CN112240915B - 一种5-氨基-1h-1,2,4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及高效液相色谱检测技术领域,公开了一种5‑氨基‑1H‑1,2,4‑三氮唑‑3‑羧酸的高效液相色谱检测方法,包括:1)称取5‑氨基‑1H‑1,2,4‑三氮唑‑3‑羧酸样品并将其添加至硫酸水溶液中,超声震荡,使样品溶解至无色透明,得到样品溶液;2)取样品溶液用流动相稀释定容,超声处理;所述流动相为0.18‑0.22wt%的戊烷磺酸钠溶液和乙腈的混合溶液;3)对步骤3)所得溶液自动进样,进行高效液相色谱检测,获得结果。本发明采用高效液相色谱法对产品进行定量检测,具有灵敏度高、快速分离、准确定量,分离度良好、检测时间短等优点,克服了滴定分析不准确的缺点,所得到的峰形好,样品线性好。
Description
技术领域
本发明涉及高效液相色谱检测技术领域,尤其涉及一种5-氨基-1H-1,2,4-三氮唑-3- 羧酸的高效液相色谱检测方法。
背景技术
5-氨基-1H-1,2,4-三氮唑-3-羧酸是合成抗病毒药物利巴韦林的一个重要的中间体。目前国内对其含量的主要分析方法有以下几种:
(1)针对其氨基采用高氯酸滴定法。其步骤和原理为:
步骤:精确称取5-氨基-1H-1,2,4-三氮唑-3-羧酸0.1g,加冰乙酸30mL,加热回流至溶解,冷却到室温。加α-萘酚苯甲醇指示剂2滴,用0.1mol/L高氯酸滴定至显绿色即为终点。同时做空白校对。(每1mL高氯酸相当于12.8mg环合物)。
原理:产品中含有氨基和羧基,溶解在冰乙酸中时显示碱性较多,可以用高氯酸滴定检测含量。
(2)针对其羧基采用的盐酸的滴定法。其步骤和原理为:
步骤:称取样品置于烧杯中,用移液管移取氢氧化钠标准溶液,加热使之完全溶解,静置 45min,加入酚酞指示剂,用0.1mol/L的盐酸溶液滴定至红色褪去,记录数据,同时做空白试验,同时记录消耗盐酸的体积。
总体来说,由于5-氨基-1H-1,2,4-三氮唑-3-羧酸难以溶于大部分的溶剂,所以现有技术中都采用了滴定的方法。但由于滴定试剂准确度和5-氨基-1H-1,2,4-三氮唑-3-羧酸中影响滴定的杂质基团的影响,造成含量或多或少存在偏差影响后续产品的质量控制。因此有必要开发出一种精准性更好的新检测方法。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种5-氨基-1H-1,2,4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法,本发明采用高效液相色谱法对产品进行定量检测,具有灵敏度高、快速分离、准确定量,分离度良好、检测时间短等优点,克服了滴定分析不准确的缺点,所得到的峰形好,样品线性好。
本发明的具体技术方案为:一种5-氨基-1H-1,2,4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法,包括以下步骤:
1)称取5-氨基-1H-1,2,4-三氮唑-3-羧酸样品并将其添加至硫酸水溶液中,超声震荡,使样品溶解至无色透明,得到样品溶液。
2)取样品溶液用流动相稀释定容,超声处理;所述流动相为0.18-0.22wt%的戊烷磺酸钠溶液和乙腈的混合溶液。
3)对步骤3)所得溶液自动进样,进行高效液相色谱检测,获得结果。
本发明首先对样品进行衍生化,然后再进行高效液相色谱,在特定的检测条件下,本发明方法的可重复性好,保证了产品的准确定性定量。
本发明衍生化的原理为利用硫酸将产品制成硫酸盐,使其易溶于以水相为主的流动相中,其他含有氨基的杂质也可以生成硫酸盐,在色谱柱内进行分离。
本发明选个限定流动相组成,本发明选择戊烷磺酸钠溶液和乙腈作为流动相的原因在于:根据本发明团队的大量实践结果,使用戊烷磺酸钠溶液和乙腈体系做为流动相,可以使样品的保留时间比较好,产品出峰时间不会太晚,也不会太早,并且和杂质具有较好的分离度。
作为优选,步骤1)中,所述硫酸水溶液的浓度为0.08-0.12N,所述样品与硫酸水溶液的用量比为23-27mg/10mL。
本发明选择硫酸水溶液并严格限定上述参数,其原因在于,本发明团队在实践中发现,若使用其他酸的水溶液难以使样品的衍生化,且在流动相中的溶解度不好,容易造成色谱柱堵塞。限定硫酸浓度是为了使样品的pH值满足色谱柱的pH值要求。PH值太低容易损坏色谱柱,太高使得产品出峰拖尾,含量检测不准确。
作为优选,步骤1)中,超声震荡时间为3-7min。
作为优选,步骤2)中,将样品溶液用流动相稀释定容至原体积4-6倍。
作为优选,步骤2)中,超声时间为30sec-3min。
作为优选,步骤2)中,所述戊烷磺酸钠溶液的制备方法为:取戊烷磺酸钠,加水溶解后用磷酸溶液调节pH值至1.8-2.2。
若pH值太低容易损坏色谱柱,若pH太高则使得产品出峰拖尾,含量检测不准确。
作为优选,步骤2)中,所述戊烷磺酸钠溶液与乙腈的体积比为(96-98)∶(2-4)。
本发明限定上述参数范围的原因是,本发明团队发现若体积比过高,流动相极性太大,出峰过早,容易受基线波动干扰,造成检测不准确。若过低,流动相极性较弱,出峰时间太长,浪费时间。
作为优选,步骤3)中,自动进样量为5-20μL。
作为优选,步骤3)中,高效液相色谱检测所采用的仪器型号为Waters 2695;GC柱子规格为ODS-C18,5um,4.6*250mm;检测器型号为PDA996。
作为优选,步骤3)中,检测波长为204nm;流速为0.8-1.2mL/min;柱温30-35℃;运行时间为13-17min。
虽然本发明进行了衍生化以及采用HPLC,但是若要实现更高的精准性、灵敏性,同时需要严格控制HPLC的检测条件。
本发明将流速控制在0.8-1.2ml/min,过高会导致出峰较早,杂质和产品的分离度下降。过低会导致产品出峰拖尾,峰宽变大,出峰时间太长。本发明将柱温控制在30-35℃,过高,容易造成流动相在色谱柱内产生气泡,影响出峰稳定性。过低,会导致产品在流动相中析出,长时间会导致色谱柱堵塞。
与现有技术对比,本发明的有益效果是:本发明采用高效液相色谱法对产品进行定量检测,具有灵敏度高、快速分离、准确定量,分离度良好、检测时间短等优点,克服了滴定分析不准确的缺点,所得到的峰形好,样品线性好。
附图说明
图1为实施例1检测所得谱图;
图2为实施例2中不同进样量所得谱图峰型;
图3为实施例2中进样量与峰面积对应图;
图4为实施例3检测所得谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
具体检测方法:
仪器:Waters 2695
GC柱子规格:C18 5um,4.6*250mm
检测器:PDA996
流动相:以0.18-0.22戊烷磺酸钠溶液(取戊烷磺酸钠,加水1000mL溶解后用磷酸溶液调节pH值至1.8-2.2)-乙腈(96-98∶2-4)为流动相;
检测波长:204nm;
流速:0.8-1.2mL/min
柱温:30-35℃
制样:精密称定23-25mg样品加入10mL的0.08-0.12N的硫酸水溶液中,超声震荡3-7mins,样品溶解至无色透明,取2mL样品溶液用流动相定容至10mL,超声30sec-3min,进样5-20μL,运行13-17mins。
实施例1
精密称定25mg标准品加入约10mL的0.1N的硫酸水溶液中,超声震荡5min,样品溶解至无色透明,取2mL样品溶液用流动相定容至10mL,超声1min,自动进样10μL。以0.2%戊烷磺酸钠溶液(取戊烷磺酸钠2.0g,加水1000mL溶解后用磷酸溶液调节pH值至2.0)-乙腈(97∶ 3)为流动相,柱子:ODS-C18,柱温:30℃,流速1.0mL/min,运行15min,保留时间为:3.93min。检测结果详见图1。
实施例2
精密称定25mg标准品加入约10mL的0.1N的硫酸水溶液中,超声震荡5min,样品溶解至无色透明,取2mL样品溶液用流动相定容至10mL,超声1min,分别自动进样5PL,10μL,15μL, 20μL,以0.2%戊烷磺酸钠溶液(取戊烷磺酸钠2.0g,加水1000mL溶解后用磷酸溶液调节pH 值至2.0)-乙腈(97∶3)为流动相,柱子:ODS-C18,柱温:30℃,流速1.0mL/min,运行15mins,保留时间为:3.93min。如图2所示,不同进样量谱图峰型一致,且如图3所示,进样量和峰面积成正比,说明在5-20μL的进样量均可用于分析。
实施例3
精密称定25mg标准品加入约10mL的0.1N的硫酸水溶液中,超声震荡5min,样品溶解至无色透明,取2mL样品溶液用流动相定容至10mL,超声1min,自动进样10μL。以0.2%戊烷磺酸钠溶液(取戊烷磺酸钠2.0g,加水1000mL溶解后用磷酸溶液调节pH值至2.0)-乙腈(97∶ 3)为流动相,柱子:ODS-C18,柱温:35℃,流速分别设定为0.8mL/min,1.0mL/min,1.2mL/min。运行15min,如图4所示,不同流速出峰形态一致。含量一致,保留时间分别为:4.82min,3.93min,3.20min。说明保留时间随流速增加而有所提前。
精准性对比
针对同一待检样品,分别采用本发明方法与背景技术中提及的滴定法进行测试,结果如下:采用本发明方法:采用本发明方法,对市购的标准品(含量99.8%)进行检测,检测含量为 99.78%。
采用高氯酸滴定法:精确称取本品0.1g,加冰乙酸30mL,加热回流至溶解,冷却到室温。加α-萘酚苯甲醇指示剂2滴,用0.1mol/l高氯酸滴定至显绿色即为终点。同时做空白校对。测定使用高氯酸检测三次,最后检测含量为:100.48%采用盐酸滴定法:精确称取样品0.15g置于烧杯中,用移液管移取0.1mol/L氢氧化钠标准溶液,加热使之完全溶解,静置45mins,加入酚酞指示剂,用0.1mol/L的盐酸溶液滴定至红色褪去,记录数据,同时做空白试验,平行滴定三次,同时记录消耗盐酸的体积。最后测得含量为98.9%。
通过上述对可知,本发明方法的检测结果与标准品含量99.8%的结果更为接近,并且与两种滴定法相比,取得了显著的进步。
本发明中所用原料、设备,若无特别说明,均为本领域的常用原料、设备;本发明中所用方法,若无特别说明,均为本领域的常规方法。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明作任何限制,凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换,均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (7)
1.一种5-氨基-1H-1,2,4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法,其特征在于包括以下步骤:
1)称取5-氨基-1H-1,2,4-三氮唑-3-羧酸样品并将其添加至硫酸水溶液中,超声震荡,使样品溶解至无色透明,得到样品溶液;
2)取样品溶液用流动相稀释定容,超声处理;所述流动相为0.18-0.22wt%的戊烷磺酸钠溶液和乙腈的混合溶液;所述戊烷磺酸钠溶液的制备方法为:取戊烷磺酸钠,加水溶解后用磷酸溶液调节pH值至1.8-2.2;所述戊烷磺酸钠溶液与乙腈的体积比为(96-98):(2-4);
3)对步骤2)所得溶液自动进样,进行高效液相色谱检测,获得结果;所述高效液相色谱检测采用的仪器型号为Waters 2695;LC 柱子规格为ODS-C18,5μ m,4.6*250mm;检测器型号为PDA996。
2.如权利要求1所述的一种5-氨基-1H-1,2,4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法,其特征在于,步骤1)中,所述硫酸水溶液的浓度为0.08-0.12N,所述样品与硫酸水溶液的用量比为23-27mg/10mL。
3.如权利要求1或2所述的一种5-氨基-1H-1,2,4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法,其特征在于,步骤1)中,超声震荡时间为3-7min。
4.如权利要求1所述的一种5-氨基-1H-1,2,4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法,其特征在于,步骤2)中,将样品溶液用流动相稀释定容至原体积4-6倍。
5.如权利要求1或4所述的一种5-氨基-1H-1,2,4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法,其特征在于,步骤2)中,超声时间为30sec-3min。
6.如权利要求1所述的一种5-氨基-1H-1,2,4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法,其特征在于,步骤3)中,自动进样量为5-20µL。
7.如权利要求1所述的一种5-氨基-1H-1,2,4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法,其特征在于,步骤3)中,检测波长为204nm;流速为0.8-1.2mL/min;柱温30-35℃;运行时间为13-17min。
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