PT1558648E - Anticorpos monoclonais humanos contra cd20 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO ANTICORPOS MONOCLONAIS HUMANOS CONTRA CD20

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0001] A molécula CD20 (também designada por antigénio de diferenciação com restrição ao linfócito B ou Bp35) é uma proteína transmembranar hidrófoba com um peso molecular de aproximadamente 35 kD, localizada em linfócitos pré-B e em linfócitos B maduros (Valentine et al. (1989) J. Biol. Chem. 264 (19) : 11282-11287; e Einfield et al. (1988) EMBO J. 7(3):711-717). 0 CD20 é encontrado na superfície de mais de 90% das células B do sangue periférico e órgãos linfáticos e é expresso durante o desenvolvimento inicial das células pré-B, permanecendo até à diferenciação das células plasmáticas. O CD20 está presente quer em células B normais, quer em células B malignas. Em particular, o CD20 é expresso em mais de 90% dos linfornas de células B não-Hodgkin (NHL) (Anderson et al. (1984) Blood 63(6):1424-1433), mas não se encontra presente em células estaminais hematopoiéticas, células pró-B, células plasmáticas normais ou em outros tecidos normais (Tedder et al. (1985) J. Immunol. 135(2):973-979).

[0002] A região carboxi-terminal com 85 aminoácidos da proteína CD20 está localizada no interior do citoplasma. O comprimento desta região contrasta com o correspondente a outras estruturas superficiais específicas das células B, tais como as cadeias pesadas da IgM, IgD e da IgG ou agentes de histocompatibilidade de classe II α ou cadeias β, que possuem regiões intracitoplasmáticas relativamente curtas, com 3, 3, 28, 15 e 16 aminoácidos, respectivamente (Komaromy et al. (1983) NAR 11:6775-6785). Dos últimos 61 aminoácidos carboxi-terminais, 21 são resíduos ácidos, enquanto que apenas 2 são básicos, o que indica que esta região tem uma forte carga negativa. O N.°. do Acesso GenBank é NP_690605.

[0003] Pensa-se que o CD20 possa estar envolvido na regulaçao do(s) passo (s) inicial (is) do processo de activação e diferenciação das células B (Tedder et al. (1986) Eur.J.

Immunol. 16:881-887) e poderia funcionar como um canal iónico de cálcio (Tedder et al. (1990) J. Cell. Biochem. 14D:195).

[0004] Apesar da incerteza acerca da verdadeira função do CD20 na promoção da proliferação e/ou diferenciação das células B, este fornece um importante alvo para a terapia mediada por anticorpos para o controlo ou eliminação das células B envolvidas em cancros e perturbações auto-imunes. Em particular, a expressão de CD20 em células tumorais, por exemplo, NHL, torna-o um importante alvo para a terapia mediada por anticorpos, no seu direccionamento específico de 1 agentes terapêuticos contra células neoplásicas positivas para CD20. Contudo, apesar de os resultados obtidos até à data estabelecerem claramente a utilidade do CD20 enquanto alvo para a imunoterapia, estes também mostraram que os anticorpos murinos e quiméricos actualmente disponíveis não constituem agentes terapêuticos ideais.

[0005] Desse modo, existe uma necessidade de anticorpos aperfeiçoados contra CD20, eficazes na prevenção e/ou tratamento de doenças associadas a células que o expressam.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0006] A presente invenção fornece um anticorpo monoclonal humano isolado que estabelece ligação com o CD20 humano, que é capaz de induzir a citotoxicidade dependente do complemento (CDC) de células que expressam CD20 na presença de um complemento e que inclui: (i) uma região CDR1 da cadeia leve que contém a sequência de aminoácidos definida na SEQ. ID N.° 16, uma região CDR2 da cadeia leve que contém a sequência de aminoácidos definida na SEQ. ID N.° 17 e uma região CDR3 da cadeia leve que contém a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ. ID N. 0 18; (ii) (a) uma região CDR1 da cadeia pesada que contém a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ. ID N.° 13 e uma região CDR2 da cadeia pesada que contém a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ. ID N.° 14; ou (b) uma região CDR1 da cadeia pesada que contém a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ. ID N.° 19 e uma região CDR2 da cadeia pesada que contém a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ. ID N.° 20; e (iii) uma região CDR3 da cadeia pesada que tem a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ. ID N.° 15.

[0007] A presente invenção fornece, desse modo, terapêuticas mediadas por anticorpos aperfeiçoadas para o tratamento e/ou prevenção de doenças associadas a células que expressam CD20, incluindo as doenças tumorais, imunológicas, com inclusão das auto-imunes. Os anticorpos englobados pela invenção são aperfeiçoados na medida em que são totalmente humanos e, desse modo, potencialmente menos imunogénicos para os doentes. 2 [0008] Como aqui exemplificado, os anticorpos humanos da presente invenção mediam a eliminação de células B que expressam CD20, através de uma variedade de mecanismos. Numa modalidade da presente invenção, os anticorpos humanos da invenção são indutores de citotoxicidade dependente do complemento (CDC), por exemplo, induzem pelo menos 20% da lise mediada pela CDC, preferencialmente cerca de 30% da lise mediada pela CDC e, mais preferencialmente, de 40-50% da lise mediada pela CDC a nível das células, tais como as células B da leucemia linfática crónica (B-CLL). Noutra modalidade, os anticorpos humanos da invenção induzem a apoptose das células que expressam o CD20. Noutra modalidade, os anticorpos humanos da invenção induzem a adesão homotípica de células que expressam o CD20. Adicionalmente, os anticorpos humanos da invenção podem induzir uma citotoxicidade celular dependente dos anticorpos (ADCC) de células que expressam CD20, na presença de células efectoras humanas (por exemplo, monócitos, células mononucleares, células NK e neutrófilos polimorfonucleares (PMN)). Para além disso, os anticorpos humanos da invenção podem induzir a faqocitose de células que expressam CD20 na presença de macrófagos. Os anticorpos monoclonais humanos da invenção podem funcionar através de um ou mais destes mecanismos. Os exemplos de células que podem ser eliminadas pelos anticorpos humanos da presente invenção incluem, não exclusivamente, células B que expressam CD20, como as células B cancerígenas e as envolvidas em doenças imunológicas. Numa modalidade específica, os anticorpos humanos são utilizados para mediar a eliminação de linfócitos B no tratamento do linfoma, por exemplo, linfoma não-Hodgkin de células B.

[0009] Os anticorpos monoclonais da invenção incluem os anticorpos IgGl (e.g., IgGl,K), IgG3 (e.g., IgG3,x) e IgG4 (e.g., IgG4,k). Contudo, são também englobados pela invenção outros isótipos de anticorpos, incluindo IgG2, IgM, IgAl, IgA2, IgA secretora, IgD e IgE. Os anticorpos podem ser anticorpos inteiros ou fragmentos de ligação ao antigénio dos mesmos incluindo, por exemplo, Fab, F(ab')2r Fv, fragmentos Fv de cadeia simples ou anticorpos biespecíficos. Adicionalmente, os fragmentos de ligação ao antigénio incluem proteínas de fusão do domínio de ligação da imunoglobulina que contêm (i) um polipéptido do domínio de ligação (tal como uma região variável da cadeia pesada ou leve) fundido com polipéptido da região de dobradiça da imunoglobulina, (ii) uma região constante CH2 da cadeia pesada da imunoglobulina fundida com a região de dobradiça e (iii) uma região constante CH3 da cadeia pesada da imunoglobulina fundida com a região constante CH2. Tais proteínas de fusão do domínio de ligação da imunoglobulina são ainda divulgadas pelas patentes US 2003/0118592 e US 2003/0133939. 3 [0010] Os anticorpos humanos específicos da presente invenção incluem os designados como 2F2 e 7D8, codificados por ácidos nucleicos da cadeia κ humana, incluindo sequências de nucleótidos nas respectivas regiões variáveis, tal como apresentadas nas SEQ. ID N.° 1 ou 5 e nas SEQ. ID N.° 3 ou 7, respectivamente. Noutra modalidade, os anticorpos humanos são caracterizados por incluírem regiões variáveis das cadeias humanas pesada e κ leve, que compreendem as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ. ID N.° 2 ou 6 e nas SEQ. ID N.° 4 ou 8, respectivamente.

[0011] Ainda noutra modalidade, os anticorpos humanos são caracterizados por incluírem regiões variáveis das cadeias humanas pesada e κ leve, homólogas às sequências de aminoácidos em pelo menos 90%, preferencialmente em pelo menos 95% e, mais preferencialmente em 98% ou em pelo menos 99%, como apresentado na SEQ. ID N.° 2 e na SEQ. ID N.° 4, respectivamente; ou na SEQ. ID N.° 6 e na SEQ. ID N.° 8, respectivamente.

[0012] Também são incluídos na presente invenção anticorpos que se dissociam do CD20 com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) de aproximadamente 1- 10 nM. Tais anticorpos também incluem aqueles que não apresentam reactividade cruzada com antigénios da superfície celular e, desse modo, não inibem a sua função.

[0013] Noutra modalidade, os anticorpos humanos anti-CD20 da presente invenção são caracterizados por uma ou mais das seguintes propriedades: a) especificidade para o CD20 humano; b) uma afinidade de ligação ao CD20 (KD) de cerca de 1-10 nM, preferencialmente de cerca de 1-5 nM e, mais preferencialmente, de cerca de 1-3 nM, como determinado pela experiência de ligação aqui divulgada no Exemplo 5 (Figura 9) ; c) uma constante da taxa de dissociação (kd) do CD20 igual ou inferior a 10~4 seg~4, preferencialmente igual ou inferior a 1CT5 seg~4 e, mais preferencialmente, igual ou inferior a 1CT6 seg-1, como determinado pela experiência para a taxa de dissociação aqui divulgada pelo Exemplo 5 (Figura 9); d) a capacidade de mediar um nível elevado de CDC em células negativas ou positivas para o CD55/59 ; e) a capacidade de se translocar para rafts lipídicos, aquando da ligação ao CD20; 4 f) a capacidade de inibir o crescimento de células que expressam CD20; g) a capacidade de induzir a apoptose de células que expressam CD20; h) a capacidade de induzir a adesão homotípica de células que expressam CD20; i) a capacidade de induzir a ADCC de células que expressam CD20 na presença de células efectoras; j) a capacidade de prolongar a sobrevivência de um sujeito com células tumorais que expressam CD20; k) a capacidade de depleção das células que expressam CD20; e/ou l) a capacidade de depleção das células que expressam níveis reduzidos de CD20 (células CD20low) .

[0014] Os anticorpos humanos anti-CD20 da presente invenção podem ser derivados, ligados ou co-expressos para outras especificidades de ligação. Numa modalidade em particular, a invenção fornece uma molécula biespecífica ou multi-específica que contém pelo menos uma primeira especificidade de ligação para o CD20 (por exemplo, um anticorpo humano anti-CD20 ou um mimético do mesmo) e uma segunda especificidade de ligação para uma célula efectora humana, tal como uma especificidade de ligação para um receptor Fc (por exemplo, um receptor Fcy humano como o FcyRI ou um receptor Fca humano) ou para um receptor de linfócitos T como, por exemplo, o CD3.

[0015] Desse modo, a presente invenção inclui moléculas biespecí ficas que se ligam tanto ao CD20 humano como a um receptor Fc ou a um receptor de linfócitos T, por exemplo, CD3. São também divulgadas as moléculas multi-específicas correspondentes. Os exemplos de receptores Fc são, por exemplo, um receptor da IgG humana, por exemplo, um receptor

Fc gama (FcyR), como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16). Podem também ser visados outros receptores Fc, tais como os receptores da IgA humana (por exemplo, FcaRI). 0 receptor Fc está, de preferência, localizado na superfície de uma célula efectora, por exemplo, um monócito, macrófago ou uma célula mononuclear activada. As moléculas biespecíficas e multi-específicas estabelecem ligação com um receptor Fc num local que é diferente daquele em que é estabelecida a ligação ao receptor Fc da imunoglobulina (por exemplo, IgG ou IgA) . Assim, a ligação das moléculas biespecíficas e multi- 5 específicas não é bloqueada pelos níveis fisiológicos de imunoglobulinas.

[0016] Ainda noutro aspecto, os anticorpos humanos anti-CD20 da invenção são derivados, ligados ou co-expressos com outra molécula funcional, por exemplo, outro péptido ou proteína (por exemplo, um fragmento Fab')· Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por ligação química, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais entidades moleculares, tal como outro anticorpo (para, por exemplo, produzir um anticorpo biespecífico ou multi-específico), uma citotoxina, ligante celular ou antigénio (para, por exemplo, produzir um imunoconjugado, como uma imunotoxina). Um anticorpo da presente invenção pode ser ligado a outras fracções terapêuticas como, por exemplo, um radioisótopo, um medicamento anticancro de moléculas pequenas, um agente anti-inflamatório ou um imunossupressor. Como tal, a divulgação engloba uma grande variedade de anticorpos conjugados, moléculas bi e multi-especificas e proteínas de fusão que estabelecem ligação com células que expressam CD20 e que podem ser utilizados para direccionar outras moléculas a essas células.

[0017] Ainda noutro aspecto, a invenção fornece composiçoes, por exemplo, composições/kits farmacêuticos e de diagnóstico que contêm um veículo farmacologicamente aceitável, formulado em conjunto com um anticorpo monoclonal ou uma combinação de anticorpos monoclonais humanos da invenção. Numa modalidade específica, a composição inclui uma combinação de anticorpos que se ligam a epítopos distintos ou que possuem características funcionais distintas, tais como a indução de CDC e a indução de apoptose.

[0018] Anticorpos, imunoconjugados, moléculas biespecíficas e multi-específicas e composições humanas podem ser aplicados numa variedade de métodos de inibição do crescimento de células que expressam CD20 e/ou eliminação de células que expressam CD20 através do seu contacto com uma quantidade eficaz do anticorpo, imunoconjugado, molécula biespecíficas/ mult i-especí fica ou composição de modo a que o crescimento da célula seja inibido e/ou que a célula seja eliminada. Numa modalidade, o método inclui a eliminação das células que expressam CD20 na presença de células efectoras, por exemplo, através de apoptose, ADCC, fagocitose ou pela combinação de dois ou mais destes mecanismos. As células são, preferencialmente, eliminadas ou inibidas sem eliminação ou inibição da actividade das células que não expressam o CD20 mas que podem, por exemplo, expressar antigénios da superfície celular estruturalmente relacionados (ou seja, sem reactividade cruzada com antigénios da superfície celular 6 relacionados mas funcionalmente distintos) . As células que expressam CD20 que podem ser inibidas ou eliminadas pelos anticorpos humanos da invenção incluem, por exemplo, as células B tumorogénicas.

[0019] Como tal, os anticorpos humanos da presente invenção podem ser usados para tratar e/ou prevenir uma variedade de doenças que envolvem células que expressam CD20, através da administração de anticorpos a doentes afectados por tais doenças. Os exemplos de doenças que podem ser tratadas (por exemplo, aliviadas) ou prevenidas incluem, não exclusivamente, doenças cancerígenas e imunológicas, por exemplo, doenças auto-imunes. Os exemplos de doenças cancerígenas que podem ser tratadas e/ou prevenidas englobam o linfoma de células B, por exemplo, linfoma não-Hodgkin, incluindo leucemia/linforna linfoblástico de percursores de célula B e neoplasias de células B, tais como leucemia linfocítica crónica de células B (CLL)/linfoma de pequenos linfócitos (SLL), leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmocítico, linfoma de células do manto (MCL), linfoma folicular (FL) , incluindo os FL de grau baixo, moderado e elevado, linfoma do centro folicular, linfoma de células B da zona marginal (tipo MALT, nodular e esplénico), tricoleucemia, linfoma difuso de grandes células B, linfoma de Burkitt, plasmocitoma, mieloma de células plasmáticas, distúrbio linfoproliferativo pós-transplante, macroglobulinemia de Waldenstrom e linfoma anaplástico de grandes células (ALCL). Os exemplos de distúrbios imunológicos em que estão envolvidas células B que expressam CD20 que podem ser tratados e/ou prevenidos incluem a psoríase, artrite psoriática, dermatite, esclerodermia ou esclerose sistémica, doença inflamatória intestinal (DII), doença de Crohn, colite ulcerosa, sindrome de dificuldade respiratória, meningite, encefalite, uveíte, glomerulonefrite, eczema, asma, aterosclerose, deficiência da adesão leucocitária, esclerose múltipla, sindrome de Raynaud, sindrome de Sjõgren, diabetes juvenil, doença de Reiter, doença de Behçet, nefrite mediada por complexos imunes, nefropatia por IgA, polineuropatias IgM, trombocitopenia imunomediada, tal como púrpura trombocitopénica idiopática aguda e púrpura trombocitopénica idiopática crónica, anemia hemofílica, miastenia grave, nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistémico, artrite reumatóide (AR), dermatite atópica, pênfigo, doença de Graves, tiroidite de Hashimoto, granulomatose de Wegener, sindrome de Omenn, insuficiência renal crónica, mononucleose infecciosa aguda, HIV e doenças associadas ao vírus da Herpes. Exemplos adicionais são a sindrome de dificuldade respiratória aguda grave e a coriorretinite. Outros exemplos adicionais são doenças e distúrbios causados pela infecção de células B por vírus, como o Epstein-Barr (EBV). 7 [0020] Numa modalidade específica da invenção, o sujeito a quem está ser administrado o anticorpo é adicionalmente tratado com um agente quimioterápico, radiação ou um agente que modula, e.g. potência ou inibe, a expressão ou actividade de um receptor Fc, por exemplo, um receptor Fca ou Fcy, como uma citocina. As citocinas típicas para administração durante o tratamento incluem o factor de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF), o factor de estimulação de colónias de granulócitos macrófagos (GM-CSF), interferão γ (IFN-γ) e o factor de necrose tumoral (TNF). Os agentes terapêuticos típicos incluem, entre outros, agentes antineoplásicos como doxorrubicina, cisplatina, bleomicina, carmustina, clorambucil e ciclofosfamida.

[0021] Ainda noutro aspecto, a presente invenção fornece um

método para a detecção in vitro ou in vivo da presença de CD20 numa amostra ou indivíduo para, por exemplo, diagnosticar uma patologia associada ao CD20, de preferência durante a fase inicial. Este pode também ser útil na monitorização da doença e efeito do tratamento e para a determinação e ajustamento da dose de anticorpo a ser administrada. O método in vivo pode ser levado a cabo através de uma técnica de imagiologia como a PET (tomografia por emissão de positrões) ou a SPECT (tomografia computadorizada por emissão de fotão único). Numa modalidade da invenção, isto é concretizado a partir do contacto de uma amostra a testar, opcionalmente conjugada com uma amostra de controlo, com um anticorpo monoclonal humano para permitir a formação de complexos entre o anticorpo e o CD20. A formação do complexo é então detectada (por exemplo, por análise FACS ou Western blotting). Quando se utiliza uma amostra de controlo em conjunto com a amostra de teste, é detectado um complexo em ambas as amostras e qualquer diferença estatisticamente significativa na formação de complexos entre ambas é indicativa da presença do CD20 na amostra de teste.

[0022] Ainda noutro aspecto, a invenção fornece um animal transgénico não-humano, como um rato transgénico, que expressa anticorpos monoclonais humanos que se ligam ao CD20. Numa modalidade específica, o animal transgénico não-humano é um rato transgénico cujo genoma inclui um transgene humano de cadeia pesada e um transgene humano de cadeia leve na base da codificação da totalidade ou de uma porção de um anticorpo da invenção. 0 animal transgénico não-humano pode ser imunizado com uma preparação purificada ou enriquecida de antigénio CD20 e/ou células que expressam CD20. De preferência, o animal transgénico não-humano, e.g., o rato transgénico, é capaz de produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais humanos para o CD20 (e.g., IgG, IgA e/ou IgM) por recombinação VDJ e comutação de isotipos. A comutação de isotipos pode ocorrer, 8 por exemplo, por comutação de isotipos clássica ou nao-clássica.

[0023] Desse modo, ainda noutro aspecto, a invenção fornece células B isoladas de um animal transgénico não-humano como acima definido, por exemplo, um rato transgénico, que expressa anticorpos humanos anti-CD20. As células B isoladas podem ser imortalizadas por fusão a uma célula imortalizada para fornecer uma fonte (por exemplo, um hibridoma) de anticorpos humanos anti-CD20. Tais hibridomas (i.e., que produzem anticorpos humanos anti-CD20) estão também incluídos no âmbito da invenção.

[0024] Como aqui exemplificado, os anticorpos humanos da presente invenção podem ser obtidos a partir de hibridomas que os expressam ou ser clonados e expressos de modo recombinante numa célula hospedeira (por exemplo, uma célula CHO, NS/0 ou linfocítica). Exemplos adicionais de células hospedeiras são microorganismos, como a E. coli, e fungos, como as leveduras. Alternativamente, estes podem ser produzidos de modo recombinante por uma planta ou animal não-humano transgénico. Como tal, noutro aspecto, a presente invenção fornece métodos para a produção de anticorpos monoclonais humanos que estabeleçam ligação com o CD20 humano. Numa modalidade, o método inclui a imunização de um animal transgénico não-humano, por exemplo, um rato transgénico, como anteriormente descrito (e.g., cujo genoma contenha um transgene humano de cadeia pesada e um transgene humano de cadeia leve na base da codificação da totalidade ou de uma porção do anticorpo anti-CD20), com uma preparação purificada ou enriquecida de antigénio humano CD20 e/ou células que expressam CD20 humano. As células B (e.g., células B esplénicas) do animal são então obtidas e fundidas com células de mieloma para formar células imortais de hibridoma que segregam anticorpos monoclonais humanos contra o CD20.

[0025] Também são divulgadas moléculas de ácidos nucleicos codificadoras de anticorpos humanos anti-CD20 (e.g., regiões variáveis dos mesmos), assim como vectores de expressão recombinante que incluem tais ácidos nucleicos, células hospedeiras transfectadas com esses vectores e métodos de produção de anticorpos por cultura destas células hospedeiras. Os ácidos nucleicos específicos compreendem as sequências de nucleótidos apresentadas nas SEQ. ID N.° 1 ou 5 e nas SEQ. ID N.° 3 ou 7, codificadoras das cadeias pesada e leve dos anticorpos humanos anti-CD20 2F2 e 7D8, respectivamente.

[0026] Outras funcionalidades e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e reivindicações em anexo. 9 BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0027] A Figura 1 ilustra o vector pesado ρΟΟΝγΙί/variável utilizado para a produção recombinante dos anticorpos monoclonais humanos 2F2 e 11B8. A Figura 2 ilustra o vector leve pCONr/variável utilizado para a produção recombinante de 2F2 e 11B8. A Figura 3 ilustra o vector duplo de clonagem genética (ρΟΟΝγΙί/k2F2) utilizado para produção recombinante de 2F2 e 11B8 . A Figura 4 é um gráfico que compara a ligação dos anticorpos monoclonais humanos 2F2, 7D8 e 11B8 a células Raji, Daudi, NS/0 transfectadas com CD20 e NS/0 parentéricas, através de citometria de fluxo.

As Figuras 5A e 5B ilustram a ligação do 2F2 a PBMCs de três dadores humanos, através de citometria de fluxo. A Figura 6 é um gráfico que compara a afinidade de ligação do 2F2 marcado com 125I e do 11B8 marcado com 125I a cells Ramos-EHRB.

As Figuras 7A e 7B ilustram a ligação do 2F2 marcado com 125I e 11B8 marcado com 125I em comparação com a do rituximab marcado com 125I (anticorpo quimérico anti-CD20, IDEC) e BI marcado com 125I (o termo BI corresponde à forma não marcada do Bexxar™, um anticorpo murino anti-CD20 humano marcado com 131I, Coulter) a células Ramos-EHRB (A) e células Daudi (B). A Figura 8 é um gráfico que compara as taxas de dissociação do 11B8T marcado com 125I, 2F2 marcado com 125I, rituximab (RIT) marcado com 125I e BI marcado com 125I. A Figura 9 ilustra as taxas de dissociação dos fragmentos F(ab')2 de 2F2, 11B8T e rituximab em células Ramos-EHRB.

As Figuras 10A e 10B ilustram a CDC por 2F2T, 11B8T, 7D8, rituximab e um anticorpo de controlo isotipo (HuMab-KLH) de células Daudi (A) e SU-DHL-4 (B) , em diferentes pontos temporais (dissociação funcional), através de citometria de fluxo.

As Figuras 11A-E ilustram a cinética da CDC induzida por 2F2 e rituximab em diferentes linhas celulares, através de citometria de fluxo.

As Figuras 12A-D ilustram a CDC induzida por 2F2 e rituximab em diferentes linhas celulares, enquanto função da concentração do complemento (soro humano normal (NHS)), em duas concentrações distintas de anticorpos, através de citometria de fluxo.

As Figuras 13A-D ilustram a indução da CDC dependente da concentração por 2F2 e rituximab em diferentes linhas celulares, através de citometria de fluxo.

As Figuras 14A e 14B ilustram a indução da CDC dependente da concentração por 2F2, 2F2T, 11B8T, BI e rituximab em células

Daudi (A) e Raji (B). 10

As Figuras 15A e 15B são gráficos que comparam a CDC de células Daudi (células que expressam níveis reduzidos de CD55/59) por anticorpos monoclonais humanos 2F2, 7D8, 11B8 e rituximab; (A) ilustra a percentagem de lise de células não lavadas e (B) ilustra a percentagem de lise de células que foram lavadas antes da adição do soro.

As Figuras 16A e 16B são gráficos que comparam a CDC de células Raji (células que expressam níveis elevados de CD55/59) por anticorpos monoclonais humanos 2F2, 7D8, 11B8 e rituximab; (A) ilustra a percentagem de células não bloqueadas por anticorpos anti-CD55 e anti-CD59 e (B) ilustra a percentagem de lise de células bloqueadas por anticorpos anti-CD55 e anti-CD59.

As Figuras 17A-C ilustram o envolvimento do CD55 e CD59 na CDC induzida por 2F2 e rituximab em células Raji. (A) ilustra a percentagem de células lisadas com a adição do anticorpo anti-CD55, (B) ilustra a percentagem de células lisadas com a adição do anticorpo anti-CD59 e (C) ilustra a percentagem de células lisadas com a adição dos anticorpos anti-CD55 e anti-CD59.

As Figuras 18A-D ilustram a ligação do factor complementar Clq por 2F2 e rituximab em diferentes linhas celulares, através de citometria de fluxo.

As Figuras 19A-D ilustram a deposição do fragmento do factor complementar C4c por 2F2 e rituximab em diferentes linhas celulares, através de citometria de fluxo. A Figura 20 ilustra a lise de células ARH-77 por 2F2, rituximab e 11B8T na presença de neutrófilos polimorfonucleares (PMN), células mononucleares de sangue periférico (MNC), plasma ou sangue total. A Figura 21 ilustra a lise de células B-CLL por 2F2, rituximab e 11B8T na presença de PMNs, MNCs, plasma ou sangue total. A Figura 22 ilustra a lise de células HCL (tricoleucemia) por 2F2, rituximab e 11B8T na presença de PMNs, MNCs, plasma ou sangue total. A Figura 23 ilustra a lise de células B-ALL por 2F2 e rituximab na presença de PMNs, MNCs, plasma ou sangue total. A Figura 24 ilustra a lise de células do linfoma folicular (FL) por 2F2, rituximab e 11B8T na presença de PMNs, MNCs, plasma ou sangue total. A Figura 25 ilustra a lise de células do linfoma de células do manto por 2F2, rituximab e 11B8T na presença de PMNs, MNCs, plasma ou sangue total. A Figura 26 ilustra a lise dependente da concentração de células ARH-77 por 2F2 e rituximab na presença de sangue total. A Figura 21 ilustra a lise mediada por MNCs de células ARH-77 por 2F2T, 11B8T e rituximab. A Figura 28 ilustra a lise mediada por neutrófilos polimorfonucleares (PMN) de células Raji por 2F2T, 11B8T e rituximab. 11

As Figuras 29 A, B e C são gráficos que ilustram a aglomeração de CD20 nos rafts lipídicos após incubação com 2F2, 7D8 ou 11B8, através da análise da transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) e do ensaio de insolubilidade Triton-X. A Figura 30 ilustra a aglomeração do CD20 nos rafts lipídicos, após incubação com 2F2, rituximab ou 11B8T, através da análise da transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET). A Figura 31 ilustra a proporção reminiscente de CD20 na fracção insolúvel do raft, após tratamento com Triton X-100 (TX) e incubação com 2F2, rituximab ou 11B8T. A Figura 32 ilustra a distribuição de CD20 entre as fracções membranares do raft e não-raft, após estimulação das células Daudi com 2F2, rituximab ou 11B8T.

As Figuras 33A-G ilustram a apoptose de células Daudi por 2F2, 7D8 e 11B8, através de citometria de fluxo. A Figura 34 ilustra a indução da apoptose de células Raji por 2F2, 11B8T, rituximab ou Bl, através de citometria de fluxo. A Figura 35A ilustra a indução da apoptose de células Raji por 2F2T, 11B8T, rituximab ou Bl, através de citometria de fluxo. A Figura 35B ilustra as apoptoses inicial e tardia de células Daudi por anticorpos monoclonais humanos 2F2T, 11B8T, rituximab e Bl, através de citometria de fluxo.

As Figuras 36A-E ilustram a adesão homotípica de células Ramos-EHRB por 2F2, 7D8 e 11B8, através de microscopia óptica. A Figura 37 ilustra a adesão homotípica de células Daudi por 2F2, rituximab e Bl, através de microscopia óptica. A Figura 38 é um gráfico que mostra a percentagem de sobrevivência de ratos SCID injectados com células Daudi e tratados com 2F2 ou 7D8. A Figura 39 mostra a percentagem de sobrevivência de ratos injectados com células Tanoue e tratados com 2F2, rituximab ou Bl . A Figura 40 mostra a percentagem de sobrevivência de ratos SCID injectados com células Daudi e tratados com diferentes concentrações de 2F2 ou rituximab. A Figura 41 ilustra a percentagem de sobrevivência de ratos SCID injectados com células Daudi e tratados com 11B8T ou Bl. A Figura 42 ilustra a captação imagiológica por bioluminescência em células tumorais de ratos SCID, no dia 39 (31 dias após tratamento com 10 pg de Bl, rituximab, 11B8T, 2F2T ou huIgGl). A bioluminescência é representada a vermelho (áreas escuras nos ratos) (intensidade luminosa > 50 fotões, por 5 min) , enquanto sobreposição na imagem corporal a preto e branco dos ratos. A Figura 43 ilustra a quantificação da massa tumoral em cada rato no dia 25, 32, 39 e 46, após administração, no dia 8, de 10 pg de Bl, rituximab, 11B8T, 2F2T ou huIgGl através da integração de sinais luminosos ao longo da superfície corporal. 12

As Figuras 44A-C ilustram a análise citométrica de fluxo de células CD20+ em sangue periférico de macacos cinomolgos, após administração intravenosa de 2F2 ou rituximab em diferentes dosagens, 4 x 1,25 mg/kg (A), 4 x 6,25 mg/kg (B) ou 4 x 12,50 mg/kg (C).

As Figuras 45A-C ilustram a análise citométrica de fluxo de células CD21+ em sangue periférico de macacos cinomolgos, após administração intravenosa de 2F2 ou rituximab em diferentes dosagens, 4 x 1,25 mg/kg (A), 4 x 6,25 mg/kg (B) ou 4 x 12,50 mg/kg (C).

As Figuras 46A-C ilustram a análise citométrica de fluxo de células CD20+ em nódulos linfáticos de macacos cinomolgos, após administração intravenosa de 2F2 ou rituximab em diferentes dosagens, 4 x 1,25 mg/kg (A), 4 x 6,25 mg/kg (B) ou 4 x 12,50 mg/kg (C).

As Figuras 47A-C ilustram a análise citométrica de fluxo de células que expressam CD20lowCD23+CD40high em sangue periférico de macacos cinomolgos, após administração intravenosa de 2F2 ou rituximab em diferentes dosagens, 4 x 1,25 mg/kg (A), 4 x 6,25 mg/kg (B) ou 4 x 12,50 mg/kg (C).

As Figuras 48A-E ilustram a ligação do rituximab (A), 2F2 (B), 11B8 (C) , BI (D) ou de um anticorpo de controlo isotipico (E) a células CHO que expressam CD20 de tipo selvagem (WT) CD20, CD20 mutante (AxP), ou ambos, conforme determinado por citometria de fluxo.

As figuras 49A-F ilustram a percentagem de ligação do 2F2,

11B8T, Bl ou rituximab ao P172S mutante vs. CD20 de tipo selvagem (WT) (A) , a percentagem de ligação do 2F2T, 11B8T, Bl, CAT (CAT 13.6E12, um anticorpo monoclonal murino anti-CD20 humano, Diatec.Com), um anticorpo de controlo isotipico (KLH) ou rituximab ao CD20 mutante (AxP) vs. CD20 de WT (B) , a percentagem de ligação do 2F2, 11B8T, Bl ou rituximab ao N166D mutante vs. CD20 WT (C), a percentagem de ligação do 2F2T, CAT ou rituximab ao N166D mutante vs. CD20 WT (D), a percentagem de ligação do 2F2T, 2F2, 11B8T, Bl ou rituximab ao N163D mutante vs. CD20 WT (E) e a percentagem de ligação do 2F2T, CAT ou rituximab ao N163D mutante vs. CD20 WT (F). A Figura 50 ilustra a ligação do 2F2T, 7D8 e do anticorpo de controlo isotipico, conforme determinada por ELISA, a três anticorpos anti-idiotipicos, anti-2F2 sab 1.1, anti-2F2 sab 1.2 e anti-2F2 sab 1.3, desenvolvidos contra o 2F2. A Figura 51 ilustra a ligação do 11B8T, conforme determinada por ELISA, a anticorpos anti-idiotipicos anti-llB8T sab 2.2, anti-llB8T sab 2.3, anti-llB8T sab 2.4, anti-llB8T sab 2.5 e anti-llB8T sab 2.6, desenvolvidos contra ο 11B8T mas que não estabelecem ligação com os anticorpos anti-idiotipicos anti-2F2.

As Figuras 52A-C ilustram a ligação dependente da dose do 2F2T, conforme determinada por ELISA, a três anticorpos anti-idiotipicos, anti-2F2 sab 1.1 (A), anti-2F2 sab 1.2 (B) e anti-2F2 sab 1.3 (C), desenvolvidos contra o 2F2. 13 A Figura 53 ilustra a sequência de aminoácidos (SEQ. ID N.° 2) da região V da cadeia pesada e a sequência de aminoácidos (SEQ. ID N.° 4) da região V da cadeia leve (ê) do anticorpo monoclonal humano 2F2 com a indicação das regiões CDR. A Figura 54 ilustra a sequência de nucleótidos (SEQ. ID N.° 1) da região V da cadeia pesada e a sequência de nucleótidos (SEQ. ID N.° 3) da região V da cadeia leve (ê) do anticorpo monoclonal humano 2F2. A Figura 55 ilustra a sequência de aminoácidos (SEQ. ID N.° 6) da região V da cadeia pesada e a sequência de aminoácidos (SEQ. ID N.° 8) da região V da cadeia leve (ê) do anticorpo monoclonal humano 7D8 com a indicação das regiões CDR. A Figura 56 ilustra a sequência de nucleótidos (SEQ. ID N.° 5) da região V da cadeia pesada e a sequência de nucleótidos (SEQ. ID N.° 7) da região V da cadeia leve (ê) do anticorpo monoclonal humano 7D8. A Figura 57 ilustra a sequência de aminoácidos (SEQ. ID N.° 10) da região V da cadeia pesada e a sequência de aminoácidos (SEQ. ID N.° 12) da região V da cadeia leve (ê) do anticorpo monoclonal 11B8 com a indicação das regiões CDR. A Figura 58 ilustra a sequência de nucleótidos (SEQ. ID N.° 9) da região V da cadeia pesada e a cadeia de nucleótidos (SEQ. ID N.° 11) da região V da cadeia leve (ê) do anticorpo monoclonal 11B8.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0028] A presente invenção fornece terapias baseadas em anticorpos aperfeiçoadas para o tratamento e diagnóstico de uma variedade de distúrbios que envolvem células que expressam CD20. As terapias da invenção empregam anticorpos monoclonais humanos isolados que se ligam especificamente a um epitopo presente no CD20. Os anticorpos monoclonais humanos englobados pela presente invenção incluem os anticorpos IgA, IgGl-4, IgE, IgM, e IgD.

[0029] Numa modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgGl, mais particularmente um isotipo IgGl,κ ou IgGl,λ. Ainda noutra modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG3, mais particularmente um isotipo IgG3,κ ou IgG3,À. Ainda noutra modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG4, mais particularmente um isotipo IgG4,κ ou IgG4,X. Ainda noutra modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgAl ou IgA2.

[0030] Ainda noutra modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgM.

[0031] Numa modalidade, os anticorpos humanos sao produzidos num animal transgénico não-humano, e.g., um rato transgénico, capaz de produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais 14 humanos para o CD20 por recombinação VDJ e comutação de isotipos. Assim, os aspectos da invenção contemplam não apenas anticorpos, fragmentos de anticorpos e composições farmacêuticas dos mesmos, mas também animais transgénicos não-humanos e transfectomas de células hospedeiras que produzem anticorpos monoclonais.

[0032] Os métodos de utilização dos anticorpos da invenção na detecção de células que expressam CD20 são contemplados pela invenção. São também fornecidos os métodos de utilização dos anticorpos da invenção para bloquear ou inibir as actividades induzidas pelo CD20, e.g. actividades de proliferação e/ou diferenciação, úteis no tratamento de distúrbios associados ao CD20, tais como doenças cancerígenas (por exemplo, linfoma de células B) e auto-imunes (por exemplo, artrite reumatóide (AR), doença de Chrohn e granulomatose de Wegener).

[0033] Determinados termos serão agora definidos de forma a que a presente invenção possa ser mais facilmente compreendida. Serão apresentadas definições adicionais ao longo da descrição detalhada.

[0034] Os termos "CD20" e "antigénio CD20" são aqui utilizados indistintamente e incluem quaisquer variantes, isoformas e espécies homólogas do CD20 humano, que são naturalmente expressas por células ou expressas em células transf ectadas com o gene CD20. A ligação de um anticorpo da invenção ao antigénio CD20 medeia a eliminação de células que expressam CD20 (por exemplo, uma célula tumoral) através da inactivação do CD20. A eliminação de células que expressam CD20 pode ocorrer através de um ou mais dos seguintes mecanismos: citotoxicidade dependente do complemento (CDC) de células que expressam CD20; apoptose de células que expressam CD20; a fagocitose de células efectoras de células que expressam CD20; ou citotoxicidade de células efectoras dependente dos anticorpos (ADCC) de células que expressam CD20.

[0035] Os sinónimos de CD20, como reconhecidos na área, incluem o antigénio CD20 dos linfócitos B, antigénio BI da superfície dos linfócitos B, Leu-16, Bp35, BM5 e LF5.

[0036] Como aqui empregue, o termo "inibir o crescimento" (por exemplo, aplicado a células) destina-se a incluir qualquer redução mensurável a nível do crescimento das células quando em contacto com um anticorpo anti-CD20, relativamente ao crescimento das mesmas células na ausência desse anticorpo, por exemplo, a inibição do crescimento de uma cultura de células em, pelo menos, cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ou 100%. Tal incremento no crescimento celular pode decorrer de uma variedade de mecanismos, por 15 exemplo, a fagocitose de células efectoras, ADCC, CDC e/ou apoptose.

[0037] 0 termo "raft" refere-se a microdomínios membranares ricos em esfingolipídios e em colesterol, localizados no área do folheto externo da membrana plasmática de uma célula. A capacidade de certas proteínas se associarem a tais domínios pode afectar a sua função. Por exemplo, a translocação de moléculas CD20 para rafts lipídicos, após ligação com anticorpos humanos da presente invenção, dá origem a uma elevada densidade de complexos anticorpo-antigénio CD20 nas membranas plasmáticas. Tal densidade elevada de complexos anticorpo-antigénio CD20 pode permitir uma activação eficaz do sistema complemento, durante a CDC.

[0038] O termo "anticorpo" como aqui referido inclui anticorpos inteiros e qualquer fragmento de ligação a antigénio (ou seja, "porção de ligação ao antigénio") ou cadeia simples do mesmo. Um "anticorpo" refere-se a uma glicoproteína que contém, pelo menos, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto ou, uma porção de ligação ao antigénio do mesmo. Cada cadeia pesada é composta por uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e por uma região constante de cadeia pesada. Cada cadeia leve é composta por uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como VL) e por uma região constante de cadeia leve. As regiões VH e VL podem ainda ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, designadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões mais conservadas designadas regiões de estrutura (FR). Cada região VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, organizadas do terminal amina até ao terminal carboxilo, pela seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antigénio. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos do hospedeiro ou factores, incluindo várias células do sistema imunitário (e.g., células efectoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema complemento clássico.

[0039] O termo "porção de ligaçao ao antigénio" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo"), com aqui empregue, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que mantém a capacidade de se ligar especificamente a um antigénio (e.g., CD20). Foi demonstrado que a função de ligação ao antigénio de um anticorpo pode ser executada por fragmentos de um anticorpo inteiro. Os exemplos de fragmentos de ligação englobados pelo termo "porção de ligação ao antigénio" incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente composto pelos domínios VL, VH, CL e CHi; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente composto por dois 16 fragmentos Fab ligados na região dobradiça por uma ponte dissulfeto; (iii) um fragmento Fd composto pelos domínios VH e Chi; (iv) um fragmento Fv composto pelos domínios VL e VH de um braço simples de um anticorpo; (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), composto por um domínio VH; (vi) uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada e (vii) uma combinação de duas ou mais CDRs isoladas que podem ser unidas por um ligante sintético. Adicionalmente, apesar da codificação dos dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, ser feita por genes separados, estes podem ser unidos, através de métodos de recombinação, por um ligante sintético que lhes permite ser construídos como uma cadeia proteica única onde as regiões VL e VH se associam para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv); ver, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:587 9-5883).

Também é pretendido que tais anticorpos de cadeia simples sejam englobados no termo "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo. Um exemplo adicional diz respeito às proteínas de fusão do domínio de ligação da imunoglobulina que contêm (i) um polipéptido do domínio de ligação fundido com polipéptido da região dobradiça da imunoglobulina, (i i) uma região constante CH2 da cadeia pesada da imunoglobulina fundida com a região dobradiça e (iii) uma região constante CH3 da cadeia pesada da imunoglobulina fundida com a região constante CH2. 0 polipéptido do domínio de ligação pode ser uma região variável de cadeia pesada ou leve. As proteínas de fusão do domínio de ligação da imunoglobulina são ainda divulgadas pelas patentes U.S. 2003/0118592 e US 2003/0133939. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos através de técnicas convencionais conhecidas pelos especialistas da área e, examinados quanto à sua utilidade da mesma forma que os anticorpos intactos.

[0040] 0 termo "epítopo" corresponde a uma proteína capaz de se ligar especificamente a um anticorpo. Os epítopos habitualmente consistem em agrupamentos de moléculas de superfície quimicamente activa, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e têm, normalmente, características estruturais tridimensionais assim como características específicas de carga. Os epítopos conformacionais e não conformacionais são diferentes na medida em que o estabelecimento de ligação ao primeiro mas não ao segundo se perde na presença de solventes desnaturados.

[0041] O termo "epítopo descontínuo", como aqui aplicado, corresponde a um epítopo conformacional num antigénio proteico, que se forma a partir de, pelo menos, duas regiões separadas na sequência primária da proteína.

[0042] O termo "molécula biespecífica" destina-se a incluir 17 qualquer agente como, por exemplo, uma proteína, péptido ou complexo peptídico que detenha pelo menos duas especificidades de ligação diferentes. Por exemplo, a molécula pode ligar-se a, ou interagir com, (a) um antigénio da superfície celular e (b) um receptor Fc na superfície de uma célula efectora. 0 termo "molécula multi-específica" ou "molécula heteroespecífica" destina-se a incluir qualquer agente como, por exemplo, uma proteína, péptido ou complexo peptídico que detenha mais do que duas especificidades de ligação diferentes. Por exemplo, a molécula pode ligar-se ou interagir com (a) um antigénio da superfície celular, (b) um receptor na superfície de uma célula efectora e (c), pelo menos, um componente diferente. Por conseguinte, a invenção inclui, mas não exclusivamente, moléculas bi, tri e tetraespecíficas e outras moléculas multi-específicas direccionadas aos antigénios da superfície celular, como o CD20, e a outros alvos, como os receptores Fc em células efectoras.

[0043] 0 termo "anticorpos biespecíficos" também inclui diacorpos. Os diacorpos são anticorpos bivalentes, biespecí f icos em que os domínios VH e VL são expressos numa cadeia polipeptídica simples mas que usam, contudo, um ligante demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios da mesma cadeia e que, desse modo, forçam o emparelhamento dos seus domínios com domínios complementares de outra cadeia e criam dois locais de ligação ao antigénio (ver, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123) .

[0044] 0 termo "derivados de anticorpos humanos" refere-se a qualquer forma modificada do anticorpo, por exemplo, um conjugado do anticorpo e outro agente ou anticorpo.

[0045] Como aqui empregue, um anticorpo "deriva de" uma determinada sequência germinativa se for obtido a partir de um sistema que utiliza sequências de imunoglobulina humana, por exemplo, através da imunização de um rato portador de genes de imunoglobulina humana ou através da pesquisa de uma biblioteca genética de imunoglobulina humana e, em que o anticorpo humano seleccionado seja idêntico à sequência codificada pela linha germinativa humana em pelo menos 90%, mais preferencialmente em pelo menos 95% e, ainda mais preferencialmente em pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% da sequência de aminoácidos. Habitualmente, um anticorpo humano derivado de uma determinada sequência da linha germinativa humana irá exibir não mais do que 10 diferenças de aminoácidos, mais preferencialmente não mais do que 5 ou, ainda mais preferencialmente não mais do que 4, 3, 2 ou 1 relativamente à sequência de aminoácidos codificada pelo gene da imunoglobulina da linha germinativa. 18 [0046] Como aqui empregue, o termo "heteroanticorpos" refere-se a dois ou mais anticorpos, derivados dos mesmos ou porções de ligação ao antigénio em ligação, em que pelo menos dois dos anteriores têm diferentes especificidades. Estas diferentes especificidades incluem uma especificidade de ligação para um receptor Fc numa célula efectora e uma especificidade de ligação para um antigénio ou epítopo numa célula alvo como, por exemplo, uma célula tumoral.

[0047] 0 termo "anticorpo humano", como aqui empregue, destina-se a incluir anticorpos que possuem regiões variáveis e constantes que derivam de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagénese aleatória ou sítio-dirigida in vitro ou por mutação somática in vivo). Contudo, o termo "anticorpo humano", como aqui empregue, não se destina a incluir anticorpos em que as sequências CDR derivadas da linha germinativa de outras espécies de mamíferos, como a murina, tenham sido enxertadas em sequências de estrutura humanas.

[0048] Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpos monoclonais" como aqui empregues, referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpos com uma composição simples. Uma composição de anticorpos monoclonais expressa uma especificidade única de ligação e afinidade para um epítopo em particular. Assim, o termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos que demonstram uma especificidade de ligação única e que contêm regiões variáveis e constantes de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Numa modalidade, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal transgénico ou transcromossómico não-humano, por exemplo, um rato transgénico, cujo genoma compreende um transgene humano de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve fundidos numa célula imortalizada.

[0049] 0 termo "anticorpo humano recombinante", como aqui empregue, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um rato) que é transgénico ou transcromossómico para os genes humanos de imunoglobulina ou um hibridoma preparado a partir destes (adicionalmente descrito abaixo, na Secção I), (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, um transfectoma, (c) anticorpos isolados de uma biblioteca recombinante e combinatória de anticorpos humanos, e (d) 19 anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvam splicing de sequências de qenes da imunoqlobulina humana para outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm reqiões variáveis e constantes que derivam de sequências de imunoqlobulina da linha qerminativa humana. Em determinadas modalidades, contudo, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser sujeitos a mutagénese in vitro (ou, quando é usado um animal transgénico para sequências Ig humanas, mutagénese somática in vivo) e, apesar das sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes serem sequências que, apesar de derivadas e relacionadas com as sequências VH e VL da linha germinativa humana, podem não existir naturalmente in vivo no repertório de anticorpos da linha germinativa humana.

[0050] 0 termo "transfectoma", como aqui empregue, inclui células hospedeiras eucarióticas recombinantes que expressam o anticorpo, tais como as células CHO, NS/0, HEK293, vegetais ou fúngicas, incluindo as células das leveduras.

[0051] Como aqui empregue, um "anticorpo heterólogo" é definido em função do organismo não-humano transgénico que o produz. Este termo refere-se a um anticorpo que tem uma sequência de aminoácidos ou uma sequência codificadora de ácidos nucleicos correspondente à encontrada num organismo diferente do animal transgénico não-humano e, geralmente, de uma espécie diferente da do animal transgénico não-humano.

[0052] Como aqui empregue, um "anticorpo heterohíbrido" refere-se a um anticorpo que possui cadeias leves e pesadas provenientes de diferentes organismos. Por exemplo, um anticorpo com uma cadeia pesada humana associada a uma cadeia leve murina é um anticorpo heterohíbrido. Os exemplos de anticorpos heterohíbridos incluem os anticorpos quiméricos e humanizados, acima discutidos.

[0053] Um "anticorpo isolado", como aqui empregue, destina-se a designar um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos com diferentes especificidades antigénicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente ao CD20 é substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a antigénios que não o CD20). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a um epítopo, isoforma ou variante do CD20 humano pode, contudo, ter reactividade cruzada com outros antigénios relacionados, por exemplo, de outras espécies (e.g. CD20 de espécies homólogas). Adicionalmente, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou químicos. Numa modalidade da invenção, uma combinação de anticorpos monoclonais "isolados" com diferentes especificidades são combinados numa composição bem definida. 20 [0054] Como aqui empregue, "ligação especifica" refere-se à ligação do anticorpo a um antigénio pré-determinado. Habitualmente, o anticorpo estabelece ligação com uma afinidade que corresponde a uma KD igual ou inferior a cerca de 1 x 1CT7 M, ligando-se ao antigénio pré-determinado com uma afinidade que corresponde a uma KD inferior em, pelo menos, duas ordens de magnitude relativamente à sua afinidade de ligação a um antigénio não especifico (por exemplo, BSA, caseína) diferente do pré-determinado ou a um antigénio intimamente relacionado. As frases "um anticorpo que reconhece um antigénio" e "um anticorpo específico para um antigénio" são aqui usadas indistintamente com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antigénio".

[0055] Como aqui empregue, o termo "kd" (seg 7) destina-se a referir a constante de dissociação de uma interacção particular entre anticorpo e antigénio. 0 valor mencionado é também designado como koff.

[0056] 0 termo "ka" (M 1 x seg 1), como aqui empregue, destina-se a referir a constante de associação de uma interacção particular entre anticorpo e antigénio.

[0057] 0 termo "KD" (M) , como aqui empregue, destina-se a referir a constante de equilíbrio de dissociação de uma interacção particular entre anticorpo e antigénio.

[0058] 0 termo "KA" (M 7) , como aqui empregue, destina-se a referir a constante de equilíbrio de associação de uma interacção particular, entre anticorpo e antigénio e é obtida pela divisão de ka por kd.

[0059] Como aqui empregue, o "isotipo" refere-se à classe de anticorpos (por exemplo, IgM ou IgGl) que é codificada por genes de região constante de cadeia pesada.

[0060] Como aqui empregue, "comutaçao de isotipos" refere-se ao fenómeno pelo qual a classe ou isotipo de um anticorpo muda de uma classe Ig para uma das outras classes Ig.

[0061] Como aqui empregue, "isotipo não comutado" refere-se à classe isotípica de cadeia pesada que é produzida quando não ocorre qualquer comutação de isotipos; o gene CH que codifica o isotipo não comutado é, tipicamente, o primeiro gene CH imediadamente a jusante do gene VDJ rearranjado. A comutação de isotipos foi classificada como clássica e não-clássica. A comutação de isotipos clássica decorre de eventos de recombinação que envolvem, pelo menos, uma região de sequência de comutação no transgene. A comutação de isotipos não-clássica pode ocorrer, por exemplo, através de recombinação 21 homóloga entre as sequências humanas σμ e Σμ (deleção associada ao δ). Os mecanismos alternativos de comutação não-clássica, como a recombinação intertransgene e/ou intercromossómica, entre outros, podem ocorrer e resultar na comutação de isotipos.

[0062] Como aqui empregue, o termo "sequência de comutação" refere-se às sequências de DNA responsáveis pela recombinação do comutação. Uma sequência "dadora de comutação", tipicamente uma região de comutação μ, estará a 5' (ou seja, a montante) da região constructo a ser apagada durante a recombinação de comutação. A região "aceitadora de comutação" estará entre a região constructo a ser apagada e a região constante de substituição (por exemplo, γ, ε, etc.). Uma vez que não existe um local especifico para a ocorrência da recombinação, a sequência de genes final não será, tipicamente, previsível a partir do constructo.

[0063] Como aqui empregue, o "padrão de glicosilaçao" é definido como o padrão das unidades de hidratos de carbono ligadas de forma covalente a uma proteína, mais concretamente, a uma proteína de imunoglobulina (anticorpo). Um padrão de glicosilação de um anticorpo heterólogo pode ser caracterizado como substancialmente similar aos padrões de glicosilação de ocorrência natural em anticorpos produzidos pela espécie do animal transgénico não-humano quando um especialista de habilidade comum na arte reconhece o padrão de glicosilação do anticorpo heterólogo como sendo mais semelhante ao padrão de glicosilação referido para a espécie do animal transgénico não-humano do que ao da espécie de onde foram obtidos os genes CH do transgene.

[0064] 0 termo "ocorrência natural" como aqui empregue aplicado a um objecto, refere-se ao facto desse objecto poder ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipéptidos ou polinucleótidos que está presente num organismo (incluindo os vírus) , que pode ser isolada de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificada pelo Homem em laboratório é considerada de ocorrência natural.

[0065] O termo "rearranjado", como aqui empregue, refere-se a uma configuração do locus das cadeias pesada ou leve de imunoglobulina onde um segmento V se encontre numa posição imediatamente adjacente a um segmento D-J ou J numa configuração essencialmente codificadora de um domínio completo VH ou VL, respectivamente. Um locus reorganizado de um gene de imunoglobulina (anticorpo) pode ser identificado por comparação ao DNA da linha germinativa; um locus reorganizado terá, pelo menos, um elemento de homologia heptamero/nonamero reorganizado. 22 [0066] O termo "inalterado" ou "de configuração germinativa", como aqui empregue em relação a um segmento V, refere-se à configuração onde o segmento V não é recombinado de forma a encontrar-se numa posição contígua à dos segmentos D ou J.

[0067] 0 termo "molécula de ácido nucleico", como aqui empregue, destina-se a incluir moléculas de DNA e RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de cadeia única ou dupla, mas é de preferência de cadeia dupla.

[0068] 0 termo "molécula de ácido nucleico isolada", como aqui empregue em relação a anticorpos ou porções de anticorpos codificadoras de ácidos nucleicos (por exemplo, VH, VL, CDR3) que se ligam ao CD20, pretende referir-se a uma molécula de ácido nucleico em que as sequências de nucleótidos codificadoras do anticorpo ou porção do anticorpo estão livres de outras sequências de nucleótidos codificadoras de anticorpos ou porções de anticorpos que se ligam a outros antigénios que não o CD20, sequências essas que podem flanquear naturalmente o ácido nucleico do DNA genómico humano. Numa modalidade, o anticorpo humano anti-CD20 inclui a sequência de nucleótidos ou aminoácidos do 2F2 ou 7D8, assim como regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e leve (VL) com as sequências apresentadas nas SEQ. ID N.° 1 ou 5 e nas SEQ. ID N.° 3 ou 7, respectivamente.

[0069] Como aqui descrito, as sequências estabelecidas nas SEQ. ID N.° 1-30 incluem "modificações de sequência conservadoras", ou seja, modificações das sequências de nucleótidos e aminoácidos que não afectam ou alteram significativamente as características de ligação do anticorpo codificado pela sequência de nucleótidos ou que contêm a sequência de aminoácidos. Tais modificações de sequência conservadoras incluem substituições, adições e deleções de nucleótidos e aminoácidos. As modificações podem ser introduzidas nas SEQ. ID N.° 1-30 através de técnicas padrão conhecidas na área, tais como a mutagénese dirigida e mediada por PCR. As substituições conservadoras de aminoácidos incluem aquelas em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral semelhante. As famílias de aminoácidos com cadeias laterais semelhantes foram definidas na área. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (e.g., lisina, arginina, histidina) , ácidas (e.g., ácido aspártico, ácido glutâmico), polares sem carga (e.g., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), não polares (e.g., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina). beta-ramifiçadas (e.g., treonina, valina, isoleucina) e aromáticas (e.g., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um resíduo de aminoácido não 23 essencial previsto para um anticorpo humano anti-CD20 é preferencialmente substituído por outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral.

[0070] Adicionalmente, a presente invenção inclui anticorpos em que foram realizadas alterações na região Fc no sentido de modificar as suas propriedades funcionais ou farmacocinéticas. Estas alterações podem resultar numa diminuição ou aumento da ligação ao Clq e da CDC ou da ligação ao FcyR e da ADCC. As substituições podem, por exemplo, ser realizadas em um ou mais dos resíduos de aminoácidos presentes nas posições 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 da região constante da cadeia pesada, causando assim uma alteração numa função efectora, sem prejuízo da capacidade de ligação ao antigénio, quando em comparação com o anticorpo inalterado, cf. Patentes U.S. 5.624.821 e US 5.648.260.

[0071] A semivida in vivo dos anticorpos pode igualmente ser melhorada através da modificação do epítopo receptor de recuperação do domínio constante da Ig ou um domínio constante similar a Ig, de forma a que a molécula não inclua um domínio CH2 intacto ou uma região Fc intacta, cf. US 6.121.022 e US 6.194.551. A semivida in vivo pode ainda ser estendida pela introdução de mutações na região Fc, por exemplo, pela substituição da treonina por leucina na posição 252, pela substituição da treonina por serina na posição 254, ou pela substituição da treonina por fenilalanina na posição 256, cf. a patente U.S. 6.277.375.

[0072] Adicionalmente, o padrão de glicosilaçao dos anticorpos pode ser modificado de modo a alterar a sua função efectora. Por exemplo, os anticorpos podem ser expressos num transfectoma que não adiciona a unidade de fucose, normalmente ligada ao Asn na posição 297 da região Fc, de modo a aumentar a afinidade da região Fc para o FcyRIII que, por sua vez, irá resultar num aumento da ADCC dos anticorpos na presença de células NK, cf. Shield et al. (2002) JBC, 277:26733. Para além disso, podem ser feitas modificações à galactosilação de modo a alterar a CDC.

[0073] Em alternativa, noutra modalidade, podem ser introduzidas aleatoriamente mutações ao longo de toda ou em parte da sequência codificadora de um anticorpo anti-CD20, por exemplo, através de mutagénese por saturação, e os anticorpos anti-CD20 modificados resultantes podem ser testados relativamente à sua actividade de ligação.

[0074] Dessa forma, os anticorpos codificados pelas sequências de nucleótidos (da região variável de cadeias pesada e leve) aqui divulgadas e/ou que contêm as sequências de aminoácidos (da região variável de cadeias pesada e leve) 24 aqui divulgadas (ou seja, as SEQ. ID N.° 1-30) incluem anticorpos substancialmente similares codificados por, ou contendo, sequências que foram alvo de modificação conservadora. Uma discussão mais aprofundada sobre a forma como tais anticorpos substancialmente similares podem ser gerados com base nas sequências parciais aqui descritas (ou seja, regiões variáveis de cadeias pesada e leve) como SEQ. ID N.°s 1-30, é fornecida abaixo.

[0075] Quando aplicado a ácidos nucleicos, o termo "homologia substancial" indica que dois ácidos nucleicos, ou sequências designadas dos mesmos, quando idealmente alinhados e comparados, são idênticos, com as devidas inserções ou delecções de nucleótidos em pelo menos 80%, usualmente de 90% a 95% e, preferencialmente, em cerca de 98% a 99,5% dos nucleótidos. Em alternativa, considera-se existir homologia substancial quando os segmentos se hibridizam em condições selectivas de hibridização para complementar a cadeia.

[0076] Quando aplicado a sequências de nucleótidos e de aminoácidos, o termo "homologia" indica o grau de identidade entre duas sequências de nucleótidos ou de aminoácidos quando idealmente alinhadas e comparadas com as devidas inserções ou delecções. Alternativamente, existe homologia substancial quando os segmentos de DNA se hibridizam em condições selectivas de hibridização, para complementar a cadeia.

[0077] A percentagem de identidade entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências (ou seja, a % de homologia = n.° de posições idênticas/n.0 total de posições x 100), tendo em conta o número de lacunas e o comprimento de cada lacuna, que devem ser introduzidas para garantir o alinhamento ideal das duas sequências. A comparação de sequências e a determinação da percentagem de identidade entre duas sequências podem ser conseguidas através de algoritmos matemáticos, como descrito nos exemplos não limitativos abaixo.

[0078] A percentagem de identidade entre duas sequências de nucleótidos pode ser determinada através da aplicação GAP incluída no pacote de software GCG (disponível no sítio http://www.gcg.com), usando um ficheiro matriz NWSgapdna.CMP, um peso de lacuna (gap weight) de 40, 50, 60, 70, ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. A percentagem de identidade entre duas sequências de nucleótidos ou aminoácidos pode também ser determinada através do algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que foi incorporado na aplicação ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de peso de resíduos PAM120, um intervalo de comprimento de lacuna (gap length) de 12 e intervalo de lacuna (gap penalty) de 4. Adicionalmente, a percentagem de identidade entre duas 25 sequências de aminoácidos pode ser determinada através do algoritmo de Needleman-Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) que foi incorporado na aplicação GAP incluída no pacote de software GCG (disponível no sítio http://www.gcg.com), usando as matrizes Blossum 62 ou PAM250, um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

[0079] As sequências de ácidos nucleicos e proteínas podem ainda ser utilizadas como "sequências de consulta" na pesquisa em bases de dados públicas para identificar, por exemplo, sequências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas através das aplicações NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. As pesquisas BLAST de nucleótidos podem ser executadas através da aplicação NBLAST, pontuação (score) =100, comprimento de palavra (wordlength) =12, para obter sequências de nucleótidos homólogas às moléculas de ácido nucleico da invenção. As pesquisas BLAST de proteínas podem ser executadas através da aplicação XBLAST, pontuação = 30, comprimento de palavra = 3, para obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas proteicas de ácido nucleico da invenção. Para obter alinhamentos de lacunas para efeitos de comparação, pode ser utilizado o Gapped BLAST como descrito por Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Quando se utilizam as aplicações BLAST e Gapped BLAST, podem ser empregues os respectivos parâmetros padrão (por exemplo, XBLAST e NBLAST). Ver http://www.ncbi.nhn.nih.gov.

[0080] Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, num lisado de células ou numa configuração parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando é purificado de outros componentes celulares ou contaminantes, por exemplo, ácidos nucleicos celulares ou proteínas, através de técnicas padrão que incluem o tratamento alcalino/SDS, o bandeamento CsCl, cromatografia em coluna, gel de agarose e outras técnicas bem conhecidas na área. Ver, F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).

[0081] As composições de ácidos nucleicos, embora muitas vezes presentes numa sequência nativa (excepto em locais de restrição modificados e similares), quer de cDNA, genómica ou de misturas das mesmas, podem ser mutadas, usando técnicas padrão para o fornecimento de sequências de genes. Para as sequências codificadoras, estas mutações podem afectar a sequência de aminoácidos, como desejado. Em particular, são contempladas as sequências de DNA substancialmente homólogas ou derivadas de sequências nativas V, D, J, constantes, comutadoras e outras sequências como as aqui descritas (onde a 26 designação "derivada" indica que a sequência é idêntica ou modificada a partir de outra sequência).

[0082] Um ácido nucleico é "operacionalmente ligado" quando é colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor ou potenciador está operacionalmente ligado a uma sequência codificadora se afectar a sua transcrição. No que concerne às sequências reguladoras de transcrição, a ligação operacional significa que as sequências de DNA em ligação são contíguas e, onde for necessário unir duas regiões de codificação proteicas, são contíguas e estão no quadro de leitura. Para as sequências de comutação, a ligação operacional indica que as sequências são capazes de efectivar a recombinação de comutação.

[0083] 0 termo "vector", como aqui empregue, pretende referir-se a um ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual tenha sido ligado. O "plasmídeo" é um tipo de vector que se refere a uma espiral de DNA de cadeia dupla circular a que podem estar ligados segmentos adicionais de DNA. Outro tipo de vector é o vector virai, através do qual podem ser ligados ao genoma virai segmentos adicionais de DNA. Certos vectores são capazes de se replicar de forma autónoma numa célula hospedeira em que sejam introduzidos (por exemplo, vectores bacterianos que tenham uma origem de replicação bacteriana e vectores epissómicos de mamíferos). Outros vectores (por exemplo, vectores não-epissómicos de mamíferos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira no momento de introdução na célula hospedeira e, assim, são replicados em conjunto com o genoma hospedeiro. Para além disso, certos vectores são capazes de direccionar a expressão dos genes a que se encontram operacionalmente ligados. Tais vectores são aqui referidos como "vectores de expressão recombinante" (ou, simplesmente, "vectores de expressão"). Em geral, os vectores de expressão de utilidade para as técnicas de DNA recombinante encontram-se sob a forma de plasmídeos. Na presente especificação, "plasmídeo" e "vector" podem ser usados indistintamente, uma vez que o plasmídeo é a forma de vector utilizada com maior frequência. Contudo, pretende-se que a presente invenção inclua outras formas de vectores de expressão, como os vectores virais (por exemplo, retrovírus de replicação defeituosa e vírus adeno-associados) que desempenham funções equivalentes.

[0084] 0 termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente, "célula hospedeira"), como aqui empregue, destina-se a referir uma célula em que tenha sido introduzido um vector de expressão recombinante. Deverá compreender-se que tais termos pretendem referir-se não apenas a uma célula particular mas à progénie dessa célula. Uma vez que tais modificações podem ocorrer em gerações sucessivas quer por 27 mutação, quer por influências ambientais, tal progénie pode não ser, de facto, idêntica à célula-mãe, contudo ainda são abrangidas pela designação "célula hospedeira", como aqui empregue. As células hospedeiras recombinantes incluem, por exemplo, células CHO, NS/0 e linfociticas.

[0085] Como aqui empregue, o termo "sujeito" inclui qualquer animal humano ou não-humano. 0 termo "animal não-humano" inclui todos os vertebrados e.g., mamíferos e não-mamíferos, tais como primatas não-humanos, ovelhas, cães, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc.

[0086] O termo "animal não-humano transgénico" refere-se a um animal não-humano cujo genoma contenha um ou mais transgenes ou transcromossomas humanos de cadeia pesada e/ou leve (quer integrados, quer não integrados no DNA genómico natural do animal) e que seja capaz de expressar anticorpos totalmente humanos. Por exemplo, um rato transgénico pode ter um transgene humano de cadeia leve e um transgene humano de cadeia pesada ou um transcromossoma humano de cadeia pesada, de modo a que o rato produza anticorpos humanos anti-CD20 quando imunizado com o antigénio CD20 e/ou células que expressam CD20. 0 transgene humano de cadeia pesada pode ser integrado no DNA cromossómico do rato, como no caso dos ratos transgénicos, e.g. HuMAb, p. ex. ratos HCo7 ou HCol2, ou ser mantido extracromossomicamente, como no caso de ratos transcromossómicos (e.g. KM), conforme descrito na patente WO 02/43478. Tais ratos transgénicos e transcromossómicos são capazes de produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais humanos para o CD20 (por exemplo, IgG, IgA e/ou IgE) por recombinação VDJ e comutação de isotipos.

[0087] Vários aspectos da invenção são descritos mais detalhadamente nas subsecções que se seguem. I. Produção de anticorpos humanos ao CD20 [0088] Os anticorpos monoclonais humanos da presente invenção podem ser produzidos através de uma variedade de técnicas, incluindo a metodologia convencional para anticorpos monoclonais como, por exemplo, a técnica padrão de hibridização de células somáticas descrita por Kohler & Milstein, Nature 256: 495 (1975). Embora por princípio sejam preferidos procedimentos de hibridização de células somáticas, podem ser empregues outras técnicas de produção de anticorpos monoclonais como, por exemplo, a transformação virai ou oncogénica de linfócitos B ou técnicas de phage display com aplicação de bibliotecas de genes de anticorpos humanos.

[0089] O sistema murino é o sistema animal preferido para a preparação de hibridomas que segregam anticorpos monoclonais 28 humanos. A produção de hibridomas no rato é um procedimento muito bem estabelecido. Os protocolos de imunização e técnicas para o isolamento e fusão de esplenócitos imunizados são bem conhecidos na área. São também conhecidos os parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma murinas) e procedimentos de fusão.

[0090] Numa modalidade preferida, os anticorpos monoclonais humanos direccionados contra o CD20 podem ser gerados através da utilização de ratos transgénicos ou transcromossómicos, portadores de partes do sistema imunitário humano, em detrimento do murino. Estes ratos transgénicos e transcromossómicos incluem os ratos aqui designados por HuMAb e KM, respectivamente, sendo aqui colectivamente designados como "ratos transgénicos".

[0091] 0 rato HuMAb contém um minilocus de imunoglobulina humana que codifica as sequências de imunoglobulina das cadeias pesada (μ e γ) e κ leve inalteradas, em conjunto com mutações direccionadas que inactivam os loci endógenos das cadeias μ e κ (Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859). Deste modo, os ratinhos exibiram uma expressão reduzida de IgM de rato ou κ e, em resposta à imunização, os transgenes humanos introduzidos de cadeia pesada e leve sofrem troca de classe e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais humanos de elevada afinidade, IgGx (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisto em Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. & Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93, e Harding, F. &

Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sei 764: 536-546). A preparação de ratos HuMAb é descrita em detalhe em Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al., (1994)

Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of

Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg, N. & Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93; Harding, F. & Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sei 764:536-546; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. Ver também as Patentes U.S. N.°s 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633,425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299 e 5.770.429; todas para Lonberg & Kay, assim como a Patente U.S. 5.545.807 para Surani et ai.; WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 e WO 01/09187.

[0092] O rato KM contém um transcromossoma humano de cadeia pesada e um transgene humano de cadeia leve κ. Os genes murinos endógenos de cadeia pesada e leve foram também alterados nos ratos KM, de forma a que a sua imunização conduzisse à produção de imunoglobulinas humanas, em 29 detrimento das imunoglobulinas murinas. A produção de ratos KM e a sua utilização no desenvolvimento de imunoglobulinas humanas é descrita em detalhe na patente WO 02/43478.

Imunizações [0093] Para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos para o CD20, ratos transgénicos ou transcromossómicos que contêm genes de imunoglobulina humana (e.g., ratos HCol2, HCo7 ou KM) podem ser imunizados com uma preparação enriquecida do antigénio CD20 e/ou células que expressam CD20, conforme descrito, por exemplo, por Lonberg et al. (1994), supra·, Fishwild et al. (1996), supra, e WO 98/24884. Em alternativa, os ratos podem ser imunizados com DNA que codifica o CD20 humano. Preferencialmente, os ratinhos terão entre 6-16 semanas de idade aquando da primeira infusão. Por exemplo, pode ser usada uma preparação enriquecida do antigénio CD20 (5-50 pg) para imunizar os ratos HuMAb por via intraperitoneal. Na eventualidade de as imunizações que usam uma preparação purificada ou enriquecida do antigénio CD20 não resultarem em anticorpos, os ratos podem também ser imunizados com células que expressam o CD20, e.g., uma linha celular, para promover respostas imunitárias.

[0094] A experiência cumulativa com vários antigénios demonstrou que os ratos transgénicos HuMAb respondem melhor quando inicialmente imunizados por via intraperitoneal (IP) ou subcutânea (SC) com células que expressam CD20 em adjuvante completo de Freund, seguida de imunizações IP em semanas alternadas (até um total de 10) com células que expressam CD20 em PBS. A resposta imunitária pode ser monitorizada no decurso do protocolo de imunização, sendo as amostras de plasma obtidas a partir de hemorragias retro-orbitárias. 0 plasma pode ser analisado por FACS (como abaixo descrito) , e os ratos com títulos suficientes de imunoglobulina humana anti-CD20 podem ser usados para fusões. Os ratos podem ser injectados com células que expressam CD20, por via intravenosa, 3 dias antes do seu sacrifício e remoção do baço.

Geração de hibridomas produtores de anticorpos monoclonais humanos para o CD20 [0095] Para gerar hibridomas produtores de anticorpos monoclonais humanos para o CD20, podem ser isolados e fundidos esplenócitos e células de nódulos linfáticos de ratos imunizados para uma linha celular imortalizada adequada, tal como uma linha celular murina de mieloma. Os hibridomas resultantes podem então ser examinados quanto à produção de anticorpos específicos do antigénio. Por exemplo, suspensões de célula única de linfócitos esplénicos de ratos imunizados podem ser fundidas com células de mieloma de ratos não 30 secretoras SP2/0-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) com PEG a 50% (p/v). As células podem ser colocadas 1 x 105 por poço em placas de microtitulação de base plana, para incubação durante duas semanas em meio selectivo contendo para além dos reagentes habituais, soro fetal Clone Serum a 10%, factor de clonagem de hibridoma de origem a 5-10% (IGEN) e IX HAT (Sigma) . Após cerca de duas semanas, as células podem ser cultivadas em meio no qual o HAT é substituído por HT. Os poços individuais podem então ser rastreados por ELISA para anticorpos humanos com cadeia leve κ e por análise FACS para a especificidade para o CD20, utilizando células que expressam CD20. Quando ocorre crescimento extensivo do hibridoma, o meio pode ser observado, habitualmente, após 10-14 dias. Os hibridomas secretores de anticorpos podem ser recolocados em placas, novamente rastreados e, se permanecerem positivos para a IgG Humana, os anticorpos monoclonais anti-CD20 podem ser subclonados, pelo menos, duas vezes, através da limitação da diluição. Os subclones estáveis podem ser então cultivados in vitro para gerar anticorpos no meio de cultura de tecido para caracterização.

Geração de transfectomas produtores de anticorpos monoclonais humanos para o CD20 [0096] Anticorpos humanos da invenção podem também ser produzidos num transfectoma de célula hospedeira utilizando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção de genes, como é conhecido na área (Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

[0097] Por exemplo, numa modalidade, o(s) gene(s) de interesse, e.g., genes de anticorpos humanos, podem ser ligados num vector de expressão como um plasmídeo de expressão eucariótica como os utilizados pelo sistema de expressão de genes GS divulgado nas publicações WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338 841, ou outros sistemas de expressão conhecidos na área. 0 plasmídeo purificado com os genes de anticorpos clonados pode ser introduzido em células hospedeiras eucarióticas, tais como as células CHO, NS/0 ou HEK293 ou, em alternativa, outras células eucarióticas como as derivadas de plantas, fungos ou células de levedura. O método usado para a introdução destes genes pode ser um dos descritos na área, como p. ex. electroporação, lipofectina, lipofectamina ou outros. Após a introdução desses genes de anticorpos nas células hospedeiras, podem ser identificadas e seleccionadas células que expressam o anticorpo. Estas células representam os transfectomas que podem ser amplificados para o seu nível de expressão e optimizados para a produção de anticorpos. Os anticorpos recombinantes podem ser isolados e purificados a partir desses sobrenadantes e/ou células de cultura. 31

Meios recombinantes adicionais para a produção de anticorpos monoclonais humanos para o CD20.

[0098] Em alternativa, os genes do anticorpo clonado podem ser expressos noutros sistemas de expressão, incluindo células procarióticas como microorganismos, tais como E. coli, para a produção de anticorpos Fv de cadeia simples, algas, assim como células de insectos. Além disso, os anticorpos podem ser produzidos por animais transgénicos não-humanos, tal como no leite de ovelha e coelho e nos ovos de galinha ou por plantas transgénicas. Ver, e.g. Verma, R., et ai. (1998). Antibody engineering: Comparison of bacterial, yeast, insect and mammalian expression Systems. J. Immunol.Meth. 216:165-181;

Pollock, et al. (1999). Transgenic milk as a method for the production of recombinant antibodies. J. Immunol.Meth. 231:147-157; e Fischer, R., et al. (1999). Molecular farming of recombinant antibodies in plants. Biol.Chem. 380:825-839.

Utilização de sequências de anticorpos parciais para a expressão de anticorpos intactos [0099] Os anticorpos interagem com antigénios alvo, predominantemente, através de resíduos de aminoácidos que estão localizados nas seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia leve e pesada. Por essa razão, as sequências de aminoácidos dentro das CDR são mais diversas entre anticorpos individuais do que as que se encontram fora das CDR. Uma vez que as sequências CDR são responsáveis pela maioria das interacções anticorpo-antigénio, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitam as propriedades de anticorpos específicos de ocorrência natural através da produção de vectores de expressão que incluem sequências CDR do anticorpo específico de ocorrência natural enxertados em sequências de estrutura de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (ver, por exemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; e Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A. 86:10029-10033). Tais sequências estruturais podem ser obtidas a partir de bases de dados de DNA públicas, que incluem sequências germinativas de genes de anticorpos. Estas sequências germinativas serão diferentes das sequências de genes de anticorpos maduros porque não irão incluir genes variáveis completamente agregados, formados pela junção V(D)J durante a maturação das células B. As sequências de genes germinativas serão, também, diferentes das sequências de um anticorpo com um repertório secundário de elevada afinidade a nível individual, uniformemente através da região variável. Por exemplo, mutações somáticas são relativamente raras na secção amino-terminal da região de estrutura 1 e na secção carboxi-terminal da região de estrutura 4. Para além disso, muitas mutações somáticas não alteram, 32 significativamente, as propriedades de ligação do anticorpo. Por este motivo, não será necessário obter a sequência completa de DNA de um determinado anticorpo para recrear um anticorpo recombinante intacto, com propriedades de ligação similares às do anticorpo original (ver WO 99/45962). Uma sequência parcial de cadeia leve e pesada que abrange as regiões CDR é, habitualmente, suficiente para este propósito. A sequência parcial é usada para determinar que segmentos de junção e germinativos contribuíram para os genes variáveis de anticorpos recombinados. A sequência germinativa é, então, utilizada para preencher as porções em falta das regiões variáveis. As sequências líder de cadeia pesada e leve são clivadas durante a maturação proteica e não contribuem para as propriedades do anticorpo final. Para adicionar as sequências em falta, podem ser combinadas sequências de cDNA com oligonucleótidos sintéticos, por ligação ou amplificação PCR. Em alternativa, toda a região variável pode ser sintetizada como um conjunto de oligonucleótidos curtos e sobrepostos e, combinada por amplificação de PCR para criar um clone de uma região variável inteiramente sintético. Este processo tem certas vantagens como a eliminação ou inclusão de determinados locais de restrição ou a optimização de codões específicos.

[0100] As sequências de nucleótidos de cadeia leve e pesada transcritas de hibridomas são utilizadas para desenhar um conjunto sobreposto de oligonucleótidos sintéticos para criar sequências V sintéticas com capacidades de codificação de aminoácidos idênticas às das sequências naturais. A sequências de cadeia pesada e kapa sintéticas podem ser diferentes das sequências naturais em três aspectos: fitas de bases de nucleótidos repetidas são interrompidas para facilitar a síntese de oligonucleótidos e amplificação de PCR; locais de iniciação de tradução óptima estão incorporados de acordo com as regras de Kozak; (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870); e locais HindIII estão concebidos a montante dos locais de iniciação de tradução óptima.

[0101] Para ambas as regiões variáveis de cadeia leve e pesada, as sequências optimizadas de cadeias de codificação e de não-codificação correspondentes são divididas em 30-50 nucleótidos, aproximadamente no ponto médio do oligonucleótido não-codifiçado correspondente. Assim, para cada cadeia, os oligonucleótidos podem ser agregados em conjuntos sobrepostos de cadeia dupla que abrangem segmentos de 150 - 400 nucleótidos. Os conjuntos são então usados como modelos para produzir produtos de amplificação PCR com 150 - 400 nucleótidos. Habitualmente, será dividido um único conjunto de oligonucleótidos da região variável em dois agrumamentos, amplificados em separado para gerar dois produtos PCR sobrepostos. Estes produtos sobrepostos são então combinados por amplificação PCR, para formar toda a região variável. Pode 33 também ser desejável incluir um fragmento sobreposto da região constante de cadeia pesada ou leve (incluindo o local Bbsl da cadeia leve κ ou o local Agel da cadeia pesada gama) na amplificação PCR para gerar fragmentos gue possam facilmente ser clonados em constructos de vectores de expressão.

[0102] As regiões variáveis de cadeia pesada e leve reconstruídas são então combinadas com as sequências promotora clonada, líder, inibitória de tradução, constante, 3' sem tradução, de poliadenilação e de terminação de transcrição, para formar constructos de vectores de expressão. Os constructos de expressão de cadeia pesada e leve podem ser combinados num vector único, co-transfectados, transfectados em série ou separadamente transfectados em células hospedeiras que são, então, fundidas para formar uma célula hospedeira que expressa ambas as cadeias.

[0103] Os plasmídeos para uso na produção de vectores de expressão para a IgGx humana são descritos abaixo. Os plasmídeos foram produzidos de modo a que as sequências de cDNA de cadeia pesada V e de cadeia leve κ amplificadas por PCR possam ser utilizadas na reconstrução de minigenes completos de cadeia pesada e leve. Estes plasmídeos podem ser usados para expressar anticorpos IgGl,x ou IgG4,x, totalmente humanos ou quiméricos. Podem ser produzidos plasmídeos similares para a expressão de outros isotipos de cadeia pesada ou de anticorpos que incluam cadeias leves lambda.

[0104] Assim, as características funcionais dos anticorpos humanos anti-CD20 da invenção, por exemplo, 2F2 ou 7D8, são utilizadas para criar anticorpos humanos anti-CD20 estruturalmente relacionados que retêm, pelo menos, uma propriedade funcional dos anticorpos da invenção, tal como a ligação ao CD20. Mais especificamente, uma ou mais regiões CDR do 2F2 ou 7D8 podem ser combinadas por recombinação com regiões de estrutura e CDRs humanas conhecidas para criar anticorpos humanos anti-CD20 de concepção recombinante.

[0105] Como tal, um anticorpo humano anti-CD20 pode ser preparado a partir de um método que engloba a preparação de um anticorpo que compreende (1) regiões de estrutura de cadeia pesada humana e CDRs de cadeia pesada humana, em que pelo menos uma das CDRs de cadeia pesada humana contém uma sequência de aminoácidos seleccionada entre as sequências de aminoácidos das CDRs apresentadas nas Figuras 53 ou 55 (ou entre os resíduos de aminoácidos correspondentes, apresentados nas SEQ. ID. N.° 13-15 ou 19-21); e (2) regiões de estrutura de cadeia leve humana e CDRs de cadeia leve humana, em que pelo menos uma das CDRs de cadeia leve humana contém uma sequência de aminoácidos seleccionada entre as sequências de aminoácidos das CDRs apresentadas pelas figuras 53 ou 55 (ou 34 entre os resíduos de aminoácidos correspondentes, apresentados nas SEQ. ID. N.° 16-18 ou 22-24); onde o anticorpo mantém a capacidade de se ligar ao CD20.

[0106] A capacidade de ligação do anticorpo ao CD20 pode ser determinada através de ensaios de ligação padrão, como os apresentados nos Exemplos (por exemplo, análise FACS).

[0107] Visto ser bem conhecido na área o importante papel desempenhado pelos domínios CDR3 de anticorpos de cadeia pesada e leve na especificidade/afinidade de ligação de um anticorpo para um antigénio, os anticorpos recombinantes preparados como acima estabelecido compreendem, preferencialmente, as CDR3 de cadeia pesada e leve dos anticorpos 2F2 ou 7D8. Os anticorpos podem ainda conter as CDR2s do 2F2 ou 7D8. Os anticorpos podem ainda conter as CDRls do 2F2 ou 7D8. Assim, tais anticorpos anti-CD20 contêm: (1)

regiões de estrutura de cadeia pesada humana, uma região CDR1 de cadeia pesada humana, uma região CDR2 de cadeia pesada humana e uma região CDR3 de cadeia pesada humana, onde a região CDR3 de cadeia pesada humana é a CDR3 do 2F2 ou 7D8, como apresentado pelas figuras 53 ou 55 (ou entre os resíduos de aminoácidos correspondentes, apresentados nas SEQ. ID. N.° 15 ou 21); e (2) regiões de estrutura de cadeia leve humana, uma região CDR1 de cadeia leve humana, uma região CDR2 de cadeia leve humana, uma região CDR3 de cadeia leve humana, em que a região CDR3 de cadeia leve humana é a região CDR3 do anticorpo 2F2 ou 7D8, como ilustrado pelas figuras 53 ou 55 (ou resíduos de aminoácidos correspondentes, como ilustrado pelas SEQ. ID N.° 18 ou 24), onde o anticorpo liga o CD20. O anticorpo pode ainda conter a CDR2 de cadeia pesada e/ou leve do 2F2 ou 7D8. 0 anticorpo pode ainda conter a CDR1 de cadeia pesada e/ou leve do 2F2 ou 7D8.

[0108] As CDR1, 2 e/ou 3 dos anticorpos fabricados pelo método acima descrito contêm, preferencialmente, a(s) sequência(s) exacta(s) de aminoácidos aqui divulgada (s) para o 2F2 ou 7D8. Contudo, o especialista de habilidade comum na área compreenderá a possibilidade de ocorrência de alguns desvios em relação às sequências CDR exactas do 2F2 ou 7D8, sem que o anticorpo perca a capacidade de se ligar eficazmente ao CD20 (e.g., substituições conservadoras). Assim, noutra modalidade, o anticorpo artificial pode ser composto por uma ou mais CDRs que são, por exemplo, 90%, 95%, 98% ou 99,5% idênticas a uma ou mais CDRs do 2F2 ou 7D8.

[0109] Para além de se ligarem simplesmente ao CD20, os anticorpos fabricados através do método acima descrito podem ser seleccionados pela sua manutenção de outras propriedades funcionais dos anticorpos da invenção, tais como: 35 (1) baixa taxa de dissociação do CD20; (2) elevada afinidade de ligação ao CD20; (3) ligação a um epítopo único no CD20 e/ou ligação numa orientação específica ao CD20 e/ou ligação a uma forma específica de CD20; (4) mediação de um nivel elevado de CDC quer em células CD55/59 negativas como em positivas; (5) translocação para rafts lipídicos aquando da ligação ao CD2 0; (6) inibição do crescimento de células que expressam CD20; (7) indução da apoptose de células que expressam CD20; (8) indução da adesão homotípica de células que expressam CD2 0; (9) sobrevivência prolongada de um sujeito portador de células tumorais que expressam CD20; (10) mediação da ADCC de alvos CD20 quando conjugadas com células efectoras apropriadas; (11) depleção de células que expressam CD20; e/ou (12) capacidade de depleção das células que expressam níveis reduzidos de CD20 (células CD20low) .

Caracterização da ligação de anticorpos monoclonais humanos para o CD20 [0110] Para purificar anticorpos humanos anti-CD20, podem ser cultivados hibridomas seleccionados para a purificação de anticorpos, em frascos de centrifugação (spinner) de dois litros. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes do processo de purificação da proteína por cromatografia de afinidade em proteína A-sefarose (para isotipos de anticorpos IgGl) (Pharmacia, Piscataway, NJ) ou IgG anti-humana revestida por sefarose ou proteína G-sefarose, no caso de isotipos de anticorpos IgG3. A IgG eluída pode ser verificada por electroforese em gel e cromatografia líquida de alta resolução para garantir a pureza. A solução tampão pode ser substituída por PBS e a concentração pode ser determinada por OD280 , usando um coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser divididos em alíquotas e armazenados a -80 °C. 36 [0111] Para determinar se os anticorpos monoclonais humanos anti-CD20 se ligam a epítopos específicos, pode utilizar-se a mutagénese dirigida ou multicêntrica.

[0112] A determinação do isotipo de anticorpos purificados pode ser realizada através de testes ELISA. Poços de placas de microtitulação podem ser revestidos com 10 yg/ml de IgG anti-humana, durante a noite, a 4°C. Após bloqueio com BSA a 5%, as placas são colocadas em reacção com 10 yg/ml de anticorpos monoclonais ou isotipos de controlo purificados, à temperatura ambiente por duas horas. Os poços podem então ser colocados em reacção quer com a IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana, quer com sondas conjugadas de fosfatase alcalina, específicas para a IgM. Após lavagem, as placas são desenvolvidas com substrato pNPP (1 mg/ml) e analisadas por densidade óptica (OD) a 405-650.

[0113] A citometria de fluxo pode ser utilizada de modo a demonstrar a presença de anticorpos anti-CD20 em soros de ratos imunizados ou a ligação de anticorpos monoclonais a células vivas que expressam CD20. Resumidamente, as linhas celulares que expressam CD20 (cultivadas em condições padrão) são misturadas com várias concentrações de anticorpos monoclonais em PBS com BSA a 0,1% e azida de sódio a 0,02% e incubadas a 4o C, durante 30 minutos. Após lavagem, as células são colocadas em reacção com anticorpos anti-IgG humana marcados com fluoresceina nas mesmas condições da coloração de anticorpos primários. As amostras podem ser analisadas com um instrumento FACS, com utilização de propriedades de luz e dispersão lateral para o alcance de células individuais, vivas. Pode ser utilizado um ensaio alternativo que recorre a microscopia de fluorescência (em acréscimo ou em vez de), o ensaio de citometria de fluxo. As células podem ser coradas tal como acima descrito e examinadas por microscopia de fluorescência. Este método permite a visualização de células individuais podendo, contudo, ter sensibilidade reduzida, dependendo da densidade do antigénio.

[0114] As IgGs humanas anti-CD20 podem ainda ser testadas por Western blotting quanto à reactividade com o antigénio CD20. Resumidamente, os extractos de células que expressam CD20 podem ser preparados e sujeitos a electroforese em SDS-PAGE. Após a electroforese, os antigénios separados serão transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados com soro murino a 20% e sondados com os anticorpos monoclonais a serem testados. A ligação da IgG humana pode ser detectada através da utilização de fosfatase alcalina anti-IgG humana e desenvolvida com comprimidos de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO). 37

Actividades fagocitária e de eliminação dos anticorpos monoclonais humanos para o CD20 [0115] Para além de estabelecerem ligaçao específica com o CD20, os anticorpos monoclonais humanos anti-CD20 podem ser testados para a sua capacidade de mediação da fagocitose e eliminação das células que expressam CD20. A análise da actividade in vitro dos anticorpos monoclonais fornecerá um rastreio inicial, que antecede a análise de modelos in vivo. Resumidamente, as células polimorfonucleares (PMN), NK, monócitos e outras células efectoras podem ser purificadas por centrifugação com gradiente de densidade Ficoll Hypaque, seguida de lise de eritrócitos contaminantes. As células PMN lavadas podem ser colocadas em suspensão em RPMI suplementado com 10% de 10% de soro fetal de vitela inactivado por calor e misturadas com células 51Cr marcadas que expressam CD20, em várias proporções de células efectoras para tumorais (células efectoras:células tumorais). Podem ser adicionadas IgGs humanas purificadas anti-CD20 em várias concentrações. Podem ser usada IgG humana irrelevante enquanto controlo negativo. Podem ser realizados ensaios durante um período de 4 a 20 horas a 37aC, dependendo do tipo de célula efectora utilizado. As amostras podem ser ensaiadas para a citólise através da medição da libertação de 51Cr para o sobrenadante da cultura. Os anticorpos monoclonais anti-CD20 podem também ser testados em combinações entre si para determinar se a citólise é reforçada pela presença de múltiplos anticorpos monoclonais.

[0116] Os anticorpos monoclonais humanos que se ligam ao CD20 podem também ser testados num modelo in vivo (e.g., em ratos) para determinar a sua eficácia no controlo do crescimento de células tumorais que expressam CD20. Estes anticorpos podem ser seleccionados, por exemplo, com base nos seguintes critérios, que não devem ser entendidos como exclusivos: 1. ligação a células vivas que expressam CD20; 2. taxa reduzida de dissociação do CD20; 3. elevada afinidade de ligação ao CD20; 4. ligação a um epítopo único no CD20; e/ou ligação ao CD20 numa orientação específica, e/ou ligação a uma forma específica de CD20; 5. opsonização de células que expressam CD20; 6. mediação da inibição do crescimento, fagocitose e/ou eliminação de células que expressam CD20 na presença de células efectoras humanas; 38 7. capacidade de indução da CDC quer em células CD55/CD59 negativas como em positivas; 8. capacidade de indução da adesão homotípica; 9. capacidade de indução da translocação para rafts lipidicos aquando da ligação ao CD20; 10. capacidade de indução da apoptose; 11. capacidade de indução da ADCC em células que expressam CD2 0; 12. capacidade de depleção das células que expressam CD20; e/ou 13. capacidade de depleção das células que expressam niveis reduzidos de CD20 (células CD20low) .

[0117] Os anticorpos monoclonais humanos da invenção preferidos cumprem um ou mais destes critérios.

[0118] Os anticorpos monoclonais humanos anti-CD20 podem ser testados para a sua capacidade de mediação da CDC através de uma variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, o soro para o complemento pode ser obtido a partir do sangue de sujeitos saudáveis, que pode ser centrifugado e colhido. Podem ser utilizados diferentes métodos para determinar a actividade CDC de vários mAbs. A libertação de 51Cr pode, por exemplo, corresponder à permeabilidade de membrana calculada ou elevada e ser avaliada através de uma ensaio de exclusão de iodeto de propidio (IP). Resumidamente, as células alvo podem ser lavadas e suspensas em RPMI-1% BSA a 1 x 106/ml. Podem ser adicionadas às células várias concentrações de mAb e permitir-se o estabelecimento de ligação, durante 10-15 minutos, à temperatura ambiente. O soro pode ser adicionado a uma concentração final de 20% (v/v) e as células incubadas, a 37 °C durante 45 minutos. Podem ser adicionadas todas as células de cada amostra à solução de IP, num tubo FACS. A mistura pode então ser imediatamente avaliada por citometria de fluxo, utilizando um citómetro de fluxo FACScalibur e analisadas através da aplicação CellQuest pro (BD Biosciences, Mountain view, CA).

[0119] Para testar a capacidade de iniciação da apoptose, os anticorpos monoclonais humanos anti-CD20 podem, por exemplo, ser incubados com células tumorais positivas para o CD20, e.g., da linhagem Daudi, a 37 °C durante cerca de 20 horas. As células podem ser colhidas, lavadas em tampão de ligação Anexina-V-FITC (BD Biosciences) e marcadas com Anexina V-FITC (BD Biosciences) durante 15 minutos no escuro, a 4 °C. Podem 39 ser adicionadas todas as células de cada amostra à solução de IP (10 pg/ml em PBS) num tubo FACS e imediatamente avaliadas por citometria de fluxo (tal como acima).

[0120] Numa modalidade específica da invenção, os anticorpos monoclonais humanos são usados em combinação, por exemplo, na forma de uma composição farmacêutica que compreende dois ou mais anticorpos monoclonais anti-CD20. Por exemplo, os anticorpos monoclonais humanos anti-CD20 com actividades diferentes, embora complementares, podem ser combinados numa única terapia para alcançar um efeito terapêutico ou de diagnóstico desejado. Numa modalidade preferida, a composição inclui um anticorpo monoclonal humano anti-CD20 que, em combinação com outro anticorpo monoclonal humano anti-CD20, media a CDC. Noutra modalidade, a composição inclui anticorpos monoclonais humanos anti-CD20 que mediam uma eliminação altamente eficaz de células alvo na presença de células efectoras, combinados com outros anticorpos monoclonais humanos anti-CD20 que inibem o crescimento de células que expressam CD20. 11. Produção de animais transgénicos e transcromossómicos não-humanos que geram anticorpos monoclonais humanos anti-CD20 [0121] São também revelados animais transgénicos e transcromossómicos não-humanos, tais como ratos transgénicos ou transcromossómicos, capazes de expressar anticorpos monoclonais que se ligam especificamente ao CD20. Numa modalidade específica, o genoma do rato transgénico ou transcromossómico contém um transgene humano de cadeia pesada, de modo a que este possa produzir anticorpos humanos anti-CD20 quando imunizado com células que expressam CD20. 0 transgene humano de cadeia pesada pode ser integrado no DNA cromossómico do rato, como é o caso para ratos transgénicos, e.g., HuMAb, conforme aqui descrito e exemplificado em detalhe. Em alternativa, o transgene humano de cadeia pesada pode ser mantido extracromossomicamente, como é o caso para ratos transcromossómicos (e.g., KM), conforme descrito na patente WO 02/43478. Tais animais transgénicos e transcromossómicos são capazes de produzir múltiplos isotipos de anticorpos monoclonais humanos para o CD20 (e.g., IgG, IgA e/ou IgE) por recombinação VDJ/VJ e comutação de isotipos. A concepção de um animal transgénico ou transcromossómico não-humano com um repertório heterólogo de anticorpos que responde a estimulação genética externa, requer que os transgenes de imunoglobulina contidos no animal transgénico funcionem correctamente durante o percurso de desenvolvimento das células B. Tal inclui, por exemplo, a comutação de isotipos do transgene heterólogo de cadeia pesada. Como tal, os transgenes são construídos de modo a que possam ser induzidas a comutação de isotipos e uma ou mais das seguintes características dos genes de anticorpos: 40 (1) expressão de alto nível e específica para tipos de células, (2) reorganização do gene funcional, (3) activação e resposta à exclusão alélica, (4) expressão de um repertório primário suficiente, (5) transdução de sinal, (6) hipermutação somática e (7) domínio do locus do anticorpo transgene durante a resposta imune.

[0122] Nem todos os critérios precedentes necessitam de ser cumpridos. Por exemplo, nas modalidades em que os loci da imunoglobulina endógena do animal transgénico são funcionalmente alterados, o transgene não necessita de activar a exclusão alélica. Adicionalmente, nas modalidades em que o transgene contém um gene de imunoglobulina de cadeia pesada e/ou leve funcionalmente reorganizada, o segundo critério de reorganização funcional do gene é desnecessário, pelo menos para o transgene que já se encontra reorganizado. Para referências de fundo em imunologia molecular, ver Fundamental Immunology, 2nd edition (1989), Paul William E., ed. Raven Press, N.Y.

[0123] Nalgumas modalidades, os animais não-humanos transgénicos ou transcromossómicos usados para produzir os anticorpos monoclonais humanos da invenção incluem transgenes de imunoglobulina heteróloga de cadeia pesada e leve rearranjados, inalterados ou numa combinação entre rearranjados e inalterados na linha germinativa do animal transgénico. Cada um dos transgenes de cadeia pesada compreende, pelo menos, um gene CH. Adicionalmente, o transgene de cadeia pesada pode conter sequências de comutação de isotipos funcionais, capazes de suportar comutação de isotipos de um transgene heterólogo que codifique múltiplos genes CH nas células B do animal transgénico. Tais sequências de comutação podem ser aquelas que ocorrem naturalmente no locus da imunoglobulina na linha germinativa da espécie que serve como fonte do transgene dos genes CH, ou tais sequências de comutação podem derivar daquelas que ocorrem na espécie que irá receber o constructo transgénico (o animal transgénico). Por exemplo, o constructo transgénico humano que é usado para produzir um rato transgénico pode produzir um aumento na frequência de eventos de comutação de isotipos, se incorporar sequências de comutação semelhantes àquelas que ocorrem naturalmente no locus da cadeia pesada do rato por, presumivelmente, as sequências de comutação do rato serem optimizadas para funcionar com sistema de troca por enzima recombinase do rato, enquanto que as sequências de comutação humanas não. Sequências de comutação podem ser isoladas e clonadas por clonagem convencional ou ser sintetizadas de novo por sobreposição de oligonucleótidos sintéticos concebidos com base em informação publicada referente a sequências de regiões de comutação da imunoglobulina (Mills et al., Nucl. Acids Res. 15:7305-7316 (1991); Sideras et al. , Intl. Immunol. 1:631-642 41 (1989) ) . Para cada um dos seguintes animais transgénicos são encontrados transgenes de imunoglobulina heteróloga de cadeia pesada ou leve numa fracção significativa das células B do animal transgénico (pelo menos 10 por cento).

[0124] Os transgenes usados para gerar os animais não-humanos transgénicos da invenção incluem um transgene de cadeia pesada que compreende DNA que codifica pelo menos um segmento de gene variável, um segmento de gene de diversidade, um segmento de gene de junção e, pelo menos, um segmento de gene de região constante. O transgene de imunoglobulina de cadeia leve inclui DNA que codifica pelo menos um segmento de gene variável, um segmento de gene de junção e, pelo menos, um segmento de gene de região constante. Os segmentos de gene que codificam os segmentos de gene de cadeia leve e pesada são heterólogos ao animal transgénico, na medida em que derivam ou correspondem ao DNA que codifica segmentos de gene de imunoglobulina de cadeia leve e pesada de uma espécie não consistente com o animal transgénico não-humano. Num aspecto da invenção, o transgene é construído de forma a que segmentos individuais de genes se mantenham inalterados, ou seja, não rearranjados, de modo a codificar uma imunoglobulina funcional de cadeia pesada ou leve. Tais transgenes inalterados suportam a recombinação dos segmentos de gene V, D, e J (reorganização funcional) e, preferencialmente, a incorporação de uma porção ou totalidade do gene de região D na imunoglobulina de cadeia pesada reorganizada resultante no animal transgénico não-humano, quando exposto ao antigénio CD20.

[0125] Numa modalidade alternativa, os transgenes compreendem um "mini-locus" inalterado. Tais transgenes incluem, tipicamente, uma porção substancial dos segmentos C, D e J, assim como um subconjunto dos segmentos de gene V. Em tais constructos transgénicos, as várias sequências reguladoras, e.g. promotoras, potenciadoras, regiões de comutação de classe, sequências doadoras e aceitadoras de splicing para processamento de RNA, sinais de recombinação e similares, compreendem sequências derivadas do DNA heterólogo. Tais sequências reguladoras podem ser incorporadas no transgene da mesma espécie ou de uma espécie relacionada à do animal não-humano usado na investigação. Por exemplo, segmentos de gene de imunoglobulina humana podem ser combinados num transgene com uma sequência potenciadora de imunoglobulina de roedor para utilização em ratos transgénicos. Alternativamente, sequências reguladoras sintéticas podem ser incorporadas no transgene, onde tais sequências reguladoras sintéticas não são homólogas à sequência funcional de DNA que é conhecida por ocorrer naturalmente nos genomas de mamíferos. As sequências reguladoras sintéticas são designadas de acordo com regras consensuais tais como, por exemplo, aquelas que especificam as sequências admissíveis de um sítio aceitador de splicing ou um 42 motivo promotor/potenciador. Por exemplo, um minilocus compreende uma porção do locus da imunoglobulina genómica tendo, pelo menos, uma deleção interna (ou seja, não no término da porção) de uma porção de DNA não-essencial (por exemplo, sequência de intervenção; intrão ou parte deste) em comparação com o locus Ig de ocorrência natural da linha germinativa.

[0126] Os animais transgénicos e transcromossómicos não-humanos preferidos, por exemplo, ratos, exibirão uma produção de imunoglobulina com um repertório significativo, idealmente, substancialmente similar à de um humano quando ajustado para o volume.

[0127] 0 repertório irá idealmente aproximar-se ao apresentado por um humano quando ajustado para o volume, habitualmente com uma diversidade tão elevada quanto, pelo menos, 10%, de preferência entre 25 e 50% ou mais. Geralmente, são produzidas pelo menos cerca de mil imunoglobulinas diferentes (idealmente IgG), preferencialmente de 104 a 106 ou mais, dependendo principalmente do número de regiões V, J e D introduzidas no genoma do rato e conduzidas pela diversidade adicional gerada pelas adições aleatórias de nucleótidos nas regiões de junção através das reorganizações do segmento de gene V(-D-)J. Tipicamente, as imunoglobulinas exibirão uma afinidade (KD) com antigénios pré-seleccionados inferior a 10~7 M, p. ex. inferior a 10~8 Μ, 10~9 M ou 1CT10 M ou mesmo menor.

[0128] Conforme descrito acima, os animais transgénicos e transcromossómicos não-humanos, e.g. ratos, podem ser imunizados com, por exemplo, células que expressam CD20. Em alternativa, os animais transgénicos podem ser imunizados com DNA que codifica o CD20 humano. Os animais irão então produzir células B que são sujeitas a comutação de classe através de recombinação de comutação (cis-switching) e expressam imunoglobulinas reactivas com o CD20. As imunoglobulinas podem ser anticorpos humanos (também designados "sequências de anticorpos humanos"), em que os polipéptidos de cadeia pesada e leve são codificados por sequências de transgenes humanos, que podem incluir sequências derivadas por mutação somática e articulações recombinatórias da região V, assim como sequências codificadas pela linha germinativa; estes anticorpos humanos podem ser referidos como sendo substancialmente idênticos a uma sequência polipeptidica codificada pelos segmentos de gene VL e JL ou ou VH, DH e JH humanos, apesar de poderem estar presentes outras sequências não germinativas como resultado de mutação somática e de articulações recombinatórias diferenciais V-J e V-D-J. As regiões variáveis de cada cadeia de anticorpos são, normalmente, 80 por cento similares às dos segmentos de gene V, J e, no caso das cadeias pesadas, D da linha germinativa 43 humana; frequentemente, pelo menos 85 por cento similares às sequências da linha germinativa humana presentes no transgene; frequentemente, entre 90 e 95 por cento, ou mais, às sequências da linha germinativa humana presentes no transgene. No entanto, uma vez que as sequências não germinativas são introduzidas por mutação somática e articulação VJ e VDJ, as sequências de anticorpos humanos terão frequentemente algumas sequências de região variável que não são codificadas pelos segmentos de gene V, D ou J, como encontrados no(s) transgene (s) humano(s) da linha germinativa do rato. Tipicamente, tais sequências não germinativas (ou posições de nucleótidos individuais) irão aglomerar-se em ou perto de regiões determinantes de complementaridade (CDRs), ou em regiões conhecidas pela aglomeração de mutações somáticas.

[0129] As células B podem ser obtidas de animais transgénicos ou transcromossómicos não-humanos, como aqui descrito. As células B podem ser usadas para gerar hibridomas que expressam anticorpos monoclonais humanos que se ligam com elevada afinidade (por exemplo, uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) inferior a 1CT7 M) ao CD20 humano. Pode ser fornecido um hibridoma que produz um anticorpo humano com uma afinidade (KD) inferior a 1CT7 M, quando determinada através de análise de Scatchard de células que expressam CD20, utilizando um anticorpo monoclonal marcado radioactivamente, ou da determinação da concentração de ligação para 50%, por análise FACS .

[0130] Aqui, o anticorpo monoclonal inclui uma sequência de cadeia leve humana composta por (1) uma região variável de cadeia leve que contém uma sequência polipeptídica substancialmente idêntica à codificada por um segmento de gene VL humano e um segmento JL humano, e (2) uma região constante de cadeia leve codificada por um segmento de gene CL humano; e uma sequência de cadeia pesada humana composta por (1) uma região variável de cadeia pesada que contém uma sequência polipeptídica substancialmente idêntica à codificada por um segmento de gene VH humano, uma região D, e um segmento JH humano, e (2) uma região constante codificada por um segmento de gene CH humano.

[0131] O desenvolvimento de anticorpos monoclonais humanos com elevada afinidade para o CD20 pode ser facilitado através de um método de alargamento do repertório de segmentos de gene humano de região variável num animal transgénico não-humano cujo genoma integre um transgene humano de imunoglobulina; o método mencionado compreendendo a introdução no genoma de um transgene de gene V com segmentos de gene de região variável V que não se encontram presentes no transgene humano de imunoglobulina referido. Frequentemente, o transgene da região V é um cromossoma artificial de levedura composto por uma 44 porção de um conjunto de segmentos de gene VH or VL (VK) humanos, no formato de ocorrência natural no genoma humano ou individualmente unidos por métodos de recombinação, que podem incluir segmentos de gene V fora de ordem ou omitidos. Normalmente, pelo menos cinco ou mais segmentos funcionais de gene V estão contidos nos cromossomas artificiais de levedura (YAC) . Nesta variação, é possível produzir um animal transgénico a partir do método de alargamento do repertório V, em que o animal expressa uma cadeia de imunoglobulina que compreende um segmento de região variável codificado por um segmento de gene de região V presente no transgene de região V e uma região C codificada no transgene humano Ig. Por meio do método de alargamento do repertório V, podem ser gerados animais transgénicos com, pelo menos, 5 genes V distintos; assim como animais com, pelo menos, 24 genes V ou mais. Alguns segmentos de gene V podem ser não funcionais (por exemplo, pseudogenes e similares); estes segmentos podem ser retidos ou selectivamente excluídos pelos métodos de recombinação disponíveis ao especialista, se desejado.

[0132] Logo que a linha germinativa do rato tenha sido concebida para conter um cromossoma artificial de levedura (YAC) funcional com um repertório alargado de segmentos V, substancialmente ausente no transgene humano Ig que contém segmentos de gene J e G, este traço pode ser propagado e criado noutros contextos genéticos, incluindo contextos onde o YAC funcional com um repertório alargado de segmentos V é introduzido na linha germinativa de um animal não-humano com um transgene humano Ig diferente. Múltiplos YACs funcionais com um repertório alargado de segmentos V podem ser introduzidos na linha germinativa para funcionar com um transgene humano Ig (ou múltiplos transgenes Ig). Embora aqui designados como transgenes YAC, estes transgenes quando integrados no genoma podem ter carência significativa de sequências de levedura, como as sequências necessárias à replicação autónoma na levedura; tais sequências podem ser, opcionalmente, removidas por engenharia genética (e.g., digestão de restrição e electroforese em gel de campo pulsado ou outro método adequado), uma vez que após replicação em levedura deixam de ser necessárias (i.e., antes da introdução na célula ES ou pré-zigoto do rato). Os métodos de propagação das características da expressão da sequência da imunoglobulina humana incluem a criação de um animal transgénico com transgene(s) humano(s) Ig e, opcionalmente, com um YAC funcional com repertório alargado de segmentos V. Tanto o segmento de gene VH como o VL podem estar presentes no YAC. 0 animal transgénico pode ser criado em qualquer contexto desejado, incluindo contextos que abrigam outros transgenes humanos, incluindo transgenes humanos Ig e/ou transgenes que codificam outras proteínas de linfócitos humanas. Uma sequência de imunoglobulina humana de elevada afinidade pode 45 ser produzida por um rato transgénico que tenha um transgene YAC de repertório alargado de regiões V. Apesar do exposto descrever uma modalidade preferida do animal transgénico da invenção, são contempladas outras modalidades que foram classificadas em três categorias: I. Animais transgénicos com um transgene de imunoglobulina de cadeia pesada inalterada e leve reorganizada; II. Animais transgénicos com um transgene de imunoglobulina de cadeia pesada e leve inalteradas; e III. Animais transgénicos com um transgene de imunoglobulina de cadeia pesada reorganizada e leve inalterada.

[0133] Destas categorias de animais transgénicos, a ordem preferencial é a seguinte II > I > III onde genes endógenos de cadeia leve (ou pelo menos o gene K) tenham sido removidos por recombinação homóloga (ou outro método) e I > II > III onde genes endógenos de cadeia leve não tenham sido removidos e devam ser dominados por exclusão alélica. III. Moléculas bi/multi-específicas que se ligam ao CD20 [0134] Os anticorpos monoclonais humanos para o CD20 podem ser derivados ou ligados a outra molécula funcional, por exemplo, outro péptido ou proteína (e.g., um fragmento Fab') para dar origem a outra molécula bi ou multi-específica que se liga a múltiplos locais de ligação ou epítopos alvo. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por ligação química, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais de outras moléculas de ligação, tais como outro anticorpo, péptido ou mimético de ligação.

[0135] Assim, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas que contêm um anticorpo monoclonal humano ou fragmento de anticorpo da invenção e uma segunda especificidade de ligação para uma célula efectora, receptor Fc humano ou um receptor de linfócitos T (segundo epítopo alvo) . São também divulgadas moléculas multi-específicas que contêm estas especificidades de ligação. 0 segundo epítopo alvo pode, portanto, ser um receptor Fc, por exemplo, um receptor FcyRI (CD64) ou Fca (CD89) humano ou um receptor de linfócitos T, por exemplo, CD3. Assim, as moléculas bi e multi-específicas podem ser capazes de se ligar a células efectoras que expressam FcyR, FcaR ou FcsR (e.g., monócitos, macrófagos ou células polimorfonucleares (PMN)) e de ter como alvo células que expressam CD20. Estas moléculas bi e multi-específicas direccionam as células que expressam CD20 à célula efectora e, tal como os anticorpos monoclonais humanos da 46 invenção, accionam as actividades mediadas pelo receptor Fc das células efectoras, tais como a fagocitose de células que expressam CD20, a citotoxicidade de células efectoras dependente dos anticorpos (ADCC), a liberação de citocinas e a produção de anião superóxido.

[0136] As moléculas bi-especificas e multi-especificas podem ainda incluir uma terceira especificidade de ligação, para além da especificidade de ligação anti-Fc e da especificidade de ligação anti-CD20. Numa modalidade, a terceira especificidade de ligação é uma porção do factor anti-reforço (EF) , por exemplo, uma molécula que estabelece ligação com uma proteína de superfície envolvida na actividade citotóxica e que, dessa forma, intensifica a resposta imune contra a célula alvo. A "porção do factor anti-reforço" pode ser um anticorpo, fragmento de anticorpo funcional ou um ligante que estabelece ligação com uma determinada molécula, por exemplo, um antigénio ou receptor, e produz, dessa forma, uma intensificação do efeito dos determinantes de ligação para o receptor Fc ou antigénio da célula alvo. A "porção do factor anti-reforço" pode ligar um receptor Fc ou um antigénio da célula alvo. Em alternativa, a porção do factor anti-reforço pode ligar-se a uma entidade diferente daquela a que se ligam a primeira e segunda especificidades de ligação. A porção do factor anti-reforço pode, por exemplo, ligar um linfócito T citotóxico (e.g., via CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ou outra célula imunitária que dê origem a uma resposta imune intensificada contra a célula alvo).

[0137] Numa modalidade, a especificidade de ligação das moléculas bi e multi-especificas compreende pelo menos um anticorpo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2/ Fv ou um Fv de cadeia simples. 0 anticorpo pode também ser um dímero de cadeia leve ou pesada ou qualquer fragmento mínimo do mesmo, como um Fv ou um constructo de cadeia simples, conforme descrito por Ladner et al., na patente US 4.946.778. O anticorpo pode também ser uma proteína de fusão do domínio de ligação da imunoglobulina, como divulgado nas Patentes U.S. N.° 2003/0118592 e 2003/0133939.

[0138] Numa modalidade, as moléculas bi e multi-especificas incluem uma especificidade de ligação para um FcyR ou FcaR presente na superfície de uma célula efectora e uma segunda especificidade de ligação para um antigénio da célula alvo, por exemplo, o CD20.

[0139] Numa modalidade, a especificidade de ligação para um receptor Fc é fornecida por um anticorpo monoclonal humano, cuja ligação não é bloqueada pela imunoglobulina G humana (IgG) . Como aqui empregue, o termo "receptor IgG" refere-se a qualquer dos oito genes de cadeia γ localizados no cromossoma 47 1. Estes genes codificam um total de doze isoformas do receptor, transmembranares ou solúveis, agrupadas em três classes de receptores Fcy: FcyRI (CD64) , FcyRII(CD32), e

FcyRIII (CD 16) . Numa modalidade preferida, o receptor Fcy é um FcyRI humano de elevada afinidade.

[0140] A produção e caracterização destes anticorpos monoclonais preferidos é descrita por Fanger et al.r nas patentes WO 88/00052 e U.S. N.° 4.954.617. Estes anticorpos estabelecem ligação com um epítopo de FcyRI, FcyRII ou FcyRIII num local do receptor distinto daquele a que se liga o Fcy e, dessa forma, a sua ligação não é substancialmente bloqueada pelos níveis fisiológicos de IgG. Os anticorpos anti-FcYRI específicos com utilidade para esta invenção são os mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 e mAb 197. Noutras modalidades, o anticorpo anti-FcY é uma forma humanizada do anticorpo monoclonal 22 (H22). A produção e caracterização do anticorpo H22 é descrita em Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol-155 (10): 4996-5002 e WO 94/10332. A linha celular produtora do anticorpo H22 foi depositada na American Type Culture Collection em 4 de Novembro de 1992, sob a designação HA022CL1 e com o N.° de acesso CRL 11177.

[0141] Ainda noutras modalidades preferidas, a especificidade de ligação para um receptor Fc é fornecida por um anticorpo que estabelece ligação com o receptor da IgA humana, por exemplo, um receptor Fc-alfa (FcaRI (CD89)), cuja ligação não é, preferencialmente, bloqueada pela imunoglobulina A humana (IgA) . 0 termo "receptor IgA" destina-se a incluir o produto de um gene α (FcaRI), localizado no cromossoma 19. Este gene é conhecido pela codificação de isoformas transmembranares alternativamente unidas de 55 a 110 kDa. O FcaRI (CD89) é constitutivamente expresso em monócitos/macrófagos, granulócitos eosinofílicos e neutrofílicos, mas não em populações de células não efectoras. O FcaRI tem uma afinidade média para a IgAl e IgA2, que é ampliada pela exposição a citocinas, tais como G-CSF ou GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996) Criticai Reviews in Immunology 16:423-440). Foram descritos quatro anticorpos monoclonais específicos para o FcaRI, identificados como A3, A59, A62 e A77, que estabelecem ligação com o mesmo fora do domínio de ligação do ligante da IgA (Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764).

[0142] FcaRI e FcyRI são receptores de desencadeamento aplicáveis à invenção por serem (1) primariamente expressos em células efectoras imunitárias, por exemplo, monócitos, PMNs, macrófagos e células dendríticas; (2) expressos em níveis elevados (por exemplo, 5.000-100.000 por células); (3) mediadores de actividades citotóxicas (por exemplo, ADCC, fagocitose); (4) mediadores de uma apresentação aperfeiçoada 48 dos antigénios, incluindo auto-antigénios, a eles direccionados.

[0143] Noutra modalidade, a molécula biespecífica é contida por dois anticorpos monoclonais humanos de acordo com a invenção que possuem actividades funcionais complementares, tal como um anticorpo que funciona predominantemente pela indução de CDC e outro que funciona predominantemente pela indução da apoptose, por exemplo, 2F2 em combinação com 11B8.

[0144] Noutras modalidades, são também reveladas moléculas biespecificas e multi-específicas que compreendem ainda uma especificidade de ligação que reconhece, e.g., estabelece ligação com, um antigénio de célula alvo, por exemplo, CD20. Numa modalidade preferida, a especificidade de ligação é fornecida por um anticorpo monoclonal humano da presente invenção.

[0145] Um "anticorpo especifico para células efectoras", como aqui empregue, refere-se a um anticorpo ou fragmento de anticorpo funcional que liga o receptor Fc de células efectoras. Os anticorpos preferidos para utilização na presente invenção ligam o receptor Fc de células alvo num local que não é limitado pela imunoglobulina endógena.

[0146] Como aqui empregue, o termo "célula efectora" refere-se a uma célula imunitária envolvida na fase efectora de uma resposta imune, por oposição às fases cognitiva e de activação. Os exemplos de células imunitárias incluem células de origem mielóide ou linfóide, por exemplo, linfócitos (e.g., células B e linfócitos T, incluindo linfócitos T citoliticos (CTLs)), células exterminadoras e NK, macrófagos, monócitos, eosinófilos, neutrófilos, células polimorfonucleares, granulócitos, mastócitos e basófilos. Algumas células efectoras expressam receptores Fc específicos e desempenham funções imunitárias específicas. Em modalidades preferidas, uma célula efectora é capaz de induzir a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), e.g., um neutrófilo capaz de induzir a ADCC. Por exemplo, os monócitos, macrófagos, que expressam FcR estão envolvidos na eliminação específica de células alvo e na apresentação de antigénios a outros componentes do sistema imunitário ou na ligação de células que contêm antigénios. Noutras modalidades, uma célula efectora pode fagocitar um antigénio, célula alvo ou microorganismo. A expressão de um determinado FcR numa célula efectora pode ser regulada por factores humorais, como as citocinas. Por exemplo, constatou-se que a expressão do FcyRI é suprarregulada pelo interferão gama (IFN-γ). Este reforço da expressão aumenta a actividade citotóxica de células que contêm FcyRI contra alvos. Uma célula efectora pode fagocitar ou lisar um antigénio ou célula alvo. 49 [0147] Uma "célula alvo" poderá ser qualquer célula indesejável num sujeito (e.g., um humano ou animal), que possa ser visada por uma composição (e.g., um anticorpo monoclonal humano, uma molécula biespecífica ou multi-especifica) da invenção. Em modalidades preferidas, a célula alvo é uma célula que expressa ou sobrexpressa CD20. As células que expressam CD20 incluem, normalmente, células B e tumores de células B.

[0148] Embora sejam preferidos os anticorpos monoclonais humanos, podem ser empregues nas moléculas biespecíficas ou multi-especificas outros anticorpos como os murinos, quiméricos e monoclonais humanizados. Tais anticorpos monoclonais murinos, quiméricos e humanizados podem ser preparados através de métodos conhecidos na área.

[0149] As moléculas biespecíficas e multi-especificas podem ser produzidas através de técnicas químicas (ver, e.g., D. M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:5807), "polidoma" (ver a Patente U.S. N.° 4.474.893, Reading) ou de DNA recombinante.

[0150] Em particular, as moléculas biespecíficas e multi- específicas podem ser preparadas pelo conjugação dos constituintes das especificidades de ligação, e.g., anti-FcR e anti-CD20, através de métodos conhecidos na área e aqui descritos nos exemplos aqui fornecidos. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica e multi-específica pode ser gerada em separado e, em seguida, conjugada com outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou péptidos, pode ser utilizada uma variedade de agentes de junção ou ligação cruzada para a conjugação covalente. Exemplos de agentes de ligação cruzada incluem a proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA), ácido 5,5 ' -ditiobis-2-nitrobenzóico (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3(2-piridil- ditio)propionato (SPDP) e sulfo-succinimidil-4-(N-maleimido-metil)ciclohexano-l-carboxilato (s-SMCC) (ver, e.g., Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160 : 1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:8648). (1984) J. Exp. Med.

160 : 1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:8648). Outros métodos incluem os descritos por Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) N.° 78, 118-132); Brennan et al. (Science (1985) 229:81-83), e Glennie et al. (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375). Os agentes de conjugação preferidos são SATA e sulfo-SMCC, disponibilizados pela Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

[0151] Quando as especificidades de ligação são anticorpos, estes podem ser conjugados através de uma ligação sulfidrilo 50 das regiões dobradiça da extremidade C-terminal de duas cadeias pesadas. Numa modalidade particularmente preferida, a região dobradiça é modificada para conter um número impar de residuos sulfidrilo, preferencialmente um, antes da conjugação.

[0152] Em alternativa, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vector e expressas e agregadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil onde a molécula biespecifica e multi-especifica é mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ou uma proteína de fusão ligante x Fab. Uma molécula biespecifica e multi-especifica da invenção, por exemplo, uma molécula biespecifica, pode ser uma molécula de cadeia simples, tal como um anticorpo biespecífico de cadeia simples, uma molécula biespecifica de cadeia simples que contém um anticorpo de cadeia simples e um determinante de ligação ou uma molécula de cadeia simples que contém dois determinantes de ligação. As moléculas biespecíficas e multi-específicas podem também ser moléculas de cadeia simples ou conter, pelo menos, duas moléculas de cadeia simples. Os métodos de preparação de moléculas biespecíficas e multi-específicas são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N.° 5.260.203; 5.455.030; 4.881.175; 5.132.405; 5.091.513; 5.476.786; 5.013.653; 5.258.498 e 5.482.858.

[0153] A ligação de moléculas biespecíficas e multi- específicas aos seus alvos respectivos pode ser confirmada através de um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), análise FACS, bioensaio (e.g., inibição do crescimento) ou de um ensaio Western Blot. Cada um destes ensaios detecta, geralmente, a presença de complexos proteína-anticorpo de particular interesse, através da aplicação de um reagente marcado específico (por exemplo, um anticorpo) para o complexo de interesse. Por exemplo, os complexos FcR-anticorpo podem ser detectados, por exemplo, através de um anticorpo ligado a uma enzima ou fragmento de anticorpo que reconhece e se liga especificamente aos complexos anticorpo-FcR. Em alternativa, os complexos podem ser detectados através de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado radioactivamente e utilizado num imunoensaio (RIA) (ver, por exemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986). O isótopo radioactivo pode ser detectado através de meios como a utilização de um contador γ ou de cintilação ou através de auto-radiografia. IV. Imunoconjugados [0154] Noutro aspecto, a presente invenção inclui um anticorpo monoclonal humano anti-CD20 conjugado com uma fracção 51 terapêutica como a citotoxina, um fármaco (por exemplo, um imunossupressor) ou um radioisótopo. Tais conjugados são aqui designados como "imunoconjugados". Os imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são designados como "imunotoxinas". Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente com acção prejudicial sobre as células (que, por exemplo, as mata). Os exemplos incluem o taxol, a citocalasina B, a gramicidina D, o brometo de etídio, a emetina, a mitomicina, o etoposido, a tenoposida, a vincristina, a vinblastina, a colquicina, a doxorrubicina, a daunorrubicina, a dihidroxi-antracina diona, a mitoxantrona, a mitramicina, a actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, os glucocorticóides, a procaina, a tetracaina, a lidocaína, o propranolol, e a puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos.

[0155] Os agentes terapêuticos adequados à formaçao dos imunoconjugados da invenção incluem, mas não exclusivamente, antimetabolitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil dacarbazina), agentes alquilantes (mecloretamina, clorambucil tiotepa, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, platina cis-diclorodiamina (II), ciplastina (DDP)), antraciclinas daunomicina) dactinomicina mitramicina e (por exemplo, preferida, o (e.g.f daunorrubicina (anteriormente e doxorrubicina) antibióticos (e.g., (anteriormente actinomicina), bleomicina, antramicina (AMC)), e agentes anti-mitóticos vincristina e vinblastina). Numa modalidade agente terapêutico é um agente citotóxico ou radiotóxico. Noutra modalidade, o agente terapêutico é um imunossupressor. Ainda noutra modalidade, o agente terapêutico é o GM-CSF. Numa modalidade preferida, o agente terapêutico é doxorrubicina, cisplatina, bleomicina, sulfato, carmustina, clorambucil, ciclofosfamida ou ricina A.

[0156] Os anticorpos da presente invenção podem também ser conjugados com um radioisótopo, por exemplo, iodo-131, ítrio-90 ou ítrio-111, de forma a gerar radiofármacos citotóxicos para o tratamento de distúrbios associados ao CD20, como o cancro. Os anticorpos conjugados da invenção podem ser usados para modificar uma determinada resposta biológica e, a fracção farmacológica não deve ser considerada como limitada aos agentes terapêuticos químicos clássicos. A fracção farmacológica pode, por exemplo, ser uma proteína ou polipéptido que possua uma actividade biológica desejável. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente activa ou um fragmento activo da mesma, como a abrina, a ricina A, as pseudomonas-exotoxina e a toxina da difteria; uma proteína, como o factor de necrose tumoral ou interferão γ; ou modificadores da resposta biológica como, por 52 exemplo, as linfocinas, a interleucina 1 ("IL-1"), a interleucina 2 ("IL-2"), a interleucina 6 ("IL-β"), o factor de estimulação de colónias de granulócitos macrófagos ("GM-CSF"), o factor de estimulação de colónias de granulócitos ("G-CSF") ou outras citocinas ou factores de estimulação.

[0157] As técnicas de conjugação de tais fracções terapêuticas a anticorpos são bem conhecidas. Ver, por exemplo, Arnon et ai., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinicai Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Câncer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).

[0158] Numa modalidade adicional, os anticorpos monoclonais humanos de acordo com a invenção são ligados a um ligante quelante como, por exemplo, o tiuxetano, o que permite que o anticorpo seja conjugado com um radioisótopo. V. Composições farmacêuticas [0159] Noutro aspecto, a invenção fornece uma composição, por exemplo, farmacêutica, que contém um ou uma combinação dos anticorpos monoclonais humanos da presente invenção. As composições farmacêuticas podem ser formuladas com veículos ou diluentes farmacologicamente aceitáveis, assim como com quaisquer outros adjuvantes e excipientes nos termos das técnicas convencionais, tais como as reveladas por Remington em: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. Numa modalidade, as composições incluem uma combinação de múltiplos (por exemplo, dois ou mais) anticorpos humanos isolados da invenção que actuam através de diferentes mecanismos, por exemplo, um anticorpo que actua predominantemente pela indução da CDC combinado com outro anticorpo que actua predominantemente pela indução da apoptose.

[0160] As composições farmacêuticas da invenção podem também ser administradas na terapêutica de combinação, ou seja, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapêutica de 53 combinação pode incluir uma composição da presente invenção com, pelo menos, um agente anti-inflamatório ou, pelo menos, um agente imunossupressor. Numa modalidade, tais agentes terapêuticos incluem um ou mais agentes anti-inflamatórios, tais como um fármaco esteróide ou um ΑΙΝΕ (anti-inflamatório não esteróide). Os agentes preferidos incluem, por exemplo, aspirina e outros salicilatos, inibidores da COX-2, tais como rofecoxib (Vioxx) e celecoxib (Celebrex), AINEs como o ibuprofeno (Motrin, Advil), fenoprofeno (Nalfon), naproxeno (Naprosyn), sulindac (Clinoril), diclofenac (Voltaren), piroxicam (Feldene), cetoprofeno (Orudis), diflunisal (Dolobid), nabumetona (Relafen) , etodolac (Lodine) , oxaprozin (Daypro) e indometacina (Indocin).

[0161] Noutra modalidade, tais agentes terapêuticos incluem um ou mais DMARDs, tais como metotrexato (Rheumatrex), hidroxicloroquina (Plaquenil) , sulfassalazina (Asulfidine) , inibidores da síntese da pirimidina, e.g., leflunomida (Arava), agentes bloqueadores do receptor da IL-1, e.g., anacinra (Kineret) e agentes de bloqueio do TNF-α, e.g., etanercept (Enbrel), infliximab (Remicade) e adalimumab.

[0162] Noutra modalidade, tais agentes terapêuticos incluem um ou mais agentes imunossupressores, tais como ciclosporina (Sandimmune, Neoral) e azatioprina (Imural).

[0163] Ainda noutra modalidade, tais agentes terapêuticos incluem um ou mais quimioterápicos, como doxorrubicina (Adriamicina), cisplatina (Platinol), bleomicina (Blenoxane), carmustina (Cytoxan, Procytox, Neosar) e clorambucil (Leukeran).

[0164] Noutra modalidade, a administração dos anticorpos humanos da presente invenção pode ser realizada em combinação com clorambucil e prednisona; ciclofosfamida e prednisona; ciclofosfamida, vincristina e prednisona; ciclofosfamida, vincristina, doxorrubicina e prednisona; fludarabina e antraciclina; ou em combinação com outros regimes multif ármacos comuns para o NHL, tal como os divulgados em, por exemplo, Non-Hodgkin's Lymphomas: Making sense of Diagnosis, Treatment, and Options, Lorraine Johnston, 1999, 0'Reilly and Associates, Inc.

[0165] Ainda noutra modalidade, a administração de anticorpos humanos pode ser conjugada com radioterapia e/ou transplante autólogo de células estaminais do sangue periférico ou da medula óssea.

[0166] Ainda noutra modalidade, os anticorpos humanos podem ser administrados em combinação com um ou mais anticorpos seleccionados entre os anti-CD25, anti-CD19, anti-CD21, anti- 54 CD22, anti-CD37, anti-CD38, anti-IL6R, anti-IL8, anti-IL15, anti-ILl5R, anti-CD4, anti-CDlla (e.g., efalizumab), anticorpos anti integrina alfa-4/beta-l (VLA4) (e.g., natalizumab) e CTLA4-Ig.

[0167] Numa modalidade em particular, a administração dos anticorpos monoclonais humanos é feita em combinação com um anticorpo anti-CD25, para o tratamento do penfigóide bolhoso em, por exemplo, doentes portadores da doença do enxerto contra hospedeiro.

[0168] Noutra modalidade em particular, os anticorpos monoclonais humanos são administrados em combinação com um ou mais anticorpos seleccionados entre os anticorpos anti-CD19, anti-CD21, anti-CD22, anti-CD37 e anti-CD38, para o tratamento de doenças malignas.

[0169] Ainda noutra modalidade em particular, os anticorpos são administrados em combinação com um ou mais anticorpos, seleccionados entre os anti-IL6R, anti-IL8, anti-IL15, anti-IL15R, anti-CD4, anti-CDlla (por exemplo, o efalizumab), anti-integrina alfa-4/beta-l (VLA4) (por exemplo, natalizumab) e CTLA4-Ig, para o tratamento de doenças inflamatórias.

[0170] Ainda noutra modalidade, os anticorpos humanos podem ser administrados em combinação com um anticorpo anti-C3b(i), de modo a reforçar a activação do complemento.

[0171] Como aqui empregue, o termo "veiculo farmacologicamente aceitável" inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardadores da absorção ou similares fisiologicamente compatíveis. 0 veículo deve, preferencialmente, ser adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentérica, espinal ou epidérmica (por exemplo, por injecção ou infusão).

Dependendo da via de administração, o composto activo, ou seja, anticorpo, molécula bi e multi-específica, pode ser revestido com um material que o proteja da acção de ácidos e outras condições naturais que o possam inactivar.

[0172] Um "sal farmacologicamente aceitável" refere-se a um sal que retém a actividade biológica desejada do composto precursor e não causa quaisquer efeitos toxicológicos indesejáveis (ver, e.g., Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sei. 66:1-19) . Os exemplos de tais sais incluem os sais de adição ácida e básica. Os sais de adição ácida incluem aqueles que derivam de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como o clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, hidrobrómico, iodídrico, fosfórico e similares, assim como de ácidos orgânicos não tóxicos como os mono e dicarboxílicos 55 alifáticos, fenil-alcanóicos substituídos, hidróxi-alcanóicos, aromáticos, sulfónicos alifáticos e aromáticos. Os sais de adição básica incluem aqueles que derivam de metais alcalino-terrosos como o sódio, potássio, magnésio, cálcio e similares, assim como de aminas orgânicas não tóxicas como a N,N'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e similares.

[0173] Uma composição da presente invenção pode ser administrada por uma variedade de métodos conhecidos na área. Como será compreendido pelo especialista, a via e/ou modo de administração irá variar em função dos resultados pretendidos. Os compostos activos podem ser preparados com veículos que os protejam contra a libertação rápida, como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de administração microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, tais como etileno-vinil acetato, polianidrido, ácido poliglicólico, colagénio, poli(orto ésteres) e ácido polilático. Os métodos para a preparação de tais formulações são, geralmente, conhecidos pelos especialistas na área. Ver e.g., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, 1978.

[0174] Para administrar um composto da invenção por certas vias, pode ser necessário revesti-lo ou co-administrá-lo com um material que impeça a sua inactivação. 0 composto pode, por exemplo, ser administrado a um sujeito através de um veículo apropriado como, por exemplo, lipossomas ou diluentes. Os diluentes farmacologicamente aceitáveis incluem as soluções tampão salinas e aquosas. Os lipossomas incluem, para além dos convencionais, emulsões CGF água em óleo (w/o) e óleo em água (o/w) (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).

[0175] Os veículos farmacologicamente aceitáveis incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões e pós estéreis, para a preparação extemporânea de soluções estéreis injectáveis ou dispersão. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmacologicamente activas é bem conhecida na área. Excepto quando algum meio ou agente convencional é incompatível com o composto activo, é contemplada a sua utilização nas composições farmacêuticas da invenção. Podem também ser incorporados nas composições compostos activos suplementares.

[0176] As composições terapêuticas devem normalmente ser estéreis e estáveis sob as condições de fabrico e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, micro-emulsão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada a concentrações elevadas do fármaco. 0 veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão que contenha, por 56 exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, propilenoglicol líquido e similares) e misturas convenientes dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento como a lecitina, pela manutenção da dimensão necessária das partículas, no caso da dispersão, e pelo uso de surfactantes. Será preferível, em muitos casos, incluir agentes isotónicos na composição como, por exemplo, açúcares, poliálcoois como o manitol e o sorbitol, ou cloreto de sódio. A absorção prolongada de composições injectáveis pode ser provocada pela inclusão de um agente que retarda a absorção na composição como, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

[0177] As soluções estéreis injectáveis podem ser preparadas através da incorporação do composto activo, na quantidade necessária, num solvente adequado com um ou mais ingredientes dos acima mencionados, conforme necessário, seguida esterilização, por microfiltração. Geralmente, as dispersões são preparadas através da incorporação do componente activo num veiculo estéril que contém um meio de dispersão básico e outros ingredientes necessários, de entre os acima mencionados. No caso dos pós estéreis utilizados para o fabrico de soluções estéreis injectáveis, os métodos de preparação preferidos incluem as técnicas de secagem por vácuo e congelação (liofilização), que produzem um pó de ingrediente activo e qualquer ingrediente adicional pretendido, a partir de uma solução previamente esterilizada por filtração.

[0178] As posologias são ajustadas de modo a garantir a resposta ideal pretendida (ou seja, uma resposta terapêutica). Por exemplo, pode ser administrado um bólus único, podem ser administradas várias doses ao longo do tempo ou ser aumentada ou reduzida a dose, em proporção, conforme as exigências da situação terapêutica. A formulação de composições parentéricas em forma farmacêutica unitária é especialmente vantajosa para facilitar a administração e uniformidade da dosagem. A forma farmacêutica unitária, como aqui empregue, refere-se a uma unidade fisicamente discreta, em forma de dose unitária, apropriada aos sujeitos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade pré-determinada de composto activo, calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, associada ao veículo farmacêutico necessário. A especificação para as formas farmacêuticas unitárias da invenção é ditada ou directamente dependente (a) das características únicas do composto activo e o efeito terapêutico particular a ser conseguido e (b) das limitações inerentes à área de composição destes compostos activos para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.

[0179] Os exemplos de antioxidantes farmacologicamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes hidrossolúveis como o 57 ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e similares; (2) antioxidantes solúveis em óleo como o palmitato de ascorbil, hidroxianisolo butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propil gaiato, alfa-tocoferol e similares; e (3) agentes quelantes de metal como o ácido cítrico, ácido etlilenodiaminotetracético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e similares.

[0180] Para as composiçoes terapêuticas, as formulações da presente invenção incluem aquelas adequadas para administração oral, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), rectal, vaginal e/ou parentérica. As formulações farmacêuticas podem ser convenientemente apresentadas em forma farmacêutica unitária e preparadas por qualquer método conhecido na área farmacêutica. A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinada com um veículo, para produzir uma forma farmacêutica individual, irá variar de acordo com o sujeito a ser tratado e o modo de administração. A quantidade de ingrediente activo que pode ser combinada com um veículo para produzir uma forma farmacêutica individual será, geralmente, a quantidade de composição terapeuticamente eficaz. Geralmente, em cem por cento, esta quantidade de componente activo irá variar entre cerca de 0,01 a cerca de noventa e nove por cento, de preferência entre cerca de 0,1 e cerca de 70 por cento e, com maior preferência, entre cerca de 1 a cerca de 30 por cento.

[0181] As formulações da presente invenção que sao adequadas para administração vaginal incluem pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou spray, contendo os veículos reconhecidos na área como apropriados. As formas farmacêuticas para a administração tópica ou transdérmica das composições desta invenção incluem pós, sprays, pomadas, cremes, loções, géis, soluções, adesivos e inaladores. O composto activo pode ser misturado em condições estéreis com um veículo farmacologicamente aceitável e quaisquer conservantes, tampões ou propulsores que possam ser necessários.

[0125] As frases "administraçao parentérica" e "administrado por via parentérica", como aqui empregues, significam outros meios de administração, usualmente injectáveis, que não entéricos ou tópicos e incluem, sem limitação, a injecção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intra-espinal, epidural e intra-esternal.

[0183] Os exemplos de veículos aquosos e nao aquosos apropriados que podem ser usados nas composições farmacêuticas da invenção incluem a água, o etanol, os polióis (como o 58 glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol e similares) e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais como o azeite, e ésteres orgânicos injectáveis como o oleato de etilo. A fluidez apropriada pode, por exemplo, ser mantida pela aplicação de materiais de revestimento como a lecitina, pela manutenção da dimensão adequada das partículas, no caso das dispersões, e pela utilização de surfactantes.

[0184] Estas composiçoes podem também conter adjuvantes como conservantes e agentes humidificadores, emulsificantes e dispersores. A prevenção da presença de microorganismos pode ser assegurada quer através de procedimentos de esterilização, supra, quer pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e similares. Pode também ser desejável incluir nas composições agentes isotónicos tais como açúcares, cloreto de sódio e similares. Adicionalmente, a absorção prolongada da forma farmacêutica injectável pode ser provocada pela inclusão de agentes que retardam a absorção, como o monoestearato de alumínio e a gelatina.

[0185] Numa modalidade, os anticorpos monoclonais humanos da invenção são administrados na sua forma cristalina por injecção subcutânea, cf. Yang et ai. (2003) PNAS, 100 (12) :6934-6939.

[0186] Quando os compostos da presente invenção são administrados como fármacos a humanos e animais, podem ser aplicados isoladamente ou como uma composição terapêutica que contém, por exemplo, entre 0,01 e 99,5% (mais preferivelmente, entre 0,1 e 90%) de ingrediente activo combinado com um veículo farmacologicamente aceitável.

[0187] Independentemente da via de administração seleccionada, os compostos, que podem ser usados sob a forma hidratada adequada e/ou as composições farmacêuticas da presente invenção são formulados em formas farmacêuticas farmacologicamente aceitáveis, através de meios convencionais bem conhecidos dos especialistas na área.

[0188] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes activos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a atingir uma quantidade de ingrediente activo eficaz para alcançar a resposta terapêutica pretendida para um paciente, composição ou via de administração particular, sem ser tóxica para o paciente. A dosagem seleccionada irá depender de uma variedade de factores farmacocinéticos, incluindo a actividade das composições particulares da presente invenção utilizadas ou o éster, sal ou amida das mesmas, da via e tempo de administração, da taxa de excreção do composto particular em utilização, da duração 59 do tratamento, da interacção com outros fármacos, compostos e/ou materiais usados nas composições particulares em utilização, da idade, sexo, peso, condição, estado de saúde geral e antecedentes médicos do paciente a ser tratado, assim como por outros factores bem conhecidos na área.

[0189] Um médico ou veterinário com competências regulares pode, prontamente, determinar e prescrever a quantidade terapêutica da composição farmacêutica. Por exemplo, 0 médico ou veterinário poderá prescrever doses iniciais dos compostos da invenção empregues na composição farmacêutica em níveis inferiores aos necessários para atingir o efeito terapêutico desejado e, gradualmente, aumentar a dose até atingir o efeito pretendido. Em geral, uma dose diária adequada de uma composição da invenção corresponde à menor dose de composto que é eficaz na produção do efeito terapêutico. Tal dose eficaz irá, geralmente, depender dos factores acima descritos. É preferível que a administração seja intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea e que seja aplicada numa área próxima do alvo. Se desejado, a dose diária de uma composição terapêutica pode ser administrada separadamente, em duas, três, quatro, cinco, seis ou mais sub-doses em intervalos adequados ao longo do dia e, opcionalmente, em doses unitárias. Embora seja possível que um composto da presente invenção seja administrado isoladamente, é preferível que este seja administrado como uma formulação farmacêutica (composição).

[0190] Numa modalidade, os anticorpos monoclonais humanos de acordo com a invenção podem ser administrados por infusão, numa dose semanal de 10 a 500 mg/m2, como por exemplo de 200 a 400 mg/m2. Tal administração pode ser repetida, e.g. de 1 a 8 vezes, por exemplo, 3 a 5 vezes. A administração pode ser realizada por infusão contínua ao longo de um período de 2 a 24 horas, por exemplo de 2 a 12 horas.

[0191] Noutra modalidade, os anticorpos monoclonais humanos são administrados lentamente por infusão contínua, durante um longo período, por exemplo superior a 24 horas, de forma a reduzir os efeitos secundários tóxicos.

[0192] Ainda noutra modalidade, a administração dos anticorpos monoclonais humanos é realizada numa dose semanal de 250 mg a 2000 mg, por exemplo, 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg ou 2000 mg, até um máximo de 8 vezes, tal como de 4 a 6 vezes. A administração pode ser realizada por infusão contínua ao longo de um período de 2 a 24 horas, por exemplo de 2 a 12 horas. Este regime pode ser repetido uma ou mais vezes, conforme necessário, por exemplo, após 6 ou 12 meses. A dosagem administrada pode ser determinada ou ajustada a partir medição da quantidade de anticorpos monoclonais anti-CD20 em 60 circulação numa amostra biológica no momento de administração, através da utilização de anticorpos anti-idiotipicos, que têm os anticorpos anti-CD20 como alvo.

[0193] Ainda noutra modalidade, os anticorpos monoclonais humanos são administrados como uma terapia de manutenção, por exemplo, uma vez por semana ao longo de um período de 6 meses ou mais.

[0194] Ainda noutra modalidade, os anticorpos monoclonais humanos de acordo com a invenção podem ser administrados através de um regime que engloba uma infusão do anticorpo monoclonal humano contra o CD20, seguida de uma infusão de um anticorpo monoclonal humano contra o CD20 conjugado com um radioisótopo. O regime pode ser repetido, por exemplo, após um período de 7 a 9 dias.

[0195] As composições terapêuticas podem ser administradas através de dispositivos médicos conhecidos na área. Por exemplo, numa modalidade preferida, uma composição terapêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivo de injecção hipodérmica sem agulha, semelhante aos divulgados pelas Patentes U.S. N.° 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824 ou 4.596.556. Os exemplos de implantes e módulos bem conhecidos, com utilidade para a presente invenção incluem: a Patente U.S. N.° 4.487.603, que divulga uma micro bomba de infusão implantável que dispensa medicação a um ritmo controlado; a Patente U.S. N.° 4.486.194, que divulga um dispositivo terapêutico que administra medicação através da pele; a Patente U.S. N.° 4.447.233, que divulga uma bomba de infusão de medicamentos que administra medicação a um ritmo preciso; a Patente U.S. N.° 4.447.224, que divulga um aparelho de infusão implantável de fluxo variável que administra medicação a um ritmo contínuo; a Patente U.S. N.° 4.439.196, que divulga um sistema osmótico compartimentado de administração de medicação com múltiplas câmaras e a Patente U.S. N.° 4.475.196, que divulga um sistema osmótico de administração medicação. Muitos outros implantes, sistemas de entrega e módulos são conhecidos dos especialistas na área.

[0196] Em certas modalidades, os anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser formulados para assegurar uma distribuição adequada in vivo. Por exemplo, a barreira hemato-encefálica (BHE) exclui muitos compostos altamente hidrofóbicos. Para garantir que os compostos terapêuticos da invenção atravessam a BHE (se pretendido) estes podem, por exemplo, ser formulados em lipossomas. Para mais informações sobre os métodos de produção de lipossomas, ver, por exemplo, as Patentes U.S. N.° 4.522.811; 5.374.548 e 5.399.331. Os lipossomas podem incluir uma ou mais fracções que são selectivamente transportadas para células específicas ou 61 órgãos e, dessa forma, potenciam a entrega direccionada de medicação (ver, por exemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). As fracções direccionadas exemplares incluem o folato ou a biotina (ver, por exemplo, a patente U.S. 5.416.016 para Low et al.); manosideos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticorpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBSLett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de proteína A do surfactante (Briscoe et al. (1995) Am. J.

Physiol. 1233:134), diferentes espécies das quais se podem compreender as formulações das invenções, assim como componentes das moléculas inventadas; pl20 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); ver também K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273. Numa modalidade da invenção, os compostos terapêuticos são formulados em lipossomas; numa modalidade preferida, os lipossomas incluem uma fracção direccionada. Numa modalidade preferida, os compostos terapêuticos contidos nos lipossomas são injectados em bólus num local próximo da área desejada, por exemplo, o local de inflamação ou infecção ou de um tumor. A composição deve ser fluida, de modo a permitir uma fácil utilização em seringa. Deve ser estável sob as condições de fabrico e armazenamento e ser preservada da acção contaminante de microorganismos como bactérias e fungos.

[0197] Numa modalidade adicional, os anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser formulados para evitar ou reduzir o seu transporte através da placenta. Tal pode ser conseguido a partir de métodos conhecidos na área, por exemplo, pela PEGilação dos anticorpos ou utilização de fragmentos F(ab)2'. Podem fazer-se referências adicionais a "Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation. J Immunol Methods. 152:177-190; e a "Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann Allergy Asthma Immunol 74:279-283. Tal é particularmente relevante quando os anticorpos são utilizados no tratamento ou prevenção do aborto espontâneo recorrente.

[0198] Uma "dosagem terapêutica eficaz" para a terapia tumoral pode ser medida através das respostas tumorais objectivas, que podem ser completas ou parciais. Uma resposta completa (RC) é definida pela ausência de indícios clínicos, radiológicos ou de outras evidências da doença. Uma resposta parcial (RP) resulta de uma redução superior a 50% da dimensão dos agregados tumorais. O tempo médio de progressão é uma medida que caracteriza a durabilidade da resposta tumoral objectiva. 62 [0199] Uma "dosagem terapêutica eficaz" para a terapia tumoral pode também ser medida através da sua capacidade de estabilização da progressão da doença. A capacidade de um composto para inibir o cancro pode ser avaliada através de um sistema de modelo animal, preditivo da eficácia em tumores humanos. Em alternativa, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada pela análise da capacidade do composto de inibir o crescimento celular ou apoptose, através de ensaios in vitro conhecidos do especialista. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto pode diminuir a dimensão do tumor ou, de outro modo, aliviar os sintomas num sujeito. Um especialista de habilidade comum na área seria capaz de determinar tais quantidades com base em factores como o tamanho do sujeito, a gravidade dos seus sintomas e a composição ou via de administração seleccionadas.

[0200] Uma "dosagem terapêutica eficaz" para a artrite reumatóide irá, preferencialmente, resultar numa Definição Preliminar de Melhoria ACR20 nos pacientes, mais preferencialmente numa Definição Preliminar de Melhoria ACR50 e, ainda mais preferencialmente numa Definição Preliminar de Melhoria ARC70.

[0201] A Definição Preliminar de Melhoria ACR20 é definida como:

Uma melhoria á20% a nivel da contagem de articulações dolorosas (TCJ) e de articulações inchadas (SWJ) e uma melhoria ^ 20% em 3 das seguintes 5 avaliações: Avaliação da dor do paciente (VAS), Avaliação global do paciente (VAS), Avaliação global do médico (VAS), Auto-avaliação de incapacidade patente (HAQ), Reagente de fase aguda (CRP ou ESR) .

[0202] Os critérios de avaliação ACR50 e ACR70 são definidos da mesma forma, com melhorias á 50% e ^ 70%, respectivamente. Para mais detalhes, ver Felson et al. em American College of Rheumatology Preliminary Definition of Improvement in Rheumatoid Arthritis; Arthritis Rheumatism (1995) 38: 727-735.

[0203] A composição deve ser estéril e fluida de modo a permitir a administração por seringa. Para além de água, o veiculo pode ser uma solução isotónica salina tamponada, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, propilenoglicol liquido e similares), e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento de lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de uma dispersão e pela utilização de surfactantes. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotónicos na composição como, 63 por exemplo, açúcares, poliálcoois, como o manitol ou sorbitol, e cloreto de sódio. A absorção a longo prazo das composições injectáveis pode ser provocada pela inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina.

[0204] Quando o componente activo é devidamente protegido, como descrito acima, o composto pode ser administrado oralmente com, por exemplo, um diluente inerte ou um veículo assimilável ou comestível. VI. Utilizações e métodos da invenção [0205] Os anticorpos humanos (incluindo imunoconjugados, moléculas bi/multi-específicas, composições e outros derivados aqui descritos) da presente invenção têm numerosas utilizações, in vitro e in vivo, de diagnóstico e terapêuticas que envolvem o diagnóstico e tratamento de distúrbios em que estão envolvidas células que expressam CD20. Por exemplo, os anticorpos podem ser administrados, por exemplo, in vitro ou ex vivo a células em cultura ou, por exemplo, in vivo a sujeitos humanos para tratar, prevenir e diagnosticar uma variedade de distúrbios. Como aqui empregue, o termo "sujeito" destina-se a incluir animais humanos e não-humanos que respondem aos anticorpos humanos contra o CD20. Os sujeitos preferidos incluem pacientes humanos portadores de distúrbios, que podem ser corrigidos ou minorados através da inibição ou controlo de células B (normais ou malignas).

[0206] Por exemplo, numa modalidade os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados no tratamento de um sujeito com uma perturbação cancerígena como, por exemplo, uma perturbação caracterizada pela presença de células tumorais que expressam CD20 incluindo, por exemplo, o linfoma de células B, e.g., NHL. Os exemplos de doenças cancerígenas que podem ser tratadas e/ou prevenidas englobam o linfoma de células B, por exemplo, NHL, incluindo leucemia/linforna linfoblástico de percursores de célula B e neoplasias de células B, tais como leucemia linfática crónica de células B /CLL)/linfoma de linfócitos pequenos(SLL), leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmocítico, linfoma de células do manto (MCL), linfoma folicular (FL), incluindo os FL de grau baixo, moderado e elevado, linfoma do centro folicular, linfoma de células B da zona marginal (tipo MALT, nodular e esplénico), tricoleucemia, linfoma difuso de grandes células B, linfoma de Burkitt, plasmocitoma, mieloma de células plasmáticas, distúrbio linfoproliferativo pós-transplante, macroglobulinémia de Waldenstrom e linfoma anaplástico de grandes células (ALCL).

[0207] Os exemplos adicionais de linfomas de células B nao- 64

Hodgkin são a granulomatose linfomatóide, linfoma de efusão primária, linfoma intravascular de grandes células B, linfoma mediastinal de grandes células B, doenças da cadeia pesada (incluindo as doenças γ, μ e α) , linfomas induzidos pela terapia com agentes imunossupressores, como os linfomas induzidos pela ciclosporina e pelo metotrexato.

[0208] Numa modalidade adicional, os anticorpos humanos da presente invenção podem ser utilizados no tratamento do linfoma de Hodgkin.

[0209] Os exemplos de distúrbios imunológicos em que estão envolvidas células B que expressam CD20 que podem ser tratados e/ou prevenidos incluem perturbações auto-imunes, psoriase, artrite psoriática, dermatite, esclerodermia ou esclerose sistémica, doença inflamatória intestinal (DII), doença de Crohn, colite ulcerosa, sindrome de dificuldade respiratória, meningite, encefalite, uveite, glomerulonefrite, eczema, asma, aterosclerose, deficiência da adesão leucocitária, esclerose múltipla, sindrome de Raynaud, sindrome de Sjõgren, diabetes juvenil, doença de Reiter, doença de Behçet, nefrite mediada por complexos imunes, nefropatia por IgA, polineuropatias IgM, trombocitopenia imunomediada, tal como púrpura trombocitopénica idiopática aguda e púrpura trombocitopénica idiopática crónica, anemia hemofílica, miastenia grave, nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistémico, artrite reumatóide (RA), dermatite atópica, pênfigo, doença de Graves, tiroidite de Hashimoto, granulomatose de Wegener, sindrome de Omenn, insuficiência renal crónica, mononucleose infecciosa aguda, HIV e doenças associadas ao vírus da Herpes. Exemplos adicionais são a sindrome de dificuldade respiratória aguda grave e a coriorretinite. Para além destes, outras doenças e distúrbios incluem os causados ou mediados pela infecção de células B por vírus, tais como o Epstein-Barr (EBV).

[0210] Exemplos adicionais de perturbações inflamatórias, imunológicas e/ou auto-imunes em que se destacam os autoanticorpos e/ou a actividade excessiva de linfócitos B e podem ser tratadas ou prevenidas, incluem as seguintes: vasculites e outras perturbações vasculares, como a poliangeíte microscópica, sindrome de Churg-Strauss ou outras vasculites associadas ao ANCA (anticorpo anti-citoplasma de neutrófilos) , poliarterite nodosa, vasculite crioglobulinémica essencial, angeíte cutânea leucocitoclástica, doença de Kawasaki, arterite de Takayasu, arterite de células gigantes, púrpura de Henoch-Schõnlein, angeíte primária ou isolada do SNC, eritema nodoso, tromboangeíte obliterante, púrpura trombocitopénica trombótica (incluindo o sindrome hemolítico urémico) e vasculites secundárias; incluindo a vasculite cutânea 65 leucocitoclástica (por exemplo, secundária à hepatite B e C, macroglobulinemia de Waldenstrõm, neoplasias de células B, artrite reumatóide, síndrome de Sjõgren ou ao lúpus eritematoso sistémico); os exemplos adicionais são o eritema nodoso, vasculite alérgica, paniculite, doença de Weber-Christian, púrpura hiperglobulinémica e a doença de Buerger; distúrbios cutâneos, como a dermatite de contacto, dermatose linear por IgA, vitiligo, pioderma gangrenoso, epidermólise bolhosa adquirida, pênfigo vulgar (incluindo o penfigóide cicatricial e bolhoso), alopécia areata (incluindo a alopécia universal e total), dermatite herpetiforme, eritema multiforme e a urticária auto-imune crónica (incluindo o edema angioneurótico e a vasculite urticariforme). citopenias imunomediadas, como a neutropenia auto-imune e a aplasia eritróide pura; perturbações do tecido conjuntivo, como o lúpus do SNC e eritematoso discóide, síndrome de CREST, doença mista do tecido conjuntivo, polimiosite/dermatomiosite, miosite de corpos de inclusão, amiloidose secundária, crioglobulinemia de tipo I e II, fibromialgia, síndrome do anticorpo-fosfolípide, hemofilia secundária, policondrite recidivante, sarcoidose, síndrome da pessoa rígida e febre reumática; um exemplo adicional é a fasciite eosinofílica. artrites, como a espondilite anquilosante, artrite juvenil crónica, doença de Still do adulto, síndrome de SAPHO; exemplos adicionais são a sacroileíte, artrite reactiva, doença de Still e a gota; perturbações hematológicas, como a anemia aplástica, anemia hemolítica primária (incluindo o síndrome por aglutininas a frio), anemia hemolítica secundária à leucemia linfocítica crónica (LLC) ou ao lúpus eritematoso sistémico; síndrome de POEMS, anemia perniciosa, púrpura hiperglobulinémica de Waldemstrõm; os exemplos adicionais são a agranulocitose, neutropenia auto-imune, doença de Franklin, doença de Seligmann, doença da cadeia μ, síndrome paraneoplásico secundário ao timoma e linfomas e a formação de inibidores do factor VIII. endocrinopatias, como a poliendocrinopatia e a doença de Addison; exemplos adicionais são a hipoglicémia, hipotiroidismo e o síndrome de resistência à insulina auto-imune, a tiroidite de Quervain e a resistência do receptor à insulina mediada por anticorpos. distúrbios hepato-gastrointestinais, como a doença celíaca, doença de Whipple, cirrose biliar primária e a colangite esclerosante primária; um exemplo adicional é a gastrite auto-imune. nefropatias, como a glomerulonefrite rapidamente progressiva, nefrite pós-estreptocócica, síndrome de

Goodpasture, glomerulonefrite membranosa e a nefrite 66 crioglobulinémica; um exemplo adicional é a doença de mudança minima; distúrbios neurológicos, como as neuropatias auto-imunes, mononeurite múltipla (multiplex), sindrome miasténico de Lambert-Eaton, coréia de Sydenham, tabes dorsalis e o sindrome de Guillain-Barré; exemplos adicionais são a paraparésia espástica mielopática/tropical, a miastenia grave e a polineuropatia desmielinizante inflamatória aguda e crónica. distúrbios cardíacos e pulmonares, como a alveolite fibrosante, bronquiolite obliterante, aspergilose alérgica, fibrose cística, sindrome de Lõffler, miocardite e a pericardite; exemplos adicionais são a pneumonia por hipersensibilidade e o sindrome paraneoplásicos secundário ao cancro do pulmão. perturbações alérgicas, como a asma brônquica e o sindrome Hiper IgE; um exemplo adicional é a amaurose fugaz; distúrbios oftálmicos, como a coriorretinite idiopática; doenças infecciosas, como a infecção por parvovírus B (incluindo o sindrome purpúrico-papular em "luvas e meias"); e distúrbios ginecológicos e obstétricos, como o aborto e a perda fetal recorrentes e o atraso do crescimento intra-uterino; um exemplo adicional é o sindrome paraneoplásico secundário às neoplasias ginecológicas. distúrbios reprodutivos do sexo masculino, como o sindrome paraneoplásico secundário a neoplasias testiculares; e perturbações decorrentes de transplantes, como a rejeição do aloenxerto e do xenoenxerto e a doença do enxerto contra hospedeiro.

[0211] Numa modalidade, a doença é uma perturbação inflamatória, imunológica e/ou auto-imune seleccionada entre a colite ulcerosa, doença de Crohn, diabetes juvenil, esclerose múltipla, trombocitopenias imunomediadas como a púrpura trombocitopénica idiopática aguda e púrpura trombocitopénica idiopática crónica, anemia hemolítica (incluindo a anemia hemolítica auto-imune), miastenia grave, esclerose sistémica e o pênfigo vulgar.

[0212] Noutra modalidade, os anticorpos humanos da invenção podem ser utilizados na detecção dos níveis de CD20 em células que contêm CD20 na sua superfície membranar, podendo então estes níveis ser associados a sintomas de determinadas doenças. Em alternativa, os anticorpos podem ser utilizados para esgotar ou interagir com a função de células que expressam CD20 implicando-as, dessa forma, como importantes mediadoras da doença. Tal pode ser conseguido através do contacto de uma amostra e de uma amostra de controlo com o anticorpo anti-CD20, em condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo e o CD20. Quaisquer complexos 67 formados entre o anticorpo e o CD20 são detectados e comparados, na amostra e no controlo.

[0213] Os anticorpos humanos da invenção podem ser inicialmente testados para a actividade de ligação associada à sua utilização terapêutica ou de diagnóstico in vitro. Por exemplo, os anticorpos podem ser testados através dos ensaios citométricos de fluxo abaixo descritos, nos Exemplos. Para além disso, pode ser avaliada a actividade dos anticorpos no accionamento de pelo menos uma actividade das células efectoras mediada por efectores, incluindo a inibição do crescimento e/ou a eliminação de células que expressam CD20. Por exemplo, pode ser testada a capacidade dos anticorpos para accionar a CDC e/ou a apoptose. Os protocolos para a análise da CDC, adesão homotípica, aglomeração molecular ou da apoptose são abaixo descritos, nos Exemplos.

[0214] Os anticorpos humanos da invenção têm também utilidade na terapêutica e diagnóstico de várias doenças associadas ao CD20. Por exemplo, os anticorpos podem ser utilizados para a promoção in vivo ou in vitro de uma ou mais das seguintes actividades biológicas: inibição do crescimento e/ou diferenciação de uma célula que expressa CD20; mediação da fagocitose ou da ADCC de uma célula que expressa CD20 na presença de células efectoras humanas; mediação da CDC de uma célula que expressa CD20 na presença de um complemento; mediação da apoptose de uma célula que expressa CD20; indução da adesão homotípica e/ou indução da translocação para rafts lipídicos, aquando da ligação ao CD20.

[0215] Numa modalidade em particular, os anticorpos humanos são utilizados para o tratamento, prevenção ou diagnóstico in vivo de uma variedade de doenças associadas ao CD20. Exemplos de doenças associadas ao CD20 incluem, entre outras, o linfoma de células B, e.g., NHL, e doenças imunológicas, e.g., doenças auto-imunes, tais como as acima indicadas.

[0216] Numa modalidade em particular, os anticorpos da invenção são utilizados para o tratamento ou prevenção do NHL, uma vez que estes esgotam as células tumorais que contêm CD20.

[0217] 0 linfoma não-Hodgkin é um tipo de linfoma de células B. Os linf ornas, por exemplo, de células B, são um grupo de doenças cancerígenas relacionadas que surgem quando um linfócito (célula sanguínea) se torna maligno. A função normal dos linfócitos é a defesa do corpo contra invasores: germes, vírus, fungos e até do cancro. Existem muitos subtipos e estádios de maturação de linfócitos e, como tal, muitos tipos de linfomas. Tal como as células normais, os linfócitos malignos podem mover-se para várias partes do corpo. As células do linfoma formam, tipicamente, tumores no sistema 68 linfático: medula óssea, nódulos linfáticos, baço e sangue. Estas células podem, contudo, migrar para outros órgãos. Certos tipos de linfoma terão tendência para crescer em locais onde reside a versão normal da célula. Por exemplo, é comum que o desenvolvimento de tumores foliculares NHL ocorra nos nódulos linfáticos.

[0218] 0 CD20 é normalmente expresso em níveis elevados em células B neoplásicas (ou seja, tumorogénicas) associadas ao NHL. Assim, os anticorpos de ligação ao CD20 da invenção podem ser utilizados para a depleção das células tumorais portadoras do CD20 que conduzem ao desenvolvimento do NHL e, desse modo, na prevenção ou tratamento desta doença.

[0219] Os anticorpos humanos (por exemplo, anticorpos monoclonais humanos, moléculas bi e multi-específicas) da presente invenção podem também ser utilizados no bloqueio ou prevenção de outros efeitos do CD20. Por exemplo, sabe-se que o CD20 é expresso em linfócitos B e que está envolvido na proliferação e/ou diferenciação destas células. Uma vez que os linfócitos B funcionam como imunomoduladores, o CD20 é um importante alvo para a terapia mediada por anticorpos no seu direccionamento a estes linfócitos, para, por exemplo, inactivar ou eliminar os linfócitos B envolvidos em perturbações auto-imunes. Tais perturbações auto-imunes incluem, por exemplo, as acima indicadas.

[0220] As vias de administração in vivo e in vitro adequadas às composições de anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais humanos, moléculas biespecificas e multi-especificas e imunoconjugados) da invenção são bem conhecidas na área e podem ser seleccionadas pelos seus especialistas. A administração de anticorpos da invenção pode, por exemplo, ser realizada por injecção (e.g., intravenosa ou subcutânea). As dosagens adequadas das moléculas utilizadas irão depender da idade e peso do sujeito e da concentração e/ou formulação da composição de anticorpos. Para além disso, a carga tumoral pode ser determinada e utilizada para calcular as dosagens adequadas.

[0221] Tal como anteriormente descrito, os anticorpos anti-CD20 da invenção podem ser co-administrados com um ou mais agentes terapêuticos como, por exemplo, um agente citotóxico, radiotóxico ou imunossupressor. 0 anticorpo pode ser ligado ao agente (como um imunocomplexo) ou ser administrado em separado, relativamente ao agente. No último caso (administração separada), o anticorpo pode ser administrado antes, depois ou em simultâneo como o agente ou co-administrado com outras terapias conhecidas, e.g., uma terapia anticancerosa como, por exemplo, a radiação. Tais agentes terapêuticos incluem, entre outros, agentes antineoplásicos 69 como doxorrubicina, cisplatina, bleomicina, carmustina, clorambucil e ciclofosfamida. A co-administração dos anticorpos humanos anti-CD20 da presente invenção com agentes quimioterápicos fornece dois agentes anticancerosos, que actuam através de diferentes mecanismos e produzem um efeito citotóxico para as células tumorais humanas. Tal co-administração pode solucionar as questões associadas ao desenvolvimento da resistência a fármacos ou a uma alteração na antigenicidade das células tumorais, que as tornaria não reactivas relativamente ao anticorpo.

[0222] As células efectoras direccionadas, por exemplo, células efectoras ligadas a composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas biespecíficas e multi-específicas) da invenção, podem também ser utilizadas como agentes terapêuticos. As células efectoras para o direccionamento podem ser leucócitos humanos, tais como macrófagos, neutrófilos ou monócitos. Outras células incluem eosinófilos, linfócitos NK (Natural Killer) ou outras células que contêm receptores IgG ou IgA. Se desejado, as células efectoras podem ser obtidas a partir do sujeito a ser tratado. A administração de células efectoras direccionadas pode ser realizada sob a forma de uma suspensão de células, numa solução fisiologicamente aceitável. O número de células administradas pode encontrar-se na ordem de 108 a 109, mas irá variar de acordo com o objectivo terapêutico. Em geral, a quantidade será suficiente para obter a localização na célula alvo, por exemplo, uma célula tumoral que expressa CD20 e para a execução da eliminação das células, por exemplo, através de fagocitose. As vias de administração podem também variar.

[0223] A terapia com células efectoras direccionadas pode ser realizada em conjunto com outras técnicas de remoção de células alvo. Por exemplo, a terapia antitumoral que aplica as composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas bi e multi-especificas) da invenção e/ou células efectoras munidas destas composições pode ser conjugada com quimioterapia. Além disso, a imunoterapia de combinação pode ser utilizada para direccionar duas populações efectoras citotóxicas à rejeição de células tumorais. Por exemplo, os anticorpos anti-CD20 ligados ao anti-Fc-YRI ou anti-CD3 podem ser conjugados com agentes de ligação específicos para os receptores IgG ou IgA.

[0224] As moléculas biespecíficas e multi-específicas da invenção podem também ser utilizadas na modulação dos níveis de FcyR ou FcoíR em células efectoras, por exemplo através da captação e eliminação de receptores na superfície celular. Podem também ser utilizadas para este efeito misturas de receptores anti-Fc.

[0225] As composições (e.g., anticorpos humanos, moléculas 70 biespecíficas e multi-específicas e imunoconjugados) da invenção que contenham locais de ligação ao complemento, tais como porções de IgGl, 2, 3 ou M que se ligam ao complemento, podem também ser utilizadas na presença do mesmo. Numa modalidade, o tratamento ex vivo de uma população de células composta por células alvo com um agente de ligação da invenção e por células efectoras apropriadas pode ser suplementado pela adição de complemento ou de soro com complemento. A fagocitose de células alvo revestidas por um agente de ligação da invenção pode ser aperfeiçoada através da ligação de proteínas do complemento. Noutra modalidade, a lise de células revestidas pelas composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas bi e multi-específicas) da invenção pode ser concretizada pelo complemento. Ainda noutra modalidade, as composições da presente invenção não activam o complemento.

[0226] As composições (e.g., anticorpos humanos, moléculas bi e multi-específicas e imunoconjugados) da invenção podem também ser administradas em conjunto com o complemento. Assim, no âmbito da invenção estão incluídas composições que contêm anticorpos humanos, moléculas bi e multi-específicas e soro ou complemento. Estas composições são vantajosas na medida em que o complemento se encontra muito próximo dos anticorpos humanos, moléculas bi ou multi-específicas. Em alternativa, os anticorpos humanos, moléculas bi ou multi-específicas da invenção e o complemento ou soro podem ser administrados em separado. A ligação de composições da presente invenção a células alvo causa a translocação do complexo antigénio-anticorpo CD20 para rafts lipídicos da membrana celular. Esta translocação cria uma elevada densidade de complexos antigénio-anticorpo que pode eficientemente activar e/ou potenciar a CDC.

[0227] Também se inserem no âmbito da presente invenção kits constituídos por composições de anticorpos da invenção (p. ex., anticorpos e imunoconjugados humanos) e instruções para a sua utilização. 0 kit pode ainda conter um ou mais reagentes adicionais, como um reagente imunossupressor, um agente citotóxico ou radiotóxico ou um ou mais anticorpos adicionais da invenção (por exemplo, um anticorpo humano com uma actividade complementar).

[0228] Assim, os doentes tratados com composições de anticorpos da presente invenção podem ainda receber (antes, em simultâneo ou após a administração do anticorpo humano da invenção) outro agente terapêutico, como um agente citotóxico ou radiotóxico que reforça ou amplifica o efeito terapêutico dos anticorpos humanos.

[0229] Noutras modalidades, o sujeito pode ainda ser tratado com um agente que modula, por exemplo, potência ou inibe, a 71 expressão ou actividade dos receptores Fcy ou Fca através, por exemplo, do seu tratamento com uma citocina. As citocinas preferidas para a administração durante o tratamento com a molécula multi-especificas incluem o factor de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF), o factor de estimulação de colónias de granulócitos macrófagos (GM-CSF), interferão γ (IFN-γ) e o factor de necrose tumoral (TNF).

[0230] As composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas biespecificas e multi-especificas) da invenção podem também ser utilizadas no direccionamento a células gue expressam FcyR ou CDC20 no sentido de, por exemplo, as marcar. Para tal utilização, o agente de ligação pode ser ligado a uma molécula detectável. Assim, a invenção fornece métodos para a localização ex vivo ou in vitro de células que expressam receptores Fc, tais como FcyR ou CD20. O marcador detectável pode, por exemplo, ser um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um co-factor enzimático.

[0231] Numa modalidade em particular, a invenção fornece métodos para a detecção da presença do antigénio CD20 numa amostra ou para a a medição da sua quantidade, que engloba, o contacto entre uma amostra, uma amostra de controlo e um anticorpo monoclonal da invenção que se liga especificamente ao CD20, sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo, ou porção do mesmo, e o CD20. É então detectada a formação de um complexo, onde a existência de uma diferença entre a formação de complexo na amostra e na amostra de controlo é indicativa da presença do antigénio CD20 na amostra.

[0232] Noutras modalidades, a invenção fornece métodos para o tratamento de um distúrbio em que estão envolvidas células que expressam CD20 num sujeito, por exemplo, o linfoma não-Hodgkin e a artrite reumatóide, através da administração dos anticorpos humanos acima descritos. Tais anticorpos e seus derivados são utilizados para a inibição de actividades induzidas pelo CD20 associadas a certos distúrbios, por exemplo, a proliferação e/ou diferenciação. Através do contacto do anticorpo com o CD20 (por exemplo, pela administração do anticorpo a um sujeito) é inibida a capacidade do último para a indução de tais actividades e é, dessa forma, tratado o distúrbio.

[0233] Assim, noutra modalidade, a presente invenção fornece um método para o tratamento ou prevenção de uma perturbação cancerígena em que estão envolvidas células que expressam CD20, por exemplo, NHL. 0 método envolve a administração a um sujeito de uma composição de anticorpos da presente invenção, numa quantidade eficaz para o tratamento ou prevenção da perturbação. A composição de anticorpos pode ser administrada 72 isoladamente ou em conjunto com outro agente terapêutico, tal como um agente citotóxico ou radiotóxico que actua em conjunção ou sinergicamente com a composição de anticorpos para o tratamento ou prevenção de doenças em que estão envolvidas células que expressam CD20. Numa modalidade particularmente preferida, a presente invenção fornece um método para o tratamento do linfoma não-Hodgkin.

[0234] Ainda noutra modalidade, a presente invenção fornece um método para o tratamento ou prevenção de uma perturbação auto-imune em que estão envolvidas células que expressam o CD20 humano como, por exemplo, as doenças acima mencionadas. O método envolve a administração a um sujeito de uma composição de anticorpos da presente invenção, numa quantidade eficaz para o tratamento ou prevenção da perturbação. A composição de anticorpos pode ser administrada isoladamente ou em conjunto com outro agente terapêutico, tal como um imunossupressor que actua em conjunção ou sinergicamente com a composição de anticorpos para o tratamento ou prevenção da doença em que estão envolvidas células que expressam CD20.

[0235] Ainda noutra modalidade, a invenção fornece um método in vivo ou in vitro para a detecção da presença ou para a quantificação da quantidade de células que expressam CD20. 0 método compreende (i) a administração ao sujeito de uma composição (por exemplo, molécula biespecifica ou multi-especifica) da invenção conjugada com um marcador detectável; (ii) a exposição do sujeito a um meio de detecção do marcador mencionado para a identificação das áreas que contêm células que expressam CD20. Ainda noutra modalidade, os imunoconjugados da invenção podem ser utilizados para o direccionamento de compostos (por exemplo, agentes terapêuticos, marcadores, citotoxinas, radiotoxinas, imunossupressores, etc.) a células que contêm CD20 expresso na sua superfície, através da ligação de tais compostos ao anticorpo. Assim, a invenção fornece também métodos para a localização ex vivo ou in vitro de células que expressam CD20, como as células Reed-Sternberg (e.g., com um marcador detectável, como um radioisótopo, composto fluorescente, uma enzima ou um co-factor enzimático). Em alternativa, o imunoconjugado pode ser utilizado para a eliminação de células que tenham CD20 expresso na sua superfície, através do direccionamento de citotoxinas ou radiotoxinas ao CD20.

[0236] A presente invenção é ilustrada mais detalhadamente nos exemplos que se seguem e que não devem ser interpretados como limitadores da mesma.

EXEMPLOS 73

Linhas de células B usadas nos exemplos [0237]

Linha celular Daudi ARH-77 DOHH Ra j i SU-DHL-4 Ramos-EHRB Tanoue

Origem jObtida de

Linfoma de Burkitt jECACC | (85011437)

Leucemia plasmocitária da fracçãojDSMZ (ACC 512) IgG |

Linfoma de células B imunoblásticojDSMZ (ACC 47) refractário j

Linfoma de Burkitt ^ECACC | (85011429) B-NHL, linfoma histiocítico difuso |DSMZ (ACC 495)

Linfoma de Burkitt lECACC I (85030804)

Leucemia humana de células B jDSMZ (ACC 399) [0238] Linhas de células B Daudi, ARH-77, DOHH, Raji, Ramos-EHRB e Tanoue foram cultivadas em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitela (FCS) (Optimum C241, Wisent Inc., st Bruno, Canadá), L-glutamina 2 mM, penicilina a 100 IU/ml, 100 pg/ml de estreptomicina e piruvato de sódio 1 mM (tudo da Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, Escócia).

[0239] A linha de células B SU-DHL-4 foi cultivada no mesmo meio mas sem piruvato de sódio.

[0240] As culturas foram mantidas a 37 °C numa incubadora humidificada de C02 a 5%, dividida e colhidas a 80-90% de confluência. 0 meio foi refrescado duas vezes por semana. Desta vez, as células foram dividas e inoculadas 1-1,5 x 106 células/ml para garantir a viabilidade e um crescimento óptimo.

Exemplo 1 Produção de anticorpos humanos contra CD20 [0241] Ratos HCo7 e KM: Foram preparados anticorpos monoclonais totalmente humanos a CD20 usando ratos HCo7 e KM que expressam genes de anticorpos humanos. Na estirpe de rato KM, o gene endógeno de cadeia kapa leve de rato foi alterado homozigoticamente como descrito por Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820 e o gene endógeno de cadeia pesada de rato foi 74 alterado homozigoticamente como descrito no Exemplo 1 da Publicação PCT WO 01/09187.

Esta estirpe de rato transporta um transgene humano de cadeia kapa leve, KCo5, como descrito por Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851.

Esta estirpe de rato também transporta um transcromossoma humano de cadeia pesada composto pelo fragmento hCF do cromossoma 14 (SC20) como descrito em WO 02/43478.

[0242] Os ratos HCo7 têm uma disrupção JKD nos seus genes endógenos de cadeia leve (kapa) (como descrito por Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830), uma disrupção CMD nos seus genes endógenos de cadeia pesada (como descrita no Exemplo 1 da WO 01/14424) , um transgene humano de cadeia kapa leve KCo5 (como descrito por Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851), e um transgene humano de cadeia pesada HCo7 (como descrito na patente US 5.770.429).

[0243] Imunizações de ratos HCo7 e KM: ratos HCo7 e KM foram imunizados com células NS/0 transfectadas com CD20 humano. Para a primeira imunização, por rato, lxlO7 células em 150 μΐ de PBS foram misturadas 1:1 com adjuvante completo de Freunds e injectados por via intraperitoneal (i.p.).

As imunizações i.p. subseguentes foram realizadas usando uma quantidade semelhante de células sem adjuvante. Três e dois dias antes da fusão, os ratos receberam uma injecção intravenosa de 0,5 x 107 células suspensas em PBS.

[0244] A presença de anticorpos dirigidos ao CD20 humano no soro dos ratos foi monitorizada por citometria de fluxo usando análise FACS, usando células NS/0 transfectadas com CD20 humano, assim como células NS/0 precursoras negativas para CD20 .

[0245] Geração de hibridomas para produção de anticorpos monoclonais humanos para o CD20 Os esplenócitos de rato foram isolados a partir de ratos HCo7 e KM e fundidos, com PEG, com uma linha celular de mieloma de rato, usando protocolos padrão. Os hibridomas resultantes foram então examinados quanto à produção de IgG,κ humana por ELISA e quanto à especificidade do CD20 usando células NS/0 e SKBR3 transfectadas com CD20 humano e por análise FACS. Suspensões de célula única de linfócitos esplénicos de ratinhos imunizados foram fundidas com um quarto do número de células de mieloma de rato SP2/0 não secretoras (ATCC, CRL 1581) com PEG a 50% (Sigma) . As células foram colocadas em placas de microtitulação de base plana de aproximadamente lx 105/poço , para incubação durante duas semanas em meio selectivo contendo soro fetal bovino a 10%, meio condicionado de P388D1 a 10% (ATCC, CRL TIB-63), Origen a 3-5% (IGEN) em DMEM (Mediatech, CRL 10013, com glicose elevada, L-glutamina e piruvato de 75 sódio) mais HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM, 50 mg/ml de gentamicina e lx HAT (Sigma, CRL P-7185) . Após 1-2 semanas, as células foram cultivadas em meio no qual a HAT é substituída por HT. Os poços individuais foram então analisados por citometria de fluxo quanto a anticorpos IgG monoclonais humanos anti-CD20. Quando já tenha ocorrido crescimento extensivo do hibridoma, o meio foi monotorizado habitualmente após 10-14 dias. Os hibridomas secretores de anticorpos foram novamente colocados em placa, analisados e se continuassem positivos para a IgG humana, os anticorpos monoclonais anti-CD20 foram subclonados limitando a diluição. Os subclones estáveis foram então cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpos no meio de cultura de tecido para caracterização. Um clone de cada hibridoma, que mantinha a reactividade das células-mãe (por FACS), foi seleccionado. Foram gerados bancos de células em 5-10 frascos para cada clone e guardados em nitrogénio líquido.

[0246] Selecção de anticorpos monoclonais humanos que se ligam a CD20/rastreio primário: Para determinar o isotipo dos anticorpos, foi realizado um teste ELISA para isotipos. Poços de placas de microtitulação foram revestidos com 1 pg/ml de cadeia kapa leve anti-humano de rato, 50 μΐ/poço em PBS incubados a 4 °C de um dia para o outro. Após bloqueio com soro de galinha a 5%, as placas foram postas em reacção com sobrenadante e controlo purificado de isotipo. As placas foram então incubadas à temperatura ambiente durante 1-2 horas. Os poços foram então colocados em reacção com sondas específicas para IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 humanas conjugadas com peroxidase de rábano silvestre. As placas foram desenvolvidas e analisadas conforme descrito acima.

[0247] Foram geradas quatro linhas celulares de hibridomas, três da fusão de rato KM e uma da fusão de rato HCo7, expressando os seguintes anticorpos: 2F2: um anticorpo IgGl,ê monoclonal humano com as sequências de nucleótidos: SEQ. ID N.°s 1 e 3 e as sequências de aminoácidos SEQ . ID N.°s 2 e 4. 4C9: um anticorpo IgGl,ê monoclonal humano exactamente com as mesmas sequências de aminoácidos do que 2F2: SEQ. ID N.°s 2 e 4 • 7D8: um anticorpo IgGl,ê monoclonal humano com as sequências de nucleótidos: SEQ. ID N.°s 5 e 7 e as sequências de aminoácidos SEQ . ID N.°s 6 e 8. 11B8: um anticorpo IgG3,ê monoclonal humano com as sequências de nucleótidos: SEQ. ID N.°s 9 e 11 e as sequências de aminoácidos SEQ . ID N.°s 10 e 12.

[0248] O termo "2F2" é usado aqui para designar tanto os 76 anticorpos derivados do clone de hibridoma 2F2 como o anticorpo idêntico derivado do clone de hibridoma 4C9.

[0249] Os anticorpos da invenção podem ser comutados para outros isotipos conforme determinado pelo animal não-humano transgénico ou transcromossómico a partir do qual são derivados. Numa modalidade da invenção, o anticorpo IgG3,K monoclonal humano 11B8 pode ser comutado para o isotipo IgGl,K monoclonal humano exactamente com as mesmas sequências VH e VL. Noutra modalidade, o anticorpo IgGl,K 2F2 ou o anticorpo IgGl,K 7D8 pode ser comutado para o isotipo monoclonal humano IgG2, IgG4, IgAl, IgA2 ou IgE tendo exactamente as mesmas sequências VH e VL.

Exemplo 2 Sequenciação de anticorpos humanos contra CD20 Sequenciação das Regiões VL e VH

[0250] Preparação de RNA: O RNA total foi preparado a partir de 5xl06 células de todas linhas celulares de hibridoma CD20 HuMAb (2F2, 7D8 e 11B8) com kit o RNeasy (Qiagen, Westburg,

Leusden, Países Baixos) de acordo com o protocolo do fabricante.

[0251] Preparação de cDNA de 2F2 e 7D8: O DNA complementar (cDNA) 5'-RACE-Ready de RNA foi preparado a partir de 1 pg de ARN total, usando o kit de Amplificação de cDNA SMART RACE (Clonetech), seguindo o protocolo do fabricante.

As regiões VH e VL foram amplificadas usando um vantajoso Kit HF 2 PCR (Clonetech, BD) e usando os seguintes primers (iniciadores) : VK RACE 2 5 ' ATT GCA TC GGC ACA CAA CAG AGG CAG TTC CAGlrecozido em jC-kapa vH RACE 2 5 ' GCT GTG CCC CCA GAG GTG CTC TTG GAG G jrecozido em |Chi [0252] Preparação de cDNA de 11B8: 0 DNA complementar (cDNA) de RNA de células 11B8 foi preparado a partir de 3 pg de RNA total com enzima AMV para transcriptase reversa com tampão (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha), oligo d(T)i5 (Promega, Madison, WI, EUA), dNTP (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) e RNAsin (Promega), de acordo com o protocolo do fabricante (2000, versão 3).

Primers PCR usados para amplificar as regiões VH e VL para clonagem: [0253] 77

Pares de primers usados: VH: \Primers 5' FR1

! AB62 | CAg gTK CAg CTg gTg CAg TC ! AB63 | SAg gTg CAg CTg KTg gAg TC | AB65 igAg gig CAg CTg gTg CAg TC — -------------------------------- \Primers líder 5' VH | AB8 5 jATg gAC Tgg ACC Tgg AgC ATC | AB8 6 jATg gAA TTg ggg CTg AgC Tg IAB8 7 jATg gAg TTT ggR CTg AgC Tg j AB8 8 jATg AAA CAC CTg Tgg TTC TTC | AB8 9 jATg ggg TCA ACC gCC ATC CT | Primer 3 ' VH |ab90 jTgC CAg ggg gAA gAC CgA Tgg — — VK: \Primers 5' FR1 |AB8 |rac ATC CAg ATg AYC CAg TC |aB9 IgYC ATC YRg ATg ACC CAg TC |abio j gAT ATT gTg ATg ACC CAg AC |abii igAA ATT gTg TTg ACR CAg TC |AB12 |gAA ATW gTR ATg ACA CAg TC I ABI 3 | gAT gTT gTg ATg ACA CAG TC | ABI 4 igAA ATT gTg CTg ACT CAg TC — -------------------------------- \Primers líder 5' VK j AB12 3 ÍCCC gCT Cag CTC CTg ggg CTC CTg j AB12 4 CCC TgC TCA gCT CCT ggg gCT gC j AB12 5 ÍCCC AgC gCA gCT TCT CTT CCT CCT gC j AB12 6 jATg gAA CCA Tgg AAg CCC CAg CAC AgC -------------------------------- |Primer 3 ' VK !aB16 jCgg gAA gAT gAA gAC AgA Tg em que K = T ou G, S = C ou G, R = A ou G, Y = C ou T, e W = A ou T. 78 [0254] Condições PCR usadas para amplificar as regiões VH e VL para clonagem 2F2 e 7D8: Foram realizadas reacções em cadeia da polimerase (PCR) com mistura de polimerase HF (Clonetech.) num TI Cycler (Biometra, Westburg).

Condições de PCR: 94 °C 30 seg. ^5 ciclos 72 °C 1 min. | 94 °C 30 seg. j 70 °C 30 seg. Í5 ciclos 72 °C 1 min. j 94 °C 30 seg. j 68 °C 30 seg. Í27-30 ciclos 72 °C 1 min. | [0255] Condições PCR usadas para amplificar as regiões VH e VL para clonagem 11B8: Foram realizadas reacções em cadeia da polimerase (PCR) com polimerase AmpliTaq (Perkin Elmer) num Tl Cycler (Biometra, Westburg, Leusden, Países Baixos).

Protocolo de ciclos de PCR: ! 94 °C 2 min. 11 ciclos 194 °C 30 seg. 16 5 °C 3 seg., menos 1 °C por ciclo 172 °C 30 seg. 30 ciclos j 94 °C 30 seg. 155 °C 30 seg. 172 °C 30 seg. 172 °C 10 min.

: arrefecer até 4 °C

[0256] Clonagem de VH e VL em pGEMT-Vector System II (2F2, 7D8 e 11B8): Depois de analisar os produtos PCR em gel de agarose, os produtos foram purificados com o kit QIAEX II Gel Extraction (Qiagen, Westburg, Leusden, Países Baixos) . Dois produtos PCR amplificados independentemente de cada região VH e VL foram clonados em pGEMT-Vector System II (Promega) de acordo com o protocolo do fabricante (1999, versão 6). 79 [0257] Após a transformação para E. coli JM109, as colónias individuais foram examinadas por PCR de colónia, utilizando os primers T7 e SP6, 30 ciclos de recozimento a 55 °C. O DNA plasmideo das colónias foi purificado utilizando um kit Qiaprep Spin miniprep (Qiagen) . Para uma análise mais aprofundada das regiões VH e VL, foi realizada uma digestão Ncol/Notl (NE Biolabs, Westburg, Leusden, Paises Baixos) e analisada em gel de agarose.

[0258] Sequenciação (2F2, 7D8 e 11B8) : As regiões V foram sequenciadas após clonagem no pGEMT-Vector System II. A sequenciação foi realizada em Baseclear (Leiden, Paises

Baixos). As sequências foram analisadas alinhando sequências germinativas do gene V em Vbase www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/publiclintro.htm).http://www.mrc-çpe.cam.ac.uk/vbase- ok.php?menu=901.

[0259] As sequências obtidas estão apresentadas nas Figuras 53-58 .

Exemplo 3 Produção recombinante de 2F2 e 11B8 na linha de células GS-NS/0 [0260] 2F2T: As regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo 2F2 foram amplificadas, por PCR, a partir de um vector de clonagem padrão, pGem-5Zf (Promega), com aplicação de primers que incluíam uma sequência de Kozak ideal e locais de restrição adequados para a clonagem dos fragmentos nos vectores GS da região constante ρΟΟΝγΙί e PCONk (Lonza).

[0261] Após amplificação, os fragmentos foram purificados e digeridos com as enzimas de restrição para clonagem e ligados nos dois vectores. O fragmento variável da cadeia pesada foi digerido com Hind III e Bsi WI e ligado ao vector ρΟΟΝγΙί, que havia sido digerido com Hind III e Bsi WI, e desf osf orilado com fosfatase alcalina. O fragmento variável da cadeia leve foi digerido com Hind III e Apa I e ligado ao vector PCONk, que havia sido digerido com Hind III e Apa I, e desfosforilado com fosfatase alcalina. Os vectores variáveis pesado/pCONYlf e leve/PCONK estão representados nas Figuras 1 e 2, respectivamente. As colónias de E. coli transformadas foram verificadas por PCR de colónia e foram cultivadas duas colónias positivas de cada constructo de cadeia pesada (HC) e leve (LC), para isolar o plasmideo. Foi sequenciado o plasmideo destes 4 clones, para confirmar a sequência. Ambos os clones HC e um dos clones LC revelaram ter as sequências correctas.

[0262] Os dois constructos HC e LC foram combinados para produzir duas combinações de LC-HC e transitoriamente co- 80 transfectados em células CH0-K1, para serem verificado quanto à respectiva produção adequada do anticorpo 2F2 . Nesta experiência de expressão foram alcançados niveis de produção normais para todas as combinações e seleccionou-se 1 constructo de HC e LC para a construção de um vector genético duplo.

[0263] Foram utilizados procedimentos de clonagem padrao para combinar os constructos HC e LC num vector duplo de clonagem genética, designado por pCONYlf/k2F2, através da ligação da cassete de expressão completa do vector de cadeia pesada, variável pesado/pCONYlf, ao vector de cadeia leve, variável leve/pCONK. O vector pCONYlf/k2F2 está representado na Figura 3.

[0264] Este constructo foi novamente alvo de teste funcional numa transfecção transitória em células CHO-K1 e revelou níveis de expressão normais.

[0265] Foram sequenciadas as regiões variáveis do plasmídeo pCONYlf/k2F2, para revalidação das sequências correctas.

[0266] 0 plasmídeo linear foi preparado para transfecções estáveis pela digestão do pCONYlf/k2F2 com uma enzima de restrição única, Pvu I, excluindo regiões vitais para a expressão. Foi confirmada a conclusão da linearização através de electroforese em gel de agarose e o ADN foi purificado e armazenado a -20 °C até ser utilizado.

[0267] Foram realizadas seis transfecções de células hospedeiras NS/0, por electroporação com DNA plasmídeo, utilizando o DNA plasmídeo linear acima mencionado. Após transfecção, as células foram distribuídas em placas de 96 poços e incubadas. Foi adicionado meio selectivo (contendo 10% de soro fetal de vitela dialisado (dFCS) e 10 μΜ do inibidor GS L-metionina-S-sulfoximina, mas sem glutamina) e monitorizaram-se as placas para determinação do momento da morte das células não transf ectadas e do seu abandono dos focos de células transfectadas. Para mais detalhes acerca dos sistemas vectoriais GS, ver a Patente WO 87/04462. As placas transfectadas foram incubadas durante, aproximadamente, 3 semanas para permitir a formação de colónias. As colónias resultantes foram examinadas microscopicamente para verificar se tinham as dimensões adequadas ao ensaio (cobrindo uma superfície superior a 60% do fundo do poço) e se estava presente apenas uma colónia em cada poço. Os sobrenadantes celulares de 436 transfectantes foram analisados por IgG,k-ELISA quanto a anticorpos agregados. Através destes dados, foram seleccionados 111 transfectantes para progressão e avaliação mais aprofundada, em cultura estática. As culturas das linhas celulares seleccionadas foram expandidas e 81 adaptadas a meio com níveis séricos reduzidos (composto por albumina sérica bovina (BSA) e 1% de dFCS) e foi realizada uma avaliação mais aprofundada da produtividade em cultura estática (ELISA e medição da confluência percentual). As 65 linhas celulares com classificações mais elevadas foram seleccionadas para progressão. Foi feita uma análise preliminar da produtividade das linhas celulares seleccionadas num lote agitado em frasco da cultura em suspensão num meio de nível sérico reduzido (contendo BSA e 1% de dFCS). Com base na concentração de anticorpos à colheita (por ELISA) e nas características de crescimento aceitáveis foram seleccionadas 30 linhas celulares para avaliação adicional num meio livre de soro, utilizando um lote agitado em frasco da cultura em suspensão. As 10 linhas celulares que produziram as concentrações mais elevadas do anticorpo foram adicionalmente avaliadas em culturas em suspensão em frascos de agitação com alimentação dupla dos lotes, num meio livre de soro. As concentrações de produto à colheita foram determinadas por cromatografia líquida de alta resolução com proteína A (HPLC), de acordo com métodos padrão bem conhecidos. Todas as linhas celulares produziram anticorpo 2F2 (denotado por 2F2T) com bons rendimentos, num intervalo de 671-1333 mg/L, conforme determinado por HPLC com proteína A.

[0268] 11B8T: De modo semelhante, foi estabelecida uma linha celular GS-NS/0 para a produção de 11B8 (denotado por 11B8T), através da leve modificação do procedimento de transfecção, tal como se segue.

[0269] Foram realizadas quatro transfecções de células hospedeiras NS/0, por electroporação com DNA plasmídeo, utilizando o DNA plasmídeo linear acima mencionado. Após análise microscópica das colónias resultantes para verificar que as suas dimensões eram adequadas para o ensaio (cobertura de uma área superior a 60% do fundo do poço) e que estava presente apenas uma colónia em cada poço, foram analisados os sobrenadantes celulares de 596 transfectantes para anticorpos agregados pela IgG,K-ELISA. Através destes dados, foram seleccionados 100 transfectantes para progressão e avaliação mais aprofundada, em cultura estática. As culturas das linhas celulares seleccionadas foram expandidas e adaptadas a meio com níveis séricos reduzidos (composto por albumina sérica bovina (BSA) e 1% de dFCS) e foi realizada uma avaliação mais aprofundada da produtividade em cultura estática (ELISA e medição da confluência percentual). Foram seleccionadas para progressão as 60 linhas de células com melhores resultados e 13 linhas celulares adicionais, cujos resultados se encontravam indisponíveis. Foi feita uma análise preliminar da produtividade das linhas celulares seleccionadas num lote agitado em frasco da cultura em suspensão num meio de nível sérico reduzido (contendo BSA e 1% de dFCS) . Com base na 82 concentração de anticorpos à colheita (por ELISA) e nas caracteristicas de crescimento aceitáveis foram seleccionadas 10 linhas celulares para avaliação adicional num lote duplamente alimentado da cultura em suspensão em agitador, num meio de nível sérico reduzido (contendo BSA e 1% de dFCS) . As concentrações de produto à colheita foram determinadas por cromatografia líquida de alta resolução com proteína A (HPLC), de acordo com métodos padrão bem conhecidos. Com base nesta, foi descartada uma das linhas celulares. Todas as 9 linhas celulares resultantes produziram anticorpo 11B8 (denotado por "11B8T") com bom rendimento, num intervalo de 354-771 mg/L, conforme determinado por HPLC com proteína A.

Exemplo 4 Comparação de 2F2 derivado de hibridoma e 2F2T recombinante derivado de transfectoma [0270] Foi demonstrado, através de electroforese em gel (SDS-PAGE e electroforese nativa em gel de agarose) que os anticorpos 2F2 e 2F2T são do mesmo tamanho e apenas ligeiramente diferentes a nível da carga eléctrica.

[0271] Para além disso, os anticorpos 2F2 e 2F2T ligam-se com uma afinidade semelhante a células Raji e células NS/0 transfectadas com CD20, conforme medido por citometria de fluxo com utilização do FACScalibur™ (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA). Não foi observada qualquer ligação às células NS/0 não transfectadas, demonstrando-se assim especificidade do 2F2 e 2F2T. Os anticorpos 2F2 e 2F2T também induzem a CDC de uma forma dependente da concentração e em igual proporção para células ARH-77 (leucemia plasmocitária da fracção IgG) , células Daudi, células DOHH (leucemia plasmocitária da fracção IgG com evolução a partir do linfoma folicular centroblástico/centrolítico, DSMZ, Braunschweig, Alemanha) e células Raji, com medição da lise celular (número de células positivas para IP) por citometria de fluxo (FACScalibur). Numa segunda experiência, as concentrações de 2F2 e 2F2T foram mantidas constantes, embora o soro tenha sido adicionado em diferentes concentrações. Não foram observadas diferenças significativas entre 2F2 e 2F2T.

[0272] Por fim, os anticorpos 2F2 e 2F2T unidos ao CD20 associado às células ligam, fortemente e em igual proporção, o factor complementar Clq. A experiência foi realizada em células Daudi, DOHH e Raji, utilizando anticorpos policlonais anti-Clq conjugados com fluoresceína para a detecção da ligação do Clq.

Exemplo 5 Características de ligação dos anticorpos humanos contra o CD20 [0273] Ligação a diferentes linhas celulares: As células 83 NS/O, NS/O transfectadas com CD20 humano, Daudi e Raji foram incubadas durante 30 minutos a 4 °C, com sobrenadante da cultura contendo anticorpos humanos 2F2, 7D8 e 11B8, a que se seguiu a incubação com anticorpo IgG anti-humano conjugado com FITC. A ligação foi avaliada por citometria de fluxo, através de um citómetro de fluxo FACScalibur. As intensidades de fluorescência foram comparadas com amostras emparelhadas de controlo isotipo negativo. Conforme ilustrado na figura 4, todos os três anticorpos ligados a células NS/O estabeleceram ligação com o CD20 humano, não tendo sido observada qualquer ligação a células NS/O parentéricas não transfectadas. Todos os três anticorpos também se ligaram a duas linhas de células B do linfoma de Burkitt (Raji e Daudi), indicando a especificidade dos anticorpos 2F2, 7D8 e 11B8 para o CD20. Os sobrenadantes que continham 7D8 ou 11B8 foram testados em condições não saturantes e foram, portanto, observadas intensidades médias de fluorescência mais baixas, quando comparadas com as obtidas para o 2F2.

[0274] Valor EC50 de 2F2 como determinado por citometria de fluxo: De modo a determinar a afinidade aparente de 2F2 com o CD20 expresso em células B humanas, foi realizada uma curva de ligação de 2F2 usando PBMCs isoladas a partir de três dadores humanos e bloqueio das células negativas para o CD3. As PBMCs isoladas foram incubadas durante 1 hora com um intervalo de concentração de 2F2 marcado com FITC e analisado em FACS e a intensidade fluorescência média (MFI) foi determinada. Os valores de MFI são apresentados nas Figuras 5A e 5B em função da concentração de anticorpos. Os valores EC50 foram calculadas através de Graph Pad Prism 3.02 por regressão não-linear. O valor EC50 de 2F2 em humanos foi semelhante para os três dadores com uma média (± EPM) de 287 ± 12,7 ng/ml (1,9 ± 0,1 nM) .

[0275] Ligação de mAbs marcados com 1251 a células que expressam CD20: mAbs foram iodinizados usando Iodobeads (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) . Os mAbs marcados com I foram sucessivamente diluídos e incubados com células Ramos-EHRB durante 2 horas a 37 °C na presença de azida de sódio e 2-deoxiglicose para evitar a endocitose. Os mAbs marcados com I livres ou ligados a célula foram então separados por centrifugação a 14.000 x g durante 2 min. através da mistura de óleos ftalato, permitindo a separação rápida sem perturbar o equilíbrio da ligação. As células granuladas em conjunto com o anticorpo ligado foram então contadas usando um contador gama (Wallac UK Ltd, Milton Keynes, RU).

[0276] Como representado na Figura 6, 2F2 e 11B8 exibem KD semelhantes (ou pontos de saturação semelhantes) indicando que ambos os anticorpos se ligam com afinidade semelhante. Contudo, 11B8 satura a um nível mais baixo do que 2F2 84 indicando que reconheceu uma forma diferente de CD20. Isto também está em conformidade com outra experiência que mostra que um número similar de moléculas de anticorpos de 2F2 e rituximab se liga a CD20 em células Ramos-EHRB e células Daudi, como representado pelos níveis idênticos de saturação de ligação (aproximadamente 2-3 x 105 moléculas de anticorpos por célula). 11B8 e Bl, pelo contrário, saturam a metade deste nível e apenas cerca de 1-2 x 105 moléculas de anticorpos se ligam a células Ramos-EHRB (Figura 7A) e células Daudi (Figura 7B) .

[0277] Para excluir a possibilidade de que os anticorpos iodinizados se liguem via receptores Fc, as curvas de ligação foram confirmadas pelo uso de fragmentos anti-CD20 F(ab')2· Novamente, números semelhantes de fragmentos de 2F2 e rituximab-F(ab')2 ligam-se tanto a células Ramos-EHRB como a células Daudi. Também nestas experiências, o número de moléculas de anticorpos 2F2 ou rituximab ligadas a células Ramos-EHRB e a células Daudi satura a aproximadamente duas vezes o número de moléculas de 11B8 e Bl ligadas às células.

[0278] Taxa de dissociação: Para determinar a taxa de dissociação dos mAbs, células Ramos-EHRB (volume final de 1 ml na presença de azida/2D0G) foram incubadas durante 2 horas a 37 °C com 2 pg/ml 125I mAbs para conseguir uma ligação máxima. Após centrifugação numa microcentrífuga (2000 rpm durante 2 min.), o sobrenadante foi removido, o granulado suspenso rapidamente em 1 ml de meio e imediatamente transferido para 9 ml de meio a 37 °C num tubo cónico de 15 ml. Em vários momentos ao longo das 2 horas seguintes, foram retiradas amostras de 0,4 ml e separadas em óleos de ftalato para determinar o nível de mAbs radiomarcados restantes na superfície celular. Como representado na Figura 8, 2F2 e 11B8 dissociaram-se de modo significativamente mais lento de CD20 do que rituximab ou Bl.

[0279] Taxas de dissociação de fragmentos anti-CD20 F(ab)2: Células Ramos-EHBR foram saturadas com 2 pg/ml de fragmentos F(ab)2 marcados com 125I de 2F2, 11B8 e rituximab, respectivamente. As células Ramos-EHBR foram lavadas e incubadas na presença de uma concentração elevada do anticorpo não marcado. A ligação máxima (inicial) a células Ramos-EHRB foi definida a 100%. Em vários momentos ao longo das 3 horas seguintes após o carregamento, foram retiradas amostras de 0,4 ml e separadas em óleo de ftalato para determinar os níveis de mAbs radiomarcados restantes na superfície celular. Como pode ser observado a partir da Figura 9, 2F2 e 11B8 dissociaram-se muito mais lentamente da superfície de CD20 do que rituximab. Aos 90 minutos, aproximadamente 50% das moléculas de rituximab F(ab)2 estavam ligadas à célula, ao passo que metade das moléculas de 2F2 F(ab)2 estavam dissociadas após 3 horas. Os 85 valores kd (koff) para 2F2, 11B8T e rituximab são calculados como se segue: F(ab>2 2F2: kd = In 2/t* (sec) = ln 2/10800 (sec) = 6.4 x IO'5 sec'1 F(ab)2 11B8T: kd - ln 2Λκ (sec) = ln 2/9000 (sec) = 7.7 x 10'5 sec1 F(ab)2 rituximab: kd = ln 2/tyi (sec) = ln 2/5400 (sec) = 1.3 x IO"4 sec’1 [0280] Taxas de dissociação do mAb anti-CD20: O impacto da taxa de dissociação reduzida do 2F2, relativamente ao rituximab, foi avaliado através de um ensaio funcional da CDC. Para tal, as células Daudi ou SU-DHL4 foram pré-incubadas com 10 pg/ml de mAb anti-CD20 ou anticorpo de controlo isotipico, lavadas e incubadas num meio para diferentes pontos temporais. Nesses pontos temporais, após o inicio do ensaio, as amostras foram incubadas com complemento (soro humano normal a 20 vol/vol%) e, então, incubadas durante mais 45 minutos, a 37 °C. Posteriormente, foi determinada a lise celular em FACS, através do método de coloração com IP (iodeto de propídio). A % de células lisadas (células positivas para IP) é representada nas Figuras 10A (células Daudi) ou 10B (células SU-DHL4), em função do tempo de incubação. O anticorpo 2F2 induziu uma CDC elevada em ambas as linhas celulares e, ainda assim, lisou até 90% das células após o período de 6 horas indicando, dessa forma, que a saturação celular de CD20 permaneceu suficientemente elevada para a indução da lise mediada pelo complemento da maioria das células. O rituximab, pelo contrário e de acordo com os estudos da taxa de dissociação supracitados, dissociou-se rapidamente das células e falhou na indução da lise específica após o período de incubação de 6 horas. Ο 11B8 foi utilizado como um controlo e não induziu a CDC.

Exemplo 6 CDC de anticorpos humanos contra o CD20 [0281] Preparação do soro: 0 soro para a lise do complemento foi preparado através da colheita de sangue de voluntários saudáveis para gel Autosep e tubos de coagulação Vacutainer (BD biosciences, Rutherford, NJ) , que foram mantidos à temperatura ambiente durante 30-60 minutos e, então, centrifugados a 3000 rpm durante 5 minutos. O soro foi colhido e armazenado a -80 °C.

[0282] Citometria de fluxo: Para a citometria de fluxo, foi utilizado um citómetro de fluxo FACScalibur com a aplicação CellQuest pro (BD Biosciences, Mountain view, CA) . 86

Foram recolhidos pelo menos 5000 eventos para análise com detritos celulares, excluídos pelo ajustamento do limiar da dispersão frontal e lateral (FCS) .

[0283] Cinética da CDC: Na primeira de um conjunto de experiências (n=3), foi determinada a cinética da CDC de 5 linhas de células B, ou seja, Daudi, SU-DHL-4, Raji, DOHH e ARH-77, pela adição de 10 yg/ml de 2F2, rituximab e de um anticorpo IgG de controlo, respectivamente, durante 10 minutos antes da adição de soro humano. Em vários intervalos temporais (de até uma hora) , após indução da CDC, as células foram suspensas em solução de IP e foi medida a lise celular (número de células IP-positivas), através de citometria de fluxo. Os resultados são representados nas figuras 11A (células ARH-77), 11B (células Daudi), 11C (células Raji), 11D (DOHH) e 11E (SU- DHL-4). Conforme observado, a adição de anticorpos induziu a lise celular no prazo de 5 minutos. Curiosamente, a adição de 2F2 resultou numa lise celular marcada superior a 80% nas 5 linhas de células B. O rituximab induziu uma lise celular superior a 80% apenas nas linhas celulares SU-DHL-4 e Daudi, enquanto que a lise da linha DOHH foi de 50% e inferior a 20% nas linhas ARH-77 e Raji. Não foi observada lise com o anticorpo IgG de controlo (dados apenas representados na figura 11B).

[0284] Titulação sérica da CDC: Num conjunto independente de experiências (n=5), o NHS (soro humano normal) foi titulado em duas concentrações distintas de anticorpos, de 0,5 pg/ml e 5 pg/ml. As células foram pré-incubadas com 2F2 ou rituximab durante 10 minutos, antes do acréscimo de um intervalo de concentração de NHS. 45 minutos após a indução da CDC, as células foram re-suspensas numa solução de IP. A lise celular (número de células positivas para IP) foi medida por citometria de fluxo. As figuras 12A-D ilustram a percentagem de células lisadas (IP-positivas) em função da concentração de NHS. A figura 12A ilustra a lise de células Daudi, a figura 12B a lise de células ARH-77, a figura 12C a lise de células DOHH e a figura 12D a lise de células Raji. Foi observado um incremento da lise celular com o aumento da concentração de NHS. A adição de 2F2 causou a lise máxima de células Daudi, à concentração mais elevada de NHS e anticorpo. O rituximab induziu uma lise de células Daudi de cerca de 50%, à concentração mais elevada de NHS.

[0285] Nas células ARH-77, apenas a concentração mais elevada de NHS e 2F2 conduziu a uma lise celular de cerca de 75%. As concentrações mais reduzidas de anticorpo foram insuficientes para induzir a lise de células ARH-77. Nesta experiência, o rituximab não foi capaz de induzir a lise de células ARH-77.

[0286] O 2F2 foi capaz de induzir a lise celular dependente 87 da concentração de NHS de células DOHH, tanto a alta como a baixa concentração, enquanto o rituximab não foi capaz de induzi-la nestas condições.

[0287] Por fim, o 2F2 induziu a lise dependente da concentração de NHS de células Raji, que apenas foi evidente através da utilização de 5 pg/ml de mAb. Não foi observada lise com rituximab.

[0288] Nestas experiências, não foi observada lise com o anticorpo de controlo isotipico (dados não representados).

[0289] Titulaçao de anticorpos CDC: Para medir a capacidade de indução da CDC dos anticorpos anti-CD20 em concentrações reduzidas, foi realizada uma experiência onde estes anticorpos foram titulados (n=6). Foram pré-incubadas várias linhas celulares com um intervalo de concentrações de 2F2 e rituximab, respectivamente, durante 10 minutos, antes da adição de NHS. Após 45 minutos de incubação a 37 °C (quando ocorre a lise máxima), as células foram re-suspensas numa solução IP e foi medida a lise celular (número de células positivas para IP), através de citometria de fluxo. As figuras 13A (células Daudi), 13B (células DOHH), 13C (células ARH-77) e 13D (células Raji) ilustram a percentagem de células lisadas (IP-positivas), em função da concentração de anticorpo. Tanto 2F2 como rituximab induziram um aumento da lise celular dependente da concentração. 0 2F2 induziu mais de 80% da lise de células Daudi pela adição de 2 pg/ml, enquanto que com o rituximab este nivel não foi atingido, mesmo após a adição de 10 pg/ml. Adicionalmente, o 2F2 induziu mais de 80% da lise de células DOHH a 0,4 yg/ml, enquanto que com o rituximab apenas foi observada uma lise mínima a esta concentração. A lise máxima de células DOHH com rituximab ( 30% do total de células analisadas) foi atingida a uma concentração de 10 pg/ml. A indução da lise de células ARH-77 e Raji por 2F2 foi inferior, mas ainda assim foi atingida uma lise de 70% a uma concentração do anticorpo de 10 yg/ml. À sua concentração mais elevada, o rituximab induziu a lise em apenas 23% das células ARH-77 e em apenas 6% das células Raji.

[0290] Numa experiência semelhante, os anticorpos 2F2, 2F2T, 11B8T e rituximab foram investigados quanto à sua capacidade de indução da CDC em linhas de células Daudi e Raji; ver as

Figuras 14A e 14B. Também nesta experiência, mais de 80% da lise de células Daudi foi observada com 2F2T a 10 pg/ml (derivado de transfectoma), enquanto que o rituximab apenas alcançou 60% da lise, mesmo a 10 yg/ml, cf. Figura 14A. A lise de células Daudi com 2F2T foi idêntica à obtida com 2F2 derivado de hibridoma.

[0291] A lise de células Raji foi mais difícil, mas mais uma 88 vez, tanto 2F2 como 2F2T induziram a lise destas células, na mesma medida (Figura 14B). 0 rituximab não foi capaz de induzir a CDC de células Raji, o que está de acordo com a experiência ilustrada na figura 13D.

[0292] Conforme pode ser verificado através das figuras 14A e 14B, nem as células Daudi nem as Raji eram susceptíveis à CDC por 11B8T. 0 BI induziu, mas apenas em pequena escala, a lise de células Daudi mas não foi capaz de o fazer para as células Ra ji.

[0293] Actividade CDC do anti-CD20 em células Daudi: Para determinar a actividade CDC de cada anticorpo, foi avaliada a elevação da permeabilidade da membrana através de análise FACS de células coradas com iodeto de propídio (IP) . Resumidamente, as células Daudi foram lavadas e re-suspensas em RPMI/BSA a 1%, a uma concentração de 1 x 106 células/ml.

Adicionaram-se várias concentrações de anticorpos monoclonais humanos às células Daudi e permitiu-se a ligação ao CD20 a nível celular durante 10-15 minutos, à temperatura ambiente. Em seguida, foi adicionado soro como fonte de complemento a uma concentração final de 20% (v/v) e as misturas foram incubadas durante 45 minutos, a 37 °C.

As células foram então mantidas a 4 °C, até à respectiva análise. Cada amostra (150 μΐ) foi então adicionada a 10 μΐ de solução de IP (10 pg/ml em PBS) num tubo de FACS. A mistura foi imediatamente avaliada por citometria de fluxo. Conforme ilustrado na Figura 15A, os anticorpos 2F2 e 7D8 demonstraram uma actividade CDC superior relativamente ao rituximab.

[0294] Numa segunda experiência, as células foram, tal como acima, marcadas com anticorpos monoclonais humanos, lavadas e incorporadas em PBS, durante 45 minutos a 37 °C, antes do acréscimo de soro humano. Tal assegurou que apenas o anticorpo ligado à célula no momento de adição do soro se encontrava disponível para activar o complemento para a lise celular. Conforme ilustrado na Figura 15B, foi encontrada para o rituximab uma actividade CDC reduzida em comparação à verificada para 2F2 e 7D8, indicando que os anticorpos humanos (2F2 e 7D8) não são afectados pela lavagem das células antes da adição de soro.

[0295] Actividade CDC do anti-CD20 em células Raji: A actividade CDC foi avaliada através de células Raji que têm uma expressão superficial de CD55 e CD59 relativamente elevada e que, como tal, são mais resistentes ao ataque do complemento. Os anticorpos foram adicionados às células Raji e permitiu-se o estabelecimento da ligação, durante 15 minutos. Foi adicionado soro humano (20%) e as misturas foram incubadas durante 45 minutos, a 37 °C. 89

Conforme ilustrado na Figura 16A, o rituximab foi ineficaz na mediação da CDC em células Raji, em oposição à ocorrência de niveis significativos de lise em células Raji opsonizadas com 2F2 ou 7D8.

Assim, 2F2 e 7D8 têm uma capacidade única para a lise de células alvo positivas para CD55/59.

[0296] Numa experiência independente, as células Raji foram pré-incubadas com concentrações saturantes de mAb anti-CD55 (concentração final de 5 pg/ml) e mAb anti-CD59 (concentração final de 5 pg/ml), para bloquear os efeitos destas moléculas de defesa do complemento. Os anticorpos humanos anti-CD20 foram então adicionados, em conjunto com o soro (20%) , conforme acima descrito, durante 45 minutos, a 37 °C. Conforme ilustrado na Figura 16B, o bloqueio de moléculas CD55 e CD59 resultou numa lise de células Raji de quase 100% com os anticorpos 2F2 ou 7D8, em oposição à lise de apenas 25% observada com rituximab.

[0297] Papel dos inibidores complementares I - Expressão de moléculas superficiais: Uma vez que os inibidores complementares como o CD55 e o CD59 aparentam desempenhar um importante papel na susceptibilidade à CDC induzida por rituximab, foi realizada uma experiência para determinar a expressão destas moléculas nas linhas de células B em investigação (Raji, Daudi, DOHH, ARH-77 e SU-DHL-4).

[0298] As células foram coradas com anticorpos anti-CD55, anti-CD59 e anti-CD20 conjugados com FITC e foi analizada a expressão das moléculas, através de citometria de fluxo. Os resultados estão ilustrados abaixo, na Tabela 1.

Tabela 1 ; Expressão CD2 0 CD55 CD5 9 !ARH-77 + + ++++ ++ Raji + ++ +++ DOHH + + +++ ++ SU-DHL-4 + + + + ++ Daudi + + + + [0299] Papel de inibidores do complemento II - Bloqueio de CD55 e CD59: Pacra estudar mais aprofundadamente os papéis desempenhados por CD55 e CD59 na CDC induzida por anti-CD20, ambas as moléculas inibidoras do complemento foram bloqueadas por anticorpos específicos antes da indução de CDC (n=3). Foram usadas células Raji porque só foi induzida uma lise 90 parcial pelo 2F2 isoladamente. As células Raji (1 x 105 células/50 μΐ) foram pré-incubadas com uma gama de concentrações de 2F2 e rituximab em conjunto com anticorpos anti-CD55 (5 pg/ml) ou anti-CD59 (5 pg/ml) durante 10 min, antes de se adicionar NHS agrupado (20%) . 45 minutos após a indução da CDC, as células foram re-suspensas numa solução de IP. A lise celular (número de células positivas para IP) foi medida por citometria de fluxo. As Figuras 17A-C mostram a percentagem de células lisadas (positivas para IP) em função da concentração de anticorpos e apresentam uma experiência que é exemplificativa de três experiências. A Figura 17A mostra a incubação de células Raji com anticorpo anti-CD55, a Figura 17B a incubação de células Raji com anticorpo anti-CD59 e a Figura 17C a incubação de células Raji com anticorpos anti-CD55 e anti-CD59.

[0300] Como pode ser observado na Figura 17A, a adição de anticorpo anti-CD55 não influenciou a CDC induzida por rituximab ou por 2F2. A adição de anticorpo anti-CD59 aumentou a susceptibilidade das células tanto a 2F2 como a rituximab em 30% (Figura 17B). A adição de anti-CD55 e anti-CD59 aumentou ainda mais a lise de células induzida por anti-CD20 em 30% (Figura 17C).

[0301] Papel de factores complementares, como determinado por citometria de fluxo I - ligação do Clq: Foram adicionados anticorpos anti-CD20 (2F2 e rituximab) e um anticorpo de controlo isotipico a várias linhas de células B. Após 10 min. de incubação, foi adicionado NHS (1 vol/vol%) . Após incubação por mais 10 min. a 37 °C e lavagem das células, o sobrenadante foi removido e o granulado celular foi incubado com anticorpo anti-Clq conjugado com FITC. Os dados revelam intensidade de fluorescência média das células coradas com Clq e estão apresentados nas Figuras 18A (Daudi), 18B (ARH-77), 18C (DOHH) e 18D (Raji) (n=6). Os resultados indicaram um aumento dos anticorpos dependente da concentração na ligação de Clq por 2F2, independentemente da linha de células B investigada. Além disso, a ligação de Clq por 2F2 foi sempre superior à ligação por rituximab, em todas as linhas celulares testadas. Não foi observado qualquer aumento na fluorescência média com o anticorpo de controlo isotipico (dados não representados).

[0302] Papel de factores complementares, como determinado por citometria de fluxo II - accionamento do complemento pela via clássica: A fixação de C4c a células revestidas com anticorpos é uma indicação da activação do complemento pela via clássica. Foram adicionados anticorpos anti-CD20 (2F2 e rituximab) e um anticorpo de controlo isotipico a várias linhas de células B. Após 10 min. de incubação a 37 °C, foi adicionado NHS (1 vol/vol%). Após incubação e lavagem das células, o sobrenadante foi removido e o granulado celular foi incubado 91 com anticorpo anti-C4c conjugado com FITC. Os dados revelam intensidade de fluorescência média das células coradas com C4c e estão apresentados nas Figuras 19A (Daudi), 19B (ARH-77), 19C (DOHH) e 19D (Raji) (n=6) . A fixação do factor complementar C4c a 2F2 foi demonstrada em todas as linhas de células B testadas (n=3), com um máximo atingido a 1 yg/ml de anticorpo. A fixação de C4c após ligação de 2F2 foi muito mais elevada do que após rituximab, independentemente da linha celular testada. Não foi observado qualquer aumento na fluorescência média com o anticorpo de controlo isotípico (dados não representados).

[0303] CDC em soro inactivado por calor: Células (células Daudi, células ARH-77 ou células Raji) e anticorpos (rituximab, 2F2, 2F2T, 11B8 e anticorpo de controlo isotípico IgGl HuMab-KLH) foram pré-incubados numa gama de concentrações de anticorpos anti-CD20 durante 10 min. antes da adição de NHS (activo ou inactivado por calor num banho de água a 57 °C durante 30 min.). 45 minutos após a indução da CDC, as células foram re-suspensas numa solução de IP. A lise celular (número de células positivas para IP) foi medida por citometria de fluxo. Não foi observada qualquer lise das células na presença de soro inactivado por calor, independentemente da linha celular e anticorpos CD20 usados, não foi observada CDC na presença de soro inactivado por calor.

Exemplo 7 ADCC de anticorpos humanos contra CD20 - Ensaio de ADCC I

[0304] Enriquecimento de neutrofilos humanos: Células polimorfonucleares (neutrófilos, PMNs) foram enriquecidas a partir de sangue total heparinizado. 0 sangue foi diluído duas vezes em RPMI 1640 e foi disposto em camadas em Ficoll (Lymphocyte Separation Médium 1077 g/ml, 710 g, RT, 20 min; BioWhittaker, cat. 17-829E, lote n.° 0148 32) e centrifugado a 2000 rpm durante 20 min. A camada de células mononucleares foi removida e os eritrócitos dentro do granulado que contém neutrófilos foram lisados hipotonicamente usando solução de NH4C1 gelada (NH4C1 155 mM, NaHC03 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,4). Os neutrófilos remanescentes foram lavados duas vezes e suspensos em RPMI 1640 suplementado com FCS a 10% (RPMI-10).

[0305] Enriquecimento de células mononucleares de sangue periférico humano: O sangue humano foi diluído duas vezes em RPMI 1640 e as células sanguíneas foram dispostas em camadas em Ficoll (Lymphocyte Separation Médium 1077 g/ml, 710 g, RT, 20 min; BioWhittaker, Cambrex Bio Science Verviers, Verviers, Bélgica, cat. 17-829E, lote n.° 0148 32). Células mononucleares de sangue periférico (MNCs) foram colhidas da interfase, lavadas e suspensas em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com FCS a 10%, L-glutamina 2 mM, 5 U/ml 92 de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina (todas derivadas da BioWhittaker) ao qual foi adicionado HEPES 25 mM (BioWhittaker).

[0306] Preparação de ADCC: Células B alvo (células B recém-isoladas ou provenientes de linhas de células B) foram marcadas com 20 pCi 51Cr (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia) durante 2 horas. Após lavagem extensiva em RPMI-10, as células foram ajustadas para 1 x 105 células/ml. Sangue total ou células efectoras isoladas (50 μΐ; MNCs, PMNs) ou plasma (50 μΐ) , anticorpos de sensibilização (50 μΐ) e RPMI-10 (50 μΐ) foram adicionados a placas de microtitulação de fundo redondo (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Alemanha). Os ensaios foram iniciados adicionando células alvo (50 μΐ) produzindo um volume final de 200 μΐ. Para células efectoras isoladas, foi usada uma razão de células efectoras para células alvo (E:T) de 40:1. Para o sangue total, foi usada uma quantidade de 33% vol/vol, correspondente a uma razão estimada de células efectoras para células alvo de 40:1. Após incubação (3 horas, 37 °C), os ensaios foram parados por centrifugação e a libertação de 51Cr dos triplicados foi medida em contagens por minuto (cpm) num contador de cintilação. A percentagem de citotoxicidade celular foi calculada usando a seguinte fórmula: % specific lysis - (experimental cpm - basal cpm)/(maximal cpm - basal cpm) x 100 com libertação máxima de 51Cr determinada adicionando ácido perclórico (concentração final 3%) a células alvo e a libertação basal foi medida na ausência de anticorpos de sensibilização e células efectoras.

[0307] Estatísticas: Os dados foram analisados por ANOVA unidireccional, seguido de teste post-hoc de Tukey para comparações múltiplas. A análise foi realizada usando o Graph Pad Prism (versão 3.02 para Windows, software Graph Pad, San Diego, CA, EUA).

[0308] Lise de células ARH-77: Num primeiro conjunto de

experiências, células ARH-77 foram usadas como células alvo (Figura 20) . A adição de 2F2 (n=3) , rituximab (n=3) ou 11B8T (n=l) resultou em lise mediada por MNC de células ARH-77 de cerca de 50%. Não foi observada qualquer lise específica na presença de neutrófilos. A adição de plasma (para avaliar o papel do complemento) induziu a lise de células ARH-77 após incubação com 2F2, mas não após incubação com rituximab (p<0,05, 2F2 vs. sem anticorpo, ANOVA) ou 11B8T.

Na presença de sangue total, a lise de células ARH-77 aumentou após incubação com 2F2 (p<0,05, 2F2 vs. rituximab e 2F2 vs. sem anticorpos, ANOVA), mas não com rituximab. A lise 93 específica induzida por rituximab foi de facto muito baixa na presença de sangue total. 0 11B8T induziu uma lise celular de aproximadamente 25% (n=l) na presença de sangue total. Na ausência de anticorpos, foi observada lise não-específica de 10-15%.

[0309] Lise de células B-CLL: Num segundo conjunto de experiências, as células de leucemia B-linfocitica crónica (B-CLL) obtida de doentes B-CLL (n=12) foram subclonadas para 5 ciclos e depois usadas como células alvo na experiência (Figura 21) . Na ausência de anticorpos, não foi observada qualquer lise especifica, mas a adição de 2F2, 11B8T ou rituximab (10 yg/ml) aumentou a lise especifica mediada por MNC para 10-20% (p<0,001, ANOVA). A incubação de células alvo com plasma e 2F2 induziu a lise específica de células B-CLL, ao passo que não foi observada qualquer lise especifica com 11B8T ou rituximab (p<0,001, ANOVA). Além disso, o 2F2 mediou a lise específica de células B-CLL após incubação em sangue total. Não foi observada qualquer lise específica de células B-CLL por sangue total com 11B8T (p<0,01, ANOVA) ou rituximab (p<0,001, ANOVA). Não foi observada qualquer lise especifica na presença de neutrófilos.

[0310] Uma vez que o rituximab foi capaz de mediar a ADCC eficaz mas não a CDC das células tumorais testadas, é provável que a lise de células B induzidas por sangue total por parte do 2F2 seja mediada pelo complemento.

[0311] Lise de células de tricoleucemia (HCL): Num terceiro conjunto de experiências, foi determinada a lise de células HCL por 2F2, 11B8T e rituximab por ADCC ou na presença de plasma ou sangue total. Os dados estão apresentados na Figura 22. Enquanto os neutrófilos não conseguiram mediar a ADCC independentemente do mAb usado, ο 11B8T foi capaz de induzir a lise mediada por MNC de células HCL mais eficientemente do que o 2F2 (p<0,001, ANOVA) ou o rituximab (p<0,05, ANOVA). 2F2 e rituximab não foram capazes de induzir a lise mediada por MNC de células HCL. A lise mediada por plasma das células aumentou fortemente com 2F2, quando comparada com rituximab (p<0,05, ANOVA), 11B8T (p<0,01, ANOVA) ou sem anticorpos (p<0,001, ANOVA). Quando foi estudada a lise induzida por anti-CD20 na presença de sangue total, o 2F2 induziu a lise completa das células, e foi superior ao rituximab (p<0,01, ANOVA), 11B8T ou nenhum anticorpo adicionado (p<0,001, ANOVA).

[0312] Lise de células B-ALL: Usando células de dois doentes, foi investigada a capacidade do 2F2 e do rituximab de induzirem a lise de células B-ALL por ADCC ou complemento (Figura 23). Como foi observado nas experiências anteriores, o 2F2 e rituximab induziram a ADCC mediada por MNC de células B-ALL na mesma medida. Mas novamente, o 2F2 foi capaz de induzir 94 a lise de células B-ALL mediada por plasma e sangue total, ao passo que o rituximab não o foi.

[0313] Lise de células de linfoma folicular: Quando a lise de células de linfoma folicular (n=2) foi investigada, emergiu uma imagem diferente (Figura 24). Foi observada uma lise menor mediada por PMN de células com 2F2, e tanto 2F2 como rituximab foram incapazes de induzir a ADCC mediada por MNC. 11B8T foi também capaz de induzir a lise mediada por MNC de aproximadamente 20%. Embora tenha sido induzida uma lise relativamente elevada mediada por plasma por rituximab, foi observada lise completa mediada por plasma com 2F2. Também com sangue total, foi observada a lise completa com 2F2, ao passo que foi observada 70% de lise com rituximab. Foi observada lise minima por 11B8T mediada por sangue total ou plasma.

[0314] Lise de células de linfoma primário de células do manto: Foi mais difícil induzir a lise específica de células de linfoma das célula do manto (n=l, Figura 25). Foi observada lise mínima ou nenhuma lise por 2F2, 11B8T ou rituximab após a adição de PMN ou MNC e mAbs de CD20. Contudo, 2F2 ainda foi capaz de induzir aproximadamente 40% de lise por plasma ou sangue total, ao passo que com rituximab apenas 10-20% das células foram lisadas. Ο 11B8T não foi capaz de induzir a lise de células de linfoma primário célula do manto.

[0315] Lise dependente da concentração de anticorpos de células ARH-77 em sangue total: Noutra experiência, foi analisada a dependência de dose (n=4) relativamente à indução de ADCC em células ARH-77 na presença de sangue total. Como pode ser observado na Figura 26, a titulação de 2F2 induziu um aumento dependente da dose na percentagem de lise específica (p<0,05: efeito do tratamento, ANOVA bidireccional) de células ARH-77. Não foi observada qualquer lise específica de células ARH-77 com rituximab.

Ensaio ADCC II

[0316] Preparação de células alvo marcadas com 51Cr: Células ARH-77 e células Raji foram colhidas (3 x 106 células) em RPMI++, centrifugadas (1500 rpm; 5 min), suspensas em 140 μΐ de 51Cr (Chromium-51; CJSll-lmCi, lote 12; 140 μΐ é cerca de 100 pCi) e incubadas (banho de água a 37 °C; 1 hora) . Após lavagem das células (1500 rpm, 5 min, em PBS, 3x) , as células foram suspensas em RPMI++ e contadas por exclusão de azul de tripano. As células foram levadas a uma concentração de 2 x 104 células/ml.

[0317] Preparação de células efectoras: Células mononucleares (MNC) de sangue periférico fresco foram isoladas a partir de 40 ml de sangue de heparina por Ficoll (Bio Whittaker; meio de 95 separação de linfócitos, cat 17-829E) seguindo as instruções do fabricante. Após ressuspensão das células em RPMI++, as células foram contadas por exclusão de azul de tripano e ajustadas para uma concentração de 1 x 106 células/ml.

[0318] Preparação de ADCC: 50 μΐ de RPMI++ foram pipetados para placas de 96 poços e foram adicionados 50 μΐ de células alvo marcadas com 51Cr. Subsequentemente, foram adicionados 50 μΐ de anticorpos, diluidos em RPMI++ (concentrações finais 10, 1, 0,1, 0,01 pg/ml). As células foram incubadas (RT, 10 min) e foram adicionados 50 μΐ de células efectoras, resultando numa razão de células efectoras para células alvo de 50:1 (para determinação de lise máxima; 50 μΐ de Triton-X-100 a 5% foi adicionado em vez de células efectoras). As células foram centrifugadas (500 rpm, 5 min.) e incubadas (37 °C, C02 a 5%, 4 horas). Após centrifugação das células (1500 rpm, 5 min.), foram colhidos 100 μΐ de sobrenadante em tubos micrónicos e procedeu-se à contagem num contador gama. A percentagem de lise especifica foi calculada como se segue: cejjs oujX) x j 00 ^ sbecjçc jXsia = (cbur smrbje- cbiu (siSg{ cgjjs oujX)\(cbm ujsxjujítj jXgis —cbm {siSgj [0319] Estatísticas: Os dados foram analisados por ANOVA unidireccional, seguido de teste post-hoc de Tukey para comparações múltiplas. A análise foi realizada usando o Graph Pad Prism (versão 3.02 para Windows, software Graph Pad, San Diego, CA, EUA).

[0320] Lise dependente da concentração de anticorpos de células ARH-77 e células Raji: 2F2T e 11B8T foram testados quanto à respectiva capacidade para induzir a ADCC de ARH-77 e células Raji (n=3) em comparação com rituximab.

[0321] Uma relação dose-efeito com mAbs de CD20 foi observada em ADCC de células ARH-77 usando MNC como células efectoras (Figura 27) . Tanto o 2F2T como ο 11B8T induziram a lise especifica de células ARH-77, que foi máxima (50%) a 10 pg/ml de mAb.

Rituximab induziu apenas 25% de lise das células alvo. A adição do anticorpos de controlo isotípicos (HuMab-KLH) não induziu a ADCC. Não foi observada qualquer lise especifica sem adição de MNCs (dados não representados).

[0322] Quando as células Raji foram usadas como células alvo, emergiu uma imagem similar à das células ARH-77 (Figura 28) . Tanto o 2F2T quanto ο 11B8T induziram a lise mediada por MNC de células Raji, embora o 2F2T pareça mais potente do que o 96 11Β8Τ a baixas concentrações. A lise máxima atingida com 2F2T e 11B8T foi de aproximadamente 35%.

Rituximab induziu a lise mediada por MNC de células Raji, embora apenas 20% das células alvo tenham sido susceptiveis ao rituximab. A adição do anticorpos de controlo isotípicos (HuMab-KLH) não induziu a ADCC. Não foi observada qualquer lise especifica sem adição de MNCs (dados não representados).

Exemplo 8 Análise de insolubilidade FRET e Triton-X

[0323] Preparação de mAb conjugados com Cy3 e Cy5 para transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET): Os anticorpos monoclonais foram directamente conjugados com derivados bifuncionais NHS-éster de Cy3 e Cy5 (Amserham Biosciences UK Ltd) como descrito nas instruções do fabricante. Resumidamente, os mAb foram dialisados sobre tampão carbonato/bicarbonato 0,1 M (pH 9). Depois disso, o corante foi dissolvido em H20, adicionado imediatamente a 1 mg de mAb, e incubado à temperatura ambiente no escuro durante 45 min. Os mAbs marcados foram separados do corante não conjugado por cromatografia em gel usando uma coluna G25 PDIO-Sephadex equilibrada em PBS. As razões molares de acoplamento foram determinadas espectrof otometricamente a partir de ε552 = 150/mM/cm para Cy3, ε650 = 250/mM/cm para Cy5 e ε28ο = 170/mM/cm para proteína, e variaram de 5 a 8 vezes o excesso de corante:proteína.

[0324] Análise FRET: Células Daudi (5 x 106 células/ml) foram suspensas em PBS/BSA a 0,1%, e mAb equimolar dador conjugado (Cy3) e aceitador conjugado (Cy5) foram combinados e adicionados à suspensão celular (concentração final de 10 pg/ml). Células foram incubadas durante 30 min. no escuro, a 4 °C ou 37 °C. Cada experiência incluiu células marcadas com mAb dador e aceitador conjugado após pré-incubação com um excesso molar de 20 vezes de mAb não conjugado, e as células marcadas com mAb dador ou aceitador conjugado na presença de mAb equimolar não marcado. Para avaliar a associação de antigénios marcados, foi realizada uma medição FRET de citometria de fluxo usando uma FACScalibur (BD Biosciences). As intensidades de fluorescência a 585 nm (FL2) e 650 nm (FL3), ambas excitadas a 488 nm, e as intensidades de fluorescência a 661 nm (FL4), excitadas a 635 nm, foram detectadas e usadas para calcular a FRET de acordo com a equação abaixo, em que A é aceitador (Cy5) e D é dador (Cy3). Todos os valores obtidos foram corrigidos quanto à auto-fluorescência usando a seguinte fórmula: FRET = FL3(D,A)-FL2(DA)/a-FL4(D,A)/b em que a = FL2(D)/FL3(D) e b = FL4(A)/FL3(A) 97

Os parâmetros de correcção foram obtidos usando os dados colhidos de células marcadas únicas, e foi usada a dispersão de luz de ângulo lateral para eliminar detritos e células mortas. A FRET entre derivados de mAb dadores e aceitadores em células duplamente marcadas é expressa em termos da emissão sensibilizada de aceitador a 488 nm. Valores FRET superiores indicam maior associação fisica dos anticorpos dador e aceitador marcados ou uma densidade superior de mAb aceitador marcado na proximidade de mAb de dador marcado.

[0325] Avaliaçao de antigénio associado raft por insolubilidade de Triton X-100 (TX): Como uma avaliação rápida da presença de antigénio em microdominios raft, foi usado um método de citometria de fluxo baseado em insolubilidade de Triton X-100 (TX) a baixa temperatura, como descrito previamente. Resumidamente, as células Daudi foram lavadas em RPMI/BSA a 1% e suspensas a 2,5 x 106/ml. As células (100 μΐ) foram então incubadas com 10 pg/ml de mAb conjugado com FITC durante 15 min a 37°C, lavadas em solução fria de PBS/BSA a 1%/azida de sódio 20 mM (PBS-BS) e a amostra foi dividida em metade. Todas as amostras foram mantidas em gelo no resto do ensaio. Metade foi mantida em gelo para permitir o cálculo de 100% dos níveis de antigénio de superfície, enquanto a outra metade foi tratada com TX a 0,5% durante 15 min. em gelo para determinar a proporção de antigénios restantes na fracção raft insolúvel. As células foram então mantidas a 4 °C ao longo do resto do ensaio, lavadas uma vez em PBS-BS, suspensas em PBS-BS e avaliadas por citometria de fluxo. Para determinar o nível constitutivo de associação raft dos antigénios alvo, as células foram primeiro tratadas com TX a 0,5% durante 15 min em gelo e lavadas em PBS-BS antes da ligação de mAb marcado com FITC.

[0326] Como representado nas Figuras 29A, 29B e 29, a análise da transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) indica aglomeração de CD20 aquando da incubação com 2F2 ou 7D8. Não foi observada qualquer aglomeração após a incubação com 11B8. Estes resultados são consistentes com os dados de tratamento TX, cf. Figura 29C, (i.e., 2F2 e 7D8, ao contrário do 11B8, continuam com a fracção insolúvel da célula após a ligação) e suportam o conceito de que o 2F2 e o 7D8, após ligação, translocam o CD20 para compartimentos raft lipídicos da membrana da célula B.

[0327] Como representado na Figura 30 (valores FRET e EPM das três experiências usando ANOVA unidireccional seguido de teste post-hoc de Tukey para comparações múltiplas), a análise FRET indica aglomeração de rituximab e 2F2, ao passo que não foi observada qualquer aglomeração com 11B8T. Estes dados estão em 98 conformidade com os dados obtidos após tratamento com TX a 0,5% antes da ligação de mAbs marcados com FITC, como representado na Figura 31 (n=2).

[0328] Preparação de fracções lípidicas raft e Western blotting; Outra forma de examinar a associação de CD20 com rafts lipidicos, é investigar a distribuição de CD20 entre as fracções de membrana raft e não raft usando o método de fraccionamento de gradiente de sacarose como revelado por Deans, J.P., et al. , J. Biol. Chem., 1998. 273(1): pp 344-348, excepto que em vez de sacarose foi usada Optiprep (Sigma).

Anticorpos monoclonais direccionados contra o CD20 (10 yg/ml) foram deixados ligar-se a células Daudi (1 x 107) durante 20 min. a 37°C.

Após esta incubação, as células foram granuladas, lavadas duas vezes com PBS e lisadas em tampão de lise gelado (TX 1,0% em solução salina tamponada com MES (MES 25 mM, pH 6,5, NaCl 150 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonil 1 mM, 5 pg/ml de aprotinina, 5 pg/ml de leupeptina, EDTA 10 mM) ) . O granulado celular foi suspenso cuidadosamente e incubado durante 20 min. em gelo. Depois disso, o lisado foi misturado com 400 μΐ de Optiprep a 60% frio (Sigma) . A amostra foi sobreposta com um passo de 600 μΐ de cada um de 35%, 30%, 25%, 20%, 0% de

Optiprep em tampão de lise. Os gradientes foram centrifugados a 40.000 rpm a 4 °C durante 18 horas. Foram colhidas seis fracções do topo, resolvidas num gel de SDS-PAGE 4-15%, transfectadas sobre membranas de nitrocelulose e incubadas com anticorpo primário (polisoros anti-CD20 de rato; Serotec, RU), seguido de anticorpo secundário conjugados com HRP (HRP anti-rato de coelho; Jackson, Bar Harbor, Maine, EUA) . As manchas foram visualizadas usando substrato de longa duração

Supersignal West Dura (Pierce, Woburn, MA, EUA).

[0329] Os resultados estão apresentados na Figura 32. Como se pode observar, as moléculas de CD20 estão confinadas à fracção 5 de elevada densidade (células sem tratamento). As células tratadas com rituximab apresentaram uma troca distinta na distribuição do CD20 com uma proporção significativa nas fracções 2 e 3 da membrana de baixa densidade, coincidente com a fracção em que se espera que os rafts da membrana sedimentem. As células tratadas com 2F2 também apresentaram esta troca nas fracções 2 e 3. Por contraste, as células tratadas com 11B8T durante 20 min. apresentaram uma distribuição similar à das células sem tratamento, com moléculas de CD20 na fracção 5. Em conclusão, a ligação a 2F2 e rituximab induz uma conversão de moléculas CD20 às fracções de densidade inferior da membrana, ao passo que a ligação ao 11B8T não.

Exemplo 9 A apoptose de linhas de células Burkitt com anticorpos humanos contra o CD20 99 [0330] Apoptose: Células Daudi, 0,5 x 106 em 1 ml de meio de cultura tecidular, foram colocadas em placas de base plana com 24 poços com 1 ou 10 pg/ml de mAb ou anticorpos de controlo e incubadas a 37°C. Após 20 horas, as células foram colhidas, lavadas em tampão de ligação Anexina-V-FITC (BD Biosciences) e marcadas com Anexina V-FITC (BD Biosciences) durante 15 minutos no escuro, a 4 °C. As células foram mantidas a 4 °C até à respectiva análise. Cada amostra (150 μΐ) foi adicionada a 10 μΐ de solução IP (10 pg/ml em PBS) num tubo FACS. A mistura foi imediatamente avaliada por citometria de fluxo, utilizando um citómetro de fluxo FACScalibur com o software CellQuest pro (BD Biosciences, Mountain view, CA) . Pelo menos 10.000 eventos foram recolhidos para análise.

[0331] Indução de apoptose em células Daudi: As células Daudi foram incubadas durante 20 horas na presença de anticorpos humanos contra o CD20 (1 pg/ml) (sem adição de um anticorpo de ligação cruzada secundário). A indução da apoptose foi avaliada por coloração Anexina V/IP usando citometria de fluxo.

[0332] Como apresentado nas Figuras 33A-G, ο 11B8 revela indícios claros de induzir a apoptose (similar à induzida por um anticorpo anti-IgM) . 2F2 e 7D8 não induziram a apoptose de células Daudi. Foi usado um anticorpo murino anti-CD20 indutor de apoptose, AT80, como controlo.

[0331] Indução de apoptose em células Daudi: A indução da apoptose de células Raji foi testada com uma gama variada de concentrações de mAbs CD20. A Figura 34 mostra a percentagem de células positivas para anexina-V. Como pode ser observado na Figura 34, o mAb murino anti-CD20 humano de controlo positivo, Bl, induziu um aumento dependente da concentração na apoptose de células Raji com um máximo de aproximadamente 70% a 10 pg/ml de mAb. Ο 11B8 também foi um indutor potente da apoptose, resultando na apoptose de células Raji com um máximo de 53,4% a 10 pg/ml de mAb. Por outro lado, o 2F2 e o rituximab foram muito fracos na indução da apoptose de células Raji, com níveis apenas ligeiramente elevados de apoptose comparativamente a níveis de controlo negativos.

[0334] Indução de apoptose em células Daudi: A mesma imagem surgiu guando células Daudi foram usadas como células alvo, após a adição de 1,0 pg/ml de mAb CD20 (Figuras 35A e 35B) . Os dados na Figura 35A mostram o total de células positivas para anexina V e os dados na Figura 35B (o eixo X representando a anexina V e o eixo Y representando IP) mostram as percentagens de células Daudi na apoptose inicial (positiva para anexina V e negativa para IP) e na apoptose tardia (positiva para anexina V e positiva para IP). Novamente, tanto Bl (65,9%) 100 como 11B8T (56,3%) foram indutores potentes da apoptose (Figura 36), quando usados numa concentração de 1,0 pg/ml. A adição de 2F2T resultou num nível reduzido de células Daudi apoptóticas (17%). A adição de rituximab resultou em aproximadamente 29% de apoptose de células Daudi. A adição de anticorpos de controlo isotípicos HuMab-KLH não induziu a apoptose de células Daudi (6%).

Exemplo 10 Adesão homotipica de células com anticorpos humano contra CD20 [0335] A agregação homotipica correlaciona-se com a indução da apoptose. Assim, foi investigada a capacidade dos mAbs anti-CD20 de induzirem a agregação homotipica de células B.

[0336] Agregação homotipica de células Ramos-EHRB: Células Ramos-EHRB (0,5 x 106 em 1 ml de meio de cultura tecidular) foram incubadas a 37°C durante 4 horas na presença dos anticorpos anti-CD20 11B8, 2F2 ou 7D8 (sem ligação cruzada) e a indução da adesão homotipica foi avaliada por microscopia óptica (como descrito acima).

[0337] Como representado nas Figuras 36A-E, ο 11B8 causou uma agregação extensiva de células Ramos-EHRB (semelhante à agregação causada pelo anticorpo murino anti-CD20, AT80). 2F2 e 7D8 não induziram a agregação homotipica de células Daudi.

[0338] Agregação homotipica de células Daudi: Células Daudi foram colocadas em placas de base plana com 24 poços com 1 ou 10 pg/ml de mAb ou anticorpos de controlo e incubadas a 37 °C durante 4 horas. A extensão da agregação homotipica foi determinada por microscopia óptica. Como pode ser observado na Figura 37, o 2F2 quase não induziu a agregação homotipica de células Daudi, com 1,0 pg/ml (e 10 pg/ml, dados não representados) . 0 rituximab produziu pouca agregação homotipica de células Daudi. Pelo contrário, o anticorpo Bl foi um indutor potente da agregação homotipica.

Exemplo 11 Imunoterapia através de anticorpos humanos contra CD20 [0339] Terapêutica com dose elevada (100 pg) de 2F2 e 7D8 para ratos SCID provocados com células Daudi: Os ratos SCID foram adquiridos à Harlan UK Ltd., Blackthorn, Oxon, RU, criados e mantidos sob condições livres de patogénios. Células Daudi (2,5 x 106) foram injectadas i.v. na veia da cauda de coortes de ratos SCID com 12-16 semanas de idade, a que se seguiu 7 dias mais tarde a injecção de 100 pg de 2F2 ou 7D8 pela mesma via. Os animais foram sacrificados após apresentação de paralisia dos membros, em conformidade com as instruções do comité de ética animal. Como representado na 101

Figura 38, a sobrevivência dos ratos é prolongada após o tratamento com 2F2 ou 7D8.

[0340] Terapêutica com dose elevada (100 pg) de 2F2 e rituximab para ratos SCID provocados com células Tanoue: Células Tanoue (2,5 x 106 em 200 μΐ de PBS) foram injectadas i.v. na veia da cauda de coortes de ratos SCID (Harlan UK Ltd., Blackthorn, Oxon, RU) com 12-16 semanas de idade, a que se seguiu 7 dias mais tarde a injecção de 100 yg de (em 200 μΐ de PBS) de mAb anti-CD20 pela mesma via. Nesta experiência, o 2F2 foi comparado a rituximab e BI. Os animais foram sacrificados após apresentação de paralisia dos membros posteriores. Os resultados estão apresentados na Figura 39. No dia 39, os primeiros dois ratos de controlo morreram e pelo dia 54 todos os ratos deste grupo tinham morrido. Apenas um rato morreu neste intervalo de tempo após tratamento com 2F2 e a sobrevivência aumentou consideravelmente para os outros ratos deste grupo. Um rato morreu 81 dias após a injecção das células tumorais e os ratos restantes (60% do número total) sobreviveram para lá do término da experiência aos 100 dias pós provocação tumoral. Rituximab em contraste apenas aumentou a sobrevivência em 2 de 5 ratos (que morreram ao 66° e 83° dias após a provocação) e nenhum dos ratos sobreviveu até ao final da experiência.

No grupo Bl, a sobrevivência dos ratos SCID foi semelhantes à do grupo 2F2, tendo dois ratos morrido no dia 48 e um rato no dia 76. Neste grupo, quarenta porcento dos ratos estavam vivos no final da experiência.

[0341] Dose-resposta do tratamento com 2F2 e rituximab de ratos SCID provocados com células Daudi: Para avaliar a eficácia do 2F2 em comparação com rituximab na protecção contra a tumorogénese, foi realizada uma titulação da dose na terapêutica de ratos SCID provocados com células tumorais Daudi. As células Daudi expressam mais CD20 do que as células Tanoue e são mais sensíveis à morte in vitro. 10 grupos de ratos SCID (4 por grupo) e 1 grupo de controlo (5 ratos SCID) foram injectados com 2,5 x 106 células Daudi (em 200 μΐ de PBS) i.v. no dia 0 e depois tratados com 20, 5, 2, 0,5 ou 0,1 yg (em 200 yl de PBS) de rituximab, 2F2 ou PBS (controlo) i.v. no dia 7. Os animais foram sacrificados após apresentação de paralisia dos membros posteriores. Os resultados estão apresentados na Figura 40.

[0342] No grupo de controlo, todos os ratos morreram no intervalo de 26-29 dias. Contudo, foi observada uma clara relação dose-efeito com o 2F2 (Figura 40, gráfico superior).

Embora não tenha sido observado qualquer efeito com as doses de 0,1 yg e 0,5 yg 2F2, uma dose tão baixa quanto 2 yg de 2F2 prolongou substancialmente a sobrevivência até ao dia 41, 5 yg 102 de 2F2 prolongou a sobrevivência até ao dia 47 e 20 pg de 2F2 prolongou a sobrevivência até ao dia 50.

[0343] Em contraste, o rituximab mesmo testado na dose mais elevada de 20 pg apenas aumentou ligeiramente a sobrevivência e, assim, não foi observada qualquer relação dose-efeito nas concentrações mais baixas testadas (Figura 40, gráfico inferior).

[0344] Tratamento de ratos SCID com tumores Daudi por 11B8T e

Bl: Células Daudi (2,5 x 106) em 200 pl de PBS foram injectadas i.v. na veia da cauda de coortes de ratos SCID com 12-16 semanas de idade, a que se seguiu 7 dias mais tarde a injecção de 100 pg de 11B8 ou Bl pela mesma via. Os animais foram sacrificados após apresentação de paralisia dos membros posteriores. Nos ratos de controlo tratados com PBS, todos os ratos morreram no intervalo de 35-53 dias (Figura 41). O tratamento com 11B8T protegeu fortemente os ratos, tendo estes morrido entre 72 e 98 dias pós a provocação tumoral. No grupo de tratamento com Bl, a maior parte dos ratos sobreviveu até ao dia 98 e 40% dos ratos sobreviveu para lá do término da experiência, i.e., dia 100.

Exemplo 12 Avaliação de anticorpos anti-CD20 num modelo de xenoenxerto Daudi-luc usando ratos SCID

[0345] A ef icácia terapêutica dos anticorpos anti-CD20 foi avaliada num modelo murino no qual a proliferação de células de tumor de células B humanas é acompanhada através de imagiologia óptica externa. Neste modelo, as células tumorais são transfectadas com luciferase de pirilampo. Após administração de luciferina (Molecular Probes, Leiden, Paises Baixos) aos ratos, as células marcadas podem ser detectadas in vivo por imagiologia de bioluminescência usando uma câmara CCD de alta sensibilidade, cf. Wetterwald et al. (2002) American Journal of Pathology, 160(3):1143-1153.

[0346] As células Daudi foram transfectadas com luciferase gWIZ do Gene Therapy Systems (San Diego, CA) e cultivadas em RPMI com FCS a 10%, Pen/Strep, piruvato de sódio e 1 ug/ml de puromicina (Sigma). As células foram analisadas quanto à expressão de luciferase (expressa em RLU/1 x 105 células) num luminómetro e quanto à expressão de CD20 por FACS. 2,5 x 106 células Daudi transfectadas com luciferase/rato foram injectadas i.v. em ratos SCID. Oito após a inoculação, os ratos receberam um tratamento de dose única (10 pg) de 2F2T, 11B8T, rituximab, Bl ou anticorpo de controlo isotipico (huIgGl) (6 ratos por grupo de tratamento). Para a imagiologia, os ratos foram anestesiados por injecção i.p. com uma mistura de cetamina/xilazina/atropina. D-Luciferina sintética (sal de sódio, Molecular Probes) foi administrada 103 i.p. numa dose de 25 mg/ml. Os ratos foram então colocados numa câmara escura e após 3 min. começou o procedimento de imagiologia usando um detector CCD arrefecido com nitrogénio líquido VersArray 1300B (Roper Scientific). Os fotóes emitidos pela luciferase foram determinados ao longo de um período de exposição de 5 min.

Sob iluminação, foram captadas imagens a preto e branco para referência. Foi usado o software MetaVue (Universal Imaging Corp) para recolha de dados e análise das imagens. Foi estabelecida a significância estatística das diferenças entre grupos através de análise de variância unidireccional com pós-teste de Newman-Keuls, usando o software GraphPad PRISM, versão 3.02 (Graphpad Software Inc).

[0347] Foram colhidas semanalmente imagens da traseira dos animais. No dia 8, o dia do tratamento, a emissão de luz só foi detectada nos locais de inoculação na cauda. A formação de tumor em locais distantes foi detectada no dia 14 em todos os ratos do grupo de controlo isotipo (huIgGl) e num rato do grupo rituximab. Nas semanas seguintes, a emissão de luz aumentou continuamente. A Figura 42 fornece as imagens de todos os ratos captadas no dia 39 (31 dias após o tratamento) , nas quais a bioluminescência é representada a vermelho (áreas escuras nos ratos) (intensidade luminosa > 50 fotóes por 5 min.) enquanto sobreposição na imagem corporal a preto e branco dos ratos. A massa tumoral em cada rato foi quantificada nos dias 25, 32, 39 e 46 através da integração de sinais luminosos ao longo da superfície corporal, cf. Figura 43. 0 crescimento tumoral mais rápido foi observado no grupo de controlo isotipo. O tratamento com rituximab produziu uma inibição significativa do crescimento tumoral. Contudo, a inibição do crescimento tumoral por 2F2T, 11B8T e Bl foi significativamente mais potente (ver os níveis de significância na Tabela 2, abaixo.)

Tabela 2 Níveis de significância das diferenças na intensidade luminosa integrada entre grupos em diferentes pontos temporais

Dia 25 jDia 32 jDia 39 Dia 46 Bl vs. rituximab P > 0, 05 jp < 0, 05 jp < 0, 01 P < 0, 001 Bl vs. 11B8T P > 0, 05 jp > 0, 05 jp > 0, 05 P > 0, 05 Bl vs. 2F2T P > 0, 05 |p > 0, 05 jp > 0, 05 P > 0, 05 Bl vs. huIgGl P < 0, 001 jp < 0,001 jp < 0, 001 rituximab vs. 11B8T P > 0, 05 jp < 0.05 jp < 0, 01 P < 0, 001 rituximab vs. 2F2T P > 0, 05 jp > 0, 05 jp > 0, 05 P < 0, 001 rituximab vs. huIgGl P < 0, 001 jp > 0,05 jp < 0. 05 104 Níveis de significância das diferenças na intensidade luminosa integrada entre grupos em diferentes pontos temporais jDia 25 jDia 32 jDia 39 Dia 46 Í11B8T vs. 2F2T jp > 0,05 jp > 0, 05 jP > 0,05 Ρ > 0,05 11B8T vs. huIgGl jP < 0,001 jp < 0, 001 jp < 0,001 2F2T vs. huIgGl jp < 0, 001 jp < 0, 01 jp < 0,01

Exemplo 13 Estudo piloto e farmacocinético em macacos cinomolgos [0348] 0 objectivo foi determinar o padrão farmacocinético e os efeitos farmacológicos do 2F2 em macacos cinomolgos (cerca de 2 anos de idade; intervalo de pesos de 2,1-2,6 kg) submetidos à administração de uma infusão intravenosa diária (via veia safena) durante 4 dias consecutivos. 0 estudo também comparou os efeitos farmacológicos do rituximab para determinar o seu potencial de equivalência. Para este fim, 6 machos e 6 fêmeas de macacos cinomolgos foram distribuídos por 6 grupos de dosagem que receberam 2F2 ou rituximab em níveis de dosagem de 1,25, 6,25 e 12,5 mg/kg/dia num volume de dosagem constante de 10 ml/kg durante 4 dias consecutivos, no total 5, 25 e 50 mg/kg, respectivamente. Após a administração da última toma, os animais foram em observação pós-tratamento durante 130 dias. As práticas e procedimentos adoptados durante este estudo foram consistentes com os Princípios OCDE de boas práticas laboratoriais, conforme estabelecido pelo Departamento de Saúde do Reino Unido. Todos os animais foram observados regularmente em busca de sinais de doença ou de reacção ao tratamento e foram submetidos a exame físico. Durante o estudo foram realizados exames laboratoriais hematológicos, de coagulação, química clínica e análises à urina. Foram obtidas amostras de sangue e biópsias dos nódulos linfáticos (a partir de nódulos linfáticos superficiais) para análise por citometria de fluxo ao longo dos períodos de tratamento e de observação pós-tratamento. Os seguintes fenótipos celulares foram analisados por citometria de fluxo: CD3, CD4, CD8, CD20 e CD21.

Após a conclusão do período de observação pós-tratamento, os animais foram sacrificados e submetidos a uma necropsia detalhada.

[0349] Não se observaram quaisquer sinais clínicos adversos ou achados que se considerasse estarem relacionados com o tratamento com 2F2 ou rituximab. As Figuras 44 e 45 mostram a análise de citometria de fluxo de células que expressam CD20 e CD21 no sangue periférico dos animais tratados, respectivamente. A Figura 46 mostra a análise de citometria de fluxo de células que expressam CD20 em nódulos linfáticos. Em conjunto, ambos os fenótipos analisados durante o estudo 105 apresentam uma depleção potente e eficiente das célula B após a administração de 2F2 e rituximab a 6,25 mg/kg/dia (25 mg/kg no total) e 12,5 mg/kg/dia (50 mg/kg no total) . Para além disso, os dados mostram que o repovoamento de células que expressam o CD20 nos nódulos linfáticos e no sangue periférico de animais tratados com 2F2 recomeçou aproximadamente no dia 75 após a dosagem de 25 mg/kg e 50 mg/kg, i.e., acentuadamente mais tarde do que nos animais tratados com rituximab.

[0350] Além disso, as Figuras 47A-C mostram a análise de citometria de fluxo de subpopulações de células que expressam CD20baixoCD23+CD40elevado no sangue periférico (Y. Vugmeyster et al. (2003) Cytometry 52A:101-109).

[0351] Células de sangue periférico obtidas de macacos tratados com 2F2 ou com rituximab em níveis de dosagem de 1,25 mg/kg (Figura 47A) , 6,25 mg/kg (Figura 47B) e 12,5 mg/kg (Figura 47C), administrados em toma única diária por infusão intravenosa em 4 dias consecutivos, foram incubadas com anticorpo monoclonal murino FITC anti-CD20 humano (Coulter) à temperatura ambiente durante 10 min. Em seguida, foram adicionadas esferas de contagem em conjunto com PBS e as células foram lavadas duas vezes (300 g durante 10 min.), seguido de análise imediata de subpopulação de células que expressam CD20baixoCD23+CD40elevado vs. CD20elevado CD23+CD40baixo num citómetro de fluxo (Beckman Coulter). Os resultados de células CD20baixo CD23+CD40elevado apresentados são expressos em células por μΐ. Como pode ser observado na Figura 47, o 2F2 foi capaz de induzir uma depleção completa e prolongada das células que expressam CD20baixoCD23+CD40elevado comparativamente a rituximab.

Exemplo 14 Mapeamento de epitopos por mutagénese dirigida [0352] Os estudos de mapeamento de epitopos através de abordagem mutagénica indicaram que a alanina na posição 170 (Al 7 0) e a prolina na posição 172 (P172) da segunda alça ("loop") extracelular são críticas para o reconhecimento do CD20 humano pelos anticorpos anti-CD20 conhecidos. Em estudos por Deans e colaboradores (M.J. Polyak, et al., Blood, (2002) 99(9): pp 3256-3262; M.J. Polyak, et al., J. Immunol., (1998) 161(7): pp 3242-3248) a ligação de todos os mAbs anti-CD20 testados foi eliminada através da transformação de A170 e P172 nos respectivos resíduos murinos de CD20, S170 e S172.

Foi identificada alguma heterogeneidade no reconhecimento do epítopo AxP, contudo, a maioria dos anticorpos como o rituximab reconhece a CD20 murina com S 170 e S 172 mutados para a sequência humana A170xP172, ao passo que outros requerem a existência de mutações adicionais imediatas ao N-terminal da sequência AxP. Para verificar se o motivo A170xP172 também é importante para a ligação dos anticorpos de acordo com a invenção, a sequência AxP foi mutada para SxS 106 ,através de mutagénese dirigida (mutante AxP = A170S, P172S), as células foram transfectadas com o mutante AxP e CD20 DNA de tipo selvagem (WT) e foram comparadas as caracteristicas de ligação dos mAbs anti-CD20.

[0353] Foram preparados mutantes adicionais, P172S (mutação da prolina na posição 172 para serina) e N163D (mutação da asparagina na posição 163 para ácido aspártico), através de mutagénese dirigida para avaliar se os resíduos de aminoácidos mutados são importantes para a ligação dos anticorpos da invenção. Para realizar esta análise, foi construído um vector de expressão CD20 através da amplificação da sua sequência codificadora, utilizando para o efeito primers adequados que inserem locais de restrição e uma sequência Kozak, para uma expressão ideal. O fragmento amplificado foi digerido e ligado no vector de expressão pEE13.4. Após a transformação em E. coli, avaliaram-se as colónias relativamente a inserções e seleccionaram-se dois clones para sequenciação e confirmação da sequência correcta. Este constructo foi denominado pEE13.4CD20HS.

[0354] A mutagénese foi realizada para introdução da mutação AxP e de 20 mutações murinas nos loops extracelulares do CD20 humano. A mutagénese foi verificada através de digestão com enzimas de restrição e sequenciação. Os constructos foram transitoriamente transfectados em células CHO (para mutações AxP) ou HEK293F e analisados 24 ou 48 horas após a transfecção, através de citometria de fluxo.

[0355] Primers de oligonucleótidos para PCR: Os primers de oligonucleótidos foram sintetizados e quantificados pela Isogen BV (Maarssen, Países Baixos) . Os primers foram reconstituídos em água a uma concentração de 100 pmol/μΐ e armazenados a -20 °C, até serem necessários. A Tabela 3 inclui um sumário da PCR e a sequenciação dos primers.

[0356] Determinação da densidade óptica de ácidos nucleicos: A densidade óptica foi determinada através da utilização de um Ultrospec 2100 pro Classic (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia), de acordo com as instruções do fabricante. A concentração do DNA foi medida através da análise da OD260iw onde uma unidade de OD26onm = 50 pg/ml. A solução de referência era idêntica à utilizada para dissolver os ácidos nucleicos.

[0357] Isolamento do DNA plasmídeo a partir de culturas E. coli: 0 DNA plasmídeo foi isolado de culturas de E. coli através da utilização de kits da Qiagen, de acordo com as instruções do fabricante (Westburg BV, Leusden, Países Baixos) . Para a preparação de plasmídeos a "granel" foram utilizados um kit Hi-Speed plasmid Maxi ou um kit Hi-Speed plasmid Midi (Qiagen). A preparação de plasmídeos em pequena 107 escala (ou seja, 2 ml de cultura de E. coli) foi realizada através da utilização de um kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen) e o DNA foi eluido em 50 μΐ de TE (tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM) .

[0358] Amplificação PCR: As reacções PCR foram realizadas por polimerase de DNA Pfu- Turbo® Hotstart (Stratagene, Amsterdão, Países Baixos), de acordo com as instruções do fabricante.

Cada 20 μΐ de reacção continham 1 x tampão de reacção PCR, 200 μΜ de dNTPs misturados, 6,7 pmol de cada primer dianteiro e inverso, aproximadamente 1 ng de modelo de DNA e 1 unidade de DNA polimerase Pfu-Turbo® Hotstart. As reacções PCR foram realizadas num T-gradient Thermocycler 96 (Biometra GmbH,

Goettingen, Alemanha), utilizando um programa de 30 ciclos de: + 95 °C durante 2 minutos, seguido de 30 ciclos de: +95 °C durante 30 segundos, recozimento: gradiente de 45-65 °C durante 30 segundos e extensão: +72 °C durante 2 minutos, seguida por um passo final de extensão durante 10 minutos a 72 °C e armazenamento subsequente a 4 °C. As reacções concluídas foram analisadas por electroforese em gel de agarose.

[0359] Electroforese em gel de agarose: A electroforese em gel de agarose foi realizada de acordo com o procedimento descrito por Sambrook (Molecular Cloning Laboratory Manual, 3rd edition) , utilizando géis de 50 ml, em tampão 1 x Tris/ácido acético/EDTA (TAE). O DNA foi visualizado através da inclusão de brometo de etídio no gel e por observação sob luz UV. As imagens de gel foram capturadas por uma câmara CCD e por um sistema de processamento de imagens (GeneGnome; Syngene, Cambridge, RU).

[0360] Digestões com enzimas de restrição: As enzimas de restrição foram fornecidas pela New England Biolabs (Beverly, MA) e utilizadas de acordo com as suas recomendações. Em geral, cada 100 ng foram digeridos com 5 unidades de enzima(s) em tampão apropriado, num volume final de 10 μΐ. Os volumes de reacção foram expandidos, conforme apropriado. As digestões foram incubadas durante um período mínimo de 60 minutos, à temperatura recomendada pelo fabricante.

[0361] No caso dos fragmentos que exigem digestões duplas com enzimas de restrição que têm requisitos de tampão ou temperatura incompatíveis, as digestões foram realizadas de modo sequencial, de modo a oferecer condições favoráveis para cada enzima, alternadamente.

[0362] Tratamento com fosfatase alcalina: Foi utilizada fosfatase alcalina de camarão (USB, Cleveland, OH) , de acordo com as recomendações do fornecedor. A fosfatase alcalina remove os grupos 5' fosfato das terminações de fragmentos de 108 DNA e previne, dessa forma, a auto-ligação. Tal é de particular relevância uma vez que uma restituição da ligação de um fragmento de DNA poderia resultar num vector com competências de replicação. A enzima é activa para a maioria dos tampões de enzimas de restrição e é adicionada sempre que apropriado. Após a digestão, a enzima foi inactivada através do aumento da temperatura até 70 °C, durante 15 minutos.

[0363] Purificação dos produtos PCR e da reacção enzimática: A purificação foi realizada através da utilização de um kit de purificação MinElute PCR (fornecido pela Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as amostras de DNA foram diluídas em 5 volumes de tampão de ligação I (Qiagen) e inseridas numa coluna MinElute, no interior de um tubo de centrifugação Eppendorf. A montagem foi centrifugada numa microcentrifugadora de bancada. A coluna foi lavada duas vezes com tampão II (Qiagen) : Após aplicação do tampão, a montagem foi centrifugada e descartado o caudal de escoamento. A coluna foi seca por centrifugação, na ausência de tampão adicionado. 0 DNA foi eludido através da adição de tampão de eluição à coluna e o eluato recolhido por centrifugação. O DNA isolado foi quantificado por espectroscopia UV e a sua qualidade aferida através de electroforese em gel de agarose.

[0364] Isolamento dos fragmentos de DNA a partir do gel de agarose: Quando apropriado (ou seja, na presença de múltiplos fragmentos), as amostras de DNA digerido foram separadas por electroforese em gel, o fragmento desejado foi excisado do gel e recuperado através do kit QIAEX II Gel Extraction (Qiagen) , de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as bandas de DNA foram excisadas do gel de agarose e derretidas num tampão apropriado, a +55 °C. A resina QIAEX II foi adicionada e incubada durante 5 minutos. A resina QIAEX II foi granulada através de um breve passo de centrifugação (1 minuto, 14000 g, RT) e lavada, duas vezes, com 500 μΐ de tampão de lavagem PE. O granulado final foi seco numa hotte e o DNA foi eluído com o volume de TE e temperatura apropriados (dependendo da dimensão do DNA).

[0365] Ligação de fragmentos de DNA: As ligações foram realizadas com o Kit Quick Ligation (New England Biolabs), de acordo com as instruções do fabricante. Para cada ligação, o vector de DNA foi misturado com um excesso molar de aproximadamente 3 vezes o DNA inserido, de forma a que a quantidade total de DNA fosse inferior a 200 ng em 10 μΐ, com o ajustamento adequado do volume com água. Foram adicionados 10 μΐ de 2 x Quick Ligation Buffer e 1 μΐ de DNA ligase Quick T4 e a mistura foi incubada durante 5-30 minutos, à temperatura ambiente.

[0366] Transformação do DNA em bactérias: Foram utilizadas 109 amostras de DNA para transformar células E. coli One Shot DH5oí-T1R competentes (Invitrogen, Breda, Países Baixos), através do método de indução de choque térmico, de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, foram adicionados 1-5 μΐ de solução de DNA (tipicamente 2 μΐ de mistura de ligação de DNA) a uma alíquota de células bacterianas com competências de transformação e a mistura foi incubada em gelo, durante 30 minutos. As células foram então submetidas a choque térmico através da sua transferência para um banho-maria a 42 °C, durante 30 segundos, seguida por uma incubação adicional em gelo, durante 5 minutos. As células foram deixadas recuperar por incubação num meio de cultura não selectivo (SOC) durante 1 hora, com agitação, a 37 °C e, subsequentemente, espalhadas sobre placas de ágar com um agente selectivo apropriado (ampicilina a 50 pg/ml). As placas foram incubadas durante 16-18 horas a +37 °C ou até que as colónias de bactérias se tornassem evidentes.

[0367] Rastreio de colónias bacterianas por PCR: As colónias bacterianas foram examinadas quanto à presença de vectores com as sequências pretendidas, através da técnica PCR de rastreio de colónias. Foram adicionados 20 μΐ da mistura de reacção PCR que inclui 0,5 volumes de HotStarTaq Master Mix (Qiagen) e 4 pmol dos primers dianteiro e inverso, num tubo de FACS. O volume foi completado com água. Uma colónia foi suavemente tocada com uma ponta de pipeta de 20 μΐ, tocada uma vez em 2 ml LB num tubo de cultura (para cultivo de bactérias contendo o plasmídeo correspondente) e re-suspensa na mistura PCR de 20 μΐ. A reacção PCR foi realizada num T-gradient Thermocycler 96 (Biometra GmbH, Goettingen, Alemanha), utilizando um programa de 35 ciclos de: +94 °C durante 30 segundos, recozimento: 55°C durante 30 segundos e extensão: +72 °C durante 2 minutos, seguida por um passo final de extensão durante 10 minutos a 72 °C e armazenamento subsequente a 4 °C. As reacções concluídas foram analisadas por electroforese em gel de agarose. Consultar a Tabela 3 para detalhes acerca dos pares de primers utilizados para a PCR de colónia.

[0368] Sequenciação de DNA: As amostras de DNA plasmídeo foram enviadas à AGOWA (Berlim, Alemanha) para análise das sequências. As sequências foram analisadas usando o pacote de software VectorNTI (Informax, Frederick, MD, EUA).

Nome

Tabela 3 Aplicação

Compriment

Sequência oligonucleotidica CD20P172S jMutagénes ; 3 6 je do CD20 CD20N166D jMutagénes 39 \e do CD20

; TGGGGAGTTTTTCTCAGAGGAATTCGATGGTTCACAGTTGTA

TGTAACAGTATTGGGTAGATGGG 110

Nome | Aplicação Compriment o Sequência oligonucleotídica CD20N163D jMutagénes 36 AATCATGGACATACTTAATATTA je do CD20 cd20exfor jConstruçã 41 TATAGCCCGGGGCCGCCACCATGACAACACCCAGAAATTCA !o do CD20 cd20exrev jConstruçã 38 GCGTCTCATGTACATTAAGGAGAGCTGTCATTTTCTAT jo do CD20 peel3.4seq jPCR de 23 TCGGACATCTCATGACTTTCTTT rev2 jcolónia pConKseql |PCR de 23 GTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGC jcolónia cd20hsapmu jMutagénes 42 TGGGGAGTTTTTCAGAGGAATTCGATGGTTCACAGTTGTA tr (AxP) je do CD20 cd20hsapmu jMutagénes 42 TACAACTGTGAACCATCGAATTCCTCTGAGAAAAACTCCCCA tf (AxP) je do CD20 CD20seq2 jSequencia 23 TGTAACAGTATTGGGTAGATGGG jção do |CD2 0 cd20seql jSequencia 23 AATCATGGACATACTTAATATTA jção do jCD2 0 [0369] Mutagénese: A mutagénese foi concretizada com o kit QuikChange® XL Site-Directed. Mutagenesis (Cat. 200517-5, Lote 1120630, Stratagene Europe), de acordo com as intruções do fabricante.

[0370] As reacções de mutagénese foram concentradas utilizando precipitação com etanol e transformadas em células E. coli One Shot DH5oí-T1R competentes ou electroporadas em células ElectroTen-Blue® Electroporation Competent. As colónias foram verificadas por PCR de colónia e digestão de restrição antes da transfecção.

[0371] Transfecção de células HEK293F: As células HEK293F foram obtidas da Invitrogen e transfectadas de acordo com as instruções do fabricante, utilizando 293fectin™. As células HEK293F foram utilizadas para todas as seguências mutantes.

[0372] Transfecção de células CHO: As células CHO cultivadas até aproximadamente 95% de confluência foram transitoriamente transfectadas com CD20 de tipo selvagem, cDNA mutante ou uma combinação de ambos os constructos utilizando Lipofectamine 2000 (M668-019, Invitrogen, Breda, Países Baixos). Para este efeito, foram diluídos 24 pg da precipitação de DNA (lpg/pl) 111 em 500 μΐ de Opti-MEM, numa razão de 100% de AxP: 0% WT; 33,3 % AxP: 66,6% WT; 66,6% AxP: 33,3 % WT; 0% AxP: 100% WT 100. Foram diluídos, para cada transfecção, 24 μΐ de Lipofectamine em 500 μΐ de Opti-MEM. Então, o Lipof ectamine diluído foi incubado (RT, 5 minutos) e combinado com o DNA diluído. Após combinação suave e incubação da solução (RT, 20 minutos), foram adicionados 1000 μΐ de DNA/Lipofectamine às células CHO, a solução foi bem misturada e incubada durante 48 horas, a 37°C sob CO2 a 5%. Dois dias após a transfecção das células

CHO, estas foram lavadas, duas vezes, com tampão FACS (PBS suplementado com BSA a 0,1% e NaN3 a 0,002%) . As células CHO foram tratadas com tripsina/EDTA (Gibco BRL, Life

Technologies, Paisley, Escócia) e retiradas das placas de cultura.

[0373] Ligação do Anticorpo Anti-CD20: As células HEK293F e CHO foram inseridas em PBS a uma concentração de 2 x 106/ml e colocadas em placas de fundo redondo (1 x 105/poço). Então, foram adicionados 50 μΐ de mAb CD20, em diluições em série de 10; 5; 2,5 ou 0 pg por poço (4 °C, 30 minutos) . Após lavagem em tampão FACS (PBS suplementado com BSA a 0,1% e NaN3 a 0,002%), as células foram analisadas num citómetro de fluxo (Becton Dickinson, San Diego, CA, EUA) e recolhidos 5000 eventos por amostra, a uma taxa de fluxo elevada.

[0374] Conforme pode ser observado nas figuras 48A-E, todos os mAbs anti-CD20 se ligaram de forma eficiente a células que expressam CD20 WT. Tal como esperado, o rituximab não ligou o mutante AxP (Figura 48A) e o BI ligou-o debilmente (Figura 48D) . Em contraste, tanto 2F2 como 11B8 se ligaram igualmente bem ao mutante AxP do CD20 (Figuras 48B e 48C). A titulação da quantidade de CD20 WT na superfície titulou de facto a ligação de rituximab e Bl. Tanto 2F2 como 11B8 foram novamente insensíveis à ausência ou presença da mutação.

[0375] Este estudo indica que a ligação dos anticorpos 2F2 e 11B8 ao CD20 humano é insensível a mutações nas posições de aminoácidos 170 e 172. 2F2 e 11B8 representam então uma nova classe de mAbs CD20 que reconhecem um novo epítopo do CD20.

[0376] A Figura 49 ilustra a percentagem de ligaçao do 2F2,

11B8T, Bl e rituximab ao P172S mutante vs. CD20 WT; a Figura 49B ilustra a percentagem de ligação de 2F2T, 11B8T, Bl, CAT (CAT 13.6E12, um anticorpo IgG2A monoclonal murino anti-CD20, Diatec.Com), um anticorpo de controlo isotípico (KLH) ou rituximab ao CD20 mutante (AxP) vs. CD20 WT.

[0377] No que concerne ao mutante onde a asparagina na posição 166 foi substituída por ácido aspártico (CD20N166D), foi demonstrada uma ligação muito reduzida pelo 2F2 ao passo que Bl, rituximab e 11B8T foram capazes de estabelecer ligação 112 (ver Figura 49C) . Numa experiência semelhante, CAT13.6E12 e rituximab foram capazes de se ligar ao CD20N166D, enquanto que o 2F2T apenas demonstrou uma ligação muito reduzida (ver Figura 49D) . No que concerne ao mutante onde a asparagina na posição 163 foi substituída por ácido aspártico (CD20N163D), o rituximab, ο 11B8T e o BI foram, novamente, capazes de estabelecer ligação com o CD20N163D, enquanto o 2F2 e o 2F2T apenas demonstraram uma ligação muito reduzida (ver Figura 49C). Numa experiência semelhante, CAT13.6E12 e rituximab foram capazes de se ligar ao CD20N163D, enquanto que o 2F2T apenas demonstrou uma ligação muito reduzida, ver a Figura 4 9F.

[0378] Estas experiências indicam que o 2F2 e ο 11B8 se ligam a diferentes epítopos.

Exemplo 15 Mapeamento de epítopos utilizando o método Pepscan [0379] Síntese de péptidos: Foram sintetizados péptidos 7-, 9- e 15-mer, de acordo com as técnicas padrão. Nalguns casos, a ligação química das pernas de um péptido 15-mer ajuda a identificar as sequências de aminoácidos de um epítopo potencialmente descontínuo. De acordo com procedimentos conhecidos (H.M. Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad Sei. USA, 81:3998; J.W. Slootstra et al. (1996) Mol. Divers. 1:87; e WO 01/60769), foram sintetizados péptidos 7-, 9- e 15-mer que poderiam ser eventuais locais de ligação ou epítopos envolvidos na ligação do 2F2 ou 11B8 à molécula do CD20 humano. 9- e 15-mer foram sintetizados como loops e analisados através de cartões mini-PEPSCAN em forma de cartão de crédito (formato/cartão de 455 péptidos). Em todos os péptidos em loop foram substituídos aminoácidos em diversas posições por uma cisteína (por exemplo, acetilo-XCXXXXXXXXXXXCX-minicard). Os péptidos foram sintetizados através de métodos padronizados de química Fmoc e desprotegidos com detritívoros. Subsequentemente, os péptidos desprotegidos foram colocados em reacção no microarranjo com uma solução a 0,5 mM de 1,3-bis(bromometil)benzeno em bicarbonato de amónio (20 mM, pH 7,9), suplementada com acetonitrilo (1:1 (v/v)). Os microarranjos foram gentilmente agitados na solução durante 30-60 minutos, quando totalmente cobertos pela mesma. Finalmente, os microarranjos foram extensivamente lavados com excesso de H2O Millipore e alvo de sonicação num tampão de disrupção contendo dodecilsulfato de sódio a 1%, β- mercaptoetanol a 0,1%, em PBS (pH 7,2) a 70°C durante 30 minutos, seguida de nova sonicação em H2O Millipore, por mais 45 minutos. Em seguida, os micropoços estavam prontos para análise num ensaio ELISA.

[0380] Ensaio ELISA Pepscan: Os cartões de polietileno em formato de cartão de crédito de 455 poços, contendo os 113 péptidos ligados de forma covalente, foram incubados com soro (diluído a 1:1000 em solução de bloqueio que contém 5% de soro de cavalo (v/v) e 5% de ovalbumina (p/v) ) (4 °C, durante a noite). Após a lavagem, os péptidos foram incubados em anticorpo humano anti-peroxidase (diluição de 1:1000, 1 hora, 25 °C) e, após a lavagem do substrato de peroxidase, foram adicionados sulfonato de 2,2'-azino-di-3-etilbenzotiazolina e 2 μΐ/ml de H202 a 3%. Após uma hora, foi medido o desenvolvimento da cor. O desenvolvimento da cor do ensaio ELISA foi quantificado com uma câmara CCD e com um sistema de processamento de imagens. A instalação é composta por uma câmara CCD e uma lente de 55 mm (Câmara de Video Sony CCD XC- 77RR, Nikon micro-nikk ou lentes de 55 mm f/2,8), um adaptador de câmara (Sony Camera Adaptor DC-77RR) e pelo pacote de software de processamento de imagens Óptimas, versão 6.5

(Media Cybernetics, Silver Spring, MD 20910, E.U.A.). O Óptimas é executado num sistema informático com um processador Pentium II.

[0381] As absorvâncias (valores OD) para os péptidos a diferentes concentrações de anticorpos são apresentadas abaixo nas Tabelas 4 e 5.

Tabela 4 wwwwwwwwwwwwssssssssssssssssssswwwwwwww. j11B8i11B8Í7D8 ! 10 100 10 jug/m jug/m jug/m μ ji ji 7D8 rituximÍ2F2 (2F2 100 ab 10|l0 100 pg/m jug/ml ipg/m |ug/m 1 1 μ ! BI 10 ug/m 1 BI 100 ug/m 1 KMECLNFIRAHCPYI |763 12 997 ! 134 41 I 90 j 4 8 I 66 147 304 LKMECLNFIRCHTPY ! 165 1738 il 60 41 12 0 14 9 87 179 216 KNESCNFIRACTPYI (625 13090 1142 52 123 ! 3 9 78 170 308 MESLCFIRAHCPYIN Π 79 1956 1127 55 1102 ! 41 65 119 178 CFIRAHTPC |188 1534 ; 181 69 1134 ij 91 1114 170 212 CIRAHTPYC ]151 | 4 4 9 186 60 1132 I57 I 92 151 195 CRAHTPYIC (427 j1605 1188 64 ! 145 (48 | 87 179 216 CAHTPYINC ! 17 9 1452 1174 65 j 125 ij 42 j 10 6 161 172 IPAGIYA 1217 | 950 ! 164 76 1177 ! 4 8 185 165 192 PAGIYAP |449 (2501 170 64 1111 (4 3 (85 165 300 AGIYAPI ! 2 51 12207 188 73 1110 j 4 4 1 98 187 143 GIYAPIC 99 s 2 51 152 64 1141 (34 j 93 177 147 114 11B8 jllB8 10 ] 100 pg/m jpg/m 1 I1 7D8 10 pg/m 1 7D8 jrituxim 100 ab 10 pg/m jug/ml i | 2F2 |2F2 10 1100 pg/m jpg/m 1 I1 BI 10 pg/m 1 BI 100 pg/m 1 IYAPICV 137 1313 174 58 1159 58 | 99 175 90 GIYAPIA 172 | 857 177 96 1156 62 ! 96 165 121 IYAPIAV 161 ] 654 181 58 1116 62 17 6 161 106

Tabela 5 11B8 10 7D8 10\rituximab 10|2F2 10 — pg/ml pg/ml jpg/ml jpg/ml PCINIYNAEPANPCE 118 1163 j 152 | 65 YCNIYNAEPANPSCK 287 1181 12 418 186 ICIYNAEPANPSECN 138 1192 1142 17 8 NCYNAEPANPSEKCS 93 j 121 |2 64 9 49 ICNAEPANPSEKNCP 115 1165 |3283 43 YCAEPANPSEKNSCS 106 1188 13 7 7 0 | 65 NCEPANPSEKNSPCT 159 1183 1347 6 61 ACPANPSEKNSPSCQ 146 1148 j 2 5 0 j 77 ECANPSEKNSPSTCY 134 117 9 i 188 j 68 [0382] Como é apresentado na Tabela 4, ο 11B8 apresentou ligação a AGIYAP do primeiro loop extracelular pequeno do CD20 humano tanto a 10 pg/ml como a 100 pg/ml, ao passo que os outros anticorpos testados não revelaram uma ligação significativa a AGIYAP.

[0383] Além disso, ο 11B8 apresentou ligação a MESLNFIRAHTPYI do segundo loop extracelular do CD20 humano tanto a 10 pg/ml como a 100 pg/ml, ao passo que os outros anticorpos testados não revelaram uma ligação significativa a MESLNFIRAHTPYI.

[0384] Como é apresentado na Tabela 5, o rituximab apresentou ligação a EPANPSEK do segundo loop extracelular do CD20 humano tanto a 1 pg/ml como a 10 pg/ml, ao passo que os outros anticorpos testados não revelaram uma ligação significativa a EPANPSEK.

Exemplo 16 Anticorpos anti-idiotipicos [0385] Geração de anticorpos anti-idiotipicos: Anticorpos anti-idiotipicos de rato foram produzidos através da imunização de ratos Balb/C com 2F2 ou 11B8T, e geração de 115 hibridomas a partir de baços desses ratos por fusão com células de mieloma NS1 usando técnicas padrão. Foram gerados os seguintes anticorpos anti-idiotipicos: anti-2F2 sab 1.1, anti-2F2 sab 1.2, anti-2F2 sab 1.3, anti-llB8T sab 2.2, anti-11B8T sab 2.3, anti-llB8T sab 2.4, anti-llB8T sab 2.5 e anti-11B8T sab 2.6. Estes foram testados para ligação especifica a 2F2T, 7D8 e 11B8T. Placas ELISA foram revestidas com 2F2T, 7D8 ou 11B8T purificados (diluidos em PBS numa concentração final de 1-2 pg/ml, 37 °C, 2 horas) . As placas foram bloqueadas com PBS com Tween-20 a 0,05% e soro de galinha a 2% (RT, 1 hora). Subsequentemente, as placas foram incubadas com sobrenadantes a partir de culturas dos anticorpos anti-idiotípicos (concentração final ajustada para 1-10 pg/ml, RT, 2 horas). Os anticorpos anti-idiotípicos de rato ligados foram detectados com anticorpo IgG de coelho anti-rato conjugado com HRP (Jackson ImmunoResearch).

[0386] Como representado na Figura 50, os anticorpos anti-2F2 sab 1.1, anti-2F2 sab 1.2 e anti-2F2 sab 1.3 ligam-se a 2F2T e 7D8, mas não a 11B8T ou a um anticorpo humano de controlo isotipo não relacionado. Uma vez que 2F2T e 7D8 são extremamente homólogos na sequência VL e VH, era esperada uma reacção dos anticorpos idiotípicos anti-2F2 ao 7D8.

[0387] A Figura 51 mostra que anti-llB8T sab 2.2, anti-llB8T sab 2.3, anti-llB8T sab 2.4, anti-llB8T sab 2.5 e anti-llB8T sab 2.6 se ligam todos ao 11B8T numa proporção semelhante.

[0388] Anticorpos anti-idiotípicos como ferramenta de imunodiagnóstico: Os anticorpos anti-idiotípicos específicos para 2F2/7D8 e 11B8T podem ser usados como ferramenta de imunodiagnóstico para detectar e quantificar níveis de anticorpos humanos monoclonais contra o CD20 em amostras laboratoriais ou de doente. Isto pode ser útil para examinar a farmacocinética do anticorpo anti-CD20 ou para determinar e ajustar a dosagem do anticorpo anti-CD20 e para monitorizar a doença e o efeito de tratamento num doente. Como um exemplo deste ensaio, as placas ELISA foram revestidas com 4 pg/ml de anti-2F2 sab 1.1, anti-2F2 sab 1.2 ou anti-2F2 sab 1.3. As placas foram bloqueadas com PBS com Tween-20 a 0,05% e soro de galinha a 2% (RT, 1 hora) . Subsequentemente, as placas foram incubadas com uma diluição em série de 2F2T (10.000-9,77 ng/ml, RT, 2 horas) . 2F2T ligado foi detectado com anticorpo IgG anti-humano de rato conjugado com HRP. Como representado nas Figuras 52A-C, foi observada uma ligação dependente da dose do 2F2T.

Equivalentes [0389] Os especialistas na arte conhecerão ou serão capazes de determinar usando apenas a experimentação de rotina, muitos 116 equivalentes das modalidades especificas da invenção aqui descritas. Tais equivalentes destinam-se a ser englobados pelas reivindicações que se seguem. Qualquer combinação das modalidades reveladas nas reivindicações anexas está também contemplada no âmbito da invenção. LISTA DE SEQUÊNCIAS [0390] <110> Genmab, Inc. et al. <120> ANTICORPOS MONOCLONAIS HUMANOS CONTRA CD20

<130> GMI-055PC <150> US 60/419,163 <151> 2002-10-17 60/460,028 1 424 DNA 1 2 122 PRT 2

<150> US <151> 2002-04-02 <160> 57 <170> FastSEQ para Versão 4.0 do Windows <210> <211> <212> <213> Homo sapiens <400> atggagttgg gactgagctg gattttcctt ttggctattt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg gcaggtccct gagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac ctttaatgat tatgccatgc actgggtccg gcaagctcca 180 gggaagggcc tggagtgggt ctcaactatt agttggaata gtggttccat aggctatgcg 240 gactctgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaagtc cctgtatctg 300 caaatgaaca gtctgagagc tgaggacacg gccttgtatt actgtgcaaa agatatacag 360 tacggcaact actactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 420 tcag 424 <210> <211> <212> <213> Homo sapiens <400>

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser ile Gly Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ile Gin Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai Trp 100 105 110 Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> <211> <212> 3 382

DNA <213> Homo sapiens 117 <400> atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgatcac cttcggccaa 360 gggacacgac tggagattaa ac 382 <210> <211> <212> <213> Homo sapiens <400>

Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> <211> <212> <213> Homo sapiens <4 0 0> atggagttgg gactgagctg gattttcctt ttggctattt taaaaggtgt gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtacagcctg acaggtccct tgtgcagcct ctggattcac ctttcatgat tatgccatgc actgggtccg gggaagggcc tggagtgggt ctcaactatt agttggaata gtggtaccat gactctgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaactc caaatgaaca gtctgagagc tgaggacacg gccttgtatt actgtgcaaa tacggcaact actactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt tcag <210> <211> <212> <213> Homo sapiens <400> 3 4 107 PRT 4 5 424 DNA 5 ccagtgtgaa 60 gagactctcc 120 gcaagctcca 180 aggctatgcg 240 cctgtatctg 300 agatatacag 360 caccgtctcc 420 424 6 122 PRT 6

Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Asp Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe His Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ile Gin Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai Trp 100 105 110 Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 118

Homo sapiens 1 382 DNA 7 <210> <211> <212> <213> <4 Ο 0> atggaagccc cagctcagct tctcttcctc gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc ggccaggctc ccaggctcct catctatgat aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag gggacacgac tggagattaa ac ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 gcatccaaca gggccaotgg catcccagcc 240 ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300 cgtagcaact ggccgatcac cttcggccaa 360 382 <210> <211> <212> <213> Homo sapiens <400>

Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 55 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu ile Lys 100 105 <210> <211> <212> <213> Homo sapiens <4 0 0> gccâfrccccf: cgd 333 acaaaagapF (rcpgíragcaa cccccgcaac g^aascaccp aaaaccggaa agccgcaâcc ^30 spasrgcgdcc câgagãccâg aagcgcââci: afrâjrgpcgcF âpacggagag 3ço fccdcaggaa âccagcjrcgc cgccpccsag âgcggcaircg gaggccccn: acgcccírcgg 300 aagggsaapc Fââggpâaap gpcggFFSfFF aaascFaapâ âpâfcgcgFg cpgf:ac9agc 5^0 câcgcgaacc cpad^Fccgc cFfcgacF^c cgcSccgcâc gffaââccca ccgââcjrccg i80 aFFcgacpaa (racgapcFaa aaagaacFpa apgcgfccca aaaaapcccF agagcFcpcc 130 g^sagaccaa aaccagacca aacFFFccpF airpacfgjrgí: pggggaaFap ccgapacaga eo <210> <211> <212> <213> Homo sapiens 8 107 PRT 8 9 433 DNA 9

10 125 PRT 119 <4 0 0>

Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Gly Gly Leu Vai His Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr His 20 25 30 Ala Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ile He Gly Thr Gly Gly Vai Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Vai Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Tyr Tyr Gly Ala Gly Ser Phe Tyr Asp Gly Leu Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 125 <210> <211 > <212> <213> Homo sapiens <40 0> atggaagccc cagcacagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 180 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 300 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcgact ggccgctcac tttcggcgga 360 gggaccaagg tggagatcaa ac 382 <210> <211> <212> <213> Homo sapiens <400> Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asp Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu ile Lys 100 105 <210> <211> <212> <213> Homo sapiens <4 0 0>

Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> <211> <212> <213> Homo sapiens <400> αιλ I ? J0 12 χμχ IJ6 2SJ1 xnb yau gst QjX 3®*· lis GT^ χλχ. yjsr yab sei Λ^Τ Γλβ 10 11 382 DNA 11 12 107 PRT 12 13 5 PRT 13 14 17 PRT 14 120 15 13 PRT 15 Ηο/ηο sapiens <210> <211 > <212> <213> <4 Ο 0>

Asp Ile Gin Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai 15 10 <210> <211> <212> <213> <400>

Homo sapiens

Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10 <210> <211> <212> <213> <4 0 0>

Homo sapiens 16 11 PRT 16 17 7 PRT 17

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 18 9 PRT 18

Homo sapiens <210> <211> <212> <213> <400> Ί 2

Gju Gju 3GX ysu j,iJb ije χμι.

Homo sapiens Ijs CJU lAz GIX vau χλΓ, ^Xt GJX WS(; V3b ASfJ <210> <211> <212> <213> Homo sapiens <4 0 0>

Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> <211> <212> <213> Homo sapiens <400>

Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Ile 1 5

Gly <210> <211> <212> <213> <400>

J yab 19 5

PRT 19 20 17

PRT 20

Gly Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 10 15 21 13

PRT 21 121 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 23 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Ile Thr 1 5 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 25 Tyr His Ala Met His 1 5 <210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Ile Ile Gly Thr Gly Gly Vai Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys Gly 1 5 10 15 <210> <211> <212> <213> <400> Λ3Τ 7

Homo sapiens 27 17 PRT 27 ΙΟ Τ2 yab ιΛε- χλχ ejA yjs ejA gsi. bps χλχ yab οΐλ rsn χλχ ejA wep yab <210 <211 <212 <213 <400 > > > > Homo sapiens > 28 11 PRT 28

Arg 1 <210 <211 <212 <213

Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser 5 > >

Tyr

Leu Ala 10 > > Homo sapiens

29 7 PRT 122 29 29 Homo sapiens DNA Sequência artificial gctgtgcccc cagaggtgct cttggagg gaggtgcagc tggtgcagtc <400>

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 s <210> <211> <212> <213> <400>

Gin Gin Arg. Ser Asp Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> primer <4 0 0> gcaggcacac aacagaggca gttccagatt tc 32 <210> <211> <212> <213> Sequência artificial <22 0> <223> primer <4 0 0> 28 <210> <211> <212> <213> Sequência artificial <22 0> <223> primer <4 0 0> 20 caggtkcagc tggtgcagl <210> <211> <212> <213> Sequência artificial <22 0> <223> primer <4 0 0> 20 saggtgcagc tgktggagl <210> <211> <212> <213> Sequência artificial <22 0> <223> primer <4 0 0> 20 <210> <211> 30 9 PRT 30 31 32

31 32 28 DNA

32 33 20 DNA

33 34 20 DNA

34 35 20 DNA 35 36 21 123 <212> <213> <22 0> <223> <400> 21 <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <400> 20 <210> <211> <212> <213> <22 0> <22 3> <400> 20 <210> <211> <212> <213> <22 0> <22 3> <400> 21 <210> <211> <212> <213> <22 0> <22 3> <400> 20 <210> <211> <212> <213> <22 0> <22 3> <400> 21 <210> <211> <212> <213>

DNA

Sequência artificial primer atggactgga cctggagcat c Sequência artificial primer atggaattgg ggctgagctg Sequência artificial primer atggagtttg grctgagctg Sequência artificial primer atgaaacacc tgtggttctt c Sequência artificial primer atggggtcaa ccgccatcct Sequência artificial primer tgccaggggg aagaccgatg g Sequência artificial

36 37 20 DNA

37 38 20 DNA

38 39 21 DNA

39 40 20 DNA

40 41 21 DNA

41 42 20 DNA 124 <22 0> <223> primer <400> 42 20 racatccaga tgayccagtc <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> primer <400> 43 20 gycatcyrga tgacccagtc <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <22 3> primer <400> 44 20 gatattgtga tgacccagac <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <22 3> primer <4 0 0> 45 20 gaaattgtgt tgacrcagtc <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <22 3> primer <4 0 0> 46 20 gaaatwgtra tgacacagtc <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <22 3> primer <400> 47 20 gatgttgtga tgacacagtc <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <22 3> primer 125 48 <400> 20 <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <400> 24 <210> <211> <212> <213> <22 0> <22 3> <400> 23 <210> <211> <212> <213> <22 0> <22 3> <400> 26 <210> <211> <212> <213> <22 0> <22 3> <4 0 0> 27 <210> <211> <212> <213> <22 0> <22 3> <400> 20 <210> <211> <212> <213> gaaattgtgc tgactcagtc Sequência artificial primer cccgctcagc tcctggggct cctg Sequência artificial primer ccctgctcag ctcctggggc tgc Sequência artificial primer cccagcgcag cttctcttcc tcctgc Sequência artificial primer atggaaccat ggaagcccca gcacagc Sequência artificial primer cgggaagatg aagacagatg Homo sapiens

49 24 DNA

49 50 23 DNA

50 51 26 DNA

51 52 27 DNA

52 53 20 DNA

53 54 116 PRT 126 54 55 139 PRT 55

56 141 PRT <400>

Met Glu 1 Leu Gly Leu 5 Ser Trp Vai Phe Leu 10 Val Ala Ile Leu Glu 15 Gly Vai Gin Cys Glu 20 Vai Gin Leu Vai Gin 25 Ser Gly Gly Gly Leu 30 Val His Pro Gly Gly 35 Ser Leu Arg Leu Ser 40 Cys Ala Gly Ser Gly 45 Phe Thr Phe Ser Ser 50 Tyr Ala Met His Trp 55 Val Arg Gin Ala Pro Gly 60 Lya Gly Leu Glu Trp 65 Vai Ser Ala Ile Gly 70 Thr Gly Gly Gly 75 Thr Tyr Tyr Ala ASp 80 Ser Vai Lys Gly Arg 85 Phe Thr Ile Ser Arg 90 Asp Asn Ala Lys Asn 95 ser Leu Tyr Tyr Cys Leu Ala 115 Gin 100 Arg Met Asn Ser Leu Arg 10S Ala Glu Asp Met Ala 110 Val Tyr <210> <211> <212> <213> Homo sapiens <4 Ο 0>

Met Glu Ala Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu : Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Sfer Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45 Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser 100 105 110 Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 <210> <211> <212> <213> Homo <400> Met Glu Leu ' sapiens Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ile Leu Lys Gly 56 1 Val Gin Cys Glu 5 Val Gin Leu Val Glu 10 Ser Gly Gly Gly Leu 15 Val Gin Pro Gly Arg 20 Ser Leu Arg Leu Ser 25 Cys Ala Ala Ser Gly 30 Phe Thr Phe Asp Asp 35 Tyr Ala Met His Trp 40 Val Arg Gin Ala Pro 45 Gly Lys Gly Leu Glu 50 Trp Val Ser Gly Ile 55 Ser Trp Asn Ser Gly 60 Ser Ile Gly Tyr Ala 65 Asp Ser Val Lys Gly 70 Arg Phe Thr Ile Ser 75 Arg Asp Asn Ala Lys 80 Asn Ser Leu Tyr Leu 85 Gin Met Asn Ser Leu 90 Arg Ala Glu Asp Thr 95 Ala Leu Tyr Tyr Cys 100 Ala Lys Asp Ile Asp 105 Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr 110- Tyr Gly Met Asp <210 Val 130 > 115 Trp Gly Gin Gly Thr 135 120 Thr Val Thr Val Ser 140 125 Ser 57 127 127 <211 > PRT <212> <213> Homo sapiens <400> 57 Met 1 Glu Ala Pro Ala 5 Gin Leu Leu Phe Leu 10 Leu Leu Leu Trp Leu 15 Pro Asp Thr Thr Gly Glu 20 Ile Vai Leu Thr 25 Gin Ser Pro Ala Thr 30 Leu Ser Leu Ser Pro 35 Gly Glu Arg Ala Thr 40 Leu Ser Cys Arg Ala 45 Ser Gin Ser vai Ser 50 Ser Tyr Leu Ala Trp 55 Tyr Gin Gin Lys Pro 60 Gly Gin Ala Pro

Ile Pro Ala 80 Thr Ile Ser 95 Gin Arg Ser 110 Ile Lys

Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly 65 70 75

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Aap Phe Thr Leu 85 90

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin 100 105

Asn Trp Pro Ile Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu 115 120 125 128

Claims (40)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo monoclonal humano isolado que estabelece ligação com o CD20 humano, capaz de induzir a citotoxicidade dependente do complemento (CDC) de células que expressam CD20 na presença de complemento e que inclui: (i) uma região CDR1 da cadeia leve que contém a sequência de aminoácidos definida na SEQ. ID N.° 16, uma região CDR2 da cadeia leve que contém a sequência de aminoácidos definida na SEQ. ID N.° 17 e uma região CDR3 da cadeia leve que contém a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ. ID N.0 18; (ii) CDR3 da cadeia pesada que tem a sequência estabelecida na SEQ. ID N.° 15. (a) uma região CDR1 da sequência de aminoácidos 13 e uma região CDR2 da sequência de aminoácidos 14; ou (b) uma região CDR1 da sequência de aminoácidos 19 e uma região CDR2 da sequência de aminoácidos 20; e (iii) uma região de aminoácidos cadeia pesada que contém a estabelecida na SEQ. ID N.° cadeia pesada que contém a estabelecida na SEQ. ID N.° cadeia pesada que contém a estabelecida na SEQ. ID N.° cadeia pesada que contém a estabelecida na SEQ. ID N.°
2. 2. O anticorpo da reivindicação 1, que compreende as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada e as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve de um anticorpo que contém a sequência da região variável da cadeia pesada estabelecida na SEQ. ID N.° 2 e a sequência da região variável da cadeia leve estabelecida na SEQ. ID N.0 4.
3. 3. O anticorpo da reivindicação 1 ou 2, que compreende uma sequência da região variável da cadeia pesada que é idêntica à sequência da região variável da cadeia pesada estabelecida na SEQ. ID N.° 2 em, pelo menos, 90% e uma sequência da região variável da cadeia leve que é idêntica à sequência da região variável da cadeia leve estabelecida na SEQ. ID N.° 4 em, pelo menos, 90%.
4. 4. O anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, que compreende a sequência da região variável da cadeia pesada estabelecida na SEQ. ID N.° 2 e a sequência da região variável da cadeia leve estabelecida na SEQ. ID N.° 4.
5. 5. O anticorpo da reivindicação 3 ou 4, em que a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve 1 sao codificadas pelas sequências de nucleótidos estabelecidas nas SEQ. ID N.0 1 e 3.
6. 6. 0 anticorpo da reivindicação 1, que compreende as reqiões CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada e as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve de um anticorpo que contém a sequência da região variável da cadeia pesada estabelecida na SEQ. ID N.° 6 e a sequência da região variável da cadeia leve estabelecida na SEQ. ID N.0 8 .
7. 7. 0 anticorpo da reivindicação 1 ou 6, que compreende uma sequência da região variável da cadeia pesada que é idêntica à sequência da região variável da cadeia pesada estabelecida na SEQ. ID N.0 6 em, pelo menos, 90% e uma sequência da região variável da cadeia leve que é idêntica à sequência da região variável da cadeia leve estabelecida na SEQ. ID N.° 4 em, pelo menos, 90%.
8. 8. O anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1, 6 e 7, que compreende a sequência da região variável da cadeia pesada estabelecida na SEQ. ID N.° 6 e a sequência da região variável da cadeia leve estabelecida na SEQ. ID N.° 8.
9. 9. O anticorpo da reivindicação 7 ou 8, em que a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve são codificadas pelas sequências de nucleótidos estabelecidas nas SEQ. ID N.0 5 e 7.
10. 10. Um anticorpo monoclonal humano isolado que se liga ao CD20 humano, que é capaz de induzir a citotoxicidade dependente do complemento (CDC) de células que expressam CD20 na presença de um complemento e que se liga a um epítopo no CD20 humano definido pelo anticorpo de qualquer uma das reivindicações 4, 5, 8 e 9.
11. 11. O anticorpo de qualquer uma das reivindicações precedentes, que é um anticorpo IgGl, IgG3 ou IgM.
12. 12. 0 anticorpo da reivindicação 11, que esteja intacto e glicosilado numa célula eucariótica.
13. 13. O anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 11, que é um anticorpo de cadeia simples.
14. 14. Um fragmento de anticorpo do anticorpo de qualquer uma das reivindicações precedentes que estabelece ligação com o CD20 humano.
15. 15. O fragmento de anticorpo da reivindicação 14 que é uma proteína de fusão do domínio de ligação da imunoglobulina que compreende (i) um polipéptido do domínio de ligação sob a 2 forma de uma região variável da cadeia pesada ou leve como definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 5 e 7 a 9 fundido com polipéptido da região de dobradiça da imunoglobulina, (ii) uma região constante CH2 da cadeia pesada da imunoglobulina fundida com a região de dobradiça e (iii) uma região constante CH3 da cadeia pesada da imunoglobulina fundida com a região constante CH2.
16. 16. Um transfectoma compreendendo ácidos nucleicos que codificam uma cadeia humana pesada e uma cadeia humana leve, em que o transfectoma produz uma quantidade detectável do anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
17. 17. Uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica que produz o anticorpo da reivindicação 4, 5, 8 ou 9.
18. 18. Uma planta ou animal não-humano transgénico que produz o anticorpo da reivindicação 4, 5, 8 ou 9.
19. 19. Um vector de expressão que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica a região variável de uma cadeia leve, pesada ou das cadeias leve e pesada do anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e, opcionalmente, a região constante da cadeia leve, pesada ou das cadeias leve e pesada do anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
20. 20. Uma composição que compreende o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou o vector de expressão da reivindicação 19 e um veiculo farmacologicamente aceitável.
21. 21. Uma composição que compreende o anticorpo da reivindicação 4 e um anticorpo que contém regiões variáveis das cadeias humanas pesada e κ leve que contém as sequências de aminoácidos estabelecidas na SEQ. ID N.° 10 e na SEQ. ID N.° 12, respectivamente.
22. 22. Uma composição da reivindicação 20 ou 21 que compreende ainda um agente terapêutico.
23. 23. A composição da reivindicação 22, em que o agente terapêutico é seleccionado entre um agente citotóxico ou radiotóxico, um imunossupressor, um agente de modulação imunológico, tal como uma citocina ou uma quimiocina, doxorrubicina, cisplatina, bleomicina, carmustina, clorambucil, ciclofosfamida, anticorpos anti-CD25, anti-CD19, anti-CD21, anti-CD22, anti-CD37, anti-CD38, anti-IL6R, anti-IL8, anti-IL15, anti-IL15R, anti-CD4, anti-CDlla, anti- integrina alfa-4/beta-l (VLA4), CTLA4-Ig e anti-C3b(i).
24. 24. 0 anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 13, 3 que compreende ainda um ligante quelante para a fixação de um radioisótopo.
25. 25. Um imunoconjugado que compreende um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ligado a um agente citotóxico, radioisótopo ou um fármaco.
26. 26. Uma molécula biespecífica que compreende um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou um fragmento de anticorpo da reivindicação 14 e uma especificidade de ligação para uma célula efectora humana, um receptor Fc humano ou para um receptor de células T, como o CD 3 .
27. 27. Um método in vitro para a eliminação ou inibição do crescimento de uma célula que expressa CD20, que compreende colocar a célula em contacto com uma quantidade eficaz de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, de forma a que o crescimento da célula seja inibido ou que esta seja eliminada.
28. 28. A utilização de um anticorpo, composição, vector de expressão, imunoconjugado ou molécula biespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e 19 a 26 no fabrico de um medicamento para o tratamento ou prevenção do linfoma de células B, linfoma de células B não-Hodgkin, leucemia/linforna linfoblástico de percursores de células B e neoplasias de células B, tais como a leucemia linfocítica crónica de células B (CLL)/linforna de pequenos linfócitos (SLL), leucemia prolinfocitica de células B, linfoma linfoplasmocítico, linfoma de células do manto (MCL) , linfoma folicular (FL), linfoma do centro folicular, linfoma de células B da zona marginal (tipo MALT, nodular e esplénico), tricoleucemia, linfoma difuso de grandes células B, linfoma de Burkitt, plasmocitoma, mieloma de células plasmáticas, distúrbio linfoproliferativo pós-transplante, macroglobulinemia de Waldenstrõm, linfoma anaplástico de grandes células (ALCL), granulomatose linfomatóide, linfoma de efusão primária, linfoma intravascular de grandes células B, linfoma mediastinal de grandes células B, doenças da cadeia pesada (incluindo as doenças γ, μ, e α) , linfomas induzidos pela terapia com agentes imunossupressores, tais como os linfomas induzidos pela ciclosporina e pelo metotrexato.
29. 29. A utilização da reivindicação 28 em que a doença é o linfoma folicular (FL) ou a leucemia linfocítica crónica de células B (CLL)/linfoma de pequenos linfócitos (SLL).
30. 30. Um anticorpo humano, composição, vector de expressão, imunoconjugado ou molécula biespecífica de acordo com as reivindicações 1 a 13 e 19 a 26 para utilização num método de 4 tratamento ou prevenção de uma doença imunológica com o envolvimento de células imunitárias que expressam CD20, em que o referido método para o tratamento da doença inclui, opcionalmente, a morte de células B produtoras de anticorpos contra autoantigénios.
31. 31. A utilização de um anticorpo, composição, vector de expressão, imunoconjugado ou molécula biespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e 19 a 26 na produção de um medicamento para o tratamento ou prevenção da psoriase, artrite psoriática, dermatite, esclerodermia ou esclerose sistémica, doença inflamatória intestinal (DII), doença de Crohn, colite ulcerosa, sindrome de dificuldade respiratória, meningite, encefalite, uveite, glomerulonefrite, eczema, asma, aterosclerose, deficiência da adesão leucocitária, esclerose múltipla, sindrome de Raynaud, sindrome de Sjõgren, diabetes juvenil, doença de Reiter, doença de Behçet, nefrite mediada por complexos imunes, nefropatia por IgA, polineuropatias IgM, trombocitopenia imunomediada, tal como púrpura trombocitopénica idiopática aguda e púrpura trombocitopénica idiopática crónica, anemia hemofílica, miastenia grave, nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistémico, artrite reumatóide (AR), dermatite atópica, pênfigo, doença de Graves, tiroidite de Hashimoto, granulomatose de Wegener, sindrome de Omenn, insuficiência renal crónica, mononucleose infecciosa aguda, HIV e doenças associadas ao vírus da Herpes.
32. 32. A utilização da reivindicação 31, em que a doença auto-imune é a artrite reumatóide (AR).
33. 33. Um método in vitro para a detecção do antigénio CD20 ou de uma célula que expressa CD20 numa amostra, que compreende: colocar a amostra em contacto com o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 13, sob condições que possibilitam a formação de um complexo entre o anticorpo e o CD20; e detectar a formação de um complexo.
34. 34. A ligação de um anticorpo anti-idiotípico a um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
35. 35. A ligação de um anticorpo anti-idiotípico de acordo com a reivindicação 34 ao anticorpo da reivindicação 4, 5, 8 ou 9.
36. 36. A utilização de um anticorpo anti-idiotípico da reivindicação 34 ou 35 para a detecção do nível de anticorpo monoclonal humano contra o CD20 numa amostra.
37. 37. Um anticorpo humano, composição, vector de expressão, imunoconjugado ou molécula biespecífica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e 19 a 26 para utilização no 5 tratamento ou prevenção do linfoma de células B, linfoma de células B não-Hodgkin, leucemia/linfoma linfoblástico de percursores de células B e neoplasias de células B, tais como a leucemia linfocítica crónica de células B (CLL)/linfoma de pequenos linfócitos (SLL), leucemia prolinfocitica de células B, linfoma linfoplasmocitico, linfoma de células do manto (MCL), linfoma folicular (FL), linfoma do centro folicular, linfoma de células B da zona marginal (tipo MALT, nodular e esplénico), tricoleucemia, linfoma difuso de grandes células B, linfoma de Burkitt, plasmocitoma, mieloma de células plasmáticas, distúrbio linfoproliferativo pós-transplante, macroglobulinemia de Waldenstrõm, linfoma anaplástico de grandes células (ALCL), granulomatose linfomatóide, linfoma de efusão primária, linfoma intravascular de grandes células B, linfoma mediastinal de grandes células B, doenças da cadeia pesada (incluindo as doenças γ, μ, e α) , linfomas induzidos pela terapia com agentes imunossupressores, tais como os linfomas induzidos pela ciclosporina e pelo metotrexato.
38. 38. Um anticorpo humano, composição, vector de expressão, imunoconjugado ou molécula biespecifica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e 19 a 26, para utilização no tratamento ou prevenção do linfoma folicular (FL) ou da leucemia linfocítica crónica de células B (CLL)/linfoma de pequenos linfócitos (SLL).
39. 39. Um anticorpo humano, composição, vector de expressão, imunoconjugado ou molécula biespecifica de acordo com qualquer uma das reivindicações Ial3el9a26 para o tratamento ou prevenção da psoríase, artrite psoriática, dermatite, esclerodermia ou esclerose sistémica, doença inflamatória intestinal (DII), doença de Crohn, colite ulcerosa, síndrome de dificuldade respiratória, meningite, encefalite, uveíte, glomerulonefrite, eczema, asma, aterosclerose, deficiência da adesão leucocitária, esclerose múltipla, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjõgren, diabetes juvenil, doença de Reiter, doença de Behçet, nefrite mediada por complexos imunes, nefropatia por IgA, polineuropatias IgM, trombocitopenia imunomediada, tal como púrpura trombocitopénica idiopática aguda e púrpura trombocitopénica idiopática crónica, anemia hemofílica, miastenia grave, nefrite lúpica, lúpus eritematoso sistémico, artrite reumatóide (AR), dermatite atópica, pênfigo, doença de Graves, tiroidite de Hashimoto, granulomatose de Wegener, síndrome de Omenn, insuficiência renal crónica, mononucleose infecciosa aguda, HIV e doenças associadas ao vírus da Herpes.
40. 40. Um anticorpo humano, composição, vector de expressão, imunoconjugado ou molécula biespecifica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e 19 a 26, para utilização no tratamento ou prevenção da artrite reumatóide (AR). 6