CN112240915A

CN112240915A - 一种5-氨基-1h-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法

Info

Publication number: CN112240915A
Application number: CN201910658599.0A
Authority: CN
Inventors: 林峰
Original assignee: Hangzhou Sft New Material Technology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Sft New Material Technology Co ltd
Priority date: 2019-07-19
Filing date: 2019-07-19
Publication date: 2021-01-19
Anticipated expiration: 2039-07-19
Also published as: CN112240915B

Abstract

本发明涉及高效液相色谱检测技术领域，公开了一种5‑氨基‑1H‑1，2，4‑三氮唑‑3‑羧酸的高效液相色谱检测方法，包括：1）称取5‑氨基‑1H‑1，2，4‑三氮唑‑3‑羧酸样品并将其添加至硫酸水溶液中，超声震荡，使样品溶解至无色透明，得到样品溶液；2）取样品溶液用流动相稀释定容，超声处理；所述流动相为0.18‑0.22wt%的戊烷磺酸钠溶液和乙腈的混合溶液；3)对步骤3）所得溶液自动进样，进行高效液相色谱检测，获得结果。本发明采用高效液相色谱法对产品进行定量检测，具有灵敏度高、快速分离、准确定量，分离度良好、检测时间短等优点，克服了滴定分析不准确的缺点，所得到的峰形好，样品线性好。

Description

一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法

技术领域

本发明涉及高效液相色谱检测技术领域，尤其涉及一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3- 羧酸的高效液相色谱检测方法。

背景技术

5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸是合成抗病毒药物利巴韦林的一个重要的中间体。目前国内对其含量的主要分析方法有以下几种：

(1)针对其氨基采用高氯酸滴定法。其步骤和原理为：

步骤：精确称取5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸0.1g，加冰乙酸30mL，加热回流至溶解，冷却到室温。加α-萘酚苯甲醇指示剂2滴，用0.1mol/L高氯酸滴定至显绿色即为终点。同时做空白校对。(每1mL高氯酸相当于12.8mg环合物)。

原理：产品中含有氨基和羧基，溶解在冰乙酸中时显示碱性较多，可以用高氯酸滴定检测含量。

(2)针对其羧基采用的盐酸的滴定法。其步骤和原理为：

步骤：称取样品置于烧杯中，用移液管移取氢氧化钠标准溶液，加热使之完全溶解，静置 45min，加入酚酞指示剂，用0.1mol/L的盐酸溶液滴定至红色褪去，记录数据，同时做空白试验，同时记录消耗盐酸的体积。

原理：产品中含有羧基，利用酸碱中和的原理。

总体来说，由于5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸难以溶于大部分的溶剂，所以现有技术中都采用了滴定的方法。但由于滴定试剂准确度和5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸中影响滴定的杂质基团的影响，造成含量或多或少存在偏差影响后续产品的质量控制。因此有必要开发出一种精准性更好的新检测方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法，本发明采用高效液相色谱法对产品进行定量检测，具有灵敏度高、快速分离、准确定量，分离度良好、检测时间短等优点，克服了滴定分析不准确的缺点，所得到的峰形好，样品线性好。

本发明的具体技术方案为：一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法，包括以下步骤：

1)称取5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸样品并将其添加至硫酸水溶液中，超声震荡，使样品溶解至无色透明，得到样品溶液。

2)取样品溶液用流动相稀释定容，超声处理；所述流动相为0.18-0.22wt％的戊烷磺酸钠溶液和乙腈的混合溶液。

3)对步骤3)所得溶液自动进样，进行高效液相色谱检测，获得结果。

本发明首先对样品进行衍生化，然后再进行高效液相色谱，在特定的检测条件下，本发明方法的可重复性好，保证了产品的准确定性定量。

本发明衍生化的原理为利用硫酸将产品制成硫酸盐，使其易溶于以水相为主的流动相中，其他含有氨基的杂质也可以生成硫酸盐，在色谱柱内进行分离。

本发明选个限定流动相组成，本发明选择戊烷磺酸钠溶液和乙腈作为流动相的原因在于：根据本发明团队的大量实践结果，使用戊烷磺酸钠溶液和乙腈体系做为流动相，可以使样品的保留时间比较好，产品出峰时间不会太晚，也不会太早，并且和杂质具有较好的分离度。

作为优选，步骤1)中，所述硫酸水溶液的浓度为0.08-0.12N，所述样品与硫酸水溶液的用量比为23-27mg/10mL。

本发明选择硫酸水溶液并严格限定上述参数，其原因在于，本发明团队在实践中发现，若使用其他酸的水溶液难以使样品的衍生化，且在流动相中的溶解度不好，容易造成色谱柱堵塞。限定硫酸浓度是为了使样品的pH值满足色谱柱的pH值要求。PH值太低容易损坏色谱柱，太高使得产品出峰拖尾，含量检测不准确。

作为优选，步骤1)中，超声震荡时间为3-7min。

作为优选，步骤2)中，将样品溶液用流动相稀释定容至原体积4-6倍。

作为优选，步骤2)中，超声时间为30sec-3min。

作为优选，步骤2)中，所述戊烷磺酸钠溶液的制备方法为：取戊烷磺酸钠，加水溶解后用磷酸溶液调节pH值至1.8-2.2。

若pH值太低容易损坏色谱柱，若pH太高则使得产品出峰拖尾，含量检测不准确。

作为优选，步骤2)中，所述戊烷磺酸钠溶液与乙腈的体积比为(96-98)∶(2-4)。

本发明限定上述参数范围的原因是，本发明团队发现若体积比过高，流动相极性太大，出峰过早，容易受基线波动干扰，造成检测不准确。若过低，流动相极性较弱，出峰时间太长，浪费时间。

作为优选，步骤3)中，自动进样量为5-20μL。

作为优选，步骤3)中，高效液相色谱检测所采用的仪器型号为Waters 2695；GC柱子规格为ODS-C18，5um，4.6*250mm；检测器型号为PDA996。

作为优选，步骤3)中，检测波长为204nm；流速为0.8-1.2mL/min；柱温30-35℃；运行时间为13-17min。

虽然本发明进行了衍生化以及采用HPLC，但是若要实现更高的精准性、灵敏性，同时需要严格控制HPLC的检测条件。

本发明将流速控制在0.8-1.2ml/min，过高会导致出峰较早，杂质和产品的分离度下降。过低会导致产品出峰拖尾，峰宽变大，出峰时间太长。本发明将柱温控制在30-35℃，过高，容易造成流动相在色谱柱内产生气泡，影响出峰稳定性。过低，会导致产品在流动相中析出，长时间会导致色谱柱堵塞。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明采用高效液相色谱法对产品进行定量检测，具有灵敏度高、快速分离、准确定量，分离度良好、检测时间短等优点，克服了滴定分析不准确的缺点，所得到的峰形好，样品线性好。

附图说明

图1为实施例1检测所得谱图；

图2为实施例2中不同进样量所得谱图峰型；

图3为实施例2中进样量与峰面积对应图；

图4为实施例3检测所得谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

总实施例

具体检测方法：

仪器：Waters 2695

GC柱子规格：C18 5um，4.6*250mm

检测器：PDA996

流动相：以0.18-0.22戊烷磺酸钠溶液(取戊烷磺酸钠，加水1000mL溶解后用磷酸溶液调节pH值至1.8-2.2)-乙腈(96-98∶2-4)为流动相；

检测波长：204nm；

流速：0.8-1.2mL/min

柱温：30-35℃

制样：精密称定23-25mg样品加入10mL的0.08-0.12N的硫酸水溶液中，超声震荡3-7mins，样品溶解至无色透明，取2mL样品溶液用流动相定容至10mL，超声30sec-3min，进样5-20μL，运行13-17mins。

实施例1

精密称定25mg标准品加入约10mL的0.1N的硫酸水溶液中，超声震荡5min，样品溶解至无色透明，取2mL样品溶液用流动相定容至10mL，超声1min，自动进样10μL。以0.2％戊烷磺酸钠溶液(取戊烷磺酸钠2.0g，加水1000mL溶解后用磷酸溶液调节pH值至2.0)-乙腈(97∶3)为流动相，柱子：ODS-C18，柱温：30℃，流速1.0mL/min，运行15min，保留时间为：3.93min。检测结果详见图1。

实施例2

精密称定25mg标准品加入约10mL的0.1N的硫酸水溶液中，超声震荡5min，样品溶解至无色透明，取2mL样品溶液用流动相定容至10mL，超声1min，分别自动进样5PL，10μL，15μL，20μL，以0.2％戊烷磺酸钠溶液(取戊烷磺酸钠2.0g，加水1000mL溶解后用磷酸溶液调节pH值至2.0)-乙腈(97∶3)为流动相，柱子：ODS-C18，柱温：30℃，流速1.0mL/min，运行15mins，保留时间为：3.93min。如图2所示，不同进样量谱图峰型一致，且如图3所示，进样量和峰面积成正比，说明在5-20μL的进样量均可用于分析。

实施例3

精密称定25mg标准品加入约10mL的0.1N的硫酸水溶液中，超声震荡5min，样品溶解至无色透明，取2mL样品溶液用流动相定容至10mL，超声1min，自动进样10μL。以0.2％戊烷磺酸钠溶液(取戊烷磺酸钠2.0g，加水1000mL溶解后用磷酸溶液调节pH值至2.0)-乙腈(97∶3)为流动相，柱子：ODS-C18，柱温：35℃，流速分别设定为0.8mL/min，1.0mL/min， 1.2mL/min。运行15min，如图4所示，不同流速出峰形态一致。含量一致，保留时间分别为：4.82min，3.93min，3.20min。说明保留时间随流速增加而有所提前。

精准性对比

针对同一待检样品，分别采用本发明方法与背景技术中提及的滴定法进行测试，结果如下：采用本发明方法：采用本发明方法，对市购的标准品(含量99.8％)进行检测，检测含量为 99.78％。

采用高氯酸滴定法：精确称取本品0.1g，加冰乙酸30mL，加热回流至溶解，冷却到室温。加α-萘酚苯甲醇指示剂2滴，用0.1mol/l高氯酸滴定至显绿色即为终点。同时做空白校对。测定使用高氯酸检测三次，最后检测含量为：100.48％采用盐酸滴定法：精确称取样品0.15g置于烧杯中，用移液管移取0.1mol/L氢氧化钠标准溶液，加热使之完全溶解，静置45mins，加入酚酞指示剂，用0.1mol/L的盐酸溶液滴定至红色褪去，记录数据，同时做空白试验，平行滴定三次，同时记录消耗盐酸的体积。最后测得含量为98.9％。

通过上述对可知，本发明方法的检测结果与标准品含量99.8％的结果更为接近，并且与两种滴定法相比，取得了显著的进步。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）称取5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸样品并将其添加至硫酸水溶液中，超声震荡，使样品溶解至无色透明，得到样品溶液；

2）取样品溶液用流动相稀释定容，超声处理；所述流动相为0.18-0.22wt%的戊烷磺酸钠溶液和乙腈的混合溶液；

3)对步骤3）所得溶液自动进样，进行高效液相色谱检测，获得结果。

2.如权利要求1所述的一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于，步骤1）中，所述硫酸水溶液的浓度为0.08-0.12N，所述样品与硫酸水溶液的用量比为23-27mg/10mL。

3.如权利要求1或2所述的一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于，步骤1）中，超声震荡时间为3-7min。

4.如权利要求1所述的一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于，步骤2）中，将样品溶液用流动相稀释定容至原体积4-6倍。

5.如权利要求1或4所述的一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于，步骤2）中，超声时间为30sec-3min。

6.如权利要求1或4所述的一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于，步骤2）中，所述戊烷磺酸钠溶液的制备方法为：取戊烷磺酸钠，加水溶解后用磷酸溶液调节pH值至1.8-2.2。

7.如权利要求1或4所述的一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于，步骤2）中，所述戊烷磺酸钠溶液与乙腈的体积比为（96-98）：（2-4）。

8.如权利要求1所述的一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于，步骤3）中，自动进样量为5-20µL。

9.如权利要求1所述的一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于，步骤3）中，高效液相色谱检测所采用的仪器型号为Waters 2695；GC柱子规格为ODS-C18，5um，4.6*250mm；检测器型号为PDA996。

10.如权利要求9所述的一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于，步骤3）中，检测波长为204nm；流速为0.8-1.2mL/min；柱温30-35℃；运行时间为13-17min。