). Células Daudi foram transfectadas com gWIZ luciferase da Gene Therapy Systems (San Diego, CA) e cultivadas em RPMI com FCS a 10%, Pen/Estrep, Piruvato de Sódio e puromicina a 1 yg/mL (Sigma). As células foram analisadas quanto à expressão de luciferase (expressa em RLU/1 x 105 células) num luminómetro e quanto à expressão de CD38 por FACS. 2,5 χ 106 células Daudi transfectadas com luciferase/ratinho foram injetadas i.v. em ratinhos SCID. Os ratinhos foram tratados com -003, -005, anticorpo de controlo do isotipo (HuMab-KLH) ou rituximab (anticorpo anti-CD20). Os anticorpos foram injetados intraperitonealmente. Foram usados quatro cenários de tratamento (ver Tabela 4) . No cenário preventivo, o anticorpo (100 yg/ratinho) e as células foram administrados simultaneamente. No cenário terapêutico I, o anticorpo (300 yg/ratinho) foi administrado 7 dias após administração das células. No cenário terapêutico II, o anticorpo (10 yg/ratinho) foi administrado 14 dias após administração das células. No cenário terapêutico III, o anticorpo (100 yg/ratinho) foi administrado 7 dias após administração das células. Para visualização, os ratinhos foram anestesiados por injeção i.p. de uma mistura de cetamina/xilazina/atropina. D-Luciferina sintética (sal de sódio, Molecular Probes) foi dada i.p. a uma dose de 25 mg/mL. Os ratinhos foram depois colocados numa caixa apertada e, após 3 min, a visualização foi iniciada usando um detetor de CCD arreferido de nitrogénio liquido VersArray 1300B (Roper Scientific). Os fotões emitidos da luciferase foram contados ao longo de um período de exposição de 5 min. Sob iluminação foram feitas imagens pretas e brancas para referência. Foi usado o software MetaVue (Universal Imaging Corp) para recolha de dados e análise de imagens. A significância estatística de diferenças entre grupos foi estabelecida usando análise de uma via da variância com um teste post de Newman-Keuls usando GraphPad PRISM versão 3.02 (Graphpad Software Inc).

Tabela 4 - Cenários de tratamento para experiências de luciferase in vivo

Tratamento com anticorpo Dose de anticorpo

Cenário (dias após inoculação de (pg/ratinho) experimental células)

Cenário 0 100 preventivo

Cenário 7 300 preventivo

Cenário 14 10 preventivo II Cenário 7 100

preventivo III

As Figuras 17A e 17B mostram gue -003 e -005 inibem o crescimento de células tumorais no cenário preventivo e no cenário terapêutico I, similar à inibição observada para o anticorpo anti-CD20. Ambos os anticorpos se desempenham significativamente melhor do que o anticorpo de controlo do isotipo. Igualmente no cenário terapêutico II, os anticorpos para CD38 atrasam o crescimento de células tumorais Daudi-luc (Figura 17C) . No cenário terapêutico III, -003 e -024 mostram uma inibição clara do crescimento de células tumorais Daudi-luc (Figura 17D). EXEMPLO 14

Apoptose O ensaio de apoptose foi levado a cabo de acordo com as instruções do fabricante (estojo de Apoptose Annexin-V, BD Biosciences, Alphen a.d. Rijn, Holanda). Em resumo, mAbs para CD38 foram adicionados a 2,5 x 105 células (células

Daudi transf ectadas com luciferase, em 0,5 mL de RPMI++ numa placa com 24 poços), numa concentração de 5 yg/mL de -003 ou -005 ou um anticorpo anti-CD20 sozinho ou na presença de anti-hlgG de rb com bloqueio cruzado (50 yg/mL).

Após incubação (37°C, CO2 a 5%, 20 hr) , as células foram cuidadosamente recolhidas, e lavadas com Tampão de Ligação (1200 rpm, 4°C, 5 min, BD Biosciences) . O pélete foi ressuspenso em 100 yL de Tampão de Ligação. Depois, 5 yL de Annexin-V-FITC (BD Biosciences) e 10 yL de PI (BD Biosciences) foram adicionados à suspensão e incubados durante 15 minutos à RT. 400 yL de Tampão de Ligação foram adicionados e as amostras foram medidas (leitura de PI em FL2). Para análise de células apoptóticas, todas as células positivas quanto a Annexin-V foram contadas por citometria de fluxo usando um citómetro de fluxo FACScalibur com software CellQuest pro (BD Biosciences). Pelo menos 10.000 eventos foram recolhidos para análise. Esta população inclui tanto células positivas quanto a PI como células negativas quanto a PI. A Figura 18 mostra que -003 e -005 não induzem apoptose. No entanto, após reticulação, é observada apoptose de células alvo. -003 induziu apoptose após reticulação que era similar à apoptose induzida por um anticorpo anti-CD20 (rituximab). -005 foi menos capaz de induzir apoptose após reticulação. Foram obtidos resultados similares com células RAMOS como células alvo (dados não mostrados). EXEMPLO 15

Efeito de -005 em células B de enxerto de tecido em modelo de ratinho RA-SCID

Implantação de tecido sinovial

Ratinhos SCID, estirpe C.B.-17/IcrCrl-SCID-bg, machos/fémeas, 4-12 semanas, adquiridos dos Charles River Laboratories Nederland (Maastricht, Holanda) foram mantidos em gaiolas IVC sob condições padrão de temperatura e luz, e foram alimentados com comida laboratorial e água ad libitum. Antes da implantação, os ratinhos (três ratinhos em cada grupo experimental, dia 0) foram anestesiados por injeção intraperitoneal de cetamina (NIMATEK, EuroVet) e xilazina (Rompun, Bayer) à razão 1:1. Foi feita uma pequena incisão da pele usando tesouras cirúrgicas. Tecido sinovial inflamado de um paciente com artrite reumatoide sendo submetido a cirurgia de substituição de articulações foi implantado subcutaneamente como um agrupamento de seis fragmentos pequenos (total 2-3 mm3) em cada flanco do ratinho. A ferida foi fechada usando cola de cianoacrilato Permacol. Ao dia 1 da experiência, o tecido sinovial restante foi analisado de modo a verificar células B nos transplantes sinoviais inflamados. -005 (12 mg/kg) ou anticorpo de controlo (anti-KLH, 30 mg/kg) foi injetado (i.v.), num volume de 200 yL ao dia 8 da experiência. No final da experiência (dia 14), os ratinhos foram sacrificados por inalação de CO2 e os enxertos sinoviais foram explantados. Um dos enxertos foi imediatamente congelado em composto OCT (TissueTek, Sacura Finetek Europe) para análise imunohistoquímica adicional, e outro foi congelado por imersão em nitrogénio liquido para análise de RNA adicional.

Imunohistoquímica

Criossecções a 5 μΜ em lamelas SuperFrost (Menzel GmbH, Braunschweig) foram preparadas usando crióstato LEICA CM1900 e armazenadas a -80°C. As secções descongeladas foram fixadas em acetona durante 10 min, secas à temperatura ambiente e lavadas 3x5 min em PBS. Todos os passos foram realizados à temperatura ambiente. A atividade de peroxidase endógena foi bloqueada por incubação com PBS suplementado com peróxido de hidrogénio a 0,3% e azida de sódio a 0,1% durante 20 min. As lamelas foram lavadas 3x5 min em PBS e incubadas com soro humano normal (NHS) a 10%/soro de coelho normal (NRbs) a 10% em PBS/BSA a 1% durante 30 min. De seguida, anticorpo primário (mAb de ratinho) diluido em PBS suplementado com BSA a 1%/NHS a

10%/NRbS a 10% foi incubado durante 60 min. Após 3 x lavagens de 2 min em PBS, conjugado de HRP (anti-Ig-HRP de ratinho de cabra; DAKO P0447) diluido 1:50 em PBS (suplementado com BSA a 1%/NHS a 10%/NRbS a 10%) foi adicionado durante 30 min. O sinal de peroxidase foi intensificado usando sistema de Biotina TSA™ (Perkin Elmer Life Sciences, NEL700) . As lamelas foram lavadas 3x2 min em PBS e incubadas com tiramida de biotinilo diluida 1:1600 em tampão de amplificação durante 30 min. Após 3 x lavagens de 2 min em PBS, estreptavidina-HRP diluida 1:400 em PBS (suplementado com BSA a 1%) foi adicionada durante 30 min. As lamelas foram lavadas 3x2 min em PBS e incubadas com solução de DAB (DAKO Cytomation K3465) durante 5 min. A reação de cor foi parada com água destilada. Finalmente, as lamelas foram contracoloridas com hematoxilina (MERCK), lavadas com água da torneira e cobertas com glicerina de Kaiser e lamela cobreobjetos .

Pontuação da intensidade de coloração A pontuação de xenoenxertos tecido sinovial coloridos foi realizada de um modo cego por duas pessoas treinadas. Em primeiro lugar, a seção mais forte foi selecionada de uma série de secções e a esta secção de referência foi atribuída a pontuação máxima 8. A intensidade de coloração nas outras secções foi depois pontuada numa escala de 0 a 8, em relação à secção de referência.

Análise estatística A pontuação da intensidade de coloração foi analisada por ANOVA de uma via de Kruskal-Wallis seguida por teste de comparação múltipla de Dunn usando GraphPad Prism versão 4.01 (software GraphPad, Inc., San Diego, CA, EUA). A Figura 19 e Figura 21 mostram que os números de células plasmáticas positivas quanto a anti-CD38 são reduzidos após tratamento com -005. A coloração de células plasmáticas com anti-CD138 confirma que -005 resulta em números reduzidos de células plasmáticas (Figuras 20 e 22). EXEMPLO 16

Seguenciação da sequência codificante de anticorpos humanos contra preparação de RNA de CD38 RNA total foi preparado a partir de 5 x 106 células das linhas de células de hibridoma expressando os anticorpos monoclonais -003, -005 e -024, respetivamente, com o estojo RNeasy (Qiagen, Westburg, Leusden, Holanda) de acordo com o protocolo do fabricante.

Preparação de cDNA de -003, -005 e -024 DNA Complementar 5'-RACE (cDNA) de RNA foi preparado a partir de 100 ng de RNA total, usando o estojo de Amplificação de cDNA SMART RACE (Clontech), seguindo o protocolo do fabricante.

Os iniciadores de oligonucleótidos foram sintetizados e quantificados por Isogen Bioscience (Maarssen, Holanda). Os iniciadores foram dissolvidos em H2O até 100 pmol/yL e armazenados a -20°C. Um resumo de todos os iniciadores de PCR e sequenciação está tabulado (Tabela 5). Para PCR, DNA polimerase PfuTurbo® Hotstart (Stratagene, Amesterdão, Holanda; # de produto 600322) foi usada de acordo com as instruções do fabricante. Cada mistura reacional continha dNTPs mistos a 200 μΜ (Roche Diagnostics, Almere, Holanda; # de produto 1814362) , 12 pmol do iniciador reverso (RACEGlAl para VH3003-005, RACEVHApaI para VH3003-003 e RACEVlBsíWI para VL3003-003 e 005), Mistura de UPM a 7,2 pmol (Mistura de UPM: ShortUPMH3 a 2 μΜ e LongUPMH3 a 0,4 μΜ) , 0,6 pL do molde de cDNA 5'RACE, e 1,5 unidades de DNA polimerase PfuTurbo® Hotstart em tampão de reação PCR (fornecido com polimerase) num volume total de 30 pL. As reações PCR foram levadas a cabo com um Termociclador TGradient 96 (Whatman Biometra, Goettingen, Alemanha; # de produto 050-801) usando um programa com 35 ciclos: desnaturação a 95°C durante 2 min; 35 ciclos de 95°C durante 30 seg, a 55°C durante 30 seg, e 72°C durante 1,5 min; extensão final a 72°C durante 10 min. Se apropriado, as misturas de PCR foram armazenadas a 4°C até análise ou processamento adicional.

Tabela 5 - Iniciadores

Clonagem de Vh e Vl de -003-2F5 e Vl de -005 e Vh e Vl de -024 em Sistema de Vetor II pGEMT

Os produtos de reação foram separados por eletroforese num gel de agarose TAE a 1% e coloridos com brometo de etídio. Bandas do tamanho correto foram cortadas dos géis e o DNA foi isolado da agarose usando o estojo de extração em gel QiaexII (Qiagen, no de cat 20021) .

Foi adicionado aos fragmentos de PCR isolados em gel uma cauda de A por uma incubação de 10 min a 72 °C com dATP a 200 μΜ e 2,5 unidades de Amplitaq (Perkin Elmer) e foram purificados usando colunas MinElute (Qiagen). Os fragmentos de PCR com cauda de A foram clonados no vetor pGEMTeasy (Promega) usando o estojo e protocolo do sistema de vetor II pGEMT easy (LJ270, página 3/4) . 2 pL da mistura de ligação foram transformados em E. Coli competentes OneShot DH5oíT1R (Invitrogen) e plaqueados em placas LB/Amp/IPTG/Xgal.

Sequenciação

As regiões V -003 e -024 e a região VL de -005 foram sequenciadas por AGOWA (Berlim, Alemanha) após escolha de respetivamente 20 (Vh-003), 16 (Vl-003), 15 (VL-005) e 6 (VH e Vl-024) colónias brancas, isolamento de plasmideo e sequenciação com o iniciador reverso M13. A região Vh de -005 foi sequenciada diretamente no produto de PCR por uso do iniciador HCseq5. As sequências foram analisadas usando a suite avançada Vector NTI (Invitrogen).

Geração de vetores de expressão para os anticorpos -003, -005, -024 e anticorpo 3079 da Morphosys A região codificante de Vh de -003 foi amplificada por PCR a partir de um clone de plasmideo pGemT contendo a região Vh de -003, usando os iniciadores VH3003-003for e RACEVHApal, introduzindo locais de restrição adequados (HindIII e Apal) para clonagem em pConGlf0.4 (Lonza Biologics, Slough, RU) e uma sequência de Kozak ideal (GCCGCCACC). O vetor pConGlf0.4 contém a região constante de cadeia pesada de IgGl humana. O fragmento de PCR de Vh foi inserido, em grelha, no vetor pConGlf0.4 usando HindIII e Apal. O constructo foi verificado por análise de sequência. A região codificante de VH de -005 foi amplificada por PCR a partir de um clone de plasmídeo pGemT contendo a região Vh de -005, usando os iniciadores VH3003-5for e RACEVHApal, introduzindo locais de restrição adequados (HindIII e Apal) para clonagem em pConGlf0.4 e uma sequência de Kozak ideal. O fragmento de PCR de VH foi inserido, em grelha, no vetor pConGlf0.4 usando HindIII e Apal. O constructo foi verificado por análise de sequência. A região codificante de Vh de -024 foi amplificada por PCR a partir de um clone de plasmídeo pGemT contendo a região Vh de -024, usando os iniciadores VH300324exfor e RACEVHApal, introduzindo locais de restrição adequados (HindIII e Apal) para clonagem em pConGlf0.4 e uma sequência de Kozak ideal. O fragmento de PCR de Vh foi inserido, em grelha, no vetor pConGlf0.4 usando HindIII e Apal. O constructo foi verificado por análise de sequência. A região codificante de Vh do anticorpo 3079 da Morphosys foi sintetizada por GeneArt (Regensburg, Alemanha), com base nos dados publicados na patente WO 2005/103083 A2. A região codificante foi otimizada quanto aos codões para expressão em células HEK para intensificar os niveis de expressão e locais de restrição adequados (HindIII e Apal) para clonagem em pConGlf0.4 e uma sequência de Kozak ideal foram introduzidos. O plasmídeo contendo a região Vh sintética foi digerido com Apal e HindIII e o fragmento de Vh foi inserido, em grelha, no vetor pConGlf0.4. A região codificante de VL de -005 foi amplificada por PCR a partir de um clone de plasmídeo pGemT contendo a região Vl de -005, usando os iniciadores VL3003-5exfor e RACEVLBsiWI, introduzindo locais de restrição adequados (HindIII e PfI23II) para clonagem em pConKappa0.4 (Lonza Biologies) e uma sequência de Kozak ideal. O vetor pConKappaO.4 contém a região constante de cadeia leve kappa. 0 fragmento de PCR de VL foi inserido, em grelha, no vetor pConKappa0.4 usando HindIII e PÍI23II. 0 constructo foi verificado por análise de sequência. A região codificante de Vl de -003 foi amplificada por PCR a partir de um clone de plasmideo pGemT contendo a região VL de -003, usando os iniciadores VL3003-003for e RACEVLBsiWI, introduzindo locais de restrição adequados (HindIII e PÍI23II) para clonagem em pConKappa0.4 e uma sequência de Kozak ideal. O fragmento de PCR de Vl foi inserido, em grelha, no vetor pConKappa0.4 usando HindIII e PÍI23II. O constructo foi verificado por análise de sequência. A região codificante de VL de -024 foi amplificada por PCR a partir de um clone de plasmideo pGemT contendo a região VL de -024, usando os iniciadores VL3003-24-5exfor e RACEVLBsiWI, introduzindo locais de restrição adequados (HindIII e PÍI23II) para clonagem em pConKappa0.4 e uma sequência de Kozak ideal. O fragmento de PCR de VL foi inserido, em grelha, no vetor pConKappa0.4 usando HindIII e PÍI23II. O constructo foi verificado por análise de sequência. A região codificante de VL do anticorpo 3079 da Morphosys foi sintetizada por GeneArt, com base nos dados publicados em WO 2005/103083. A região codificante foi otimizada quanto aos codões para expressão em células HEK; para intensificar os níveis de expressão e locais de restrição adequados (HindIII e PÍI23II) para clonagem em pConKappa0.4 e uma sequência de Kozak ideal foram introduzidos. O plasmideo, contendo a região Vl sintética, foi digerido com PÍI23II e HindIII e o fragmento de VH foi inserido, em grelha, no vetor pConKappa0.4.

Os anticorpos foram transientemente expressos em células HEK-293F, como descrito no Exemplo 17, por cotransfecção dos seus vetores de cadeia pesada e cadeia leve.

Geração de linhas de células estáveis em células CH0-K1SV

Para geração de linhas de células estáveis, os vetores de cadeia pesada e leve de -003 ou -005 foram combinados num único vetor de gene duplo por técnicas de clonagem padrão.

Os vetores de gene duplo de -003 ou -005 foram linearizados e transfectados em células CHO-K1SV (Lonza Biologies), essencialmente como descrito pelo fabricante. As linhas de células estáveis foram selecionadas por seleção com sulfoximina de L-Metionina a 25 μΜ (MSX) como descrito por Lonza Biologies. Os clones produtores de topo foram selecionados e propagados em meio CD-CHO (Invitrogen) e os anticorpos foram purificados do sobrenadante de cultura de células como descrito no Exemplo 3. EXEMPLO 17

Mapeamento de epítopos usando mutagénese sítio-dirigida

Os iniciadores de oligonucleótidos foram sintetizados e quantificados por Isogen Bioscience (Maarssen, Holanda). Os iniciadores foram dissolvidos em H2O até 100 pmol/yL e armazenados a -20°C. Um resumo de todos os iniciadores de PCR e sequenciação está mostrado na Tabela 6. Para PCR, DNA polimerase PfuTurbo® Hotstart (Stratagene, Amesterdão, Holanda) foi usada de acordo com as instruções do fabricante. Cada mistura reacional continha dNTPs mistos a 200 μΜ (Roche Diagnostics, Almere, Holanda), 12 pmol de

ambos os iniciadores direto e reverso, 100 ng de DNA genómico ou 1 ng de DNA de plasmídeo e 1 unidade de DNA polimerase PfuTurbo® Hotstart em tampão de reação PCR (fornecido com polimerase) num volume total de 20 pL. As reações PCR foram levadas a cabo com um Termociclador TGradient 96 (Whatman Biometra, Goettingen, Alemanha) usando um programa com 32 ciclos: desnaturação a 95°C durante 2 min; 30 ciclos de 95°C durante 30 seg, um gradiente de 60-70°C (ou outra temperatura de emparelhamento especifica) durante 30 seg, e 72°C durante 3 min; extensão final a 72°C durante 10 min. Se apropriado, as misturas de PCR foram armazenadas a 4°C até análise ou processamento adicional. A eletroforese em gel de agarose foi realizada de acordo com Sambrook (Sambrook, Russell et al. 2000) usando géis de 50 mL, em lx tampão Tris Acetato EDTA. O DNA foi visualizado pela inclusão de brometo de etidio no gel e observação sob luz UV. As imagens do gel foram registadas por uma câmara CCD e um sistema de análise de imagens (GeneGnome; Syngene, através de Westburg B.V., Leusden, Holanda). A purificação de fragmentos de PCR desejados foi levada a cabo usando um Estojo de Purificação de PCR MinElute (Qiagen, através de Westburg, Leusden, Holanda; # de produto 28006), de acordo com as instruções do fabricante. O DNA foi quantificado por espetroscopia de UV (ver em baixo) e a qualidade foi avaliada por eletroforese em gel de agarose.

Alternativamente, os produtos de PCR ou digestão foram separados por eletroforese em gel de agarose (por exemplo quando estavam presentes múltiplos fragmentos) usando um gel de agarose Tris Acetato EDTA a 1%. 0 fragmento foi excisado do gel e recuperado usando o Estojo de Extração em

Gel QIAEX II (Qiagen; # de produto 20051), de acordo com as instruções do fabricante. A densidade ótica de ácidos nucleicos foi determinada usando um Espetrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Isogen Life Science, Maarssen, Holanda) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de DNA foi medida por análise da densidade ótica (OD) a 2 60 nm (uma unidade de OD260 nm = 50 pg/mL). Para todas as amostras, o tampão no qual os ácidos nucleicos foram dissolvidos foi usando como uma referência.

As enzimas de restrição e suplementos foram obtidos dos New England Biolabs (Beverly, MA, EUA) ou Fermetas (Vilnius, Lituânia) e usados de acordo com as instruções do fabricante. O DNA (100 ng) foi digerido com 5 unidades de enzima(s) no tampão apropriado num volume final de 10 pL (o volume de reação foi escalonado coOmo apropriado). As digestões foram incubadas à temperatura recomendada durante um minimo de 60 min. Para fragmentos requerendo digestões duplas com enzimas de restrição que envolvem tampões incompatíveis ou requisitos de temperatura, as digestões foram realizadas sequencialmente. Se necessário, os produtos de digestão foram purificados por eletroforese em gel de agarose e extração em gel.

As ligações de fragmentos de DNA foram realizadas com o Estojo de Ligação Quick (New England Biolabs) de acordo com as instruções do fabricante. Para cada ligação, DNA de vetor foi misturado com excesso molar de aproximadamente três vezes de DNA da inserção. DNA de plasmideo (1-5 pL de solução de DNA, tipicamente 2 pL de mistura de ligação de DNA) foi transformado em células de E. coli One Shot DH5oí-T1r (Invitrogen, Breda, Holanda; # de produto 12297-016) usando o método de choque térmico, de acordo com as instruções do fabricante. De seguida, as células foram cultivadas em placas de ágar Luria-Bertani (LB) contendo ampicilina a 50 pg/mL. As placas foram incubadas durante 16-18 h a 37°C até se tornarem evidentes colónias bacterianas.

As colónias bacterianas foram rastreadas quanto à presença de vetores contendo as sequências desejadas através de PCR de colónias usando a Mistura Principal de PCR ThermoStart (Abgene, através de Wetsburg, Leusden, Holanda; # de produto AB-938-DC15/b) e os iniciadores pConGlseql e pEE13.4seqrev2 (Tabela 6). As colónias selecionadas foram ligeiramente tocadas com uma ponta de pipeta de 20 pL e tocadas brevemente em 2 mL de LB para cultivo em pequena escala, e depois ressuspensas em mistura de PCR. PCR foi realizada com um Termociclador TGradient 96 usando um programa com 35 ciclos: desnaturação a 95°C durante 15 min; 35 ciclos de 94°C durante 30 seg, 55°C durante 30 seg e 72°C durante 2 min; seguido por um passo de extensão final de 10 min a 72°C. Se apropriado, as misturas de PCR foram armazenadas a 4°C até análise por eletroforese em gel de agarose. DNA de plasmideo foi isolado de culturas de E. coli usando os seguintes estojos da Qiagen (através de Westburg, Leusden, Holanda) , de acordo com as instruções do fabricante. Para preparação de plasmideos a granel (cultura de 50-150 mL) foi usado um Estojo HiSpeed Plasmid Maxi (# de produto 12663) ou um Estojo HiSpeed Plasmid Midi (# de produto 12643). Para preparação de plasmideos a pequena escala (cultura de ± 2 mL) foi usado um Estojo Qiaprep Spin Miniprep (# de produto 27106) e o DNA foi eluido em 50 pL de tampão de eluição (fornecido com o estojo).

Construção de vetor de expressão de HA-CD38 pEE13.4HACD38 0 domínio extracelular de CD38 humano foi amplificado a partir do plasmídeo pClpuroCD38 (obtido do Prof. M. Glennie, Tenovus Research Laboratory, Southampton General Hospital, Southampton, RU) usando os iniciadores cd38forha e cd38exrev. Por esta reação PCR foi introduzido um marcador de HA. Este produto de PCR foi usado como molde para uma segunda reação PCR com os iniciadores SPHMM38ex e cd38exrev. Por esta reação PCR foram introduzidos o péptido sinal SPHMM, locais de restrição e uma sequência de Kozak ideal (GCCGCCACC) para expressão ótima. Após purificação, este fragmento de PCR foi clonado no vetor de expressão pEE13.4 (Lonza Biologies) e a sequência codificante completa foi confirmada por sequenciação com os iniciadores pConKseql, pEE13.4seqrev, cd38seqlfor e cd38seq2rev (Tabela 6). Este constructo foi chamado pEE13.4HACD38

Mutagénese sitio-dirigida

Foram construídos três proteínas mutantes únicas de huCD38, nas quais T foi mutada em A na posição 237 (T237A, SEQ ID No: 32), Q foi mutada em R na posição 272 (Q272R, SEQ ID No: 33), ou S foi mutada em F na posição 274 (S274F, SEQ ID No: 34). A mutagénese sítio-dirigida foi realizada usando o Estojo de Mutagénese Sitio-Dirigida QuickChange II XL (Stratagene, Amesterdão, Holanda) de acordo com as instruções do fabricante. Este método incluiu a introdução de um local de restrição extra silencioso ou perda de um local de restrição para rastrear quanto à mutagénese bem-sucedida (local Xbal extra para o mutante T237A, local Bcgl extra para o mutante Q272R e perda do local Sspl para o mutante S274F). Brevemente, 5 pL de lOx tampão de reação, 1 pL de oligonucleótido HACD38T237Afor2, HACD38Q272Rfor ou HACD38S274Ffor (100 pmol/pL), 1 pL de oligonucleótido HACD38T2 37Arev2, HACD38Q272Rrev ou HACD38S274Frev (100 pmol/pL), 1 pL de mistura de dNTP, 3 pL de Quicksolution, 1 pL de plasmídeo pEE13.4HACD38 (50 ng/pL) e 1 pl de DNA polimerase PfuUltra HF foram misturados num volume total de 50 pL e amplificados com um Termociclador TGradient 96 (Whatman Biometra, Goettingen, Alemanha; # de produto 050-801) usando um programa com 18 ciclos: desnaturação a 95°C durante 1 min; 18 ciclos de 95°C durante 50 seg, 60°C durante 50 seg, e 68°C durante 10 min. As misturas de PCR foram armazenadas a 4°C até processamento adicional. De seguida, as misturas de PCR foram incubadas com 1 pL de Dpnl durante 60 min a 37°C para digerir o vetor WT pEE13.4HACD38 e armazenadas a 4°C até processamento adicional. A mistura reacional foi precipitada com 5 pL de NaAc a 3 M e 125 pL de etanol, incubada durante 20 minutos a -20°C e girada para baixo durante 20 minutos a 4°C a 14000xg. O pélete de DNA foi lavado com etanol a 70%, seco e dissolvido em 4 pL de água. O volume de reação total de 4 pL foi transformado em células de E. coli competentes One Shot Top 10DH5a TlR (Invitrogen, Breda, Holanda) de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). De seguida, as células foram plaqueadas em placas de ágar Luria-Bertani (LB) contendo ampicilina a 50 pg/mL. As placas foram incubadas durante 16-18 h a 37°C até se tornarem evidentes colónias bacterianas. As colónias foram rastreadas por PCR de colónias usando os iniciadores pConGlseql e pEE13.4seqrev2 (Tabela 5) e digeridas com as enzimas de restrição relevantes para rastrear quanto à incorporação do oligonucleótido mutagénico. 2 clones positivos para cada mutante foram cultivados e DNA de plasmídeo foi isolado. A sequência codificante completa de HACD38n foi determinada usando os iniciadores cd38seqlfor, pConGlseql e pEE13.4seqrev2 para confirmar a presença das mutações e a ausência de mutações indesejáveis adicionais.

Seguenciação de DNA

Amostras de DNA de plasmídeo foram enviadas para a AGOWA (Berlim, Alemanha) para análise de sequência. As sequências foram analisadas usando software avançado Vector NTI (Informax, Oxford, RU).

Expressão transiente em células HEK-293F Células Freestyle™ 293-F (um subclone de HEK-293 adaptado a crescimento em suspensão e meio Freestyle quimicamente definido, (HEK-293F)) foram obtidas da Invitrogen e transfectadas com pEE13.4HACD38 e com os três constructos transportando as mutações T237A, Q272R e S274F, de acordo com o protocolo do fabricante usando 293fectina (Invitrogen). Sobrenadantes de cultura de células transfectadas foram usados em ELISA para estudos de ligação a anti-CD38.

Ligação de anticorpos anti-CD38

Placas de ELISA (Greiner, # 655092) foram revestidas O/N a 4°C com 1 yg de anticorpo anti-HA (Sigma, # H-9658) e subsequentemente bloqueadas com soro de galinha a 2%. Os sobrenadantes de cultura de células HEK293F transfectadas foram diluídos, aplicados às placas de ELISA e incubados durante 1 hr à RT. Após lavagem, diluições em série de HuMabs -003 e -005 foram adicionadas e incubadas durante 1 hr à RT. Os anticorpos ligados foram detetados com anticorpos anti-IgG humana de cabra conjugados com HRP. O ensaio foi desenvolvido com ABTS (Roche, # 1112597) e a absorvância foi medida a 405 nm usando um espetrofotómetro.

Como pode ser visto a partir das Figuras 23A-23C, ambos -003 e -005 se ligam a CD38 humano WT. A ligação de -003 não foi afetada pela introdução das mutações T237A (Figura 23A) , Q272R (Figura 23B) ou S274F (Figura 23C) . -005 foi capaz de se ligar a CD38 transportando a mutação T237A (Figura 23A). A ligação de -005 a CD38 com a mutação Q272R foi gravemente afetada (Figura 23B), no que diz respeito tanto à EC50 como à capacidade de ligação máxima. -005 não foi capaz de se ligar ao CD38 mutante em que a serina na posição 274 foi substituída por fenilalanina (Figura 23C).

Estes dados mostram que -003 e -005 se ligam a epítopos diferentes. Além do mais, estes estudos revelaram que a ligação de -005 a CD38 é sensível a mutações nas posições 272 e 274. Particularmente, S274 é essencial para a ligação de -005 a CD38.

Tabela 6 - Iniciadores Nome Sequência

rvnftforh* CT GCT GT ©GCGC ATGGT QTG GGCCTÂCCCTTACG AC8TGC

cu o oionid CTGACTACeCCAGõTGGCGOCAGACSTGQAGC

cd38exrev AGGTCAGGTACCTCAGATCTCAGATGTGCAAG

TATAQCCCGGGGCCGCCAGCATGTGGTGGCGCCTGTGGTG S PHMM3 8 ex GCTGCTGCTGCTGQTGCTGCTGÇTGTGGCCCATGGTGTGG

GCC

pConGlseql GAAGACTTAAGGCAGCGGCAGAA

pConKseql GTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGC

pEE13.4seqrev TGCATTCATTTTATGTTTCAGGT

pEE13.4seqrev2 TCGGACATCTCATGACTTTCTTT

cd38seqlfor AGGACACGCTGCTAGGCTACCTT

cd38seq2rev GTCCTTTCTCCAGTCTGGGCAAG

„ TCCACCATGTATCACCCAGGCCTCTAGAGCCTGAACCTTCT HACD38T237Arev2 U s Ge; íb

HACD3 8 T2 3 7Af or 2 CAACCASAGAAGGTTCAGGGTCTÂGAGGCCTGGGTGATACA

HACD38Q272Rrev GATATTCTTGCAGGAAAATCGAATATTCCTTTTGCTTAT

Nome Sequência

HACD3 8Q2 72Rfor ATAAGCAAAAGGAATATTCGATTTTCCTGCAAGAATATC

HACD38S2 7 4Frev TCTGTAGATATTCTTGCÂSAAMATTGAATeTTCCTTTTGCTT

ATA

HACD38S274Ff or TATAAGCAAAAQGAACATTCAATTTTTCTGCAAGAATATCTAC

AGA EXEMPLO 18

Indução da proliferação de PBMC -003, -005 e -024 foram testados num ensaio essencialmente como descrito em Ausiello et al., Tissue antigens 56, 538-547 (2000). Brevemente, PBMCs de dadores saudáveis foram cultivadas a 1 x 105 células/poço em placas com 96 poços de fundo redondo na presença de anticorpos (concentração final: 1,1 - 3,3 - 10 - 30 yg/mL) em 200 yL de RPMI++. A estimulação de células com IL-15 (a 333 ng/mL; Amgen Inc., Thousand Oaks, CA, EUA) foi usada como controle positivo. Após uma incubação de 4 dias a 37°C, 30 yL de 3H-timidina (16,7 yCi/mL) foram adicionados, e a cultura foi continuada O/N. A incorporação de 3H-timidina foi avaliada usando um contador gama Packard Cobra (Packard Instruments, Meriden, DT, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Os dados estão mostrados como as cpm médias (± SEM) de PBMCs obtidas de 10 dadores. Os resultados mostram que -003 e -005 não induzem proliferação significativa de PBMCs (Figura 24A). Igualmente, -024 não induz proliferação significativa de PBMCs (dados não mostrados). EXEMPLO 19

Indução de IL-6 -003, -005 e -024 foram testados num ensaio como descrito em Ausiello et ai., Tissue antigens 56, 538-547 (2000).

Brevemente, PBMCs foram cultivadas a 1 x 106 células/poço em placas com 48 poços na presença de 20 pg/mL de anticorpos e LPS a 10 ng/mL (Sigma-Aldrich Chemie,

Zwijndrecht, Holanda) em 500 pL de RPMI++. Após uma incubação O/N a 37°C, o sobrenadante foi recolhido e armazenado a -20°C. A concentração de IL-6 foi avaliada por ELISA (Estojo de ELISA IL-6, U-CyTech Biosciences, Utrecht, Holanda) de acordo com as instruções do fabricante. Os dados estão mostrados concentração média em pg/mL (± SEM) de 7 dadores. Os resultados mostram que -003 e -005 não induzem libertação de niveis significativos de IL-6 (Figura 24B) . Igualmente, -024 não induziu libertação de niveis significativos de IL-6 (dados não mostrados). EXEMPLO 20

Indução da libertação de IFN-y -003, -005 e -024 foram testados num ensaio como descrito em Ausiello et al., Tissue antigens 56, 538-547 (2000).

Brevemente, PBMCs foram cultivadas a 1 x 106 células/poço em placas com 48 poços na presença de 20 pg/mL de anticorpos e OKT-3 a 1 pg/mL (Sanquin, Amesterdão, Holanda) em 500 pL de RPMI++. Após uma incubação O/N a 37°C, o sobrenadante foi recolhido e armazenado a -20°C. A concentração de IFN-γ foi avaliada por ELISA (Estojo de ELISA IFN-γ, U-CyTech Biosciences, Utrecht, Holanda) de acordo com as instruções do fabricante. Os dados estão mostrados concentração média em pg/mL (± SEM) de 9 dadores. Os resultados mostram que -003 e -005 não induzem libertação de níveis detetáveis de IFN-γ (Figura 24C). Igualmente, -024 não induziu libertação de níveis significativos de IFN-γ (dados não mostrados). EXEMPLO 21

Afinidade de ligação de -003 e -005 a CD38 recombinante A ligação de -003 e -005 a CD38 foi testada usando ressonância de plasmão de superfície. Brevemente, anticorpos purificados foram imobilizados em sensorchip CM-5 (Biacore, Uppsala, Suécia) através de acoplamento de amida. CD38 marcado com HA (ver Exemplo 3) foi fluído sobre ele, e a ligação de antigénio a mAb foi detetada por uma mudança no índice refratário à superfície do chip usando um Biacore 3000 (Biacore). As constantes associadas e de taxa para -003 (Tabela 7) e -005 (Tabela 8) estão resumidas em baixo, média de 3 experiências ± SD, e mostram que ambos -003 e -005 têm uma afinidade elevada quanto a CD38.

Tabela 7 - Constante de associação e taxa a 25°C -003 ka (1/Ms) 2,17 x 105 ± 2,65 x 104 kd (1/s) 1,9 x IO"4 ± 4,51 x 10"6 KA (1/M) 1,14 x 109 ± 1,58 x 108 KD (M) 8,85 x 10“10 ± 1,2 x 10"10

Tabela 7 - Constante de associação e taxa a 25°C -005 ka (1/Ms) 8, 88 x 104 ± 1,95 x 104 kd (1/s) 5,22 x IO"4 ± 1,16 x 10“5 KA (1/M) 1,7 x 108 ± 3,68 x 107 KD (M) 6,06 x 10~9 ± 1,21 x 10“9 EXEMPLO 22

Mapeamento de epítopos

Mapeamento de epítopos usando PEPSCAN

De acordo com procedimentos conhecidos (Geysen et al. 1984. Use of peptide synthesis to probe virai antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid. Proc Natl Acad Sei USA 81: 3998; Slootstra et al. 1996. Structural aspects of antibody-antigen interaction revealed through small random peptide libraries. Mol Divers 1: 87; Puijk et al. 2001. Segment synthesis. Em PCT, Holanda, p.l.) foram sintetizados péptidos lineares de 20-mero e alçados de 15-mero sobrepostos abrangendo 138 aminoácidos no terminal C de CD38 humano. Além do mais, com base na sequência no terminal C, foram preparados péptidos com alça única de tamanho diferente abrangendo a região KNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI, a região CVHNLQPEKVQTLEAWVIHGG, e a região CLESIISKRNIQFSAKNIYRC. Adicionalmente foram concebidos conjuntos extra para reconstruir regiões com alça dupla que eram compostas por SKRNIQFSCKNIYR e EKVQTLEAWVIHGG. As cisteinas nativas foram substituídas por alaninas. Os péptidos foram rastreados num ensaio ELISA usando cartões mini-PEPSCAN com formato de cartão de crédito. Síntese de péptidos

Os péptidos foram sintetizados usando química Fmoc padrão e desprotegidos usando TFA com removedores. Subsequentemente, os péptidos desprotegidos foram reagidos na microrrede com uma solução a 0,5 mM de 2,6-bis(bromometil)piridina ou 2,4,6-tris(bromometil)mesitileno em bicarbonato de amónio (20 mM, pH 7,9), suplementado com acetonitrilo (1:1 [volume/volume]). As microrredes foram gentilmente agitadas na solução durante 30-60 min, enquanto completamente cobertas na solução. Finalmente, as microrredes foram lavadas extensivamente com excesso de H2O Millipore e sonicadas em tampão de disrupção contendo dodecilsulfato de sódio a 1%, 3-mercaptoetanol a 0,1%, em PBS (pH 7,2) a 70°C durante 30 min, seguido por sonicação em H2O Millipore durante outros 45 min.

Ensaio de ELISA PEPSCAN

Os cartões de polietileno com formato de cartões de crédito com 755 poços, contendo os péptidos covalentemente ligados, foram incubados com soro (p.ex., diluído 1:1000 em solução de bloqueio que contém soro de cavalo a 5% [volume/volume] e ovalbumina a 5% [peso/volume]) (4°C, durante a noite).

Após lavagem, os péptidos foram incubados com anti-Ig humana de coelho peroxidase (diluição 1:1000, 25°C, 1

hora) , e após lavagem o substrato de peroxidase (sulfonato de 2,2'-azino-di-3-etilbenztiazolina e H2O2 a 3% e 2 yL/mL) foi adicionado. Após uma hora, o desenvolvimento de cor foi medido com uma câmara CCD e um sistema de processamento de imagens. O cenário consiste numa câmara CCD com uma lente de 55 mm (Vídeo Câmara Sony CCD XC-77RR, Nikon micro-nikkor 55 mm lente f/2,8), um adaptador de câmara (adaptador de Câmara Sony DC-77RR) e o pacote Image Processing Software Óptimas, versão 6.5 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD 20910, E.U.A.; Óptimas funciona num sistema de computador

Pentium II). Método para representação de epítopos

Aminoácidos individuais foram identificados por motivos de dipéptidos que representam as unidades únicas mais pequenas na sequência de aminoácidos de CD38 humano. A todos os motivos de dipéptidos presentes em cada um dos 1164 péptidos testados foi atribuído o valor de ELISA obtido pelo respetivo péptido inteiro. Para classificar os motivos de dipéptidos de ligação forte a fraca, um sinal relativo foi calculado por divisão do valor de ELISA calculado para cada motivo individual pelo valor de ELISA médio de todos os 1164 péptidos lineares e alçados testados, e estes foram separados quanto a valores decrescentes. Deste modo foram consideradas as contribuições de aminoácidos para os epítopos conformacionais. Para cada um dos mAb testados, todos os motivos de dipéptidos pontuando acima de 2,5 (i.e., os valores de ELISA de péptidos contendo estes motivos foram pelo menos 2,5 vezes o valor de ELISA médio daqueles obtidos com todos os 1164 péptidos) foram selecionados. Os dados foram descomplicados em contribuições de aminoácidos únicos representados na sequência linear de CD38 por um sistema de pontuação.

Caminhando ao longo da sequência linear de CD38 e usando as unidades de dipéptidos únicas como um ponto de referência foi atribuído um ponto de cada vez que um aminoácido de CD38 estava presente neste conjunto de péptidos com pontuação elevada.

Descobriu-se que -003, 005 e -024 se ligavam todos às regiões SKRNIQFSCKNIYR e EKVQTLEAWVIHGG de CD38 humano. -003 reconheceu especialmente os motivos RNIQF e WVIH, -005 reconheceu especialmente os motivos KRN e VQTL. EXEMPLO 23

Atividade enzimática A atividade enzimática de CD38 humano foi medida num ensaio essencialmente como descrito em Graeff et al., J. Biol. Chem. 269, 30260-30267 (1994). Brevemente, o substrato NGD+ (80 μΜ) foi incubado com CD38 (dominio extracelular marcado com His de CD38 humano a 0,6 yg/mL, ver Exemplo 3 no que toca à purificação de His-CD38) num tampão contendo Tris-HC1 a 2 0 mM, pH 7,0. A produção de cGDPR pode ser monitorizada espetrofotometricamente ao comprimento de onda de emissão de 410 nm (excitação a 300 nm) . Neste exemplo foram usados um filtro de excitação de 340 ± 60 nm e um filtro de emissão de 430 ± 8 nm.

Para testar a eficácia de -003, -005 e -024 na atividade enzimática de CD38, a proteina His-CD38 recombinante foi pré-incubada durante 15 min à temperatura ambiente com várias concentrações (30, 3, 0,3 e 0,03 yg/mL) dos diferentes anticorpos antes da adição do substrato NGD+. A produção de GDP-ribose ciclica (cGDPR) foi registada a diferentes pontos temporais após adição de anticorpos (3, 6, 9, 12, 30, 45, 60, 75 e 90 min) . A Fig 25B mostra que -005 tem um efeito inibidor pronunciado na produção de cGDPR. Após 90 minutos, a adição de -005 a 30 e 3 yg/mL resultou numa produção de cGDPR reduzida em 32% e 34% (Tabela 9) . Foram observados resultados similares em experiências independentes usando diferentes lotes de -005. Não foi observado nenhum efeito inibidor na produção de cGPDR após adição de -003 (Figura 25B, Tabela 9) , -024 (Figura 25D, Tabela 9) ou anti-KLH (Figura 25A, Tabela 9).

Com base nestas descobertas espera-se também que -005 iniba a síntese de ADP-ribose Cíclica (cADPR) a partir de NAD+. A inibição da síntese de cADPR pode ser determinada de acordo o método de HPLC descrito em Munshi et al., J. Biol. Chem. 275, 21566-21571 (2000) .

Tabela 9. Produção de cGDPribose na presença de anticorpos específicos quanto a CD38 ou anti-KLH.

EXEMPLO 24

Comparação de -003 e -005 com anticorpo 3079 da Morphosys.

Os anticorpos -003 e -005 foram funcionalmente comparados com o anticorpo 3079 da Morphosys (TH-3079). Métodos para clonagem e expressão do anticorpo TH-3079 da Morphosys estão descritos no Exemplo 16. Métodos para CDC estão descritos no Exemplo 6. Métodos para ADCC estão descritos no Exemplo 5. A Figura 26A mostra que -005 e -003 e TH-3079 induzem lise mediada por CDC de células CHO transfectadas com CD38, com lise máxima similar. Quando são comparados valores de EC50, o anticorpo -005 é melhor que TH3079 na indução de lise de células CHO-CD38, com EC50 2 vezes mais baixas (ver Tabela 10). A Figura 26B mostra que -005 é superior do que TH-3079 na indução de lise mediada por CDC de células Daudi-luciferase, com a lise máxima por -005 sendo 2-3 vezes mais elevada do que por TH3079. Quando são comparados valores de EC50, o anticorpo -005 é similar a TH-3079 na indução de lise de células Daudi-luciferase (ver Tabela 10). -003 não induz lise mediada por CDC significativa de células Daudi-luciferase . A Figura 26C mostra que nesta experiência -005, -003 e TH-3079 medeiam a lise de células alvo Daudi através de ADCC. Não foi encontrada nenhuma diferença em (log) EC50 e lise máxima (Tabela 11, n = 5).

Tabela 10. Valores de lise máxima e EC50 de anticorpos específicos quanto a CD38 em CDC.

Tabela 10. Valores de lise máxima e EC50 de anticorpos específicos quanto a CD38 em ADCC.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Genmab A/S <120> Anticorpos contra CD38 para tratamento do mieloma múltiplo <130> N402226EP-B <160> 34 <170> Patentln versão 3.2 <210> 1 <211> 321

<212> DNA <213> Homo sapiens <4 0 0> 1 gacafcccag* tgacccagtc tccstectca ctgtctgcat etgtaggaga cagagteacc 60 ateaettgtc gggcgagtca gggtattagc agotggtfcag cctggfcatca gc&amp;g&amp;aacca Í30 gagaaagccc ctaagtccct gatcfcatgcfc gctfcccagtt tgcaa&amp;gtgg ggtcccafcca 180 aggtuoagcsg gcagfcggafcc tgggacagafc tteaatcfcca ccateagcag cctgcagcct

24Q gaag&amp;tttfcg caactfcaet® ctgccaaeag tat&amp;afcagfct accctegg&amp;c gfctcggccaa 300 gggaeeaagg fcggauaafccaa a 321

<210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Asp lia Gin Met Thr Gin Ser Pr o Ser Ser Leu Sér Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15

Mp Arg Vai Tfer XIa Th,r Cys Arg Ala Sm Gin Gly Ile Ser Ser Trp 30 2S 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala Fro ltys Ser Leu Xle 35 " 40 45

Tyr Ala Ala Ser Sm Leu Gin Ser Gly Vai Pro £far Arg Phe Sar Gly

50 55 SO

Ser Gly Ser Gly Thz Asp Phe Thr Leu Tlir XI© Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ma Thr Tyr Tyr Çys Gin Gin 'Tyr hsn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95

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<210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

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1 5 W <210> 4

<211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

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<210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

Gin Gin Tyr &amp;S» Ser Tyr Fr© Arg Thr 1 5 <210> 6 <211> 366

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 caggtccagc tggfcgcagfcc tggggstgag gtgaagaagc ctgggfccctc ggçg&amp;sggtc 60 teccfcgcaagg ctfccfcgg&amp;gg c&amp;cefctcagc; agctatgcfct fcc&amp;gctgggt gcgae&amp;ggcc 120 cctggaeaag gacttg&amp;gtg g&amp;fcggg&amp;agg gtcatccstt teettggfcat agcaaactce· 180 gcacagaaat tccagggcag agtcaoaatt accgoggaca aatescacgag cacagcctac 240 atggacctga gcagcctgag afcofcgaggac aoggocgfeat afcfcactgtgc gagagatgat; 300 atagcagcao ttggfcoectt fcg&amp;ct&amp;ctgg ggocaggga* eecfcggtcaç cgtctcctca 360 gcctcc 366

<210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7

Oln Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ma Gin Vai lys Lyss Pro Gly Ser 1 5 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser €ys Lys Ala Ser Gly Gly Thr P&amp;e Ser Ser Tvr 20 23 30

Ala Fhe Ser Trp Vai &amp;rg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Gin Trp Mat 35 40 45

Gly Arg vai xie Pro Phé Leu Gly IIe Ala Asn Ser Ma Gin Lys Phe 50 55 60

Gin. Gly Arg Vai Thr Xle Thr Ale Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr SB 70 75 80

Met Ã.ap Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys 85 .90 95

Ala Arg Asp Asp Ile Ala Ala Leu Gly Pro P.ha A&amp;p Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser 115 130

<210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Ssr Tyr &amp;1&amp; Phe Ser 1 5

<210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 Ο Ο> 9

Aar# V&amp;l 11$ Pro Phe Leu Gly XI© Ma &amp;s» Ser Ma Gin Lye Phe Gin 1 5 10 15

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<210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 10 &amp;sp Mp II© &amp;la Ãla Leu Gly Pr o Pias ãsp Tyr 1 5 10 <210> 11 <211> 321

<212> DNA <213> Homo sapiens <4 0 0> 11 gaãsttgtgt fcgacaeagte teeageeaee etgecttfcgt ctcc&amp;gggga aagagccaec 60 etctcctgca gggceagfcea gagfcgfctagc agctacttag cctggt&amp;cca acaga&amp;acct 120 ggceaggcfcc ccssggctoet catcfcafcgafc gcatacaaaa gggccacfcgg catcceagcc

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<210> 12 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 12

Glu 11 e Vai Leu Thr Gls Ser Pro Ais Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 XO 15

Glu .Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Tyr ao 25 30

Leu Ala Txp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Xle 3S 40 45

Tyr Ãsp Ala Ser Asn Arg Ais Thr Gly Xle Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 S5 50

Ser Glv Ser Gly Thr Aep Phe Thr Leu Thr Sle Ser Ser Leu Glu Pro 55 ' 70 75 80

Glu Asp Pfce Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Pro S5 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Xle Lys 100 105

<210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 13

Arg Ala Ser Gin. Ser Vai Ser Ser Tyx Leu Ala Λ IT *

X D

<210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 14

Asp Ma Ser Mn Arg Tfar 1 5

<210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15

Gin Ql» Arg Ser Asn $rp Pro Pro ‘Fhr Phe I S 13 <210> 16 <211> 372

<212> DNA <213> Homo sapiens <4 0 0> 16

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<210> 17 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 17

Slu Vai Gin Lôu Leu Glu Ser GXy Gly GXy Leu Vai Gin Pr o Gly Gly 1 5 10" 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Va.l Ser Giy Phe Thr Phe Asa Ser Phs 20 2S ~ 30

Ala Met Ser Tro Vai. Arg Gin Ala Pra <3Xv X»ys Gly Leu. GXu Trp Vai

35 " 40 “ 4S

Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Gyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 50

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Ala Lyg Asp Lys Ile Leu Trp Phs Glv Glu Pro Vai Lha Asp Tyr Tro 100 105 11Ò

Gly Gls Glv Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser XIS 120

<210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 18

Ser Phe &amp;la M&amp;t Ser 1 5

<210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 19

&amp;la He Ser siv Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ma Asp Ser Vai Lys 1 ~ 5 10 ÍS

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<210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20

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<210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22

Slu Ile Vai Leu Tíir Gin Ser Sr ο Ala Thr Léu Ser Leu Ser Pm Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Tbr Leu Ser Cys Arg Ala Ser G2» Ser vai Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyx Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Gly Leu Leu Ile 35 40 45

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<210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23

Arg Ala Ser Gin Ser Vai S&amp;r Ser Tyr Leu Ala 1 5 10

<210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24

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<210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 <31n Glia Ara Ser Asa. Trp Pr o Leu Thr 1 ' 5 <210> 26 <211> 366

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Claims (31)

REIVINDICAÇÕES

1. Um anticorpo que se liga a CD38 humano, em que o referido anticorpo compreende regiões variáveis de cadeia leve humana e cadeia pesada humana, em que a região variável de cadeia leve compreende uma CDR1 de Vl tendo a sequência como apresentada em SEQ ID No: 13, uma CDR2 de Vl tendo a sequência como apresentada em SEQ ID No: 14 e uma CDR3 de Vl tendo a sequência como apresentada em SEQ ID No: 15, e a região variável de cadeia pesada compreende uma CDR1 de VH tendo a sequência como apresentada em SEQ ID No: 18, uma CDR2 de VH tendo a sequência como apresentada em SEQ ID No: 19 e uma CDR3 de Vh tendo a sequência como apresentada em SEQ ID No: 20.

2. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, que é um anticorpo monoclonal humano.

3. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado por ser um anticorpo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM de comprimento total.

4. O anticorpo de acordo com a reivindicação 3, que é um anticorpo IgGl.

5. O anticorpo de acordo com a reivindicação 4, que é um anticorpo IgGl,K.

6. O anticorpo de acordo com a reivindicação 3, que é um anticorpo IgM.

7. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 6, que é um anticorpo IgM,K.

8. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, compreendendo uma região VH tendo a sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID No: 17.

9. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, compreendendo uma região VH tendo a sequência de aminoácidos abrangendo a região CDR1 de VH - CDR3 de VH de SEQ ID No: 17.

10. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, compreendendo uma região Vl tendo a sequência de aminoácidos como apresentada em SEQ ID No: 12.

11. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo é codificado por (i) ácidos nucleicos de cadeia leve humana e cadeia pesada humana compreendendo sequências de nucleótidos nas suas regiões variáveis como apresentadas em SEQ ID No: 11 e SEQ ID No: 16, respetivamente; ou (ii) ácidos nucleicos de cadeia leve humana e cadeia pesada humana compreendendo sequências de nucleótidos nas suas regiões variáveis, que são modificações de sequências conservativas das sequências como apresentadas em (i).

12. Um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, que é um fragmento de anticorpo ou um anticorpo de cadeia única.

13. Um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, que está numa forma substancialmente isolada.

14. Um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, compreendendo adicionalmente um ligante quelante para anexação de um radioisótopo.

15. Um ácido nucleico isolado codificando um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

16. Um vetor de expressão compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificando um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

17. Uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica que produz um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

18. Um imunoconjugado compreendendo um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ligado a um agente citotóxico, um radioisótopo ou um fármaco.

19. Uma molécula biespecifica ou multiespecifica compreendendo o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 e uma especificidade de ligação quanto a uma célula efetora humana.

20. Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, o imunoconjugado de acordo com a reivindicação 18, ou a molécula biespecifica ou multiespecifica de acordo com a reivindicação 19 e um transportador farmaceuticamente aceitável.

21. Um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, um imunoconjuqado de acordo com a reivindicação 18, uma molécula biespecífica ou multiespecifica de acordo com a reivindicação 19 ou um vetor de expressão de acordo com a reivindicação 16 para uso como um medicamento.

22. Um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, um imunoconjuqado de acordo com a reivindicaçãi 18, a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 20, a molécula biespecífica ou multiespecifica de acordo com a reivindicação 19 ou um vetor de expressão de acordo com a reivindicação 16 para uso num método de tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio envolvendo células expressando CD38, em que a doença ou distúrbio é selecionado do grupo consistindo em linfoma/leucemias de células B incluindo leucemia linfoblástica/linforna de células B precursoras e linfomas de não Hodgkin de células B; leucemia linfoblástica aguda; neoplasmas de células B maduras incluindo leucemia linfocítica crónica (CLL)/linfoma linfocítico pequeno (SLL) de células B; leucemia linfocítica aguda de células B; leucemia pró-linfocítica de células B; linfoma linfoplasmacítico; linfoma de células do manto (MCL); linfoma folicular (FL) incluindo FL de grau baixo, grau intermédio e grau elevado; linfoma de centros foliculares cutâneos; linfoma de células B da zona marginal incluindo tipo MALT, tipo nodal e esplénico; leucemia de células pilosas; linfoma de células B grandes difusas; linfoma de Burkitt; plasmacitoma; mieloma de células plasmáticas; leucemia de células plasmáticas; distúrbio linfoproliferativo pós-transplante; macroglobulinemia de Waldenstrõm; leucemias de células plasmáticas; linfoma de células grandes anaplásicas (ALCL); mieloma múltiplo; linfoma de Hodgkin; neoplasmas de células T e células NK maduras incluindo leucemia pró-linfocitica de células T; leucemia granular grande de células T; leucemia agressiva de células NK; leucemia/linforna de células T adultas; linfoma de células NK/T extranodais; linfoma de células T do tipo nasal, tipo enteropatia; linfoma de células T hepatoesplénicas; linfoma de células T tipo paniculite subcutânea; linfoma de células NK blásticas; Micose Fungoide/Sindrome de Sézary; distúrbios linfoproliferativos de células T positivos quanto a CD38 cutâneos primários incluindo linfoma de células grandes anaplásicas cutâneas C-ALCL, papulose linfomatoide e lesões limite; linfoma de células T angioimunoblásticas, linfoma de células T periféricas não especificado; linfoma de células grandes anaplásicas; leucemia mieloide aguda incluindo leucemia pró-mielocítica aguda; e doenças mieloproliferativas crónicas incluindo leucemia mieloide crónica.

23. 0 anticorpo, imunoconjugado, composição farmacêutica, molécula biespecifica ou multiespecifica ou vetor de expressão para uso de acordo com a reivindicação 22, em que a doença é linfoma de não Hodgkin de células B.

24. 0 anticorpo, imunoconjugado, composição farmacêutica, molécula biespecifica ou multiespecifica ou vetor de expressão para uso de acordo com a reivindicação 22, em que a doença é mieloma múltiplo.

25. 0 anticorpo, imunoconjugado, composição farmacêutica, molécula biespecífica ou multiespecifica ou vetor de expressão para uso de acordo com a reivindicação 22, em que a doença é leucemia linfoblástica aguda.

26. 0 anticorpo, imunoconjugado, composição farmacêutica, molécula biespecifica ou multiespecifica ou vetor de expressão para uso de acordo com a reivindicação 22, em que a doença é leucemia linfoblástica crónica de células B.

27. 0 anticorpo, imunoconjugado, composição farmacêutica, molécula biespecifica ou multiespecifica ou vetor de expressão para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 26, em que o método compreende administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais ao sujeito.

28. 0 anticorpo, imunoconjugado, composição farmacêutica, molécula biespecifica ou multiespecifica ou vetor de expressão para uso de acordo com a reivindicação 27, em que o um ou mais agentes terapêuticos adicionais são selecionados de um agente quimioterapêutico, um agente anti-inflamatório ou um agente imunossupressor e/ou imunomodulador.

29. 0 anticorpo, imunoconjugado, composição farmacêutica, molécula biespecifica ou multiespecifica ou vetor de expressão para uso de acordo com a reivindicação 27, em que o um ou mais agentes terapêuticos adicionais são selecionados de um grupo consistindo em cisplatina, gefitinib, cetuximab, rituximab, bevacizumab, erlotinib, bortezomib, talidomida, pamidronato, ácido zoledrónico, clodronato, risendronato, ibandronato, etidronato, alendronato, tiludronato, trióxido arsénico, lenalidomida, filgrastim, pegfilgrastim, sargramostim, ácido hidroxâmico de suberoilanilida e SCIO-469.

30. Um método in vitro para deteção da presença de antigénio CD38 ou uma célula expressando CD38, numa amostra compreendendo: a) contacto da amostra com o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e CD38; e b) deteção da formação de um complexo.

31. Um anticorpo anti-idiotípico ligando-se a um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12.