DE10224825A1

DE10224825A1 - Verfahren zur Analyse von Biomolekülen

Info

Publication number: DE10224825A1
Application number: DE10224825A
Authority: DE
Inventors: Sven Buelow
Original assignee: Eppendorf SE
Current assignee: Eppendorf SE
Priority date: 2002-06-05
Filing date: 2002-06-05
Publication date: 2003-12-24
Also published as: US20040014241A1

Abstract

Verfahren zur Analyse von Biomolekülen, bei dem die Biomoleküle oder Teile davon auf einem Träger immobilisiert werden, der Träger mit den immobilisierten Biomolekülen dann mit Sondenmolekülen inkubiert wird, die in der Lage sind, spezifisch an Biomoleküle zu binden und die mit einer Markierung versehen sind, die nicht gebundenen Sondenmoleküle von dem Träger mit den daran gebundenen Sondenmolekülen separiert werden, dann die gebundenen Sondenmoleküle von dem Träger wieder abgetrennt werden und mit einer separaten Einrichtung identifiziert werden und die gewonnene Information über die von den Biomolekülen gebundenen Sondenmoleküle ausgewertet wird, wobei unterschiedliche Sondenmoleküle mit unterschiedlichen aus partikulären Trägern bestehenden oder an partikuläre Träger gekoppelten Markierungen versehen sind, die eine direkte Identifikation des Sondenmoleküls ermöglichen, und die eingesetzte Einrichtung in der Lage ist, die unterschiedlichen Markierungen zu differenzieren.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, bei dem Biomoleküle nach Immobilisierung auf einem Träger mittels spezifisch an die Biomoleküle bindender markierter Sonden analysiert werden.
Ein gattungsgemäßes Verfahren ist z. B. die in der EP 1164201 beschriebene "Reverse-Array-Technik". Bei dieser Technik wird eine zu analysierende Target- Nukleinsäure, ggf. nach Auftrennung in Teilsequenzen, an einem Träger immobilisiert. Dann werden z. B. mit Fluoreszenzmarkierungen versehene Oligonukleotidsonden mit jeweils unterschiedlichen Sequenzen unter Hybridisierungsbedingungen mit der immobilisierten Target-Nukleinsäure in Kontakt gebracht. Die nicht hybridisierten Sonden werden durch Waschen entfernt. Anschließend werden unter denaturierenden Bedingungen die hybridisierten Sonden von der Target-Nukleinsäure abgetrennt und in Kontakt gebracht mit einem Array, auf dem eine Vielzahl unterschiedlicher Oligonukleotidsonden in jeweils definierten Bereichen immobilisiert sind. Die markierten Sonden hybridisieren jeweils mit den passenden immobiliserten Oligonukleotidsonden auf dem Array. Mit einer geeigneten Screeningeinrichtung wird dann überprüft, in welchen Bereichen des Arrays eine Markierung detektierbar ist. In diesen Bereichen hat ein Hybridisierung mit den markierten Oligonikleotidsonden stattgefunden. Da bekannt ist, welche Oligonukleotidsonden in welchen Bereichen des Arrays angeordnet sind, kann man die Markierung mit einer definierten Sequenz verknüpfen, die gleichzeitig einer Teilsequenz der Targetnukleinsäure entspricht. Bei der Sequenzanalyse lassen sich z. B. mittels Kombinatorik die aus den detektierten Markierungen abgeleiteten Teilsequenzinformationen zu einem längeren Abschnitt bzw. der Gesamt Targetsequenz zusammensetzen.
Die bekannte Technik ist relativ aufwendig und darüber hinaus beschränkt auf die Analyse von Nukleinsäuresequenzen.
Aufgabe der Erfindung ist es, gattungsgemäße Verfahren so fortzubilden, daß sie einfacher und auch universeller durchführbar sind.
Gelöst wird die Aufgabe mit einem Verfahren, das die Merkmale des Anspruches 1 aufweist.
Danach ist vorgesehen, daß die erfindungsgemäß eingesetzten Sondenmoleküle mit unterschiedlichen Markierungen versehen sind, die jeweils direkt in einer geeigneten Einrichtung detektiert werden können. Im Rahmen der Erfindung ist weiterhin erforderlich, daß die Sondenmoleküle anhand ihrer Markierung erkannt und identifiziert werden können.
Im Gegensatz zu dem bekannten Verfahren sieht die Erfindung vor, daß z. B. jedes Sondenmolekül eine eigene Markierung aufweist, die direkt in einer geeigneten insbesondere physikalischen Einrichtung detektiert und ohne Zwischenschaltung weiterer biochemischer oder immunologischer Reaktionen dem betreffenden Sondenmolekül zugeordnet werden kann. Da die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Sondenmoleküle bekannt sind, können aus dem Nachweis einer bestimmten Markierung unmittelbar Informationen über das zu analysierende Biomolekül abgeleitet werden, z. B. das Vorhandensein eines bestimmten Sequenzabschnitts etc.
Ein wesentlicher Vorteil der direkten Detektion und Identifizierung des Sondemoleküls ist, daß das erfindungsgemäße Verfahren universeller angewendet werden kann. Es ist nicht wie die geschilderte "Reverse-Array-Technik" auf die Analyse von Target-Nukleinsäuremolekülen und den Einsatz von Oligonukleotidsequenzen als Sondenmoleküle beschränkt.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich vielmehr alle Moleküle analysieren, für die spezifisch bindende Sondenmoleküle existieren. So können, z. B. als zu analysierende Moleküle z. B. auch Proteine oder Peptide immobilisiert werden, die dann mit Antikörpern, Antikörperfragmentne, mit Oligonukleotiden versehenen Antikörpern, Peptiden, Lektinen, komplexen Zuckern, doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen, RNA oder spezifisch bindenden Proteine als Sondenmoleküle kontaktiert werden.
Für die Analyse von Nukleotidsequenzen können als Sondenmoleküle neben den bereits erwähnten Oligonukleotidsequenzen auch z. B. regulatorische Proteine eingesetzt werden, um nur ein Beispiel zu nennen.
Kernpunkt der Erfindung ist, daß die Sondenmoleküle mit unterschiedlichen direkt detektierbaren Markierungen versehen sind, die eine Identifizierung der Sondenmoleküle ohne Zwischenschaltung einer biochemischen oder immunologischen Reaktion erlauben.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, daß unterschiedliche Sondenmoleküle unterschiedliche Markierungen tragen. Diese Definition ist weit zu fassen und deckt auch die Möglichkeit ab, daß mehrere unterschiedliche Sondenmoleküle die gleiche Markierung tragen und mittels Kombinatorik oder sonstiger Auswerteverfahren die tatsächliche oder statistische Zuordnung der dektektierten Markierung zu den Sonden vorgenommen wird.
Wie genau die Markierungsstrategie konzipiert ist, hängt von dem jeweiligen Analyseziel ab. Besonders geeignete Markierungen, die im Rahmen der Erfindung eingesetzt werden können, sind partikulärer Natur.
Denkbar ist, die Sondenmoleküle z. B. mit Partikeln mit unterschiedlicher Korngröße, Form oder unterschiedlichen detektierbaren Einfärbungen zu verbinden. Der Begriff Einfärbungen ist weit zu fassen. Er soll alle detektierbaren Farbstoffe abdecken, einschließlich z. B. Fluoreszenzmarkierungen und nicht sichtbare Markierungen, z. B. im Infrarotbereich.
Solche partikulären Markierungen lassen sich in besonders einfacher Weise z. B. in einem Durchflußzytometer messen und anhand der Korngröße, Form und/oder Einfärbung identifizieren.
Ein Beispiel für geeignete Markierungen sind z. B. Quantum Dots, die wie in dem US-Patent 6,207,392 näher beschrieben, aus fluoreszierenden Halbleiter- Nanokristallen bestehen und über Linkermoleküle an die Sondenmoleküle gebunden werden können.
Weiterhin geeignet sind Nano-Barcodes, die aus an die Sondenmoleküle gebundenen Latexbeads bestehen, die eine Kombination aus verschiedenfarbig fluoreszierenden Quantum Dots aufweisen, wie in dem erwähnten US-Patent 6,207,392 beschrieben.
Es gibt weitere geeignete Nano-Barcodes, die aus kovalent an die Sondenmoleküle koppelbaren Siliziumpartikeln bestehen, die mit einem maschinenlesbaren binären Code markiert sind, der z. B. aus Vertiefungen, Gruben oder Scharten bestehen oder in der Form des Partikels selbst verschlüsselt sein kann. Zu Einzelheiten bezüglich dieser Barcodes wird auf die EP 0,863,797 verwiesen.
Weiterhin geeignet sind z. B. die in dem US-Patent 6,057,107 beschriebenen "Luminex"-Beads, die aus mit einer Vielzahl mit spezifischen Farbcodes versehen Microsphären bestehen, die wiederum mit den Sondenmolekülen koppelbar sind.
Die obige Aufzählung ist nicht abschließend. Es können vielmehr alle an die Sondenmoleküle koppelbaren partikulären Marker zum Einsatz kommen, die z. B. in einem Durchflußdetektor oder einer anderen direkt detektierenden Einrichtung identifiziert und ggf. quantifiziert werden können.
Die Durchführung des erfindungsgmäßen Verfahrens kann z. B. wie in dem nachfolgenden Beispiel beschrieben erfolgen:

Beispiel

Toxikologische Prüfung der Wirkung eines Medikamentes auf Rattenleberzellen

Ratten werden auf bekannte Weise mit einem Agens behandelt, dessen Toxizität geprüft werden soll. Maß für die Toxizität soll dabei die Expression von Genen bestimmter Funktionsklassen sein, wobei deren Expressionsprodukte, in diesem Falle RNA bzw. die während des Versuchs davon abgeschriebene cDNA, nachgewiesen werden sollen. Eine unbehandelte Kontrollgruppe wird mit denselben Methoden untersucht.
Zu bestimmten Zeiten wird jeweils ein Tier aus der Versuchs- und der Kontrollgruppe entnommen. Die Tiere werden betäubt und getötet, und ihre Lebern werden präpariert.
Nach Extraktion der RNA aus dem Lebergewebe mit gängigen Aufreinigungsmethoden wird die RNA jeweils einer Rattenleber mittels Reverser Transkription in cDNA überführt und über eine nachfolgende PCR amplifiziert. Die PCR- Produkte werden in Reaktionsgefäße mit modifizierter Oberfläche aus zugänglichen Aldehydgruppen gegeben. Nach kovalenter Bindung der cDNA über deren Aminogruppen an die Aldehydgruppen der Gefäßwandungen werden freie Bindungsstellen an den Oberflächen geblockt.
Zu jedem Gefäß werden Mischungen von Sonden gegeben, die representative Gene bestimmter relevanter Funktionsklassen erkennen, wobei die Sonden an mit einem definierten Signal aus zwei Farbmarkern codierten Luminexbeads konjugiert sind. Die Gene gehören z. B. zu den Funktionsklassen Apoptose, Zellzyklusaktivierung, Cytochrom P450, DNA-Reparatur, Entzündung, Glucuronyltransferase, Onkogene, oxidativer Stress, Phosphorylierung, Seneszenzmarker, Transkriptionsfaktoren, Transporter, TGF-β-Rezeptoren, Tumorsuppressoren und Tumornekrosefaktoren.
Die Sonden werden unter Hybridisierungsbedingungen in den Reaktionsgefäßen inkubiert. Nach Waschen unter stringenten Bedingungen zur Entfernung ungebundener Partikel werden die gebundenen Partikel durch Temperaturerhöhung abgelöst, so daß sie wieder ins Reaktionsmedium gehen. Das nunmehr die Partikel enthaltende Medium wird durch ein Durchflußgerät zur Detektion des Farbcodes jedes einzelnen Partikels geschickt. So werden allein auf Grund des Vorhandenseins des jeweiligen Partikelcodes ohne zusätzliche Markierung der Targetmoleküle Bindungsereignisse erfaßt und quantifiziert.
Unterschiede in der Häufigkeit einzelner Partikelcodes zwischen Proben von unbehandelten und behandelten Ratten lassen auf unterschiedliche Expression der jeweiligen Gene und damit die toxikologische Wirkung des verabreichten Wirkstoffes schließen. Zudem lassen sich neue Wirkstoffe bekannten Wirkmechanismusklassen zuordnen, indem man das Expressionsmuster mit denen von bereits zuvor untersuchten Medikamenten vergleicht.

Claims

1. Verfahren zur Analyse von Biomolekülen, bei dem

a) die Biomoleküle oder Teile davon auf einem Träger immobilisiert werden,

b) der Träger mit den immobilisierten Biomolekülen dann mit Sondenmolekülen inkubiert wird, die in der Lage sind, spezifisch an Biomoleküle zu binden und die mit einer Markierung versehen sind,

c) die nicht gebundenen Sondenmoleküle von dem Träger mit den daran gebundenen Sondenmolekülen separiert werden,

d) dann die gebundenen Sondenmoleküle von dem Träger wieder abgetrennt werden und mit einer separaten Einrichtung identifiziert werden und

e) die in Schritt d gewonnene Information über die von den Biomolekülen in Schritt b gebundenen Sondenmoleküle ausgewertet wird,

wobei unterschiedliche Sondenmoleküle mit unterschiedlichen Markierungen, die aus partikulären Trägern bestehen oder an partiküläre Träger gekoppelt sind, versehen sind, die eine direkte Identifikation des Sondenmoleküls ermöglichen, und die in Schritt d eingesetzte Einrichtung in der Lage ist, die unterschiedlichen Markierungen zu differenzieren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungen Partikel sind, und zur Identifizierung ein Partikeldetektor eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel sich bezüglich ihrer Größe und/oder Form und/oder ihrer Codierung mit detektierbaren Farbstoffen unterscheiden.

4. Verfahren nach einem der Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Biomolekülen um Nukleinsäuremoleküle handelt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Sondenmoleküle einzelsträngige Oligonukleotide sind.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Sondenmoleküle regulatorische Proteine sind.

7. Verfahren nach einem der Ansprüch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Biomoleküle Proteine oder Peptide sind.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Sondenmoleküle Antikörper sind.

9. Verfahren nach Anspruch 4 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Sondenmoleküle Antikörperfragmente, mit Oligonukleotiden versehene Antikörper, Peptide, Lektine, komplexe Zucker, doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle, RNA oder spezifisch bindende Proteine sind.