CZ218398A3 - Způsoby a kompozice pro zjištění vaznosti ligandových párů za použití nefluoreskujícího značení - Google Patents

Description

Způsoby § kompozice pro zjištění vaznosti ligandových párů za použití nefluoreskujíčího značení,

Oblast techniky

Tento vynález se obecně týká způsobů a kompozic pro analyzování molekul nukleových kyselin, přesněji řečeno specializovaných značených složek a vazebných složek, lze využít pro zvýšení citlivosti analýz při různých testů, založených na biologii.

použití kterých o brně nác h

Dosavadní stav technik?/

Důkaz a analýza molekul nukleových kyselin patří mezi nejdůležitější technické postupy v biologii. Je to srdce molekulární biologie a hraje rychle se rozšiřující důležitou úlohu ve zbývající části biologie.

Obecně řečeno po vyčerpání v podstatě všech biologických reakcí analýza zahrnuje určité formy důkazních postupů. Zvláštní význam má sledování hybridizace nukleových kyselin a vazby antilátky na antigen. V ideálním případě má být možnost důkazu citlivá a dovolovat současné sledování několika vzorků. Avšak současné postupy důkazů jsou z hlediska obou těchto charakteristik poněkud omezené.

Hybridizace molekul nukleových kyselin se obecně zjistí autoradiografií nebo analýzou fosforového zobrazení, jestliže hybridizační vzorek obsahuje radioaktivní značení, nebo denii.

zitometricky, pokud hybridizační vzorek obsahuje ghačení, jako je biotin nebo digoxin, což se rozpozná enzymově vázanou antilátkou nebo ligandem. Použije-li se radioakticně značený vzorek, pak důkaz autoradiografií je postižen omezení^zv souvislosti s tvorbou filmu, jako je reciproční selhání nebo nelinearita. Tyto nesnáze v souvislosti s filmem lze překobat zjištěním značení nebo analýzou fosforového zobrazení. Avšak z hlediska radioaktivního značení jsou zde bezpečnostní požadavky, zvýšená poptávka po znovupoužití zdrojů, nutné gpecializov_ané zařízení a výchova obsluhy.

• ·

-2Z těěhto důvodů použití neradioaktivních značení se vyznačuje zvyšováním popularity. V takových systémech obsahují nukleotidy značení, jako je biotin nebo digoxin, které lze zjistit antilátkou ne bp jinou molekulou, jež je značena enzymem, reagujícím s chromogenním substrátem. Jinak se mohou použít fluoreskující značení. Tyto systémy nejsou spojeny & bezpečnostními omezeními, jak je to výše uváděno, ale jsou spojeny s použitím složek, které jsou často labilní a mohou vést k nespecifickým reakcím, což se projeví vysokým pozadím (t.j. nízký odstup signálu od šumu).

Vazné reakce nntilátka na antigen lze zjistit jedním z několika možných postupů. Pokud se hybridizace nukleových kyselin týká, pak se značení, radioaktivní či neradioaktivní typicky konjuguje s antilátkou. Typy značení jsou podobné: enzym, reagující s chromogenním substrátem, fluoreskujícím, který se zjřstí ligandem nebo jinou antilátkou apod. Jako je tomu při důkazu hybridizace nukleových kyselin jsou podobná omezení spojena s použitím těchto detekčních postupů.

Podstata vynálezu

Tento vynález popisuje nové kompozice, kterých lze využít při nejrozmanitěších nukleových kyselinách, postupech, založených na nukleových kyselinách nebo proteinech (např.antilátkách) a postupy jsou spojeny s dalšími zpřízněnými výhodami.

Krátce řečeno popisuje tento vynálezu kompozice a postupy, kterých lze využít ke zvýšení citlivosti a průchodu sledovaných vzorků při nejrozmanitějších testech. Zvláště pak se zřetelem na dosud popisované objevy bylo možno v případech testů, trvajících dlouhou dobu, provést tyto desetkrát až více než stokrát rychleji. Zde popisované postup;/ jsou tedy spojeny s dramatickým a velmi důležitým vylepšením ve srovnání s dříve popisovanými postupy.

Například podle jednoho aspektu tohoto vynálezu jsou popisovány postupy pro zjištění vazby jednoho člena na druhý člen páru ligandů, obsahující stupně:

a) spojení sady prvých značených členů s biologickým vzorkem, který může obsahovat jeden či více druhých Členů, to za

-3podmínek a dobu, dostačující k tomu, aby se vázal prvý člen na druhý Člen, přičemž uvedeng značená složka je korelativní s příslušným prvým členem a zjistitelná nefluoreskující spektrometrií,

b) oddělí se prvé a druhé členy od nevázaných členů,

c) odštěpí se značená složka od značeného prvého člena, a

d) zjistí se značená složka nefluoreskující spektrometrií, nebo potenciometričky a takto se zjistí vazba prvého člena na druhého člena.

V souvislosti s tímto vynálezem lze využít velké množství nejrozmánitějších prvých i druhých členů, čítaje v to například molekuly nukleových kypelin (například DNA, RNA, analoga nukleových kyselin, jako je PNA nebo jakoukoli jejich kombinaci), proteiny mebo polypeptidy (například antilátky nebo jejich fragmenty (např. monoklonální antilátky, polyklonální antilátky nebo vázající se složky, jako GDR), oligosacharidy, hormony, organické molekuly a další substráty (např. xenobiotika, jako je vazba glukuronidasy na molekulu léku), jakož i jakýkoli další ligandový pár. Mezi četná provedení dle tohoto vynálezu patří to, že prvé a druhé členy mohou být téhož typu molekul, nebo typů různých. Tak např.

jako reprezentativní příklady ligandových párů prvé^clena a druhého člena lze uvést kombinaci molekula nukleové kyseliny/molekula nukleové kyseliny, antilátka/molekula nukleové kyseliny, antilátka/hormon, antilátka/xenobjotikum a antilátka/protein.

S výhodou prvý člen rozezná buď zvoleného druhého člena specificky (např. s vyloučením dalších jiných molekul) nebo třídu příbuzných molekul druhého člena (například třídu příbuzných receptorů). S výhodou se prvý člen bude vázat na druhého —3 —6 —7 člena s afinitou nejméně asi 10^->/M, s výhodou 10 /M, 10 /M,

10^-θ/Μ, 10^-¾ nebo i nach 1O^-^²IY1. Afinita jedné molekuly na druhou molekulu se dá snadno zjistit, jak to odborník zná, viz také Scatchard, Ann.lI.Y.Acad.Sci. 51, 660-672 (1949).

Rodfte dalšího příbuzného aspektu tohoto vynálezu se popisují postupy pro analyzování vzorů genové exprese ze zvoleného bio• · • « • · • ·

-4logického vzorki, zahrnující stupně:

s) vyjmutí nukleové kyseliny z biologického vzorku,

b) kombinování vyjmuté nukleové kyseliny s jedním či více zvolených značených vzorků nukleové kyseliny, to za podmínek a po dobu dostačující k tomu, aby došlo k hybridizaci vzorků na uvedené nukleové kyseliny, přičemž značená část je korelativní s odpovídajícím vzorkem nukleové kyseliny a zjistitelná nefluoreskující spektrometrií, nebo potenciometricky,

c) oddělí se hybridizované vzorky od něhybridizovaných,

d) ze značných fragmentů se odštěpí značená složka, a

c) zjistí se značená složka nefluoreskující spektrometrií nebo potenciometricky a tím se zjistí vzor genové exprese biologického vzorku.

Podle jednoho provedení se může biologický vzorek stimulovat se zvolenou molekulou před stupněm vyjmutí nukleové kyseliny. Jako reprezentativní příklady stimulujících složek lze uvést molekuly nukleovýoh kyselin, rekombinantní genové přepravní činidla, organické molekuly, hormony, proteiny, zánětlivé faktory, cytokiny, léky, jejich předchůdce, parakrinní a autokrinní faktory atd.

V souvislosti s tímto vynálezem je třeba chápat, že výraz biologické vzorky nezahrnuje pouze vzorky, získané z živých organizmů (např. savců, ryb, bakterií, parazitů, virů, hub apod.) nebo z okolního prostředí (např. jako je vzduch, voda nebo pevné vzorky(, ale i biologické materiály, které lze získat uměle nebo synteticky (jako jsou např. sestavy fágů, sestavy organických molekul, shluky genomických klonů apod.). Jako příklady biologických vzorků lze uvést bilogické kapaliny (např. krev, sperma,'ceřebrálňí spinální kapalinu, moč), biologické buňky (např. buňky rostlinného původu, buňky B nebo T, jsterní buňky fibroblasty apod), a biologické tkáně.

Použitím různých provedení výše uvedených postupů lze získat vzorky nukleovýoh kyselin nebo molekul dle tohoto vynálezu například vázáním, štěpením nebo extenzí (např. reakcí PCR). Podle dalších aspektů mohou být vzorky či molekuly • ·

-5nukleových kyselin značeny na odpovídajících 5koncovkách a takto značené molekuly mohou přebrat funkci olmgonukleotidových primerů nebo didesoxynukleotidových terminátorů.

Podle dalších provedení tohoto vynálezu lze 4, 5, 10, 15,

20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 250, 300, 350, 400, 450 nebo více než 500 různě či jednotně značených molekul použít současně pro uvedenou reakci, kdeže každá značená složka je jednotná pro zvolený fragment nukleové kyseliny, vzorek, nebo prvý či druhý člen a může se pak odděleně identifikovat.

Podle dalších provedení dle tohoto vynálezu lze značenou složku či značené složky zjistit fluorometričky, hmotnostní spektrometrií, infračervenou či ultrafialovou spektrometrií, nebo potenciostatickou amperometrií (například použitím coulometrických či ampérometrických detektorů). Příkladnými postupy použití vhodných spektrome^rických způsobů zahrnují průletovou hmotnostní spektrometrii, quadrupolní hmotnostní spektrometrii, magnetickou sektorovou hmotnostní spektrometrii a elektrickou sektorovou hmotnostní spektrometrii. Speciflká provedení takových postupů zahrnují iontově-zachycující hmotnostní spektrometrií, elektrosprejovou ionizační hmotnostní spektrometrii, iontově-sprejovou hmotnostní spektrometrii, kapalinovou ionizační hmotnostní spektrometrii, ionizační hmotnostní spektrometrii za norm.tlaku, elektronovou ionizační hmotnostní spektrometrii, ionizační hmotnostní spektrometrii za bombardování rychlými atomy, hmotnostní spektrometrii MALDI, fotoionizační průletovou hmotnostní spektrometrii, laser-ovou kapičkovou hmotnostní apektro metrii, spektrometrii MALDI-TOF, hmotnostní spektrometrii AFCI, nano-sprejovou hmotnostní spektrometrii, párově-sprejovou hmotnostní spektrometrii, chemickou ionizační hmotnostní spektrometrii, rezonančně-ionizační hmotnostní spektrometrii, sekundárně ionizační hmotnostní spektrometrii a termosprejovou hmotnostní spektrometrii.

Mezi ještě další provedení dle tohoto vynálezu lze oddělit prvé a druhé členy nebo vyjmuté nukleové kyseliny od nevázaných členů či molekul postupy, jako je gélová elektroforéza, kapilární elektroforéza, mikrokanálková elektroforéza, vysokotlaková kapalinová chromatografie nebo velikostně exkluzní chromatografie, filtr • · ce, gélová elektrofořéza na polyakrylamidu, kapalinová chromatografie,exkluzní velikostní chromatografie, iontoměničová chromatografie, kapalinová chromatografie v reverzní fázi, elektroforeza v pulzníra poli nebo v inverzním poli, dialyfca, členění kapiček za aktivace fluorescencí. Jinak buď prvý nebo druhý člen, nebo vyjmutá nukleová kyselina se může vázat na pevný podklad, např.dutá vlákna (Amicon Corp., Danvers, llass.) kuličky (Polysciences, Warrington, Pa), magnetické kuličky (Robbin Scientific, Uountain View, Galii.), destičky, mističky či lahvičky (Corning Glass Works, Corning, H.Y.), síta (Becton Dickinson, liountain View, Galif.), česle a pevná vlákna (Edelman a spol., U.S.pat. 3 843 324), též Kuroda a spol., U.S.pat. 4 4l6 777), membrány (I-illipore Corp., Bedford, Mass.) a ponorné pásky. Je-li prvý nebo druhý člen či vyjmuté nukleové kyseliny ve vazbě na pevný podklad, pak za určitých provedení postupu dle tohoto vynálezu lze dále zahrnout stupně vymývání nevázaného podílu z pevného podkladu.

Podle dalších provedení se značený prvý člen může odštěpit chemicky, oxidací, redukcí, labilitou v kyselém či alkalickém prostředí, enzymově, elektrochemicky, postupy za zahřívání nebo použitím fotolability. Podle dalších možných provedení lze pracovat kontinuálně, např. použitím jednoho automatizovaného přístroj

Tyto a ještě další aspekty dle tohoto vynálezu budou jasně zřejmé s odkazem na falší podrobný popis a připojená vyobrazení. Dále pak jsou připojeny četné odkazy, kde se popisují podrobněji určité postupy či kompozice, například plasmidy atd, a jsou sem zahrnuty se zřetelem na úplnost.

Krátký popis vyobrazení.

Vyobr.l je schéma synthesy pentafluorfenylesterů chemicky štěpitelných značených vzorků dle hmotnostní spektroskopie k uvolení značených vzorků s karboxamidovou koncovou skupinou.

Vyobr„2 je schéma synthesy pentafluorfenylesterů chemicky štěpitelných značených vzorků dle hmotnostní spektroskupie k uvolnění značených vzorků s koncovou karboxylovou skupinou.

Vyobr.3 až 6 i 8 popisuje schéma synthesy tetrafluorfenylesterů serie 36ti fotochemicky štěpitelných vzorků dle • ·

-7hmotnostní spektroskopie.

Vyobr.7 popisuje schéma synthesy serie 36 fotochemicky štěpitelných vzorků dle hmotnostní spektroskopie s koncovou aminoskupinou.

Vyobr,9 popisuje schéma synthesy 36 fotóchemicky štěpitelných dle hmotnostní spektroskopie značených oligonukleotidů připravených z odpovídající serie 36 tetraf/luorfenylesterů fotochemicky štěpitelných dle hmotnostní spektroskopie značených kyselinVyobr.lO popisuje synthesu 36 fotochemicky štěpitelných dle hmotnostní spektroskopie značených oligonukleotidů, připravených z odpovídající serie 36 fotochemicky štěpitelných dle hmotnostní spektroskopie značených vzorků s koncovou amino skupinou,

V-yobr.ll znázorňuje současnou detekci většího počtu značených vzorků hmotnostní spektrometrií.

v

Vyobr.l2 znázorňuje hmotnostní spektrogram samotné o£x-kyan-matriee.

Vyobr.13 uvádí modulárně konstruovaný fragment značené nukleové kyseliny.

Podrobný popis vynálezu

Jak to zde již bylo uvedeno, popisuje tento vynález značené složky-a vazebné složky, jichž lze-využít pro zvýšení citlivosti i počtu vzorků ve velkém rozsahu biologických testů. Popisovány jsou zde podrobněji příklady vhodných značených složek i vazebných složek, velmi četné postupy, kdy mohou být značené složky užitečné, jakož i postupy pro zjištování a detekci značených složek.

—8— X/2&lfS~ U^TSl^ vtwr pfrweT

Krátce řečeno, jedním předmětem tohoto vynálezu jsou sloučeniny, kde molekula vlastního zájmu, nebo výchozí látka pro ni je vázána labilní vatbou či labilními vazbami na značenou látku. Lze tedy nazírat na sloučeniny dle tohoto vynálezu jako na látky obecného vzorce

vyjádřitelné lépe specifičtějšími vzorci

Λ ti .

«>fy

Z důvodů, které budou ještě detailněji dále probrány, serie sloučenin T-L-RIOI mohou být účelově vystaveny podmínkám, jež způsobí rozrušení labilní vazby nebo labilních vazeb, čímž se uvolní značená část od zbytku molekuly. Značená část se potom charakterizuje jedním či více analytických postupů, čímž se dospěje přímo k informaci o struktuře značené části a (to je velice, důležité) nepřímo k informaci o identitě odpovídající látkyMOI.

Jako/ jednoduchý názorný příklad reprezentativní molekuly dle tohoto vynalezu, kde L znamená přímou vazbu, lze odkázat • ·

-9na následující strukturu (i)

značená složka molekula interesantní sloučeniny

V uvedené struktuře (i) znamená T pólycyklickou aromatickou částici, obsahující dusík a vázanou na karbonylovou skupinu, a X znamená MOI (a přesněji řečeno fragment nukleové kyseliny se zakončením aminoskupinou), L pak znamená vazbu, tvořící amidovou skupinu. Amidová •'fcaz&B·· je labilní v porovnání sevazbami v části T , protože - jak to odborníci znají - lze amidovou skupinu chemicky čtěpit (rozrušit) v kyselém či alkalickém prostředí za podmínek, kdy zůstanou vazby ve složce T nedotčeny. Takže značená část (tj.produkt štěpehí, obsahující T) se může uvolnit takto:

fragment nukleové kyseliny

kyselina či báze • · ·

značená část

Zbytek sloučeniny

Avšak vazebnou složkou 1 může být více než jedna přímá vazba, jak je to patrné z dalšího připojeného příkladu,

Je velmi dobře známo, že sloučeniny, obsahující o-nitrobenzylaminovou část (viz zarámovaná skupina atomů ve struktuře (ii) ) jsou fotolyticky nestálé a že je-li taková sloučenina vystavena účinkům aktinického záření specifikované vlnové délky, dojde k selektivnímu odštěpení benzylaminové vazby (viz silná vazba ve struktuře (ii). Takže struktura (ii) má tytéž skupiny či složky T a MOI, jako má struktura (i), ale vazebná skupina obsahuje větší počet atomů a vazeb, mezi nimiž je případná labilní vazba. Fotolyzou struktury (ii) se uvolňuje značená část T (tedy část obsahující T) od zbývající části sloučeniny, jak je to zachyceno zde dále.

• · · · · · · • · · * • · ♦ ··

-11• ·

značená část zbytek sloučeniny

Jsou tedy dle tohoto vynálezu dostupné sloučeniny, které za podmínek vhodného štěpehí podlehnou tomuto štěpení za uvolnění značené části od zbytku molekuly. Sloučeniny dle tohoto vynálezu lze popisovat výrazy značená část, část MOI (nebo ospovídající výchozí složka L^) a labilní vazba či vazby, čímž jsou spojeny obě skupiny dohromady. Jinak lze sloučeniny dle tohoto vynálezu popisovat citováním složek, ze kterých vznikly. Takže sloučeniny je možno definovat jako reakční produkt značené části, vazebné složky a reakční složky MOI.

Značená složka z chemické složky (T^, Chemical-handle) a variabilní složky (T ), takže reakční značená složka má νθ obecný vzorec

K obja snění tohoto názvosloví je třeba odkázat na strukturu (iii), jež znázorňuje reaktivní značenou složku, kterou lze využít při přípravě sloučenin struktury (ii). Reaktivní značená složka struktury (iii) obsahuje variabilní značený podíl a manipulační složku, viz dále:

(iii) variabilní značený manipulační složka podíl

Ve struktuře (iii) představuje manipulační složka -C(=O)-A východisko pro reakci značné složky s vazebnou složkou za vzniku částice T-L. Skupina A ve struktuře (iii) znamená,že karboxylová skupina je v chemicky aktivním stavu, takže je schopná reagovat s dalšími složkami. Skupinou Aů může být například skupina hydroxylové nebo pentafluorfenoxylová mezi četnými dalšími možnostmi. Vynález tedy zahrnuje velký počet značených složek, které lze vázat na variabilní značený podíl, jak to ještě bude zde podrobněji popisováno. Variabilní značený podíl je tedy částí ”Tů ve vzorci T-L-X a bude tedy také částí značené složky, jež se vytvoří reakcí štěpením 1.

Jak to zde bude ještě podrobněji popisováno, je variabilní značený podíl takto označován proto, že při přípravě členů určitého seskuúení je žádoucí, aby měly jednotnou variabilní složku, takže lze jednotlivé členy takového seskupení rozlišit vzájemně od sebe analytickými postupy. Jako jeden z příkladů lze uvést, že variabilní značenýpodíl struktury (iii) může být jedním z členů dále uvedeného seskupení, kde lze členy tohoto seskupení rozlišit jejich ultrafialovými nebo hmotnostními spektry:

Podobně lze vazebnou složku popisovat použitím pojmů odpovídajícího chemického se chování (obvykle jsou nutné nejméně dvě, každá z nich může být označena jako L^), které jsou bočně na vazebné labilní složce, kde vazebná labilní složka sestává z nutné labilní složky (L ) a případně labilnich složek (L^x a Ir), kde případné labilní podíly slouží účinně 2 od oddělení L od manipulačních složek a potřebná labilní složka slouží jako labilní vazba uvnitř vazebné labilní složky. Takže vazebná složka může mít obecný vzorec

L_h-L¹-I²-l³-L_h

Zde používané názvosloví vazebné složky může být objasněno pohledem na strukturu vzorce (iv), jež je odvozena od struktury (ii):

(iv) manipulační složka

Jak to plyne ze strultury (iv), mohou atomy zastávat více než jednu funkční úlohu. Takže ve struktuře (iv) dusíkatá funkce benzylové skupiny může sloužit jako manipulační složka, umožňující vazebné složce napojení na značenou složku reakční tvorbou amidu, a pak slouží jako nutná část struktury labilní vazebné složky L tím, že ··· · • ·

-14vazba dusíku na uhlík benzylové skupiny je zvláště vhodná k fo tolytickému štěpení. Struktura (iv) také ukazuje, že vazebná složka může mít skupinu I? ( v tomto případě methylenovou skupinu), ačkoliv neobsahuje skupinu ΐΛ. Podobně může v 3 v mít vazebná složka skupinu L , nikoli však L , nebo může obsahovat skupiny L a L , nebo nemít žádnou z nich. Ve struktuře (iv) přítomnost.' skupiny ’’Pⁿ v blízkosti karbonylové akupiny naznačuje, že karbonylové skupina je před reakcí chráněna. Za této konfigurace může aktivovaná karboxylová skupina značené složky (iii) reagovat čistě s aminoskupinou vazebné složky (iv) za vzniku amidové vazby a tedy látky vzorce, T_L-L^o

Reakční složka MOI je vhodnou reaktivní formou předmětné molekuly. Je-li takovou molekulou fragment nukleové kyseliny, je vhodná reakční složka MOI fragmentem nukleové kyseliny, který je vázán 5 '-hydroxylovou skupinou na fosfodiesterovou .skupinu a potom dále na alkylenový řetězec, končící aminoskupinou. Tato aminoskupina může potom reagovat s karbonylovou skupinou struktury (iv), pochopitelně po odstranění chránících funkcí karbonylové skupiny a s výhodou potom ještě aktivovat karbonylovou skupinu při reakci s aminoskupinou, takže se složka MOI naváže na vazebnou složku.

Vezme-li se v úvahu chronologické pořadí, pak z pohledu vynálezu se použije značená složka (obsahující značenou manipulační složku a značenou variabilní složku), vazebná složka (se dvěma chemickými manipulačními složkami, potřebnou labilní Částí a s nulou až dvěma případně.labilními částmi) a reakční složka MOI, obsahující molekulu předmětné zajímavé složky a chemickou molekulu manipulační složky) ke vzniku v

látky vzorce T_1-MOI. Takže při vzniku T-L-MOI bud reaguje značená složka nejprve s vazebnou složkou dohromady za vzniku T-L-L^í ^a potom s tímto seskupením reaguje MOI za vzniku T-LJMOI, nebo - a to je méně výhodné - reagují spolu nejprve vazebná složka a složka MOI za vzniku L^-L-MOI a další reakcí se značenou složkou se připraví T-L „MOI.

Pro pohodlí budouv.zde sloučeniny vzorce T-L-MOI popisovány výrazem značená, složka, vazebná složka a reagens MOI, kterých ······ ·· • · · · • · · 4 • fc • 4 » · fc • fc

-15Ize použít pro přípravu takových látBkPochopitelně se může sloučenina Či sloučeniny vzorce T-L_MOI připravovat jinými (obvykle pracnějšími) postupy a to vše spadá do rozsahu tohoto vynálezu.

V každém případě se vynálezem dají získat sloůčeári&ny vzorce T-L-KOI, které lze štěpit tak, že se značená složka uvolní od zbytku sloučeniny. Vazebná složka pak bude obsahovat nejméně značenou variabilní složku a báde typicky dále obsahovat některé nebo všechny atomy ze značené manipulační složky, některé nebo všechny atomy z vazebné manipulační složky, jež byla použita k navázání značené reakční složky na vazebnou složku, případně 1 bilní složku ΐΛ, byla-li tato přítomná v T-1-M0I, a bude snad i obsahovat určitou část nutné labilní složky L v závislosti na přesné struktuře L^r a povaze chemického štěpení. Pro pohodlí značená složka se může označovat jako T-obsahující částice, protože T bude typicky představovat největší podíl (míněno hmotnostně) značené složky.

Po tomto výkladu jednoho aspektu dle tohoto vynálezu budou rlzné složky T, L a X popsány podrobněji. Tento popis začíná definováním určitých termínů, jak zde budou nadále použity při popisech T, L a X.

Jak je zde použit, , výraz fragment nukleová kyseliny znamená molekulu, jež je doplňkem k vyvolené molekule značené nukleové kyseliny (to znamená doplňkem docela nebo určité její Části) a může být odvozena od přírodních nebo synthetických či rekombinantně získaných molekul, čítaje v to i tahové, které se mezi přírodními látkami nevyskytují a může být v dvojitě nebo jednoduše navázané formě, jak se to hodí; zahrnuje tedy oligonukleotid (tedy DNA či ŘNA), primér, vzorek, obdobu nukleové kyseliny(třeba PNA), oligonukleotid, který je protažen ve směru poloh 5 ' a 3 -polymerasou, nukleovou kyselinu, jež se štěpí chemicky nebo enzymově, nukleovou kyselinu, jež je zakončena didesoxyterminátorem nebo zastřešena na koncovkách 3 *nebo 5' sloučeninou, jež předchází polymerování koncovky 5* nebo 3* - a jejich kombinace,.

Doplnění fragmentu nukleové kyseliny na zvolenou cílovou značenou molekulu nukleové kyseliny znamená obvykle zvýšení

9 99 99 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 9 99 9 9 99 • ···· · · · · 9 9 999 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 99 99 99 99

-16mejméně o asi 70% specifického základu, čítaje v to zdvojení po délce fragmentu. S výhodou se fragment nukleové kyseliny vyznačuje nejméně o asi 80% specifického zdvojení základu, výhodněji nejméně asi 90%_o Testy pro zjištění procenta překřížení (nahodilého a tedy procenta specifického propojení základu) jsou dobře známé a jsou založeny na % překřížení ve funkci Tm, pokud je tím míněn kontrolní vzorek s dokonale prokříženým základem.

v

Jak je použit zde, výraz alkyl či alkylova skupina, bud co taková nebo v kombinaci, znamená nasycený, přímý nebo větvený uhlovodíkový řetězový zbytek, obsahující 1 až 10, s výhodou 1 až 6, nejvýhodněji 1 až 4 atomy uhlíku. Jako příklady lze uvést, ale bezjakéhokoli omezování, skupiny methylovou, ethylo_ z* vou, n-propyÍovou, isopropylovou, n-butylovou, isobutylovou, sekr-butylavou, terc.-butylovou, pentyÍovou, isoamylovou, hexylovou, decyÍovou a pod. Výraz alkylen či alkylenová skupina znamená nasycenou, přímou nebo větvenou uhlovodíkovou řetězovou skupinu charakteru diradikálu s obsahem 1 až 10, s výhodou až 6 a nejvýhodněji 1 až 4 atomy uhlíku. Jako příklady lze uvést bez jakéhokoli omezování skupiny methylenovou, ethylenovou, (-CHg.CHg-), propylenovou apod.

Výraz .alkenyl či alkenylová skupina, samotný či v kombinaci, znamená uhlovodíkový řetězec přímý nebo větvený s nejméně jednou dvojnou vazbou mezi uhlíkovými atomy a to celkem se 2 až 10, s výhodou 2 až 6 a nejvýhodněji 2 až 4 atomy uhlíku. Jako příklady takových zbytků opět bez jakéhokoli omezování lze jmenovat skupiny ethenylovou, E- a Z-propenylovou, isopropenylovou, E- a Z-ButeriyTovou, E- a Z-isobůtenyÍovou, E a Z-pentenylovou, decehylovou apod_o Výraz alkenylen nebo alkenylenová skupina znamená přímou nebo větvenou uhlovodíkovou biradikálovou skupinu s nejméně jednou dvojnou vazbou mezi atomy uhlíku, celkem se až 10, s výhodou 2 až 6 a nejvýhodněji 2 až 4 atomy uhlíku. Jako příklady bez jakéhokoli omezování lze uvést skupiny methylidenovou (=01^), ethylidenovou (-CH=CH-) propylide novou (-CHg-CHsCH)- apod.

Výrazalkinylová skupina, samotný či v kombinaci znamená přímou či větvenou uhlovodíkovou skupinu s nejméně jednou troj• · • · • ·

nou vazbou mezi uhlíkovými atomy celkem se 2 až 10, s výhodou 2 až 6 a nejvýhodněji 2 až 4 atomy uhlíku. Jako příklady takových skupin, ale bez jakéhokoli omezování, lze uvést skupiny ethinylovou (acetylenylovou), propinylovou (propargylovou), butinylovou, hexinylovoUjt d.ecinylovou apod. Výrazem alkinylenová skupina” se míní, samotná či v kombinaci, přímá nebo větvená uhlovodíková dvojvazná skupina s nejméně jednou trojnou vazbou mezi uhlíkovými atomy celkem se 2 až 10, s výhodou 2 až 6 a nejvýhodněji 2 až 4 atomy uhlíku. Jako příklady bez jakéhokoli omezování lze uvést skupiny ethinylenovou (C£C-), propinylenovou (-CH^C— C-) a pod.

Výrazem ”cykloalkylová skupina”, samotným či v kombinaci, se míní nasycené cyklické uspořádání uhlíkových atomů v počtu 3 až 8, a s výhodou 3 až 6. Jako příklady takových cyklcalkylových skupin bez jakéhokoli omezování lze uvést skupiny cyklepropylovou, cyklobutylcvou, cyklopentylovou, cyklohexylovou apod. Výraz cykloalkylenová skupina” se týká diradikálu cykloalkylové skupiny.

Výrazem '!>cykloalkenylová skupina”, samotným či v kombinaci, se míní cyklocká uhlíkatá skupina se čtyřmi až 8, s výhodou 5 nebo 6 atomy uhlíku e. s jednou dvojnou vazbou či více takových. Příklady .takových skupin zahrnují skupinu - ale bez jakéhokoli omezení _cyklopentenylovou, cyklohexenylovou, cyklopentadienylovou apod. Výraz ”cykloalkenylenová skupina” se týká odvozených diradikálů.

Výraz aryl či arylová skupina znamená karbosykličkou aromatickou skupinu, (tedy jen z atomů uhlíku a vodíku), jako je skupina fenylová, naftylová, indenylová, andynylová, azulenylová, fluorenylová a anthracenylová, nebo heterocyklickou aromatickou skupinu, jako je furylová, thienylová, pyridylová, pyrrolylová, oxazolylová, thiazolylová, imidazolylová, pyrazolylová, 2-pyrazolinylová, pyrazolidinylová, isoxazolyl vá, isothiazolylová,

1,2,3 .oxadiazolylová, 1,2,3-triazolylová, 1,3,4-rťhiadiazol lová, pyride.zinylová, pyrimidinylová, pyrazinylová, 1,3,5-triazinylová,

1,3,5-trithianylová, indolizinylová, andolylová, isoindolylová,

3H-indolylová, indolinylová, benzo^bjfuranylová, 2,3-dihydrobenzofuranylová, benzo^bjthiofenylová, IH-indazolylová, benzimidazolylová, benzthiazolylová, purinylová, 4H-chinolizinylová, chino-r linylová, isotfinolinylová, cinnolinylová, ftalazinylová, chinačK

-18zolinylová, chinoxalinylová, 1,8-na.ftyridinylová, pteridinylová, karbqzolylová, akridinylová, fenazinylová, fenothiazinylová, a fenoxazinylová.

Arylové skupiny”, jak jsou záe definovány, mohou vzájemně nezávisle obsahovat 1 až 4 substituenty, které jsou nezávisle zvoleny z těchto: halogeny, skupina hydroxylová, aminoskupina, nitro skupina, skupina trifluormethylevá, trifluormethoxylová, alkylová, alkenylová, alkinylová, kyanová, karboxylové, karboalkoxylová, 1,2-oxyethylenová, alkoxylové, alkenoxylová nebo alkinoxylová, alkylaminoskuoina, alkenylamjnoskupina, alki-r nylaminoskupina nebo alifatická či aromatická acylová skupina, alkoxykarbonylamino skupina, alkylsulf o nylaminoskupina, morfo.lino•karbo nylaminoskupina, thiomorfolinokarbonylaminoskupina, M-alkylguanidinová, sralkylaminosulfonylová skupina, dále aralkoxyalkylová, ; ΙΊ-arakjixymočovina, N-hydroxylmočovina, K-alkenylmočovina,

K,N-(alkyl,hydroxyl)-močovina,, dále skupina heterocyklylová, thioaryloxysubstituovaná arylová, N,N-(aryl,alkyl)hydrazinová,

Ar'-substituovaná sulfonylheterocyklylová, aršíkyIsubstituovaná heterocyklylová, cykloalkyl- a cy kloalkenyl-substituovaná. heterocyklylová, cykloalkyl-nakondensobaná arylová, aryloxysubstituovaná alkylová, heterocyklylaminoskupina, alifatická či aromatická acylaminokarbonylové skupina,, alifatická či aromatická acyl-substituova.ná alkenylová, Ar -substituovaná aminokarbonyloxylová, Ar '-disubstituovaná arylová, alifatická či aromatická acyl-substituovaná acylová, cykloalkylkarbonylalkylová, cykloalkylsubstituovaná aminoskupina, aryloxykarbonylalkylová skupina,., fosfordiamidy lová kyselina nebo ester.

Ar je karbocyklická nebo heterocyklická arylová skuúina, jak byla zde výše definována s jedním až třemi substituenty ze skupiny, kterou tvoří halogeny, hydroxylová skupina, aminoskupina, nitroskupina, skupena trifluormethylová, trifluormethoxylová, alkylová, alkenylová, alkinylová, 1,2-dioxymeth-ylenová,

1,2-dioxyethylenová, alkoxylová, alkenoxylová, alkinoxylocá, alkylaminoskupina, alkenylamino- nebo alkinylaminoskupina, dále skupina alkyIkarbonyloxylová, alifatická či aromatická acylová, • ·· · · · · ·· • · · · · · · « · • · · · · · * ···

-19alkylkarbonylaminoskupina, alkoxykarbonylaminoskupina, alkylsulfonylaminoskupina, N-alkyl- anebo N,H-dialkylmočovina.

Výrazem alkoxylová skupina či. alkoxy se míní, samotná či v kombinaci skupina typu alkyletherového radikálu, kde výraz alkyl byl zde již výše definován. Jako příklady vhodných alkyletherových radikálů lze uvést bez jakéhokoli omezování skupiny methoxylovou, ethoxylovou,mn-propoxylovou, isopropoxylovou, n-butoxylovou, iso-butoxylovou, sek.-butoxylovou, ierc.-butoxylovou apod₀

Výrazem alkenoxylová skupina, samotným či v kombinaci, se míní radikál vzorce alkenyl-Ο-, kde výraz alkenyl byl již výše definován za předpokladu, že radikálem není enol-ether.

Příklady vhodných alkenoxylevých skupin zahrnují bez jakéhokoli omezování skupiny allyloxylovou, E a Z-3-methyl2-propenoxylovou apod.

Výraz alkinyloxylová skupina, samotný či v kombinaci, znamená zbytek vzorce alkinyl-Ο-, kde výraz alkinyl byl již výše definován, ale za omezení, že nejde o inol-ether. Jako vhodné příklady takových skupin lze uvést bez jakéhokoli omezování skupinu propargyloxylovou, 2-butinyloxylovou apod.

Výraz thioalkoxylová skupina se týká thioetherových zbytků vzorce alkyl-S-, kdeobyl byl již výše definován.

Výraz alkylamino, samotný či v kombinaci, znamená mono- nebo dialkylaminosubs.tituovanou aminoskupinu (např.

zbytek vzorxe alkyl-NH- nebo (alkyl)₂“N-), kde pojem alkyl byl již dříve definován.Jako vhodné příklady možno uvést skupiny, to bez jakéhokoli omezování - methylaminovou, ethylamino— vou, propylaminovou, isopropylaminivou, terč.-butylaminovou, Ν,Ν-diethylaminovou apod.

Výraz alkenylaminová skupina, samotný či v kombinaci, znamená zbytek vzorce alkenyl-NH- nebo (alkenyl)₂-N-, kde pojem alkenyl^byl již výše definován, to za omezení, že se nejedná o nějaký enamin. Jako příklad lze uvést allylaminovou skupinu.

Výraz alkinylaminoskupina, samotný či v kombinaci, znamená zbytek alkinyl-NH nebo (alkinyl)₂-N, kde výraz alkinyl byl již výše definován, to za omezení, že nejde o inamin. Jako příklad • · . * ·· · · · ·

-20lze uvést propargylaminový zbytek.

Výraz amid se týká buď seskupení -1^(^)-0(=0)- nebo -0(=0)-13-(11^)-, kde R^ ve sn^lu zde již dříve uvedené definice znamená vodík, jakož i jiné skupiny. Výraz substituovaný amid” je vztažen k situaci, kdy R^ neznamená vodík, zatím co výraz nesubstituovaný amid se týká situace, kdy R vodík znamená.

Výraz aryloxy, samotný či v kombinaci, znamená zbytek vzorce aryl-Ο-, kde pojem aryl_dbyl zde již definován. Jako příklady lze uvést bez jakéhokoli omezování skupiny fenoxylovou, neftoxylovou, pyridyloxylovou apod.

Výraz arylamino, samotný či v kombinaci, znamená zbytek vzorce aryl-NH, kde aryl byl již zde výše definován. Jako příklady opět bez jakéhokoli omezování lze uvést skupiny anilineminovou (tanilidovou), naftylaminovou, 2-, 3- a 4-pyridylaminovou apod.

Výraz arylnavázaná cykloalkylová skupina, samotný ěi v kombinaci, znamená cykloalkylovou skupinu, jež sdílí dva sousedící uhlíkové atomy s arylovým zbytkem, kde výrazy cykloalkyl a aryl byly zde již dříve definovány. Jako příklad lze uvést cyklobutylovou skupinu s nakondenzovaným Penze novým jádrem.

Výraz alkylkarbonylaminoskupina, samozný či v kombinaci, znamená zbyteg: vzorce alkyl-ΝΟ-ΝΗ-, kde výraz alkyl byl zde již definován.

Výraz alkoxykarbonylaminoskupina, samotný či v kombinaci, ' I, znamená. zbytek vzorce alkyl-OCONH-, kde výraz alkyl byl zde již dříve definován.

.....Výraz alkylsulfonylaminoskupina, samotný či v kombinaci, znamená zbytek vzorce alkyl-SO^NH-, - kde výraz alkyl byl zde již definován.

Výraz arylsulfonylaminoskupina, samotný či v kombinaci, znamená zbytek vzorce aryl-S0₂-NH-, kde pojem aryl byl zde již dříve definován.

Výraz N-alkylmočovina, samozný či v kombinaci, znamená skupinu vzorce alkyl-NH-CO-NH, kde výraz alkyl byl zde jiz dříve definován.

• ·· f-^1Výraz N-arylmočovina, samotný či v kombinaci, znamená zbytek vzorce aryl-NH-CO-NH, kde poje i aryl byl zde již dříve definován.

Výrazem Bhalogen je míněn fluor, chlor, brom Či jod.

Výrazem uhlovodíkový zbytek” se míní uspořádání uhlíku a vodíku, kde je třeba pouze jediného'· vodíkového atomu, aby vznikla nezávislá st_abilní molekula. Má tedy uhlovodíkový zbytek jedno volné valenční místo na uhlíkovém atomu, kde je uhlovodíkový zbytek navázán na jiný atom či atomx. Jako příklády lze uvést skupiny alkylovou, alkenylovou, cykloalkylovou apod.

Výraz uhlovodíkový diradikál se týká uspořádání atomů uhlíku a vodíku, kde je třeba dvou vodíkových atomů ke vzniku stálé nezávislé molekuly. Takže má tedy takový diradikál dvě volná valenční místa ns jednom či na dvou uhlíkových atomech, kudy je tento zbytek názán na jiný atom či atomy. Jako přík&ady takový skupin možno jmenovat skupinu alkylenovou, alkenylenovou, alkinylenovou, cykloalkylenovou.

Výrazem hydrokarbyl se míní každé stabilní uspořádání pouze z atomů uhlíku a vodíku s jedním valenčním volným místem, kudy je vázáno na jinou částici a zahrnuje tedy skupiny alkylové, alkenylové, alkinylové, cykloalkylové, cykloalkeny^Aývé, arylové (bez vsunutí# heteroatomu do arylového cyklu), arylalkylové, alkylarylové a pod.

Výrazem hydrokarbylen se míní jakékoli stabilní uspořádání jen z atomů uhlíku a vodíku se dvěma volnými velenčními místy, kudy je vázáno na jiné částice, takže sem patří skupiny alkylenové, alkenylenové, alkinylenové, cykloalkylenové, cykloalfeenylenové, arylenové (bez heteroatomu, vsunutého do aromatického jádra), arylalkylenové, alkylarylenové apod.

Výraz hydrokarby1-0-hydrokarbylen se týká hydrokarbylové skupiny, vázané na atom kyslíku, kde kyslíkový atom je dále vázán na hydrokarbylenovou skupinu na jednom či dvou valenčních místech, kde je hydtokarbylenová skupina vázána na další jiné. Výraz hydrokarby1-S-hydrokarbylen, hydrokyrbyl-NH-hydrokarbylen a hydrokarbyl-amido-hydrokarbylen mají odpovídající

-22— významy, kdeže kyslík byl nahrazen sírou, skupinou -NH- nebo amidovou v tom kterém případě.

Výraz ” N-(hydrokarbyl)-hydrokarbylen se týká hydrokarbylenové skupiny, kde jedno či dvě valenční místa jsou ve vazbě na dusíkový atom a tento dusíkový atom je současně vázán na vodík a hydrokarbylovou skupinu. Výraz N,N-di(hydrokarbyl)-hydrokarbylen se týká hýdrokarbylenové skupiny, kde jedno ze dvou valenčních míst je vázáno na atom dusíku a dusíkový atom je současně vázán na dvě hýdrokarbylove skupiny.

Výraz hydrokarbylacyl-hydrokarbylen” se vztahuje k hydrokarbylové skupině, vázané pomocí acylové skupiny -C(=0)- ne jedno či dvě valenční místa hydrokarbylenové skupiny.

Výrazy heterocyklylhydroearbyl a hererocyklyl se týkají stabilního cyklického uspořádání atomů se zahrnutím atomů uhlíku a až do čtyř atomů (označovaných jako heteroatomy) ze skupiny kyslík, dusík, fosfor a síra. Cyklické uspořádání může mít formu monocyklického zbytku s 3 až 7 atomy, nebo bicyklického s .8 až 11 atomy. Cykly mohou být nasycené či nenasycené (čítaje v to aromatické kruhy) a mohou případně mít nakonáenfeované benzo-zbytky. Atomy dusíku a síry mohou zde být v jakémkoli oxidačním stavu, čítaje v to kvarternizovanou formu dusíku. Heterocyklyhýdrokarbytový zbytek může být vázán na kterémkoli endocyklickém atomu uhlíku či heteroatomů, čímž vznikne stabilní struktura. Výhodnými takovými zbytky jsou 5-7miělenné monocyklické heterocykly, (isahující jeden nebo dva atomy dusíku ve smyslu heteroatomů. * _ Substituovaný heterocyklylhydrokarbylový zbytek odpovídá výě^uvedenému, kde nejméně jeden z cyklů je vázán na uvedený substituent, který je navázán na kruhu.

S odkazem na hýdrokarbylové a hydrokarbylenové skupiny, výraz ” deriváty kteréhokoli z uvedených, kde jeden či více atomů vodáku je nahrazeno totožným množstvím atomů fluoru”, se týká molekul, obsahujících uhlík, vodík a fluo r, nikoli však další jiné atomy.

• · • · ·

-23Výrazem aktivovaný ester” se míní taičový ester, který obsahuje odštěpující se skupinu, kterou lze snadno nahr_adit nukleofilem, jako je amin, alkohol nebo thiolový nukleofil. Takové odštěpující se skupiny jsou dobře známé a zahrnují bez jakéhokoli omezování N-hydroxyimid kyseliny jantarové, N-hydroxybenzotriazol, halogeny (jako helogenidy), alkoxylové skupiny se zahrnutím tetrafluorfenolátů, thioalkoxylové skupiny a pod. Výraz chráněný ester se týká esterové skupiny, jež je maskována či jinak převedena do nereaktivní formy. K tomu viz Greene Protecting Gcoups in Organic Synthesis „

S přihlédnutím k výše uvedeným definicím budou další ^chemické termíny, jak jsou použitelné v textu, snadno pochopitelné obeznámeným v tomto oboru. Termíny mohou být použity samostathě či v kombinaci a je výhodné, případně ještě výhodnější, aby délky řetězců, radikálů vyhovovaly všem uvedeným kombinacím.

A. Příprava značených fragmentů nukleových kyselin

Jak to zde již bylo uvedeno, je jedním z předmětů tohoto vynálezu zajištění generálního schématu pro sekvence DNA, kdy by bylo možno použití více než l6 značených vzorků v každé linii; za nepřetržitého detegování lze značené vzorky zjistit a odečtení sekvence v závislosti na míře dělení se provede právě jako při obvyklém sekvencování na podkladu fluorescence. Toto schéma je aplikovatelné na jakýkoli postup sekvencování DNA, založený na míře dělení značených molekul. 0 vhodných značených látkách i vazebných použitých složkách při použití dle tohoto vynálezu, jakož i o postupech sekvencování nukleových kyselin bude podrobnější fiskuse ještě zde dále.

1. Značené vzorky

Značený vzorek (Tů, tj.tag) chemické částice, jež se dá použít vání molekuly, těšící se zájmu a je obvykle vztažen k pojetí k jednoznačnému identifikopřesněji řečeno se týká obvyk • ··

-24le proměnné složky značené složky, at již je jakkoli těsněji vázána na ni a kterémkoli z dále uvedených činidel: značená reagující látka, značená složka a značená částice.

Značená složka, používaná při postupu dle tohoto vynálezu má několik výhod:

1) Je schopná odlišeni od všech ostatních značených složek. Toto odlišeni od ostatních chemických částí může být založeno na chromátografickém chování se značené složky (zvláště po štěpné reakci), na spektroskopických nebo potenciometrických vlastnostech, nebo jejich kombinací. Spektroskopické postupy, jimož lze značené složky jednoznačně rozlišit, zahrnují hmotnostní spektroskopii (MS), infračervená spektra (IR), •ultrafialová spektra (UV) a fluorescenci, přičemž prvé 3 postupy lze označit za výhodnější, prvý'za nejvýhodnější. Z potenciometrických postupů je výhodnou potenciometrická amperometrie.

2) Značenou složku je možno dokázat za přítomnosti az 10 mol.

,3) Značena složka je vybavena ehemickou schopností navázat se na MOI, kteroužto složku má značená látka jednoznačně identifikovat. Napojení může proběhnout přímo na MOI, nebo nepřímo prostřednictvím vazebné složky.

4) Značená složka je z chemického hlediska stabilní za všech pochodů, jimž je vystavena, čítaje v to navázání na MOI a odštěpení z MOI, jakož i ze všech manipulací, prováděných s MOI, je-li navázána tamže značená složka.

5) Značená složka nijak závažněji nevadí při ..postupech a manipulacích -s MOI, je-li tamže značená složka navázána. Např. je-li značená složka navázána na oligonukleotid, pak značená složka nesmí podstatněji vadit při jakékoli hybridizaci nebo při enzymových reakcích, prováděných s oligonukleotidem (např. PCR-sekvenčních reakcích.Podobně je-li značená složka ngvázána na antilátku, nesmí podstatněji rušit při zjištování antigenu antilátkou.

Značená složka, jež má být zjištována určitými spektroskopickými nebo potenciometrickými postupy se má vyznačovat vlastnostfc· fcfc

I · · · » · ·· » · · · ► · · · »· · · • · « • fcfc

-25mi, jež zvyšují citlivost a specifičnost zjištění tímto postupemv Typicky bude mít značená složka takového vlastnosti, protože ty byly vneseny do značené variabilní komponenty, a ta bude typicky představovat hlavní část značené složky. V dalším pojednání se výraz značená složka obvykle týká štěpného produktu, obsahujícího variabilní značenou komponentu, ale může být použit i pro variabilní značenou komponentu jako takovou, protože ta je odpovědná za možnost provedení jednoznačeného důkazu a k dosažení nutných vlastností. Ve sloučeninách vzorce T-L-X bude podíl T obdahovat značenou variabilní komponentu.

Zatím co značená variabilní složka byla takto označena za účelem charakterizování, například hmotnostní spektrometrií, může být Tg, část celku T-L-X označována jako T^ms* štěpný produkt z T-L-X, obsahující T, může být ozbačován jako T^ms-obsahující složka. Následující spektroskopické a potenciometriď postupy se mohou použít k charakterizování podílů, obsahují, , _mms cích T .

s Charakterizování značených složek hmotnostní spektrometrií

Pokud se má značená složka analyzovat hmotnostní spektrometrií (např.tedy v příůadě značené složky, sledovatelné hmotnostní chromatografií, kdeže tato část je označována také jako složka-obsahující ’'T^ms”), pak je základním předpokladeem pro značnou složku, aby byla ionizovatelná. Je tedy výhodným předpokladem pro zjištování značených složek pomocí hmotnostní chromatografie,__aby tamže byla vnesena a přítomná chemická funkce , nesoucí kladný nebo záporný náboj za podmínek ionizování při hmotnostní spektrometrii. Tento rys přispívá ke zvětšení tvorby iontů a celkově vyšší citlivosti při konstitučním sledování, zvláště elektrosprejovou ionizací. Chemická funkce, jež podporuje tvorbu ionizovaného stavu, se může odvozovat od T^ms či L, nebo od obou dvou typů. Faktory, které zvašují relativní citlivost analyzované látky, sledované hmotnostní spektrometrií, jsou diskutovány např. v pojednání Sunner-a a spol., Anal.Chem. 60, 1300-1307 (1988).

• · » « • · • · • ·· »· · · «

-26Výhodnou funkcí k usnadnění vzniku záporného náboje, je některá z organických kyselých funkcí, jako je fenolická hydroxylové skupina, karboxylová skupina, skupina fosfonátová, fosfátová, tetrazolová, sulfonylmočovinová, perfluoroalkoholová a zbytek sulfonové kyseliny.

Výhodnou fuhkcí pro usnadnění kladného náboje za podmínek ionzizace jsou alifatické a aromatické aminy. Jako příklady aminových funkčních skupin, kdy dochází ke zvýšení možnosti zjištění pomocí hmotnostní spektroskopie značených složek, lze uvést kvartérnizované aminy (tj.aminy, jež mají na dusíku 4 vazby, každou z nich směřující na atom uhlíku) v tomto směru viz Aebersold, US pat.spis 5 240 859, a terč.aminy (tj. dusíkaté látky se třemi vazbami směřujícími vždy na atom uhlíku s tím, že sem patří i látky se skupinou C=K-C, jako je tomu například v pyridinu, vis Hess a spol., Anal.Biochem. 224. 373 )19959, dále Bureš a spol., Anal.Biochem. 224. 364 (1995). Stericky bráněné terč.-aminy jsou zvláště výhodné. Terč.aminy i kvarterní amoniové soli mohou být povahy alifatické či aromatické. Část, obsahující T^ras, musí obsahovat nejméhě jednu ionizovstelnou složku, ale může jich obsahovat a i více. Výhodným nábojem je jediný ionizovaný druh na jednu značenou složku. Ve shodě s tím je výhodné, aby každý podíl s obsahem T (a tedy každá značená variabilní komponenta) obsahovala pouze jeden sterický bráněný amin nebo skupinu organické kyseliny.

Jako vhodné skupiny, obsahující aminovou funkci, jež mohou tvořit část složky, obsahující T^ras, je možno uvést tyto další:

O-(C₂-Cio

π _a ^bl 10

• · ··

-27-<°ι-^σιο»γ2^

/—\ •Η >-(ο.,-σ₁₀)• φ · φ • φ φφ • · · φ φ φ φ φ φφ φφ φφ φφ φ · φ φ • φ φφ • ΦΦΦ φ φ · φ • Φ φφ

^<^ci“^cioK

Λ \_

Identifikování značené složky pomocí hmotnostní v spektrometrie se s výhodou provádí na základě odpovídajícího poměru molekulární hmotnosti k náboji (m/z). Výhodné molekulární hmotnostní rozmezí značených složek MS se pohybuje v rozmezí od asi 100 do 2000 daltonů a s výhodou podíl s obsahem T^ms má hmotnost nejméně asi 250 daltonů, s výhodou nejméně asi 300 · —daltonů a ještě výhodněji nejméně asi 350.....daltonů. Je zpravidla nesnadné pro hmotnostní spektrometry rozlišit mezi podíly ty, které mají matečné ionty pod asi 200 až 250 daltonů (v závislost na přesnosti přístroje), takže výhodné podíly s obsahem T^ms mají hmotnost nad tímto rozsahem.

Jak to již bylo vysvětleno výše, podíl, obsahující T^ms může obsahovat jiné atomy, než jsou ty, které jsou přítomné ve variabilní komponentě značené složky a ve skutečnosti i jiné, než jsou v T^ms jako látce co takové. Podle toho hmotnost samotné látky T^ms může být pod asi 250 daltonů, a to tak dlouho, pokud podíl T^ms má sám hmotnost nejméně asi 250 daltonů. Takže • · • » hmotnost T^ms může kolísat od 15 (tj. např.methylový radikál) do asi 10 000 daltonů, s výhodou se pohybuje v rozmezí od 100 do asi 5000 daltonů a nejvýhoěněji od asi 200 do asi 1000 daltonů.

Je poměrně obtížné rozlišit značené složky hmotnostní spektrometrií, pokud takové složky obsahují atomy, obsahující více než jeden izotop v podstatném nadbytku. Dle toho výhodné skupiny T, které jsou určené pro hmotnostní spektrometrii a spektroskopické identifikování (T skupiny) obsahují uhlík, nejméně jeden vodík a fluor a případně další atomy ze skupiny, kterou tvoří kyslík, dusík, síra, fosfor a jod_o I když mohou být v T^ms další jiné atomy, pak jejich přítomnost může poněkud znesnadnit analýzu pomocí údajů hmotnostních spekter. S výhodou T^ms skupiny obsahují pouze uhlík, atomy dusíku a kyslíku navíc k vodíku a/nebo fluoru.

Fluor je výhodný a dokonce preferovaný atom ve skupině ms ve srovnání s vodíkem je fluor pochopitelně těžší. Takže ,ms přítomnost atomu fluoru místo vodíkových způsobí u skupin T že mají vyšší hmotnost a tím je možno, že skupiny T ’ dosahují až i převyšují hmotnost nad 250 daltonů, a to je žádoucí, viz zde dříve. Navíc náhrada vodíku fluorem vede k větší těkavosti podílu, obsahujícího T , a větší těkavost analyzované látky zvyšuje citlivost použité hmotnostní^spektrometrie, použité jako analytické metody.

ms z \x

Molekulární vzorec T spadá do rozmezí, vyjádřeného vzorcem ^C1-500^IxT0-100°0-100^S0-10^]?0-10^íí A ^{F kde sou}°et a iXje dostaču ^¹⁰¹ k uspokojení jinak nenasycených vazností atomů uhlíku, dusiku, kyslíku, síry a fosforu.

Označení 0₁_₅g₀N₀_₁₀₀0_e_₁₀₀SQ_₁₀P₀_₁₀H_iPj.iy'_znamená, že T^ms obsahuje nejméně jeden, ale může obsahovat jakékoli množství od. 1 do 500 atomů uhlíku, navíc až případně 100 atomů dusíku (N’/ znamená, že T^ms neobsahuje žádný atom dusíku) a až 100 atomů kyslíku, až 10 atomů síry a až 10 atomů fosforu. Symboly Ά, ^představují počet atomů vodíku, fluoru a jodu v T^ms když kterékoli z těchto dvou čísel mohou znamenat nulu a kde

-2 9• · «· *

a kde součet těchto Čísel odpovídá celkovému počtu jinak nenasycených vazeb na uhlíku, dusíku, kyslíku, síře a fosforu. S výhodou má. T^ms molekulární vzorec, spadající do rozsahu ^G1 50^0 l0°0-10d_ ^F * kde 4 «^znamena jí dohromady číslo, jež se rovná počtu atomů vodíku a fluoru, přítomných v částici

X®

Chrakterizování spektry značených složek infračervenými

Jssu dvě zásadní formy infračerveného zjištování organických chemických skupin: Ramanovo rozptylové infračervené spektrum a absorpční infračervené, spektrum. Dohromady jsou . označována jako spektroskopické postupy. Obecně lze říci, že Ramenová excitace záleží na zrněných polarizevanosti vazeb, zatím co absorpční infračervená spektra jsou závislá na změnách vazebného dipolového momentu. Čáry slabé absorpce infračervených spekter zesílí v Ramenových spektrech a naopek. Pro infračervená spektra jsou charakteristickými jednotkami vlnočty. Jsou zde 3 spektrální oblasti pro infračervená spektra značených složek s možností oddělitelných použití a aplikací: blízká IR v oblasti

12500 až 4000 cní*\ střední IR 4000 až 600 cm”'^L a daleká v oblasti 600 až 30 cm^-·*·. Pro zde používané použití, kde sloučenina se použivá jako značná složka pro identifikaci Μ0Ι, vzorku či priméru je výhodná střední spektrální oblast. Tak například karbonylová vazba (1850 až 1750 cm^) se měří pro karboxylové kyseliny, jejich estery a amidy, alkyl- a arylestery kyseliny uhličité, karbamáty a' ketony . Va zba Ν-Ή (1750-160 cm*) se použi j e při iďentifiková ní —1 aminů, amoniových iontů”a’ amidů. Při 1400 až 1250’cm se zjistí = vazba R-OH, jakož i C-H v amidech. Aromatické substituční stavy se zjistí při 900 až 690 cra^ (vazba C-H, N-H v případě ArNHg ). Nasycené vazby uhlíku s vodíkem, olefiny, aromatické cykly, dvojné a trojné vazby, estery, acetaly, ketaly, amoniové soli, sloučenina s vazbou N-0, jako jsou oximy, nitrosloučeniny, N-oxidy a nitráty, azosloučeniny, hydrazony, chinony, karboxylové kyseliny, amidy a laktamy, ty všechny obsahují porovnatelné infračervené vibrační údaje, viz Pretsch a spol., Spectral Data for Strupture Determination of Organic Compounds, Springer-30* · ···» *

► · ·· » * · « » * · « ·« ··

Verlag, New $ork 1989). Mezi výhodné sloučeniny v tomto směru patří aromatické nitrily s velmi silnou nitrilovou vibrací mezi 2230 až 2210 cm“\ Dalšími vhodnými typy jsou aromatické alkiny se silnou vibrací s ostrým absorpčním pásem mezi 2140-2100 ckT\ Třetím typem této skupiny jsou aromatické azidy s intenzivním absorpčním pásem v rozmezí 2l60 až 2120 cm^-\ Thiokyanatany jsou reprezentanty sloučenin ge silnou absorpcí mezi 227 5 až 2263 cm~\

c. Charakterizování značených složek ultrafialovými spektry

Souhrn organických chromofornich typů a jejich v ultrafialových spektrech viditelné vlastnosti jsou uvedeny v publikaci Scott Interpretation of the UV Spectra of Natural Products',’ Pergamon Press, New York, 1962 . Jako chromofor je označován atom nebo skupina atomů či elektronů, které jsou odpovědné za případnou světelnou absorpci. Jsou zde empirická pravidla pro hodnoty /(_ až jj maksim v konjugovaných systémech, viz Pretsch a spol., Spectral Data for Structure Determination of Organio Compounds, str. B65 až B70, Springer-Verlag, New

York, 1989). Výhodné sloučeniny ( s konjugovaným systémem) £

se budou vyznačovat přechodem n až jt- a Jk až /V . Příklady takových sloučenin viz Acid Violet 7, Acridine Orange, Acridine Yellow O, Brilliant Blue G, Congo Red, Crystal Violet, Malachite Green jako oxalát, Metanil Yellow, methylenová modř, methyloranž, methylviolet B, naftolová zeleň B, Oil Blue N, 011 Red 0, 4-fenyl azofenol, Safranie 0, Solvent Green 3 a Sudan Orange G a„ty jsou všechny běžně obchodbě dostupné /Aldrich, Milwaukee, WD). Jsou uváděny i další vhodné sloučeninym viz např. Jane ₉ spol.,

J .Chrom. 323, 191-225 (1985).

d. Charakterizování značených složek fluorescencí

Fluoreskující vzorky se identifikují a kvantitativně vyhodnotí vlnovými délkami absorpce a fluorescenční emise, jakož i použitím odpovídajících intenzit. Emisní spektra (fluorescence a fusforescence) jsou mnohem citlivější a dovolují specicičtější měření ve srovnání s absorpčními spektry. Jin£fotofy-

Q • ·

-31• · «· φ φ φ φ

zikální charakterizování, jako je životnost excitovaného stavu a fluorescenční anizotropie se využívají podstatně méně.

Obecně nejuživatelnějšími parametry zjištování intenzity je molární extinkční koeficient či odpovídající koeficienty pro absorpci a kvantové zjištění (quantum yield, QY) fluorescencí. Hodnota £ je specifikována pro jedinou vlnovou délku (zpravidla maximum absorpce vzorkuj zatím co hodnota QY je mírou totální fotonové emise z hlediska celého profilu spektrální fluorescence. Pro fluorescenční excitaci (cestou absorpce) se obvykle používá úzké optické pásové rozmezí (pod 20 nm), zatím co pásová rozmezí pro fluorescenční detekci jsou mnohem variabilnější a v + zasahují od plného spektra maximální citlivosti az k uzkému pásu ( asi 20 nm) pro nejvyšší rozlišeni. Fluorescenční intenzita vzorku molekuly je úměrná produktu z a QY. Rozmezí těchto parametrů mezi chromofory běžné praktické důletitosti činí asi 10 000 až 100 000 cm^ pro £ a 0,1 až 1,0 pro QY, Sloučeniny, použitelné jako fluoreskující značné vzorky jsou tyto: rhodamin, modř Lambda 470, zelen lambda, červen lambda 664, červen lambda 665, 'akridinová oranž a propidiniumjodid, vse běžně dostupné od Lambda Fluorescence Co (Plea.sent Gap, PA). Jiná fluoreskující činidla, jako je nilská červen texaská červen, lissamine , mv·

BODIPY jsou dostupné od Molecular Probes (Eugene, OR).

e Potenciometrické charakterizování značených složek

Princip elektrochemické detekce (BOD) je založen na oxidaci či redukci sloučenin, které za určité nanesené voltáže, jsou buď donorem či akceptorem elektronů ža vzniku proudu, který lze změřit. Pokud jsou některé sloučeniny vystaveny účinkům diferenčních potenciálů, pak molekula podléhne molekulárnímu přesmyku na povrchu pracovních elektrod za ztráty (oxidace) nebo získání (redukce) elektronů; takovým sloučeninám se říká, že jsou elektronické a podléhají elektrochemické reakci.EC-detektory nanesou voltové napětí na povrch elektrory, po kterém teče eluent z vysokotlakové kapalinové chEomatografie. Elektroaktivní slouče• ·

I ···· » * · · · · ··· * * • · 9 9 · * . · · ♦

... 9 99 ·· «· ··

-32niny, eluované z kolony, jsou buď donory elektronů (oxidující) nebo potřebují elektrony (redukující) za vzniku proudového píku v reálném čase. Podíl vzhiklého proudu je velmi důležitě závislý jak na koncentraci analyzované látky, tak i na naneseném voltovém napětí s tím, že každá sloučenina má své specifické voltové napětí, za kterého se začne oxidovat či redukovat. Nejběžnějším obecně známým elektrochemickým detektorem je amperometrický detektor, na kterém se udržuje potenciál konstantní a měří se potom proud vzniky elektrochemickou reakcí. Tento typ spektrometrie se běžně označuje jako potensiostac amperometf ie”. Komárně jsou amperometry dostupné od ESA, lne., Chemfordi, MA .

Pokud je účinnost detekce 100%ní, pak jsou specializované detektory označovány jako ''coulometrické”.Jsou citlivé a mají určité výhody z praktického hlediska se zřetelem ns selektivitu a citlivost a proto jsou tyto detektory užitečné na určitém úseku. Při použití coulometrických detektorů se za dané koncentrace analyzované látky nanáší signální proud jako funkce naneseného potenciálu (voltáže) proti pracující elektrodě. Výsledný sigmonální graf se nazývá křivkou proud/napětí nebo hydrodynamickým voltammagramem (HDV)..JOV umožňuje nejlepší volbu potenciálu nanášeného na pracovní elektrodu, jež dovoluje maximalizovat pozorovaný signál. Velkou výhodou ECD je bezprostřední citlivost na hladinu proudu detekce v subfentomolárním rozmezí.

Četné chemikálie a sloučeniny jsou elektrochemicky aktivní, čítaje v to četné biochemické sloučeniny^ farmaceuticky používané látkya pesticidy. Chromátograficky koeluovatelné sloučeniny lze účinně rozdělit,i když' jejich půlvl nový potenciál (potenciál poloviny signálu maxina) se liší v rozmezí pouze 30-60 mV,

V současné době vyvinuté coulometrické sensory zajištujj selektivitu, identifikaci a rozdělení koeluovaných sloučenin, použijí-li se jako detektory při děleních, založených na chromatografii kapalin.

• 4

9 • ♦ · ·

4 φ

4

4-4

Λ

-334 4 «· * 1

4 · ♦

4944 * · ♦ i ·

4 4 *

A proto takové vhodně uspořádané detektory představují další možnost provádění dělení, jež provede detektor sám.

Běžné přístroje obsahují l6 kanálků, jejichž výkonnost je omezena v podstatě jen rychlostí, za které lze potřebné údaje získat. Počet sloučenin, které je možno dělit za SC-uspořádání je z chromátografického hlediska omezen (např.omezením počtu destiček). Avšak jestliže dvě sloučeniny, nebe i více, které jsou chromátograficky koeluovatelné, se vyznačují rozdílem půlvlnového potenciálu 30 až 60 mV, je zařízení schopno je rozlišit. Schopnost sloučenin k elektroaktivnímu rozlišeni je závislá na tom, zde obsahují EC-aktivní skupinu (například hydroxylovou, kyslík, síru nebo dusík).

Mezi sloučeniny, které byly s úspěchem detegovány použitím coulometrických detektorů, patří 5-hydroxytryptamin, 3-metho- ’ xy-4-hydroxyfenylglykol, kyselina homogentisová, dopamin, metanefrin, 3-hydroxykynurenin, acetaminofen, 3-hydroxytryptol, kyselina 5-hydroxyindoloctová, oktansulfonová, fenol, o-kresol, pyrogallol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, 2,4-dinitrofenol,

4.6- dinitrokresol, 3-methyl-2-nitrofenol, 2,4-dichlorfenol,

2.6- dichlorfenol, 2,4,5-trichlorfenol, 4-chlor-3-methylfenol, 5-methylfenol, 4-methyl-2-nitrofenol, 2-hydroxyanilin, 4-hydroxyanilin, 1,2-fenylendiamin, benzokatechin, buturan, chlortholuron, diuron, isoproturon, linuron, methobromuron, metoxuron, monolinuron, monuron, methionin, tryptofan, tyrosin, kyselina 4-aminobenzoová, 4-hydroxybenzoová, 4-hydroxykumarinová, 7-methoxykumarin, apigenin, baikalein, kyselina kávová,......

katechin, cenraurein, kyselina chlorgenova, doidzein, datisCGbin, diosmetin, epikatechin-galar, epigallo-katechin, epigallo-katechin-galát, euganoi, eupatorin, kyselina ťerulova, fiset

Z ' gaiangm, Kyselina galova, gardenin, genistein, kyselina gentisova hesperidln, irigenin, kemřerol, Isukokyanidm , luteolin, mangostin, morin, Myricetin, naringin, narirutin, pelargonidin, peonidin, floretin, pratensin, kyselina protokatechová, rhamnetin, kvercetin, sakuranetin, skutelarein, skopoletin, aldehyd kyseliny syringové, kyselina syringová, tangeritin, troxerutin, umbeliferon, kyselina vanilová, 1,3-dimethyltetrahydroisochinolin, 6-hydroxydopamin, r-salsolinol, N-methyl-r-salsolinol, <9 · • φ

ΦΦΦ Φ • ·

Φ Φ « “35tetrahydroisochinolin, amitriptylih, apomorfin, kapsaicin, chlordiazepoxid, chlorpromazin, daunorubicin, desipramin, áoxepin,flhoxetin, fluorazepan, imipramin, isoproterenol, Hethoxamin, morfin, morfin-3-glukuronid, nortriptylin, oxazepam, fenylefrin, trimipramin, kyselina askorbová, K-acetylserotonin, 3,4-dihydroxybenzylamin, kyselina 3,4-dihydroxymandlová (DOMA), 3,4-dihydroxyfenyloctová (DOPAC), 3,4-dihydroxyfenylalanin (L-DOPA),

3,4-dihydroxyfenylglykol (DHPG), kyselina 3-hydroxyanthranilová, 2-hydroxyfenyloctová (2HPAC), 4-hydroxybenzoová (4HBAC), 5“hydroxyindol-3-octová (5HIAA), 3-hydroxykynurenin, kyselina

3- hydroxymandlová, 3-hydroxy-4-methoxyfenylethylamin, kyselina

4- hydroxyfenyloctová (4HPAC), 4-hydroxyfenylmléčná (4HPLA),

5- hydroxytryptofan (5HTP), 5-hydroxy£ryptofol (5HTOL), 5-hydroxytryptamin (5HT), , jeho síran, 3-aethoxy-4-hydroxyfenylglykol (MHPG), 5-methoxytryptamin, 5-methoxytryptofan, 5-methoxypraktofol, 3-methoxytyramin (3MT), 3-methoxytyrosin (3-0M-D0PA), 5-methylcystein, 3-methylguanin, bufotenin, dopamin, jeho 3-glukuronid, dopamin-3-sulfán a -4-sulfát, epinefrin, epinin, kyselina folová, glutathion (redukovaný), guanin, guanosin, kyselina homogentisová (HGA), homovanilová(HVA), dále homovanilylalkohol (HVOL), kyselina homoveratrovu, hva-síran, hypoxahthin, indol, kyselina indol-3-octová a indo1-3-mléčná, kynurenin, melatonin, metanefrin, N-methyltryptamin, N-methyltyramin, N,N-dimethyltryptamin, Ν,Ν-dimethyltyramin, norepinefrin, normetanefrin, oktopamin, pyridoxal, jeho fosfát, pyridoxamin, synefrin, pryptofol, tryptamin, kyselina močová, venilylmandlová (vma), xanthin a xanthosin. Pro další vhodné látky viz např. Jane I. a spol.,

J.Chrom. 323. 191-225 (19θ5) a Ivíusch G., a spol., J.Chrom. 348. 97-110 (1985). Tyto sloučeniny lze vtěsnat do látek vzorce T-L-X použitím jinak známých postupů. Například sloučenin s karboxylovou skupinou mohou reagovat s aminem, hydroxylovou skupinou atd. za vzniku amidu či esteru atd a lze vytvořit i jiné vazby mezi T a L.

-36♦ · · • · · * «··· • ·

999 9

Navíc k výše uvedeným vlastnostem a bez zřetele na zvolenou detekční metodu je žádoucí, aby značená složka měla_ modulární chemickou strukturu. To nepomáhá velmi při kontruování velkého počtu strukturně příbuzných značených složek za použití techniky kombinační chemie. Tak např. jsou žádoucí pro skupinu T některé vlastnosti. Je žádoucí, aby obsahovala funkční skupinu, jež podporuje jediný ionizovaný nábojový stav, je-li τη c?

složka, obsahující T sledována hmotnostní spektrometrií;( jednodušeji je-li to látka, podporující citlivost hmotnostních spekter, tedy mass spéct.sensitivity enhancer”, jinak MSEE).

Také je žádoucí, aby mohla být použita jako jediný člen ve skupině látek, obsahujících T‘ , kde jednotliví členové této skupiny mají vzájemně lišící se poměr hmotnost/náboj, ale současně mají přibližně tutéž citlivost pro hmotnostní spektrometrii.

Takže členové této skupiny mají totéž LíSEE, Se zřetelem na tvorbu a přípravu skupin takových sloučenin bylo nalazeno, že je vhodné generovat značené složky cestou modulární syntetické chemie, takže lze nazírat na sloučeniny, obsahující značené složky jako akupiny s T^ms, očbsahující moduly.

Je výhodným postupem z hlediska modularity ke struktuře strukturu aby T^ms měla

T²-(J-T³-)_nkde T² je organický podíl, vytvořený z uhlíku e jednoho či více vodíků, fluoru, jodu, kyslíku, nusíku, síry a fosforu s hmotnostním rozsahem 15 až 500 daltonů, dále kde T³ je organický podíl, vytvořený z uhlíku a jednoho ci více vodíku, nuoru, jocu, kyslíku, dusíku, síry a fosforu v hmotnostním rozsahu 50 až 1000 daltonů.

V takovém případě znamená J přímou vazbu, nebo některou z funkčních skupin, jako je amidová, esterová, aminová, sulfidová, etherová, thioesterova, disulfidická, thioetherová, močovinová, karbamátová, thiokerbamátová, některá ze Schiff-ových bází, případně redukovaná, iminová, oximová, hydrazonová, fosfáto¹ fosfonátová, fosforamidová, fosfonamidová, sulfonátová, sulfonamidová, nebo vazba, uhlíku na uhlík; n znamená celé kladné číslo od 0 do 50 a to tak, že pokud, je te větší než 1, pak T³ a J jsou voleny na sobě nezávisle.

• ·'

-374

3 ^v

Modulární struktura T -(J-T^) podminuje vhodné vsunutí do skupiny sloučenin vzorce T-L-X, kde každý člen této skupiny ,ms má líčící se skupinu T. Tak například pokud T znamená Τ’ každý z členů této skupiny má nutně shodné MSSE, jedna ze skupin T^ může odpovídat struktuře MSSE. S přihlédnutím k šeřízení variability mezi členy skupiny v pojetí hmotnosti Τ’ , může se skupina T obměňovat mezi členy této skupiny. Tak například 2 jeden člen této skupiny má jako T methylovou skupinu, jiný ethylovou a další propylovou atd.

Se zřetelem na zajištění rozdílné hmotnosti nebo velkých

-“v skoků v hmotnostech se může skupina T^-5 označit jako podstatný přírůstek (například od 1 do několika set) hmotnostních jednotek do

TLX. Takovou skupinu lze pak označit jako skupinu, jež upravuje či adjustuje rozsah molekulárních hmotností skupiny

V/RA (weight range adjuster). Tato skupina je velice užitečná, pokud se pracuje jen s jedinou sadou skupin T~, jež budou mít hmotnosti přesahující omezené rozmezí. Jediná sada skupin T“

PIS se může použít cro seřízení skupin T s velmi širokým rozsahem * - * . 3 hmotností a to jednoduše vsunutím jedné či více WRA-T skupin do T^ms. Takže za ooužití jednoduchého příkladu:jestliže sada skupin T se nalézá v hmotnostním rozsahu 250 až 340 daltonů pro skupinu T^ms, vsunutí jedné Y/RA, jež má například 100 daltonů, jako skupina T zajistí postup do hmotnostního rozsahu 350 až 440 daltonů při použití téže sady skupin T .Podobně vsunutí dvou WA skupin s 100 daltony (každá jako skupina T^) umožní vstup do hmotnostního rozmezí 450 až 540 daltonů, a tamže inkrementální přidávání skupin V/RA může pokračovat až do velkého hmotnostního rozsahu pro skupiny Τ' . Výhodné sloučeniny vzorce T²-(J-T³-)n-L-X mají vzorec ^Rvwcr(^p^_ra)-^gsE“^L-X’ ^{kde WG} znamená skupinu T a každá ze skupin WRA (wra) a MSSE znamená skupinu T . Struktura je doložena vyobrazením 12 a představuje iris jeden z modulárních přístupů pro přípravu T‘ .

• ·

-382 3 2 3

Ve vzorci Τ -(J-T -) - se Τ a Τ s výhodou zvolí ze skupiny kterou tvoří tyto: hydrokarbylová, hydrokarbyl-O-hydrokarbylenová, hydrokarbyl-S-hydrokarbylenová, hydrokarbyl-NH-hydrokarbylenová, hy dr o kar by 1-amido-hydrokar by lenová, N-( hydrokar byl )-hydro kar byle nová, N,N-di(hydrokarbyl)-hydrokarbylenová, hydrokarbylapylhydrokarbylenová heterocyklylhydrokarbylová, kde heteroatom/y mohou být kyslík, dusík, sírg a fosfor, dále sem patří substituované heterocyklylkydrokarbylové skupiny, kde heteroatom/s patří do skupiny kyslík, dusík, síra a fosfor a substituenty jsou zvoleny z těchto: hydrokarbylová, hydrokarby1-0-hydrokarbylenové, hydrokarby1-NH-hydrokarbylenové, hydrokarbyl-S-hydrokarbylenové, N-(hydro karbyl)-hydrokarbylenové, N,N-di.(hydrokarbyl)hydrokarbylenové a hydrokarbylacyl-hydrokarbylenová. Dále oak T a/nebo mohou být deriváty kterékoli z dříve uvedených ootenciálbí skupin T /T^ tak, že jeden či více atomů vodíku se nahradí fluorem.

n

Dále se zřetelem na vzorec T -(J-T’'*-) - má výhodná skupina o o n vzorec -G(lU·)-, kde G znamená alkylenovou řetězovou skupinu s jedním až šesti atomy uhlíku s jediným substituentem R . Takže znamená-li G ethylenovou skupinu (-Gl^-G^-) > pak jeden nebo oba dna ethylenové uhlíky mohou mít substituent R , který je zvolen z těchto možných skupin: alkylová, alkenylová, alkinylová, cykloalkylová, cykloalkylová s na kondenzovaným arylovým cyklem, cykloalkenylová, arylová, aralkylová, aryl-substituovaná alkenylová nebo alkinylová, cykloalkyl-substituov_sná alkylová, cykloalkenylsubstituovaná cykloalkylová, biarylová, alkoxylová, alkenoxylová, slkinoxylová, aralkoxylová, aryl-substituovaná alkenoxylová nebo alkinoxylová, alkylaminoskupina, alkenylamino- či alkinylaminoskupina, arylaubstituovaná alkylaminoskupina či takto substituovaná alkenylamino či alkinylaminoskupina, aryloxylová, aryla.minová, N-alkylraočovinu, substituovanou alkylem, N-arylmočovinu substituovanou alkylem, alkylkarbonylaminosubstituovanou alkylovou skupinu, aminokarbonylsubstituovanou alkylovou skupinu, skupinu heterocyklylovou, heterocyklysubstituovanou alkylovou, heterocyklylsubstituovanou aminoskupinu, karboxyalkylsubstituovanou aralkylovou skupinu, oxokarbocyklyl-makondenzovanou 'lovou skupinu a heterocyklylalkylovou skupinu, dále »

• φ <·

• ·

skupinu cykloalkenylovou, aryl-substituovanou alkylovou e aralkylovou, hydroxysubstituávanou, alkoxysubstituovanou, aralkoxysubstituovanou, alkoxysubstituovanou, sralkoxysubstituovanou, aminosubstituovanou alkylovou skupinu, (arylsubstituovanou alkyloxykarbonylamino)-substituovanou alkylovou, thiolsubstituovanou alkylovou, alkylsulfonylsubstituovanou alkylovou, (hydroxysubstituovanou alkylthip)-substituoyenou alkylovou skupinu, thioalkox_vsubstituovanou alkylovou skupinu, hydro karbykacylaminosubstituovanou alkylovou skupinu, keterocyklylacylaminosubstituovanou alkylovou skupinu, hydro karbylsubstituovanou-heterocyklylacylamino-substituovanou alkylovou skupinu, alkylsulfonyleminosůbstituovanou alkylovou a arylsulfonylaminosubstituovanou alkylovou skupinu, morfolinosubstituovanou, thiomorfolinosubstituovanou a morfolinokarbonylsubstituovanou alkylovou skupinu, případně ještě v alkylové části dále substituovanou, |_N-(alkyl, alkenyl . nebo alkinyl)- nebo K,lí- dialkyl, dialkenyl, dialkinyl nebo (alkyl, alkenyl)-amino |-karbonylsubstituovanou alkylovou skupinu heterocyklylaminokarbonylovou skupinu, heterocyklylaikylenaminokarbonylovou skupinu, heterocyklylaminokarbonylsubstituovanou alkylovou skupinu, heterocyklylalkylenaminokarbony1-substituovanou alkylovou skupinu, N,IÍ-( dialkyl)-alkyle námi no kar bonylsubstituovanou či K,N-(dialkyl)-alkylenaminokarbonylsubstituovanou alkylovou skupinu, alkylsubstituovanou heterocyklylkarbonylovou, heterocyklylkarbonylalkylovou substituovanou alkylovou skupinu, di^lkylaminosubstituovanou acylaminoalkylovou skupinu a aminokyselinové postranní řetězce, odvozené od argininu, aspareginu, gluteminu, S-methylcysteinu, methioninu a odpovídajícího sulfoxidu a odpovídajících sulfonových derivátů, glycinu, leucinu, isoleucinu, allo-isoleucinu, terč.-leucinu, norleucinu, fenylalsninu, tyrosinu, tryptofanu, prolinu, alaninu, ornithinu, his«idinu, glutaminum valinu, threoninu, šeřinu, kyseliny asparagové, ť^-kyanalaninu ^a sllothreoninu, dále od alynylových a heterocyklylkarbonylových, amino karbonylových derivátů, látek s amidovou skupinou, mono- nebo dialkylaminokarbonylovou, mono- nebo diatylaminokarbonylovou, alkylarylaminokarbonylovou, diarylaminokarbonylovou, mono- n^bo diacylaminokerbonylovou, • · ··· · • ·« · · » · · · * 4 ·

-40aromatickou nebo alifatickou skupinou, nebo ze skupiny substituen tů, případně alkylovou skupinou substituovaných, jako jsou skupiny aminové, karboxylové, hydroxylové, merkaptoskupiny, mononebo dialkylaminoskupiny, mono- nebo diarylaminoskupiny, alkylarylaminoskupiny, mono- nebo diacylaminoskupiny, alkoxylové, alkenoxylové, aryloxylové, thioslkoxylové, thioalkenoxylové, thioalkinoxylové, thioaryloxylové a heterocyklylové.

Výhodné sloučeniny vzorce T^e-(_n-L-X mají strukturu

A T '

A kde G znamená jednu až šest methylenových skupin (CH,,) s tím, že vodík na jedné, ale pouze jedné ze skupin CHg, který je vyznačen jako G je nahrazen seskupením -(CH?) -amido-T‘,

4. z ^{r G} kde dále T a T jsou organické skupiny vzorce ^C1-25'^TO-9°O-9^HX^P β s tím, že součet

Λ + (S dostačuje k uspokojení jinak nenasycených vazeb na atomech uhlíku, dusíku a kyslíku, amido skupina má vzorec 0 0 il

-N-C- ... nebo -C-N*1 '1 kde R^ znamená vodík nebo alkylovou skupinu s jedním až deseti atomů uhlíku, c znamená celé kladné číslo od 0 do 4 a n znamená celé kladné číslo od 1 až do 50 a to tak, že je-li 14, n větší než l,,pak se volí G, c, amidoskupina, R a T vzájemně nezávisle.

Podle dalšího výhodného provedení má sloučenin^ vzorce T²-( J-T*^-) _n~L-X strukturu:

-41• · 4 9

9 9 «

4 94

4 9 « • · · 4 ·· ··

Τ

kde Τ'⁵ znamená organickou skupinu vzorce ^p A a to tak, že součet d\ + (^dostačuje k uspokojení všech'jinak nenasycených vazeb na atomech uhlíku, dusíku a kyslíku, dále 5 kde T znamená terc,_amin nebo kvart.amoniovou skupinu nebo zbytek organické kyseliny, m znamená celé kladné číslo od ·η do 49 a Τ , T ', R¹, L a X mají významy, jak zde již byly uve d e nv.

p J

Další výhodná skupina sloučenin vzorce T~-(J-T'-) -L-X• má tu to s truk t ur u:

_T4

I amid o

X amieo

I ^t5 kde T znamená organickou skupinu vzorce ^g1_2cUq_^0₀_qR_^ a to tak, že součet +(p je dostačující k uspokojení všech jinak nenasycených vazeb na atomech uhlíku, dusíku a kyslíku, T^ znamená terč.-amin nebo kvart.amoniovou skupinu či zbytek organické kyyeliny, m je celé kladné čáslo p A Ί od 0 do 49, a Τ , Τ , c, R , amidoskupina, L a X mají významy, jak zde již byly dříve uvedeny.

• · • · · «··· • · · ·

-425

Ve výše uvedených strukturách se skupinou T má seskuc pění -amido-T s výhodou jednu z dále uvedených struktur, a ty se pohodlně připrsvují reakcí organických kyselin a volnou aminoskupinou či aminoskupinami, jak jsou na zbytku 0”:

/

-HNC _< n O

>— o<c₂-c₁₀)-n )Ci ^Cl(?

mc-(c_n-c_nn)-N u \ o

J-T

-H1ÍC-(C_O-C_1O).

O

•^KH°r\

O '-NHC-(C,-C_in)-N (I I lU | o ^L

pokud výše uvedené sloučeniny obsahují skupinu T a skupina

G” má volnou karboxylovou skupinu (nebo odpovídající reaktiv5 ní derivát), pak dále uvedené výhodné seskupení -amido-T^ lze běžně připravit reakcí vhodného organického aminu s volnou karboxylovou skupinou na seskupení ”G”:

•CHH-(C -C -)-I!

g ^{2 10}

/

-CNH-(C₉-C_in)-N íl 2 10 _v • · ·· ·· ·· ·· ··· <······· · · · · ·· · · ·· • ···· · · 9 9 9 9 999 · · • · ···· ··· «·· · ·· 99 99 99

-43-C_NH-(C_O

-«ιοΜ

K-Ciq)

-CNHlí

ΛΛ

Ό-Ν I

-°io’

Ve třech výhodných provedeních dle tohoto vynálezu má seskupení T_L-MOI dále uvedené struktury:

(0^0^)-0^1-3

-OH l

arniko

nebo • · ···· · · • · ··· ·

Η (Ο^-Οθ)-0DN-3 '-ΟΗ kde Τ θ znamenají organická seskupení vzorce ^G1-25^KO-9°_o_₉§(O-3)^PO-3^HR ^I(T ^{8 to t8kj} že součet gí ·.

3θ dostačující k uspokojení všech jinak nenasycených vazeb atomů uhlíku, dusíku, kyslíku, síry a gosforu, kde dále G zname.ná skupinu (CH^ _e j_e(3_{en a} pouze jeden vodík methylenové skupiny ve smyslu G je nahrazen seskupením -(CHp) -amido-T^? amido-skupina má vzorec n

-N-cR¹ nebo -C-Nh

R^-1· znamená vodík nebo alkylovou skupinu s jedním až deseti atomy uhlíku, c je celé kladné číslo v rozsahu od 0 do 4,

02-0-^θ^η znamená hydrokarbylenovou skupinu se dvěma až deseti atomy uhlíku, ODN-3 '-0H znamená fragment nukleové kyseliny s koncovou 3 '-hydroxylovou skupinou (tedy třeba fragment nukleové kyseliny, navázaný na (C^-C-jq) na jiném místě, než je 3 -koncovka fragmentu nukleové kyseliny, a n znamená celé kladné číslo v rozsahu 1 až 50, a to tak, že^n je větší než 1, ''pokuď pak významy G, c amido, R^P a Τ²*^- jsou voleny nezávisle. Je výhodné, nejsou-li 3 heteroatomy vázány na jediný atom uhlíku.

Ve výše uvedených strukturách, jež obsahují seskuoení T -C-(=0)-N(R ) se může tato skupina vytvářet reakcí aminu vzorce HN(R^P)- s organickou kyselinou, a to některou z dále uvedených, které jsou uvedeny pouze jako příklady a v žádném případě nejsou vyčerpávajícím seznámen potenciálních orggnických kyselin. Tedy kyselina mravenčí, octová, propiolová, propionová, ··· · • · ·· ·· · · • · · · • ···· · · • · · · · · · · • fcfc · ·· ·· ·· ··

-45fluoroctová, 2-butinová, cyklopropankarboxylová, máselná, methoxyoctová, óifluoroctová, 4-pentinová, cyklobutankarboxylová, 3,3-dimethylakrylová, valerová, N,N-dimethy1glycin, N-formyl-Gly-OH, ethoxyoctová, (methylthio)-octová, pyrrol-2-karboxylová, 3-furoová, isoxazol-5-karboxylová, trans-3-hexenová, trifluoroctová, hexanová, Ac-Gly-OH, 2-hydroxy-2-methylmáselná, benzoová, nikotinová, 2-pyrazinkarboxylová, 1-methy1-2-pyrrolkarboxylová, 2-cyklopěnten-l-octová, cyklopěntyloctová, (S)-(-)-2~pyrrolidon-5-karboxylová, N-methyl-L-prolin, heptanová, Ac-b-Ala-OH, 2-ethyl-2-hydroxymáselná ethoxy)-octová, p-toluová, 6-methylnikotinová, 5 zinkarboxylová, 2,5-dimethylpyrrol-3-karboxylová , 2-(2-me t hoxy-methyl-2-pyra, 4-fluorbenzoová

3,5-d ime t hy1i so xa zo1-4-kar boxy1ová, oktanová, Ν, N -d ime t hy 1sukc i na mi nov á,

2-cyklopentylpropionová, fenylpropilová, skořicová,

4-ethylbenzoová, p-anisová,

1,2,5 -1 r ime t hy 1 py r r o 1-3 - ka r bo xy 1 o v á,

3-fluor-»4-methylbenzoová, Ac-DL-propargylglycin, 3hy1) —máee1ná, 1-piperidinpropionová, N-acetylprolin rifluormet3,5-difluorbenzoová, A xylová, hen c-L-Val-OH, indol-2-karboxylová, 2-benzofurankarbozo tria sol-5-karboxylová, 4-n-propylbenzoová, 3-dimeth y 1 a m i no b e n s o o v á, 4 - e t h o xy b e n z o o v á, 4 - (m e t hy 11 h i o) - b e n z o o v á, N-(2-furoyl)-glycin, 2-methylthio)-nikotinová, 3-fluor-4-methoxybenzoová, Tfa-Gly-OK, 2 naftoová, chinaldová, Ac-L-Ile-OK, 3-methyl 3?nde n-2 -kar boxylová, 2 -chinoxalinkar boxylová, 1-methy1-ind ol-2 -karboxylová, 2₁3,6-trifluorbenzoová, N forrayl-L-Met-OH, 2-|_2-(2-methoxy ethoxy)-ethoxy*]-octová, 4-n-butylbenzoová, N-benzoylglycin, 5-fluorindol-2-karboxylová, 4-n-propoxybenzoová, 4-acetyl-3,5dime thy1-2-pyrrolkarboxylová, 3,5-dime thoxy benzoová, 2 ,,6-dimethoxynikotinová, cyklohexanpentanová, 2-naftyloctová, 4-(lH-pyrroll-yl)-benzoová, indol-3-propionová, 51-trifluormethylbenzoová, 5-methoxyindol-2-karboxylová, 4-pentylbenzoová, Bz-b-Ala-OH, 4-diethylaminobenzoová, 4-n-butoxybenzoová, 3-methyl-5-trifluormethylisoxazol-4-karboxylová, (3,4-dimethoxyfenyl)-octová, 4-bifenylkarboxylová, pivaloyl-Pro-OH, Oktanoyl-Gly-OH,(2-neftoxy)octová, indol-3-máselná, 4-( trifluormethyD-fenyloctová, 5-methoxyindol-3-octová, 4-(trifluormethoxy)-benzoová, Ac-L-Phe-OH, '·· ·· • · · ···· · ·

• · ► ·· ·

-464-pentyloxybenzoová, Z-Gly-OH, 4-karboxy-H-(fur-2-ylmethyl)pyrrolidin-2-on, 3,4-diethoxybenzoová, 2,4-dimethyl-5-ethoxykarbonyil-pyrrol-3-karboxylová, K-(2-fluorfenyl)-sukcinaminová,

3,4,5-trimethoxybenzoová, K-fenylanthranilová, 3-fenoxybenzoová, nonanoyl-Gly-OH, 2-fenoxypyridin-3-karboxylová, 2,5-dimethyl-lfenylpyrrol-3-karboxylová, t.r a ns-4-( trifluormethyl)-skořicová, (5-methy1-2-fenyloxazol-4-yl)-octová, 4-(2-cyklohexenyloxy)-benzoová, 5-methoxy-2-methylindol-3-octová, trans-4-kotininkarboxylová, Bz-5-aminovalerová, 4-hexyloxybenzoová, H-(3-methoxyfenyl)sukcinaminová, Z-Ssr-OH, 4-(3,4-dimethoxyfenyl)-máselná, Ac-o-řluorDL-Phe-OH, H-(4-fluorfenyl)-glutaramová, 4 *-ethyl-4-bifenylkarboxylová, 1,2,3,4-tetrahydroakridinkarboxylová, 3-fenoxyfenyloctová, K-(2,4-difluorfenyl)-sukcinamová, K-dekanoyl-Gly-OH, (+)-6-methoxyΤχ-πτθ thy 1t2-naft ale noc tová, 3-( trifluormethoxy)-skořicová, N-formylDL-Trp-OH , (R)-(+)- cL-methoxy- 7_x-(trifluormethyl)-fenyloctová, Bz-Dl-Leu-OH, 4-(trifluormethoxy)-fenyloctová, 4-heptyloxybenzoová,

2,3,4-trimethoxyskořicová, 2,6-óimethoxybenzoyl-Gly-OH, 3-(3,4,5trimethoxyfenyl)-propionová, 2,3,4,5,6-pentafluorfenoxyoctová,

H-(2,4-difluorfenyl)-glutaramová, K-undekanoyl-Gly-OH, 2-(4-fluor-r benzoyD-benzoová, 5-trifluormethoxyindol-2-karboxylová, N-(2,4difluorfenyl)-diglykolamová, Ac-L-Tro-OH, Tfa-L-fenylglycin-OH,

3-jod benzoová, 3-(4-n-pentylbejizoyl)-propionová, 2-fenyl-4-chinolinkarboxylová, 4-oktyloxybenzoové, Bz-L-Iiet-OH, 3,4,5-triethoxybenzoová, K-lauroyl-Gly-OH, 3,5-bis-(trifluormethyl)-benzoová, Av-5-methyl-DL-Trp-0H, 2-jodfenyloctová, 3-jodmethylbenzoová,

3-(4-n-hexylbenzoyl)-propionová, N-hexanoyl-L-Phe-OH, 4-nonyloxybenzoová, 4^z-(trifluormethyl)-2-bifenylkarboxylová, Bz-L-Phe-OH, N-tridekanoyl-GÍy-OH, 3,5-bis-(trifluormethyl)-fenyloctová,

3-(4-n-heptylbenzoyl)-propionová, Tí-heptanoyl-L-Phe-OH, 4-decylbenzoová, N-( <í_, ct,-trifluor-m-tolyl)-anthranilová, 4-(2-hydroo.

xyhexafluorisopropyl)-benzoová, K-myristoyl-Gly-OH, 3-(4-n-oktylbenzoyl)-propionová, K-oktanoyl-L-Phe-OH, 4-undecyloxybenzoová,

3-(3,4,5-trimethoxyfenyl)-propionyl-Gly-OH, 8-jodnaftoová, N-pentadekanoyl-Gly-OH, 4-dodecyloxybenzoová, N-palmitoyl-Gly-OH, a N-stearoyl-Gly-OH.

Tyto uvedené organické kyseliny jsou dostupné od Advanced Chem,Tech.,,Louisville, KY;$achem Bioscience Unc., Torrance, CA;

• · ·· ·· ·· ·· ··· ···· ···· • · · · · ·· · ··· • ···· · · · · · · ··· · · • · ···· ··· ··· · · ·· ·· ·· ··

-47Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA; Parchan Laboratories lne., Gainesville, PL; Lancaster Synthesis, Windham NH;

a MayBridge Chemical Company /c/o Rván Scientific), Columbia, Sc.

V katalogách těchto výrobců jsou zkratky, použité výše pro identifikování kyselin.

f) Kombinační chemie jako postup pro přípravu značených vzorků.

Kombinační chemie je typ chemické strategie, která vede k produkci velkého množství chemických vzorků (viz například PCT přihláška WO 94/08051. Tyto prokombinované vzorky se dají použít jako značené složky pro identifikování molekul, těšících se zájmu (MOI). Kombinační chemie lze definovat jako systematické a opakující se kovalentní spojení různých základních bloků různých struktur vzájemně mezi sebou, to za vzniku velkého množství různých molekulových svazků. Základní bloky mohou být nejrůznějších forem, jak přírodních, tak i syntetických, jako jsou nukleofily, elektrofily, dieny, alkylační nebo acylační činidla, diaminy, nukleotidy, aminokyseliny, cukry, lipidy, organické monomery, syntetické látky i jejich kombinace. Chemické reakce, použitelné k výstavbě zmíněných základních bloků mohou zahrnovat alkylace, acylace, oxidace, redukce, hydrolyzu, substituce, eliminace, adice, cyklizace, kondenzace apod. Tímto postupem se dají připravit molekulové svazky sloučenin, které lze pokládat za oligomery, ne-oligomery nebo jejich .kombinace.. Pokud se . oligomerů týká, pak sloučeniny mohou být-větvené, nevětvené nebo cyklické. Jako příklady oligomerních struktur, které lze připravit kombinačními postupy, lze uvést oligopeptidy, oligonukleotidy, oligosacharidy, polylipidy, polyestery, polyamidy, polyurethany, polymočovinové deriváty, polyethery, póly(fosforové deriváty), například fosfáty, fosfonáty, fosforarnidy, fosfonamidy, fosfity, fosfinamidy atd a polyderiváty s obsahem síry, jako jsou odpovídající sulfony, sulfonáty, sulfity, sulfonamidy, sulfenamidy atd.

Jednám ze společných typů oligomerní kombinační sbírky je kombinační peptidová sbírka. Poslední čerstvá inovace chemie •999 9 9 • 9

-49peptidů a molekulární biologie umožnily vznik sbírek desítek až stovek milionů různých peptidových sekvencí, které třeba připravit ještě a použít. Takové sbírky je možno rozdělit do tří širokých kategorií. Jedna z nich zahrnuje sbírky chemickou syntézou připravených rozpustných peptidů bez vazby ns podklad, viz např. Houghten a spol., Nátuře 354. 84 (1991)· Druhá kategorie se týká sbírek chemicky připravených peptidů, vázaných na podklad, vesměs pevný, jako jsou plastové jehly, kuličky z pryskyřic nebo bavlna, viz Geysen a spol., Mol.Immunol. 23,

709 (1986), dále Lam a spol., Nátuře 354. 82 (1991), Eichler a Houghten, Biochemistry 32, 11 035 (1993). V těchto dvou kategoriích jsou stavebními bloky’typicky L-aminokyseliny, D-aminokyseliny, nenasycené aminokyseliny nebo směsi či kombinace těchto látek. Třetí kategorie využívá přístupy cestou molekulární biologie k přípravě peptidů nebo proteinů na povrchu vláknitých částeček nebo plasmidů, viz Scott a Oraig, Curr.Opinion Biotech. 5., 40 (1994). Srnírky rozpustných peptidů bez vazby na podklad jsou vhodné pro celou řadu aplikací, čítaje v to značené složky. Dostupný repertoár chemických růzností a odlišnosti ve sbírkách peptidů se dá rozšiřovat použitím stupňů, jako je napřijlad permethylace, viz Ostresh a spol.,

Proč.Nati.Acad.Sci., USA 91, 11 138 (1994).

Jsou možné četné varianty peptidů v kombinačních sbírkách, kdy se základní peptidová kostra modifikuje a/nebo se amidové vazby nahrazují mimetickými skupinami. Amido-mimetické skupiny, kterých lze využít, zahrnují močovinové deriváty, urethany a karboxymethylenové skupiny. Restrukturalizace základní kostry tak, že se mění postranní řetězce na dusíkovém atomu amidové skupiny každé z aminokyselin, ponejvíce nikoli jinde, než na qT uhlíkovém atomu, vedou ke sbírkám sloučenin, označovaných jako peptoidy, viz Simon a spol., Proč.Nati.Acad.Sci USA 89,

9367 (1992).

Dalším běžným typem oligomerní kombinační sbírky je kombinační sbírka oligonukieotidů, kde stavební bloky jsou určité • · ···♦ • » ·· «· ·· »* ·· · · · · · » * · * ··· ♦ · ·· » · ·· • ···* · ♦ · · · · ··· · * • · 9 9·· · · ♦ «· · ·· ·· ·· ··

-5Óformy přírodních nebo nenasycených nukleosidů nebo derivátů polysacharidů, čítaje v to látky, kdy vazby fosforu mohou se nahradit různými organickými nebo anorganickými skupinami a kyslík v etherových vazbách je nahrazen dusíkem nebo sírou, viz Schneider a spol., Biochem.J. 34. 9599 (1995); Freier a spol., J.Med,Chem. 38, 344 (1995); Frank, J.Biotechnol. 41,

259 (1995); Schneider a spol., publ. PCT 942 052; Seker a spol., Mucleic Acids Pes. 21, 1853 (1993).

Nověji byly ještě popsány postupy přípravy kombinačních sbírek neoligomernich sloučenin s malými, molekulami,, viz DeV/itt a spol., Proč .Kati. Acsd .Sci., USA 00, 690 (1993); Proč.

Katl,Acad.Sci., USA 91. 4708 (1994). Struktury, které jsou vhodné Zapracování do látek ve sbírkách sloučenin s nízkou molekulární hmotností zahrnují velký počet organických molekul, jako jsou např. heterocyklická, alicyklické, alifatické sloučeniny, steroidy, antibiotika, enzymové inhibitory, ligandy, hormony, léky, alkaloidy, opiové látky, tsrpeny, porfyriny, roziny, katalyzátory, jakož i jejich kombinace.

g) Specifické postupy pro kombinační syntézy značených složek

Sále jsou popsány dva postupy přípravy a použití různých sad MS-značených složek s obsahem aminoskupin. V obou případech se použivá při syntéze pevná fáze, aby se tím umožnilo současné paralelní syntetizování velkého počtu funkčních skupin značených složek za použití techniky kombinační chemie. Při prvém z postu-.....

pů případné štěpení značné složky od oligonukleotidu má za následek uvolnění karboxylamidové skupiny. Při druhém postupu vzniká štěpením značené složky ksrbozylová kyselina. Chemické složky, jakož i vazebné podíly, použité při těchto postupech, jsou zkracovány takto:

R

FMOC

AU = pryskyřice (resin) = fluorenylmethoxykarbonylová chránící skupina, = allylová chránící skupina,

-51• · · · « · »·

COOH	= karboxylová skupina
conh2	= karboxamidová skupina,
nh2	= pr im.ami no skupina
OH	= hydroxylová skupina,
CONH	= amidová vazba
COO	= esterová vazba
NHg - kr uh-0 0 OH	= 4 ;k-amino )-2,4-d imethoxy benzyl] - fenoxymáselná kyselina (vazba kruhu)
0H-lMe0-C00H	= (4-hydroxymethyl)-fenoxymáselná kyselina
0H-2-Me0-COOH	= (4-hydroxymethyl-3-methoxy)-fenoxyoctová kyselina
NK2~A-COOH	= aminokyselina s funkcí alifatického nebo aromatického aminu v postranním řetězci
Xl,..Xn-C00H	= sada různých karboxylových kyselin ..tedy ..n...s jednotnou molekulární hmotností,
oligol....oligo(b)	= sada n oligonukleotidů
HBTU	= O-benzotriazol-l-yl-Ν,Ν,Ν',N '-tetramethyl

uroniumhexafluorfosfát

Sekvence stupňů při prvém postupu je tato:

OH-2 Me O-C ONH-R

PMOC-NH-kruh-C O OH-2 Me 0-0ONH-R PMOG-NH-kruh-C 00-2 Me 0-C ONH-R piperidin (odstranění HlvíOC) KH₂-kruh-C00-2Me0-0ONH-R .p

PMOC-NH-A-COOH; spojení (např.HBTU) PMOC-NK-A -C ONH- kr uh-C 00-2 Me 0-C ONH-rR piperidin (odstranění PMOC)

NH₂-A-C ONH-kr uh-C 00-2 Me 0-C ONH-R íéózdělení na n alikvotních částí navázání na n různých kyselin Xl...Xn-COOH

• · > 4 4 « ··· · pokr.

XI.. .Xn-CONH-A-GONH-kruh-COO-2MeO-CONH-R

I I I Ij odštěpené značených funkčních skupin z

Γ//7 pryskyřice pomocí 1% kyseliny trifluoroctové XI----Xn-C O-NH-A-C ONH-kruh-C 00K ί, II, Spojení s n podíly oligo (oligo l...oligo (n) např.via Pfp-esterů

XI.. .Xn-COKH-A-CONH-kruj-CONH-oligol. . .oligo(b) i shromáždění značených oligo-podíl&; provedení sekvenční reakce; oddělení fragmentů s různými délkami po sekvenční reakci (například vysokotlakovou kapalinovou chromatografií nebo elucí; štěpení značených podílů z vazebných čásfí pomocí 25% až 100% kyseliny trifluroctové jz

XI....Xn-GONH-A-COKH

P analýza hmotnostní spektrometrií

Sekvence stupňů při druhém postupu je tato

OH-lMeO-COO-All i FMOC-NH-A-COOH, spojení (naúř.HBTU)

FMOC-NH-A-COO-lMeO-COO-All ]/ palladium (odstranění allylové skupiny)

FMOC-NH-A-C00-lMe0-C00H ¢/ 0H-2Me0-C0NH-R, spojení (např.NBTU)

SMOG -NH-A -G 00-lMe 0-000-2 -MeO-C ONH-R piperidin (odstranění FMOC)

1¾-A-C 00-lMe0-C00-2 MeO-C ONH-R

V rpzdělení na n alikvotních částí navázání na n různých kyselin Xl....Xn-COOH

XI... .Xn-CONH~A-COO-lMeO-COO-2MeO-CONH-R odštěpení značených funkčních skupin z pryskyřice pomocí 1% kyseliny trifluoroctové • · » · • · · · · · ·

-53-: :.:

• ·

XI....Xn-CONH-A-COO-lMeO-COOH nevázání na n podílů oligo (oligo l...oligo(a) např.via Pfp-esterů

XI....Xn-CONH-A-COO-lMeO-CONH-oligol....oligo( n) 'y shromáždění značených oligo-podílů;

provedení sekvenční reakce; oddělení fragmentů s různými délkami po sekvenční reakci (například vysoko tlakovou chromatografií nebo elucí);

štěpení značených podílů z vazebných částí pomocí 25% až 100% kyseliny trifluoroctové

XI....X n-G ONH-A _G 00H •l· analýza hmotnostní spektrometrií

2. Vazebné složky v

Výraz vazebná složka, jak se zde používá, znamená bud •^přímou kovalentní vazbu nebo organickou chemickou skupinu, jež se použije ke spojení značené složky (T) na zájmovou molekulu (MOI) pomocí kovalentních chemických vazeb .Dále pak, pokud se přímé vazby týká, pak jedna či více vazeb ve vazebné složce je štěpitelná za podmínek, jež dovolují uvolnění T (jinými slovy odštěpení) ze zbývající T-L-X-sloučeniny (čítaje v to složku LiOT.^. Značená variabilní složka, přítomná v T, má být stálá za podmínek štěpení. S výhodou se má štěpení provést rychle; to znamená za několik málo-minut, s výhodou během 15 sekund či ještě méně o Obecně řečeno: použije se vazebná složka ke spojení každé značené složky z velké sady na kaýdou zájmovou molekulu MOI, sada je v tomto případě podobného rozsahu. Typicky je jediná kombinace zlacená složks-vazebná složka navázána na. každou komponentu MOI )vzniknou různé a četné T-L MOI), ale v některých případech více než jedna jediná kombinace značená složka-vazebná složka se může napojit na každou individuální MOI za vzniku různých (T-L) -MOI, Při jiném provedení tohoto

-54vynálezu se dvě nebo i více značených složek napojí na jedinou vazebnou složku prostřednictvím většího počtu nezávislých míst na vazebné složce a takto vybavená kombinace většího počtu značených složek s vazebnou složkou se pak naváže na individuální MOI za vzniku různých (T) -L-MOI.

Po četných manipulacích se sadou značených MOI se použijí specielní chemické a/nebo fyzikální podmínky ke štěpení jedné či více kovalentních vazeb vazebné složky, což vede k uvolnění značených složek z MOI, Stěpitelná vazba či takové vazby mohou, ale také nemusí být některými z týchž vazeb, které vznikly při spojení složek značená, vazebná a MOI dohromady. Ráz vazebné složky z větší míry bude určovat podmínky, za kterých je možno štěpehí uskutečnit. Dle toho jsou vazebné složky dány podmínkami štěpení, aby byly k tomuto úkonu vhodné. Pokud je vazebná složko fotolabilní (například tedy náchylná ke štěpení po vystavení gktinickému záření), pak takovou složku L lze označit jako I? Podobné aalsi označeni L ^J , L , IP ^z, L ', Tj ' ,IP 1^Δ a L^oS mohou být použita ve spojení s vazebnými složkami, které jsou zvláště vhodné k odštěpení působením kyselin, zásad, oxidací, redukcí, enzymově, elektrochemickou oxidací či redukcí, za zvýšené teploty nebo thiolovou výměnou v tom kterém případě.

Určité typy vazebných složek jsou labilní za jediného typu podmínek štěpení, jiné jsou labilní za podmínek několika typů štěpení. Dále pak navíc vazebné složky, které jsou schopné vázat větší počet značených složek za vzniku struktur typu (T) -L-MOI, mohou být každá v různých místech značené složky labilnější za určitých podmínek štěpení. Tak například v případě vazebné složky s navázanými dvěma ^značenými složkami může být jedna labilní pouze v alkalickém prostředí, druhá pouze za podmínek fotolyzy.

Vazebná složka, použitelná při postupu dle tohoto vynálezu, má mít několik schopností:

1) Má mít schopnost vázat se chemicky (L^, Chemical handle), čímž se může napojit na MOI,

2) má druhou, oddělenou chemickou možnost (L^), pomocí • ♦ » · · ···· 9 9 9 9 · · · 9 9 9 ···· * 9 · · 9 9 ··· 9 9 • ··«· · · * • 99 99 99 99

-55kfeeré se naváže značená složka na vazebnou složku. Pokud se větší počet značených složek naváže na jedinou vazebnou složku za vzniku struktury (T) -L-MOI, pak pro každou značenou 11 složku existuje oddělené chemické zacházení,

3) vazebná složka má být stabilní za všech manipulací, jímž je vystavena s výjimkou těch podmínek, které dovolují odštěpení skupiny, obsahující značenou část od zbytku sloučeniny, čítaje v to MOI, Takže vazebná složka je stabilní při navazování značené složky na ni, navázání vazebné složky na

MOI a za všech manipulací, kdy MOI obsahuje jak značenou složku, tak i vazebnou složku (T-L), navázané na MOI,

4) vazebná složkq nemůže podstatněji vadit při manipulacích s MOI, jsou-li na. tuto složku navázány složky značená a vazebná (T-L), Tedy, je-li složka Π navázána na oligonukleotid, nesmí složka T-L podstatněji vadit při jakýchkoli hybridízaČních nebo enzymových reakcích, prováděných s oligonukleotidem. Podobně je_li T-L názána na antilátku, nesmí podstatněji rušit při zjištování antilátký antigenem.

5) Odštějbení značené složky od zbývající části sloučeniny se provádí za vysoce kontrolovaných podmínek, to za použití postupů fyzikálních nebo chemických, které nijak nepříznivě neovlivňují možnost zjištění značené složky.

Po každý druh vazebné složky platí, že je výhodné, aby byl navázatelný na velký rozsah struktur MOI a že velmi různé značené složky mohou být navázány na vazebnou složku. Taková pružnost je výhodná, protože dovoluje použít sbírku konjugátů

T-L, jednou j již připravených, k pouiití s dalšími jinými sadami

MOT.

Jak to již bylo výše uvedeno, má výhodná vazebná složka vzorec _T2 kde L^ znamená reaktivní použitou složku (reqctive handle),kterou lze využít pro navázání vazebné složky na značenou složku a reagu jící molekulu, těšící se zájmu. L je zásadní částí vazebné složky, protože ovlivňuje labilitu vazebné složky. L a Ir jsou ořio ^w pádné vhodné skupiny, jež účinně slouží k oddělení li od L^.

-56-·*· ’ ΐΛ (jež se nalézá blíže k T než I?) slouží k oddělení T od potřebně labilní části L². Takové oddělení může být užitečné, když se za podmínek štěpení získávají zvláště reaktivní podíly (například volné radikály), které mohou způsobit chaotické a nahodilé změny ve struktuře části, obsahující T. Jelikož místo štěpení je dále odděleno od složky, obsahující T, sníží se nahodilost, že by mohl vzniknotřvreaktivní podíl v místě štěpení a nerušil by strukturu podílu, obsahujícího T. Také protože atomy v ΐΛ budou typicky obsaženy v podílu, obsahujícím T, mohou takové atomy L ovlivňovat žádoucí kvalitu podílu, obsahujícího T. Například je-li podílem, obsahujícím T složka, obsahující T^ms a stericky bráněný amin je žádoucně přítomný jako část struktury podílu s obsahem T' \tedy aby byl použit jako MSSE), muže být stericky chráněný amin přítomný v labilní části L”.

V jiných případech mohou být L a/nebo If přítomny ve vazebné složce jen proto, že komerční dodavatel vazebné složky poskytuje vazebnou složku pouze ve formě, mající takovou ΐΛ a/nebo skupinu» V takovém případě není na škodu použít vazebné složky se skupinami 1 a/nebo 1 (pokud tyto skupiny nevadí při štěpných reakcích), i když nijak nepřispívají k případným výhodám provedení při použití sloučenin, které je η obsahují. Takže tento vynález dovoluje, aby skupiny 1 a/nebo 3

L byly přítomny ve vazebné složce.

Skupinami L a/nebo L mohou být přímé vazby (v kterémžto případě tam skupina ve skutečnosti není), skupiny hýdrokarbyle no vé (např» alkylenhvé, arylenové, cykloalkylenové atd), -0-hydrokarbylenové (například skupiny vzorců -Č-CHg-, -0-CH₂VH(CH^)atd, nebo hydrokarbylen-^-hydrokarbylenové^, , kde w je celé kladné číslo v rozsahu od 1 do asi 10, například tedy

-CHg-O-Ar-OHg-CO-CHgCHg)^- atd.

V souvislosti se syntézou na pevné fázi byl zaznamenán velký počet literárních údajů v souvislosti s vazebnými složkami labilními za určitých reakčních podmínek. Při provedení typické syntézy na. pevné fázi se takový pevný podklad váže labilním vazným činitelem na reaktivní místo a molekula, jež se má synteticky připravit, se generuje na reaktivním místě. Jakmile byla

-57molekula dokonale syntetizována, pak konstrukce pevného podkladu s vazebnou složkou a molekulou se vystaví podmínkám štěpení, za kterých se molekula uvolní od pevného podkladu. Labilní vazebná činidla, jež byla vyvinuta k použití v této souvislosti (nebo která by mohla být použita) se mohou snadno použít jako vazebná činidla dle tohoto vynálezu.

Llloyd-V/illiams P. a spol. v článku Convergent Solid-Phase

Peptide Synthesis’,' Tetrahedron P-eport č.347, 49(48), 11065-11133 (1993) velmi důkladně diskutují o vazebných složkách, labilních za aktinického záření (např.fotolyzou) jakož i o podmínkách štěpení kyselinami, zásadami a i jinak. Další zdroje informací o labilních vazebných složkách lze získat snadno.

Jak to již konečně bylo uvedeno zde výše, různé znaky a charaktery vazebných složek budou rozhodujícími fg^tory _za v

různých a lišících se podmínek štěpehí, at již fyzikálními nebo chemickými postupy. Jako příklady podmínek, za nichž lze štěpit různé typy vazebných složek, lze uvést reakce v kyselém či alkalickém prostředí, oxidace, redukce, fluoridy, thiolovou výměnu, fotolyzu a enzymové reakce.

Příklady štěpitelných vazebných složek, jež vyhovují obecným kriteriím pro charakter vazebných složek, jak jsou zde uvedeny výše, jsou obeznámeným dobře známé a zahrnují tyto látky, jak jsou obsaženy v katalogu od Pierce (Rockford II) Patří sem:

ethylen-gly kobis*r( sukcinimidyl-v-jantaran) (EGS), aminové reaktivní zesítující činidlo, štěpitelhé hydroxylaminem (1M, 37 °C, 3 až 6 hodin), disukcinimidyl-vínan (ĎST), a sulfo-DST, což jsou aminová zesítující reaktivní činidla, štěpitelná roztokem 0,015'. M jodistanu sodného, bis-12-(sukeinimidyloxykarbonyloxy)-ethyl\-sulfon (BSOCOES) _z V> S a sulfo-BSOGOES, což jsou aminová zesítující činidla, štěpitelná působením zásad (pH 11,6),

1,4-di-£3 ^z-(2 ^z-pyridyýdithio(propionamidoýj -butan (DPDPB)^ • · • ·

-58v pyridyldithiol, jako zesítovač, který je štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukcí,

N~J4-(p-azidosalicylamido)-butylj-3 '-(2 '-pyridyldithio )-pro pionamid APDP), pyridyldithio, jako zesítovac, štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukcí, bis-|p>-(4-(azidosalicylamido)-ethyl| -disulfid, fotoreaktivní zesítovač, který je šzěpitelný thiolovou výměnou nebo redukcí,

N-sukcinimidyl-(4-azidofenyl)-l,3 '-dithiopropionát (SADP), fotoreaktivní zesítovač, který je štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukcí,

Sulfosukcinimidyl-2-(7 -azido-4-nethylkumarin-3-acetamido)ethyl-1,3 '-dithiopropionát (SAED), fotoreaktivní zesítovač, který je štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukcí, sulfosukcinimidyl-2_T(m-azido-o-nitrobenzamido)-ethyl-1,3 dithiopropionát (SAMD), fotoreaktivní zesítovač, štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukcí.

Dalšími příklady štěpitelnýcs vazebných složek a podmínek při štěpení, jak je lze použít při uvolňování značených slovek, jsou tyto: silylovou zesítující skupinu lze štěpit fluorem nebo za podmínek kyselého štěpeníp 3-, 4-, 5- nebo 6-substituovaná

2-nitrobenzyloxy- nebo 2-, 3-, 5- nebo 6-substituoyaná 4-nitrobenzyloxy-zesítující skupina se může štěpit zdrojem fotonů (fotolyzou). Zesítující 3-, 4-, 6- nebo 6-substituovanou-2-atkoxy~ fenoxylovou nebo 2-, 3-, 5- nebo 6-substituovanou 4-alkoxyfenoxylovou zesítující skupinu lzeštěpit oxidačně působením sloučeniny vzorce . Zesítovač typu.NCOO „(urethan) se dá štěpit, působením hydroxidů, kyselin, nebo redukčně hydridem hlinitolithným.o 3-Pentenylovou, 2-butenylovou nebo 1-butenylovou zesítující skupinu lze odštěpit ozonem, směsí oxidu osmičelého a jodistanových aniontů nebo oxidačně manganistanem draselným. Zesítující skupinu 2-(3-, 4- nebo 5-substituovanou-furylJ-oxylovou lze štěpit kyslíkem, bromem, methanolem nebo kyselinou.

• ·

-59Podmínky, za ,nichž lze odštěpit další labilní vazebné složky zahrnuji tyto: terč,-alkylo^y-vazebné složky lze štěpit kyselinami, methyl(dialkyl)methoxylové nebo 4-substituované

2-alkyl-l,3-dioxolan-2-ylové vazebné skupiny lze štěpit značenou vodou H^0⁺, 2-silylethoxylové podobné skupiny lze štěpit fluorem nebo kyselinami, 2-(X)-ethoxylové skupiny, kde X fcnamená skupinu ketonickou, esterovou, amidovou, kyanovou, nitroskupinu, dále skupinu sulfidickou, sulfoxidovou a sulfonovou se dají štěpit v alkalickém prostředí, dále 2-, 3-, 4-, 5nebo 6-substituované benzyloxylové vazebné skupiny se mohou štěpit kyselinami nebo v redukčním prostředí, 2-butenyloxyvasebné skupiny se mohou štěpit působením (C^H^O^RhClíH), dále 3-, 4-, 5- nebo 6-substituované 2-bromfenoxylové vazebné skupiny je možno štěpit lithiem, hořčíkem nebo butyllithiem, methylthiomethoxylové vazebné skupiny se dají štěpit rtutnatými ionty, 2-(X)-ethyloxyskupiny, kde X znamená halogen, jsou štěpitelné zinkem nebo hořčíkem a 2-hydroxyethyloxyskupiny se mohou štěpit oxidačně, například působením octanu olovičitého.

Výhodnými vazebnými skupinami jsou ty, které lze štěpit kyselinami nebo fotolyzou. Některé z vazebných skupin, labilních v kyselém prostředí, které byly popsány v souvislosti s peptidovou syntézou na pevné fázi, jsou vhodné pro vázání značených složek na MOI. Některé z nich byly popsány nedávno v přehledné práci LLoyd-Williams-e a spol., Tetrahedron 49. 11065-11133 (1993). Jedním použitelným typem jsou vazebné složky na podkladu p-alkoxybenzylalkoholových derivátů, z nichž dva jsou dostupné od Advanced Chem.Tech. (Louisville, KY),

Jsou to kyselina 4-hydroxymethylfenyloxyoctová a kyselina

4-(4-hydroxymethyl-3-methoxyfenoxy)-máselná. Obě tyto vazebné složky se mohou napojit na značenou složku využitím esterové vazby benzylalkoholu a na MOI, obsahuje-li aminoskupinu, pak amidickou vazbou, to s přihlédnutím na karboxylovou kyselinu. Značené složky, vázané těmito molekulami, se mohou uvolnit z MOI použitím kyseliny trifluoroctové v různých koncentracích. Štěpěhí takových vazebných částí se projeví uvolněním karboxylové kyseliny značené složce. Výsledkem štěpení • · ·

111 1

-60značených složek, navázaných těmito vazebnými složkami, jako je 2,4-dimethoxy-4 '-(kar boxy me thy loxy )-benzhydrylamin se projeví uvolněním amidu karboxylová kyseliny na uvoněném značeném podílu; citovaná látka je dostupná od Advanced Chem.Tech. v FMOC-chráněné formě₀

Potolabilní vazebné podíly, použitelné v této souvislosti, byly již také z největší části vyvinuty pro syntézu peptidů na pevné fázi, viz přehled LLoyd-Williams. Obvykle jsou založeny na 2-nibrobenzy^esterech nebo 2-nitrobenzylanidech. Dva příklady fotolabilních vazebných složek, které byl); v poslední době uvedeny v literatuře, jsou kyselina 4-\4-(l-Pmoc-amino)et<y!)-2-methoxy-5-nitrofenoxy J-butanová, viz Holme s a Jo nes.-. J.Org.Chem. 60. 2318-2319 (1995) a kyselina 3-(Tmoc-amino)-3-{2-nitrofenyl)-propionoví, viz Brown a spol., v.srsity 1, 5-12 (1995). Obě vazebné složky lže karboxylová kyseliny na aminovou skupinu MOI.

Líolecular Lina vázat využitím svázání značené složky na vazebnou složku se provede vytvořením amidu mezi karbo xylovou-skupinou značené složky a aminoskupinou na vazebné složce, Ctěoení fotolabilních vazebných složek se obvykle provede intenzit a dob, které jsou složky se uvolní primární . Jako příklady fotolabilních ultrafialovým světlem (350 nm) za jinak známé. Rozštěpením vazebné amidová skupina na značené složce vazebných složek lze uvést nitrofenylestery glycinu, exo- a endo-2-benzonorborneylchloridy a methansulfonáty, dále kyselinu

3-(amino)~3-(2-nitrofenyl)-propionovou. Jako příklady enzymových štěpehí lze uvést použití esterág štěpících esterové vazby, nukleás, Štěpících fosfodiesterové vazby, proteás, štěpících peptidová vazby atď.

Za výhodnou vazebnou složku lze uvést o-nitrobenzylové deriváty dále uvedeného obecného vhorce

kde jeden z uhlíkových atomů v postaveních a, b, c, d nebo e

1 je substituován skupinou -lr-X,a L (tou je s výhodou přímá vazba) je na levé straně seskupení NÍR¹) ve výše uvedené struktuře. Taková vazebná složka může podlehnout selektivnímu foto-indukovgnému štěpení vazby mezi uhlíkem, označeným a a skupinou NÍR·⁵·). Totožnost R¹ není obvykle rozhodující pro štěpnou reakci, ale s výhodou se R¹ zvolí mezi vodíkem a hydrokarbylovou skupinou,, Tento vynález zahrnuje také možnost, že ve výše uvedené struktuře se může nahradit -N(R^)- kyslíkem. Ve výše uvedené struktuře může být jedna či více z poloh b, c, d nebo e případně substituována skupinou alkylovou, alkoxylovou, fluorem, chlorem, skupinou hydroxylovou, karboxylát vou nebo amidovou, kdeže tyto substituenty se nezávisle volí od případu k případu.

Další výhodnou vazebnou složkou s chemickou komponentou má tuto dále uvedenou obecnou strukturu

kde jedna či více z poloh b, c, d nebo e je substituována vodíkem skupinou alkylovou, alkoxylovou, fluorem, chlorem, skupinou hydroxylovou, karboxylátovou nebo amidickou, R^ -znamená vodík nebo hydrokarbylovou skupinu a R - znamená skupinu hydroxylovou, nebo skupinu, jež buď chrání nebo aktivuje napojení karboxylové kyseliny na další jinou část. Výhodnými skupinami, které aktivují karboxylovou skupinu při takovém spojování skupiny fluorkarbonové a hydrofluorkarbonové.

o Zájmová molekula (MOI, molecule of interest)

Jako příklady zájmových molekul lze uvést nukleové kyseliny nebo jejich obdoby (například PNA), fragmenty nukleových kyselin, syntetické nukleové kyseliny či jejich fragmenty, oli-62gonukleotidy (například DNA nebo RNA), proteiny, peptidy, antilátky či jejich fragmenty» dále receptory, receptorové ligandy, členy ligandových párů, cytokiny, hormony, oligosecharidý, syntetické organické molekuly, léky a jejich kombinace.

Výhodné MOI představují fragmenty nukleových kyselin. Z v

nich pak zvláště primární sekvence, doplňující sekvence, přítomné ve vektorech, kdy se vektor používá pro sekvencování báze.

S výhodou je fragment nukleové kyseliny vázán přímo či nepřímo na značenou složku v každém jiném místě, než je 3 -koncovka fragmentu, nejvýhodněji v místě 5'-koncovky fragmentu. Fragmenty nukleových kyselin lze koupit nebo připravit na podkladě genetických databází, viz Dib. a spol., N a ture 380. 152-154,(1996), jakož i CEPH Genotype Database, http://WA7.cephb.fr, a dále komerčních vektorů, viz Rromega, Madison, WI,

MOI, jak se zde tento výraz používá, zahrnuje deriváty MOI, obsahující funkčnost použitelnou pro spojení MOI s látkou T_L-L^. Tak například fragment nukleové kyseliny má na 5 -koncovce fosfodiester,, kdy fosfodiester je rovněž vázán na alkyle,namin. Takový MOI je popsán například v US pat.spise 4 762 779, na který se zde odkazuje. Nukleový fragment s vnitřním modifikováním je rovněž MOI. Jako příklady interního modifikování fragmentu nukleové kyseliny lze uvést případy, kdy odpovídající báze, tedy třeba adenin, guanin, cytosin, thymidin, uráčil byla modifikována přidáním reaktivní funkční skupiny. Takové interně modifikované fragmenty nukleových kyselin jsou běžně dostupné od např. Glen Research, Herndon, VA, Jiným příkladem interního modifikování fragmentu nukleové kyseliny je případ, kdy se použije hebázický fosfořamidát⁼pro syntézu modifikovaného fosfodiesteru, který je vsunut mezi sacharid a fosfátovou skupinu fragmentu nukleové kyseliny. Nebázický. fosfořamidát obsahuje re_aktivní skupinu, jež umožní, aby se fragment nukleové kyseliny obsahující takový podíl, odvozený od fosforamidátu, vázal na podíly jiné, například některou látku T-L-L^. Takové nebázické fosféramidáty jsou obchodě dostupné od např.Clonetech Laboratories, lne., Palo Alto, CA.

-63• · · • 9 · · · ·

4« Chemické záchytky (L^, Chemical handles)

Jako chemická záchytka je označováno stabilní, ale reaktivní atomové seskupení na prvé molekule, tedy na její části, kdy je možná chemická reakce takové záchytky s doplňující chemickou záchytkou na části druhé mokekuly za vzniku kovalentní vazby mezi oběma molekulami. Tak například takovou záchytkou můžs být hydroxylová skupina a opačnou chemickou záchytkou seskupení karboxylové kyseliny, tedy karboxylová skupina nebo odpovídající aktivovaný derivát, třeba hydrofluorarylester, načež reakcí těchto dvou záchytek dojde ke tvorbě kovalentní vazby, zvláště esterové, jež spojí obě molekuly dohromady.

Chemické záchytky se mohou použít při velmi četných reakcích, kdy vzniká kovalentní vazba, vhodná pro navázání značené složky na vazebnou složku a vazebné složky na MOI.

Takové reakce zahrnují alkylování, tedy tvorbu etherů a thioetherů, acylování, tedy tvorbu esterů, amidů, karbamátů, derivátů močoviny a thiomočoviny, fosforylace, například za vzniku fosfátů, fosfonátů, fosforemidň, fosfonamidů, sulfonylace, například za vzniku sulfonátů a sulfonamidů, kondenzační reakce, tedy za vzniku iminů, oximů, hydrazonů, silylování, tvorbu disulfidů, jakož i přípravu reaktivních meziproduktů, jako jsou nitreny či karbeny a to fotolyzou. Obecně řečeno jsou záchytky a reakce za tvorby vazby vhodné pro navázání značené složky na vazebnou složku a rovněž vhodné pro navázání na MOI, i naopak. V některých případech se může předtím podíl MOI modifikovat nebo upravit ’do formy derivátu, aby se tak získala záchytka, vhodná pro navázání na vazebnou složku.

Jedním typem vazby, jež se zvláště hodí pro navázání vazebné složky na MOI je óisulfidická vazba. Její tvorba vyžaduje přítomnosti thiolové skupiny jako záchytky na vazebné složee a další thiolové skupiny na MOI, Mírně-oxidační podmínky pak dostačují k vzájemné reakci obou thiolů za vzniku disulfidické vazby. Tvorbu disulfidu lze rovněž indukovat použitím nadbytku • · ·· ·· »·· · · · · >·>· ··· · · ·· · ··· • ···· · · · · · · ··· · ·

-64·· ·· vhodného reagens ze skupiny disulfidů;- například pyridyldišulfidu. Protože tvorba disulfidů je reverzibilní reakcí, muže se disulfid použít rovněž jako štěpitelná vazba při uvolňování značené složky, je-li to třeba. To se typicky provádí v mírně kyselém prostředí za použití vhodného výměnného činidla, jako je třeba dithiothreitol.

Zvláště zajímavá reakce pro navázání značených složek, nebo těchto složek na. vazebné složky za vzniku oligonukleotidů je tvorba amidových bloků_o Záchytky typu primárních alifatických aminů lze snadno zavést do syntetických oligonukleotidů působením fosforamiditů, jako je monomethoxytritylhexylkyanethyl-N,N-diisopropylfosforamidit, dostupný od Glenn Research,· Sterling, VA. Aminy, jak se nacházejí v přírodních nukleotidech, jako je třeba adenosin a guanosin jsou ve skutečnosti nereaktivní ve srovnání s takto zavedenými primárními aminoskupinami. Tento rozdíl v reaktivitě je základem pro možnost selektivní tvorby amidů a podobně vázaných skupin, například močovinových, thiomoóovinových, sulfonamidových s zavedenou primární aminoakupinou, nikoli však s aminoskupinami nukleotidu.

Při listování v katalogu Molecular Probes (Bugene, OR) zahrnuje částečné vyjmenování funkčních skupin, reagujících s aminy, aktivované estery karboxylových kyselin, isokyanáty, isothiokyanáty, sulfonylhalogenidy a dichlortriazeny, Aktivované estery jsou vynikajícími reagujícími složkami pro modifikování aminů, protože vzniklý amid jako produkt je velmi stálý. Rovněž se uvedená činidla vyznačují dobrou reaktivitou vůči alifatickým aminům, a nízkou vůči nukleotidovým aminům oligonukleotidů. Jako příklady aktivovaných esterů možno uvést estery N-hydroxyimidu kyseliny jantarové, pentafluorfenylestery, tetrafluorfenylestery a p-nitrofenylestery. Aktivní estery jsou vhodné, protože se dají připravit ve skutečnosti z jakékoli molekuly, pokud obsahuje karboxylovou skupinu. Přípravy aktivních esterů jsou uvedeny v publikaci Bodansky, Principles of Peptide Chemistry, 2,vyd., Springer ^verlag, London, 1993.

• ·

999 • β β e <

• · 4 <9 99

-65• · ·<·· ·· ·· • 9 9 · • · ·· • 9 9 9 • 9 9 · ·< <·

Navázání vazebné složky

Typicky se použije jediný druh vazebné složky pro spojení předpokládané sady značených složek na předpokládanou sadu MOI. Podle výhodného provedení dle tohoto vynálezu může jednoduchý a jediný postup vést ke tvorbě všech různých T-L-MOI struktur. To je zvláště výhodné, je-li sada struktur T-L-MOI velká, protože to dovoluje přípravu sady za použití postupů kombinační chemie nebo jinou odpovídající technologií. Podobně použití vazebné složky jednoho typu dovoluje provedení jedné a jednotné metody pro štěpení všch různých T-L-MDI struktur. A znovu je to výhodné pro. velké sady T_L-M0I struktur, protože se sada může zpracovávat souběžně, opakovaně a/nebo automatizovaným postupem.

Jsou však další provedení dle tohoto vynálezu, kdy se použijí dva či více typů vazebné složky ke spojení lišících _vů.

se podskupin zn«č>ůých složek za vzniku odpovídajících podskupin MOI. V takovém případě se použijí podmínky selektivního štěpení k odštěpení každé z vazebných skupin nezávisle, aniž by fošlo k odštěpení vazebných složek na jiných podskupinách MOI.

Velký počet reakcí pro tvorbu kovalentních vazeb se hodí pro navázání značené složky na vazebnou složku a vazebné složky na MOI, Patří sem alkylace, tedy tvorba etherů a thioetherů, acylace, ted./ příprava esterů, amidů, karbamátů, mo novinových a thiomonovinových derivátů, řosforylace, tedy příprava třeba fosfátů, fosfonátů, fosforamidů, fosfonamidů, sulfonylece, .....

tedy příprava—sulfonátů a sulfonamidů, kondenzace, tedy třeba tvorba iminů, oximů, hydrazonů, silylování, tvorba disulfidů, a přípravě reaktivních meziproduktů, jako jsou nitreby anebo karbeny za použití fotolyzy_c Obecně lze říci, že reakce gáchytek a vznik vazeb, které se hodí pro navázání značených složek na vazebné složky, jsou. rovněž vhodné pro navázání vazebných složek na MOI a naopak. V běkterých případech může být podíl MOI předtím modifikován nebo převeden na derivát, aby se tak získala gáchytka, vhodná pro navázání vazebné složky.

··· ·

-66Jedním typem vazby, zvlášzě vhodné pro navázání vazebné složky na MOI, je disulfidická vazba. Jejé tvorba vyžaduje přítomnosti thiolové skupiny jako gáchytky na vazebné složce a další thiolové skupiny na MOI. Mírná oxidace p_í5k dostačuje ke spojení obou dvou thiolů dohromady za vzniku disulfidu. Tvorbu disulfidu lze rovněž uskutečnit použitím nadbytku vhodného výměnného disulfidického činidla, jako jsou pyridyldisulfidy₀ Peotože tvorba disulfidu je obvykle reverzibilní, mlže se disulfid použít jako štěpitelná vazba pro uvolnění značené složky, je-li to třeba.

To se typicky provede za podobně mírných podmínek použitím nadbytku odpovídajícího thiol-výměnného činidla, jako je třeba dithiothreitol.

Zvláštnímu zájmu pro navázání vazebných složek na oligonukleotidy se těší amidové vazby. Primární alifatické aminoskupiny jako záchytky lze snadno zavést do syntetických oligonukleo tidů použitím fosforamiditů, jako je 6-monomethoxytritylhexylkyanethyl-N,N-diisopropylfosforamidit, dostupný od Glenn Research, Sterling, VA. Aminy v přírodních nukleotidech, jako jsou adenosin a guanosin,, jsou ve skutečnosti nereaktivní ve srovnání se zavedenou prim.aminoskupinou. Tento rozdíl v reaktivitě je podkladem schopnosti selektivní tvorby amidů a odpovídajících vazných skupin, jako jsou močovinové, thiomočovinové, suj.fonamidové vždy za reakce zavedené prim.aminoskupiny, nikoli s aminem nukleotidu.

Jak je to uvedeno v katalogu Molecular Probes, Eugene, OR, částečný výčet funkčních skupin, reaktivních vůei aminům, zahrnuje aktivované estery karboxylových kyselin, isokyanáty, isothiokyanáty, sulfonylhalogenidy a dichlortriazeny. Aktivní estery jsou vynikajícími reakčními složkami pro modifikování aminů, protože amidy, vzniklé jako produkty, jsou velmi stálé.

Rovněž se tato činidla vyznačují dobrou reaktivitou s alifatickými aminy a nízkou reaktivitou vůči nukleotidoYým aminům oligonukleotidů Jako příklady aktivních esterů lze uvést estery H.hydroxyémidu kyseliny jantarové, pentafluurfenylestery, tetrafluorfenylestery a p-nitrofenylestery. Aktivní estery jsou • 4

4 • 4 > 4 4

4

-67• 9 9 4 ,4 4 vhodné, protože se dají připravit skutečně z jakékoli molekuly, obsahující, karboxylovou skupinu. Způsoby příprav aktivních esterů popisuje Bodansky, viz Principles of Peptide Chemistry,

2.vyd., Springer Verlag, London 1993.

Existují četná zesítující činidla, jichž lze použít jako vazebné složky, viz např. Pierce Cross-linkers, Pierce Chemical Co., Rockford, 11. Mezi nimi jsou homobifunkční, s aminy reaktivní zesítující činidla, jako příklad lze uvést estery a to homobifunkční imidoestery a N-hydroxysukcinimidylestery (NHS).

v

Existují rovněž heterobifunkční zesítující reakční činidla, obsahující dvě nebo více reaktivních skupin, což umožňuje sekvenční reakce. Imidoestery reagují rychle s aminy v alkalické oblasti pH. Z NHS-esterů se získávají stabilní produkty při reakci s primárními nebo sekundárními aminy. Jako thiol-reaktivní látky možno jmenovat imidy maleinové kyseliny, alkyl- a arylhalogenidy, -acylované deriváty a pyridyldisulfidy. Imidy maleinové kyseliny jsou specifické pro thiolové (sulfhydrylové) sku piny v oblasti pH 6,5 až 7,5-.VaUt<J-ické oblasti pH mohou reagovat s aminy. Za fyziologických podmínek je thioetherová vazba stálá. Zesítující látky typu ^-halogenacetylderivátů obsahují jodacetylovou skupinu a vyznačují ee reaktivitou vůči sulfhydrylovým skupinám. Imidazolové látky mohou reagovat s jodacetylderiváty, ale reakce je velmi pomalá. Pyridyldisulfidy reagují s thiolovými skupinami za vzniku disulfidické vazby. Karbodiimidy spojují karboxylové skupiny s prim.eminy a hydra židy, což vede k tvorbě acyl-hydrazinové vazby. Arylazidy jsou fotoafinitními činidly, která, jsou chemicky inertní při. exponování ultrafialovým paprsky mebo viditelným světlem. Fotolyzují-li se takové sloučeniny při 250 až 460 nm, vzniká, reaktivní arylnitren. len je relativně nespecifický. Glyoxalové deriváty reagují z guanidinylovou částí argininu.

Při jednom typickém provedení postupu dle tohoto vynálezu se 'značená složka nejprve naváže na vazebnou složku a. jqjich kombinace se naváže na MCI za vzniku struktury T-L-MOI. Jinak lze dospět k téže struktuře nrjprve navázáním vazebné složky ns ·· · • ·

-68ΜΘΙ s následnou vazbou kombinace vazebné složky a MOI na značenou složku. Příkladem je stač, kdy MOI je primírem DNA nebo oligonukleotidem. V takovém případě se značená složka typicky nejprve naváže na vazebnou složku a potom se kombinace T-L naváže na DNA-primér nebo oligonukleotid, který se pak použije například při sekvenční reakci.

Jednou vhodnou formou k použití, je-li značená složka navázána reverzibilně na MOI (například oligonukleotid nebo DNA-sekvenční primér), je použití chemicky labilní <,hs vazrbné složky. Jedním z výhodných rysů pro vazebnou složku je to, že ji lze odětěpit těkavou organickou kyselinou, např, kyselinou trifluoroctovou. Ta je zvláště kompatibilní s většinou postupů za hmotnostně-spektrální ionizace, čítaje v to elektrosprej _o

Kompozice dle tohoto vynálezu jsou určeny pro mutační analýzu a vhodná taková komposice zahrnuje pár sloučenin obecného vzorce

T^ms-L-MOI kde

T^ms je organická skupina, zjistitelná hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodíku a fluoru, a případně atomy ze skupiny kyslík,dusík, síra, fosfor a jod. L v uvedeném vzorci znamená organickou skupinu,, umožňující odštěpění části, obsahující T , od zbytku molekuly, kdeže „část, obsahující T^ras zahrnuje funkční skupinu, podporující jediný ionizovaný nábojový.stav, je-li.sloučenina sledována hmotnostní spektrometrií,a je zvolena ze skupiny, kterou tvoří terč.aminy, ksrrterní amoniové skupiny a organické kyseliny.

V uvedeném vzorci znamená MOI fragment nukleové kyselin kde

L je připojena na MOI kdekoli jinde, než na 3 -koncovce MOI. Kompozice obsahuje páry sloučenin, kde členové páru nemají totožné skupiny T^ras, ale mají totožné sekvence s výjimkou postavení jedné báze, kde báze nejsou totožné. Podle jiného provedení kompozice dle tohoto vynálezu člen párů sloučenin nemá identické

Kupmy , _a]__e totožné sekvence s výjimkou postavení jedné • ·

-69báze, kde báze nejsou totožné. Tyto kompozice se potom přidávají k sekvenci nukleové kyseliny, vázané na pevném podkladu s tím, že sekvence je totožná s jedním ze členů každého páru.

Takže vynález se týká kompozice, obsahující větší počet párů sloučenin, jak to bylo popsáno výše a dále obsahuje stejné množství nukleových kyselin, imobilizovaných na pevném podkladu, kde každý člen zmíněného stejného množství nukleových kyselin ná sekvenci bází, jež je přesně komplementární k jednomu členu každého z párů.

Vynález se rovněž týká soustavy (tzv.kit) pro mutační analýzu, obsahující větší počet zásobníčků. Každý se zásobníčků obsahuje pár sloučenin obecného vzorce .ms

T -L-MOI kde

HIS λ

T‘ znamená organickou skupinu, zjistitelnou hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodík a fluor, a případně atomy ze skupiny, kterou tvoří kyslík, dusík, síra, fosfor a jod. V uvedeném vzorci znamená L skupinu organickou, jež dovoluje odštěpení části s obsahem Τ' od zbytku sloučeniny, kdeže T^ms obsahující část zahrnuje funkční skupinu, jež podporuje jediný ionizační nábojový stav, je-li sloučenina sledována hmotnostní spepktrometrií a je zvolena ze skupiny terč. aminů, kvsrterních amoniových skupin a organických kyselin.

V uvedeném vhorci znamená MOI fragment nukleové kyseliny, kde 1 je konjugována na MOI v jakékoli jiné poloze, než je 3 koncovka MOI. V sestavě (kitu) sloučeniny každého páru mají nikoli shodné skupiny T , ale mají totožné sekvence s výjimkou jedné či dvou pěloh bází, kde báze nejsou totožné. Ve výhodném provedení soustavy (kitu) znamená výraz větší počet nejméně 3 a výhodněji nejméně 5.

B. TESTY

Jak to bylo již zde uvedeno výše, umožňuje tento vynález provedení celé řady testů, kdy lze značené složky a detekční způsoby využít s úmyslem podstatně zvýšit citlivost a provedení testů co do rychlosti vůbec. Podle jednoho aspektu se mohou • · • · ·· · · ·«

-70tyto postupy využít k důkazu vazby prvého člena na druhého člena páru ligandů s tím, že zahrnují stupně

a.) kombinuje se sada prvých značených členů s biologickým vzorkem, který může obsahovat jeden či více druhých členů, to za podmínek a dobu dostačující k umožnění vazby prvého člena na druhého člena, přičemž značená složka je korelativní s odpovídajícím prvým členem a zjistitelná nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometricky,

b) oddělí se prvé a druhé člen?y od nevázaných členů,

c) . odštěpí se značená část z prvého značeného člena, a

d) zjistí se značení nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometricky a z toho se odvodé vazba prvého člena na druhého člena.

V souvislosti s kontextem dle tohoto vynálezu lze použít velké a rozmanité množství párů prvých a druhých členů, jako například molekuly nukleových kyselin (např. DNA, RNA, analoga nukleových kyselin, jako je PNA nebo jakákoli kombinace předchozích), jhroteiny nebo polypeptidy (například antilátky nebo fragmenty antilátek), monoklonální antilátky, polyklonální antilátky nebo vazebné složky( jako je CDR), oligosacharidy, hormony, organické molekuly a další substráty (například xenobiotika, jako je kombinace glukuronidasa/molekula léku) či jakýkoli jiný ligand či pár ligandů. Při různých provedeních postupu dle tohoto vynálezu mohou být prvý a druhý z členů téhož typu molekuly, nebo typů různých. Tak například jako příklady ligandových párů prvého člena a druhého člena lze uvést:

molekula nukleové kyseliny/molekula nukleovékyseliny, anti-______ látka/molekula^nukleové kyseliny, antilátks./hormon, antilátka/xe nobiotikum a antilátka/protein.

Se zřetelem na další výklad testů, které lze provést cle zde popisovaného rozboru, je zde připojen krátký popis některých zvláště výhodných testů.

► · · ·· « · ·«· ♦ · • · · · ·· ··

-711. Testy nukleových kyselin

a) Úvod

Jak to bylo již konečně uvedeno zde výše, popisuje tento vynález četná provedení postupů, kdy se mohou použít výše popisované odštěpitelné značené složky a/nebo vazebné složky místo tradičně používaného značení (například radioaktivního, fluoreskujícího či enzymového) se zřetelem na zvýšení citlivosti, specifičnosti nebo poctu vzorků, které lze současně analyzovat. Jako reprezentativní příklady takových postupů sem spadají například standartní hybridizační reakce nukleových kyselin (viz Sambrook a spol., citace zmíněna výše), diagnostické reakce, jako j? technika cyklických testů (Cycling Probe Technology, CPT), viz U.S.pat. 4 876 187 a 5 011 769), nebo test oligonukleotidové ligace (Oligonucleotide-Ligation Assay, OLA, viz Burket a spol., Science 196, 180 (1987). Tyto postupy, jakož i jiné techniky budou dále ještě podrobněji probrány.

b) Hybridizační technika

Úspěšné klonování a sekvencování genu dovoluje zjištění odpovídající struktury a exprese tím, že lze zjistit gen nebo odpovídající mRNA ve velkém nadbytku nepříbuzných molekul DNA nebo RNA. Množství mRNA zakodující specifický protein do tkáně je důležitým parametrem pro aktivitu genu a může být ve významném vztahu k aktivitě funkčních systémů.Jeho regulování je závislé na interakcích mezi sekvencemi uvnitř genu (cis-působicí prvky) a sekvencemi, specifickými pro proteiny s vazbou na DNA (transpůsobící faktory), které jsou aktivovány tkáňově-specificky nebo působením hormonů a druhými nosnými systémy.

Pró analyzování případného genu, jeho regulačních sekvencí jeho ^oecifické mRNA a regulování jeho exprese je známo několik o možných provedení; ty zahrnují Southern or N rthern blot analysis”, protekční ribonukleasový test (RNase) a hybridizaci in šitu.

Obměny v nukleotidové kompozici určitého genu mohou mít velký pathofyziologický dopad. Pokud jde o lokalizaci v nezakódovaných oblastech (5'-, 3'- bočné oblasti a intron), mohou • ·

-72ovlivnit regulování genové exprese, což způsobí abnormální aktivování nebo inhibování. Při lokalizování do kódovaných oblastí genu (exons) může dojít ke změnění funkce proteinu nebo vzniknou dysfunkční proteiny.

Takže určitá sekvence uvnitř genu se může rovnat určitému onemocnění a může se použít jako náznak nemoci. Jedním z prvých cílů výzkumu na poli lékařství je tedy zjistit takové genetické variace jako diagnostickou pomůcku a získat tak důležité informace pro porozumění pathofysiologickým stavům.

Základem postupu pro analýzu populace se zřetelem na variace určitých genů.je analýza DNA za použití Southern blot technique. V krátkosti se digeruje připravená genomická DNA s restrikčním enzymem (RE), čehož důsledkem je velký počet fragmentů DNA s různými délkami, zjištěný dle přítomnosti specifických rozpoznávacích míst v RE genomu. Allely určitých genů s mutacemi uvnitř restrikčního místa se štěpí na fragmenty různých počtů a délek. To se označuje jako restrikční polymorfizmus délky fragmentů (restriction fragment length polymorphism, RFLP) a může být důležitým diagnostickým značením pči četných aplikacích.

Fragment, který se má analyzovat, se oddělí ze shluku fragmentů DRA a rozliší od ostatních druhů DRA použitím specifických vzorků. Takže DNA se vystaví elektroforetické frakcionaci za použití gelu agarosy s následným přenosem a fixací na nylonové nebo nitrocelulosové membráně. Fixovaná, jednopro-vazoová DNA se hy br id i zu j e- na ~znače nou DNA, jež je kompleme ntární k DNA, kterou třeba zjistit. Po hybridizací se fragment DNA, těšící se hmotnostní spektrometrie IvIALDI, jak je odstranění nespecifických zájmu, zviditelní použitím to dále podrobněji rozebráno.

Přítomnost a kvantitativní vyhodnocení specifického genového přepisu a jeho regulování fyziologickými parametry se dá analyzovat použitím Northern blot analysis a RNase protection assay.

• · ···· · · · · · · • 4 · · · • ·· ··

-73Zásadním podkladem těchto postupů, je hybridizace shluku váech celulárních RNA ns specifický vzorek. Při postupu í.íorthern blot technique se veškerý podíl RNA z tkáně elektroforeticky frakcionuje za použití agarosového gelu, přenese se a znehybní na značené antisensní RNA (cRNA), jež je komplementární vůči RNA, jež se má zjistit. Tento vzorek cRNA se opatří značením, jak to z-e již bylo popsáno. Použitím přísných podmínek při promývání se odstraní nespecifické vázané molekuly. Zůstávají specificky vázané molekuly, které lze potom zjistit použitím hmotnostní spektrometrie iíALDI. liavís lze specifičnost kontrolovat porovnáním velikosti zjištěné mRNA s předem určenou délkou mRNA, jak je předmětem zájmu.

Rychlejší, ale méně specifický postup, je tečkovací metoda, jež se provádí jako Northern blot technique s tou výjimkou, že se RNA přímo nanáší jako skvrnka na membránu bez předchozího frakcionování. RNA se znehybní nespecificky v bodu skvrnky.

Nejspecifističtějším postupem pro zjištění druhu mRNA je protekční test RNase. V krátkosti se veškerý podíl RNA z tkáně či buněčné kultury hybridizuje na značenou specifickou cRNA kompletní homologie. Specifita se provede následnou digescí RNase. Něhybridizované, jednoprovazcové RNA a nespecificky hybridizované fragmenty s případnými malými příměsmi se rozpoznají a štěpí, zatím co dvouprovazcová RNA kompletní homologie není pro enzym dostupná a je tak chráněna. Po odstranění RNasy digescí s proteinasou K a extrakcí fenolem se oddělí specificky chráněný fragment z produktů degradace, zpravidla na denáturujícím polyakřyiamidovém gélu, a předem určená vslikost se dá vyhodnotit použitím vysokotlakové kapalinové chromatografie. Všechny výše uvedené testy lze kvantitativně vyhodnotit nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometricky.

Přesné umístění určité mRNA ve specifické populaci buněk v tkáni se dá stanovit hybridizováním in šitu. Tento postup je obdobou immunocytochemického postupu a ve skutečbosti se může použít současně s immunocytochemií na tutéž sekci, která se má zjistit, například je-li určitý protein skutečně syntetizován na místě, nebo je-li ve skutečnosti převzat z jiných zdrojů.

• · • · · · * · ·· 4

-74Bez zřetele na možnost identifikovat buněčný typ expresí specifické mRNA, může být hybridizování in šitu více citlivější, než analýza celkového tkáňového RNA přípravku za použití postupů, popsaných zde výše. To je případ, kdy mRNA se expresně projeví ve vysokých koncentracích a ve velmi utajované oblasti nebo typu buněk v tkáni a došlo by pak ke zředění homogenizováním veškeré tkáně. Analýza genové exprese hybridizováním in šitu je tedy zvláště důležitá pro heterogenní tkáně, jako je tomu v případě mozku. V případě hybridizování in šitu se tkáně zmrazí nebo perfuzně fixují a dělí pak dle histochemického

V protokolu. Hybridizační protokol pro tkáňové sekce a značené vzorky se podobá ostatním dalším hy bridizačním postupům, - jak jsou zde popsány výše. Možná je i semikvantitativní analýza.

c Kyseliny cDNA jako příkladná populace složek mRNA a použití jako vzorky

Většina kyselin mRNA se transkribuje z jediné kopie sekvencí. Další vlastností kyselin cDNA je to, že představují delší genomní oblast se zřetelem na intřony, přítomné v chromosomální verzi největšího poctu genů. Příklady se mění od jednoho genu k druhému, ale mohou být velmi významné, protože četné geny kryjí více než 100 kb genomické DNA za vyjádření v jediné cDNA. Jedním z možných použití molekulární hybridizace je použití vzorků z jednoho druhu ke zjištění klonů, připravených z jiných zdrojů. Sekvenční rozdíly mezi kyselinami mRNA mygJÍ a.lidí dovolují epecifické překřížené reasociace dlouhých

-sekvencí, - ale.....s výjimkou většiny vysoce, utajovaných -oblastí— ...

předcházejí překříženému hybridizování s PCR-Priméry.

Rozdílné krytí v komplexu biologických vzorků, jako je tomu při vývoji nervového systému za použití vzorků cDNA, připravených z jednotlivých buněk je nyní možné v důsledku vývoje amplifikačních postupů, založených na POR a cRNA. Některé pracovní skupiny jiř ohlásily předem vznik sestav cDNA z malých množství poly(A)⁴RNA (1 mg či méně) po přípravě z 10 až 50 buněk, viz Belyav a spol., Nucl.Acids Res. 17, 2919 (1989). Ačkoliv

-75sestavy jsou dostatečně reprezentativní se zřetelem na komplexnost mRNA, průměrná velikost vsazení cDNA v těchto sestavách byla skoro malá (pod 2 kb).

Nověji byly metodologie kombinovány se vznikem jak vzorků, založených na PCR (viz Lambolez a spol., Neuron

9, 247 (1992) Acad.Sci. USA a cRNA (viu Van Gelder a spol., Proč.Nati.

. 1663 (1990) z jednitlivých buněk. Podle elektrických záznamů byly cytoplasmové obsahy jednotlivé buňky aspirovány napojenými mikroelektrodami pro syntézu cDNA in sidu a odpovídající amplifikaci. Bylo poutito PCR k amplifikování cDNA zvoleného glutamátového receptorů mRNA z jednotlivých buněk Purkinje a GFAP mRNA z jediného glia orga no typickémozkové kultury, viz Lambolez a spol., Neuron 9, 247 (1992).

V případě cRNA-amplifikací bylj? určeny transkripce promotorových sekvencí pro priméry syntézy cDNA a komplexní protisměrové cRNA vznikly transkripcí in vitro bakteriofágovými RNA polymerasami.

Takže podle jednoho provedení dle tohoto vynálezu se dají použít značené cRNA jako značené vfrorky k objemnému shrnutí nestav cDNA, nebo pči pokusech o expresní profilování ke stínění Southern blots s obsahem cDNA fragmentů, těšících se zájmu (jako jsou receptory, růstové faktory, iontové kanálky atd.). Zdá se, že nedostatek linearity amplifikace, se kterým se často setkáváme při postupech na základu PCR, se minimalizuje postupy, založenými na cRNA.

d Testy oligonukleotidové vazby

Testy.oligonukleotidové vazby jsou rozšířením třídění na podkladu PCR za využití testů, založených na ELISA (viz ©LA, Nickerson s spol., Proč.Nati.Acad.Sci.USA 87, 8923 (1990) pro zjištění produktů PCR, které obsahují značené cílové sekvence. Takže odpadají jako gelová elektroforez a, tak i kolonová hybridizace. Krátce řečeno: OLA využívádva sousedící oligonukleotidy: hlásný vzorek (značený na 5'-koncovce) a 5'-fosforylovaný/3 '-biotinylovaný zakotvený vzo• · • ·

-76rek. Dva oligomery, které jsou komplemetární vnitřním sekvencím PCR primérů, se annealují k cílové DNA, a pokud jsou dokonale komplementární, pak se tyto dva vzorky vážou působením T4 DNA ligasy. Zachycení biotinylovanéno zakotveného vzorku na imobilizovaném streptavidinu a analýza na kovalentně připojený hlásný vzorek je důkazem přítomnosti Či nepřítomnosti cílových sekvencí mezi PCR produkty. .

e Použití hybridizačních postupů i Soudní problémy

Identifikování jednotlivců na základě variací sekvencí DNA je spojeno s řadou praktických výhod ve srovnání s dosavadními kriterii, jako jsou otisky prstů, krevní typy nebo fyzikální charakteristiky. Na rozdíl od většiny fenotypyckých značení dovoluje DNA analýza snadno dedukovat vztahy mezi jednotlivci, jak je to někdy nutné při testování otcovství. Genetická analysa se ukázala být vysoce účinnou při transplantacích kostní dřeně, kde je třeba rozlišeni mezi použitým v

donorem a buňkami recipienta. Dva typy vzorků se nyní používají pro DNA otisky prstů pomocí DNA skvrnek. Polymorfní minisatelitní vzorky identifikují násobné DNA sekvencp kdy každá je přítomna ve variabilních formách v různých jednotlivcích, takže Ifee pořídit vzorky, které jsou komplexní a vysoce variabilní mezi jednotlivci. VNTR vzorky identifikují jednotlivé sekvence v genomu, ale tyto sekvence mohou být přítomné až do 30 různých forem v lidské popuslaci dle rozlišeni velikostí identifikovaných fragmentů. Pravděpodobnost, že individuality bez vzájemného vztahu budou mít totožné hybridizační vzory .... pro násobné VNTR nebo minisatelitové vzorky je velmi nízká, mnohem méně tkáně, než je to třeba pro DNA skvrnky, případně i jednotlivé vlasy poskytují dostatek DNA pro analýzu na základě PCR genetického značení. Takže se může použít částečně degradovaná tkáh pro analýzu, protože je třeba jen malých fragmentů DNA. Soudní analysy DNA se případně provedou s polymorfnimi sekvencemi DNA, které lze studovat jednoduchými aútomatizovatelnými testy, jako je OLA. Tak například Analýza 22 oddělených

-77genových sekvencí, z nichž každá je přítomna v populaci ve dvou různých formách, povede k 1010 různých výsledků, což dovoluje jednoznačné identifikování lidské bytosti.

ii Tumorová diagnóza

Důkaz virálních nebo buněčných onkogenů je dalším důležitým úsekem aplikace s diagnózou nukleových kyselin. Virové onkogeny (v-onkogeny) jsou přenášeny pomocí retrovirů, zatím co buněční protipartneři (c-onkogeny) jsou již přítomni v normálních buňkách. Buněčné onkogeny lze vsak aktivovat specifickými modifikacemi, jako je s-bodová mutace (jako je tomi^v případě c-K-ras onkogenů karcinomu močového měchýře a kolore ktálních tu. morů), promotorova indukce, genová amplifikace (jako v případě L-myc onkogenů, viz neuroblastoma), nebo přeskupení chromosomů (jako je tomu při translokaci c-abl onkogenů z chromosomu 9 do chromosomu 22 v případě chronické myeloidní leukemie). Každý z aktivačních postupů vede ve spojitosti s dalšími degeneračními postupy ke zvýšenému a nekontrolovanému růstu buněk. Tak zvané recesivní onkogeny”, které je nutno desaktivovat při tvorbě tumoru (jako v případě retinobiastorny (Rb gen) a osteosarkomu 'lze rovněž zjistit pomocí testů DNA. Za použití testů proti imunoglobulinovým genům a proti receptorovým genům T-buněk je možný důkaz B-buněk lymfomas- a lymfoblastické leukemie.

iii. Transplantační analyzy

Odmítavé reakce transplantované tkáně lze zcela rozhodně zvládnout specifickou třídou histokompatibilních antigenů (HLA). Jsou exprimovány na povrchu krevních buněk, poskytujících antigen, jako jsou např.makrofágy. Komplex mezi HLA a cizím antigenem se rozpozná pomocnými T-bunkami pomocí odpovídajících T-buněk receptorů na buněčném povrchu. Interakce mezi HLA, antigenem a receptorem T-buněk vyvolá komplexní obrannou reakci, která vede ke kaskádovitě se rozvíjející imunitní odezvě těla.

Rozpoznání různých cizích antigenů je zprostředkováno variabilními, antigen-specifickými oblastmi receptorů T-buněk, obdobně jako je tomu při reakci na antilátku. Při odmítnutí • ···· ·

-78napojené části lze proto eliminovat ze shluku T-buněk ty, které jsou spojeny s expresí specifického receptoru T-buněk, který reaguje na cizí antigen. Takové anaiyzy jsou možné identifikováním antigeh-specifických variabilních DNA-sekvencí, které jsou amplifikovány pomocí PCR a tím lze zvýšit selektivitu. Specifická amplifikaění reakce dovoluje identifikování jediné specifické buňky specifického receptoru T-buněk.

Podobné analyzy se v tu dobu provádějí pro zjištění autoimunních onemocnění, jako je juvenilní diabetes, arterioskleroza, násobná skleróza, reumatoidní arthritis nebo encephalomyelitis.

iv. Genomní diagnostika

Ze všech novorozenců tvoří 4% jedinci s genetickými defekty. Z počtu 3500 dědičných nemocí, způsobených modifikováním pouze jediného genu, jsou primární molekulární defekty .známé jen asi v případě 400 z ohěch uvedených výše.

Dědičné nemoci byly jis dlouho rozpoznávány fenotypický_ mi analýzami (anamnesy, například nedostatek krve, thalassemias) analýzami chromosomů (karyotyp, např. mongolismus: trisomy 21) nebo genovou produkční analýzou (modifikované proteiny, např. fenylketonuria: nedostatek enzymu fenylalanin-hydroxylasy, který se projeví zvýšenou hladinou kyseliny fenyIpyrohroznové).Další využití za použití detekčními postupy s užitím nukleových kyselin zvýší podstatně rozsah genomní diagnostiky.

V případě některých genetických nemocí dostačuje modifikování jen jedné ze dvou allel pro omezení nemóciC dominantně přenášené monogenní defekty); v četných případech je třeba modifikovat obě allely (následně přenášené monogenní defekty). V případě třetího typu genetických defektů je vznik nemoci určen nejen genovou modifikací, ale i takovými faktory, jako je druh potravy ( v případě diabetes nebo arteriosklerosy) i životního stylu (v případě rakoviny). Velmi často se takové nemoci projeví v pokročilém věku. V této souvislosti lze uvést také onemocnění, jako je schizofrenie, maniakova deprese nebo epilepsie). Zkoumá ·· ·· » · · « » 9 99

9 9 I • · 4 ·· ··

-79se, projev£-li se začátek takového onemocnění v takových případech v závislosti na faktorech okolí, jako je tomu v případě modifikování několika genů v různých chromosomních lokacích.

Za použití přímé nebo nppřímé analysy DNA je možno diagnostikovat celou sérii genetických nemocí: chudokrevnost, thalassemias, nedostatek al-antitrypsinu, Lesch-Nyhan-ův syndrom, cystickou fibrosu/mucoviscidosfš, muskulární dystrofii Duchenne/Becker, Alzheimerovu nemoc, mentální deficienci v závislosti na X-chromosomech, Kuntingtonovu nemoc.

v. Infekční nemoci

Použití rekombinantních DNA-postupů pro diagnosu infekčních onemocnění bylo nejvíce sledováno se zřetelem na onemocnění virová, kde běžné postupy svízelné a těžkopádné, výsledky jsou k dispozici se zpožděním. Hybridizováním tkání nebo kultivovaných buněk in šitu je možná diagnosa akutních i chronických infekcí oparem (herpes). Bylo nalezeno, že čerstvě i formaldehydem zafixované tkáně jsou vhodné pro zjištění viru papilomy v případě náhlého karcinomu mozku i při zjištování viru HIV, zatím co kultivované buňky byly použity pro zjištění cytomegaloviru a viru Bpstein-Barr. Použití rekombinantních DNApostupů na diagnosu mikrobiálních onemocnění má svou důležitost, že se totiž nahradí nákladnost postupů, sledujících růst mi krobů, lze. se přitom spolehnout na rychlost a přesnost.-Klinické situace, kdy s^?e začínají používat rekombinantní DNA-postupy, zahrnují použití při identifikování Neisseria gonorrhoae, rezistentní na penicilín za přítomnosti transposonu, divoce rostoucích chlamydiových mikrobů na potravinách, což je jednoduchý způsob, jak rozšířit infekci mezi populací. Světová epidomiologický výzva jak čelit takovým parazitům, jako jsou leihsmania a plasmodia byla již respektována použitím rekombinantních postupů.

2. Testy na základě proteinů a Úvod

Jak to již bylo uvedeno zde výše, je možno vylepšit velké množství testů, založených na proteinech použitím zde popisovaných značených složek (viz např. Antibodies, a Laboratory Manual, vydavatelé Harlow a Lané, Cold Spring Harbor Labo44 ·· • 4

444

4 4 · · · • 44 9 9 • 4 · ♦ ··· ·

-80ratory Press, 1988). Jako příklad lz-:·. uvést test antigen/antilátka, tedy testy jako je protiproudná elektroforeza (countercurrent iramunoelectrophoresis (CIEP), imunosaprční testy s vazbou na enzym (enzyme-linked immuno-sorbent assays( ELISA), inhibiční nebo kompetitivní testy a sandvičové testy, současné imunotesty a imunofiltrační testy. Je možno takto vylepšit velký počet dalších testů, Čítaje v to například testy ligand/receptor apod.

b. Imunotesty

Od vyvinutí metody RIA pro insulin a'thyroxin byly postupy, zahrnující použití radioisotopicky značených antigenů široce použity při měření haptenových molekul, jako jsou hormony a léky. Postupy se zakládají na·kompetici mefci značeným antigenem a neznačeným antigenem pro omezený počet a množství antilátky. Tyto postupy lze také popsat jako postupy s omezeným reagens, protože se používá při testu omezené množství antilátky,

Ačkoliv byly značené antilátky použity při imunofluorescenčních postupech od 1941, nebyly dosud více použity jako kvantitativní postupy až do zavedení radioisotopově značených antilátek v IRMA. Látky IRMA. jakož i další dvojité antilátky se základem na pevné fázi, nebo sendvičové testy (ELISA, IRMA, imunofluorescenční zbarvující testy) jsou charakteristické pro nadbytek antilátky nad antigeny; mohou se tedy označovat jako postupy s nadbytkem reagens. Zásadně řečeno: použití nadbytku činidel (reagens) zkracuje inkubační dobu a potenciálně zvyšuje citlivost. Pevná fáze usnadňuje oddělení a signál je přímo úměrný množství antigenů, jako protiklad při inverzních vztazích kompetitivních testů.

Použití technologie avidin/biotin se postupně stávalo stále důležitějším v četných oblastech biochemie, molekulární biologie a lékařství, čítaje v to zjištění proteinů neradioaktivními imunitními testy, cytochemická vybarvení, dělení buněk, a izolování nukleových kyselin a zjištění epecifických sekvencí DNA/RMA hybridizací.

• · • ·

-81Technický postup je založen na použitelnosti vysoké afinity interakce avidinu s biotinem (asociační konstanta 1015M-1) a schopnosti biotinylovat velký počet cílových biomolekul, jako jsou antilátky, nukleové kyseliny a lipidy. Prvým stupněm izolování cílové molekuly je její biotinylování nebo biotinylování biomolekuly, jež se posléze váže na cílovou molekulu (jako je například antilátka nebo hybridizační vzorek, který tvoří cílový komplex).Biotinylovaná molekula nebo cílový komplex se potom oddělí od dalších molekul v takové heterogenní směsi použitím afinitních prostředí, založených na interakcích avidinu s biotinem.

Takže podle jednoho z provedení tohoto vynálezu se může kterýkoli ze standardizovaných imunotestů provést za použití značených reakčních složek spíše než typicky isotopově značených reagencií. Výsledkem takových postupů je zvýšená citlivost, jakož i možnost analyzovat četné vzorky’ současné.

3. Genová expresní analýza

Jedním z vynálezu zde popisovaného je vysoká propustnost měření expresí četných genů (1 - 2000) v jediném měření. Postupem je tedy možno zpracovat psralelněČ více než 100 vzorků jedním krokem. Tento postup je použitelný na sledování léků, vývojovou biologii, na studia molekulární mediviny apod. Tedy podle jednoho aspektu tohoto vynálezu jsou popisovány postupy pro analyzování vzoru genových exoresí ze zvoleného biologického vzorku, zahrnující

a) vyčlenění nukleové kyseliny z biologického vzorku,

b) kombinování vyčleněné nukleové kyseliny s jedním či více vzorků zválené značené nukleové kyseliny, to za podmínek a po dobu dostačující k hybridizaci uvedených vzorků na zmíněnou nukleovou kyselinu, kde značená složka je korelativní.s odpovídajícím vzorkem nukleové kyseliny a zjistitelná nefluoreskující spektrometrií nebo potenciometričky,

c) oddělení hybridizovaných vzorků od něhybridizovaných,

d) odštěpení značené složky’ od značeného fragmentu, a β ⁹⁰ • ··· · <

• » 1 • · ·-* • φ >· · • · ⁹.

-82e) zjištění značené složky nefluoreskující spektrometrií nebo potenciometricky, z čehož se stanoví vzor genové exprese biologického vzorku.

Podle zvláště .výhodného provedení postupu dle tohoto vynálezu se testy či postupy provedou takto: RNA z cílového zdroje se váže na pevný podklad specifickým hybridizačním stupněm (například zachycením poly(A)mRNA zakotvenou·.', vázajícím vzorkem olido(dT). Pevný podklad se potom promyje a cDNA se syntetizuje na pevném podkladu použitím běžných postupů (např. reversní transkriptasou). Provazec RNA se potom vy jme .. pomocí hydrolyzy. Výsledkem je vznik DNA populace, jež je kovalentně znehybněna na -pevném podkladu, což se projeví růz- ~ ností, nadbytkem a komplexností RNA, ze které byla cDNA syntetizována. Pevný podklad se potom uvede do styku (hybridizuje) s 1 až několika tisíci vzorků, které jsou komplementární ke genové sekvenci, jež je předmětem zájmu. Každý typ vzorku se značí použitím odštěpitepné značené složky a hmotnostní spektrometrie, nebo jiným typem odštěpitelné značného složky. Po provedení stupně uvedení do styku se vymyje nadbytek nehybridizovaných vzorků, pevný podklad se umístí (například) ve žlábku nikrotitrační destičky a hmotnostní spektrometrií zjistitelná značená složka se odštěpí z pevného podkladu. Pevný podklad se vyjme ze žlábku a obsah žlábku se vyhodnotí hmotnostní spektrometrií. Přítomnost specifických značených složek dle hmotnostní spektrometrie dokazuje přítomnost RNA ve vzorku a je důkazem, že došlo k expresi specifického genu v uvedeném biologickém vzorku. Postup lze rovněž mnohonásobně použít.

Kompozice a postupy pro rychlé změření exprese genu za použití odštěpitelných značených složek lze podrobněji popsat takto: Tkáně (játra, svaly atd), primární nebo transformované sestavy buněk, izolované nebo čištěné typy buněk nebo jakýkoli jiný zdroj biologického materiálu, kde je ‘vhodné stanovení genetické exprese, se dá použít jako zdroj RNA. Při výhodném postupu

-83se biologický zdroj lyžuje za přítomnosti chaotropu s úmyslem potlačit nukleasy a proteasy a podporovat přísnou hybridizaci cílové nukleové kyseliny na pevný podklad. Tkáně, buňky a biologické zdroje lze účiným způsobem lyžovat pomocí 1 až 6 molárního roztoku některé z chaotropnícli solí, jako je hydrochlorid guanidinu, thiokyanát gugnidinu, chloristen sodný atd. Poté, co byl zdroj biologického vzorku lyžován,se roztok smíchá s pevným podkladem s úmyslem zachytit cílovou nukleovou kyselinu, jak je přítomná v lyzátu. Při jednom z možných postupů se RNA zachytí použitím zakotveného a zachycujícího vzorku oligo(dT). Pevným pokladem mohou být nylonové kuličky, polystyrénové rnikrokuličky, skleněné kuličky a skleněný povrch či jakýkoli jiný typ pevného podkladu, na který se mohou oligonukleotidy kovalentně navázat. Pevný podklad se výhodou překryje polymerem typu aminů, jako je polyethylen(imin), akrylamid, amino-dendrimery atd. Aminy na polymeru se použijí ke kovalentnímu znehybnšní oligonukleotidů. Oligonukleotidy se s výhodou syntetizují s 5'-aminem (obvykle s hexylaminem, který je vřazen do rámce šesti uhlíků a distálním aminem)$ligonukleotidy mohou být co do délky 15 až 50 nukleotidů.Oligonukleotidy se aktivizují homobifunkčními nebo hetero-bifunkčními zesítujícími činidly, jako je chlorid kyseliny kyanurové. Aktivované oligonukleotidy se zbaví nadbytku zesítujícího činidla (např. chloridu kyseliny kyanurové) exkluzní chromatografií. Aktivované oligonukleotidy se potom smíchají s pevným podkladem s úmyslem docílit kovalentní navázání. Po provedení kovalentního navázání oligonukleotidů se nezraagované aminy ns pevném podkladu překryjí (např. anhydridem,ky.seliny jantarové), aby se tak odstranil kladný náboj pevného podkladu.

Pevné podklady lze použít v paralelním uspořádání a Výhodou jsou to formáty s 96 až 384 žlábky. Pevný podklad může být připojen ke kolíčkům, násadám nebo tyčinkám v uspořádání 96 v* až 384 žlábků, přičemž pevný podklad lze bud odstranit, nebo tvoří nedílnou součást uvedeného uspořádání. To či ono uspořádání nemá z hlediska pevného podkladu rozhodující důležitost pro funkčnost testu, ale spíše ovlivňuje schopnost testu při automatickém provádění.

* .··.♦· · :

• * - ·· · ·

9 · _Λ 9 9 99 9 ···· · · : σ ? · • · - · ·· • β φ ··

-84Pevné podklady se mohou míchat s lyzátem 15 minut sž několik hodin se zřetelem na zachycení cílové nukleové kyseliny na pevném podkladu. Obecně se zachycení cílové nukleové kyseliny provede použitím komplementární báze, napojující cílovou RNA a zachyceným vzorkem, který je znehybnen na pevném podkladu. Jedna permutace využívá 3 '-polyíA) snahu, zjištěnou ve většině eukaryot-ických nosičů RNA hybridizovat se na zachycenou oligo(dT) ns pevném podkladu. Jinou možností je využití specifických oligonukleotidů nebo delších vzor|ků (nad asi 50 základů) k zachycení RNA, obsahující definované sekvence·» Další možností je použití degenerocaných primérů (oligonukleotidů), kterými by se dosáhlo zachycení četných příbuzných sekvencí v cílové RNA-populaci. Doby hybridizování jsou řízeny sekvencí komplexity populace RNA a typem zachyceného vzorku, který byl použit, líy bridizační teploty jsou dány typem použitého chaotropu a konečnou koncentrací chaotropu, viz Van Ness a Chen, Nucl.Acids Res., to pro obecné pokyny), lyzát se potom s výhodou protřepává s pevným podkladem nepřetržitě k dosažení difuse cílové RNA. Jednoho stupně dosažení zachycení cílové nukleové kyseliny' se dosahuje tak, že se lyzát vymyje z pevného podkladu a všechny bhaotropní nebo hybridizační roztoky se odstraní. Pevný podklad se s výhodou promyje použitím roztoků, obsahujících iontové nebo neiontové detergenty, pufry a soli. Dalším stupněm je syntéza DNA, komplementární k zachycené DNA. V tomto stupni slouží zachycený oiigonukleotid jako extenžní primér pro reverzní transkriptázu. Reakce se obvykle provádí za teploty 25 až 37° C, s výhodou za protřepávání během polymerační reakce. Poté co byla cDNA syntetizována, je kovalentně vázána na pevném podkladu, protože zachycený oiigonukleotid slouží jako extenžní primér. RNA se potom odhydrolyzuje z duplexu cDNA/RNA. Tento stupen se dá provést použitím teploty, jez dénaturuje duplexy nebo použitím báze, jako je např. 1,1 N roztok hydroxidu sodného k chemické hydrolyze RNA. Klíčovým stupněm v tomto případ' je uvolnit cDNA pro následné hybridizování s definovanými vzorky. Pevný podklad, nebo větší počet pevných podkladů se potom vymyje s úmyslem odstranit RNA nebo odpovídající fragmenty. V tu chvíli * ^ββ. · »· * · • ♦ • ♦ ··.··

-85obsahuje pevný podklad přibližně reprezentativní populaci molekul cDNA, jež představuje RNA-populaci v pojmech sekvenčního nadbytku, komplexity a různosti.

Dalším stupněm je hybridizování zvolených vzorků na pevném podkladu se zřetelem na identifikování přítomnosti či nepřítomnosti a relativního přebytku specifických sekvenci cDlíA. Jako vzorky to jsou s výhodou oligonukleotidy o délce 15 až 50 nukleotidů. Sekvence vzorků je diktována konečným použitím testu. Tak například je-li konečným použitím míněno studium exprese genů při zánětlivé odezvě pokožky, pak.se volí vzorky tak, aby byly komplementáři s Četnými cytokiny mRNA, RNA, které -zakodováva jí enzymy, modulující lipidy.

RNA, zakodující faktory, které regulují buňky, jsou zahrnuty také do protizánětlivé odezvy. Když již byla jednou definována sada sekvencí pro další studium, pak každou sekvenci je třeba přetvořit na oligonukleotidový vzorek a každý vzorek je třeba označit specificky odštěpitelnou značenou složkou. Značená složka, či značené složky se potom připojí na odpovídající oligonukleotid/y. Pak dojde k hybridizací oligonukleotidu/ů, hybridizovaných potom na cDNA na pevném podkladu za vhodných hybridizačních podmínek, Po skončení hybridizačního stupně se pevný podklad promyje s úmyslem odstranit jakékoli nehybridizované podíly. Pevný podklad, nebo sestava takových podkladů se potom umístí do roztoku, kde dojde k odštěpení značených složek pro hmotnostní spektrometr. Takové složky se potom vyhodnotí měřením hmotnostní spektrometrií, hmotnost každé značené složky se identifikuje a přítomnost (i nadbytek) či nepřítomnosz expresní' raRNA se zjistí ·

4. Důkaz nikroorganizmů, specifických genových expresí nebo specifických sekvencí nukleových kyselin

Použití vzorků DNA s odštěpitelnými značenými složkami se dá využít ke zjištění přítomnosti nebo nepřítomnosti mikroorganizmů kteréhokoli typu ve vzorku či prověřovaném druhu. Vzorek se typicky e β β • * · · ·· · · 0 • 9 « »·

-86,··· lyžuje za použití iontových detergentů nebo choatropních činidel, potom se nukleová kyselina specificky nebo nespecificky znehybní na pevném podkladu s následným testováním pomocí značených vzorků DNA. Nehybridizovaný vzorek se vyjme ve stupni promývání, značená složka se odštěpí z toho či onoho vzorku a proměří se.

Zjistitelnou nukleovou kyselinou může býš mRNA, genomická DNA, plasmidová DNA nebo RNA, rRNA, virová DNA nebo RNA. Při provedení detekce cílové nukleové kyseliny vyžaduje cílová složka určitý typ znehybnění, protože zde popisované testy nejsou homogenní. Jsou možné dva typy znehybnění, nespecifický nebo specifický. V prvém případě se nukleová kyselina znehybní na o pevném podkladu či substrátu, který se vyznačuje určitou afinitou pro nukleovou kyselinu. Nukleové kyseliny lze čistit či nikoli před nespecifickým znehybněním. Jako pevné podklady možno jmenovat nylonové membrány, membrány na podkladu nitrocslulosy apod. Pevné podklady se potom testují použitím značených oligonukleotidů s předem určenou sekvencí, aby se tak identifikovala cílová nukleová kyselina, jež je předmětem zájmu. Nehybridizovaný vzorek se odebere ve stupni promývání, značené složky se odštěpí z odpovídajících vzorků a potom proměří.

Jiným postupem s výsledkem vyšší specifičnosti pro analýzu populace se zřetelem na přítomnost určitého genu nebo sekvence DNA je využití Southern blot technique”, Připravená DNA se digeruje s restrikčním enzymem (BS) s výsledkem velkého počtu fragmentů DNA s líšísími se délkami, to dle stanovení přítomnosti specifických rozpoznávacích míst restrikčního enzymu na genomu. Allely určitých genů s mutacemi uvnitř restrikčního místa se štěpí na fragmenty různých počtů a délek. Vzniklý.restrikční polymorfismus fragmentové délky (RPLP) může být důležitým diagnostickým znakem mikroorganismu, je-li možno fragment specificky identifikovat.

Fragment, který se má analyzovat, by se mel oddělit ze shluku fragmentů DNA a odlišit od ostatních druhů DNA použitím specifických testů. Takže DNA se vystaví elektroforetickému frakcionování za použití určitého typu gelu nebo chromatografie s následným přenosem a fixací na nylonové membráně nebo na membrá• »

-87ně z nitrocelulosy. Fixovaná, jednoprovazcová DNA se hybridizuje na značený oligonukleotid, komplementární k DNA, jež se má zjistit. Po odstranění nespecifických hybridizací se identifikuje fragment DNA, těšící, se zájmu, štěpením značené složky nebo značených složek z hybridizováného vzorku. Za použití výše popsané technologie lze zpracovat přes 100 vzorků současně.

Přítomnost a kvantitativní vyhodnocení přepisu specifického genu se dá analyticky zjistit použitím Northern blot analysis a RNase protection assay. Základem těchto postupů je hybridizování shluku celku buněčných RMA ha specificky značený vzorek nebo na sadu specificky značených vzorků. Při Northern blot technique se veškerý podíl RNA z tkáně elektroforeticky frakcionuje za použití agarosového gelu, přenosem se znehybní na pevném podkladu (nylon, nitrocelulosa $td), RNA se hybridizuje na značený oligonukleotid, komplementární k RNA, jež se má zjistit. Po odstranění nespecifických hybridizací se identifikuje zajímavý fragment RNA odštěpením značené složky ěi značených složek z hybridizováného vzorku. Použitím přesných podmínek při vymývání se odstraní nespecificky vázané molekuly v důsledku jejich slabšího hybridizování ve srovnání se specificky vázanými mole kulami.Rychlejším, ale méně specifickým postupem je tečkovací metoda, jež se provádí jako Northern blot techniqueů s tou změnou, že se RNA přímo natečkuje na membránu bez předchozího frakcionování.

Specifickým postupem pro zjištění určitého druhu mRNA je RNase protection assay . Veškerý podíl RNA z tkáně nebo buněk či buněčné kultury se hybridizuje na ribonukleotidový nebo desoxyribonukleotidový značený’'vzorek. Specifita se docílí následnou digescí RNA. Nehybridizované, jednoprova zcové RNA a nespecificky hybridizované fragmenty s případnými nahodilými příměsmi a rozpoznají a štěpí, zatím co dvouprovazcové RNA nebo DNA/RNA duplexy s kompletní homologií nejsou enzymům přístuoné a jsou tak uchráněny. Specificky chráněný fragment se dá oddělit od degradacmch produktů, značená složka či značené složky se odštěpí z odpovídajících vzorků a následně proměří·

Přesné umístění dané mRNA (nebo jakékoli sekvence kyseliny

9· 9 • · • · 4

9··· ·

-88nukleové) ve specifikované populaci buněk v tkáni se dá stanovit hybridizováním in šitu· Tento pochod může být a i citlivější, než analýza veškeré tkáňové RNA nebo jejího přípravku za použití poštupů, uvede nýc h' zde výše . To je případ, kdy dojde k expresi mRNA ve vysoké koncentraci ve velmi omezené oblasti nebo buněčných typů v tkáni a došlo by k zředění homogenizováním veškeré tkáně. Pro hybridizování in šitu je třeba tkáně zmrazit nebo perfuzně fixovat a pak členit dle histochemického protokolu. Hybridizační protokol pro tkáňové sekce a značené vzorky ye podobá jiným hybridizačním postupům, jak byly popsány zde výše. Je možná i kvantitativní analýza.

5. Technika mutační detekce

Zjištění obemocnění je zvyšujícím se způsobem důležité jak při prevenci, tak při léčbě. Při multifaktoriálních nemocích je nesnadné spolehnout se na genetické testy, protože je známo více než 200 lidských nesnází, způsobených defektem jednoduchého genu, často se záměnou zbytku jediné aminokyseliny, viz Olsen, Biotechnology. An industry comes of age, National Academie Press, 1986. Četné z těchto mutací vyústí v záměně aminokyseliny a to způsobuje stav onemocnění.

Citlivé postupy mutační detekce nabízejí často mimořádné možnosti mutačního stínění. Tak například lze provést analyzy i před implantací oplodněného vajíčka, viz Holding a Monk, Lancet 532 (1989).

· • * » · · *· • * *··· :

-89Stále se účinnější genetické testy dají využít ke stínění onkogenných mutací v buňkách, odebraných z dýchacího traktu nebo močového měchýře při zdravotních prohlídkách, viz Sidransky a spol., Science 252, 706 (1991). Také pokud nějaký neznámý gen způsobí genetické potíže, jsou způsoby sledování variant DNA sekvence užitečné pro analýzu dědičnosti nemoci v důsledku genetických vazeb. Avšak zjištování a diagnosa mutací individuálních genů je spojena s technologickými a ekonomickými problémy. Bylo již sledováno několik přístupových možností, ale žádná z nich nebyla dostatečně účinná, jakož i vždy b>ly nákladné se zřetelem na aplikování v širším rozsau.

Mutace, zahrnující jediný nukleotid, lze zjistit ve vzorku fyzikálními, chemickými a enzymovými postupy. Obecně lze rozdělit způsoby detekce mutací na rastrovací postupy, které se hodí pro identifikování dosud neznámých mutací a postupy, označené jako zjištovací, rozlišovací nebo kvantitativně vyhodnocovací známých variant sekvencí.

Několik rastrovacích postupů se zřetelem na zjištění mutací bylo rozvinuto v heteroduplexech náhodně promíchaných komplementárních provazců DNA, odvozených od sekvencí divokých typů a mutantů, a ty se vyznačujé abnormálním chováním, zvláště jsou-li denaturovány· Tento jev se využívá při denaturování a teplostně gradientově gélové elektroforese (D GGS a TGG3 v tom kterém případě. Duplexy promíchané i v jediném nukleotidovégi postavení mohou částečně denaturovat s důsledkem opožděné migrace, jsou-li elektroforeticky sledovány za použití stoupajícího děnaturujíčího gradientu gelu, viz Myers a spol., Nátuře 313,

495 (19S5); Abrams a spol., Genomics 7, 463. (1990); Henco a spol., Nucl.Acids Res. 18, 7633 (1990).Ačkoliv lze zjistitmutace, nezískají se tak informace se zřetelem na přesné umístění mutace. Mutantová forma se musí dále izolovat a analyzovat se zřetelem na sekvence DNA.

Jinak lze heteroduplex vzorku RNA a cílového provazce štěpit použitím RNase A” v postavení, kde oba provazce nejsou vhodným způsobem propojeny. Místo štěpení lze potom určit elektro sce e

9' «

9 «

-90forezou denaturovaného vzorku.. Avšak některé mutace mohou uniknout důkazu, protože ne všechny náhodně promíchané směsi se účinné spětí použitím RNase Aů.

Náhodně promíchané podklady v duplexu lze rovněž chemicky modifikovat. Takovými modifikacemi lze upravit provazce, že jsou štěpitelné v místě promíchání nebo způsobují, že polymerasa ustane v dalších prodlužovacích reakcích. Postup chemického štěpení dovoluje identifikování mutace v cílových sekvencích až do 2 kb a získají se tak informace o přibližném umístění promíchaných nukleotidů, viz Cotton a spol., PNAS USA 85, 4397 (1986) Ganguly a spo.., Nucl.Acids Res. 18, 3933 (1991). Avšak tento postup je laboratorně náročný a nemusí také identifikovat přesně umístění mutace.

Alternativní strategie pro zjištění mutací v provazci DNA spočívá v substituci (během syntézy) jednoho z normálních nukleotidů modifikovaným nukleotidem, čímž se změní mol.Hmotnost nebo jiné fyfeikální parametry produktu. Provazec se zvýšeným nebo sníženým počtem takto modifikovaného nukleotidu vztažmo k sekvenci divokého typu se vyzbsčují změněnou elektroforetickou pohyblivostí, viz Naylor a spol., Lancet 337. 635 (1991). Tímto způsobem lze dokázat přítomnost mutace, nikoli však umístění této.

Dbě další strategie umožňují nahlédnutí do mutací v segmentu DNA změnou gelové migrace. Při postupu jednoprovascového konformačního polymorfizmu (3SGP) mohou mutace denaturovat provazce potud, že nabývají lišících se sekundárních struktur, čímž ovlivňují mobilitu během elektroforesy nativního gelu. Heteroduplexní molekuly DNA, obsahující vnitřní promíchání, lze rovněž oddělit od spráyně uspořádaných molekul elektroforesou, viz Orita, CTenomics X, 874 (1989); Keen, Trends Genet. X, 5 (1991).

Jako tomu bylo v případě postupů, zmíněných zde výše, lze dokázat přítomnost mutace, nikoli však její umístění. Navíc četné z těchto postupů nerozlišuji jedinou a násobnou mutaci.

Všechny výše zmíněné postupy jsou důkazem přítomnosti mutace v limitovaném segmentu DNA a některé z nich dovolují • · ·«

-91určit přibližné lokalizování uvnitř segmentu. Avšak stále je nutná sekvenční analýza k rozřešení účinku mutace na kódující potenciál segmentu. Sekvenční analýza je velmi účinná, dovolující například odstrsbění téže stejné mutace v dalších jednotlivcích postižené skupiny, dále dovoluje sledování postupu onemocnění v případe maligních nemocí, nebo zjištění zbývajících maligních buněk v kostním morku před autologní transplantací.

«

Navzdory těmto výhodám není pravděpodobné, že by postupy mohly být uzpůsobeny pro rutinní diagnostické metody a to se zřetelem na vysoké náklady, s tím spojené.

Byl rozvinut velký počet dalších technických postupů pro analyzování známých variant sekvencí. Automatizování a ekonomie jsou velmi důležitými podmínkami takových typů analýz, měly-li' by se používat, jak pro chránění jednotlivců, tak pro populaci obecně. Žádný z diskutovaných technických postupů nekombinuje ekonomiku, automatizování s potřebnou specifičností.

Mutace lze identifikovat cestou jejich destabilizačního vlivu na hybridizování krátkých oligonukleotidových vzorků jako cílových sekvencí, viz Wetmur, Crit.Rev.Biochem.íiol.Biol. 2.6,

227 (1991). Obecné řečeno tento postup, záleže jící v allelově specifické oligonukleotidové hybridizaci zahrnuje amplifikování cílových sekvencí s následnou hybridizaci se vzorky krátkých oligonukleotidů. Amplifikovaný produkt lze tedy stupňovat pro četné možné sekvenční varianty určením hybridizačního vzoru až do dosažení řady imofeilizováných oligonukleotidových vzorků.

Avšak vystihnout podmínky, kdy by se rozlišil počet dalších strategií pro vystižení sekvencí v nukleotidech, to vše záleží na enzymech, idetifikujících sekvenční rozdíly, viz Saikm, PRAŠ USA 86, 6230 (1989); Zhang, liucl.Acids Res. 19, 3929 (1991).

Tak například restrikční enzymy rozpoznají sekvence asi 4 až 8 nukleotidů. Za předpokladu průměrného obsahu G + C lze asi polovinu nukleotidových poloh v segmentu DUA monitorovat na panelu 100 restrikčních enzymů. Alternativní, umělé rozpoznávání

• · · ··· · ·

-92sekvencí restrikcních enzymů se může vytvořit kolem variabilních poloh použitím částečně nahodile promíchaných PCR primérů. Za použití takových postupů může být rozpoznán bud mutant nebo sekvence divokého typu jako taková s následným štěpením resgrikčním enzymem po amplifikaci, viz Chen. a spol.. Anal.Biochem. 195» 51 (1991); Levi a spol.,. Cancer Res. 51 ♦ 3437 (1991).

Další postup využívá vlastnost, že oligonukleotidový primér, který je přimíchán do cílové sekvence v předposlední 3 '-poloze, se vyznačuje zredukovanou kapacitou sloužit jako primér v PCR. Avšak některé z 3 'nahodilých směsí, zvláště pak G„T, jsou menšími'inhibitory než další., omezující použitelnost. Ve snaze vylepšit tento postup byly přidány do priméru další nahodilé směsi v třetí poloze od 3 '-koncovky. Výsledkem je promíchání dvou poloh ve třech 3'-nukleotidech priméru s hybridizací pro jednu allelovou variantu, a.jedna nahodilá směs v třetí poloze od 3'-koncovky, pokud primér hybridizuje nc další allelcvé varianty, viz Ilev/ton a spol., tíucl.Acids Res. .17, 2503 (1989).

Je třeba definovat amplifikační podmínky, jež by jednoznačně svědčily pro amplifikování 1 bp nahodilé směsi.

Polymeresy DRA byly rovněž použity k rozlišeni allelových sekvencí variant, a to stanovením, který nukleotid se přidá na oligonukleotidový primér bezprostředně směrem vzhůru od proměnné polohy cílového řetězce.

Byl vyvinut i ligační test. Při tomto postupu se dva oligonukleotidové vzorky hybridizují v bezprostředním sousedství a připojí se na cílový provazec DUA ligasou. Ligace je inhibovánž jde-li o nahodilou směs, kde dva oligonukleotidy na sebe naléhs

C_J.

a Testy pro zjištění mutace Llutace je záměna páru jediné báze v genomické DRA. V kontextu s tímto vynálezem se většina takových změn snadno zjistí hybridizováním s oligonukleotidy, které jsou komplementární k předmětné sekvenci.

···· • rf • · » · • •rf · • rf rf ·· _soligo

Ve zde popisované soustavě se používají dva\ nukleotidy ke zjištění mutace. Jeden oligonukleotid vlastní sekvence divokého typu, další vlastní mutantní sekvence. Použijí-li · se dva takové oligonukleotidy jako vzorky na cílovou genomickou sekvenci divokého typu, pak se oligonukleotid divokého typu dokonale zakotví ve spárované struktuře a mutantní oligonukleotid

V vytvoří duplex sjednou dvojící promíchaného páru.

Jak to již bylo diskutováno zde výše, rozdíl o 6 až 7° C v divokého typu pr o tějpr o míchanému duplexu dovoluje snadné identifikování Si diskriminaci obou dvou typů duplexů. Při provádění takové diskriminace se provede hybridizace za T orom míchaného duplexu v odpovídájícím-hybotropním roztoku. Míra hybridizace se potom změří pro sadu oligonukleotidových vzorků, hlěří-li se poměr rozsahu hybridizace vzorku divokého typu k promíchanému vzorku, získá se hodnota 10/1 až více než 20/1.

Takové typy výsledků dovolují rozvinutí větších testů pro zjištění mutace.

Jako příklad lze uvést: jeden testovací způsob detekce využívá cílovou nukleovou kyselinu (například genomickou DNA) a oligonukleotidové vzorky, jež překlenou oblast zájmu. Oligonukleotidové vzorky jsou co do délky větší nebo rovné 24 nt (s možným maximem asi 36 nt) a jsou znsčejujfluorochromém na 3 a 5'-koncovkách oligonukleotidového vzorku. Cílová nukleová kyselina se získá lyžováním buněk tkáňové kultury, tkání, organizmů atd. v odpovídajícím hybridizačním roztoku. Lyžovaný roztok se potom vyhřeje na teplotu, kdy se denaturuje cílová nukleová kyselina (15 až 25° C na T^ duplexu cílové nukleové kyseliny). Za denaturační teploty se přidají vzorky oligonukleotidň a hybridizování se provede za T_m promíchaného duplexu v době od 0,5 do 24 hodin. Potom se shromáždí genomická DNA za použití GF/G (GF/B a pod.) filtru ze skleněných vláken. Filtr se dále promyje odpovídajícím hybridizačním roztokem s úmyslem odstranit jakékoli něhybridizované oligonukleotidové zbytky (RNA, krátké oligo- a nukleové kyseliny$i které nejsou za takových podmínek • · • φ

-94vázány na skleněná vlákna filtru). Hybridizovaný oligo-vzorek se dá tepelně eluovat z cílové DNA a proměří se (například fluorescenčně). Při zjištěních, vyžadujících vysokou hladinu citlivosti, se vzorky po zahuštění proměří.

Může se použít jiný postup vysoce citlivé hybridizace. Postup Sle tohoto vynálezu umožňuje snadné zjištění nukleové kyseliny, obsahující mutaci, podezřelou z přítomnosti v buňkách, vzor cicxi nukleová nukleové k •přítomnost td., například v cílové nukleové kyselině. Cílová kyselina” obsahuje nukleotidovou sekvenci deóxyribokyseliny (DNA) a ribonukleové kyseliny (RNA, jejich: je předmětem zajmu, a připadna přítomnost ci nepřítomnost se má zjistit hybridizačním testem. Hybridizační postup dle tohoto vynálezu se může také použít na komplexní*'biologické směsi nukleových kyselin (DNA a/nebo RNA)'. Taková komplexní biologická směs zahrnuje velký rozsah eukaryotických a prokaryotických buněk, Čítaje v to protoplasty a/nebo další biologické materiály, které zakotvují pólynukleotidovou nukleovou kyseinu. Postup je tedy použitelný na buňky tkáňových kultur, živočišné buňky, živočišné tkáně, krevní buňky (například retikulocyty, lymfocyty), rostlinné buňky, bakterie, kvasinky, viry, mykoplasmata, protozoa, houby apod, Důkazem specifické hybridizace mezi vzorkem nukleové kyseliny a· známým zdrojem lze zjistit přítomnost specifické cílové nukleové kyseliny.

Typický hybridizační test pro zjištění cílové nukleové kyseliny v komplexní populaci nukleových kyselin lze popsat takto: Cílové nukleové kyseliny se dělí dle velikosti ns gelové matrici ( elektroforezn§), klonují se a izolují, podrozdělí do nižších shluků nebo ponechají jako komplexní populace. Cílové nukleové kyseliny se přenesou, nanesou jako skvrnka nebo znehybní na pevném podkladu, jeko je mrrnbrána nylonová nebo nitrocelulosová (toto ”znehybnění se označuje někdy také jako seskupení). Znehybněné nukleové kyseliny se dále zpracují ve stupni zahřívání nebo použitím, ultrafialového záření, čímž se nukleová kyselina ireverzibilně znehybní. Membrány se potom ponoří do • · 99 • · · ·« • · ·

-95blokujících Činidel, kam patří Dendhart'ovo reagens (viz Dendhart, 3iochem.Bipphys.Res.Comm. 23., 64 (1966), heparin (viz Singh a Jones, Nucl.Acids Res. 12, 5627 (1984) a tukuprosté sušené mléko (viz Jones a spol., Gene Anal.Tech. 1, (1984). Blokující činidla se obecně přidávají v obou stupních předh.ybridizování i hybridizování, použije-li se nitrocelulosa. Cílová nukleové kyselina se potom testuje vzorkem značeného oligonukleotidu za podmínek, popsaných zde výše pro hybotropně-založené roztoky. Nevázaný enzym se dále vymyje a membrána se ponoří do roztoku substrátu. Signál se zjistí použitím hmotnostní xpektrometrie LíALDI, v podstatě jak se to popisuje zde dále.

s Sekvencování hybriďizováním

Sekvenční ianalyza DNA se běžně provádí hybridizováním priméru na cílovou DNA s následným prodloužením řetězce za použití polymerasy. Specifická místa zastavení se kontrolují inkluzí didesoxynukleotidu. Specifitou značení tímto typem analyzy je možnost zvýšení specifity přidáním hybotropu do anelovacího pufru a/nebo přidáním nebázického zbytku do priméru a anelo. váním za diskriminační teploty.

Další postupy sekvenční analyzy zahrnují hybridizaci cílené látky s uspořádáním nahodilého, krátkého oligonukleotidu či oligonukleotidů. Sekvence se konstruuje tak, že překryje hybridizační analýzu. Při tomto postupu je zásadně nutná přesná hybridizace. Přidání hybotropu nebo nebázických zbytků a anelování. za diskriminující teploty se projeví při tomto postupu blahodárně a sníží, nebo odstraní dokonale nahodile promíchané hybridizování. Cílem je vyvinout automatizované hybridizační postupy s tunyšlem možnosti vyšetření velkých uskupení oligonukleotidových vzorků nebo velkých seskupení vzorků nukleových kyselin, Použití takových technologií zahrnuje genové mapování, klonové charakterizování, lékařskou genetiku a zjištění genů, dále analýzu sekvencí DNA hybridizováním a pošlé

-96sekvenci vzorků upravit, a: párovaných vzorků, p(to se ověření sekvencování.

Je třeba zvládnout četné parametry s ohledem na automatizování nebo zvládnutí velkého poctu oligonukleotidových vzorků. Stálost odpovídajících vzorků musí být podobná, podobné mají být i stupně promíchání s cílovou nukleovou kyselinou, teplota, iontové napětí, obsah A + T ve vzorku (nebo cílové látce), jakož i další parametry, je-li vzorek krátký (tj. 6 až 50 nukleotidů). Obvykle lze pokusné podmínky a je příznivé ovlivněna tvorba dokonale termodynamicky ve srovnání s jakýmkoli jiným duplexem, obsahujícím nahodilou směs. Aplikování ve velmi velkém rozměru z hlediska vzorků, jako· jo sekvencování hybridizováním (SBH). nebo testování vysoce polymorfních loci, jako je umístění cystického fibrozního trsns-membránového proteinu vyžaduje mnohem přísnější požadavky na multiplexní vzorky.

6. Řazení

Hybridizace nukleové kyseliny na řazené vzorky DNA se již dlouho používá v případě četných aplikací základního biologického výzkumu a bažně se s nimi začíná v lékařské diagnostice, soudnictví a zemědělství. Jak se to popisuje dále ještě podrobněji, lze připojit molekuly nukleové kyseliny nebo proteiny na pevný podklad se vzniku řazení či seskupení s následným testováním značenými molekulami dle tohoto vynálezu.

Tak například dle jednoho provedení tohoto vynálezu se řazené či seskupené vzorky DNA mohou použít k identifikování individuálních klonů. V krátkosti: známé molekuly DNA se opatří značením za vzniku značeného vzorku a testují hybridizováním proti seskupení neznámých klonů. Lze tak izolovat klony, které mají specifickou hybridizaci ve srovnání s vzorkem. Takové testy lze provést, použitím neuspořádaných seskupení klonů, viz Sambrook a spol., Lloleculsr Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Bpring Harbor, H.Y., 1989. Jinak lze získat membrány, nesoucí pravidelně uspořádané v odstupech seskupení klonů známé individuální totožnosti (ačkoliv obvykle s neznámou sekvencí), např. Research Genetics, BAG cloně arrays, Huntsville, AL.

Podle dalšího našeho provedení se mohou seskupení využít uro transkripci velkého počtu genů současně, viz obecně Gess a β e ·· · · • · • · « ι · · « » · · « ·· ·· ♦ · ···· •97spol., Karamalian Genome 3, 609-619 (1992). Krátce řečeno: shluky cDNA lze značit za použití vzorků, velkých seskupení klonů cDBA’-k identifikaci expresně převažujících genů ve specifických tkáních. Mikrouspořádání z jednotlivých cDNA-klonů mohou být rovněž využita ke kvantitativnímu zjištění relativní exprese každého genu v sestavě dvou různých vzorků DNA, viz Schens a spol., Science 2J0, 467-470 (1995). Specifičtěji se mohou využít roboty pro produkci mikrosestav PCR-produktů z individuálních klonů: každá část v sestavě odpovídá jedinému cDNA-klonu. Vzorky· pro sestavy se připravují značením prvého provazce cDNA'z každého tkáňového vzorku značenou složkou. Pro srovnání genové exprese ve dvou tkáňových vzorcích se cDNA každého z nich značí lišící se značenou složkou. Dva' vzorky se potom spojáa hybridizují společně do konečného seskupení. Po hybridizování vzorků do uskupení se mohou značené složky odštěpit a analyzovat, jak je to popisováno v tomto texůu pro každou značenou složku, hybridizovanou pro ka vzorek seskupení. Pro každý uvedený gen je poměr hybridizace ka značeného vzorku komplexu. cDNA mírou relativní genové exprese ve v

dvou tkáňových vzorkách. Použití vnitřní kontroly a dvou (pokud možno až čtyř) lišících se značení je rozhodujícím faktorem pro takové použití.

Linohé z dále ještě popisovaných aplikací jsou variacemi na tento základní postup za použití různých zdrojů seskupení DNA a různých zdrojů vzorků DNA, ale každé z použití je omezeno použitím běžných zjištovacích postupů na méně než 4 až 6 rozlišitelných vzorků hybridizační směsi.

Další aplikací hybridizování seskupení DNA, na které bylo v podstatě poukázáno s možnosti velmi-širokého-upotřebení je sekvencování hybridizováním (SBH). Podstata sekvencování hybridizováním (SBH) využívá sestavu všech možných n-nukleotid ním oligomerů (n-mery) k identifikování n-merů přítomných v neznámé sekvenci DNA. Kompjutorové přístupy byly využity pro sestavení kompletní sekvenc vis obecně Drmanac a spol., Science 260, I649-I652 (1993). Použití sekvenční hybridisace (SBH) zahrnuje tSK N<

« · *· ·· ββ 9 β · · * * * · · 9 9 « · • 9 • ·*« 9 ♦ 9 9

99

99 » 9 9 9

I 9 99

9 9 9

9 *

99

-98fyzické mapování (uspořádání)překryvných DNA-klonů, vyhledávání sekvencí, porovnání DMA-otisků prstů genů normálních a vyvolaných nemocemi a. identifikování fragmentů DMA se zvláštnír sekvenčními motivy a komplementární DMA a genomických sestavách.

Sestavy DMA nalezly často také svá uplatnění při detekci genových variací a polymorfizmů. Změny jednotlivých základních párů, vypuštění či vsunutí, mutace a polymorfizmy lze zjistit znehybněním známých sekvenčních variant a testováním za použití značených produktů PCR od pacientů nebo pathogenů, viz např.

Guo a spol., Muclgic Acids Res, 22_, 5456-5465 (1994). Podobně se sestavy oligonukleotidů m©hou využít při měření genetických variací, čítaje v to detekce variantů KIV, rezistentních na lé-. ky a citlivých na léky, vis např.Lipshutz a spol., Biotechniques 19, 442-447 (1995).

Sestavy DMA lze připravit použitím nejméně dvou různých technických postupů: je to syntéza in šitu a deponování vzorků, připravených odděleně (nanášení skvrn). Jednou z velmi slibných možností významného technického postupu pro získání vzorku DMA in šitu je lehce-řízená syntéza oligonukleotidů, jak to popsali Pease a spol., P .M.A.S. USA 91. 5022-5026 (1994). V krátkosti: sestavy definovaných sekkvencí DMA se získají použitím fotolabilních blokujících skupin pro usměrnění syntézy oligonukleotidů do seskupení za použití moderních lithogragických postupů. Připraví se mas Iq/ tak, že každá část seskupení, jež potřebuje ten či onen základ pro další stupen syntézy, se vystaví účinkům světla. Jediný □ukleotidový zbytek se přidá ke každému řetězci, který byl vystaven účinkům světla a exponován použitím masky, cyklus syntézy se zakončí a iniciuje se další cyklus použitím jiné další masky a jiného oligonukleotidového zbytku. Sekvenční použití tohoto postupu se může použít pro vystavení až velmi širokého seskupení oligonukleotidů. Jednu možnost robotového sestavení popásal Schena a spol. (1995) ve spojitosti s použitím paprsků pro přepisovou analýzu.

• · • ·· · · • · · • ···<

-99Podle jednoho a provedení dle tohoto vynálezu se druhé členy seskupí na pevném podkladu, jako je oxid křemičitý, křemen nebo sklo. Seskupení se může potom použít k blokování nespecifické hybridizace s následným inkubováním značených vzorků prvých členů na pevném podkladu. Podle určitých výhodných provedení se potom sestava promyje (s definovanou přesností) s úmyslem odstranit nespecificky hybridisované· nukleové kyseliny, opláchne se roztokem, obsahujícím matriční materiál, vhodný pro spektrometrii mnebo potsnciomstrii (např.

pro laserovou desorpci za pomoci matrice nebo ionizační hmotnostní spektrometrii), vysušeníms se získá odpovídající matrice, jež se vystaví účinkům světla k, odštěpení značených částí se vzorků nukleových kyselin. Odštěpené značené složky se potom analyzují spektrometricky nebo potenciometričky, třeba použitím hmotnostní spektrometrie hAIDI.

Podle některých provedení se provede v jediném stupni štěpení a laser-ová desorpce. Podle jiných variací se provede laser-ová desorpce a ionizace bez matrice. Při některých pokusech byly přidány referenčně znavené oligonukleotidy nebo další značené sloučeniny do rohtoku matrice ke kontrole variací účinnosti foto-štěpení, laser-ové desorpce a účinnosti detekce hmotnostní spektrometrií. Změřením poměru přebytku mezi testotanou značenou složkou a sérií referenčních značených složek lze získat kvantitativní údaje z výsledků hmotnostní spektrometrie MALDI.

Podle dalšího provedení jsou gestavy složeny z oligonukleotidů délky pod 50 bp. To může být využito při zjištování polymorfizmu (např. zrně nami/jed no tlivých členů páru) pro genetické mapování nebo. .pro.- zjištění přítomnosti -či nepřítomnosti té či oné DNA ve vzorku, pro analyzování či členění klonů, zjištování paternity, při soudní analýze a při genetickém mapování. Sestavy mohou být podobně složeny z proteinů.

C. Dělení fragmentů nukleových kyselin

Vzorek, potřebující analýzu, je často směsí různých • ·

-100složek v komplexní matrici. Tak například ve vzorcích, obsahujících neznámé sloučeniny, se musí složky nejprve vzájemně od sebe oddělit tak, že každou individuální složku lze identifikovat jinými a dalšími analytickými postupy. Se zřetelem na dělení jsou vlastnosti komponent ve směsi konstantní za konstantních podmínek, a tedy pokud jsou jednou již stanoveny, mohou se použít k identifikování každé ze složek, jakož i k zjištění množství takové složky. Takové postupy jsou typickými pri postupech dělení chromátograficky či elektroforeticky.

1. Vysokotlaková kapalinová chromatogrsfie (HPLC)

Tento postup jako způsob chromá tografického dělení slouží k oddělení látek, které jsou rozpuštěny v roztoku. Příslušný přístroj sestává se zásobníku mobilní fáze, čerpadla, injektoru, dělící kolony a detektoru. Sloučeniny se dělí injikováním alikvotních podílů vzorku směsi na kolonu. Různé složky směsi procházejí kolonou různými rychlostmi v důsledku jejich rozdělení mezi mobilní kapalnou fázi a stacionární fázi.

V poslední době bylo zjištěno, že částečky Ip-RO-HPCL a neporézní PS/DVB s chemicky navázanými slkylovými řetězci jsou rychlými alternativami pro kapilární elektroforezu při analýze jak jednoprovazcových, tak i dvojitě provazcových nukleových kyselin za podobného stupně štěpení, viz Huber a spol., A hal. Biochem. 212, 351 (1993, Huber a spol., Nucl.Acids Res. 21, 1061 (1993), Huber a spol., Biotechniques lc, £96 (1993). Ha roédíl od iontově výměnné chromatografie, jež často nezadržuje dvojité provazcovité DNA ve funkci délky provazce (protože AT páry základních složek vzájemně reagují s kladně nebitou stacionární fáií, a to silněji, než GC páry základních složek) dovoluje ÍR-RP-HPLC dělení v přísné závislosti na velikosti.

Způsob, který byl popsán, používá lOOmí.I triethylamoniumacetát jako reagens, spojující ionty a fosfodiestery oligonukleotidů se dají s úspěchem dělit na neporézních částečkách pti poly(styrendivinylbenzenu) použitím vysoce výkonné kapalinové chromatografie, o o • ·

-101viz Oefner a spol., Anal.Biochem. 223, 39 (1994). Popsaný postup dovoluje odděleni PCR produktů, lišících se pouze čtyřmi až osmi páry základních složek v délce rozsahu 50 až 200 nukleotidů

2. Elektroforeza

To je postup dělení, založený na pohyblivosti iontů (nebo DNA, jak je to v zde popisovaném případě) v elektrickém poli. Negativně nabité částečky’ DNA .se pohybují směrem ke kladné elektrodě a kladně nabité ionty směrem k záporné elektrodě. Z bezpečnostních důvodů je obvykle jedna z elektrod u dna a další jinde, at již kladná či záporná. Nabité částečky se vyznačují různými migračními^rychlostmi v závislosti na jejich celkovém náboji, velikosti a tvaru a mohou se' proto oddělovat. Aparát s elektrodami je spojen se zdrojem napětí o vysoké voltáži, obsahuje elektrody, pufr a podklad pro pufr, jako je polyakrylamidov, gel, nebo kapilární trubičku. Otevřené kapilární trubičky se často používají pro četné typy vzorků a další různé gélové podklady se často používají pro biologické vzorky, jako jsou směsi proteinů nebo fragmentů DNA.

3.

Kapilární elektroforeza (CE)

Je to postup, který při různých řešeních (roztoky, isotachoforéza, isoelektrické zaostřování, polyakrylamidový gél, micelární elektrokinetická chromatografie”) se jeví být postupem pro rychlé dělení s vysokou účinností při použití velmi malých objemů vzorku komplikovaných směsí. V souvislosti s neobyčejnou citlivostí a selektivitou molekulární spektroskopie, může být kombinace CE- + léS potenciálně -účinnou ..technikou v bioana^JLyze. Při nových možnostech aplikace, jak jsou zde popisovány, propojení obou těchto postupů povede ke způsobům lepšího sledování sekvencí DNA, které vyřadí běžné postupy svou ryclfostí o několik řádů.

Soulad mezi CE a elektrosprejovou ionizací (ESI) z hlediska průtokových rychlostí a ta skutečnost, že oba postupy jsou uzpůsobeny pro (a hlavně pro) iontové podíly v roztoku je základem

-102mimořádně přitažlivé kombinace. Byla popsána kombinace jak kapilární zonové elektroforezy (CZE) a kapilární isotachoforezy a quadrupolním hmotnostním spektrometrem na základu ESI, viz Olivares a spol., Anal.Chem. 59, 1230 (1987), Smith a spol., Anal.Chem. 60, 436 (1988), Loo a spol., Abal. Chem. 179, 404 (1989), Edmonds a spol., J,Chrom. 474. 21 (1989), Loo a spol., J.tíicrocolumn.Sep. 1, 223 (1989), Lee a spol., J.Chromatog. 458,

313 (1988), Smith a spol., J.Chromatog. 480, 211 (1989), Grese a spol.51 J.Amer .Chem.Soc. 411, 2835 (1989) paptidy jsou snadno zjistitelné použitím CZE-analyzy s dobrou citlivostí.

Nejúčinnějším postupem dělení fragmentů DNA je elektroforeza na polyakrylamidovém gólu (BAGE), obecně za použití destičky gélu. Avšak velkou překážkou současné technologie je poměrně dlouhá doba, které je třeba lc provedení gélové chromatografie fragmentů DNA, vzniklých sekvenčními reakcemi. Zvýšení (asi desetinásobného) lze docílit kapilární elektroforezou za použití mimořádně tenkých gélů. \^re volném roztoku se všechny pohybují přibližně stejně fychle, protože jejich _aj_:ce de projeví kompenzací hmotnosti a náboje. Na polyakrylamidovém gélu se fragmenty prosejí a pohybují se ve funkci své délky a tento přístup byl nyní aplikován na CE. Pozoruhodný počet destiček na metr se dal nyní dosáhnout použitím zesítěného polyakrylamidu (10 destiček na metr, viz Cohen a spol., Proč.Nati.Acad.Sci., USA 85, 9660 (1988). Takové CE koleny, jak to bylo zde popsáno,, se mohou použít pro sekvencování DNA. Způsob s použitím CE je v podstatě dvacetpětkrát rychlejší, než gelová chromatografie na destičkách při standartním sekvenčním provedení. Tak například asi 300 podkladů lze přečíst za hodinu. Rychlost dělení je omezena při elektroforeza na gélových destičkách hodnotou elektrického pole, které bylo naneseno na gél bez nadbytečného vzniku tepla.

Z toho důvodu se větší rychlost CE dosáhne použitím vysokofrekvenčních polí (300 V/cm při CE proti 10 V/Cm při elektroforeze na gélových destičkách).Kapilárové provedení zredukuje ampéry a tím i mohutnost a vznik následného tepla.

-103Smith a spol., Nuc.Acids Res. 18, 4417 (1390) navrhli použití většího množství kapilái, uspořádaných paralelně, to a úmyslem zvýšit průtok. Podobně Ivlathies a Hungs, Nátuře 359,

167 (1992) zavedli kapilární elektroforezu, kdy se dělení provádí paralelně v kapilárách takto uspořádaných a dokazují tím rychlé průtokové sekvencování, Huang a spol., Anal.Chem.

64. 967, 1992, Huang a spol., Anal.Chem.64. 2149 (1992).

Největší nevýhodou kapilární elektroforezy je omezení množství vzorku, který se může nanést na kapiláru. Koncentrováním velkého množství vzorku na počátku použití kapiláry před dělením se sice zvýší možnost nanesení vzorku, ale hladina detekce se sníží o několik' řádů. Nej známějším postupem předkoncentrování při postupu CB je stahování vzorku, to bylo popsáno nedávno, viz Chien a Burgi, Anal.Chem. 64, 489A (1992). Stahování vzorku je závislé na matričních rozdílech (pH, iontová síla) mezi pufrovaným vzorkem a kapilárním pufrem, takže elektrické pole napříč pásmem vzorku je větší než v oblasti kapiláry. Při stahování vzorku se velký objem vzorku v nízké koncentraci pufru nanese pro předkoncentrování do zhlaví kapilární kolony, kapilára se naplní pufrem téhož složení, ale s vyšší koncentrací. Když ionty vzorku dosáhnou k pufru kapiláry a k dolnímu elektrickému poli, stahují se to koncentrovaného pásma. Stahováním vzorku se zvýší možnost zjištění řádově jednou až třikrát.

Jiným způsobem předkoncentrování je použití isotachoforézv (ITP) před CB dělením analyzovaných vzorků ve volném pásmu. ITP je elektroforetický technický postup, dovolující nanesení mikrolitrových objemů vzorku na kapiláru na rozdíl od nízkých nL injekčních objemů, jak to typicky bývává spojeno s CE. Postup záleží ve vnesení vzorku mezi dva pufry (vodící a nosné elektrolyty) o vyšší a nižší mobilitě v tom kterém případě ve srování s analyzovaným vzorkem. Postup je bezprostředně postupem koncentrač ním, protože koncentráty analyzované látky se dostávají do čistých pásem stejnou rychlostí. Postup je obvykle méně známý než postup stahování, popsaný výše, protože to vyžaduje volbou obou dvou pufrů jako elektrolytů a schopnost dělit pouze druhy kationtů a aniontů během postupu dělení.

-104-

Těžištěm sekvenčního postupu DNA je pozoruhodné selektivní elektroforetické dělení DNA nebo oligonukleotidových fragmentů.

Je to pozoruhodné proto, že dojde k oddělení každého fragmentu a liší se pouze jedním nukleotidem. Bylo dosaženo rozdělení až 1000 fragmentů (1000 bp). Další výhoda sekvencování s použitím odštěpitelných značených složek je tato. Není zde nutnost použít formát tabulkových gélů, dělí-li se fragmenty DNA polyakrylamidovou gelovou elektroforezou při použití odštěpitelných značených složek. Protože se prokombinují početné vzorky ( 4 až 2000), netře ba vzorky sledovat paralelně, jako je tomu v případě běžných barevných primérů nebo barevných terminátorů, jakož i postupů s nimi (např. ABI373 sekvencování). Není zde důvod používat paralelní linky, není důvod používat tabulkový gél. Takže je třeba pouze použít gel formátu trubičky při elektroforetickém postupu dělení, vis C-rossman a spol., G-enet.A nal.Tech.Appl.

9., 9 (1992). Ti poukázali na to, že se dosáhne podstatné výhody, použije-li se formát gólové trubičky místo gelových destiček. Je to v důsledku vetší schopnosti rozptýlit Joule-ovo teplo ve formátu trubičky než na destičce gélu, čímž se zvýší průtokový rychlost (asi o 50)-3, a dosáhne se většího, rozlišeni fragmentů DNA o vysoké molekulární hmotnosti (nad 100 nt). Dlouhé odčítání je rozhodující při geHornickém sekvencování. Takže použití štčpitelných. značených složek při sekvencování má svou další výhodou v tom, že dovoluje použití účinnějšího a citlivějšího postupu dělení DNA s podstatně vyšší rozlíšitelhostí.

4. Mi liro provozní zařízeni

Kapilární elektroforéza je účinným postupem sekvencování DNA, při soudní analýze, analýze produktů PGR a zjištování restrikční velikosti fragmentů. CE je mnohem rychlejší než tradiční destičková PAGE, protože s kapilárními gely se dá nanést mnohem vyšší potenciál. Avšak CE má nevýiodu v tom smyslu, že dovoluje sledování pouze jednoho vzorku na gel. Postup kombinuje rychlejší dělící doby CE se schopností analyzovat paralelně více vzorků.

« ·

-105Podtextem při použití mikroprovozních zařízení je schopnost zvýšit tím hustotu informací pči elektroforeze miniaturizováním rozměrů dílku asi na 100 mikrometrů. Elektronický průmysl využívá běžně mikroprovozních zařízení pro obvody s velikostí pod 1 mikron. Hustota proudu kalipárních sestav je omezena vnějším průměrem kapilární trubičky, mikrovýroba kanálků je spojena s vyšší hustotou sestav. Mikrofabrikace rovněž dovoluje fyzikální sestavv, jak to dosud nedovolovalo použití skleněných vláken a napojuje kanálky přímo na další přístrojové části. Bylo konstruo váno několik málo zařízení použitím mikročásteček pro technologii dělení. Plynový chromatograf, viz Terry a spol., IEEE Trans. Electron Device, ED-26, 1880 (1979) a kapalinový chromatograf, viz Hanz a spol., Sens.Actuators Bl:249 (1990) byly vyrobeny na silikonových částečkách, ale tato zařízení se nepříliš používají. Několik skupin publikovalo výsledky dělení za použití fluoreskujících barviv a aminokyselin na mikrovyrobených zařízeních, viz Manz a spol., J.Chromatography 593 . 253 (1992), Bffenhauser a spol., Anal.Chrm. 65, 2637 (1993). V poslední době Woolley a Idathies, Proč.Hati.Acad.Sci. 91, 11348 (1994) poukázali na to, že lze použít fotolithografie a chemického leptání prdí dosažení velkého počtu dělících kanálků na skleněném podkladu. Kanálky se naplní dělícími matricemi z hydroxyethylcelulosy (HEC). Bylo zjištěno, že restrikční fragmenty DNA lze oddělit v tak krátké době, jako jsou 2 minuty

D. Štěpení značených složek

Jak to již bylo popsáno výše,, různá provedení vaz ebných složek jsou charakterizována štěpitelností (labilitou”) za různých specifických fyzikálních nebo chemických podmínkách.

Jako příklady podmínek, jichž lze použít pro štěpení různých provedení vazebných složek lze uvést kyseliny, zásady, oxidaci, redukci, fluoridy, záměnu thiolů, fotolyzu a enzymové podmínky.

Příklady odštěpitelných vazebných složek, které vyhovují při výše uvedených podmínkách pro vazebné složky, jak jsou definovány zde již dříve, jsou odborníkům dobře známé a zahrnují ty, které lze nalézt v katalogu firmy Pierce (Rockford, IL. Příklady zahrnují:

• · • - · 1

-1£6ethylenglykol-bis-(sukcinimidylsukcinát) (EGS), aminické reaktivní zesítující činidlo, štěpitelné hydroxylaminem,

M, 37° G, 3 až 6 hodin, disukcinimidyl-vínan (DST) a sulfo-DST, aminické reaktivní činidlo, zesítující, odštčpitelné půbobením 0,015 M roztoku jodistanu sodného, * ·* bis-[2-( sukcinimidy loxy kar bony loxy)-ethyl| -sulfon (BSOCOES) a sulfo-BSOCOES, což jsou aminická reaktivní činidla, zesítující, odštčpitelné v alkalickém prostředí, pH 11,6,

1,4—di-[3'-(2'-pyridyldithiopropionaraido)}-butan (DEDPBft, pyridyldithiolové zesítující činidlo, štěpitelné thiolovou. výměnou nebo redukčně, * z z

N-14—(p-azidosalicylamidcO-butylJ-3 -(2 -pyridyldithio)propionamid (APDP, pyridyldithiolový zesítovač, štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukčně, bis-^-4- (azidosalicylamido)-ethylj -disulfid, fotoreaktivní zesítovač, štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukčně, N-sukcinimidyl-(4-azidofenyl)-l,3'-dithiopropionát (SADP) fotoreaktivní zesítovač, štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukčně, sulf osuke i nimidy1-2 -(7-a zido-4-met hy1kumari n-3-acetamido)-ethyl-l,3 '-dithiopropionát (SAED), fotoreaktivní zesítovač, štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukčně, sulfosukcinimidyl-2-(m -azido-o-nitrobenzamido)-ethyl1,3^z-dithiopropionát (SAKD), fotoreaktivní zesítovač, štěpitelný thiolovou výměnou nebo redukčně.

Dalším př.íklad.y_od@těpitelných va zebných složek a podmínky jejich odštěpení, jak je lze využít k odštěpení značených složek, jsou tyto. Silylovou vazebnou skupinu lze štěpit fluorem nebo v kyselém prostředí. 3-, 4-, 5- nebo 6-Substituovaná

2-nitrobenzyloxylová skupina nebo 2-, 3-, 5- nebo 6-substituovaná 4-nitrobenzyloxyskupina jako vazebná složka se dá štěpit fotonovým zdrojem (fotolyza). 3-, 4-, 5- nebo 6-Substituovaná

2-akoxyfenoxylová skupina, nebo 2-, 3, 5- či 6-substituovaná • · ··· · • · ·· «

-1074-alkoxyfenoxylová skupina se dá jako vazebná odštěpit oxidačně působením dusičnanu ceričitoamonného vzorce CeCKIí^Jg (NO3) Urethanová zesítující skupina vzorce -ITCOO- se dá štěpit působením zásady, kyseliny nebo hydridem hlinitolithným, tedy redukčně. Jakákolíp-pentenylová, 2-butehylová nebo 1-butenylová vazebná složka se dá odštěpit ozonem, směsí oxidu osmičelého a jodistanových aniontů nebo manganistanem draselným, tedy oxidačně 2-fo-, 4-, nebo 5-substituovaná-furyl)-oxyskupina se dá jako vazebná štěpit působením kyslíku, bromu, methanolu či kyselinou.

Podmínky odštěpení dalších jiných labilných vazebných skupin zahrnují: t-alkyloxyskupina jako vazebná složka se dá štěpit kyselinou, methyl(dialkyl)methoxylová nebo 4-substituovaná

2- alky1-1,3-dioxolan-2-ylová vazebná skupina se dá šzěpit ionty H^0⁺, 2-silyloxy-vazebná skupina je štěpitelná fluorem nebo kyselinou, vazebné skupiny typů 2-(X)-ethoxy, kde X znamená ketoskupinu, skupinu esterovou, amidovou, kyanovou, nitroskupinu, skupinu sulfidickou, sulfoxidovou nebo Sulfonovou se dají odštěpit v alkalickém prostředí,2-, 3-, 4-, 5- nebo 6-substituované benzyloxy-vazebné skupiny se mohou štěpit působením kyselin nebo za redukčních podmínek, 2-butenyloxy-vazebné skupiny se dají štěpit působením působením sloučeniny vzorce )^Pj^RhCl(H)

3- , 4-, 5- nebo 6-substituované 2-bromfenoxy-vazebné skupiny lze štěpit lithiem, hořčíkem nebo butyllithiem, methylthiomethoxylové vazebné skupiny se mohou štěpit kationty dvojmocné rtuti, vazebné skupiny typu 2-(X)-ethoxy-, kde X znamená halogen, lze štěpit zinkem nebo hořčíkem, 2-hydroxyethyloxylové vazebné skupiny se dají štěpit oxidačně, například použitím octanu oloviěitého.

Za výhodné vazebné skupiny lze pokládat ty, které se dají štěpit kyselinou nebo fotolyzou. Některé vazebné skupiny, labilní v kyselém prostředí, byly připraveny pro peptidové syntézy na pevné fázi a dají se použít pro vazbu značené složky na MOI.

··· · a • · « ·· ··

-108některé z vazebných skupin jsou nověji popsány v přehledném článku Llloyd-Williams-e a spol., Tetrahedron 49, 1106511133 (1993). Jeden použitelný tyk je založen na p-alkoxybenzylalkoholech, z nich dva jsou dostupné od Advanced Chem.Tech. (Louisville, KY), totiž 4-hydroxymethylfenoxyoctová kyselina a 4-(4-hydroxymethy1-2-methoxyfenoxy)-máselná kyselina. Obě vazebné skupiny se napojí na značenou složku použitím esterové vazby na benzylalkohol a na MOI s obsahem aminoskupiny amidovou vazbou karboxylové kyseliny. Značené složky těchto molekul lze uvolnit z vazby na MOI použitím kyseliny trifluoroctové o různých koncentracích. Štěpení těchto vazebných složek se projeví uvolněním karboxylové skupina na značené složce. Štěpení značených složek, navázaných podobnými vazebnými složkami, jako je '2,4-dimethoxy-4 ^z-(karboxymethyloxy)-benzhydrylamin se projeví uvolněním kar boxylamidu na takto uvolněné značené složce. Zmíněná látka je dostupná od Advanced Chem.Tech. jako PMOC-chráněná forma.

Potolabilní vazehné složky, použitelné pro toto aplikování, byly z největší míry vyvinuty pro peptidovou syntézu na pevné fázi (viz přehled Lloyd-V/illiams). Takové vazebné složky jsou obvykle založeny na 2-nitrobenzylesterech nebo 2_nitrobenzylgmidech. Dva příklady fotolabilních vazebných slořek, které byly uvedeny v poslední době v literatuře, jsou: 4-J_4-(l-Pmoc-amino)-ethylj5-2methoxy-5-nitrofenoxybutanová kyselina, Holmes a Jones, J.Org. Chem. 60, 2318-2319 (1993) a 3-(Fmoc-amino)-3-(2-nitrofenyl)propionová kyselina, Brown a spol., Molecular Diversity 1, 4-12 (1295). Obě vazebné, složky mohou být navázány pomocí karboxylové skupinyÝa amin^na molekule MOI. Napojení značené části na vazebnou vložku se provede formou amidu mezi karboxylovou skupinou na značené složce a aminoskupinou na vazebné vložce.

v

Štěpení fotolabilních vazebných složek se obvykle provede ultrafialovým světlem vlnové délky 350 nm za intensit a dob, které jsou odborníkům jasné. Jako příklady obchodně dostupných přístrojů pro fotochemické štěpení lze uvést Aura Industries Inc.(Staten Island, NY) a Agrenetics (Wilmington, MA). Štěpení

- ·· »· ·· ·· i *····* ^; *·*·’’ : .. .. .. ··:·.· : ·· ·· ·· ··

-109vazebné složky se projeví uvolněním primární amidoskupiny na značené složce. Jako příklady fotoštěpitelných vazebných složek je možno uvést nitrofenylestery glycinu, exo- a endo2-benzonorborneylchloridy a methansulíonáty, dále 3-amino-3(2_Tnitrofenyl)-propionovou kyselinu. Příklady enzymového štěpení zahrnují esterasy, štěpící esterovou vazbu, nukleasy, které štěpí fosfodiesterovou vazbu a proteasy, štěpísí peptidové vazby atd.

E. Detekce značených složek

Detekční postupy se typicky zakládají na absorpci a emisi v určité oblasti spektra. Pokud atomy nebo molekuly absorbují světlo, pak jejich vstupní energie excituje kvantovanou strukturu na vyšší energetickou hladinu. Typ excitace je závislý na vlnové délce světal. Elektrony jsou posunovány na vyšší orbitaly ultrafialovým nebo viditelným světlem,, molekulární vibrace infračerveným soektrem a rotace jsou buzeny mikrovlnami. -Absorpční spektrum je absorpcí světla ve funkci vlnové délky. Spektrum atomu nebo molekuly závisí na energetické hladině struktury. Absorpční spektra jsou vhodná pro identifikování sloučenin. Specifické absorpční spektroskopické postupy zahrnují atomovou absorpční spektroskopii (AA), infračervenou spektroskopii (IR) a ultrafialovou spektroskopii (UV-vms).

Atomy nebo molekuly, které byly excitovány na vyšší energetické hladiny, mohou klesnout na nižší hladinu emisní radiací. Tato emise světla je označována jako fluorescence, má-li transipise mezi oběma stavy týž spin, nebo fosforescence, dojde-li k přechodu mezi stavy s různým spinem. Emisní intenzita analyzované látky je lineárně úměrná koncentraci (za nízkých koncentrací) a dá se použít pro kvantifikování emitujícího zdroje Specifické emisní spektroskopické postupy zahrnují atomovou emisní spektroskopii (ASS), atomovou fluorescenční spektroskopii (APS), molekulární, laserem indukovanou fluorescenci (LIP) a fluorescenci paprsky X (XRP).

Pokud elektromagnetické záření prochází nějakou látkou, pak větší podíl z největší míry prochází původním směrem, ale malý podíl se rozptýlí do dalších směrů. Světlo, jež se rozptýlí e · o o • ·

-110za stejné vlnové délky, jako světlo příchozí se nazývá Rayleighovým rozptylem. Světlo, jež se rozptýlí průhlednou pevnou látkou v důsledku vibrací (fonony) se nazývá Bríllouin-ovým rozptylem. Toto je typicky posunuto o 0,1 až 1 vlnových čísel ve srovnání s dopadajícím světlem. Světlo se rozptyluje v důsledku vibrací v molekulách nebo nebo v opakních pevných podílesa optický mi fonony a to je označováno jako Ramanovo světlo. Ramanovo rozptýlené světlo je posun až i o 4000 vlnových čísel ve srovnání s dopadajícím světlem. Specifické rozptylové spektroskopické postupy zahrnují tedy Raman-ovu spektroskopii.

Infračervená spektroskopie je měřením vlnové délky a intenzity absorpce středního infračerveného světla vzorkem.Střední infračervené světlo (2,5 až 50 pm, 4000 - 200cm ¹) je energeticky dostačující k tomu, aby excitovalo molekulární vibrace na vyšší energetické hladiny. Vlnové délky infračervených absorpčních pásů jsou charakteristikou specifických typů chemických vazeb a infračervená spektroskopie se obecně nejvíce používá k identifikování organických a organometalických molekul.

Blízká infračervená absorpční spektroskopie (NIR) je měřením vlnové délky a intenzity absorpce blízkého infračerveného světla vzorkem. Spadá do rozsahu 800 nm-2,5 pm (12.500 až 4000 cm’¹) a energeticky dostačuje k. excitování vyšších hladin a pro kombinace molekulárních vibrací na vyšší energetické hladiny. NIR spektroskopie se typicky používá pro kvantitativní zjištování organických funkčních skupin, zvláště hydroxylových, N-H skupin a skupin kar bonylových. Složky a označení NIR instrumentace se podobá UV-vis absorpčním spektrometrům. Zdrojem světla je obvykle wolframová lampa a detektorem obvykle detektor s pevným sirníkem olovnatým. Držáky vzorku mohou být skleněné nebo z křemene, typickými rozpouštědly jsou chlorid uhličitý a sírouhlík. Běžné přístroje pro NIRspektroskopii umožňují současné monitorování a kontrolu postupu.

Ultrafialová_Sp_ektroskopie a absorpční spektroskopie ve viditelné části spektra (UV-vis) je měřením vlnové délky a inten• o • · »· · • · · *·· *

-111<» · ·· • · · · • · ·· • · · · • · · * ·« ♦· ► · ·· · · žity absorpce vzorkem v blízké ultrafialové oblasti a ve viditelné části světla. K absorpci ve vakuu UV dochází při 100 až 200 nm;(10^ - 50 000 cnT^) UV (křemen) při 200 až 35B nm; (50 000 až 28 570 cm*^) a viditelné světlo při 350 až 800 cm;

(28 570 až 12 500 cm”\ to za označení Beer-Lambert-Bouguet-ův zákon. Ultrafialové a viditelné světlo je energeticky dostačující k tomu, aby posunulo vnější elektrony na vyšší energetické hladiny. UV-vis-spektroskopie se může obvykle použít ve spojitosti s molekulami a anorganickými ionty či komplexy v roztoku. UV-vis spektra jsou omezena širokými rysy spektra. Zdrojem světla je obvykle vodíková nebo deuteriová lampa pro ultrafialové záření a v/olframová lampa pro viditelné záření. Vlnové délky těchto kontinuálních zdrojů světla se zvolí separátorem vlnové v

délky, jako je hranol nebo stupňový monoohroma tor. Spektra, tató dosažená stupňováním separatorem vlnové délky a kvantitativní měření lze provést ze spektra nebo použitím jediné vlnové délky.

Hmotnostní spektrometry využívají rozdílu v poměru hmotnost/náboj (m/z) ionizovaných atomů či molekul k jejich vzájemnému oddělení. Hmotnostní spektrometrie je tedy vhodná pro kvantové zjištění atomů či molekul, jakož i pro zjištění chemického a strukturního složení molekul. Líoleguly mají rozdílné fragmentační sklony, což vede k strukturním informacím a k identifikování sloučenin. Obecný postup při práci s hmotnostním spektrometrem je tento: vytvoří se plynná fáze iontů, ionty se oddělí prostorově či časově na základě jejich poměru m/z a změří se množství iontů každého z poměrů m/z. Schopnost dělit ionty hmotnostním spektrometrem je dána rozlišením, definovaným jako R = m/ /m.

kde m znamená hmotnost iontu a ó m je rozdíl hmotnosti mezi dvěma rozlišitelnými píky v hmotnostním spektru. Tak například hmotnostní spektrometr s rozlišovací schopností 1000 can rozliší ion s hodnotou m/z 100,0 od iontu ε hodnotou rn/z 100,1.

Hmotnostní spektrometr (MS) sestává obecně z iontového zdroje, analyzátoru,rozlišujícího hmotnost a detektoru iontů. Magnetický sektor, quadrupol a zařízení pro dobu průletu vyžadují také optickou extrakci a akceleraci iontů, aby se totiž ionty dostaly ze zdroje iontů to hmotnostního analyzátoru. Podrobnosti některých .provedení hmotnostních analyzátorů(magnetický sektor

- «· ·» • · « · e ι a a a · » «· • · · _a í Z .**· · ··· · · • í a » · · ·'* · ·

00« > ·· ··

-112MS, auadrupol MS a doba průletu MS) jsou zde uvedeny dále. Jednoduchý zaostřovacá analyzátor pro magnetický sektor MS používá paprskovou dráhu částeček 180, 90 nebo 60 stupňů. Různá zařízení, ovlivňující částečky oddělených iontů Různými poměry hmotnost/náboj. V double-zaostřovacím analyzátoru je přidán elektrostatický analyzátor k oddělení částeček s různými kinetickými energiemi.

Quadrupolní hmotnostní filtr pro quadrupolní hmotnostní spektrometrii je tvořen čtyřmi kovovými tyčinkami, uspořádanými v

paralelně. Použité voltové napětí ovlivňuje přenos iontů, pohybujících se dolů paprskem světla mezi čtyřmi tyčinkami. Při určitém voltovém napětí DG a AC pouze ionty s určitým poměrem hmotnost/náboj projdou quadrupolním filtrem a všechny ostatní vybočí z jejich původního směru. Hmotnostní ppektrum se získá monitorováním iontů, procházejích quadrupolním filtrem, jak se mění voltové napětí na tyčinkách.

Hmotnostní spektrometry typu doba průletu využívají rozdílů v době průletu driftovou oblastí k oddělení iontů s lišícími se hmotnostmi. Pracuje pulzujícím- způsobem, takže ionty se ©usí tvořit pulsy a/nebo extrahovat v pulsech. Pulsované elektrické pole urychluje všechny ionty do driftové oblasti bez elektrického pole s kinetickou energií qV, kde q znamená náboj iontu a V je použité voltové napětí. Protože kinetická energie iontů = 0,5 mV , ©ají lehčí ionty vyšší rychlost než těžší ionty a dosahují do pásma detektoru na konci driftového pásma rychleji. Vývod z iontového detektoru se přenese na osciloskop ve funkci času za vzniku hmotnostního spektra.

Způsob tvorby iontů je výchozím bodem pro analýzu hmotnostní spektrometrií. Chemická ionizace je způsob, který používá reagující ion pro reakci s molekulou analyzované látky (v tomto případě značené složky) za vzniku iontů bud transferem protonu nebo hydridu. Reagující ionty se vytvoří zavedením velkého nadbytku methanu (ve vztahu k značené složce) do elektronového zdroje dopadu na ionty (BI). Srážka s elektrony se projeví vznikem

CH a OH^, které dále reagují s methanem za vzniku CH^ a ^G2^H5

Dalším postupem pro ionizování značených složek plazma a doutnavý výboj. Plazmou je horký, částečně ionizovaný plyn, « β β β který účinně excituje a ionizuje atomy. Doutnavý výboj je nízkotlaková plazma, udržovaná mezi dvěma elektrodami. Elektronová impaktní ionizace používá elektronový paprsek, zpravidla generovaný vláknem wolframu, k ionizování atomů či molekul doutnavého výboje. Elektron z paprsku narazí na elektron analyzovaných atomů či molekul za vzniku iontů. Ionizování elektrosprejem využívá velmi jemné jehličky nebo serie stěračů. Roztok vzorku se vstřikuje do komůrky zdroje za vzniku kapiček, ty nesou náboj, když opouštějí kapiláru a jak se rozpouštědlo odpaří, kapičky zmizí, zanechávajíce vysoce nabité molekuly analyzované látky. ESI se zvláště hodí pro velké biologické molekuly, které lze nesnadno změnit na páru nebo ionizovat. Bombardování rychlými atomy (FAB) využívá paprsek neutrálních atomů o vysoké energii, typicky xenonu nebo argonu, který narazí do pevného vzorku za vzniku a průběhu desorpce a ionizování. Postup se používá pro velké biologické molekuly, které lze nesnadno převést do plynné fáze. FAB způsobí malou fragmentaci a obvykle vznikne velký molekulární iontový pík, použi^lný pro stanovení hmotnosti molekuly. Atomový paprv sek vznikne akcelerováním iontů ze zdroje iontů buňkou pro výměnu náboje. Ionty pohltí elektron při srážce s neutrálními atomy za vzniku paprsku atomů o vysoké energii, Laser-ová ionizace (LIMS) je způsob, kdy dopadem laseru se oddělí materiál z povrchu vzorku za vzniku mikroplazmy, jež ionizuje některou z dalších složek. Laserová desorpční ionizace za podpory matrice (LIALDIjí. je variací laserové ionizace při zplynování a ionizování velkých biologických molekul, jako jsou proteiny nebo fragmenty DNA. Biologické molekuly se dispergují v pevné matrici,’ jako je kyselina nikotinová. Ultrafialový l_Qser odloupne matrici, jež unáší některou z velkých molekul, přenese ji do plynné fáze v ionizovaném stavu, takže se může dostat do hmotnostního spektrometru. Plazmadesorpční ionizování (PD) využívá rozpad Gf, kdy vznikají dva štěpné fragmenty, pohybující se v opačných směrech. Jeden fragment narazí do vzorku a vyrazí odtud 1 až 10 analyzovatelných • · · ·

-114iontů. Druhý fragment narazí na detektor a zahájí začátek snímání dat. Tento ionizační postup je zvláště vhodný pro velké biologické molekuly. ResonanČní ionizace (RIMS) je pootup, _se j_e(j_en více laser-ových paprsků vyladí do resonance k transmisi atomů či molekul v plynné fázi, aby ji posunul postupně nad odpovídající ionizační potenciál za vzniku iontu. Sekundární ionizace (SIMS) využívá paprsek iontu, jako je některý z ^Re⁺, ^0⁺, nebo ^θΑτ⁺, ten se zaměří na povrch vzorku a rozpráší materiál do plynné fáze. Jiskřící zdroj je způsob, jímž se ionizuje analyzovaná látka v pevných vzorcích pulsováním elektrického proudu mezi dvěma elektrodami.

Značená složka může být nabita před, během nebo po štěpení od molekuly, na kterou byla připojena. Ionizační postupy založené na iontové desorpci”, přímá tvorba nebo emise iontů z pevných či kapalných povrchů umožnily zvýšenou aplikovatelnost na netěkavé a tepelně labilní sloučeniny. Tyto postupy eliminují nutnost neutrálních molekul zplynit se před ionizováním a obecně minimalizují tepelnou degradaci těchto molekulárních typů. Do těchto postupů patří desorpce pole, viz Bečky, Principles of Pield Ionization and Pield Desorption Mass Spectrometry, Pergamon, Oxford, 1977, plazmová desorpce, viz Sundqvist a Mac Parlane, Mass Spectrom.Rev. 4.» 421 (1985), laserová desorpce, viz Karas a Hillenkamp, Anal.Chem. 60, 2299 (1988), dále Karas a spol., Angew.Chem. 101, 805,(1989), bombardování rychlými částečkami, bapř. rychlé atomové bombardování, PAB a sekundární iontová hmotnostní spektrometrie, SIMS, viz Barber a spol., Anal.Chem. 54, 645A (1982), termosprejová ionizace, viz Vestal, Mass Spectrom.Rev. 2, 447 (1983). Termosprej se často používá při současné kombinaci s kapalinovou chromatografií. Kontinuální průtokové PAB postupy, viz Caprioli a spol., Anal.

Chem. 58, 2949 (1986) mají rovněž významnou důležitost. Dokonalejší vyjmenování kombinací ionizování a hmotnostní spektrometrie uvádí:

·· · • ·

-115hmotnostní spektrometrii se zachycení'^v$ontů, elektronově-sprejovou hmotnostní spektrometrii, iontově-sprejovou hmotnostní spektrometrii, kapalinově ionizační hmotnostní spektrometrii, ionizační hmotnostní spektrometrii za norm.tlaku, elektronověionizační hmotnostní spektrometrii, metastabilními atomy bombardovací ionizační hmotnostní spektrometrii, rychlými atomy bombardi začni ionizační hmotnostní spektrometrii, MALDI hmotnostní spektrometrii, foto-Ionizační průletovou hmotnostní spektrometrii, laserovou kapičkovou hmotnostní spektrometrii, MALDI-TOF hmotnostní spektrometrii, APGI hmotnostní spektrometrii, nanosprejovou hmotnostní spektrometrii, párově-sprejovou ionizační hmotnostní spektrometrii, chemiky ionizační hmotnostní spektrometrii, resonančně ionizační hmotnostní spektrometrii, sekundárně ionizační hmotnostní spektrometrii, termospréjovou hmotnostní spektrometrii.

Ionizační postupy, pokud se použijí na netěkavé biologické látky, mají omezené rozsahy použitelnosti. Ionizační provedení je vysoce závislé na komposicích matrice a typu látek. Z běžně dostupných výsledků plyne, že horní mezí molekulární hmotnosti pro TS je asi 8000 daltonů, viz Jones a Krolik, Rapid Gomm.Nass. Spectrom. 1, 67 (1987). Protože TS se prakticky provádí jen s quadrupolními hmotnostními spektrometry, citlivost velmi trpí neúměrně za vyšších poměrů m/z, tedy hmotnost k náboji. Průletové hmotnostní spektrometry (TOF) jsou komerčně dostupné a mají výhodu v tom směru, že rozmezí m/z je omezeno jen výkonností detektoru. Nověji byly popsány dva nové způsoby ionizačních postupů. Tytp dva způsoby jsou nyní označovány jako laser-ová desorpce za pomoci matrice (MALDI), viz Karas a Hillenkamp, Anal.Chem. 60.

2299 (1988), Karas a spol., Angenv.Chem. 101, 805 (1989) a elektrosprejové ionizování (ESI). Oba postupy se vyznačují velmi vysokou ionizační účinností, tj. velmi vysokým poměrem produkce molekulárních iontů/spotřeba molekul. Citlivost, což je konečný výsledek technického postupu, je závislá na velikosti vzorku, množství iontů, průtokové rychlosti, účinnosti detekce a účinnosti aktuální ionizace.

» ·

-116

Elektrosprejová hmotnostní spektrometrie se zakládá na myšlénce, kterou vyslovil v šedesátých letech Dole a spol., J.Chem.Phys. 49. 2240 (1968). Elektrosprejová ionizace (ESI) jest jednou možností, pak dospět k nabitým molekulám pro analýzu hmotnostní spektrometrií. V krátkosti: elektrosprejová ionizace vede ke vzniku vysoce nabitých částeček zmlžením kapalin v silném elektrostatickém poli. Vysoce nabité částečky, vytvořené zpravidla v toku suchého plynu za norm.tlaku, se smrsknou odpařením neutrálního rozpouštědla, až náboj odpuzováním překoná kohezivní síly, což vede k kulombické explozi. Přesný mechanizmus ionizování ýe kontroverzní a, hypotézy v tomto směru vyslovilo několik skupin, viz Blades a spol., Anal.Chem. 63. 2109-14 (1991), Kebarle a spol., Anal.Chem.

65, A972-86 (1993), Eenn, J.Amer.Soc.Mass Spectrom. 4, 524-35 (1993). Bez zřetele na vlastní způsob tvorby iontů, ESI vede k nabitým mokelulám z roztoku za mírných podmínek.

Možnost získat použitelné údaje hmotností spektrometrií malých množství organických molekul se zakládá na dostatečně účinné produkci iontů. Účinnost ionizování pomocí ESI se vztahuje k míře pozitivních nábojů, spojených s molekulou. Experimentální zvýšení ionizování se obvykle spojuje s použitím podmínek kyselého prostředí. Jinou možností, jak zlepšit ionizování bylo použití kvartérnizovaných aminů, je-li to ovsem možno, viz Aebersold a spol., Protein Science 1, 494-503 (1992), Smith a spol., Anal.Chem. 60, 436-41 (1988).

Elektrosprejové ionizování se podrobněji popisuje takto. Vznik iontů elektrosprejováním vyžaduje dva stupně: dispergování vysoce nabitých částeček v blízkosti norm.klaku s následným vytvořením podmínek, indikujících odpaření. Roztok analyzovaných molekul se vede jehlou, udržovanou za velmi vysokého elektr. potenciálu. Na konci jehly se roztok disperguje jako mlha malých, vysoce nabitých částeček,. obsahujících molekuly analyzované látky. Dojde k rychlému odpaření malých kapiček a postupem desorpce pole nebo konečným odpařením se uvolní protonované proteinové molekuly do plynné fáze.Elektrosprej obvykle vyža-117• · • ·

duje použití vysokého elektrického pole na malý průtok kapaliny, obecně 1-10 uL/min z kapilární trubičky. Potenciální rozdíl 3-6 kV se obvykle využije mezi kapilárou a protielektrodou, umístěnou v odstupu 0,2 až 2 cm (kde ionty, nabité shluky a i nabité částečky, v závislosti na míře vymizení rozpouštědla, se mohou testovat jako vzorky hmotnostní spektrometrií malým otvůrkem. Výsledkem elektrického pole je akumulace náboje na povrchu kapaliny na konci kapiláry; takže průtoková rychlost kapaliny, rezistivita a povrchové napětí jsou důležitými faktory při tvorbě kapiček. Výsledkem vysokého elektrického pole je rozrušení povrchu kapaliny a tvorba vysoce nabitých kapiček. Může dojít ke vzniku kladně nebo záporně nabitých Ěapiček v závislosti na předpětí kapiláry. Vytvoření negativně nabitých iontů vyžaduje přítomnost elektronových skavengerů, jako je kyslík ke znemožnění elektrického vybití.

Elektrostaticky lze sprejovat do vakua velké množství různých kapalin, případně za pomoci zmlžujícího činidla.

Použití pouhého elektrického pole pro zmizení je spojeno s určitými omezeními ve spojitosti s vodivostí kapaliny a di—5 elektrickou konstantou.Vodivost roztoku pod asi 10 ohmů je nutná za teploty místnosti pro stabilní elektrosprej za použitelných průtokových rychlostí, odpovídajících vodnému roztoku elektrolytu pod 10 M. Při provedení postupu, nejužitečnějšího pro BSI-MS se projeví průtoková rychlost kapaliny dispergováním kapaliny ve formě jemné mlhy. Krátká vzdálenost odkapiláry k průměru kapiček je často takřka jednotná a řádóvě kolem 1 pm. Zvláště důležité je to, že celkový elektrosprejový montový proud se zvýší jen nepatrně při vyšších průtokových rychlostech kapaliny. Jsou zde podklady pro tvrzení, že zahřívání je vhodné pro elektrosprejové manipulování. Tak například mírné zahřátí vodného roztoku vede k snazžímu elektrosprejování, pravděpodobně v důsledku snížení viskozity a povrchového napětí. Pomoc jak z hlediska teploty, tok i zmlžení plynem dovoluje elektrosprejování provádět za vyšších průtokových rychlostí, a_ýLe za poklesu rozsahu nabití částeček. Tvorba molekulárních • 9 ··

I 9 9 ’

-118- .:.

·· · · < • · * 4 4 iontů vyžaduje podmínky, za nichž dojde k odpaření původní populace kapiček. Toho lze docílit za vyšších tlaků proudem suchého plynu za mírných teplot, řádově pod 60° C, zahříváním během převodu kapaliny stykovou plochou a - zvláště pak v případě postupů, zachycujících jonty - energetickými srážkami za poměrně nízkého tlaku.

Ačkoliv podrobnosti postupů, spadajících do rozsahu ESI zůstávají neurčité, pak velmi malé kapičky, vzniklé při ESI se zdají dovolovat u všech možností přenos čistého náboje v roztoku na plynnou fázi po odpaření zbývajícího rozpouštědla. Hmotnostní spektrometrické detegování potom vyžaduje, aby ionty měly únosné rozmezí m/z (tedy pod 4000 daltónů pro quadrupolní zařízení) po zbavení se rozpouštědla, jakož i aby vznikaly a byly přenášeny s dostatečnou účinností. Velký počet rozpustných látek, u nichž byla zjištěna možnost použití při ESI-MS, postrádání zásadní závislosti účinnosti ionizování na molekulové hmotnosti vede k názoru, že jde o velmi hodnotný a široce aplikovatelný ionizační postup.

Funkce elektrosprejového iontového zdroje v blízkosti norm. tlaku: zdrojem je obvykle kovová nabo skleněná kapilára, zahrnující způsob elektrického předpětí kapalného roztoku vztažmo k protielektrodě. Roztoky, obvykle za použití směsi vody a methanolu, obsahující analyzovanou látku a často další přísady, jako je kyselina octová, proudí z koncovky kapiláry. Byl popsánu zdroj ESI, viz Smith a spol., Anal.Qhem. 62, 885 (1990), kterým lze uzpůsobit v podstatě jakýkoli kapalinový systém. Typická průtoková rychlost pro ESI je 1 až 10 ul/min. Zásadním požadavkem stykové plochy ESI-MS je shromáždit a přenést ionty z oblasti vysokého tlaku do oblasti MS tak účinně, jak je to jen možno.

Účinnost ESI může být velmi vysoká, což je podkladem pro mimořádně citlivá měření, což je právě vhodné pro zde popisovaný vynález. Přístrojový výkon z hlediska proudu může vyústit v celkovém proudu iontů u detektoru asi 2 x 10 A nebo 10 pulsů/s pro jednoduše nabité druhy. Ka podkladě výkonu přístroje vedou koncentrace tak nízké, jako je 10 nebo asi 10 mol/s jed-

-119Mezivrstva má také schopnost shromáždit fragmenty LNA, jak se eluují ode dna gelu* Gelem může být tabulka gelu, trubička gelu, kapilára atd. Fragmenty DNA se mohou jímat několika způsoby.Prvým je použití elektrického pole, kdy se jímají fragmenty DNA na elektrodě nebo v její blízkosti. Druhou možností je provedení, kdy se fragmenty DNA jímají tak,že se vede proud plynu u dna gelu. Předpoklady obou dvou postupů lze kombinovat, jíma^í-li se fragmenty DNA proudem plynu, který se potom může zhustit použitím elektrického pole. Konečným výsledkem je to, že se fragmenty DNA vyjmou z prostředí, ve kterém došlo k jejich oddělení. Takže fragmenty DNA mohou být uneseny” z roztoku jednoho typu do jiného použitím elektrického pole.

Pokud jsou již fragmenty DNA v odpovídajícím roztoku (kompatibilním s elektropprejem a hmotnostní spektrometrií), lze odštěpit z fragmentu DNA značenou složku. Fragment DNA (nebo jeho zbytky) se mohou oddělit od značené složky použitím elektrického pole, s výhodou, raá-li značená složka opačný náboj ve srovnání s kombinací DNA-značená složka. Značená složka se potom dostane do elektrosprejového zařízení použitím elektrického pole nebo proudu kapaliny.

Fluoreskující značené složky lze identifikovat a kvantitativně vyhodnotit ponejvíce přímo dle absorpčních a fluorescenčních emisí vlnových délek a intenzit.

Zatím co běžný spektrofluorometr je mimořádně pružný a poskytuje kontinuální rozsah excitačních a emisních vlnových délek (1θ_χ, lgp ^_s2 ), specialisovanější přístroje, jako 'v* je průtokový cytometr a stupňové laser-ové mikroskopy vyžadují vzorky, excitovatelné za jediné pevné vlnové délky.

U současných přístrojů jde o 488-nm linii argonového laseru.

Fluorescenční intenzita na vzorek molekuly je úměrná produkt z a QY. Rozsah těchto parametrů mezi fluorofory současně praktické důležitosti činí asi 10 000 až 100 000 pro a 0,1 až 1,0 pro QY.

• · · · · · · • ·* · · ·· • · · · ·· · · ·

-12 0Pokud se absorpce položí proti nasycení použitím iluminací o vysokých intenzitách, pak ireverzibilní destrukce excitovaného fluoroforu (foto-blednutí) se stane faktorem, omezujícím možnost důkazu a stanovení pomocí fluorescence. Praktický dopad foto-blednutí závisí na postupu techniky fluorescenční detekce.

Je jasné, že určité opatření (mezipovrch) lze vřadit mezi stupně dělení a detekce k umožnění kontinuálních postupů a dělení velikosti a důkazu značené složky (v konkrétní době).

To spojuje mttody dělení a instrumentační s metodami detekce a instrumentačními do jediného opaření. Tak například mezivrstva se vloží mezi postup dělení a detekce hmotnostní spektrometrií nebo potenciostatickou amperometrií.

Funkcí mezivrstvy je v prvé řade uvolnění (např.hmotnostní spektrometrií) značené složky z analyzovaného podílu, Je zde několik příkladných sežizení mezivrstvy. Ráz mezivrstvy’ je závislý na volbě štěpitelných vazebných složekY případě vazebných složek, štěpitelných světlem nafo fotoštěpitelných je nurná energie nebo zdroj fotonů. V případě vazebných složek, labilních v kyselém prostředí, v alkalickém prostředí nebo disulfidickýcli je nutné přidání vhodného činidla do mezi. vrstvy. V případě vezebných složek, labilních za tepla, je nutný tepelný zdroj. Přidání enzymů je nutné pro vazebné složky, ciťli·»vé na enzymy, jako je tomu u specifických proteasových a peptidových vazebných složek, nukleasových a DRA- či RRA-vazebných složek, glykosylasy, HRP nebo fosfatasy a vazebných složek, které nejsáu stálé po provedeném štěpení (například podobné chemiluminiscenčním substrátům). Další charakteristiky mezivrstev zahrnují minimální rozšiřování pásu, oddělení DRA of značených složek přéd injikováním do hmotnostního spektrometru. Postupy dělení zahrnují ty, které se zakládají na elektroforetických metodách a technikách, afinitních postupech, retenci dle velikosti (dialyza), filtraci apod.

Také je možné koncentrovat značené složky (nebo sestavy nukleová kyselina-vazebná složka- značená složka), jímfXje

-121U

elektroforeticky a pak uvolnit do jiného reakčního toku, který je kompatibilní s příslušným typem zvoleného ionizačního postupu. Mezivrstva může být rovněž schopná zachytit značené složky (nebo sestavy nukleová kyselinarvaze-bhá složka-značená složka) na mikrokuličkách, s následným vstřelením kuliček do dalšího prostoru, kde dojde k laser-ové desorpci a odpaření, Také je možné extrahovat tok do jiného jbufru (například z pufru pro kapilární elektroforezu do hydrofobného pufru pomocí permeabilní membrány). Může být žádoucí v některých případech přepravit značené složky bezprostředně do hmotnostního spektrometru, což zahrnuje další funkci meziwstvy. A další funkcí mezivrstvy je přepravit značené složky z většího počtu kolonek do hmotnostního spektrometru s rotační dobou štěrbiny pro každou kolonku. Také lze přepravit značené složky s jediné kolonky do většího počtu hmotnostně-spektrálních detektorů, oddělit je časově, jímat každou sadu značených složek po několik milisekund s následnou přepravou do hmotnostního spektrometru.

Dále je výčet representativních prodejců pro technologie dělení a detekce k použití dle tohoto vynálezu:

ííoefer Scientific Instruments (San Prancisco, CA): elektroforezní zařízení; (Two Step ¹ , Poker Páce^-1·*'¹ II) pro sekvenční aplikace; Pharmacia Slotech (Piscataway, NJ), elektroforetická zařízení pro dělení a sekvencování DNA (PhastSystem pro PCR-SSCP analýzu, UacroPhor Sy&tem pro sekvencování DNA), Perkin Elmer/Applied Biosystems Division (ABI, Poster City, CA): semiautomatizovaná sekvenční zařízení na základě fluorescenčních barviv (ABI377);

Análytical Spectral Devices (Boulder, CO), UV-spektrometry;

Hitachi Instruments (Tokyo, Japonsko), atomové absorpční spektrometry, fluorescenční spektrometry, LC a GC hmotnostní spektrometry, NMR-spektrometry a UV-VIS spektrometry;. PerSeptive Bio. systems (Pramingham, MA), hmotnostní spektrometry (Voyager^-^ Blité) Bruker Instruments lne. (Llanning Park, MA), PTIR-spektrometry (Vector 22), PT-raman spektrometry, průtokové hmotnostní spektrometry (Reflex II '),Ion Trap Mass Spectrometer (Esquire ) a Maldi Mass Spectrometer; Analytical Technology lne. (ATI, Boston, MA) kapilárne-gélová elektroforezní zařízení, UV-detektory, detek• ·

-122tory a diodovým uspořádáním, Teledyne Electronic Technologies (LIountain View, CA): Ion Trap Mass Spectrometer (3 DO

ΤΙ^ι·^τ TM

Discovery ¹¹ a 3 DQ Apogee ’, Perkin Elmer/Applied Biosystems Division (Poster City, CA), Sciex Mass Spectrometer (tripple quadrupole LC/MS/MS, API 100/300), kompatibilní s elektrosprejem, Hewlett-Packard (Santa Clara, CA) :hmotnostní selektivní detektory (HP 5972A), MALDI-TOF Mass Spectrometers (HP G 2025A), Diodě Array Detectors , CE unites, HPLC units (HP 1090) jako UV-spektrometry; Finnigan Corporation (San Jose, CA): hmotnostní spektrometry (magnetický sektor MAT 95 S '), quadrupolní spektrometry (MAT 95 SQ ') a čtyři další podobné hmotnostní spektrometry; Rainin (Emeryville, CA), zařízení jbro vysokotlakovou kapalinovou chromatografií.

Postupy a kompozice zde popisované dovolují použití štěpiv telných značených složek k mapování vzorků speóifikovaného typu a k průkazu nukleotidové identity. Ka počátku každého sekvenčního postupu se zvolený primér označé specielním jednotným značením tou kterou složkou. Značené složky zmapují typ vzorku, typ didesoxy terminátoru (v případě Dsnger-ovy sekvenční reakce) nebo s výhodou typy oba. Specificky značená složka zmapuje primérní typ, jímž je dále zmapován vektorový typ a tím se zmapuje identita vzorku. Značená složka se může rovněž použít k mapování didesoxy terminátoru typu ddTTP, ddCTP, ddGTP, ddATP s odkazem do které didesoxynukleotidové reakce byla značená složka primeru umístěna. Provede se potom sekvenční reakce a vzniklé fragmenty se sekvenčně dělí dle velikosti v závislosti na času.

Značené složky se odštěpují z fragmentů v časovém rámci a rovněž v časovém rámci se měří a zaznamenávají. Sekvence se konstruuje srovnáním mapy značené'.?.?' složky s časovým rámcem. Znamená to, že totožnosti značené složky se zaznamenávají v době po nasazení a vzájemné vztahy k sobě se týkají rovněž časového rámce. Stupeň dělení dle velikosti oddělí fragmenty nukleové kyseliny o jeden nukleotidový přírůstek a proto identity takto odvozených značených částí se liší jedním nuklemtidovým inkrementem. Z předchozí znalosti dióesoxy-terminátoru anebo nukleotidové mapy a téhož tápu se lineárním způsobem snadno dedukuje sekvence.

·· ·«

444 4

9

4

-123·· ··. • · * ► · ·· » 4 4 ⁹ » 4 4 · ·· ··

Příklady provedení vynálezu

Další příklady jsou· připojeny pouze se zřetelem na objasnění, v žádném případě nemají charakter omezovači.

Pokud není uvedeno jinak, pak chemická činidla, použitá v příkladech, lze získat od Aldrich Chemical Company, Milwaukee,

WI. Použity tyly tyto dále uvedené zkratky:

ANP = kyselina 3-(Fmon-amino)-3-(2-nitrofenylpropionová,

NBA = kyselina 4-(Fmoc-aminomethyl-3-nitrobenzoová,

HATU = 0-7-azabenzotriazol-l-yl-N,N,N^z,N^z-tetramethyluroniumhexafluorfosfát,

DISA = diisopropylethylamin,

IvíCT = monochlortriazin,

ΝΜΪ7Ϊ = 4-me thyImorfolin,

NMP = N-methylpyrrolidon

ACT357 = syntézní látka ACT-357 peptidu, Advanced Chem.Tech.Inc.,

Louisville, KY,

ACT é Advanced Chem.Tech., Inc., Louisville, KY

NoyaBiochem = CalBiochem.NovaBiochem International, San Diego, CA TFA = kyselina trifluoroctové

Tfa = trifluoracetyl iNIP = kyselina N-methylisonipekotová

Tfp = tetrafluorfenyl

DIABA = 2-(diisopropylamino)-ethylamin

I.ÍCT % mono chlor tria zen

-AH-ODN = 5 ^z-aminohexyl na konci oligodesoxynukleotidu, oba podíly dohromady.

Příklady

Příklad 1 Příprava vazebných složek, labilních v kyselém prostředí k použití sekvenčních, štěpitelných složek, identifikujících mol.hmotnost

A. Syntéza pentafluorfenylesterů chemicky štěpitelných, hmotnostně-spektroskopických značených složek, to k uvolnění značených složek s karboxyamidovou koncovkou.

Reakční schéma: viz v^obr.l ·· 4 ··· ·

-12 ζμStupe η A .

V dimethylformamidu se suspenduje 1 ebp. pryskyřice TentaGel S AC (sloučenina II, dostupná od ACT) v nádobce pro peptidový syntetizátor(ACT357); po přidání 3 ekv.sloučeniny I a 7,5 ekv.DIEA v dimethylformamidu se nádobka se směsí látek potřepává hodinu. Po oddestilování rozpouštědla se pryskyřice promyje 2x pomocí ΙΠ.ΊΡ, 2x methanolem a 2x dimethylformamidem. Navázání sloučeniny I na pryskyřici a stupně promývání se opakují, čímž se získá látka III.

Stupeň B.

Pryskyřice (sloučenina III) se smíchá s 25% piperidinu v dimethylformamidu, a vše se protřepává 5 minut. Pryskyřice se odfiltruje, a po přidání 25% piperidinu v dimethylformamidu se potřepává 10 minut. Rozpouštědlo se oddestiluje, zbytek se promyje 2 x použitím NMP, 2 x methanolem a 2 x dimethylformamidem. Následuje další přímé použití ve stupni 0.

Stupen C

Krycích skupin zbavená pryskyřice ze stupně B se suspenduje v dimethylformamidu, a potom se přidá do reakční směsi aminokyselina, chráněná PMOC, obsahující aminovou funkci ve svém postranním řetězci (sloučenina IV, například -N-PMOC-3(3-pyridyl)-alanin (dostupný u Synthetech, Albany, OR, 3 ekv), HATU (3 ekv), a DIBA (7,5 ekv) v dimethylformamidu. Obsah nádobky se potřepává po dobu hodiny. Po oddestilování rozpouštědel se pryskyřice promyje použitím NMP (2x), methanolu (2x) a dimethylformamidu (2x). Navázání IV na pryskyřici a stupně promývání se opakují, až se získá sloučenina V.

Stupeň D

Pryskyřice je to popsáno ve krysích skupin, reakční nádobky (sloučenina V) se v reakci s piperidinem, jak stupni B, zbaví Fí.íOC-skupin. Pryskyřice, zbavená se rovnoměrně rozdělí působením ACT357 z původní do 16 reakčních nádobek.

Stupeň Ξ alikvotních částí pryskyřice, zbavené chránících skupin ze stupně D se suspenduje v dimethylformamidu. Do každé • · ··· ·

-125zbreakčních nádobek se přidá odpovídající vhodná karboxylová kyselina VI_n (R, _1f-COOH » 3 ekv), KATU (3 ekvivalenty), a DIEA (7,5¹^) v^ďrmethylformamidu, obsah nádobek se protřepává hodinu, rozpouštědlo se oddestiluje a alikvotní podíly pryskyřice se promyjí použitím NIvIP (2x), methanolu (2x) a dimethylformamidu (2x). Navázání sloučenin VI.^^ na alikvotní podíly pryskyřice a stupně promývání se opakují za vzniku sloučenin VII^_₁^.

Stupen F

Alikvatní podíly pryskyřice (sloučeniny VII^^) se vždy promyjí třikrát methylenchloridem. Do každé nádobky se přidá l/řní roztok kyseliny trifluoroctové a methylenchloridu, obsah se protřepává 30 minut, rozpouštědlo se potom vydestiluje z jednotlivých reakčních nádobek do individuálních trubiček. Alikvotní podíl pryskyřice se promyje vždy dvakrát methylendichlcridem a methanolem, filtráty se spojí do individuálních trubiček, obsah se vždy zahustí ve vakuu za vzniku sloučenin

Stupen G

Každá z těchto volných karboxylových kyselin se odděleně rozpustí v dimethylformamidu, do každého z roztoků se přidá 1,05 ekv.pyridinu a potom 1,1 ekv. pentafluorfenylesteru kyseliny trifluoroctové. Směsi se míchají 45 minut za teploty místnosti, roztoky se zředí přidáním ethylesteru kyseliny octové a po promytí třikrát za použití 1 M vodného roztoku kyseliny citrónové a třikrát 5/yním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a po vysušení bezvodým síranem sodným a filtraci se zahuštěním ve vakuu získají sloučeniny ^IXl-l6

B. Syntéza pentafluoresterů chemicky štěpitelných značených složek s přihlédnutím k hmotnostní spektroskopii k uvolnění značených složek s koncovkou karboxylové kyseliny

Reakční schéma, viz vyobr.2 • ·

-126Stupeň Δ

V prostředí chloroformu se zahřívá 2 hodiny do varu pod zpětným chladičem směs 1 ekv. kyseliny 4-(hydroxymethyl)fenoxymáselné (sloučenina I) a 2,1 ekv. diisopropyldiethylaminu (DIEA) a 2,1 ekv.allylbromidu. Směs se dále hředí efchylesterem kyseliny octové, r©ztok se promyje dvakrát 1 N roztokem kyseliny chlorovodíkové, dvakrát uhličitanovým pufrem (pH 9,5) a jednou solankou, načež se vysuší bezvodým síranem sodným. Zahuštěním ve vakuu se takto izoluje allylester sloučeniny I. Stupen B

V prostředí methylendichloridu se smísí 1,75 ekv. allylesteru sloučeniny I ze stupně Asi ekv. PMOC-chráněné amino/kyseliny s amino-funkcí v postranním řetězci, např. jako je

-N-íOMC-3-(3-pyridyl)-alanin (Syntetech, Albany, OR) a po přidání 2,5 ekv. N-methyImorfolinu a 1,1 ekv. 0-7-azabenzo±r ia zol-l-y 1-N, Ν,Ν ^z, N ^z-1 e tramě thylur o niumhexaf luor f osf átu se reakční směs míchá za teploty místnosti po 4 hodiny. Potom se zředí methylendichloridem, roztok se promyje dvakrát 1 M vodným roztokem kyseliny citrónové, jednou vodou a dvakrát 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vysuší se bezvodým síranem sodným a po filtraci se filtrát zahustí ve vakuu. Sloučenina III se izoluje bleskovou chromatografií CHgC.i^—ethylester kyseliny octové.

Stupeň C

Sloučenina III se rozpustí v methylendichloridu, přidá se 0,07 ekv. tetra-(trifenylfosfinyiy-palladia a 1 ekv. N-methylaňilinu, reakční směs se míchá 4 hodiny za teploty místnosti, fcředf se methylendichloridem, promyje 1 M vodným roztokem kyseliny citrónové a to dvakrát, potom jednou vodou, a po vysušení bezvodým síranem sodným §e filtrát zahustí ve vakuu. Sloučenina IV se izoluje bleskovou chromatografií Ch^Cl^—Ί ethylester kyseliny octové + kyselina octová

Stupeň D

V dimethylformamidu se suspenduje 1 ekv. pryskyřice TentaC-el ·· • 9 • · ·

99

9 ·

-127• · ····

99

9 9 ·

9 99

999 9 ·

9 9

99

AC (sloučenina V) v kolekční nádobce syntetizéru peptidu ACT 357 (Advanced Chem.Tech.Inc., ACT, louisville, KY). Po přidání 3 ekv. sloučeniny IV, 3 ekv HATU (viz stupeň B) a 7,5 ekv. diisopropylethylaminu se reakční nádoba potřásá po dobu hodiny. Po oddestilování rozpouštědla se získaná pryskyřice promyje dvakrát N-methylpyrrolidonem, dvakrát methanolem a dvakrát dimethylformamidem. Navázání látky vzorce IV na pryskyřici, jakož i stupua promývání se opakují, získá se tak látka vzorce VI.

Stupeň E

Pryskyřičná látka VI se smíchá v dimethylformamidu s obsahem 25% piperidinu, po potřepávání 5 minut se pryskyřice odfiltruje, znovu smíchá s 25% piperidinu v dimethylformamidu a směs se potřepává 10 minut. Rozpouštědlo se oddestiluje, pryskyřice se promyje dvakrát N-methylpyrrolidonem, dvakrát methanolem a dvakrát dimethylformamidem. Pryskyřice, zbavená ,chránících skupin se pak rozdělí rovnoměrně dle ACT357 z kolekční nádobky do 16 reakčních nádobek.

Stupen P

Všech 16 alikvotních podílů pryskyřice, zbavené chránících skupin ze stupně E se suspenduje v dimethylformamidu, do každé z reakčních nádobek se přidá odpovídající vhodná karboxylová kyselina VlI^^g, tedy obecného vzorce R^_^COOH, a to 3 ekv, při dají se 3 ekv. HATU (viz stupen B) a 7,5 ekv. diisopropylethylaminu v dimethylformamidu, nádoba se protřásává hodinu, rozpouštědla se oddestilují‘a alikvotní podíly pryskyřice se promyjí použitím N-methylpyrrolidonu dvakrát, methanolu a čimethylformamidu rovněž vždy dvakrát. Navázání kyselin vzorce VII^__^ na alikvotní podíly pryskyřice a stupně promývání se opakují, vzniknou sloučeniny VIII^_^g.

v

Stupen G

Alikvotní podíly pryskyřice (sloučeniny VIII^__^ se promyjí třikrát methylenchloridem, do každé z reakčních nádobek se přidá methylenchlorid s obsahem 1% kyseliny trifluoroctové, po míchání 10 minut se rozpouštědlo filtruje z reakčníčh nádobek do jednotlivých trubiček. AJ.ikvotní podíly pryskyřice se promyjí vždy dvaktát methylendichloridem, a methanolem, filtráty se spojí do individuálních trubiček a zahuštěním těchto ve vakuu se získají sloučeniny IX^_^g.

Stupeň H

Každá z volných karboxylových kyselin IX-^_^g se rozpustí v dimethylformamidu, ke každému z roztoků se přidá 1,05 ekv. pyridinu, dále 1,1 ekv. pentafluorfenylesteru kyseliny trifluoroctové, reakční směsi se míchají za teploty místnosti po 45 minut, roztoky se zředí ethylesterem.kyseliny .octové s následným promytím vždy třikrát 1 li vodným roztokem kyseliny citrónové a 5%ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Následuje vysušení bezvodým síranem sodným, filtrace a zahuštění ve vakuu. Výsledek: sloučeniny X^-^.

Příklad 2

Důkaz fotolytického štěpení T-L-X

Sloučenina T-L-X, jak byla připravena v příkladu 11, se ozáří blízkým ultrafialovým světlem (7 minut, teplota místnosti). Jako zdroj ultrafialového světla se použijr Rayonett fluorescence UV lamp (Southern Nev? Sngland Ultraviolet Co., Middletown, CT) s emisním pikem 350 nm. Lampa se umístí ve vzdálenosti 15 cm od Petri-ho misek se vzorky. Podle SDS gelové elektroforezy nad 85% konjugátů bylo rozštěpeno za těchto podmínek.

Příklad 3

Příprava fluoreskujících značených primérů a důkaz štěpení fluoroforu

Syntéza a čistění oligonukleotidů

Oligonukleotidy (ODN) se připraví na automatizovaných DNA syntetizérech za použití standardní fosforamiditové chemie (dle ··· *

-12 99 · · ··

výrobce), nebo H-fosfonátové chemie (Glenn Research Sterling,

VA). Vhodné blokované dA, dG. dC a T fosforamidity jsou takto obchodně dostupné a syntetické nukleozidy je možno snadno převést do odpovídající vhodné formy. Oligonukleotidy se připraví použitím standardního fosforamiditu, přímo dodávaného, nebo N-fosfonátovou chemií. Oligonukleotidy se čistí úpravou běžných postupů.Oligonukleotidy s 5 '-tritylovou skupinou se chromqtografují vysokotlakovou kapalinovou chromatografií za použití reverzní fázové kolony, 12 mikrometrů, 300 // Rainin (Emeryville, CA) Dynamax C-8, 4,2 na 250 mm s užitím gradientu 15% až 55% acetonitrilu v 0,1 N Et^NH⁺0Ac , pH 7,0, 20 minut. Po provedeném detritylování se oligonukleotidy dále čistí gélovou exkluzní chromatografií. Analytická kontrola kvality oligonukleotidů se provede na PRP-koloně (Alltech, Deerfield, IL) v alkalické oblasti a použitím PAGE.

Příprava 2,4,6-trichlortriazinových derivátů oligonukleotidů:

Po dobu 30 až 120 minut a za teploty 19 až 25°C reagují v alkalickém pufru (pH 8,3 až 8,5) spolu 1000 pg vázaného oligonukleotidu s .5'-smi no koncovkou s nadbytkem překryštelovaného chloridu kyseliny kyanurové. Reakce se dokončí v 0,15 M roztoku bori-r tanu sodného při pH 8,3 za: přidání 3,2 mg/ml překrystalováného chloridu kyseliny kyanurové a 500 ug/ml odpovídajícího oligonukleotidu. Nezreagovaný chlorid kyseliny kyanurové se odstraní exkluzní chromatografií dle velikosti na G-50 Sephadexu (Pharmacia, Piscataway, RJ) koloně.

Aktivovaný vyčištěný oligonukleotid potom reaguje s molárně 100-násobným nadbytkem cystaminu v 0,15 M roztoku boritanu sodného (pH 8,3) hodinu za teploty místnosti, Nezreagovaný cystamin na koloně G-50 Sephadexu (viz výše) a deriváty ODN potom reagují s amino-reaktivními fluorofory. Deriváty ODN jako přípravky se rozdělí na 3 části a každá z nich reaguje bud

a) s dvacetinásobkem molárním Texas Red-sulfonylchloridu (Molecular Probes, Eugene, OR), nebo • · ♦ · ·

-130♦ 9 ··

b) s dvacetinásobkem molárním Lissamine-sulfonylchloridu (Molecučhar Probes, Eugene, OR), nebo

c) s dvacetinásobkem molárním isothiokyanatanu fluoresceinu. Konečnými reakčními podmínkami je 0,15 M roztok boritanu sodného (pH 8,3), hodina, teplota místnosti. Nezreagované fluorochromy se odstraní na koloně G-50 Sephadex, viz zde výše.

K odštěpení fluorochromu z oligonukleotidy se ODN upraví na koncentraci 1 . 10“^ molární s následným 12,3-násobným zředě ním v TE (TE je 0,01 M Tris, pH 7,0, 5 mlvl kyseliny ethylendiamintetraoctové). Do ohjemů ODN ^©Oppidá po 25 pl 0,01 M di<t;hio threitolu (DTT). Do totožné serie sady kontrolních vzorků se DDT nepřidá. Směs se ponechá stát 15 minut za teploty místnosti a fluorescence se změří na černé mikrotitrační destičce. Z inku bočních trubiček se vyjme roztok (150 mikrolitrů) a umístí se na černé mikrotitrační destičce (Dynatek Laboratories, Chantilly, VA). Z destiček se přímo provede odečet za použití fluorometru Pluoroskan II (Plow Laboratories, IvlcLean, VA) za použití excitační vlnové délky 495 nm a monitorováním emise při 520 nm pro fluorescein za použití excitační vlnové délky 591 nm a monitorováním emise při 612 nm pro Texas Red, dále za použití excitační vlnové délky 570 nm a monitorováním při 590 nm pro lissamine.

Koly fluorochromu	RPU	RPU	RPU
	neodštěpený	odštěpený	volný
1,0 . 1O5M	6,4	12 00	1343
3,3 . 106m	2,4	451	456
1,1 .- 1O6K	0,9	135 -	130
3,7 . 1O7M	0,3	44	48
1,2 o 107H	0,12	15,3	16,0
4,1 . 107M	0,14	4,9	5,1
1,4 . 1O8M	0,13	2,5	2,8
4,5 . 109M	0,12	0,8	0,9
Z údajů zde	uvedených plyne,	že dojde asi	k 200-náso

nému zvýšení relativní fluorescence, byl-li fluorochrom odště• · ··· ·

-131pen z ODN.

Přiklaď 4

Příprava značených M13 sekvenčních primérů a důkaz odštěpení značené složky

Příprava 2,4,6-trichlortriazinových derivátů oligonukleotidů: Provede se reakce 1000 pg vázgných oligonukleotidů s 5 -amino koncovkou (5 hexylamin-TGIAAAACGACGGGGAGT-3. ( sekvence ID, č.l) s nadbytkem překrystalovaného chloridu kyseliny kyanurové v 10%ním alkalickém N-methylpyrrolidonovém pufru (pH 8,3-8,5), 30 až 120 minut, 19 až 25°G. Konečné reakční podmínky: 0,15 M roztok boritanu sodného, pH 8,3, 2 mg/ml překrystalovaného chloridu kyseliny kyanurové a 500 jng/ml odpovídajícího oligonukleotidu. Kezreagovaný chlorid kyseliny kyanurové se odstraní chromá tograf o váním na koloně G-50 Sephadexu, jak to bylo popsáno zde již výše.

Pak se provede reakce aktivovaného vyčištěného oligonukleotidu ye stonásobkem nadbytku cystaminu v 0,15 M roztoku boritanu sodného při pH 8,3. 1 hodinu za teploty místnosti. Nezreagovaný cystamin se odstraní chromá tografieky na koloně G-50 Sephadexu, viz zde výše. Deriváty ODN pak reagují s různými amidy. Deriváty 0DN se potom rozdělí na 12 dílů a provede se reakce každé části (25 mol.nadbytek) s pentafluorfenylesterem kyseliny, bud

1) 4-methoxybenzoové,

2) p-fluorbenzoové,

3) toluové,

4) benzoové,

5) indol-3-óctové,

6) 2,6-difluorbenzoové,

7) N-oxidu nikotinové,

8) 2-nitrobenzoové,

9) 5-acetylsalicylové,

10) 4-ethoxybenzoové,

11) skořicové,

12) 3-aminonikotinové.

··· · • · ··

-132Reakční doba: 2 hodiny, 37° C v 0,2 M vodného roztoku boritanu sodného, pH 8,3. Deriváty ODN se čistí gelovou exkluzní chromatografií na G-50 Sephadexu.

K odštěpení značené složky z oligonukleotidu se koncentrace ODN upraví na 10“^ molární s následným zředěním 12,3-krát použitím TE (TE je 0,01 M Tris, pH 7,0, 5 mM kyseliny ethylendiamin tetraoctové) s 50% ethanolu (objem na objem). K objemům po 100 μΐ ODN se přidá po 25 μΐ 0,01 M roztoku dithiothreitolu (DTT).

Do totožné sady kontrolních DDT se nepřidá. Inkubační doba: 30 minut, teplota místnosti. Dále se přidá roztok chloridu sodného (0,1 H) a dvěma objemy ethanolu se vysráží ODN. Ta se pak izoluje z roztoku odstředěním 14.000 x G, 4° C, 15 minut. Látka nad sedlinou se uchová a dokonale vysuší, kulička se potom rozpustí v 25 |il methanolu. Kulička se dále testuje hmotnostní spektrometrií se zřetelem na přítomnost značené složky.

Hmotnostním spektrometrem, použitým při této práci, byl esterní iontový zdroj Pohrier-ova transf ormního hmotnostního spektrometru (PTMS). Vzorky, přípravné analýzou MALDI se nanesou na hrot sondy a vše se vsune do zdroje iontů. Je-li vzorek ozářen laserovým pulsem, extrahujísee ionty ze zdroje a přecházejí do dlouhého kvadrupolního vodiče iontů, který je zaměří a přepraví do PTMS analytické buňky, umístěné v otvoru supravodivého magnetu.

Ze spektra lze vyčíst tyto informace: Píky, lišící se z hlediska intenzity od 25 do 100 jednotek relativní intenzity s odpovídajícími mol.hmotnostmi:

(1)	212,1 amu.	..odpovídá derivátu	kyseliny	4-methoxybenzoové,
2)	2oo,:	1 amu	derivátu	kyseliny	4-fluor be nzoové,
(3)	196,1	amu	derivátu	kyseliny	toluové,
(4)	182,1	amu	derivátu	kyseliny	benzoové
(5)	235,2	amu	derivátu	kyseliny	indol-3-octové,
(6)	218,1	amu	derivátu	kyseliny	2,6-difluorbenzoové
(7)	199,1	amu	derivátu	N-oxidu	kyseliny nikotinové,
(8)	227,1	amu	2-nitrobenzamidu,

• ·· · ♦

-133(9) 179,18 amu...odpovídá derivátu kyseliny 5-acetylsalicylové, (10) 226,1 amu derivátu kyseliny A.ethoxybenzoové,

209,1 amu derivátu kyseliny skořicové (11) (12) 198,J amu d er ivát u ky seli n;

Z výsledků lze odvodit, že lze značené složky odštěpit z primérů a že jsou zjistitelná hmotnostní spektrometrií. Příklad 5

Příprava sady sloučenin vzorce .R^_2g-Lys(^-lli’IP)-AfíP-TPP

Na vyobr.3 je doložena paralelní syntéza sady sloučenin (36) vzorce T-L-X (X = L^), kde L (zvláště tetrafluorfenylester), IÍ • 3 ^Jh znamená aktivovaný ester znamená o-nitr ó b e n zylami novou skupinu s tím, že Ir je methylenová skupina, spojující

O 'L^ a L*^-, T má modulární strukturu, kde karboxylová skupina lysinu byla napojena na dusíkový atom benzylaminové skupiny za vzniku amidické vazby a komponentu s variabilní hmotností (kde R-skupiny odpovídají , jak to zde bylo definováno a lze je zavést použitím kterékoli specifické karboxylové kyseliny, jak jsou zde uvedeny), jež je vázána & -aminoskupinou lysinu, zatím co skupina, podporující citlivost hmotnostního spektra je vázána £ -aminoskupinou lysinu.

odkazem na vyobr.3

Stupeň A v

V shromaždovací nádobce pro AST357 ss suspenduje v dimethylformamidu pryskyřice RovaSyn HMP (1 ekv., výrobce RovaBiochera), do nádobky se vnese v množství-3 ekv.- sloučenina 1 (ARP, dostup-ná od ACT), 3 ekv.HATU a 7,5 ekv. RUM a vše se protřepává hodinu. Po odstranění rozpouštědla se pryskyřice promyje dvakrát vždy použitím RI£P, methanolu a dimethylformamidu, navázání látky 1 na pryskyřici a studně promývání se opakují: získá se tak látka II.

Stupeň B

Pryskyřice (látka II) se smíchá s 25/· pipeřidinu v dimethyl

-134formamidu, vše se protřepává 5 minut, pryskyřice se odfiltruje, smíchá znovu s 25% piperidinu v diraethylformamidu, vše se protřepává 10 minut, rozpouštědlo se odstraní, pryskyřice se promyje vždy dvakrát použitím KMP, methanolu a dimethylhforamidu, aby se použila přímo ve stupni C.

Stupen G

Krycích skupin zbavená pryskyřice ze stupně B se suspenduje v dime thy Iforraamidu a k suspenzi se přidá PL10C-chráněná aminokyselina, obsahující chráněnou aminofunkci v postranním řetězci, 3 ekv. (Praoc-Lys(Aloc)-OH, od PerSeptive Biosystems); po dalším přidání 3 ekv.HATU a 7,5 ekv» Bělí v dimethyláormamidu se vše protřepává hodinu, rozpouštědlo se odstraní a pryskyřice se promyje dvakrát vždy použitím KMP, methanolu a dimethylformamidu. navázání Praoc-Lys(Aloc)-OH na pryskyřici a stupně promývání se opakují za vzniku sloučeniny IV.

Stupen D

Pryskyřice (sloučenina IV) se promyje dvakrát· methylenchloridem, načež se suspenduje v roztoku tetra(trifenylíosfin)palladia (0,3 ekv) a monofenylsilanu (10 ekv) v methylenchloridu. Směs se protřepává hodinu, rozpouštědlo se odstraní a pryskyřice se promyje dvakrát methylenchloridem. Palladiový stupen se opakuje, rozpouštědlo se odstraní a pryskyřice se promyje dvakrát methylenchloridem, dále dvakrát K,K-diisopropylethylamoniumdiethyldithiokarbamátem v dimethyIformamidu a dvakrát óimethylformamidem. Získá se tak látka V.

Stupen B

Krycích skupin zbavená pryskyřice ze ; kyselinou H-methylisonipekotovou, jak je to tupne D se spojí popsáno ve stupni

G za vzniku sloučeniny VI.

Stupeň P

AGT357

Chráněná Pmoc-pryskyřice v

ze shromaždovací nádobky

VI se rovnoměrně rozdělí dle do 36 reakčních nádobek za vzniku • ·· · · « • · 9 9 ··· · • · · ♦ · rf rf · · · ·

-135sloučenin VI]__36.

Stupeň G

Ha pryskyřici (sloučeniny se působí piperidinem jako ve stupni B, aby se tak odstranily skupiny FT.IOC.

v

Stupen H

Všech 36 alikvotních podílů pryskyřice, zbavené chránících skupin ze stupně G se suspenduje v dimethylformamidú, do každé nádobky se přidají 3 ekv. odpovídající vhodná karboxylové kyseliny (R^_^gCOOH), £> ekv.HATU a 7,5 ekv. 4-methylmorfoli nu v dimethylformamidú, nádobky se protřepávají hodinu, rozpouštědlo se odstraní a alikvotní podíly pryskyřice se promyjí vždy dvakrát N-methylpyrrolidonem, methanolem a dimethylformamidem. Navázání kyselin R^^^COOH na alikvotní podíly pryskyřice a Stupně promývání se opakují, výsledek: sloučeniny VIH^^g · Stupeň I

Alikvotní podíly pryskyřice (sloučeniny VlII-^^se promyjí třikrát methylenchloridem, do každé reakční nádobky se přidá směs kyseliny trifluoroctové, vody a methylenchloridu 90 : 5 : 5 nádobky se protřepávají 120 minut a rozpouštědlo se odfiltruje z rea&čních nádobek do jednotlivých trubiček. Alikvotní podíly pryskyřice se promyjí vždy dvakrát methylenchloridem a methanolem a filtráty se spojí s odpovídajícími obsahy v trubičkách. Jednotlivé trubičky se zbaví rozpouštědel^ zahuštěním ve vakuu, získají se tak látky

Stupen J

Každá z volných karboxylových kyselin IX^__?g se rozpustí v dimethylformamidu, ke každému z roztoků se přidá 1,05 ekv.pyridinu' a pak 1,1 ekv. tetrafluorfenylesteru kyseliny trifluoroctové, směsi se míchají 45 minut za teploty místnosti, roztoky se zředí přidáním ethylesteru kyseliny octové a po trojnásobném

-13 6-

promytí 5í£ním vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vysušení bezvodým síranem sodným s následnou filtrací se zahuštěním ve vakuu získají sloučeniny Χ-^θ·

Příklad _6

Příprava sady sloučenin vzorce R^_^^_Tjy_S( £-IHIP)-HBA-TPP

Ha vyobr.4 je paralelní syntéza sady 36 sloučenin T-L-X (X = L, ), kde L, je aktivující ester (specificky tetrafluor2 , 3 _z fenylester), L je o-nitrobenzylaminová skupina kde L znamená přímou vazbu mezi L, a L , kdeže L, je vázána přímo na aromalip, II tický kruh skupiny L . T má mádulární strukturu, kde karboxylová skupina lysinu je vázána na dusíkový atom ΐΛ-benzylaminové skupiny za vzniku amidické vazby a složka ^s variabilní hmotností· (kde skupiny R odpovídají T , jak to bylo dříve definováno a mohou se zavést použitím kterékoli specifické uvedené kyseliny) je vázána oi-aminoskupinou lysinu, zatím co skupina, podporující citlivost hmotnostního spektra (zavedená použitím kyseliny lí-methylisonipekotové) je vázána ^.-aminoskupinou lysinu.

S od kazem na vy o br. 4 •Stupeň A

Pryskyřice HovaSyn KI.-P se spojí se sloučeninou I (ISA, příprava dle postupu Brawn.a a spol., Moéecular Diversity 1, (1935) podle postupu, popsaného ve stupni A příkladu 5; získá se tak látka H.

Stupně B-J

Pryskyřice (sloučenina II) se zpracovává, jak je to popsáno ve stupních B až J příkladu 5. Připraví se tak sloučeniny X-^^g.

Příklad 7

Příprava sady sloučenin vzorce iIIP-Lys( fc,-R-| )-ANPTPP

Ha vyobr.5 je doložena paralelní syntéza sady 36 sloučenin T-L-X (X = L^), kde 1^ je aktivující ester (zvláště tetrafluor• 4 • · « 4444 ⁴ • · ⁴ ·· *·

-137fenylester, L znamená o-nitrobenzylaminovou skupinu s tím,že 3 2

L je methylenová skupina, spojující L_b a L , T má modulární strukturu,. kde karboxylová skupina lysinu je navázána na dusíamidické vazby skupiny R odpo, _2 kovy atom li benzylaminové skupiny za vznikl a R^ 36 je složka s variabilní hmotností(kd€ vídají ^r/, jak zde to bylo uvedeno a mohou se zavést použitím kterékoli ze specifikovaných a zde popsaných kyselin) a je vázána £-aminoskupinou lysinu, zatím co skupina, podporující citlivost hmotnostního spektra (zavedená kyselinou H-meth_v nipekotovou) je vázána ^-aminoskupinou lysinu.

odkazem na vyobr.5 otupne az pr íkladu 5

Stupen D ha pryskyřici (sloučenina IV) se působí piperidinem, jak je to popsáno ve stupni B příkladu 5 k odstranění skupiny PmOC.

Štucen

Krycích skupin zbavený cX-amin na pryskyřici ze stupně D se váže na kyselinu N-methylisonipekotovou, jak je to popisováno ve. stupni C příkladu V za vzniku sloučeniny V.

otupen P

Stupen G

DQK í< Aloe.

totéž jako v příkladu 5 pryskyřici (sloučeniny VI^^ se působí palladiem, popsáno ve stupni D příkladu 5 k odstranění skupiny

Stupně H až J

Sloučeniny ^se připraví stejným způsobem, jako v příkladu 5.

• · φ φ

-138• · φ · * • φ · « φ· *♦ φφφφ « • · 4 <· ·Φ

Příklad 8

Příprava sady sloučenin vzorce R^^g-GluC ^-DIASA)-ANP-TBP

Na vyobr.6 je paralelní syntéze sady 36 sloučenin T-L-X (X = L, ), kde znamená aktivovaný ester (specificky tetrafluorfenylester), ge o-nitrobenzylaminový zbvtek s tím, že z ” _ p

L znamená methylenovou skupinu, spojující L,_ a i?

r ma modulární strukturu, kde -karboxylová skupina kyseliny glutamová z _x -z 2 , , . z .

je přímo vasana na cusruovy atorn.m -oenzylammove suupmy za vzniku anidické vazby a je složL· a κ, _r 1-0 0 'ariabilní hiaotnostíí kde tyto skupiny H odpovídají T, jak to zde bylo výše definováno a mohou se zavést použitím kterékoli se specifikovaných karboxylových kyselin, jak zde byly uvedeny) je vázána oC-aminovou skupinou glutamová kyseliny, zatím co skupina, podporující citlivost hmotnostní spektrometrie (zavedená použitím diisopropylaminoetmarninu) Je vázána ^-k^o^ovou slinou kyselin, stanové.

odvoláním na vyobr.6

Stupně A-B : totéž j?feko v příkladu 5

Stupen G

Pryskyřice, zbavená chránících skupin (sloučenina III) se naváže na Tmoc-Glu~(OAI)-£?H použitím postupu, popsaného ve stupni G příkladu 5, výsledkem je sloučenina IV.

Stupen D

Allylester na pryskyřici (sloučenina IV) se promyje dvakrát methylenchloridem a v prostředí methylenchloridu se smíchá s 0,3 ekv. tetra(trifenylfosfin)-palladia's 3 ekv.N-methylanilinu, směs se protřepává hodinu, rozpouštědlo se odstraní a pryskyřicí se promyje dvakrát methylenchloridem. Palladiový stupen se opakuje. Po odstranění rozpouštědla se pryskyřice promyje dvakrát methylenchloridem, dvakrát roztokem N,í?-diisopropylethylamániumdiethyldithiokarbamátu v dimethylformamidu a dvakrát dimethylformamidem. Výsledkem je sloučenina V.

Stupen E

Pryskyřice, zbavená chránících skupin ze stupně D se suspen• ·

··· ·

-139duje v dimethyláormamidu, aktivuje se přidáním 3 ekv. HATU a 7,5 ekv. 4-methyImorfolinu; po protřepávání 15 minut se rozpouštědlo odstraní, pryskyřice se promyje jednou N-methylpyrrolidonem, smíchá se s 3 ekv. 2-diisopropylaminoethylaminu a 7,5 ekv. N-methxlpyrrolidonu. Po protřepávání hodinu se stupeň navazování 2-diisopropylaminoethylaminu na pryskyřici a. stupně promývání opakují: výsledkem je sloučenina VI.

Stunne F až J

Příklad 9 ;otéž jako v příkladu 5

Příprava sady sloučenin vzorce R^_^g-LYS( £.-±NiP)-ANPLYS( -I;IL_a

Na vyobr.7 je paralelní syntéza sady sloučenin T-L-X (X = L^), kde znamená amin (specificky £-aminoskupinu od lysinu odvozené části), je o-nitrobenzylaminová skupina s tím, že L je karboxamidově substituovaná alkylenaminoacylalkylenová skupina, spojující a L , T má modulární strukturu, kde karboxylová skupina lysinu je připojena na dusíkový atom z _z

L benzylaminové skupiny za vzniku amidické vazby a je to složka ^2.-36 ^{s var}i^a^řPⁿr hmotností (kde skupiny R odpovídají T , jak to zde již bylo definováno a mohou se zavést použitím jakékoli specifikované karboxylové kyseliny, jak zde již byly popsány) a je vázána *4. -aminoskupinou lysinu, zatím co skupina, podporující citlivost hmotnostní spektrometrie (zavedená kyselinou N-methyInipekotovou), je vázána ξ-aminoskupinou lysinu.

odkazem na vyobr.7 Stupen A

Po dobu 5 minut se protřepává pryskyřice Fmoc-Lys(Boc)-SRALI (dostupná od ACT, sloučenina I) s 25% piperidinu v dimethylformamidu. Pryskyřice se odfiltruje a po přidání 25% piperidinu v dimethyIformamidu se znovu vše protřepává 10 minut. Rozpouštědlo se odstraní a pryskyřice se promývá vždy dvakrát N-methyIpyrrolidonem, methanolem a dimethyIformamidem k přímému použití ve stupni B.

·· ·· • · · · • · ·· ··· · · • · · • · · · • ··

-140Stupéη Β

Smíchá se: 3 ekv. pryskyřice (sloučenina II) ANP (dostupná od ACT), 3 ekv.HATU a 7,5 ekv.. 4-methylmorfolinu v prostředí dimethylformamidu, vše se míchá hodinu, rozpouštědla se odstraní a zbytek se promyje dvakrát použitím vždy H-methylpyrrolidonu, methanolu a dimethylformamidu. Navázání sloučeniny I na pryskyřici a stupně promývání se opakují, vznikne tak sloučenina III.

Stupně G až J

Pryskyřice (sloučenina III) se zpracovává jako ve stupních B až J příkladu 5 za vzniku sloučenin

Příklad 10

Příprava sady sloučenin vzorce H^_^g-LÍS ( £ -TFA )-1¼ S( AKP-TFP

TP).

Ha vyobr.8 je paralelní syntéza sady 36 sloučenin T-L-X (X = L^), kde Β_μ je aktivovaný ester (specificky tetrafluor_ 2 _{z v} fenylester), 1 je o-nitrobenzylaminová skupina s tím, že iP je methylenová skupina, spojující L_b a 1 , T má modulární strukturu, kde karboxylové skupina prvého lysinu je napojena na dusíkový atom L benzylaminové skůlny za vzniku amidické vazby a skupina, podporující citlivost hmotnostní spektrometrie (zavedená použitím kyseliny íí-methylisonipekotinové) je vázána ^-aminoskupinou prvého lysinu, druhá molekula lysinu je připojena na prvý lysin ^-aminoskupinou prvého lysinu, skupina, upravující hmotnost (mající strukturu trifluoracetylové skupiny) je vázána £ -aminoskupinou druhého lysinu variabilní mol.hmotností(kde R skupiny od posložka R-po vídají skupinám T^, definovaným zde již dříve a mohou se zavést působením kterékoli specifikované zde již je vázána cA?-aminoskupinou druhého lysinu.

lve kyseliny;

odvoláním na vyobr.8

Stupně A až S: totožné se stupni A až 3 příkladu 5

9 <

9

-141v

Stupen 3?· Na sloučeninu VI, tedy pryskyřici se působí piperidinem,Qe^&ge to popisováno ve stupni B příkladu 5 s úmyslem odstranit skupinu PMOC.

__f v ω tupen G: Pryskyřice, zbavená ochranných skupin (sloučenina VII) se naváže na.Pmoc-Lys(Tfa)-OH použitím postupu, jak byl popsán ve stupni C příkladu 5, získá se tak-látka VITI.

3tupne H až K jako ve stupních P

Pryskyřice (sloučenina VIII) se až J příkladu 5, získají se tím zpracuje sloučeniny

XI

1-36*

Příklad

Příprava sady sloučenin vzorce R^ ^^-LYS( Na vyobr. 9 je uvedena paralelní syntéza T-L-X (X = LíOI, kde LíOI je fragment nukleové *>-INIP)-ANP-5 '-ΑΗ-0 sady 36 sloučenin kyseliny, OBR), odvozených od esterů příkladu 5 (týž postup se dá použít další T-L-X sloučeniny, kde X znamená aktivovaný ester). LíOI je navázána na T-L 5 '-koncovkou LíOI pomocí fosfodiesteralkylenaminové skupiny.

S odvoláním na vyobr.9 v

Stupen A

Sloučeniny Xll^^g ^se připraví podle modifikovaného biotinylačního postupu, viz Van Ness a spol., Nucl.Acids Res, IQ

3345 (1991). K roztoku 1 mg jednoho z 5'-aminohexyloligonukleotidů (sloučeniny XI-^_n^) v 250 ml 200 mM roztoku boritanu sodného (pH 8,3) se přidá jeden z tetrafluorfenylesterů (sloučeiny z příkladu 5, stonásobek molár ní ho Jiadby, tku v 250 ml

N-methylmorfolinu).Reakce se ponechá za teploty místnosti v klidu přes noc, nezreagované a hydrolyzované tetrafluorfenylestery se odstraní ze sloučenin Xll-j^g chromatografií na Sephadexu G-50.

Příklad Ί2__

Příprava sady sloučenin vzorce R^_^^-LYS( t-INP)-ANP-LYs£x-(MCT5 '-AH-ODN) -NE^ .

Na vyobr.10 je zachycena paralelní syntéza sady 36 sloučenin T-L-X (X - MOI, kde LíOI je fragment nukleové kyseliny ODN), • · ···

-142oavozený od aminů z příkladu 9 (stejný postup se dá použít pro další sloučeniny T-L-X, kde X znamená aminoskupinu). IJoi se naváže na ϊ-L pomocí 5 '-koncovky MOI, o to cestou fosfod ie s t eralkyle námi no skupiny.

S odvoláním na vyobr.10 ν'

Stupen A Připraví se, jak to popisuje Van Hess a spol., Bucleic Acids Res. 19. 3345 (1991) 5[6-(4,6-dichlor-l,3,5triazin-2-ylaminp)-hexyl)olig:. nukleotidy 211^

Stupeň B Do roztoku jednoho z 5- 6-(4,6-dichlor-l,3,5-triazin-2-ylamino)-hexyl -oligonukleotidů (sloučeniny XII^ -^) za koncentrace 1 mg/ml v 100 mlď roztoku boritanu sodného (pH

8,3) se přidá lOOnásobek molárního nadbytku primárního aminu, zvoleného ze skupiny látek R-^^-Lysí £ -iN±P)-ANP-Lys( £-NIL)-líHg (sloučeniny X^_^g ^z příkladu 11. Směs se míchá po dobu noci za teploty místnosti. Nezreagovaný amin se odstraní ultrafiltrací membránou průřezu 3000 MW (Amicon, Beverly, MA) za použití trojnásobného promývání vodou. Sloučeniny XlII-^g se izolují smísením objemu na 100 ml.

Příklad 13

Důkaz současné detekce hmotnostní většího počtu značených složek spektrometrií.

Τ-..nto příklad je popisem možnosti současného stanovení většího počtu látek, tedy značených složek použitím hmotnostní trometrie--tomto-příkladu bylo 31 -sloučenin smícháno s sd matricí, naneseno na pevný podklad s následným vysušením a desorpcí laserem, spektrometru.

v.

nikle ionty byly potom zavedeny do hmotnostního

Byly to tyto sloučeniny (od Aldrich, Mlvaukee, Vil). Byly promíchány vzájemně na ekvimolární bázi na konečnou koncqntraci G,002 X <tedy z hlediska každé sloučeniny):

benzsmid (121,14), amid kys.nikotinové (122,13), pyrazinamid (123,12), kyselina 3-amino-4-pyrazolkar boxylová (127,10), 2-thiofenkarboxamid (127,17), 4-aminobenzanid (135,15), tolumin (135,17) amid kyseliny 6-methylnikotinové (136,15), amid kyseliny 3-amino • · t · ·· ·· · • · · • ··*· • · ··· · » · · « ·· ·· ·· ·· • · · • ·· • · · · · • » · ·· ·· nikotinové (137,14), N-oxid amidu kys.nikotinové (138,12), amid kys.3-hydroxypikolinové, (138,13), 4-fluorbenzemid (139,13), amid kyseliny skořicové (147,18), 4-methoxybenzamid (151,17),

2,6-difluorbensamid (157,12), amid kys. 4-amino-5-imidazolkerboxylové (162,58), 3,4-pyridindikarboxyamid (165,16), 4-ethoxybenzamid (165,19), 2,3-pyrasindikarboxamid (166,14), 2-nitrobehzamid (166,14), kyselina 3-fluor-^-methoxybenzoová (170,4), indol-3-acetamid (174,2), 5-acetylsalicylamid (179,18), 3,5-dimethoxybensamid (181,19), 1-noftalenacetamid (185,23), amid kyseliny 8-chlor-3,5'-diamino-2-pyrazinkarboxylové (187,59),

4-trifluormethylbenaamid (189,00), amid kys. 5-amino~5-fenyl4-pyrazolkarboxylové (202,22), l-methyl-2~benzylmalonamát (207.33),

4-amino-2,3,5,6~tetrafluorbenzamid (208,11). kyselina 2,3-naftalendikarboxylová. V uvedené koncentraci byly sloučeniny vneseny do dimethylsulfoxidu, jeden pl materiálu byl pak smíchán s matricí kyseliny ¢/. -kyan-4-hydroxyskořicové (po zředění 1 : 10.000) a nanesen na pevný podklad z nerezové oceli.

Materiál byl potom desorbován laser-em použitím Protein :T0P Mass Spectrometer (Bruker, Manning Park, MA) a vzniklé ionty byly proměřeny způsobem lineární, tak i reflektonové operace. Byly získány tyto následující hodnoty m/z (vyobr.ll):

121.1 ........benzamid (121,14)

122.1 .......amid kys.nikotinové (122,13)

123.1 ......pyrazinamid (123,12),

124.1

125.2

127.3.. ... kys.3-smino-4-pyrazolkarboxylová- (127,10)

127.2 .....2-thiofenkarboxamid (127,17)

135.1.. .. 4-aminobenzamid (435,15)

135.1.. .. toluimin (135,17)

136.2.. .. amid kys.6-methylnikotinové, (136,15)

137.1.. .. amid kys.3-aminonikotinové

138.2 .....Ií-oxid amidu kys.nikotinové (138,12), • · ··· · ’ • · <

·· ·% ·· ··.

> · · · » * ··.

• · · · • « · · ♦ · ··

-144138.2 ......amid kys.3-hydroxypikolinové (138,13)

139.2 ..... amid kys.4-fluorbenzoové,

140.2

147.3.. ... amid kys.skořicové (147,18)

148.2

149.2

4-me thoxy benzamid (151,17)

152.2

2,6-difluorbenzamid (157,12)

158.3 amid kys.4-amino-5-imidazolkarboxylové (162,58)

163.3

1^5,2.....3,4-pyridindikarboxyamid (165,16)

165.2.. ... 4-ethoxybenzamid (165,19)

166.2.. .... 2,3-pyrazindikarboxamid (166,14)

166,2.....2-nitrobenzamid (166,14) kys.3-fluor-4-methoxybenzoová (170,4)

171.1

172.2

173.4 amid kys.indol-3-octové (174,2)

178.3

..... amid kys.5-acetylsalicylove (173,18)

181.2.. ... 3,5-dimethoxybenzamid (181,19)

182,2 l±aaftalengcetamid (185,22)

186,2

8-chlor-3,5-diamino-2-pyrazinkarboxamid (187,59)

188,2

189,2-—... amid kys.4-trifluorme thylbenzoové (189,00)

190.2

191.2

192.3 amid kys,5_amino-5-fenyl-4-pyrazolkarboxylové (202,22)

03,2

203,4 • · • ·

-145l-methyl-2-benzylmalonamát (207,33) amid kys.4-amino-2,3,5,6-tetrafluorbenzoové (208,11)

212.2 kys.2,3-naftalendikarboxylová (212,22)

215.3

221,2 22 8,2

234,2

237.4

241.4

Z údajů jasně plyne, že 22 z 31 sloučenin se jeví být •ve spektru s předpokládanou hmotností, 9 z 31 sloučenin je ve spektru s hmotností η + Η (1 atomová hmotnostní jednotka, amu) nad předpokládanou hmotností. Posléze uvedený jev je pravděpodobně dán protónováním aminu ve sloučenině. Takže z 31 sloučenin lze zjistit hmotnostní spektroskopií MALDI 31.

A co je důležitější, z příkladu je jasně patrné, že lze současně detegovat větší počet značených složek spektroskopickým způsobem.

Samotná ot -kyanová matrice (vyobr.ll) má píky při 146,2, 164,1, 172,1, 173,1, 189,1, 190,1, 191,1, 192,1, 212,1, 224,1, 228,0, 234,3. Ostatní hmotnosti, zjištěné va spektru, jsou výsledkei .nečistot v dodaných sloučeninách, nebylo totiž vynaloženo žádné úsilí čistit je.

Příklad 111

Test genové exprese použitím většífeo počtu vzorků

Př^ipraví se čerstvý pufr z boritanu sodného (SBB) z kyseliny borité a hydroxidu sodného. Pufr APB, složení 0,18 chloridu sodného, 0,05 M Tris pH 7,6, 5 mM kyselin?/ ethylendiamintetraoctové a 0,5/ Tween-u 20R. TMKZ pufr, složení 0,05 M Tris, pH 9,5, 1 mM chloridu hořečnatého, 0,5 mM chloridu zinečnatého, voda k promývání: 0,09 M chloridu sodného, 50 mM Tris, plí 7,6, 25 ml kyselin?/ ethylendiamintetraoctové. SDS^PW je PW s 0,1/ sodné soli kyseliny dodeeylsírové (SDS). Lyzovací a hybridizační roztok:

-1463 M guanidinthiokyanátu, 2% N-lauroylsarkosinu (Sarcosyl), 50 mM Tris, při 7,6 a 25 mM kyseliny- ethylendiamintetraoctové. Pufr GAP: 0,1 M roztok sodné soli kyseliny citrónové a 0,2 ti roztok fosforečnanu sodného, pil 6,5. Substrátový roztok IS1P (orseradish peroxidase, křeková .peroxidasa): roztok 0,1 m sodné soli kys.citrónové, pH 6,5, 0,2 LI roztok fosforečnanu sodného,

2,87 mil 4-mathoxy-l-naftolu, 0,093 mlí hydrochloridu hydrazonu

3- methyl-2-benzothiozalinonu a 4 mil peroxidu vodíku. AP (alkalická fosfatasa) substrátový roztok: 1 mM 5-brom-4-chlorindoyl-3-fosfátu, 1 míi nitroblue tetrazolium a 0,01 % Tween-u 20 v TI® Z. Fluorescenčním substrátem pro alkalickou fosfatasu je je 0,05 mM ...

4- methylumbeliferonfosfátu, 0,05 M Tris, pil 9,5, 1 mil chloridu hořečnatého, 0,5 mlá chloridu zinečnatého. Poly(ethylenimin) byl od Polysciences (Wattington, PA). Hlazené a neleštěné nylonové kuličky byly od The Hoover Group (Sault St.Marie, LH). Triethyloxoniumtetrafluorborát, anhydrid kys.jantarové a l-methyl-2-pyrrolidon byly od Aldrich Chemical (Milwaukee, W±). Tween 20R a NHS-LC-Biotin získány od' Pierce (Rockford, J), thiokyanatan guanidinu (GeSGN) od Kodak (Rochester, ΝΎ), chlorid kyseliny kyanurové od Aldrich Chemical Co.(Milmsukerr, WI), překrystalován z toluenu.

A.

Syntéza. ODN

ODN doplňky (5 '-CCTTAGGACAGTCRRCTTCACGC) jako konzervované nebo hypervariabilní oblasti 16S ribosonální RNA (rRNA) Porphyromonas gingivalis (?g) byly syntetizovány buď použitím syntetického zařízení'ABI’380B nebď IdilliGen 7500 pro automatickou syntézu DNA za užití standardizované chemie kyanethyl-N,N-diisopropylaminofosforamiditu (CED-phosphoramidite). Aminové koncovky byly vneseny na 5'-koncovku použitím obchodné dostupného N-Monoethoxytritylaminoihex-6-yloxy-CED-fosforamididu. Kyseliny ODN s 5 -monomeOkosytritylovymi skupinami byly chromá tografovány vysokotlakovou kapalinovou chromatografií za užití Hamiltonovy PRP-1 (7,0 na 305 mm) kolony pro reverzní fázi za použití gradientu 5% až 45% acetonitrilu v 0,1 M octanu triethylaminu, pH 7,5, minut.

• fc* fc

-147Po odstranění trit.ylových skupin 80%ní kyselinou octovou byly kyseliny ODN vysrášeny přidáním 3 K roztoku octanu sodného a 1-butanolu Analytické hodnocení z hlediska kvality kyselin ODN bylo provedeno iontoměničovou vysokotlakovou kapalinovou chromatografií ’ užití kolony Toso-Hass DEAE-NPR a denaturováním polyakrylamidovou gélovou elektroforezou (PAGE).

S. Příprava nylonových kuliček, překrytých polymerem

Za teploty místnosti se 5 minut míchají neleštené nylonové kuličky (průměr 0,1 cm) v 1800 ml bezvodého 1-me thyl_2-pyrrolidonu, přidá se 200 ml 1 1.1 roztoku triethyloxoniumtetrafluorborátu v dichlormethanu, následuje další míchání po 30 minut, kapalina se oddekantuje a kuličky se rychle promyjí čtyřikrát použitím vždy 500 ml l-methyl-2-pyrrolidinonu. Potom se kuličky míchají 12 až 24 hodin s litrem roztoku (3%, hmotn/obj) poly-(ethyleniminu), mol.hmotnost 70.000 v l-methyl-2-pyrrolidinonu, připraveného z 30%ního vodného roztoku póly(ethyleniminu). Po oddekantová ní poly(-ethylenimin)-ového roztoku se kuličky promyjí dvakrát litrem l-methyl-2-pyrrolidinonu, dvakrát litrem SDS/EW, desetkrát použitím 2 litrů vody a posléze jednou použitím 500 ml 95%ního ethanolu. Kuličky se vysuší za vysokého vakua (4 až 5 hodin).

Obsah aminu na kuličkách se zjistí reakcí s kyselinou pikrylsulfonovou.

0. Příprava 5 -^6-(4,6-dichlor-l,3,5-triazin-2-yl_smino)hexylj-substituovaných ODN

Do roztoku 1 ml 5 '-aminohexyl-ODN (10 mg/ml) v čerstvě připraveném 0,1 SBB (3,2 ml, pH 8,3) a 1,8 ml vody se přidá 1 ml acetonitrilového roztoku překrystalovaného chloridu kyseliny kyanurové (50 mg/ml) a roztok se míchá 30 až 120 minut za teploty místnosti. Nezreagovaný chlorid kyseliny kyanurové se odstraní ultrafiltrací za použití membrány 3000 MW (Amicon, Beverly, KA), přičemý se k promývání použije čerstvě připravený

-148roztok 0,1 M SBB (pH 9,3, čtyřikrát po 10 ml). Po konečném promývání se objem sníží na 1 ml. Připravené kyseliny 5 -|6~(4,6_dichlor~l,3,5-triazin~2-ylamino)-hexylj| -ODN jsou tálé po dobu jednoho týdne při 4°0 v 0,1 M SBB (pH

8,3), sniž lze zjistit jakýkoli rozklad.

íavázání kyselin OPII na nylonové kuličky

500 kuliček z nylonu s krytím PBI, jak byly popsány výše, se vnese do stejného objemu čerstvé připraveného 0,1. M SBB (pH 9,3) a s úmyslem rehydratovat kuličky se vše energicky míchá 30 minut. Borátový roztok se odóekantuje, kuličky se promyjí jednou použitím 0,1 Í..ISBB (pK 8,3), načež se kódují stejným objemem čerstvě připraveného 0,1.11 SBB.

Ke kuličkám se potom přidá 0,1 ml roztoku S^-jS-CájO-dichlorl,3,5-triazin-2-ylamino)-hexylj-ODN (500 mg/ml) a směs se energicky míchá 60 minut za teploty místnosti. Po oddekantování roztoku se kuličky promyjí použitím vždy 500 ml 0,1 M SBB (pH

8,3), potom se na kuličky působí trojnásobným objemem roztoku anhydridu kyseliny jantarové, 10 mg na mL 9 : 1 směsi 1-msthyl-2-pyrrolidonu ku 1,0 1,1 SBB (pH 8,3),reakční směs se míchá hodinu za teploty místnosti a kuličky se potom promyjí třikrát použitím vždy 250 mi l-methyl-2-pyrrolidinonu, dvakrát lidtem destilované vody, pětkrát použitím srždy 250 ml SDS/TY/ a čtyřikrát litrem vody. Uchovávají· ae v 25 mil kyselinyyethylendiamintetraoctové.

B. Oz^feení a značení vzorků

V této části příkladu 5 se vzorkx opatří značením, což dovoluje diferencovanou mRNA expresi ve stimulovaných kontra nestimulovaných lymfomech Jurkat-licských T-buněk (JRT 3,5).

100 každého z 5 koncovkově amino-značených oligonukleotidů, jak byly popsány zde výše, se použije k reakci s nadbytkem chloridu kyseliny kyanurové v 10%ním n-methylpyrrolidonovém alkalickém roztoku, pH s výhodou 8,3 až 8,5), tedy pufru při 19 až 25° 0 po dobu 30 až 120 minut. Konečné -re-a-ke-ní- podm-í nky-:- 0,15 M roztoku bor i t-a nu sb-dného · při- píí-8,-3,~ • · * • ·· • · · · <

• · « ·· ·*

-149b)

c) mg/ml pře krystalováného chloridu kyseliny kyanurové a 500 jig/ml toho či onoho oiiigo nukleotidu. Hezreagovaný chlorid kyseliny kyanurové se odstraní velikostně vylučovací chromatografii na koleně G-50 Sephadex-u. Ha aktivovaný čištěný oligonukleotid se potom působí stonásobným molárním nadbytkem cystaminu v 0,15 M roztoku boritanu sodného (pE 8,3) hodinu za. teploty místnosti. Hezreagovaný cystamin se odstraní velikos vylučovgcí chromatografii na koloně G-50 Sephadex-u. Deriváty kyselin ODN potom reagují s amino-reaktivními fluorochromy. Přípravek derivátu ODN se rozdělí na 3 části a každá z nich reaguje buď

a) s dvacetinolárním nadbytkem Texas Red-sulfonylchloridu (Molekular Probes, Bugene, OH), nebo sdvacetimolárním nad by tkem Lissamine-sulfonyIchloridu (Molecular Probes, Bugene, OB), mebo s dvacetimolárním nadbytkem isothiokyanatanu fluoresceinu. Konečné reakční podmínky: 0,15 Id roztok boritanu sodného, pH 8^3, hodina za teploty místnosti. Hezreagované fluorochromy se odstraní velikostně vylučovací chromatografii na koloně G-50 Sephadex-u. Vzorky IL-2, GM_CSF byly značeny použitím Texas-Red c-fos IL-4 a PKC-g byly značeny lissaminem a CTLA4/CD28 a OKI kinasa byly značeny fluoresceinem. Vzorky IL-2, c-fos a CTLA4 byly spojeny dohromady. Vzorky IPH-g, 11-4 a GMP kinasy také jakož i vzorky GM-CSP a PKO-g.

P. Syntéza kyselin cDNA na pevném podkladu pro test genové exprese

Oligo DM0 590 5' '-ACTACTGA5EGAGGCGCGCOTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 oddělovač

Asc 1 (póly dT)2 0

G. Stimulování a příprava RKA

Rada Jurkat JRT 3,5 se stimuluje 6 hodin za hustoty buněk IxlOeO buněk/ml v prostředí sera, prostého RPMI (Life Technologies, Gaitherburd, MD) za přítomnosti 10 ng/ml phorbol-12myristat-13-acetátu (Calbiochem, San Diego, CA) a 100 ng/ml ionomycinu.

• · r « ·

• ·

-150(Calbiochem). Buňky se granulují, promyjí jednou pomocí BBS (Life Technologies), znovu granulují a lyžují v 0,5 ml pufru per 10” buněk, přičemž pufr obsahuje 4M isothiokyanatanu guanidinu/1% N-laurylsarkosinu/25 mM sodné soli kyseliny borité, pH 7,1 (Fisher Scientific Pittsburg, PA). Přidá se jedna desetina objemu 211 roztoku boritanu sodného (Fisher Scientific, pH 4,2) s následným přidáním jednoho objemu vody, nasycené fenolem (Amresco, Solon, OH). Po promíchání se přidá dále Čtvrtina objemu směsi chloroformu a isoamylalkoholu (29:1) (Fisher Scientific) a roztok se energicky promíchá, dále inkubuje v ledu na -10 minut. Lyzát se odstředí, vodný .podíl odejme a extrahuje se stejným objemem směsi chloroformu a isoamylalkoholu. Vodné podíly se potom slijí ethanolu (Quantum Chem se ethanol oddekantuje se suspenduje ve vodě mg/ml.

a RNA se vysráží přidáním dvou objemů .ical Gorp., Tuscola, II). Po odstředění , RNA se krátce vysuší na vzduchu, znovu prosté Rilasy na. koncentraci mezi 1 až 5

H. Zachycení a syntéza prvého provazce

Pouze jedna nylonová kulička s kovalentně vázaným oligonukleotidem

5'-ACTAGTGATCAGGCGCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' (GenSet, la Jolls,

CA) se přidá k 10 jxq veškeré celulární RN£,zředěné v dostatečném množství vody, prosté RNasy tak, aby se překryla kulička, afto ve sterilní 1,5 ml trubičce pro odstředivku (Fisher Scientific).

RNA. a kulička se inkubují při 65° C po 5 minut. Do každé trubičky se přidá stejný objem 2X mRNA hybridizačního pufru, obsahujícího 50 mM Tris (pH 7,5), 1 M chloridu sodného (Fisher Scientific) a 20 ug/ml acetylované BSA (New Sngland Biolabs, Beverly, MA).

Trubičky se něžně naklánějí za teploty místnosti po 2 hodiny, kapalina nad kuličkou se. odstraní a kulička se promyje třikrát hybridizačním pufrem IX mRNA. Po skončeném promývání se přidá do každé trubičky reverzní transkripční směs, obsahující IX Mmlv-reverz transkriptgsový pufy 1 mM směsi dNTP, 2 mM DTT (l^fe Technologies), 20 jednoten Rnasin-u (promega, Madison WI) a 10 jig/ml • · • « » · · ¹ • rf ·♦

-151acetylované BS (New England Biolabs). Následuje přidání 600 jednotek reverzní trans^riptasy (Life Technologies), reakční směsí se nesně pohybuje 2 hodiny při 42° 0, Přidá se 1 jednotka TNasy II (Boehringer, Mannheim, Indianapolis,

IN) a v reakci se pokračuje 30 minut. Kapalina nad sedlinou se opět odlije a každá kulička se promyje třikrát v 10 mM Tris (pH 8,0), ImM kyseliny ethylendiamintetraoctové (pH 8, Pisher scientific. Zbylý RNA templát se odstraní zavaření’..·, kuliček v iUAUi W

TE s 0,01/ SDS (Pisher Scientific.

Nylonový pevný podklad se potofe hybridizuje se 100 nanogramy na ml s následujícími značenými oligonukleotidovými vzorky 5'-GAACTCAAACCTCTGC-AGGAAGTG-311-2 _ . .

-CAGTGCAGAGGGTCGCGAGCTATA-3 ' > IPN-gamma 'vGTTGAGCATGATGGGCAGCCACTá-3 '-GM-CSP 5 '-CATTCGCACGGTCACTGCCATCTC-3 ', c-fos 5 '~GCGACTGTGCTCCGGCÁGTT0TAC-3,' IL-4 5 '-GTGGTTCÁTCGACGATGCCAGGAA-3 '-PKC- gamma 5 '-GAGCTCATGTACCCACCTGCGTAC-3 -CTLA4/CD28 5 '-ATCTTCGfGCAGCCGOCCTCACTG-B '- GMB kinasa

Všechny oligolátky jsou lidskými homology s výjimkou GMP-kinasy, jež je založena na. hovězí sekvenci. Hybridizace prováděna 8 hodin v 3 mGuSON při 37° C. Během hybridizování se reakční směsí mírně pohybovalo, aby se tak podporovala difúze vzorku na pevný podklad. Po S-mi hodinách inkubování byl pevný podklad promyt dvakrát použitím 3 M GuSGN, pětkrát 0,lxSSC a potom vnesen do 0,01 M dithiothreitolu k odštěpení flhorochromu z oligonukleotidu. Směs byla dále ponechána 15 minut za teploty místnosti-, fluorescence změřena na černé mikrotitrační destičce (Dynatek Laboratories, Ghantilly, VA). Destičky byly potom použity k přímému přečtení za použití fluorometru Pluoroskan II (Plow Laboratories, McLean, VA) za použití excitační vlnové délky při 495 nm a monitorováním emi§_e 520 nm pro fluorescein, za použití excitační vlnové délky 591 nm a monitorováním emise pří 612 nm pro Texas Red, a za použití vlnové; ^_élky 570 nm s monitorováním emise při 590 nm pro lissamin. Výsledky vzorkování a testování jsou tyto:

-152-

	Bez stimulování	Stimuloví
11-2	1,2 rfu	230 rfu
IFN	0,8 rfu	12 0 ffu
GM-G3P	21 rfu	38 rfu
c-fos	16 rfu	76 rfu
1L-4	33 rfu	12 rfu
DKG	10 rfu	130 rfu
CTLA-4	nic	nic
GMP-kinasa	450 rfu	42 0 rfu

Dříkla.d 15

Detekce náhodného párového promícháni s jedinou bází na pevném podkladu

Tento příklad popisuje detekci náhodného párového promíchání s jedinou bází na imobilizováném vzorku za použití komplementárního, fluorescenčně značeného oligonukleotidu.

Sada vzorků oligonukleotidů obsahovala jeden vzorek, který dokonale se hodí pro vytvoření páru a jeden oligonukleotid, obsahující nahodilé promíchání, je-li hybridizován. Dva nukleotidy: byly značený lišícími se fluorochromy, a po hybridisaci bylo umožněno, aby došlo při k nahodilé směsi a poměr hybridizováných flhorochromů byl stanoven.

Cílový” oligonukleotid (DM050;

5'-TTGATTCCCAATTATGCGAAGGCG-3'-) byl imobilizován na pevných podkladech.- Kuličky ODN s odpovídajícím dříve popsaným průměrem byly připraveny, jak to bylo již uvedeno (Van Hess a spol., Rucl.Acids Res.19. 3345 (1991). KUličky ODM obsahovaly 0,01 až 1,2 mg/kuličku kovalentně zmobilizované ODřl. DM0578 je komplementem k DM0501 (dokonalý komplement). DM01969 je komplementem pro DM0501 se změnou G--->T v poloze 11. DM01971 je komplementem pro DM0501 se změnou A—v poloze 12. Každý vzorek oligonukleotidu byl značen buď'pomocí BIODIPl, TUARA nebo Texas Red. Hybridizační reakce byly provedeny v 3 M GuSCN, 0,01 M Tris • ·

-153(pH 7,6) 5 mil kyseliny ethylendiamintetraoctové a 50 ng/ml toho či onoho vzorku. Ekvimolární množství každého typu vzorku bylo použito pro každou hybridizací za přítomnosti 3 pevných podkladů na trubičku. Hybridizace byly prováděny za neustálého míchání 30 minut při 42° C. Kuličky byly promyty dvakrát použitím 3 M GuSCK při 42° 0 a pak pětkrát použitím SBS/PW.

Pro denaturování vzorku oligonukleotidů byly pevné podklady umístěny v 200 pl TE (TE je 0,01 M Tris, pH 7,0, 5 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové). Směs byla inkubována 10 minut při 100° G, fluorescence byla změřena na černé mikrotitrační destičce. Roztok byl vyjmut z inkubačních trubiček (200 mikrolitrů) a umístěn na černé mikrotitrační destičce (Dynatek Laboρ ratories, Chantilly, -VA). Násrd-ovalo přímé odečtení z desek za použití fluorometru Pluoroskan II (Plov Laboratories, McLean, VA) za použití excitační vlnové délky 495 nm a monitorování emise při 520 nm pro fluorescein, za použití excitační vlnové délky 591 nm a monitorování emise při 6l2 nm pro Texas Red, za použití excitační vlnové délky 570 nm a monitorováním emise pri 590 nm pro lissamine nebo TAIVÍRA.

Výsledky jsou tyto

Směs vzorků

578TR/578BD

578TR/1S69BD

578TR/1971TA

578BD/1971TA

Poměr fluoroformu po denaturování

1,9/12 5/1

0,58/1 - 0,48/1 bulka 10

Poměr fluoroformu v hybridizační směsi

1,9/1 2,0/1 0,025/1 0,014/1

Z výsledků lze vyčíst, že nelze zaznamenat vliv fluorochrornu na hybridizací, jak je to naznačeno na prvém řádku, že Texas Red (TR) 578-oligonukleotid a 578BD (BlODYPY) se projevují z hlediska hybridizace vůči imobilizované cílové, látce stejně, protože poměr značení se po hybridizací nezměnil. Jde v průměru a dvacetinásobek obohacení dokonale složených vzorků ve srovnání s nahodilým zspořádáním v GuSCK, což dovoluje určité zjištění párovaných nahodilých podkladů.

• ·

-154Z předchozího lze odvodit, že ačkoliv zde byla popsána určitá specifická provedení postupů dle tohoto jsou zde možné četné záměrů a rozsahu tohoto jakkoli omezován s výhradou vynálezu pro doložení a ozřejmění, modifikace, aniž by se odbočilo ze vynálezu. Podle toho není vynález znění připojených nároků • · ··· ·

Vyobrazení I

-155-

stupeň A

stupen B piperidin stupeň C PMOC-NH COOH \Z

A

IV i?

ΊΑΜίί stupeň D piperidin • · • · ··· ·

-156,·:.

pokr. Vyobr.l

stupen D piperidin rozdělit do 16 reaktorů stupeň E VI_1<Lé R^g-COOH ^Rl-l6

^VII!-16 stupeň P, zředit kys.trifluoroctovou

stupen G, pentafluorester

MeO

·

99

999 9 9

9 ·

HO

Vyobrazení 2

stupeň A allylbromicL, DIEA X = H -··> allyl

stupen B

FMOC-NH\ ^xCOOH

v stupen C

III

O

Pd(O)

stupen E piperidin

VI

• · ·« ·· ·· *· ··· ···· · · · · : :.:..: :.··.. ···; : -X38-: ·..··..· ....

R.

pokr .Vyobr .2

stupen Ξ

V‘\Ž rozdělit do l6 reaktorů.

stupen P VII^g-COOH o

o

-A

H

stupen G zředěná kys.trifluoroctová

COOH stupen H pentafluorester kys, trifluoroctové ^Ll-l6

^Xl-16 • ·

-159Vyobrazení 3

stupen A h°4®> ?

NovaSyn HMP prysk. HATU, NMM

stupen B piperidin

NOr

Fmo cHN

stupen E kys.N=jnethylisonipekotová HATU, NMM • · • ·

-160-

VI

Nstupeň P, rozdělit do 36 reaktorů

-^¹

NOr

stupeň G, piperidin \|x • · ·· · ·

-161pokr·

Vyobr.3 stupen G

stupen H ^R1-36^COOH HA TU, Ní,1.1

Stupeň I

PTA A H₂0 : DCM 90 : 5 : 5 • · • ·

-162 pokr.Vyobr.3 v

xj/etupen I

Vyobrazení 4

UovaSyn HMP pryskyřice HATU, ffl stupeň A

O

Fmoc

IV stupen D

í

ΝΗ

Fmoc

V

-I64pokr.Vyobr.4 stupen F, rozdělit do 36 reaktorků.

piperidin

* · • ·

-165 »·· pokr .Vyobr .4 v

stupen H ^ri„36-COOH, HATU, MI

stupen J tetrafluorester kys.trifluoroctové pyridin, dimethylformamid pokr.Vyobr. 4

• · · ·

^ΙΧ1-36

-167·-· · • ·

Vyobrazení 5

piP3RI£IN stupen 3

stupen D piperidin k

pokr.Vyobr.5 VI

tupen P rozdělit do 36 reaktorků

AlocHN

Vl-36

G ^CSV^ÍH3

^Ll-36 stupen H

R Scook HMM

*z stupen I

TPA : RgO £DClA/ 90: 5: 5 _ stupen J tetrafluorester 0^ _n kys.trifluoroctové il pyridin, DMF

H

1-36

··· ·

-169·· ·· • · · · • · ·· • · · · • · · · ·· ·· ·· • ··

Vyobrazení 6

stupen A_

H0-©

Nova Syn-HMP pryskyřice NATU, M

<

O v

stupen CL

Pmo c-Glu(OA i)-OH HATU NMM

PmocHN

OAi

IV stupen D

L.^(C6^H5>3^PI^{M (0)} N-methylanilin

!?! W

V

pokr. Vyobr. 6 stupen F rozdělit do 36 reaktorků

Fmo cHN

V TTT

1-36 stupen J

-171Vyobrazení 7

BocHN ”0 I “°2

Fmoc-Lys(Aloc)-OH z HATU, m stupen 0 piperidin

NOr

. „ I ^H

FmocNH $

III

Boc

stupen c₆h₅síh₃

TJHAloc

V

FmocHN

Í^(C6^H5⁾3^P1^{W (0)/Λ}

PmocHN

BocHN^

VI stupen F kys.N-methylisonipekotová

HATU, NI«

4' • · ···

-172-« polcr .Vyobr .7

BocHN

stupen rozdělit do

EH 36 zásobníčků

BocHN

FmocHN

FmocHN

VII

1-36 stupen H piperidin

BocHN

v stupen I r COOH 1-36

HATU Hffl

VIII

1-36

VII

BocHN

IX

1-36 /

/stupen J < TFA : HgO : DCM 90:5:5 ^H/

NO.

NH r

x^·

1-36

X ^ul-36

173Vyobrazení 8

NO,

Pmoo

v stupen A

Pmoc

Fmo cHN

HO

NovaSyn HMP pryskyřice HATU M

IV

NHAloc stupen D

U^c6^H5>3^P34^Pd <°>

CgHjSiHj

NO.

í) stupen C H^

Pmoc-Lys(aloc)-0H ÍATU M ě'NO₂

III

II stupen B piperidin

O''”®

PmocHN s|/

N-me t hy 1 i so nrpe kotová kyselina

HATU NMM NHn

stupen E vlisonřnePmocHN

< v upen P piperidin

H^

VII • · ··· · • · · « • · · · · •174pokr.Vyobr. 8

VII stupen G

Fmoc-Ly s(T fa)-OH HATU NMM

Fmo cHN

NHTfa VIII ^a) rozdělit do 36 reservoárků. b) piperidin

NHg

NHTfa

STUPEN I

HATU M

IX

1-36

R^e-COOH *

0^ ^d' stupen J TFA:H_9n:DCM

90:5:5 σ?

OH

Nlí

NH .V*A

Ύ-36

4-36

1-36

NHTPa

XI

1-36 stupen K ’li ;r:

pyridi^n, dimethylformamid tetrafluoraster kyseliny trifluoroctové

• · • · · · • ·

-176-:.

^ll-36

R

1-36 z příkladu A

9, + řyi-CCHPg-o-p-o stupen A 100 mM boritan sodný pH 8,3

báze >1 igo nukleotid g '-aminohexyl-znače né oligonukleotidy

Al·

1-36

. - o 1 igo nukl e o t id ^3 g ^XIIl-3é ·· • 8 • 8

8

-177-

• · ·· · • · · ··

WO 97/27325

• · · · • · ··· · · * PCIYUS9T/O1046

o o

o o

o

130 150 170 190 210 230 • ·

Vyobrazení 12 zorek s obsahem pouze Q^-kyan-matrice

o o

o o

o • · • ·

WO 97/27325

-179» » ·· · · ·* » · 9 9 ···· *

9· * * « ·· ** ·* PCT/US97/01046

Vyobrazení 13 úprava '· . rozsahu proměnlivou hmotnost

Složka s

Potoodšt. vazebná · • složky oligonukleotid s 5 -aminohexylovým zakončením

Rv

W(

N—(C₂—C _l0)—ODN —3—OH podpora citlivosti hmotn.

spektroskop.

JUSr. Petr KALE ad v/ jKY

SPOLEČNÁ ADVOKÁTNÍ KANCELÁŘ VŠETEČKA ZELtNy ČVOPČÍK\ KALENSKY APARTNEŘI

120 0/Praha 2, Hálkova 2\ /peská republika

........... PiWKi?

Claims (8)

1. PATENTOVÉ

   1. Způsob zjištění vazby prvého clena ns druhého

   Člena liganclového páru, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně a) spojení sady prvých značených členů s biologickým vzorkem, který může obsahovat jeden či více druhých členů za podmínek a po dobu dostačující k dosažení vazby prvého člena na druhého člena, kdeže uvedený značená složka je korelativní s příslušným prvým členem a zjistitelná nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometričky, oddělí se vázané prvé a druhé členy od členů nevázaných, odštěpí se uvedená značená složka ze značeného prvého

   b) oddělí c) odštěpí člena, d) zjistí metrií uvedené
2. 2.

   e uvedená značená složka nefluorescenční spektrometrií nebo potenciometricky a tím se stanoví vazba prvého uvedeného člana na uvedeného druhého Člena.

   Způsob podle nároku,!, vyznačující se tím, že uvedené prvé členy jsou vázány na pevném nosiči.
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že obsahuje následně ke stupni dělení vázaných prvých a druhých členů vymývání nevázaných členů z uvedeného pevného podkladu.
4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zjištění značené složky se provede hmotnostní spektrometrií, infračervenou nebo ultrafialovou spektrometrií, nebo potenciostatickou—amperometrií. · ’ '
5. 5. Způsob podle nám o ku 1, vyznačující se tím, že se kombinuje více než 4 značených prvých členů, přičemž každá značená složka je jednotná pro zvolený fragment nukleové kyseliny.

   β · «

   -1816. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se uvedené -vázané prvé a druhé cleny oddělí od nevázaných členů postupem, zvoleným ze skupiny, kterou tvoří gélová elektroforeza, kapilární elektroforeza, milíř oka nálková elektroforeza, vysokotlaková kapalinová chromátografie, velikostně exkluzní chromatografie a filtrace.

   7· způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, uvedené značené prvé členy štěpí postupem, zvoleným ze ze se skupiny.

   kterou tvoří oxidace, redukce, labilita v kyselém či alkalickém prostředí, postupy enfcymové, elektrochemické, tepelné a založené na fotolabilite.

   8. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se uvedená značená složka zjistí průletovou hmotnostní spektrometrií, quadrupolní hmotnostní spektrometrií, magnetickou sektorovou hmotnostní spektrometrií a elektrickou sektorovou hmotnostní spektrometrií.

   C,

   J ·

   Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se uvedená značená složka zjistí potenciostatickou amperometrií za použití detektorů ze skupiny, kterou tvoří coulometrické a ampérometrické detektory.

   10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se stupně b), c) a d) provádějí kontinuálně.

   Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že

   b), c) a d) provádějí kontinuálně za použití jediného

   11.

   se stupně zařízení.

   12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že se’ stupně b), c) á d) provádějí automatizovaným postilpěm.

   13. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako uvedený prvý člen používá molekula nukleové kyseliny.

   14. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako uvedený druhý člen používá molekula nukleové kyseliny.

   15. Způsob podle nároků 13 nebo 14, vyznačující se tím, že se používá uvedená molekula nukleové kyseliny, generovaná extenzí priméru.

   16. Způsob podle nároků 13 nebo 14, vyznačující se tím, ··· · · • · · «· »·

   -182 že se uvedená nukleová kyselina generuje z oligonukleovidových primérů bez značení , v polohách 3'.

   17. Způsob podle nároků 13 nebo 14 že se uvedená nukleová kyselina generuje ze nukleotidového terminátoru.

   vyznačující se tím, značeného óidesoxy18. Způsob podle nároků 13 še se jako uveden;/ prvý člen použije nic ká mo1e kula .

   nebo 14, vyznačující se tím, protein, hormon nebo orga19, Způsob podle nároku 18, se použije uvedený protein ze skupiny a receptor;/· .....

   vyznačující se tím, že , kterou tvoří antilátky

   20. Způsob analyzování šablon genových expresí ze zvoleného biologického vzorku, vyznačující se tím, že obsahuje stupně

   a) vynětí nukleových kyselin z biologického vzorku,

   b) spojení uvedených vyňatých nukleových kyselin s jedním či více zvolených vzorků značených nukleových kyselin, to za podmínek a po dobu dostačující k tomu, aby došlo k hybridizací uvedených vzorků na uvedené nukleové kyseliny, kdeže uvedená značená složka je korelativní s odpovídajícím vzorkem nukleové kyselina a zjistitelná nefluorescenční spektrometrií nebo pope nciome tričky ,

   c) oddělí se hybridizované vzorky od něhybridizovanýxh,

   d) odštěpí se značená složka z uvedeného značeného fragmentu, a

   e) zjistí se uvedená značená složka nefluoreskující spektrometrií nebo potenciometričky, _a odtud se odvodí šablona genové exprese uvedeného biologickéíl.

   Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že uvedený biologický vzorek se volí se skupiny, kterou tvoří savčí buňky, bakterie s kvasinky.

   22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že uvedené savčí buňky obsahují virusy.

   23. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že uvedená vyňatá nukleová kyselina se váže na pevná podklad.

   ·· ·· » · * · , * ··

   999 · ⁴ • · · « • » »·

   -18324. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že se jako uveden;/ pevný podklad použije polymer.

   25. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že dále obsahuje následně ke stupni dělení promývání pevného podkladu.

   26. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že se uvedené hybridizované vzorky dělí od něhybridizovaných vzorků postupem, zvoleným ze srupiny, kterou tvoří gélová elektroforéza, kapilární elektroforéza, mikrokanálková elektroforéza, vysokotlaková kapalinová chromatografíe, filtrace a pólyakrylamidová gélová elektroforeza.

   27. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že se uvedené značené vzorky štěpí' postupem, zvoleným ze skupiny, kterou tvoří oxidace, redukce, labilita v kyselém nebo zásaditém prostředí, postupy enzymové, elektrochemické, tepelné, a založené na fotolabilitě·

   28. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že se uvedená zbačená složka zjistí postupem, zvoleným ze skupiny, kterou tvoří průletová hmotnostní spektrometrie, qúadrupolní hmotnostní spektrometrie, magnetická sektorová hmotnostní spektrometrie a elektrická sektorová hmotnostní spektrometrie.

   29. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že se uvedená značená složka zjistí potenciostatickou amperometrií za použiti detektorů ze skupiny, kterou tvoří coulometrické a amperometrické detektory.

   30. Způsob poole nároku_.20,...vyznačuj ící se tím, že se stupně c), d) a e) provádějí kontinuálně.

   31. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že se stupně c), d a e) provádějí kontinuálně v jediném zařízeni.

   32.

   používané

   33.

   kde

   Způsob podle nároku 31, vyznačující se tím, že sařízení je automatizováno.

   Sloučenina obecného vzorce T^ms-L-X • · ♦ *

   -184má hmotnost ns z

   Τ' znamená organickou skupinu, zjistitelnou hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodíku a fluoru a případně atomy ze skupiny, kterou tvoří kyslík, síra, dusík, fosfor a jod,

   L znamená organickou skupinu, jež umožňuje části, obsahující T¹ odštěpit se od zbytku sloučeniny, kdeže část, obsabující T zahrnuje funkční skupinu, jež podporuje jediný ionizovaný nábojový stav, je-li sloučenina sledována hmotnostní spektrometrií a je zvolena ze skupiny, kterou tvoří terč.aminy, kvarterní _emoniové zbytky a organická kyselina,

   X je LiOI, ale jiná složka, než je fragment nukleové kyseliny, a sloučenina má hmotnost nejméně 250 daltonů.

   34. Sloučenina podle nároku 33, kde T^ms od 15 do 10 000 daltonů a mol.vzorec ^Gl'~500^Ii0-l00°0-l00^S0-10^P0-10ⁿ\^Σ<Γ > ^{lí<3e sou}čet <ί , a Čí je dostačující, aby uspokojil jinak nenasycené valence na atomech uhlíku, dusíku a kyslíku.

   ms —

   35. Sloučenin·.» podle nároku 33, kde T a h jsou spolu vázány dohromady funkční skupinou, zvolenou ze skupin: amidové, esterové, etherové, aminové, sulfidové, thioesterové, disulfidické, thioetherové, močovina, thiomočovina, karbamáty, thiokarbamáty, Schiff-ovy báze, redukované Schiff-ovy báze, kmíny, oximy, hydrazony, fosfáty, fosfonáty, fosforamidy, fosfonamidy, sulfonáty, sulfonamidy a vazba uhlíku na uhlík.

   36. Sloučenina podle nároku 35, kde funkční skupina je zvolena, ,z,,amidů, esterů, aminů, močoviny a karbamátu.—

   37. Sloučenina podle nároku 35, kde L je zvolena ₇enz, ze skupiny, kterou tvoří ΐΛ^ν, ³, L^zás elk

   L L‘'a L^ss , kde aktinické záření, kyseliny zásady, postupy oxidační, redukční, enzymové, elektrochemické, tepelné a thiolová výměna způsobuje, že se část obsahující T¹¹¹³ může odštěpit od zbytku molekuly.

   fc • fc ··

   -18538.

   D-D-I³, ' ^ · '1 z *1V

   Sloučenina podle nároku 37, kde 1/ má vzorec 2 kde L je molekulární fragment, který absorbuje aktinické záření k podpoře odštěpení T^ms znamena j í nickou část, kde L od X, a i¹ i I?

   vzájemně nezávisle přímou vazbu nebo nějakou orgaodděluje L² od T^ms,
6. 6'd X, přičemž žádná ze skupin ±Λ ani L³ a L³ odděluje L²

   L^1- aktinické záření.

   39. Sloučenina podle nároku 38, se neštěpí, absorbuje-li

   2 3 kde li -1 má vzorec d

   kde jeden uhkíkový atom v polohách a, b, c, d nebo e je substituován skupinou -L^-X a případně jedna či více z poloh b, c, d nebo e je substituována skupinou alkylovou alkoxylovou, fluorem, chlorem, skupinou hydroxylovou, karboxylovou nebo amidovou, a p3 znamená vodík nebo hydrokarbylovou skupinu.

   40.

   2 2 -^-R- a R bQd chrání

   Sloučenina podle nároku 33, kde znamená skupinu znamená skupinu hydroxylovou, nebo skupinu, jež nebo aktivuje karboxylovou skupinu k navázání se na jinou část.

   41. Sloučenina podle nároku 38, kde L znamená bud přímou vazbu nebo skupinu hýdrokarbýlěňóvouý’ -OShýdřokarbylenovou a hydrokarbyien-(O-hydrokarbylenovou) -H a n znamená celé kladné číslo od 1 do 10.

   42. Sloučenina podle nároku 33, kde

   -L-X má vzorec

   9 99

   99 9 9 ⁴ • · 9 ·

   -186 kde jedna či vícd z poloh b, c, d nebo e je substituována vodíkem, skupinou alkylovou či alkoxylovou, fluorem, chlorem, skupinou hydroxylovou, karboxylovou nebo amidovou, a R^P znamení vodík nebo hydro karbylovou skupinu.

   43.

   Sloučenina codl nároku 33, kde ?

   yt>

   r,ms vzorec

   Ϊ -ÍJ-T-0 Ii kde ϊ⁴· je organická částice, tvořená z uhlíku a jod noho či více atomů vodíku, fluoru, jodu, kyslíku, dusíku, síry .a fosforu s • -^z η ^f;

   hmotnosti 13 az 500 daltonů,

   T je organická částice, tvořená z uhlíku a jedno či více atomů vodíku, fluoru, jodu, kyslíku, dusíku, síry a fosforu s hmotností 50 až 1000 daltonů,

   J znamená přímou vazbu, nebo funkční skupinu, jako je amidova, esterová, aminová, sulfidová, etherová, thioesterová, disulfidická, thioetherová, močovina, thiomoČovina, skupina karbamátová, thiokarbamátová, Schiff-ova báze, redukovaná

   Schiff-ova báze, iminová, oximová, hydrazonová, fosfátová, fosfonátová, fosforamidová, fosfonamidová, sulfonátová, sulfonamidická nebo vazba uhlíku na uhlík, a n znamená celé kladné číslo od 1 do 50 a pokud je n 3 vetší než 1, pak se volí každé I a J zcela nezávisle.

   2 ,

   44. Sloučenina podle nároku 43, kde T se volí ze skupiny, kterou tvoří skupiny hydrokarbylové, hydrokarbyl-Ohy d r o ka r by 1 e n o v é, hy d r o ka r b y 1 - 3 - hy d r o ks r by 1 e n o v é, hy d r o ka r by 1 NH-hy dr o kar by1enové, hy dro kar by1-amid o-hyd r o kar by 1 e n o vé, h-(hyd.rokarbyl)hydrokar bylenové, N,N-di-( hydro kar byl) hy-dr o kar by le nové May d-r o kar by lacy 1-hy dr -o kar by le novéhe t er o cy k lylhydrokarbylové, kde heteroatom či heteroatomy jsou zvoleny ze skupiny kyslík, dusík, síra a fosfor, substituované hetero, cyklyIhydrokarbylové, kde heteroatom či heteroatomy jsou zvoleny i ze skupiny kyslík,dusík, síra a fosfor a substituenty jsou zvoleny z řady hydrokarbylových, hydrokarbyl-O-hydrokarbylenových, hydrokarbyl-NH-hydrokarbylenových, hydrokarby1-3-hydrokarbylenových, N-(hydrokar byl)-hydro kar by lenových, Ν,Κ-ά^-ζ hydrokar byl) • · · ·· · · · • · « • · · ·

   -187hydrokarbylenových a hy d r o ka r b y 1 a c y 1 - h y d r o k a r b y lenových tuentů, jakož i deriváty kteréhokoli z předchozích, kde či více vodíků je nahrazen stejným počtem fluorů.

   -,3 substijeden

   Sloučenina podle nároku 43, kde T' rm vzorec

   -G(R^C)~, kde G znamená alkylenovou skupinu s jedním až šesti 2 2 atomy uhlíku s jediným substituentem R , a R je substituent ze skupiny, kterou tvoří seskupení alkylové, alkenylové, alkinylové, cykloalkylové, arylenanelované cykloalkylové, cykloalkenylová, arylové, aralkylové, arylensubstituované alkenylové či alkinylové, ' cykloalkylsubstituované alkylové, cykloalkenylsubstituované cykloalkylové, biarylové, alkoxylové, alkenoxylové, alkinoxylové, aralkoxylové, arylsubstituované alkenoxylcvé nebo alkinoxylové, alkylamino-, alkenylamino- nebo alkinylamino-, dále arylsubstituované alkylamino-, arylsubstituované alkenylaminoči alkinylamino-seskupění, aryloxylová skupina, arylaminoskupina, K-alkylmočovinou substituovaná alkylová skupina, K-arylmočovinou dubstituovaná alkylová skupina, alkylkarbonylaminosubstituovaná alkylová skupina, aminokarbonylsubstituovaná alkylová skupina, skupina heterocyklylová, heterocyklylsubstituovaná alkylová, heterocyklylsubstituovaná aminoskupina, kar boxyalkyIsubstituováná aralkylová skupina, oxokarbocyklylanelovaná arylová a heterocy kly la lilová skupina, cykloalkenylová, arylsubstituovaná alkylová a aralkylová, hydroxysubstituovaná alkylová, alkoxysubstituovaná alkylová, aralkoxysubstituovaná alkylová, alkoxysubstituovaná alkylová, aralkoxysubstituovaná alkylová, aminosubstituovaná alkylová, (arylsubstituovaná alkyloxykarbonylamino)-substituovaná alkylová,. thiolsubstikuovaná .alkylová, slky.lsulf.ony..lsubs.tit.uov.aná . . .. alkylová, (hydroxysubstituovaná alkylthio)-substituovaná alkylová, thioalkoxysubstituovaná alkylová, hydrokarbylacylaminosubstithovaná alkylová, heterocyklylacylaminosubstituovaná alkylová, heterokarbyIsubstituovaná-heterocyklylacylaminosubstituováná alkylová, alkylsulfonylaminosubstituovaná alkylová, arylsulfonylaminosubstituovaná alkylová, morfolinoalkylová, thiomorfolinoalkylová morfolino-karbonylsubstituovaná alkylová, thiomorfolinokarbonylsubstituovaná alkylová, (l'í-(alkyl, alkenyl či alkinyl)- nebo Η,ΙΪ• 0

   0· » ·0 » ·

   00 0 0 • · • · » · · «

   -188•Λ [dialkyl, dialkenyl, dialkinyl nebo (alkyl, alkenyl)»aminoj-karbonyl-substituovaná alkylová, heterocyklylaminokar bony lová, heterocyklylalkýlenáminokarbonylové, heterocyklylaminokarbony 1-substituovaná alkylová, heterocyklylalkylenaminokarbony1substituovaná a 1 ky 1 o v á, 1:, ΪΪ - (d i a 1 ky 1 ú- a 1 ky 1 e na m i n o ks. r b o ny 1 o v á, lí, ΙΪ- (d ia 1 ky 1) - a 1 ky 1 e na mi no ka r b o ny 1- s u b s t i t uo va n á a 1 ky 1 o v á, alkyl-substituovaná heterocyklyIkarbonylová, alkyl-substituovaná heterocyklylkarbonyl-alkylová, karboxyl-substituováná alkylová, dialkylamino-substituova ná acylaminoalky1o vá a aminokyselinové postranní řetězce, odvozené od argininu, asparaginu, glutsminu,

   5-methylcysteinu, methioninu a odpovídajících sulfoxidů a sulfonť jako deriváty předchozích, dále glycinu, leucinu, isoleucinu, allo-isoleucinu, terv.-leucinu, norleucinu, fenylalaninu, tyrosinu, tryptofanu, prolinu, aleninu, ornithinu,. histidinu, glutaminu, valinu, threoninu, šeřinu, kyseliny asparagové, p -kyanalaninu a allothreoninu; alynyl a heterocyklylkarbonylove, aminokarbonylové, amidové, monp- nebo dialkylaminokarbonylové, mono- a diarylaminokarbonylové, alkylarylaminokarbonylové, diarylaminokarbonylové, mono- nebo diacylaminokarbonylové, aromatické nebo alifatické acylové, alkylové, případně substituované substituenty, zvolenými ze skupin aminové, karboxylové, hydroxy love,' merkoptoskupiny, můno- nebo dialky .lamino-, mono- nebo diarylamino-, alkylarylamino-, diarylamino-, mono nebo diocylaminoskupin, alkoxylových, alkenoxylových, aryloxylových, tgioalkoxylových, thioalkenoxylových, thioalkinyloxylových, thioaryloxylových _r heterocykl-lo^ých.

   Sloučenina nodle nároku 33 vzorce amid

   I (CH?)

   2'c il

   G_

   X • φ • Φ ·· • · * φφ ·· ft ♦ ♦ ·

   I · ·· ·· · φ « φ φ « • Φ ··

   -189kde

   G znamená skupinu (CLy)^^, kde 3^Θάθ^η ξ vodíků skupiny methylenové je nahrazen skupinou -(Cíh,) -amido-T^

   T a T * jsou organické částice vzorce kde součet ol a je dostačující, aby uspokojil jinak nena) sycené vazby na atomech uhlíku, dusíku a kyslíku, amid znamená skupinu kde R' ;n$ il ;mená vodík nebo nebo alkylovou skupinu s jedním až deseti atom?/ uhlíku, c je celé kladné číslo od 0 do 4

   X má významy, jak byly uvedeny v nároku 1, a n je celé kladné číslo od 1 do 50 a to tak, že je-li n vetší než 1, volí se G, c, amid, R' a vzájemně nezávisle.

   47.

   Sloučenina podle nároku 33 vzorce amid l

   kde Τ'³ je organická částice vzorce Οη5^0-9^0-9^lf⁵ * kde součet Áa p>js dostačující k uspokojení jinak nenasycených vazeb na atomech uhlíku, dusíku a kyslíku a 5

   T znamená terč.amin, nebo kvarterní amoniovou skupinu či organickou kyselinu, m pak je celé kladné číslo od 0 do 49.

   48.

   Sloučenina podle nároku 33 vzorce

   4 4

   4 4

   4 44

   44·4 <

   44 44

   -19044 44 m4 (|ElÍd) (CXk
7. 8 ¹

   XíA^·' ^v |1 m ll i

   amid trX

   3 z _z cde T znamená organickou částici vzorce l-25^±‘o-9°O-9^I'ⁱ ď X kde součet a je dostačující k uspokojení jinak nenasycených vazeb na atomech uhlíku, dusíku a kyslíku a znamená terč.-amin nebo kvart.amoniovou skupinu nebo karboxylovou organickou kyselinu a m je celé kladné číslo od 0 do 49

   49.

   Sloučenina podle kteréhokoli z nároků 47 a 48.

   kde seskupení -amid-T⁹ se zvolí z následujících •^o-(c₂-Cio-N(Ci-Ci_O5,

   -1ÍHC-(C_O-C ) 8

   XX u-(C₁-C₁₀) a

   -HH(y.(c₁-c₁₀-H

   50.

   kae seskupeni

   Sloučenina, podle kteréhokoli z nároků 47 a 48 í -amid-X se zvolí z následujících

   -™-(ο_Γο₁₀)ϋ ‘íi-ho’

   -191-CNH-(Co li c

   -CHH-(C,

   I» ¹

   61. Sloučenina podle nároku jež je důsledkem kondenzace některé s aminem sa vzniku sloučeniny vzorce

   43, kde má strukturu, ϊ dále uvedených kyselin

   1^-0(=0)-11-(^)-: kyselin?

   mravenči,octová, propionová,propiolová, fluoroctová, 2-butinová, cyklopropankarboxylová, máselná, methoxyoctová, difluoroctová,

   4- pentinová, cyklobutankarboxylová, 33-dimethylakrylová, valerová, •ϊ,Ν-dimethylglycin, ΐί-formyl-Gly-OH, kyselina ethoxyoctová, (methylthio)-octová, pyrrol-2-karboxylová, 3-furoová, isoxazol5- karboxylová, trans-3-hexenová, trifluoroctová, hexanová, Ac-Gly-0 kyselina 2-hydroxyT2Tmethylmáselná, benzoová, nikotinová, 2-pyrasinkarboxylová, 1-methy1-2-pyrrolkarboxylová, 2-cyklopěnten-1octová, cyklopentyloctová,. (3)-(-)-2vpyrrolidon-5-karboxylová, H-methyJL-L-prpJ-ln,. heptanpyá,.. Ac-b-Ala-QH, 2-ethyl-2-hy.droxy.má- selná, 2-(2-methoxyethoxy)-octová, p-toluová, 6-methylnikotinová, 5-methy1-2-pyrazinkarboxylová, 2,5-dimethylpyrrol-5-karboxylová, 4-fluorbenzoová, 3,5-dimethylisoxazol-4-karboxylcvá,

   3-cyklopentylpropionová, oktanová, N,N-dimethylsukcinaminová, fenylpropiolová, skořicová, 4-ethylbenzoová, p-anisová, 1,2,5-trimethylpyrrol-3-karboxylová, 3-í'luor-4-methylbenzoová, Ac-DL-propargylglycin, kyselina 3-(trifluormethyl)-máselná, 1-piperidin·· ·· » · · «

   I · ·· > · ·· • · · · 4 • · 4 ·· ··

   -192k · · « ·· ·· propionova, x-acetylprolin, 3,5-difluorbenzoová, Ac-L-Val-OH,

   Indol-2-karboxylová, 2-be nzofurankarboxylová, b.:nzotriazol-5karboxylová, 4-n-propylbenzoová, 3-dimethylaminobenzoová, 4-ethoxy benzoová, 4-(methylthio)-benzoová, N-(2-furoyl)'glycin, 2-(methylthio )-nikotinová, 3-rf luor-4-rme thoxy benzoová, Tfa-Gly-OH,

   2-naftoová, chinaldové, Ac-L-Ile-OH, 3-methylinden-2-karboxylová,

   2- chinoxylin kar boxy lová, l-methylindol-2-kar boxy levá, 2,3,6trifluorbenzoová, H-formyl-L-Ilet-OS, 2-|2-(2-methoxyethoxy)-ethoxy^-octová, 4-n-butylbenzoová, H-benzoylglyein,' 5-fluorindol-2kar boxy lová, 4-n-propoxy benzoová, 4-ačety1-3,5-dirne thyl-2-pyrrolkarboxylová, 3,5-dimethoxybenzoová, 2,6-dimethoxynikotinová, cyklohexanpentanová, 2-naftyloctová, 4-(lH-p?/rrol-l-yl)-benzoová, indol-3-propio.nová, m-trifluormethylbenzoová, 5-methoxyindol-2karboxylová, 4-pentylbenzoová, Bz-b-Ala-OH, 4-dimethylaminobenzoová,

   4-n-butoxybs nzoová, 3-w.e thy1-5-£rifluormethy1-3-isoxa sol-4-karboxylová, (3.,4-dimethoxyf«nyl)-octová, 4-biřenylkar boxy lová, Pivaloyl-Pro-OH, oktsnoyl-Gly-OH, (2-naftoxy)-octová, indol-3„máselná,

   4-(trifluormethyl)-fenyloctová, 5-methoxyindol-3-octová, 4-(trifluormethoxy)-benzoová, Ac-L—4pHe-0H, 4-pentyloxybenzoová, Z-Gly-OH, 4-kar boxy-H-(fur-2-yl)-methy.lpyrrolidin-2-on, 3,4-diethoxybenzoová,

   2.4- dimethy1-5-ethoxykarbonyl-pyrrol-3-kar boxylová, H-(2-fluorfenyl )-sukcinaminová, 3,4,5-trimethoxybenzoová, N-fenylanthranilové,

   3- fenoxybenzoová, honanoyl-Gly-OH, 2-fenoxypyridin-3-karboxylová,

   2.5- dimethyl-l-fenylpyrrol-3-karboxylová, trans-4-(trifluormethyl)-skořicová, (5-methyl-2-fenyloxyzol-4-yl)-octová, 4-(2-cyklohexenyloxy)-benzoová, 5-methoxy-2-methylindol-3-ootová, trans-4kotininkarboxylová, Bz-5-aminovalerová, 4-hexyloxybenzoová,_

   H-(3-methoxyfenyl)-sukeinaminová, Z-Sar-OH, 4-(3,4-dimethox_,fenyl)máselná, Ac-o-Fluor-DL-Phe-^OH,- ií-(4-fluorřenyl)-glutaramová,

   4 '-ethy1-4-bifenylkarboxylová, 1,2,3,4-tetrahydroakridinkarboxylová, 3-fenoxyfenyloctová, Ií—(2,4-difluorfenyl)-sukcinamová,

   II dekanoyl-Gly-OH, (+)-6-methoxy-Á'methyl-2-naftalenoctová, 3-(trifluormethoxy)-skořicová, H-formyl-DL-Trp-OH, (R)-(4)-«Ámethox-y-/ ~ (trifluormethyl)-fenyloctová, Bz-DL-Leu-OH, 4-(trifluormethoxy)fenoxyoctová, 4-heptyloxybenzoová, 2,3,4-trimethoxyskořicová, • ·
8. 9 9

   9 9 9 9

   9 9 99

   99 9 9 9

   9 9 9

   9 9 9 9 • · ·

   9 9 9

   9 99 99

   9 9

   999 9

   -1932,6-dimethoxybeηzoyl-Gly-OH, 3-(3,4,5-trinethoxyfenyl)-propionová, 2,3,4,5,6-P^Gntafluorfenoxyoctová, Π-(2,4-difluorfenyl)glutaramova, N-undekanoyl-Gly-OH, 2-(4-fluorbenzoyl).benzoová,

   5-trifluormethoxyindol-2-karboxylová, H-(2,4-difluorfenyl)-diglykolamová, Áv-L-Trp-OH, Tfa-L-fenylglycin-OH, 3-jod benzoová,

   3- (4-n-pentylbenzoyl)-propionová, 2-feny1-4-chinolinkarboxylová,

   4- oktylbsnzoová, Bz-L-ÍIet-OH, 3,4,5-triethoxybenzoová, B-lauroylGly-OH, 3,5-bis-(trifluormethyl)-benzoová, Ác-5-methyl-DL-Trp-OK,

   2-jodfenyloctová, 3-jod-4-methylbensoová, 3-(4-n-hexylbenzoyl)propionová, K-hexanoyl-l-řhe-OH, 4-nonyloxybenzoová, 4^z-(trifluormethyl)-2-bifenylkarboxylová, Bz-L-Phe-OH, N-tridekanoylGly-OH,' *3,5-bis-(trifluormethyl)-fenyloctová, 3,(4-n-heptylbenzoyl)-propionová, H-heptanoyl-L-řhe-OH, 4-decyloxybsnzoová,

   -trifluor-n-tolyl)-anthrenilová, niflumová, 4-(2-hydroxyhexafluorisopropylbenzoová, N-myristoyl-Gly-OE, 3-(4-n-oktylbenzoyl)-propionový, N-oktanoyl-L-Bhe-OK, 4-undecyloxybensoová,

   3t(3,4,5-trimetho^yfenyl)-propionyl-G-y-OH, 8-jodnsftoová,

   N-pe n-tadeka noyl-Gly-OH, 4-dodecyloxybjenzoová, 1'5-palmitoyl-Gly-OR, a N-stearoyl-Gly-OH.

   52. Sloučenina podle nároku 33, kde 1Č0I je část, zvolená ze skupiny proteinů, pptidů, oligoéacharidů, antilátek, antigenů, léků a syntetických organických molekul.

   53. Komnozice obsahující pár sloučenin vzorce

   T^ms-L-nOI

   T._ znamená orgabic^kou^ skupinu,_ zjistitelnoi^hmotnostni sp ektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodíku a fluoru, případně atomy ze skupiny kyslík, dusík, síra, fosfor a jod,

   1 znamená organickou skupinu, jež umožňuje části, obsahující T^má odštěpit se od zbytku sloučeniny, kdeže část, obsahující T^ms obsahuje funkční skupinu, jež podporuje jediný ionizační nábojový stav, je-li sloučenina sledována hmotnostní spektrometrií a je zvolena ze skupiny terč.-aminů, kvart.amoniových zbytků a organických kyselin,

   KOI znamená fragment nukleové kyseliny, kde L je napojeno ·· ·· • · «

   I · ··

   -194na MOI jakkoli jinak, než 3 -koncovkou MOI, a sloučeniny uvedeného páru nemají totožné skupiny T^ms a mají totožné sekvence s výjimkou polohy jedné báze, kde právě tyto báze nejsou totožné.

   Κοποοζιοβ obsahující pár sloučenin vzorce

   T^mS-l-L'OI kce

   T znamena organickou skupinu, zjistitelnou hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z. atomů vodíku a fluoru a připadne další atomy se skupiny kyslík dusík, síra, fosfor -a jod,

   1 znamená organickou skupinu, jež umož nuje Části, obsahující T^ms odštěpit se od zbytku molekuly, kdeže část, obsahující zahrnuje funkční skupinu, jež podporuje jediný ionizační nábojový stav, je-li sloučenina sledována hmotnostní spektrometrií a je zvolena ze skupiny terč.-aminů, kvartér nich amoniových skupin a organických kyselin,

   MOI znamená fragment nukleové kyseliny, kde L je skupina vázaná na MOI v jakékoli jiné poloze, než je 3'-koncovka MOI, a sloučeniny páru mají netotožné skupiny T“ a totožné sekvence s výjimkou poloh dvou bází, kde náze nejsou totožné.

   55. Kompozice podle nároků 53 nebo 54, obsahující vetší počet uvedených párů.

   56. Kompozice podle kteréhokoli z párů 53 nebo 54, obsahující větší počet párů a stejné množství beidentických nukleových kyselin,' Zmobilizovaných kiá⁼pevněm” pohklacÍu, kde každý člen většího množství nukleových kyselin má sekvenci báze, jež je přesně komplementární k jednomu z členů každého z párů.

   57. Kompozice obsahující větší počet sloučenin vzorce

   T^ms-L-Xkde ms z z

   Τ' je organická skupina, zjistitelná hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík, nejméně jeden z atomů vodila; a fluoru a případně • 9 ·· • · · · • · ·· • · · · • · · 4 ·♦ ··

   -195další atomy ze skupiny kyslík, dusík, síra, fosfor a jod,

   L znamená organickou skupinu, umožňující části s obsahem T^ES odštěpit se od zbytku molekuly, kdeže část, obsahující T^ms zahrnuje funkční skupinu, podporující jediný ionizovaný nábojový stav, je-li sloučenina sledována hmotnostní chromatografií a je zvolena ze skupiny ter.-aminů, kvart.amoniových zbytků a karboxylových &selin,

   X znamená UOI s vyloučením fragmentu nukleové kyseliny znamená nejméně 4 sloučeniny, mající neidentické a větsx ppcez skupiny T^ras.

   58.

   nejméně 10.

   59.

   οζιαΓ

   Kompfcá-e-e podle nároku 57, kde větší počet činí

   Sestava (kit) pro mutační analýzu, obsahující větší počet zásobníčků s obsahem páru sloučenin vzorce

   T^ns-L-M0I kde

   T^ms znamená organickou skupinu, zjistitelnou hmotnostní spektrometrií, obsahující uhlík a nejméně jeden z atomů vodíku a. fluoru a případně atomy ze skupiny kyslík dusík, síra, fosfor a jod,

   L znamená organickou skupinu, jež umožňuje části, obsahující T^ras odštěpit qe od zbytku molekuly, kdeže část, obsahující T^ras zahrnuje funkční skupinu, jež podporuje jediný ionizační nábojový stav, je-li sloučenina sledována hmotnostní spektrometrií a je zvolena ze skupiny terč.“aminů, kvart.amoniových zbytků a organických kyselin, a KOI znamená fragment’ nukleové kyseliny, kde Ir je*skupina --·-— navázána na MOI kdekoli jinde, než na 3 -koncovce MOI, a to tak, že každý már má neidentické skupiny T¹ a má totožné sekvence s výjimkou poloh jedné nebo dvou bází, kdeže báze nejsou totožné.

   60. Sestava (kit) podle nároku 59, kde větší počet znamená nejméně 3

   6l. Sestava (kit) podle nároku 59, kde větší počet znamená nejméně 5 společná ařvokátNí kancelář

   VŠETEČKA ZÉLEniX^yORČÍK KALENSKÝ