JP4511636B2 - 顕微鏡的イメージングにより核酸の物理的特性を測定する方法 - Google Patents

顕微鏡的イメージングにより核酸の物理的特性を測定する方法 Download PDF

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Description

本発明は米国厚生省の国立衛生研究所により授与された認可第ＨＧ００２２５号のもとに米国政府の援助により行われたものであり、米国政府は本発明においていくらかの権利を有する。
１．発明の利用分野
本発明は、個々のポリマー分子、特に核酸分子を操作して、例えばサイズおよび／またはヌクレオチド配列に従って、特性付けるための方法並びに構成物に関する。
２．発明の背景
ゲノムレベルで核酸分子を解析することは、多数の、しばしば非常に大きな核酸分子を高処理量のＤＮＡ地図作成法およびＤＮＡ塩基配列解析法で正確かつ迅速に特性決定することを伴う極めて複雑な試みである。真核生物の染色体に関する物理的地図の作成と最終的なヌクレオチド配列の決定は、現在、依然として労力を要し、困難な作業である。これは一部には、ＤＮＡの地図作成と配列解析を行う現在の手順がもともとゲノムレベルではなく遺伝子レベルで核酸を解析するように設計されていることによる（Chumakov, I.ら, 1992, Nature 359:380; Maier, E. ら, 1992, Nat. Genet. 1:273）。
伝統的に、核酸分子の分離および分子量分布は最も一般的にはゲル電気泳動により行われてきた（例えば、Freifelder, 1976, Physical Biochemistry, W.H.Freemanを参照されたい）。このゲル電気泳動は分子が大きさに応じて分離されるように分子の集団を適当な媒体中で移動させることを含む。このような電気泳動法は許容できるレベルのサイズ分離を可能にするが、特に高処理量マッピングの場合には多くの困難を経験している。
例えば、こうした技術には大量のＤＮＡの調製が必要である。ゲノム地図作成に関しては、このような調製法はゲノムＤＮＡや酵母人工染色体（YAC; Burke, D.T.ら, 1987, Science 236:806; Barlowら, 1987, Trends in Genetics 3:167-177; Campbellら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5744）に由来するＤＮＡなどの供給源を必要とすることがある。これらの供給源から詳細な解析（例えば制限酵素切断地図の作成）を行うのに十分な量のＤＮＡを得ることは時間がかかり、しばしば実用的でない。さらに、同じような大きさの分子の集団は媒体中を同じ速度で泳動するので、かかる技法を利用することにより粒子のサンプルの内部から個々の分子を分離することは不可能である。加えて、広いサイズ範囲のＤＮＡ分子集団をゲル電気泳動技術で分離することは可能であるが、最適な技法には、目的とする分子のサイズに応じて、しばしば数種の異なるゲルマトリックス組成物および／または他の電気泳動法を使用する必要がある。例えば、大きなＤＮＡ分子の分離にはパルスフィールド電気泳動のような技法を必要とすることがある（例えば米国特許第4,473,452号を参照されたい）。さらに、標準的なゲル電気泳動法はサイズに応じた分子の集団の分離を必然的に伴い、多分散系の混合物中の個々の分子を分離することが不可能である。それゆえ、要するに、ゲノム地図作成の目的のためにしばしば必要とされる個々のＤＮＡ分子（特にサイズのバラツキが非常に大きいもの）の正確かつ迅速で実用的な高処理量分離は、ゲル電気泳動によっては達成できない。
単一の核酸分子および複合体を可視化するための技術はすでに報告されている。このような技術として、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；Manuelidis, L.ら, 1982, J. Cell. Biol. 95:619; Lawrence, C.A. ら, 1988, Cell 52:51; Lichter, P. ら, 1990, Science 247:64; Heng, H.H.Q.ら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9509; van den Engh, G.ら, 1992, Science 257:1410）および例えばヤナギダ（Yanagida, M.ら, 1983, Cold Spring Harbor Symp. Quantit. Biol. 47:177; Matsumoto, S. ら, 1981, J. Mol. Biol. 132:501-516）により報告されたもののような蛍光顕微鏡検査をベースとした技術、核酸分子の一方の末端または両方の末端が表面に固定される拘束（tethering）技術（米国特許第5,079,169号、米国特許第5,380,833号、Perkins, T.T. ら, 1994, Science 264:819; Bensimon, A. ら, 1994, Science 265:2096）、走査型トンネル顕微鏡検査法および原子間力顕微鏡検査法を始めとする走査型プローブ顕微鏡検査をベースとした可視化技術（例えばKarrasch, S. ら, 1993, Biophysical J. 65:2437-2446; Hansma, H.G. ら, 1993, Nucleic Acids Research 21:505-512; Bustamante, C. ら, 1992, Biochemistry 31:22-26; Lyubchenko, Y.L. ら, 1992, J. Biomol. Struct. and Dyn. 10:589-606; Allison, D.P. ら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10129-10133; Zenhausern, F. ら, 1992, J. Struct. Biol. 108:69-73参照）がある。
単一分子技術はゲル電気泳動が持ち合わせていない順序づけ（ordering）能力という潜在的利点を与えるものの、現在の単一分子技術はどれも実用的なレベルで、例えば高分解ゲノム地図作成の手段として、使用することができない。例えば、ヤナギダ（Yanagida, M.ら, 1983, Cold Spring Harbor Symp. Quantit. Biol. 47:177; Matsumoto, S. ら, 1981, J. Mol. Biol. 132:501-516）により記載された分子は、本質的に溶液中に遊離した状態で、どのような実際的な地図作成も不可能にするような方法で可視化された。さらに、ＦＩＳＨ技術は限られた数の固定化断片のみを使用するという利点を提供するが、ゲル電気泳動の場合に得られるサイズ分離を達成することができない。
上記した単一分子拘束技術は一般に個々の核酸分子を必要とし、核酸分子を最初にその一端または両端で表面に固定させておき、次にこの分子が伸長するように操作するものである。しかし、こうした技術はゲノム解析には適していない。第一に、必要とされる工程には時間がかかり、手順あたりの分子数が少ないときだけ達成できる。第二に、一般的には、拘束された分子は保存して再使用することができない。
かくして、ゲル電気泳動のサイズ分離能とある種の単一分子技術（例えばＦＩＳＨ）の順序づけ能を組み合わせることは、ゲノム地図作成のようなゲノム解析にとって極めて有用であろう。こうした解析は解析される単一分子を操作（manipulate）する能力によってもさらに促進されるだろう。加えて、対象の核酸サンプルを再使用できることがこの解析の効率および処理能力を高めるだろう。しかしながら、現在、これらの要素のそれぞれを実用的なやり方で具体化する単一技術はまったく存在していない。
本明細書中での文献の引用は、ここに引用した文献がどれも適切な先行技術であるということを認めるものではなく、また、引用した文献が本出願の請求の範囲の特許性に対する資料と見なされることを容認するものではない。これらの文献の日付または内容に関する表示はすべて本出願人に入手可能な情報に基づいており、これらの文献の日付または内容の正確さに関してどのような承認をも与えるものではない。
３．発明の概要
本発明は、哺乳動物染色体サイズの大きさの個々の核酸分子を含めて、個々の核酸分子を特性づけし操作するための方法並びに構成物に関する。本明細書に記載される方法および構成物は、ゲノムレベルでの核酸分子の正確で迅速な高処理量解析のために使用することができる。この解析としては、例えば、本明細書では「光学的マッピング」と称される高分解物理的地図の作成、および本明細書では「光学的配列決定」と称されるゲノム内の特定のヌクレオチド配列の検出がある。
詳細には、哺乳動物染色体サイズの大きさのＤＮＡ分子を含めて、単一の核酸分子を、この核酸分子がその生物学的機能を保持するのを可能とし、さらにこの分子の迅速な解析を可能とする、迅速で、制御された、再現可能な方法で伸長させ固定させる方法が記載される。このような方法の一実施態様において、これらの分子は溶融したまたは未重合のゲルマトリックスの流れの中で伸長される。伸長した分子はゲル組成物が固化または重合するとき固定される。このような実施態様では、ゲル組成物はアガロースゲル組成物であることが好ましい。伸長した分子はアガロースが固化するとき固定されるようになる。
第二の実施態様において、単一の核酸分子は制御できるやり方で伸長され、平らな固相表面に直接固定される。この平らな固相表面は、単一の核酸分子が核酸伸長状態の臨界パラメーター、すなわち緩和安定性の程度および生物学的活性の間の最適なバランスを示すように制御可能に改変された陽電荷密度を含んでいる。さらに、このような最適バランスが正確かつ再現可能に達成される方法、構成物およびアッセイについて記載する。
第三の実施態様において、単一の核酸分子はフロー（流れ）をベースとした技術により伸長される。このような実施態様では、単一核酸分子が層流伸長装置において伸長され、操作され（例えば、部位特異的制限酵素消化により）、そして／または解析される。本発明はさらにこのような層流伸長装置に関し、かかる装置について記載する。
その後、伸長された個々の核酸分子は、ゲノムレベルでの核酸の解析に適用されるさまざまな方法において使用することができる。例えば、このような核酸分子は単一核酸分子の順序づけられた高分解度の制限地図を作成するために使用し得る。この方法は本明細書では「光学的マッピング」または「光学的制限地図作成」と記述される。さらに、伸長された核酸分子内に存在する特定のヌクレオチド配列を同定し得る方法が提示される。かかる方法は本明細書では「光学的配列決定」と記述される。光学的マッピング技術および光学的配列決定技術は同一の個々の核酸分子に対して独立に使用することも組み合わせて使用することもできる。
さらにまた、本発明の伸長した核酸分子はどのような標準的手法を使っても操作することができる。例えば、核酸分子に作用する酵素、例えば制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、リガーゼまたはヘリカーゼを含むがこれらに限らない酵素により単一核酸分子を操作することができる。
加えて、伸長した単一核酸分子のイメージングおよびサイジングのための方法も提示される。これらのイメージング技術は、例えば、蛍光色素、顕微鏡検査および／または画像処理コンピュータのソフトウェアとハードウェアの使用を含む。サイジング法は静的測定技術と動的測定技術の両方を含む。
さらにまた、ゲノム解析においてこのような単一核酸分子を利用するための高処理量の方法が提示される。かかる高処理法の一実施態様では、高分解度の制限地図の作成のための迅速な光学的マッピング法が記載される。この種の実施態様において、単一核酸分子は伸長され、固相表面に高密度で格子状に配列されて固定される。その後地図作成のためにこれらの分子を適当な制限酵素で消化することができる。別の実施態様では、単一核酸分子が伸長され、固相表面に高密度で格子状に配列されて固定され、そして光学的配列決定に基づく種々の診断法において利用される。注目すべきことに、このような診断用格子も再利用が可能である。さらに、光学的マッピング法と光学的配列決定法を合体させる方法から誘導される情報を迅速に発生させるためにこの高処理法を用いることができる。
本発明は、生物学的機能を保持するばかりでなく操作しやすい個々の伸長核酸分子の集団を再現可能にかつ迅速に生成させて、迅速なゲノム解析を可能にする、高処理量の技術を含めた、技術を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１． 蛍光顕微鏡検査の研究に特に適合させた電気泳動チャンバーの概略図。
図２． 本発明において使用できる電気泳動チャンバー内の典型的なチャンバー電極の相互接続を示す部分的概略および部分的構成図。
図３Ａ−３Ｂ． 本発明に従って媒体中のＤＮＡ分子の顕微鏡検査研究において用いられる装置の概略的例示、および複屈折の測定装置を示すより詳細な図。
図４Ａ−４Ｉ． Ｇバクテリオファージ分子を異なる方向の２つの連続する電場にさらしたときのＤＮＡ分子のコンホメーションの変化と位置の変化を示す。
図５Ａ−５Ｊ． 実施例４に記載した蛍光顕微鏡検査実験により明らかにされた、６００秒間の電気泳動後のＧバクテリオファージＤＮＡ分子の緩和の間のコンホメーションの変化と位置の変化を示す。
図６． 光学的マッピング。マグネシウムイオンを含まない溶融アガロース中にＤＮＡ分子と制限酵素を溶解する。この混合物をスライドグラスとカバーグラスの間に挟んだとき発生する流れによりＤＮＡ分子を伸長させる。伸長した分子をアガロースのゲル化により適所に固定する。このゲルにマグネシウムイオンを拡散させると消化が開始され、切断部位が分子断片の緩和につれて成長するギャップとして現れる。
図７Ａ−７Ｄ． 光学的マッピングの柱状図。分子の大きさおよび切断部位の数により変動を示すNot 1の切断回数を示す。切断回数は顕微鏡の視野に存在する核酸分子中のNot 1切断の数を数えることで評価した。このような視野は典型的には約３〜５個の分子を含む。約半数の視野はNot 1切断をひとつも示さなかったため評価しなかったので、これは未切断分子の数を過小評価する。切断部位の予測された数および染色体の大きさ： ７Ａ：Ch. I（240kb）１； ７Ｂ：Ch.ＶおよびVIII（595kb）３および２； ７Ｃ：Ch. XI（675kb）２； ７Ｄ：Ch. XIIIおよびXVI（950および975kb）１。染色体対ＶおよびVIIIと、XIIIおよびXVIは同一のスライドグラス上に存在していた。
図８Ａ−８Ｈ． 伸長させ、ゲル固定し、１回切断した分子のいくつかの制限断片緩和様式を示す。水平方向の矢印は緩和方向を示す。例示した緩和様式： ８Ａは切断前の固定分子を示し、８Ｂ−８Ｅは検出可能に切断された分子を生じさせる可能な緩和様式を示し、８Ｆ−８Ｈは検出不能に切断された分子を生じさせる緩和様式を示す。
図９． 両コイル末端でセグメントのプールすなわち「ボール」を形成している可能な緩和現象を示す模式図。アガロースゲルは分子が利用可能なフリーのスペースをもつ一連のペグ（peg）として例示してある。ゲルペグはゲル化の間に包埋ＤＮＡ分子を横切って、おそらくそれを捕捉するだろう。プール領域に位置するコイルセグメントは緩和サブコイル領域を含み、それらの間に伸長したコイルより高いエントロピーを有する。いくつかの状況では、特にセグメントプールの塊が介在するコイルに接近するとき、これらのプールは分子リベット（鋲）として働くことができる。
図１０Ａ−１０Ｂ． 上記のように計算したS.cerevisiae染色体Ｉ、Ｖ、VIII、XI、XIIIおよびXVI由来のNot 1エンドヌクレアーゼ制限断片の、公表された結果に対してプロットされた光学的マッピングサイジングの結果。対角線は基準用である。この図には典型的な断片の像が示してある（実施例１３を参照されたい）。挿入図は母集団の標準偏差（ｋｂ）の概算を示す。誤差線は平均に対する９０％信頼（主グラフ）または標準偏差（挿入図）を表す。１０Ａ： 断片サイズの相対的強度測定。１０Ｂ： 断片サイズの相対的見かけ鎖長測定。
図１１Ａ−１１Ｃ．見かけ鎖長に対する正規化した絶対強度の散乱プロット。６個のそれぞれの画像から絶対強度を計算し、光学的マッピングにおいて一般的に採用された時間間隔（１０〜１５分）で見かけの長さに対してプロットした。各サンプルにつき、５つの隣接画像のグループからの絶対強度の数値の平均を出し、その最高値をとることで初期強度を見つけた。各画像からの数値をそのサンプルの初期強度で割ることにより、いくつかのサンプルからの数値を正規化した。１１Ａ： 染色体Ｉ 120kb Not I断片、７サンプル。１１Ｂ： 染色体XI 285kb Not I断片、４サンプル。１１Ｃ： 染色体XI 360kb Not I断片、４サンプル。
図１２． S.cerevisiae染色体ＤＮＡ分子の光学的マッピング結果のNot Iエンドヌクレアーゼ制限地図と公表された制限地図との比較。長さ（Len）、強度（Int）または両方の組合せ（Com）から地図を作成した。光学的マッピングデータの棒線の長さは図１０Ａ−１０Ｂでプロットした平均値に比例し、典型的な画像を図１３Ａ−１３Ｆに示す。
図１３Ａ−１３Ｆ． ＤＡＰＩで染色し、Not I制限エンドヌクレアーゼ切断中にアガロースゲルに埋め込まれたS.cerevisiae染色体ＤＮＡ分子の典型的な蛍光顕微鏡検査の画像。染色体ＤＮＡ分子は実施例１３および引用文献に記載されたように調製し、固定した。画像は平滑化し減衰させたバックグラウンド画像を用いてバックグラウンド修正した。１６ビットの精度で平滑化と引き延ばをした。画像はNot I制限酵素消化の展開を示し、矢印で切断部位を強調してある。Ｍｇ2+の添加後に時間間隔を定めた。１３Ａ：Ch. I（240kb）, 20および60秒；１３Ｂ：Ch. XI（675kb）, 500, 880および1160秒；１３Ｃ：Ch. V（595kb）, 200, 240, 520秒；１３Ｄ：Ch. VIII（595kb）, 440, 1220および1360秒；１３Ｅ：Ch. XIII（950kb）, 100および560秒；１３Ｆ：Ch. XVI（975kb）, 460および560秒。スケール線、５μm。パネル（１３Ａ−１３Ｄ）では結果を画像化するために１００倍率の対物レンズを使用し、パネル（１３Ｅおよび１３Ｆ）では６３倍率の対物レンズを使用した。
図１４． S.cerevisiae染色体IIIおよびXIのRsr IIおよびAsc Iエンドヌクレアーゼ制限酵素消化からの光学的マッピングの結果。完全に切断された長さ（Len）または強度（Int）のデータから地図を作成し、部分的に切断された長さを用いて改善した。棒線の長さは計算した平均値に比例し、典型的な画像を図１５に示す。切断部位の数を図７のようにして決定した。
図１５Ａ−１５Ｃ． ＤＡＰＩで染色し、Rsr IIまたはAsc I制限エンドヌクレアーゼ切断中にアガロースゲルに埋め込まれたS.cerevisiae染色体ＤＮＡ分子の蛍光顕微鏡検査画像。図１３と同様にして染色体ＤＮＡ分子を消化し、分析した。画像は制限酵素消化の展開を示し、矢印で切断部位を強調してある。１５Ａ：Ch. III, Rsr II, 1100および1820秒；１５Ｂ：Ch. XI, Rsr II, 20, 600, 920, 1060秒；１５Ｃ：Ch. XI, Asc I, 1160, 1500, 1789, 1940秒。Rsr IIのアイソシゾマーであるCsp Iも使用したところ同一の結果を得た。スケール線、５μm。
図１６． ポリリシン処理の関数としてのガラス表面特性。異なる濃度のポリ-D-リシン（ＭＷ＝350,500）中でガラス表面を１６時間インキュベートした。処理したガラス表面にマグネシウムイオンを含まないEcoRI制限緩衝液およびエチジウムホモダイマー中のλバクテリオファージＤＮＡ分子を載置した。四角および円はそれぞれ吸収されたＤＮＡの比率および吸収されたＤＮＡの平均鎖長を示す。各ポイントは測定された約５０の分子を表し、棒線は平均からの標準偏差を示す。サンプルの調製、イメージング技術および解析は「方法」のところで説明する。
図１７． 光学的マッピング結果からのλクローンの蛍光顕微鏡検査画像の陳列。Pygmy遺伝子座にわたるマウス酵母人工染色体（ＹＡＣ）（Burkeら, Science 236:806-812, 1987; Murray & Szostak, Nature 305:189-193, 1983）由来のクローンをλ FIX IIにサブクローニングし、EcoRIとBamHIで消化した。これらの分子と他の分子（示してない）の地図を光学的マッピング技術（「方法」）により作成し、これを図１９に示す。画像は地図作成のために用いた典型的な分子を示す。スケール線、５ミクロン。画像ｖは画像ｔの拡大であり、画像ｗは画像ｖと同じスケールである。地図作成に用いた酵素は、EcoRIが（E）、BamHIが（B）と示してある。ａ，未切断のλＤＮＡ；b, B3（E）; c, F（B）; d, B（B）; e, D（B）; f, E（B）; g, 914（E）; h, B（E）; i, G（B）; j, C（E）; k, B4（E）; l, Y11（E）; m, 618（E）; n, 617（E）; o, 305（E）; p, A（B）; q, 1004（B）; r, E（E）; s, B6（E）; t, A2（E）; u, C3（E）; v, A2（E）; w, F（E）。
図１８． 記載したとおりに計算し、ゲル電気泳動データに対してプロットしたλ FIX IIクローンのEcoRIおよびBamHIエンドヌクレアーゼ制限断片のサイジングの結果。ａ，相対的蛍光強度の結果。対角線は基準用である。典型的な断片の画像を図１７に示す。挿入図：母集団の標準偏差（ｋｂ）の概算。誤差線は平均に対する９０％信頼（主図）または標準偏差（挿入図）を表す。分子全体の大きさはゲル電気泳動で測定した。ｂ，小さい断片の結果。原点を通る最も適合した線（勾配0.665）を用いて、地図に組み込む前に当初は６．５ｋｂ未満と見積もられた断片を較正した。ｃ，修正後の結果。ｄ，同一画像からの相対的見かけ鎖長サイジングの結果。対角線は基準用である。
図１９． 光学的マッピングにより構築されたEcoRIおよびBamHI制限地図。左側にクローンを表記した。上側の印はEcoRI制限部位であり、下側の印はBamHI制限部位である。表１は断片のサイズを示す。
図２０． λ FIX IIクローンの挿入物ＤＮＡの光学的サイジング。表面上に載置したλクローンを、「方法」に記載したようにポリリンカー部位で切断する酵素により消化した。FIX IIクローニング系の２０ｋｂおよび９ｋｂのベクターアームを内部サイズ標準として用いて相対サイズを絶対サイズに変換した。蛍光強度および長さの結果を、ＰＦＧＥからのサイズとともに表２に示した。この酵素が挿入物を切断する事例は容易に説明された。スケール線は５ミクロンである。ａ，クローンＦ（Sal I）: 20kb, 7.5kb, 9.5kb, 9kb。ｂ，クローンＧ（Sal I）: 20kb, 10.1kb, 4.1kb, 9kb。ｃ，クローンＢ（NotI）: 20kb, 17.6kb, 9kb。ｄ，Ｂ３（SstI）: 20kb, 13.8kb, 9kb。
図２１． ＡＰＴＥＳ付着の関数としてのガラス表面のＤＮＡ結合特性。前もってＡＰＴＥＳで表示時間処理しておいたガラス表面に、（10mM Tris pH7.6, 1mM EDTA, 50mM NaCl）中の酵母（AB972）染色体Ｉ分子（240kb, 輪郭の長さ72mm, B-DNAと仮定）を溶融アガロースにてアプライした。エチジウムホモダイマーで染色した後、分子の数および長さを蛍光顕微鏡検査により測定した。プロットは、先行するＡＰＴＥＳ誘導体化の時間に対してプロットした、視野100m2あたりに付着した分子の平均数（四角）および分子の平均長さ（円）を示す。各ポイントは画像化された約６０の分子を表す。棒線は平均からの標準偏差を示す。サンプルの調製、イメージング技術および解析は「材料および方法」に示される。
図２２．記載した（実施例１３）ように計算し、公表された結果（Link & Olson, 191, Genetics 127:681）に対してプロットしたS.cerevisiae染色体Ｉ、Ｖ、VIIIおよびXIのNotIエンドヌクレアーゼ制限断片の光学的マッピングサイジングの結果。対角線は基準用である。各ポイントは２０〜４０の画像化断片を表す。挿入図：母集団の標準偏差の概算（ｋｂ）。誤差線は９０％信頼の間隔を表す。（Ａ）制限断片サイズの相対的見かけ長さ測定。（Ｂ）制限断片サイズの相対的蛍光強度測定。
図２３． NotI制限エンドヌクレアーゼで消化したS.cerevisiae染色体ＤＮＡ分子の典型的な蛍光顕微鏡写真。消化後にエチジウムホモダイマーで分子を染色した。矢印は切断部位を示し、スケール線は１０ミクロンである。Ａ，染色体XI, ２箇所の切断；Ｂ，染色体Ｖ，３箇所の切断；およびＣ，染色体VIII, ２箇所の切断。Ｄ，NotIで消化した酵母染色体の光学的マッピングの結果と公表されたＰＦＧＥ制限地図との図式による比較。光学的マッピングデータの棒線の長さは図２２でプロットした蛍光強度測定に基づく平均値に比例する。
図２４． NotI, MluI, EagIおよびNruI制限エンドヌクレアーゼで消化し、エチジウムホモダイマーで染色した酵母人工染色体の典型的な蛍光顕微鏡写真。矢印は切断部位を示し、スケール線は１０ミクロンである。YAC 7H6をA, NruI; B, EagIで消化し、YAC 3I4をC, NotI; D, MluI; E, EagI; F, NotIおよびMluI; G, MluIおよびEagIで消化した。両YAC（H, 7H6; I, 3I4）についての光学的マッピング結果とＰＦＧＥ地図作成結果との図式による比較。二重消化の結果を含めてある。光学的マッピングデータの棒線の長さは蛍光強度測定に基づく平均値に比例する。
図２５は、層流伸長装置を示す概略図である。
図２６Ａ、ＢおよびＣは、本発明のスポット形成技術を用いる伸長分子の固定化の特徴的な「サンバースト」（sunburst）パターンを示す。
図２７ＡおよびＢは、分子サイズの関数としての緩和測定を示す。
図２８ＡおよびＢは、サイズに対する緩和の対数プロットである。
図２９は、ＤＮＡスポットの拡大図および誘導体化した表面に分子を広げる一つの方法を示す。
図３０は、λクローンまたはコスミドクローンの高処理量光学的マッピングの方法を示す構成図である。
図３１は、格子状に配列されたＹＡＣ ＤＮＡの高処理量光学的マッピングに用いたシステムの構成図である。
図３２は、高処理量光学的マッピングの自動システムの一実施態様を示す構成図である。
図３３は、画像収集プロセスを最適化し、シグナル対ノイズ比を最大にする方法を例示する。
図３４は、本発明の好適な実施態様に従う画像処理法の構成図である。
５．発明の詳細な説明
本明細書には、哺乳動物染色体サイズの個々の核酸分子を含めた個々の核酸分子を特徴づけし操作するための方法並びに構成物が記載される。ここに記載する方法および構成物は、ゲノムレベルで核酸分子の正確で迅速な高処理量の解析を可能にする光学的マッピングおよび光学的配列決定の目的に利用することができる。
詳細には、第５．１節に単一核酸分子の伸長および固定化のための方法を記載する。かかる方法にはアガロースをベースとした技術（第5.1.1節）と固相表面をベースとした技術（第5.1.2節）が含まれる。また、第５．１節には、ここで用いる平らな固相表面の作製にとって重要なパラメーターを最適化するためのアッセイも記載する。さらに、第５．１節には、単一核酸分子を層流伸長装置で伸長させ、操作し、そして／または解析することからなるフロー（流れ）ベースの伸長技術も記載する（第5.1.3節）。
第５．２節に単一核酸分子のイメージングおよびサイジングの方法を記載する。この節には例えば単一核酸分子を画像化するのに有用な核酸の染色、顕微鏡検査および写真撮影の技術（第5.2.1節）が含まれる。さらに、静的測定技術と動的測定技術の両方を含む単一核酸分子のサイジングの方法をこの節に記載する（第5.2.2節）。第５．３節には本発明の単一核酸分子技術を投入しうるゲノム解析の応用面を記載する。こうした応用面として、例えば光学的マッピング技術と光学的配列決定技術がある。最後に、第５．４節で本発明の単一核酸技術の迅速で高処理量の利用方法を述べる。
5.1. 単一核酸分子の伸長技術
核酸分子の迅速で効率のよい解析および／または操作を可能にするようなやり方で単一核酸分子を迅速、制御可能、再現可能に伸長させるために、さまざまな方法を利用することができる。こうした技法には、例えばゲルベースの技術（第5.1.1節）、固相表面ベースの技術（第5.1.2節）、そしてフローベースの技術（第5.1.3節）が含まれ、それぞれを以下で別個に説明することにする。
5.1.1. ゲルベースの技術
単一核酸分子の伸長のためにゲルベースの技術を利用できる。ここに記載するゲルベースの技術は核酸分子の生物学的機能を維持し、さらに、伸長した単一核酸分子の操作および／または正確な分析を可能にする。このようなゲルベースの技術によって迅速に効率よく分析される核酸分子には、約２０ｋｂから哺乳動物の染色体サイズの長さ（すなわち１０００ｋｂ以上）までの鎖長範囲の核酸分子が含まれる。さらに、このようなゲルベースの技術の使用により、動的な測定法の利用が可能であり、比較的低いレベルの核酸の剪断が生じ、また、伸長した核酸分子を操作する際に広範囲の生化学的活性の利用が可能である。
簡単に述べると、ゲルベースの技術は、溶融したまたは未重合のゲル組成物内で単一核酸分子を伸長させて、冷却または重合の際に、伸長した核酸分子が、例えば酵素的操作および／または相補的核酸分子へのハイブリダイゼーションまたは配列特異的なタンパク質もしくはペプチドへの結合を依然として容易に受け入れながら、比較的静止した状態で維持されるようにすることを含む。さらに、ゲル化の方法はかなりの緩和状態から、例えばその酵素的切断後の、ランダムコイルのコンホメーションまでの伸長した核酸分子を拘束する。
最適なイメージングおよび操作の可能性にとって、単一核酸分子がゲル組成物内で伸長される量は重要である。核酸分子を過度に伸長させたり拡張させたりすると可視化が困難になる。例えば、あまりにも伸長しすぎると、イメージングピクセルあたりの蛍光色素が非常に少なくなり、その結果測定分子から発生した強度がバックグラウンド値に近づくようになる。しかし、不十分な伸長はあまりにも低い張力レベルを生じさせ、単一核酸分子操作の解析を妨害することがある。例えば、制限地図作成の場合、十分な伸長が起こって、消化後に新たに形成された核酸断片が互いを引き離すように、すなわち制限部位がはっきり見えるようにしなければならない。最適なゲルベースの伸長の追加的必要条件は、核酸の生物学的機能が最高に保持されるように、ゲル内に水分を保つよう注意を払うことである。
最適なイメージング／操作の可能性にとって、核酸分子がゲル内で伸長される程度は十分なレベルの分子内張力を生じるように十分大きくなければならないが、伸長分子の画像化が困難になるほど大きくてもいけない。一般に、曲線から成る輪郭の長さの約２０〜６０％に達する単一核酸分子をもたらす伸長法が好適である。
さらに、イメージングを成功させるためにはゲル内の伸長した核酸分子が浅い焦点面の内部になければならない。より大きな核酸分子に関しては、例えば、焦点を合わせる可視化の場合、厚さが約０．２μmの平面内にその分子が存在することがさらに重要である。
ゲル化または重合により包埋分子が固定されるので、ゲル化または重合が起こる速度に影響を及ぼす系統的に変化するパラメーターは固定の度合を調節することができ、終局的には分子緩和の速度を調節することができる。より小さい核酸分子（すなわち約３５０ｋｂより小さい分子）は速やかに緩和する。それゆえ、実質的な緩和が起こる前に核酸分子が伸長状態のコンホメーションで動きがとれなくなるようにゲル化／重合を速める条件下で伸長させることが好適である。より大きい核酸分子は比較的遅い速度で緩和するので、より遅い速度のゲル化／重合を考慮した条件下で伸長させることができる。
アガロースゲルに関しては、ゲル化速度に影響を及ぼすパラメーターとして、例えばゲルの濃度および／またはゲルが形成される温度が挙げられる。より高いゲル濃度または低温でのゲル化はゲルの形成を速める。ポリアクリルアミドゲルに関しては、その重合速度に影響を及ぼすパラメーターとして、例えばアクリルアミド／ビスアクリルアミドの濃度および比、重合が起こる温度、用いる硫酸アンモニウムおよびＴＥＭＥＤの濃度が挙げられる。
このような伸長技術においてどのようなゲル組成物も使用できるが、アガロースゲル組成物が好ましく、特に低いゲル化温度を示すアガロース組成物が好適である。このような低ゲル化温度のアガロース組成物は光学的に最も透明なアガロース組成物であり、しかも、こうした組成物は３７℃で溶融状態のままでいられるので、制限酵素などの酵素の生物学的活性を容易に維持することができる。さらに、この種のアガロース組成物は、伸長した核酸分子の固定化のために速やかなゲル化がしばしば望まれるという点で有用である。アガロースゲル組成物では、ゲル組成物が約０．１〜約３．０％を占めており、０．１〜１．５％が好適である。
ゲル組成物内の核酸分子を伸長させる外部力を加えるにあたって、どのような技術を採用してもよい。例えば、伸長用の外部力として電気的または機械的な力がある。最適な伸長に必要とされる外部力の正確な量は例えば特定のゲル組成物および伸長させるべき核酸分子に応じて変化するが、ゲルパラメーターの最適化は過度の実験操作を行わなくとも、例えば以下の第５．２節に記載する可視化および測定技術を利用して、簡単にアッセイすることができる。
伸長は例えば単一核酸分子を含有する溶融アガロースゲルの内部で流動力を生じさせることにより達成できる。このような流動力は核酸／溶融ゲル組成物を２つの固相表面の間、例えばスライドグラスとカバーグラスの間に配置することで引き起こすことができる。このような実施態様では、好ましくはスライドグラスに一つの穴が存在し、その穴から伸長核酸分子操作用の試薬をゲルに導入できるようになっている。これとは別に、核酸／溶融ゲル組成物を、例えば以下の第５．４節に記載するようなテフロンスタンプに押しつけることによっても核酸分子を伸長させることができる。
加えて、例えばパルスフィールド電気泳動（米国特許第4,695,548号）やパルス方向づけ（pulsed oriented）電気泳動（ＰＯＥ）を始めとする標準電気泳動法により電気的力を発生させてもよい。電気泳動技術を使用する場合は、顕微鏡検査技術による可視化に適した装置が好適である。一つのこのような具体例は図１、図２および以下の実施例４に示すような小型のＰＯＥ装置である。
ＰＯＥは短い電気パルスを用いてフィールド角を作りかつ変化させることによりサンプル中の多分散ポリマー分子の分離を改善する。有効なフィールド角は持続時間、強度、方向が変化しうる一連のパルスのベクトル和により規定される。パルスタイムとパルス強度を調節して分離を行う。また、ＰＯＥはイメージングの間に有効フィールド角を作るにも有用である。必要な装置は顕微鏡に合うように簡単に改作することができる。
ＰＯＥ用の代表的な実験室装置を図１に例示し、概略図を図２に示す。
図１に例示した装置は米国特許第4,473,452号に記載された装置の小型版と類似しているが、ＰＯＥ装置が別個の電極配列の二極操作を可能にする２組のダイオード３４をもつ点で相違している。ダイオード３４は同様の電気的絶縁をもたらす多編成継電器（示してない）で置き換えることができる。しかし、非常に速い（１秒未満）パルスが必要なときはダイオード３４を用いることが最良である。
図１および図２に示すとおり、本発明で用いる小型電気泳動チャンバー５０はだいたい標準的なカバーグラスのサイズである。これは電極４２’を有し、電極４２’はダイオード３４に接続されている（図２）。所望の電場を発生させるために、図２に示すように白金電極４２’を相互連結させてある。特に、ｄ−ｃ電力供給器２８がｄ−ｃ電力を継電器３０に供給し、継電器３０は電力供給器２８からのｄ−ｃ電力に所定の出力を接触させるべくコンピュータ３２により制御される。コンピュータ３２はｄ−ｃ電力供給器２８も制御しているので電力供給のポテンシャルを変えることができる。継電器３０への出力は各電極のそれぞれのダイオード３４を通って電極４２’に接続される。
図１に示すように、この小型ＰＯＥ装置は顕微鏡の載物台にぴったり合うホルダー５２を有する。アガロースゲルを保持するスライド５４をホルダーの中に置き、電極４２がアガロース電気接続用ウィック４４に数滴の３０％グリセロール−アガロースを配置することでスライドグラス／ゲル／カバーグラスのサンドイッチ構造と電気的接触する。グリセロールはゲルのひからびを防止する。ホルダー５２の一部である電気コネクター４６は図２に示す二極性ダイオード３４およびパルス発生装置への連結部を提供する。
米国特許第4,473,452号に記載された装置の場合と同様に、今回例示した装置は電場を発生するもので、この電場は互いに直交し、下記のような所定のパルス発生ルーチンに従って互いに位相を異にして高強度と低強度の間で交互に変わり、そして発生した電場のそれぞれの方向に対してほぼ直角の全方向でゲルマトリックスを通って漸増的に分離を受ける分子を移動させる。新規な二極性の電極設計のため、電極により生じる有意な電場のゆがみを起こすことなしに、交互に変わる高強度と低強度に加えて、所望により同時に、極性を変えることが可能である。
電極配列の配置によってではなくパルス発生ルーチンによって有効フィールド角を決定することは、さもなくば困難な分子の方向づけ（および分離）を可能にする。下記の実施例４に記載するように、ＰＯＥはＤＮＡ画像化実験に使用されてきた。図１、図２に示し、実施例４で使用した電気泳動装置は米国特許第4,695,548号の装置より好ましい。というのは、従来のパルスフィールド電気泳動により教示されるように電極を移動させることでフィールド角を変えることは、顕微鏡の載物台の物理的拘束のために実用的でないからである。
上述したとおり、ゲルベースの技術は約２０ｋｂから染色体サイズ（すなわち１０００ｋｂより大）までの大きさの単一核酸分子を成功裏に解析することができる。したがって、伸長すべき単一核酸分子の調製技法として、過度の剪断を回避できるものを選択すべきである。このような技法は当業者には公知であり、例えば以下に記載するような技法がある。
第一に、米国特許第4,695,548号に記載されるような、破損なしに大きなＤＮＡ分子を調製するためのアガロース包埋細胞溶解物技法を、本発明のゲルベースの伸長技術とともに使用するために適合させることができる。例えば、細胞を洗浄し、溶融した低融点アガロースと混合し、その後固化させる。次に、得られた塊をＥＤＴＡ、プロテアーゼおよび界面活性剤を含有する細胞溶解用の溶液に入れ、この溶液を塊の中に拡散させると細胞が溶解し、結合タンパク質をはぎ取られた無傷で裸のＤＮＡ分子となる。物理的操作を行わないのでＤＮＡは本質的に無傷のままである。その後アガロースを融解させて、上記のような外部の伸長力をかける。あるいはまた、最初に染色体ＤＮＡを、例えばパルスフィールド電気泳動のような標準法により、染色体の集団に分割することができる。その後、例えば同一染色体のコピーの集団から成る分割ＤＮＡ集団を上記のゲルベース伸長法にかけることができる。
さらに、縮合剤を用いて、ゲル結合核酸分子を、適宜に塩化ナトリウムや塩化マグネシウムなどのイオン性化合物の添加により、折りたたみ不能な剪断抵抗性の小さいボールに折りたたむことができる。縮合剤としてはスペルミンが好ましい。実施例１０に後述されるスペルミンプロトコールは、検出可能な剪断媒介破損をまったく起こすことなく、極端に長いＤＮＡ分子の固定を可能にする。こうした技法により極端に長い鎖長（すなわち約５．６Ｍｂ）の核酸分子を認めうる剪断なしに上首尾で縮合させることができた。実際、どのような大きさの核酸も実質的な剪断なしにゲルに挿入できるということは考えられることである。スペルミンの使用が好ましいが、このような核酸分子を折りたたむのに適した他の物質として、特定の核酸分子を折りたたませる物質、例えば優先的に核酸分子を溶媒和させる縮合剤がある。こうした物質の追加例として、スペルミジン、アルコールおよびヘキサミンコバルトがあるが、これらに限らない。スペルミン縮合ＤＮＡを溶融アガロースに加え、解縮合させ、その後ここに記載の技術により伸長させることができる。さらに、大きな核酸分子を、例えば標準的なパルスフィールド電気泳動法を使って、電気泳動的に最初に分離してもよい。その後分離した目的の分子を含有するゲルの部分を切り出すことができる。
ゲルの切り出し部分はその後本節に記載するゲルベースの技術の一部として使用することができる。さらに、溶液中の核酸分子を溶融アガロース液と穏やかに混合して、本節で述べる技術の一部として利用することができる。
単一核酸分子がここに述べたように満足のゆく程度に伸長され、ゲル組成物内に固定されたら、以下の第５．３節に記載する解析および／または操作技術のいずれかをルーチンに利用することができる。
5.1.2. 固相表面ベースの技法
固相表面ベースの技法は、本節に記述するように、個々の核酸分子の迅速な、制御可能で、かつ再現可能な伸長および固定のために利用することができる。個々の核酸分子を本節に記述するように固相表面上で伸長および固定したならば、第5.3節に記載の解析および／または操作技法の任意のものを容易に実施することができる。
このような固相表面ベースの伸長／固定技法は、個々の核酸の解析／操作の使用法にとって有利な点を多数もたらす。例えば、核酸分子の画像は非常にシャープで、かつ明るい。これは、部分的には、ゲルベースのイメージ散乱がないためであり、また視野における外来の蛍光背景がより少ないためである。さらに、固定技法をより正確に制御することが可能であり、例えば、上記5.1.1節にゲルベースの技法に関して記述したものより幾分厳格になし得る。したがって、本節に記述する固相表面ベースの技法は、個々の核酸分子（第5.1.1節に記載のゲルベースの技法を用いて現在使用できるものよりも遙かに短い長さの個々の核酸を含めて）に由来する高分解核酸解析情報の迅速な生成を可能とする。
広範なサイズの核酸分子、すなわち約300bpから哺乳動物染色体のサイズ（これは1000kbより大きい）までが、ここに記述する固相表面上で効率的に伸長され安定に固定され得る。これらの技法は、伸長される核酸分子の生物学的機能を維持し、かつそのうえ伸長された個々の核酸分子の操作および／または正確な解析を可能とする、穏やかな固定方法を特徴とする。さらに、ここに記述する固相表面ベースの技法は、伸長された核酸分子の保存および再使用を可能とする。さらに、ここに記述する固相表面ベースの技法は、第5.4節に記述するように、高処理量の方法に容易に適合させることができる。
本節に記載の伸長手順は、第5.1.2.2節に記述するように陽電荷密度を示す固相表面を利用する。しかし、第5.1.2.1節に論じるように、伸長、緩和、安定性及び生物活性の各パラメーターの間でバランスをとるために、陽電荷密度は最適化されなければならない。
5.1.2.1. 固相表面の最適化
核酸分子を固相表面に結合させた過去の例とは違って、ここに記述する制御された、再現可能な固相表面伸長／固定技法は、表面、特に個々の核酸分子を再現可能な形で伸長し、固定するガラス表面を利用するものである。第5.1.2.2節に詳述するように、ここに記載の表面は陽電荷密度を示す。しかし、例えば第5.3節に記載のゲノム解析技法が実施できるように固相表面電荷を最適化するためには、数種類のパラメーターを考慮に入れなければならない。
本発明の固相表面は、伸長、緩和、安定性および生物活性を含む数種のパラメーターの間で最適なバランスを達成する陽電荷密度を示さなければならない。表面の最適化を可能とするアッセイを本節に記述する。
第一に、固相表面は低度の緩和を見越しながら、分子ができるだけ完全に伸長されることを可能としなければならない。ここで「低度の緩和」とは、伸長された核酸分子が切断された時に約0.5ミクロンから約5.0ミクロンの空隙をもたらす緩和のレベルをいう。これら２つのパラメーターの間の最適なバランスは、改善されたイメージングの可能性をもたらす。例えば、伸長および緩和可能性の間の有効なバランスは、新たに形成され大きくなりつつある空隙が制限酵素開裂部位で発達するにつれ、その画像化を容易にする。
伸長／固定固相表面の陽電荷密度を最適化する時は、伸長および緩和に加え、伸長された核酸分子に保持される生物活性も考慮に入れねばならない。さらに、伸長された分子の表面上における安定性も考慮されねばならない。制限酵素消化物（すなわち、光学的マッピング手順の一部として）の場合、「安定性」とは形成された制限断片が固相表面上にいかに良好に保持されるかをいう。
これらの各パラメーターの間の最適バランスを表す陽電荷密度を決定するための第１工程として、上記陽電荷密度（例えば、表面誘導体化のレベル：第5.1.2.2節参照）を、表面上に置かれている核酸分子の測定された平均分子長に対して滴定することができる。表面上の分子数（すなわち表面上に置かれている数えられる分子の数）もまた測定することができる。
陽電荷密度（例えば誘導体化）が低レベルの場合、表面上の平均分子伸長は低い。これは、この電荷濃度では伸長した分子を安定に保持するのに十分な核酸結合部位が存在しない、という事実によるものかもしれない。陽電荷密度（例えば誘導体化レベル）が増大するにつれ、平均核酸分子伸長もまた増大し、ついにピークに達する。陽電荷密度（例えば誘導体化の量）がさらに増え続けるにつれ、分子伸長の平均量は減少し始める。これは、存在し、そして伸長を推進するすべての流動力（flow forces）が圧倒され、そのため分子伸長がある程度抑制されるほど豊富な核酸結合部位が存在することによるものかもしれない。
最大核酸分子伸長をもたらす陽電荷密度（例えば誘導体化レベル）が一旦達成されたならば、そのために個々の分子が使用される特定のイメージングまたは分析手順との関連において、伸長パラメーターを試験しなければならない。そのような試験は、核酸分子の生物活性の評価および伸長核酸の緩和レベルの測定を包含する。例えば、伸長された核酸分子を光学的制限地図作成に使用する場合、伸長／固定のレベルは、制限酵素による切断および発生しつつある制限酵素開裂部位の容易なイメージングを可能にする緩和レベルの提供を考慮に入れたものでなければならない。
光学的マッピングの場合、上記のような試験の１つは、伸長された核酸分子の消化、ならびに第一に酵素の切断効率の測定および第二に新しい開裂部位に発生しつつある空隙の大きさの測定（その結果、緩和を測定する）を含む。少なくとも約50%の切断効率が生物活性保持の許容されるレベルである。許容される緩和レベルは先に記述した通りである。
さらに、伸長させた核酸分子の安定性を確かめなければならない。上に述べた通り、光学的マッピングの場合、安定性とは表面上に新たに形成された制限断片の保持レベルをいう。光学的マッピングのためには、許容される安定性レベルは新たに形成された制限断片の少なくとも約80%が保持されるレベルである。
5.1.2.2. 固相表面の陽電荷密度
個々の核酸分子の光学的伸長および固定のために、種々の簡便な操作により固相の平らな表面を調製することができる。第一に、例えば表面を誘導体化して陽電荷密度を生じさせることができる。この陽電荷密度は、第5.1.2.1節に記載のアッセイを利用して最適化することができる。さらに、簡便な操作を実施して表面陽電荷密度を可逆的に調節し、核酸伸長、固定分析および／または操作工程の各工程においてより正確に表面電荷密度を最適化することができる。このような可逆的な電荷密度の調節を以後「任意固定（facultative fixation）」と呼ぶ。第三に、個々の核酸分子の伸長／固定にさらに影響を及ぼす別の方法が論じられる。これらの方法には、例えば制御された乾燥、陽電荷密度勾配の生成、および伸長された核酸分子の架橋のための方法が含まれる。
5.1.2.2.1. 表面誘導体化
核酸分子との相互作用を恐らくは助ける陽電荷密度を作り出す任意の方法を用いて、表面を誘導体化することができる。対象の表面に吸収され、または共有結合し、そして陽電荷密度を表面に導入する任意の化合物を誘導体化剤として利用することができる。このような化合物は、好ましくは、蛍光性であってはならない。例えば、対象の表面に吸収される、または共有結合する、アミノ基を含有する化合物を用いて表面を誘導体化することができる。そのようなアミノ基含有化合物は、例えばガラス等の表面に共有結合することができるアミノ基含有シラン化合物を含み得る。これらのアミノ基含有シラン化合物には、3-アミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）、3-メチルアミノシランが含まれる。酸化に抵抗するという点で3-メチルアミノシランの使用がある場合には有利であるが、APTESは架橋が可能であるという点で有用であり得る。
非共有的に表面に吸収される誘導体化剤のうち、ガラス表面等は例えばポリ-D-リシン（ポリリシン）によって誘導体化することができる。ポリリシンは静電相互作用によってガラスに結合する。ポリリシンは圧力に基づく伸長技法（第5.1.2.3節参照）に特に有利であり得る。誘導体化剤としてポリリシンを用いる場合、ポリマー性ポリリシンのサイズを考慮に入れなければならない。例えば、低分子ポリリシン（例えば分子量200,000未満；約90,000が好ましい）は、高分子ポリリシン（例えば分子量200,000以上；500,000が好ましい）よりも伸長された核酸をより強固に固定するように思われる。したがって、ポリリシンを有する固相表面上で伸長および固定を行なう際は、低分子ポリリシンがより強固な固定のため、例えば小さい核酸断片の固定のために好ましいであろう。
表面の誘導体化は簡便な、再現性のある技法を用いて達成することができる。例えば、APTESを用いて表面を誘導体化する場合は、ガラス表面等の清潔な表面を酸性APTES溶液中で一定時間インキュベートすることができる。インキュベーション時間を長くすると、得られる表面電荷密度が増大する。個々の核酸分子がそれらのポリマー輪郭の長さ（polymer contour length）の約50-100%まで伸長される条件を選択することが好ましい。
このようなAPTES誘導体化法の一実施態様においては、清潔なガラス表面を濃度約0.10M、pH3.5のAPTES溶液中で約65℃で適切な時間インキュベートすることができる。このような実施態様におけるインキュベーション時間は、約３時間〜約18時間であり得る。誘導体化プロセスを停止させるには、表面をAPTES溶液から取り出して高度な純水を用いて繰り返しすすぐだけでよい。次に、清潔な、誘導体化された表面を空気乾燥する。
ポリリシンを用いた表面の誘導体化については、ガラス表面等の清潔な表面をポリリシン溶液中で誘導体化することができる。誘導体化に使用されるポリリシンの濃度および分子量はインキュベーション時間あたりに達成される誘導体化のレベルに影響を及ぼす。ポリリシン濃度を上げると、形成される表面電荷密度は増大する。光学的マッピングの目的のためには、個々の核酸分子がそれらのポリマー輪郭の長さの約100%まで伸長される条件を選択しなければならない。
このようなポリリシン誘導体化法の一実施態様においては、清潔なガラス表面を分子量約350,000、濃度約10-6〜10-7g/mlのポリリシン溶液中で一晩室温でインキュベートすることができる。インキュベーション後、誘導体化されたガラス表面を高度な純水を用いてすすぎ、そして空気乾燥させるか、またはレンズティッシュペーパー（lens tissue paper）を用いて拭う。光学的制限地図作成等に適切な核酸伸長レベルを達成する条件が望まれる。
上記のような誘導体化剤の使用を伴う方法に加え、多数の別の手段によっても陽電荷密度を表面に導入することが可能である。そのような陽電荷密度は、２〜３例を挙げるならば、プラズマ誘導体化、（電荷を作り出す）静電発電機、またはコロナ放電等によって上首尾に表面に導入することができる。
5.1.2.2.2. 任意固定
ここでは固相表面の陽電荷密度の可逆的調節方法を記述する。このような方法は、伸長、固定および解析／操作工程の各工程において固相表面電荷密度を最適化するために設計されている。このような可逆的な電荷密度の調節をもたらし得る方法には、塩濃度、二価カチオン濃度、有効水濃度、および／またはｐＨの変更が含まれる。
任意固定を用いて、本明細書に記述する個々の核酸技法の各工程に適合するように表面陽電荷密度を変えることができる。例えば、粗い電荷密度に好都合である可逆的条件下で核酸分子を固定し、より高度の核酸分子の拡散をもたらすことが望ましいかもしれない。次に、例えば制限酵素消化工程のために電荷密度を増大させることができる。さらに、開裂後に緩和空隙が全く形成されないほど強固に固定された分子を消化し、そして次に空隙が形成され得るように電荷密度を下げることが望ましいかもしれない。最後に、サンプルを保存する場合は、非常に高い電荷密度を選択することができる（すなわち、新たに形成された制限断片が保存中に表面から解離しないようにする）。
塩濃度に関しては、表面自体の塩濃度が上昇するにつれ（例えば０から5M NaClへ）、表面陽電荷密度は低下する。二価カチオン（例えばMg2+、Ca2+）濃度に関しては、表面を囲む緩衝液中の二価カチオン濃度が上昇するにつれ（例えば1mMから1Mへ）表面陽電荷密度は低下する。増大する濃度の非水性物質の添加により有効水濃度が低下するにつれ、表面陽電荷密度は上昇する。
ｐＨを変化させることは、表面の電荷密度を可逆的に調節する穏やかで迅速な方法を表す。低いｐＨは陽性に荷電した環境を促進し、他方高いｐＨはより低く陽性に荷電した、より中性の環境を促進する。
アミノ基含有グループ、例えばアミノシラン化合物を用いて誘導体化した表面を例にとると、ｐＨ約６が陽電荷密度をもたらす。ｐＨを上げると、ｐＨ9〜10で電荷が本質的に中性になるまで電荷密度は低下する。種々の簡便な方法を利用してｐＨに基づく任意固定を達成することができる。例えば、種々のｐＨを有する緩衝液（Trisまたはリン酸緩衝液等）に表面を暴露することができる。さらに、ガスにより誘導されるｐＨ変化が可能である。例えば、誘導体化した表面を浸した緩衝液上に緩衝液が酸性化するようにＣＯ2ガスを導入し、これによって表面上の全電荷密度を増大させることができる。または、例えばアンモニアガスを緩衝液上に導入し、緩衝液のｐＨを上昇させ、これによって全表面電荷密度を低下させることができる。これらのガスに基づく方法は、緩衝液が任意固定プロセスを通して混乱させられずにいるという点で固相表面上の可能性としての物理的混乱を最小にすることが必須である場合に、特に有用である。
5.1.2.2.3. 他の陽電荷密度法
誘導体化の勾配： 全固相表面の均一な、制御可能な誘導体化に加え、再現可能な形で誘導体化の勾配を形成することもまた可能である。このような誘導体化の勾配は、例えば固相表面上に置かれた誘導体化剤の液滴を用いて形成することができる。表面に置かれると、このような液滴はメニスカス（meniscus）を形成し、固相表面にとって利用可能な誘導体化剤が液滴の内部よりも周辺部分でより高濃度となるであろう。これが次に、誘導体化の勾配をもたらし、固相表面の内部におけるよりも外部において液滴が高いレベルの誘導体化を示す。
このような誘導体化の勾配は、完全に伸長された分子のパーセンテージをより高くする。さらに、核酸分子を横切って生じた張力のため、より有効なレベルの整列（aligning）およびパッキングが観察され、その結果、イメージング視野あたりの使用可能な分子の量が最大限となる（本発明の目標の１つ）。
架橋： 本発明の個々の伸長された核酸分子は、付加的に、固相表面に架橋することができる。このような架橋は、分子を永久に表面に固定するのに役立ち、このことは種々の理由により有利である。例えば、非常に大きい核酸分子を用いて作業をする場合、架橋は有用であり得る。さらに、核酸損失の可能性が全くない状態で固相の表面特性を調節することが可能である。さらに、保存または長い反応の間に起こりうる許容できない核酸断片の損失または緩和の可能性が、架橋を行なった場合は存在しない。
ここで利用する架橋は、これらの節に記述する伸長／固定技法と共に実施されるべきものである。第一に、所望のレベルの伸長を決定して達成し、そして次に伸長させた核酸を永久固定するために架橋する。
グルタルアルデヒド架橋およびＵＶ架橋を含め、多数の架橋法が利用可能である。グルタルアルデヒド架橋は、例えば10mMグルタルアルデヒド溶液中で５分間インキュベートすることにより実施することができる。ＵＶ架橋は、例えばストラタリンカー（Stratalinker; Stratagene）を用いて標準的プロトコールにしたがって実施することができる。
制御された乾燥： より大きいパーセンテージの完全に伸長された核酸分子の生成を促進し、また、より低レベルの分子間オーバーラップまたは錯綜を示す乾燥特性をもたらす別の化合物を、核酸を固相表面に付着させるための水性溶液中に加えることができる（核酸付着技法については下記参照）。上記乾燥特性の両方の特徴は、分析の目的にとって極めて有用である。
伸長方法におけるこのような制御された乾燥のために添加することのできる化合物は、グリセリン、DMSO、アルコール、ショ糖、フィコール（Ficoll）等の中性ポリマー、および硫酸デキストランを含むが、これらだけに限定されない。これらの作用機構は不明であるが、これらの化合物が上記の特徴を促進する液晶状態を助長することはあり得る。
疎水性マイクロウエル： 実質的に「マイクロウエル」として役立ち得る固相表面の部分に疎水性領域を導入することができる。これらの疎水性領域は閉鎖された境界を創成し、それらは異なる試薬の固相表面上の異なる部分への導入を可能とし、その結果、多数の異なる反応を同一の固相表面上で同時に実施することが可能となる。
前固定（prefixation）技法： 本発明の固相表面は、伸長させるべき核酸分子の導入に先立って、対象となる作用物質（例えばタンパク質）を用いて前固定することができる。タンパク質を当業者に周知の架橋手段等の常套手段によって固相表面に固定することができる。本発明の固相表面に前固定することのできるタンパク質には、核酸分子または他の任意の核酸結合タンパク質を操作するのに用いられる制限酵素等の酵素がある。したがって、このように前固定した酵素を含む固相表面上で核酸分子を伸長し、そして上記酵素が核酸に作用するのに必要な付加的作用物質（特定の二価イオン等）を添加した後に、個々の核酸分子を操作する（例えば、適切な切断部位で開裂する）ことができる。このような前固定技法を用いて、多数の異なる反応を同一の表面上で同時に実施することができる。
5.1.2.3. 単一核酸分子の付着
上に記述したように、広範なサイズの核酸分子を本発明に記述する誘導体化固相表面に付着させることができる。具体的には、このような固相表面を用いて約300塩基対から1000kb以上の核酸分子を分析することができる。比較的剪断抵抗性である小さい核酸分子は、当業者に周知の標準的核酸精製技法を用いて単離することができる。これらの小さい核酸分子は約150kb未満であり得る。一般的にはそれらは約20kb未満である。剪断現象による破壊を受けやすい大きい核酸分子は、例えば第5.1節に記載の核酸分子単離技法を利用して単離することができる。このような剪断感受性核酸分子は一般に150kbより大きいが、約20kbより大きい分子を含み得る。
大きい核酸分子（すなわち、約90kbより大きいもの）は一般に剪断力による破壊を最小限にする方法で固相表面上に付着させなければならない。したがって、好ましくは、これらの大きい核酸分子は溶融アガロースを用いて固相表面上に置かれる。例えば、伸長を容易にする流動力を生成する条件下で、核酸分子を含有する溶融アガロースを表面に塗布することができる。好ましい実施態様においては、核酸分子を含有する溶融アガロースの液滴または小滴を表面上に付着させる。液滴が表面を打った時に生成される力は、必要とされる伸長を提供するのに十分である。固化後、アガロースを表面から剥がし取り、無傷な、伸長され固定された核酸分子を残す。
小さい核酸分子（例えば、約300bpから約90kbのもの）を付着させる場合は、上記のゲル技法を利用できる。さらに、水性溶液を用いてこれらの核酸分子を表面上に付着することができる。次に、種々の方法によって伸長を達成することができる。例えば、片方が誘導体化表面である２つの表面の間に分子を挟むことができる。このような方法においては、２つの表面のうち一方が試薬を導入する穴を含んでいなければならない。または、誘導体化表面上の核酸分子を含有する溶液を、例えばテフロンスタンプ（teflon stamp）を用いてプレスすることができる。
しかし、好ましくは、このような水性様式で表面上に置いた核酸分子を、ただ単に水溶液を乾燥させることによって伸長させることができる。したがって、本発明の誘導体化表面上へ単に置く以外は何の操作も行なわずに、個々の核酸分子は効率的に、上首尾に、かつ迅速に、イメージングおよび／またはさらなる操作に適した安定に伸長され固定された核酸分子を生成することができる。以下の第5.4節に記述するように、このような技法は高処理量の解析技法に特に適している。
5.1.3. フローベースの技法
本発明の個々の核酸分子を本節に記述するようなフローベース（flow-based）の技法によって伸長し、操作しおよび／または解析することができる。このような技法は、対象の核酸分子が低濃度でしか使用できない場合に特に有用であり得る。
簡単に述べると、このようなフローベースの技法は、個々の核酸分子を層流伸長装置に導入することを包含する。装置内に穏やかな溶媒の流動場（flow fields）が生成され、これらの場は重大な剪断を引き起こさずに核酸分子を伸長させる。さらに、伸長された核酸分子が層流伸長装置内を流動するにつれ、例えばこの装置に接続した顕微鏡およびカメラによりこの分子を画像化することが可能である。さらに、本節に記述する方法は伸長された核酸分子の制御された、領域特異的制限酵素消化を可能とする。これを装置の流動側面と結び付けると、リアルタイムの制限地図の生成が可能となる。
このような層流伸長装置の好ましい態様を図25に示す。簡単に述べると、ゲル挿入物から核酸分子を遊離させ伸長させるために設計されたこのような装置は、抽出領域および観察（viewing）／操作領域を備えた層流チャンバーから成る。図25に図示した装置は１個の層流チャンバーを示しているが、多重層流伸長装置を利用することもできる。そのような装置は、例えば同一の核酸の複数コピーの多重分析が迅速に達成できるような、分岐した層流チャンバーを含むことができる。
層流チャンバーは狭い空間、例えば10〜20ミクロンの開口部によって形成される空間を含まなければならない。該チャンバー内で生成された溶媒の流れは、核酸分子の重大な剪断を避けるに十分なほど穏やかでなければならない。例えば、許容できる流れは開口部が100x20ミクロンで約5x10-2nl/秒であろう。流体の流れは、抽出および観察／操作領域の上流でチャンバーに連結したポンプ手段によって生成することができる。または、抽出および観察／操作領域の下流でチャンバーに連結した真空手段によって生成することができる。
抽出チャンバー（層流チャンバーがそこを通過する）は、ゲル挿入物から核酸を遊離させると同時にその核酸を装置の流れの中に移すのに役立つ。このような抽出チャンバーは、そこを経て核酸が挿入物から出て層流チャンバーの流れに入っていく電場を生じる電極から成る。
観察／操作チャンバーは、層流チャンバーがそこを通過する顕微鏡／光源を備えたチャンバーから成る。顕微鏡は好ましくは油漬け対物レンズを含むエピフルオレセンス（epifluorescence）顕微鏡である。ここにカメラ（好ましくはビデオカメラ）が接続されている。分子が観察／操作チャンバーを通過する際に、伸長された核酸分子を可視化し、そして場合によりそれらの画像を記録することができる。
このような方法の好ましい態様においては、核酸分子が観察／操作チャンバーを通過する際に該分子を酵素的に操作する。光学的マッピングを例にとると、伸長され流れていく核酸分子を、それらが観察／操作チャンバーを通過する際に制限酵素を用いて消化することができる。
例えば、層流チャンバー内の流体は、制限酵素および該チャンバー内を流れる核酸分子を消化するのに必要な試薬のそれぞれを含むことができる。ただし、酵素活性に必要な二価カチオン（通常はMg2+）は可逆的にキレート化された形で存在する。したがって、核酸は二価カチオンが遊離されるまで消化から守られる。二価カチオンを例えば第5.3節に記述するようにDM-ニトロフェン等の光不活性化キレート化剤を用いてキレート化することにより、該カチオンは流体が顕微鏡光源を通過する際に観察／操作チャンバー内で放出され得る。したがって、核酸分子は観察／操作チャンバーを通過する際に初めて消化を受けるようになる。さらに、消化が起こると、流れは生じる制限断片の順序を維持し、これらの断片は画像化され、それゆえリアルタイムで作成された制限地図を即座にもたらす。このような光不活性化キレート化剤の例は以下の第5.3節に記述する。
5.2. 単一核酸分子のイメージング（画像化）およびサイジング（サイズ測定）技法
本発明によれば、対象となる種々の分子パラメーターの推定値を得るための多数の異なる技法を用いて、伸長され、そして恐らく固定された単一核酸分子をイメージングし、サイジングすることができる。この目的のため、本発明の好ましい実施態様において、イメージングされる分子はまず一般的に分子のサイズに比例して分子に吸収される蛍光色素を用いて染色される。次に、以後のプロセシングのために分子のデジタル画像を生成する。特に、画像化された分子のサイズを、適切な光源を用いて分子を照らした時の分子の蛍光強度の測定、デジタル化した分子の輪郭の測定、または一連のデジタル化画像を用いて測定した分子の緩和の力学から決定することができる。本発明の異なる実施態様による核酸分子のイメージングおよびサイジング工程を以下により詳細に述べる。
5.2.1. イメージング
本発明による第１のプロセシング工程は、対象となる分子を後のイメージングに使用可能とするために染色することである。下記の表は、本発明の好ましい実施態様においてイメージングの目的のために用いられる蛍光色素を纏めて示す。
Figure 0004511636
本発明によれば、分子を蛍光ビーズおよびアルカリホスファターゼを使用する化学発光標識を使用してイメージングすることができる。一般に、直径がちょうど0.01μmである最も小さいビーズを含む単一蛍光ビーズは、蛍光顕微鏡により容易にイメージングされる。蛍光ビーズは、画像処理として単一ＤＮＡ分子を標識するための信頼できる方法を提供する。なぜならば、個々のビーズは蛍光が強く、形態学的に区別可能であり、スペクトル特性が異なる広範囲の蛍光色素が手に入り、オリゴヌクレオチドに容易に結合するからである。（しかし、実際には、レイリー限界を超えると、ビーズは、画像処理には不適切な輝点として現れる。）ラテックスビーズは、例えば、Molecular Probes, Inc.によって市販されており、カルボキシレート、アビジンまたはストレプトアビジンで被覆されて、６種類のスペクトル（色）および0.01〜2μmの範囲のサイズで市販されている。カルボキシレートで変性したビーズおよびストレプトアビジンで被覆したビーズは、ビーズをＤＮＡ分子に結合させるための多くの代替物を提供する。
さらに、合成オリゴヌクレオチドは、一連の種々のサイズの蛍光ビーズ（0.01〜0.05μm）に共有結合させてＲＡＲＥ条件を最適にすることができる。（ＲＡＲＥは、RecAによって補助される制限エンドヌクレアーゼを表す。ＲＡＲＥ技術は、第5.3.1.にさらに詳細に記載されている。簡単に述べると、この技術は、特定のハイブリダイゼーション産物内でのみ生じる制限エンドヌクレアーゼ開裂の発生を含む。）より小さいビーズが一般には好ましい。なぜならば、容易にアガロースゲル中に拡散するからである。他方、より大きいビーズは、その表面積が大きいことから、誘導が容易である。同じサイズの蛍光ビーズは、ゲル内を電気泳動させて、蛍光によりイメージングすることができる。これらの変性オリゴヌクレオチドを使用したRecAフィラメントの生成、およびそれらの生成のＲＡＲＥ試験系でのアッセイも、イメージングのために使用できる。
5.2.1.1. 化学発光検出
サザンブロット法（および他の方法）での非同位体検出に対するオリゴヌクレオチドの化学発光標識は、特にその感度が高いことから、よく用いられる標識法である。その方法は、一般に、アルカリホスファターゼをオリゴヌクレオチドに結合させ（市販の系を使用）、次いで標的ＤＮＡにハイブリッドさせることから成る。ハイブリッドの形成後、化学発光基質、通常は、急速に分解して化学発光発生化合物になる１，２−ジオキセタンを添加する。次いで、最大470nmで、半減期が2〜30分である光を、化学環境に応じて照射する。
その方法の感度が高く、高品質の市販キットが手に入るならば、化学発光を本発明に従って使用し、単一ＤＮＡ分子上でＲＡＲＥを光学的に検出することができる。例えば、市販のキットを使用すると、アルカリホスファターゼは、オリゴヌクレオチドに共有結合することができ、また、ＤＮＡはビオチン−ストレプトアビジン結合に結合することができる。次いで、複合オリゴヌクレオチドがRecAフィラメント中に生成し、ＲＡＲＥ効果が試験される。過剰のビオチニル化アルカリホスファターゼは、その系から容易に透析除去され、ビオチン−ストレプトアビジン媒介アルカリホスファターゼ結合を使用して予期せぬ化学発光を減少させることができる。化学発光検出系は、ＲＡＲＥおよび基本的な光学的マッピングとともに使用することができる。RecA−オリゴヌクレオチド（アルカリホスファターゼに結合）−標的ＤＮＡ複合体を溶融アガロースゲルに入れた後、光学的マッピングのために取り付ける。マグネシウムイオンを使用して酵素的開裂を誘発する代わりに、好ましい態様では、ＲＡＲＥ部位の可視化のために化学発光系で必要とされることから、ジオキセタンを拡散させる。次いで、化学発光活性は、照射を必要とすることなく、ＩＣＣＤカメラを使用した顕微鏡により可視化できる。分子全体のイメージングには、最初の化合物が化学発光を消失させたり、妨げるならば、ＤＮＡ−蛍光色素の蛍光および種々の蛍光色素を使用することができる。
5.2.1.2. イメージングされるエネルギー移動
本発明によれば、分子イメージングの別の方法は、蛍光色素で標識したＤＮＡとオリゴヌクレオチドに結合したビーズとの間のエネルギー移動を使用することである。励起は、ＤＮＡ−蛍光色素複合体を供与体とし、ビーズを受容体とするように選択することができる。しかし、この場合、ビーズは、供与体の100Å以内にいる場合にのみ蛍光を発することができ、エネルギー移動の効率は、距離とともに急速に低下する。種々の顕微鏡フィルターを組み合わせた蛍光顕微鏡を使用したエネルギー移動イメージングは、供与体、受容体、および供与体−受容体対（これらは、都合のよいことに、照射経路に入ったり出たりする。）の可視化を可能にする。本発明の好ましい態様によれば、使用に好ましいエネルギー移動供与体は、臭化エチジウムまたはホモ二量体である。なぜならば、これらの蛍光色素はしっかりと結合し、結合すると、蛍光量が急激に増加するからである。なお、この方法の使用による潜在的な問題は、遊離蛍光色素が供与体として作用し得ることであるが、恐らくあまり影響ない。遊離蛍光色素の存在が実際に問題となる場合、イメージングされるフィラメントは２つの部分に別れる可能性があり、蛍光ビーズは、頭−頭構造で結合して、エネルギー移動イメージングに対して受容体−供与体対として作用する可能性がある。
この方法を使用するときの別の問題点は、ラテックスビーズが会合する傾向にあることである。この問題は、例えばMolecular Probes, Inc.（オレゴン州ポートランド）によって提供される発色団を適切に選択して使用することにより解決できる。会合に対して使用できる別の手段としては、イオン強度に注意しながらビーズ上にいくらかの電荷を維持すること、およびトリトンX-100洗剤またはBSAの使用が挙げられる。
その方法の次の工程では、溶融RecA−ビーズ−ＤＮＡ混合物を６−ジアミノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）で染色し、光学的マッピングのために顕微鏡スライド上に広げる。次に、次の節で述べるように、長さおよび強度の測定値を使用してビーズの位置を地図に示す。この工程では、Molecular Probes, Inc. によって供給されるような「赤い」ビーズを使用すると、ＤＡＰＩの青の蛍光と対比させることができる。
多数の標識RecAフィラメントは、あまりにも多くの蛍光ビーズフィラメントが標的分子との複合体に存在するイメージングビーズを覆い隠すので、光学的方法での別の問題点となり得る。本発明の好ましい態様によれば、次の工程を行ってこの問題を除くことができる。
（Ａ）標識フィラメントを注意深く滴定し、観察を容易にするために必要な最小のハイブリダイゼーション効率をコントラストに対して釣り合わせる。RecAによって媒介されるハイブリダイゼーションは、ＲＡＲＥメチル化および制限酵素開裂工程を必要としないので、ハイブリダイゼーション効率は、許容され得る結果に対して厳密に最適化する必要はない。
（Ｂ）未結合フィラメントは、透析によって拡散除去することができ、あるいは、ゲル固定系で温和な電気泳動を行えば、フィラメントを視野から選択的に除去し、かなり大きい標的−フィラメント複合体は正しい場所に残すことができるだろう。必要であれば、安定化のために別のRecAタンパク質を添加することができる。
上記説明は、分子のイメージング技術を網羅するものではない。必要であれば、当業者に周知の他の方法も使用することができる。
5.2.2. サイジング技術
単一核酸分子に関連する物理的パラメーターの定量的測定法は、物理的ゲノム分析の本質的に全ての面で非常に重要である。特に有用なのは、単一ＤＮＡ分子または制限酵素消化物から得られる断片のサイジング技術である。それは、高分解制限酵素地図の作成に使用できる。パルス電気泳動は、大きいＤＮＡ分子を適切に分離することが分かっているが、正確なサイジングは、他の種々の環境では問題が残っており、同様の方法を使用した独立したサイズ測定値はない場合が多い。
本発明の一発明によれば、異なるいくつかの方法が、核酸分子のサイジングに対して提案されている。これらの方法は、大きく２つに分類することができる。すなわち、（ａ）測定される分子が、測定の間、静止したままである方法、および（ｂ）分子のサイズを、分子の混乱を必要とする動的測定を使用して決定する方法である。
本発明に係る静的サイジング技術は、一般に、イメージングされる分子の相対的蛍光強度の測定およびそれらの見かけの長さの測定を含む。静的サイジングは、あまり複雑な装置を必要とせず、高処理量の同様の測定によく適するので、使用に便利である（第5.4節参照）。他方、動的、すなわち、混乱に基づくサイジング技術は、現在は高処理量の測定にはあまり適していないが、情報量、精度および解像の点で優れた結果を与える場合がある。
5.2.2.1. 静的測定技術
静的分子サイジング技術は、測定すべき分子を平面に固定し、それを蛍光染料で染色し、分子の画像を得て、イメージングした分子の、目的とするパラメーターとの関係が知られているパラメーターを測定することを基本とする。本発明によれば、静的測定で使用する場合、サイジングすべき分子はまず、上記第5.1に記載した方法のいずれかを使用して、伸長し、平面上に固定する。必要であれば、固定分子を消化するために制限酵素を添加することもできる。そのような場合、マグネシウムイオンを中に拡散させて消化を誘発し、その後、制限部位を、伸長したＤＮＡ分子の増大ギャップとして可視化することができる。このイメージング法は、分子を直接可視化することができるので、簡単で効果的であり、感度が優れている。本発明の好ましい態様によれば、分子は、第5.4節で詳述したスポット法を使用して伸長し、固定する。この方法では、溶液の小滴を規則的な格子状で平面誘導表面上に付着させ、乾燥させる。例えば図２６Ａ、ＢおよびＣに示されるように、スポットが乾燥した後、分子は、「日輪」の形状で表面上に伸長され、固定された状態を維持している。
5.2.2.1.1. 蛍光強度測定
本発明の特定の態様によれば、分子のサイジングは、蛍光染色した分子の強度の測定を使用して行うことができる。この測定法は、分子のサイズが、分子が吸収できる蛍光の量に比例するという観察に基づいており、その量は、分子をイメージングすることにより推定できる。特定の態様では、蛍光染料の量、すなわち分子サイズが、絶対蛍光強度の測定を使用して決定される。しかし、この方法では、照射源は、正確な測定値を得るために、非常に安定して、再現性のある光出力を提供しなければならない。実際には、絶対強度測定は、イメージング装置の正確な検定を必要とするが、不正確な場合が多いという事実から、分子のサイズは、基準物質、すなわち画像視野内でサイズが既知である分子の強度と比較した相対的強度を測定して決定するのが好ましい。実際には、基準物質は、単にイメージング分子の一部から成る場合が多い。
本発明の一発明によれば、蛍光強度によるサイジングの正確さは、一連の種々のサイズの基準物質を提供し、測定分子を個々の基準物質と比較することによりさらに高めることができる。測定される分子のサイズは、従って、適合する全てのサイズ測定値（すなわち、種々の分子内の相同的制限断片）を合わせて、それらの結果を平均することにより決定できる。当業者に周知であるように、この方法は、得られた測定値の数の平方根に比例するサイジング誤差の標準偏差を低下させる。所望の基準物質を得るために、本発明の重要な一発明では、制限酵素を使用して既知分子を開裂し、１個の塩基対まで知り得る物理的量を有する断片の配列にすることができる。
本発明の好ましい態様によれば、相対的強度によるサイジングは、サイジングされる分子および上記で定義した基準物質のデジタル画像を得ることを含む。好ましい態様では、高解像、すなわち、16ビットのグレーレベル解像を有する1K x 1K画像を使用する。必要であれば、デジタル画像のフラットフィールド補正を使用して、照射強度レベルを画像視野にわたって均一にすることができる。その方法はさらに、次の工程を含む。すなわち、必要であれば、スポットノイズを除くための中央フィルタリングまたは等価フィルタリング操作の施与；得られた画像を閾値処理して、イメージングした分子の輪郭に対応するバイナリー画像を得る；画像視野の照射のバックグランド量に対応する画素強度を除くためのバックグランド補正の施与；およびサイジングする分子の、既知基準物質の強度に対する相対強度の測定である。特に、サイジングする分子の強度は、バイナリー化工程で得られた分子輪郭内の全ての画素の強度を加えることにより測定される。サイジングする分子の強度測定値を基準物質の強度と比較することにより、相対的な分子サイズが決定される。すなわち、基準物質の基底サイズが既知であれば、分子の絶対サイズは、直接決定できる。相対的画像強度と分子の質量との間の関数関係は、ほぼ直線的である（すなわち、相対的強度はＭ1に比例する）。
本発明の相対的強度によるサイジング技術に伴う欠点は、測定誤差が、固定に依存して、しばしば、相対的であるよりも絶対的になる傾向があることである。これは、例えば、20kbの標準偏差が、60kbの断片に当てはまり、900kbのサイズの断片にも当てはまることを意味する。言い換えると、変動係数（平均サイズと推定標準偏差との間の比）はかなり変動し、その結果、小さい断片の測定の正確さは、より大きい断片の測定と比較して、不相応に低下し得る。次の第5.4節に記載するように、改善された蛍光色素およびより良好なカメラ装置の使用により、この問題は軽減できる。
実験的に、相対強度による光学的マッピングのサイズの下限は約300bpであり、その下限は、同じ一連の測定値に対するサンプル平均を使用することにより、より小さい断片にさらに下げることができる。下記で述べるように、最初の画像の品質が良好で、ノイズが比較的少ない場合、ＤＮＡ断片の蛍光顕微鏡を使用した方法の正確さは、1bpまで高めることができる。
相対的蛍光強度による測定の、次に述べる輪郭の長さによる方法に対する重要な利点は、分子を完全に伸長する必要がないことである。というのは、その方法は、相対的蛍光強度に依存しており、従って、吸収される染料の量によって決定されるので、たとえ固定が完全でなくても変化があまりないからである。他方、輪郭の測定の場合の正確さは、最適な固定に依存し、それは、場合によっては望ましくない。
最後に、本発明によれば、相対的蛍光強度による測定の重要な改善は、ＤＡＰＩ（ＡＴ配列を好む）または臭化エチジウム（ＧＣ領域を好む）などの配列特異的蛍光色素を使用して、分子の同様のサイズの断片を区別することにより達成できる。特に、上述したように、まず、非特異的蛍光色素による測定を行うことができる。次いで、ＤＡＰＩを使用して、種々の断片を区別すると、サイズの違いを1bpまで定量することができる。
5.2.2.1.2. 輪郭の長さによる測定
本発明の第二の態様によれば、静的核酸分子のサイズを測定する別の方法は、分子をイメージングし、その輪郭の長さを、対応するデジタル化画像の長さを測定することによって推定することである。下記に説明するように、イメージングした分子の長さから、分子のサイズを適切に推定することができる。
当業者に周知であるように、デジタル化画像における物体は、多くの場合、線と弧のパターンで構成される構造によって十分特徴付けることができる。本発明によれば、形態学的画像処理を適用して、サイジングされる分子の定量可能な位相幾何学的表示を得ることができる。本発明における形態学的処理とは、イメージングされた分子を線と弧などの一組の構成要素として表し、それによって、簡単であるが、より明らかな形状で表すことができる操作を意味する。
本発明の特定の態様では、目的とするパラメーターが、イメージングされた分子の長さであり、分子は完全に伸長しなくてもよい。イメージングされた分子の長さを推定するために、上述した画像補正およびバイナリー化工程の後、本発明の好ましい態様によれば、「間引き」として知られるアルゴリズムを使用して、イメージングされた分子を、簡単なデジタルの線および弧で表すことができる。それらは、分子の中央軸にほぼ沿っている。（物体の中央軸は、物体の最も近い境界点から等距離にある点の組として定義される。）特に、サイジングされる分子のデジタル画像は、浸食として知られる画像処理操作を使用して間引くことができる。浸食は、物体に属する１個より多くの隣接画素を有する境界画素の削除量から成る（Jain, Fundamentals of Digital Image Processing, Prentice Hall, 1989）。イメージングされた分子などの物体の中央軸がいったん決定されると、その見かけの長さは、その軸に属する連結画素の数を単に数えるだけで容易に計算できる。理解されるように、輪郭の長さの測定による方法は、ロープの長さの測定に似ており、簡単に実行できるので、自動化も容易であると考えられる。
本発明によれば、次いで、イメージングされた分子の見かけの長さを使用して、それを例えば既知の基準物質の長さと比較することにより、目的とする別の分子パラメーターを誘導する。本発明の別の態様では、系の倍率が既知であれば、分子のデジタル画像の長さは、kb測定値に直接変換することができる。
輪郭の長さによる測定は、場合によっては、特にサイズの小さい分子の場合は、上記第5.2.2.1.1節に記載した相対的強度による測定よりも正確であることが分かった。というのは、下記実施例４ならびに図４および５に示すように、蛍光顕微鏡は、適切な発色団で染色した単一のポリマー分子をイメージングして、イメージングされる分子の区別可能な輪郭を提供することができるからである。すなわち、分子の直径がほんの約20Åであっても、単一分子は、その見かけの輪郭に基づいてなおも容易に可視化され得る。他方、分子からの蛍光強度は、バックグランド強度と十分区別可能でないかもしれない。その場合は、相対的強度による測定法の方が、正確さに欠ける結果を与えるであろう。
相対的強度によるサイズ測定値の場合のように、輪郭の長さによる方法を使用したサイズ測定値は、ほぼ直線的に変化し（すなわち、Ｍ1に比例する）、感度は、下記に述べる動的測定法（Ｍ1.5-3.3を有し得る）と比較して低い。しかし、静的方法を使用する分子測定は、高処理量の系に特に適しており、実施例１０に記載するように、測定時間が、本質的に画像処理の長さに限定されるので、制限酵素消化物などのＤＮＡ断片の迅速なサイジングおよび位置決定に対して使用できる。さらに、静的測定は、分子の複雑な混乱技術を必要とせず、特定の流動および／または電界を用意する必要もないので、簡単に行うことができる。
上述した両方の静的サイジング技術の特定の実施では、画像測定を、16ビットのグレーレベルの解像を有するデジタル画像を使用して行うことができる。特に、最初の生のデジタル画像は、例えば画素の反復を使用して拡大した形で表示し、オーバーレイ（overlay）画像は、ＤＮＡの輪郭を手動で重ねることにより作成する。上記第5.2.2.1.2.節に記載した態様によれば、輪郭の長さのマップは、このオーバーレイ画像から直接作成することができる。蛍光強度測定による方法の好ましい態様では（第5.2.2.1.1.節）、13ビットの生の画像データを平らにし、オーバーレイ画像は５倍に拡大して、表面の全画素を覆うようにする。分子の一部であるとしてオーバーレイ画像に印をつけた各画素の場合、合成バックグランド量は、周囲の画素の重量平均として計算され、重量因子は距離とともに減少して、印をつけた画素に対して０となる。例えば、3 x 3または5 x 5の窓をこの目的に使用することができ、係数は、当業者に周知であるように、加えて１になるように決定される。
次に、特定の分子またはＤＮＡ断片の強度は、断片に属する全画素の強度の和から適合するバックグランドの画素の強度の和を差し引くことにより求めることができる。この測定は、オーバーレイ画像を有していた生の画像データの各フレームに対して繰り返すことができるが、焦点があまり合っていない画像を有するフレームは除く。実験の正確さを増加させるために、強度測定値は、いくつかの画像（例えば、５つの画像）に対して平均する。２つの異なる断片の相対的サイズを測定するために、同じ測定法を使用することもできる。この場合、一つの断片の長さ（または相対的強度）をｘとし、他の断片に対する同じ値をｙとすると、二つの断片の相対的サイズは、簡単に次のように計算できる。
サイズ1＝ｘ／（ｘ＋ｙ）； サイズ2＝ｙ／（ｘ＋ｙ）
同様に、断片の一方（例えば、ｙ）が後に切断されてサブ断片ｕおよびｖになる場合、例えば断片ｕのサイズは、次のように計算される。
サイズu＝〔ｕ／（ｕ＋ｖ）〕〔ｙ／（ｘ＋ｙ）〕
一連の切断に対しては、各セグメントの相対的サイズを、全断片の測定値の和に対するセグメントの測定値（ｘ）の比として同様に本発明に従って計算する。
5.2.2.2. 動的測定技術
動的緩和を使用する断片サイズの測定は、上記第5.2.2.1.節に述べた静的方法に対して重要な利点を有する。というのは、静的サイジングでは、分子が最適に伸長されることが重要である場合がある。過伸長または準最適に伸長した分子は、絶対的長さに基づく静的測定を使用して正確に測定することができない。なぜならば、この場合の分子の質量に対する関数的関係は、伸びの量に依存するからである。（しかし、先の節に述べたように、相対的サイズの測定は、分子の伸長の量の影響を受けない。）さらに、静的サイジング技術を使用する場合の特定の問題は、固定が不完全であると、不適切に固定された断片は、緩和が早まる傾向にあるということである。これは、すなわち、サイジング測定の正確さに悪影響を及ぼし得る。他方、ＤＮＡの表面への強い固定は、典型的には、一般に目に見えるギャップを得るために局部的緩和を必要とする切断部位の確認を妨げる。（しかし、本明細書に記載する任意の固定化法は、この問題を適切に処理する。）
これに対して、ＤＮＡ分子の動的測定は、正確な測定値を得るために、いつも分子を完全に伸長させる必要はない。すなわち、例えば、分子の緩和時間の測定は、典型的には、コイルの伸びの度合いに依存する。動的測定のこの重要な特徴は、例えば、Massa粘弾性技術を使用したＤＮＡ緩和時間の測定において示されている。
さらに、同様の動的測定は、分子のイメージング技術（例えば、蛍光顕微鏡）を使用して行うことができ、サイズ分布は、各分子のコンホメーション力学が別々に測定できるので、正確に決定できる。最後に、動的緩和法の使用を強いる理由は、関連する緩和時間（τ）がサイズに強く依存し、τは、Ｍ1.5-3.3に従って分子量に比例するので、サイズの区別がかなり改善され、最終的には、上記で考察した静的方法と比較してより正確であるということである。当然、実際の分子のサイズ依存性は、選択される緩和モードとともに変化する。次の節では、本発明の種々の態様に従って、分子の種々の動的サイジング技術を記載する。
5.2.2.2.1. 輪郭の光学的最大化（ＯＣＭ）
本発明のＯＣＭ分子サイジング法は、線状ＤＮＡ分子がゆるいゲルマトリックス中での電気泳動中に障害物にひっかかると、ほぼ完全に伸びて、数秒間持続し得る準安定なフックを形成するという観察に基づいている。そのようなゆるいマトリックスは、例えば、第5.1.1.節に記載したように、カバーグラス−アガロースゲルの界面に形成され得る。この場合のゲル−カバーグラスの界面は、２、３μmの深さのゆるいマトリックスから成る。これは、ＤＮＡ分子が捕らえて、上にフックを形成するのに便利な一連の「ペグ（pegs）」を提供するので、ＯＣＭサイジング法の使用には理想的である（図９参照）。つなぎ留められた、または一時的に捕らえられたＤＮＡ分子の完全な伸長には、比較的弱い電界（例えば、５〜30ボルト/cm）で十分である。フックのアームを同様にサイジングする場合、分子は、そのほぼ完全な輪郭の長さに伸ばすことができ、それは、次いで、標準的イメージング技術を使用して容易に測定することができる。ＯＣＭサイジング法を使用した本発明の好ましい態様によれば、観察される最も長いフックの輪郭の長さは、迅速に集められた一組の画像から決定され、得られた画像をデジタル的に処理することにより、分子の長さが決定される。
上述した輪郭の長さの静的測定法と違って、ＯＣＭを使用した分子の伸びの程度は最適である。実際、この方法で決定される輪郭の最大長さは、240〜680kbの間で報告されたサイズに対して直線的関係を示す。ＯＣＭサイジング法の正確さおよび精度は非常に高く、パルス電気泳動に基づく測定と同様であるか、より良好ですらある。しかし、この方法の欠点は、測定を完了するためには、一連の連続した画像を得て、加えた電界により分子が視野から離れる前に分子の最適の伸びを捕らえなければならないということである。
5.2.2.2.2. 粘弾性サイジング法
本発明の好ましい態様に従って使用される粘弾性測定技術は、コイルのコンホメーションを混乱させて、分子がランダムな状態に戻るのに要する時間を測定することに基づく。測定される緩和時間は、分子量に対する感度がかなり高く、ほぼＭ1.66として変化する。この測定法では、所定のサイズ分布内で最も大きい分子が測定される緩和を支配し、その結果、サイズ混合物は、典型的には完全には分析できない。
本発明の特定の態様では、異種サンプルのサイジングのために、コイル緩和がゲルおよび自由溶液中で測定される。特に、蛍光顕微鏡を使用してコイルのコンホメーション緩和の動力学をモニターすると、大きい単一分子のサイジングを迅速に行うことができる（ゲル中）。これに関しては、コイルのコンホメーション力学を溶液中で測定すると信頼できる分子の平均の大きさが得られ、これは容易にサイズと関連させることができる。
異なる態様では、コイル緩和を、形態学的画像分析を使用してアガロース中で測定することができる。周知のように、ゲル中でのコイル緩和のサイズ依存性は、溶液中での依存性よりも優れており、特にそれはＭ2-3に比例する（reptation理論により予想）。しかし、哺乳類の染色体に由来するＤＮＡ分子は、その緩和時間が溶液中ですら極めて長いので、測定は困難であると考えられる。例えば、100Mbのサイズの分子は、緩和時間が７時間以上と測定され、必要なデータ全部を集めるには丸一日必要であろう。緩和時間は、ゲル中では、溶液と比較して10〜50倍増加すると推定され、こ場合、実験は数週間、あるいは数カ月も続く可能性がある。測定の正確さを高め、実験をスピードアップするためには、典型的には、同様の実験を行って平均を出すことが考えられる。
本発明の別の特定の態様によれば、ランダムなコンホメーションに戻るまでの時間は、分子のみをわずかに歪める「twitch」技術を使用して短縮することができる。twitchingを使用して測定した緩和時間は、コイルが完全に歪められた場合と同じであることが分かった。本質的に、この好ましい態様では、全緩和時間は、混乱に要する時間に等しく、従って、測定時間はかなり短い。
本発明の別の特定の態様では、自由溶液測定を、比較的温和な電界強度（40ボルト/cm）を使用してコンホメーションを混乱させることにより行うことができる。この態様では、分子を溶液に懸濁させ、顕微鏡に載せて、電気的に混乱させ、得られる緩和を蛍光顕微鏡でモニターし、画像処理装置でデジタル的に記録する。これらの画像の形態学的分析を使用すると、分子の形を自動的に解析することにより、すなわち、次に記載するように、緩和コイルの画像の周りに楕円体を適合させることにより、緩和プロセスを追跡することができる。
ＤＮＡコンホメーションのゲル電気泳動中の実験的研究および理論的研究より、ＤＮＡ分子が伸長して長いフックを形成し、それが周期的に緩和してコンパクトなコンホメーションに戻ることが判っている。フックの形成を使用すると、ＤＮＡ分子を伸長することができ、その結果、混乱を生じる電界が切れたとき、単一分子の緩和動力学を、単にそれらをイメージングし、長さの変化を測定するだけで定量化することができる。原理的に、この測定は、バネを伸ばして、それをゆるめ、それが縮んで緩和状態に戻るのを観察することにより、再びコイルになる動力学を測定することと同じである。
この測定を行うためには、臭化エチジウムで染色した大きいＤＮＡ分子を1%アガロースに入れ、SITカメラ（光量感度の低い装置）を備えたエピ蛍光顕微鏡に載せて、コンピューターのイメージングボードセットにインターフェースで接続する。分子がフックを形成するように顕微鏡内の電極にパルスを流し、Wayne Rasband（wayne@helix.nih.gov.）から入手できるＮＩＨ画像マクロプログラミング言語で書かれた特定のプログラムによる緩和中、それらの長さを自動的に測定する。ＤＮＡ分子の緩和は、加えた電界が切れたときに開始する。酵母染色体ＤＮＡの特定の実施例では、単一の指数関数的緩和時間を一連の分子に対して計算し、ln-lnプロット対サイズのグラフで示す。この直線の傾きは、τの分子量依存性を示し、緩和時間（τ）＝定数（サイズ）1.45（ｋｂ）である。
本発明の特定の態様によれば、溶液中で通常出会うZimm-Rouse関係に対応する速いコイル緩和時間が、最初に測定できる。ゲルマトリックスでは、長さＬ（ｔ）（これは、実際は、基本（primitive）チューブの長さである）を有する伸長したＤＮＡ分子は、＜Ｌ（ｔ）＞＝Ａexp（−ｔ／τ）＋＜Ｌｅ＞ （τは、緩和時間であり、ｔは時間であり、括弧は全体の平均である。）として緩和することが知られている。上記式中、Ｌ（ｔ）は、顕微鏡によってイメージングされる見かけの分子の長さとして解釈することができる。Ｌｅは、平衡分子チューブの長さであり、指数関数的減衰のプラトー領域として測定される。Ｌは、下記に記載するように、基線のサイジング法の規準となる。
粘弾性サイジング法の画像収集手順は、先の節に記載したものと本質的に同じであるので、長さおよび緩和の両方の測定に対して同じ画像を使用することができる。この方法では、形態学的分析に画像処理手順を使用して、緩和コイル塊の画像の周囲に楕円体を適合させる。その方法によれば、適合する楕円体の関係する長軸および短軸を使用して、緩和の進行を推定する。一組の分子を使用して、規準点とし、緩和依存性サイジング条件を確立することができる。統計的な分析を使用すると、これらの測定の精度および正確さを決定することができる。分子サイズの緩和時間に対する関数依存性は、約Ｍ1.5である。
5.2.2.2.3.ベースライン測定サイジング（baseline measurement sizing）
本発明のもう一つの態様に従って、「ベースライン」測定として知られているものを用いて単一分子サイジング（single molecule sizing）を行うことができる。特に、長さの時間に対する明白な依存性を示す典型的なＤＮＡ緩和プロット（DNA relaxation plot）によって、いくつか（通常４〜５）の緩和の測定値の平均であるプロットされた点が与えられる。そのようなプロットは、分子の測定された長さが指数関数的に低減すること、そして重要なことにはその分子は球形のランダムコンホメーションまで十分に緩和しないことを示す。それどころか、太くて短い棒状物に似ている準平衡構造が形成される。そのような棒状物の形成は、指数関数的な減少の終わりの合図である。非常に緩慢な緩和プロセス（これは、分子サイズの３乗、すなわちＭ3に比例し得る）が依然として生じているが、それらは異なる性質のものであり、異なる時間スケール上で進展するものである。
実際に用いられた時間スケール（例えば何百秒）内に、長さの測定値は「ベースライン」と称する平衡値に落ち着く。ベースライン値は、ＤＮＡサイズとともに一次関数的に変化し、非常に再現性がある。本発明の好ましい態様においては、緩和測定値は、２つの独立した方法：（1）緩和時間τの測定、及び（2）ベースライン決定のための長さの測定、によって分子サイズの推定値を与える。このように、２つの測定アプローチを同時に用いることにより、異なる独立した分子サイズの推定値を得ることができる。
さらに具体的には、本発明のベースライン測定方法に従って緩和測定を行う手順は下記のとおりである：
（1）電場を生じさせ、そして選択された分子を場の方向を変えることによって視界に保持する。フック（hook）が形成された場合、１つのフックアームがその頂点から離れる前にすぐに電場を消滅させ、次いで画像の収集を開始する。正確な画像化には、分子全体に焦点が合うことが必要である。
（2）ノイズを低減させるために８又は16の画像のフレームアベレージング（frame-averaging）を用いて10又は20秒毎に画像を収集する。各測定に対して約50までの画像が必要である。
（3）連続データアベレージングのために所与の分子に対して工程（1）及び（2）をできるだけ多くの回数繰り返す。
（4）得られた画像のそれぞれを分析し、処理する（処理工程には、自動分析アルゴリズムがその画像上で作動し得るようにバイナリー化に適した画像を作り出すためのノイズ低減、補整（smoothing）及び概略化（skeletonization）が含まれる。）。次に、長さのパラメーターを導き出して分子緩和プロットＬi（t）（ここで、ｉは画像の数である。）を得る。
（5）所与の分子の全ての緩和プロットを足して全体平均を行う、すなわち全ての画像の〈Ｌ（t）〉を決定する。緩和曲線の最後の安定域からベースライン〈Ｌ〉を決定し、式
〈Ｌ（t）〉＝Ａ exp（-t/τ）＋〈Ｌ〉
を用いて曲線をフィッティングし、緩和時間τの推定値を得る。
上記の方法の工程は、♯15フィルターキューブ（緑色励起、赤色観察）を有するZeiss Axioplanエピ蛍光（epifluorescence）顕微鏡、並びにPol Plan-Neofluar 100xz及び63×1.30開口数対物レンズ（より大きい分子用）を用いる本発明の特定の態様において実行することができる。距離／ピクセルはUSAF-1951分解ターゲット（resolution target）を用いて計算することができ、そして特定の態様において、それぞれ0.217μm及び0.345μmであると測定された。6115A精密電源（Hewlett-Packard）を用いてチャンバー電極に電位を与える。C2400-SITカメラ（Hamamatsu）からのフレームはPixelPipeline（Perceptics）によって平均化し、デジタル化して（480×512×8ビット）、Macintosh IIfxコンピューターに保存することができる。好ましくは平均化した画像を処理してバックグラウンドを除去し、ノイズを低減し、wayne ＠helix.nih.gov及びMacintosh用のNCSA画像ソフトウェア（softdev ＠ncsa.uiuc.eduから入手可能）から入手可能なNIH画像プログラムを用いて陰影（shadowing）（幾つかの画像）をシミュレーションし、そしてポラロイドフィルムレコーダーで撮影した。
本発明のベースライン測定方法を用いるサンプルの調製は、一般的に結果に影響を及ぼし得る変化を被りがちである。例えば、少量のゲルサンプルはスライドガラスとカバーガラスの間のわずかの領域で溶融して再形成される。また蒸発も問題となり得る。これらの懸念にもかかわらず、このようなアプローチを用いてなされる測定は、特にＤＮＡを含むゲルスライスに付着している液体が溶融の前に取り除かれる場合、再現性があることが判明した。また、均一なゲル化の条件にも厳重に従わなければならない。
本発明の好ましい態様に従ったベースラインサイジング法の特定の用途においては、酵母染色体ＤＮＡは１％Seakman低融点アガロース（FMC）、1/2×TBE（42.5mM Tris、44.5mMホウ酸、1.25mM EDTA二ナトリウム）中のパルス定位電気泳動（Pulsed Oriented Electrophoresis）によって分離することができる。この終わりに、切除したゲルバンド又はその代わりの合成マトリックスをTE（10mM tris、１mM EDTA、pH8.0）中で繰り返し平衡化する（19）。バンドをさらに10mM NaClを含むTE中で平衡化し、72℃で10〜15分間溶融して37℃に安定化する。光による損傷を最小限にするために臭化エチジウム（最終濃度１μg/ml）及び2-メルカプトエタノール（最終濃度10μl/ml）を溶融サンプルに添加し、37℃で10分から数時間安定化する。最終サンプルを調製するために、10μl（切り離した黄色ピペットチップを用いた）を1.8cm×1.8cmのカバーガラスを有する予備加熱したスライド上にキャストして、２cm間隔の電極を有する段階電気泳動（stage electrophoresis）チャンバーに入れる。カバーガラスの端を鉱油でシールして蒸発を防ぐ。カバーガラス及びスライドを0.075Ｍ HCl中で約１時間煮沸することによって洗浄し、蒸留水を用いて数回すすぎ、使用前は100％エタノール中で保存する。予定のサンプルを37℃での画像収集前に４℃で少なくとも15分間インキュベートする。
上記の方法の工程に続き、約３〜８の測定値の平均をとることによって緩和時間の決定をより正確に行うことができる。各曲線について、長さＬiを最後の15データ点から決定し、次いでそれらを最初の20又は30データ点とともに用いて緩和時間τを導き出す。測定されたＬiの分布は比較的狭く、標準偏差は〈Ｌ〉-1/2未満である。
図27Ａ及びＢに緩和の測定値を分子サイズ（245〜980kb）とそれぞれから導き出されたパラメーターの関数として示す。全ての曲線は単一指数関数的減少（single exponential decay）に合理的にうまくフィッティングするように見え得る。チューブからの解放は図面からは有意に観察されない。
図28Ａ及びＢはそれぞれ緩和対サイズのプロットである。採用された数学的モデルに経験的な測定値をフィッティングさせることによって、下記の２つの関係式が得られた：
〈Ｌ〉（ピクセル）＝0.345 SIZE（kb）−32（１ピクセル＝0.27μm）
τ（秒）＝0.017 SIZE1.45（kb）。
特に、広範囲の分子サイズのデータをフィッティングさせた後では、〈Ｌ〉についての関係式は負の切片を有する。小さい分子についての関係式は、〈Ｌ〉＝SIZEv（ｖ＝1/2）である。ｖに対する値は分子サイズに依存し、大きな分子については1/2からほぼ１の範囲で変動する。
5.2.2.2.4.その他の分子サイジング法
本発明のさらなる態様には、種々の測定技術を用いる分子サイジングが包含される。特定の態様においては、分子サイジングは、例えば種々の方向に加えられた連続した電場を用いる少なくとも１つの外部力の支配下にある分子の再配向（reorientation）時間を測定することによって行われる。このアプローチは下記の実施例６に記載されており、図４Ａ及び５Ｊに例証されている。下記のその実施例に記載されたプロセスを用いることによって、パルスフィールド電気泳動中にＤＮＡ分子の小塊列（blob train）が加えられた電場により非常に複雑な様式で配向すること、そしてこのプロセス中に電気泳動移動度が配列が完全になるまで、例えば分子が加えられた電場にそって配列されるまで、減速するということが測定された。電場の方向の変化によって、小塊列は同時に幾つかの新たな方向に向きを変える（すなわち小塊が独立に少々動いているように見える。）。結局、小塊列のある部分は加えられた電場によって再配向することにおいて優勢であり、残りの小塊をゲルを通るその作り出された路に沿って引っ張る。完全な小塊列配列に必要な時間はサイズに比例して変化する。すなわち、10mb（１mb＝1,000kb）の分子は再配向に１時間を要する一方、同様の電場の強さを用いた場合、10kbの分子はわずか10秒を要するのみである。この現象は図４に例証されている。再配向は、光学顕微鏡検査法及び分光光学的方法と組み合わせた顕微鏡検査法を含む種々の方法で測定される。
本発明の別の態様には、種々の方向の連続電場の支配下にある分子の回転時間の測定を包含する。このアプローチを用いる分子の回転には、一群の漸増再配向工程が必要であり、各工程は、その分子が特定の角増分、例えば360°、の回転をうけるまで該分子を同一方向にさらに回転させる。この態様は、小さいＤＮＡ分子のような、外部力を加えることによってコンホメーションが有意に変化しない固い、棒状の分子を特性付けするのに特によく適している。しかしながら、とりわけ、大きい分子も、その分子のコンホメーションが比較的一定に、好ましくは棒状又は細長いコンホメーションの状態に保たれる場合は、この方法を用いてサイジングすることができる。本発明の特定の態様に従って、大きい分子のコンホメーションの保持は、そのサイズ、形状及び恐らくその分子の組成に適切なパルスルーチン（pulsing routine）を加えることによって達成される。
非限定的な例として、分子を、互いに90°になるように加えた正弦関数的に変化する電場の存在下で回転させる。固い、棒状の分子又は伸長された分子は、それらの長軸又は短軸のまわりを回転する。約Ｍ3に比例する回転拡散を有する長軸のまわりの回転は、最も大きな分子量依存性を有する。ゲル又はあらゆる他の隣接物（confining）に浸漬された棒状分子の回転運動は、ボートのプロペラが水中で回転するように分子を簡単に回転させるための試みがなされる場合、困難であり得る。ゲルを用いる場合、そのマトリックスは海草がボートのプロペラの回転に影響を及ぼすように、かなり分子の回転に影響を及ぼす。したがって、分子の後方運動及び前方運動をも提供するパルスルーチンを加えることによって、回転を容易にする。
一般的に言うと、パルスルーチンを規定するアルゴリズムは角度増分、時間、電場強度等の変数に依存し得る。そしてこれらの変数は互いに種々の変数の関数であり得る。よって、多くのタイプのアルゴリズムをこの本発明の態様に従って用いることができる。
好ましい態様においては、本発明で使用されるパルスルーチンは下記のように規定される。
Figure 0004511636
上記式中、
Figure 0004511636
は時間を掛けた電場ベクトル（ボルト・秒／cm）であり；
Ｅ（t，θi）は電場強度（ボルト／cm）であり；
Figure 0004511636
は単位ベクトルであり；
θiは電場角度（ラジアン又は度）であり、ｉ＝１−ｎ（ここで、完全な回転に対してはn/Σ* θi/i＝１＝２π又は360°である）であり；
Δｔはパルス長（秒）であり；
ｔは時間（秒）であり；
ｋ1及びｋ2は継続的な同一パルスの数であり；そして
Ｐは繰り返され得るパルスルーチンである。
上記のルーチンを用いて、各群のパルスＰが開始されると、適切なパルスが加えられた分子は約（θi+1−θi）ラジアン又は度、回転する。また、分子は移動して
Figure 0004511636
の向きに横方向に動き、それによって回転を促進する。
上記の方程式においてΔｔは定数であるが、これは常にそうである必要はない。
Figure 0004511636
は１以上の変数の関数であり得る。例えば、Ｅは全経過時間及び／又は角度増分の関数であり得る。また、全ての角増分の合計は360°である必要はなく、十分な精度の測定値を与える多くの部分的又は全体的な回転であり得る。分子の回転速度を測定するための特定の条件群は実施例７で説明する。
本発明の別の態様においては、サイジングには緩和分子の直径を測定することが包含される。分子の直径の測定は、上記の曲線の長さの測定の場合のように、分子を染色し、媒質中にその分子を入れる等の同様の手順に従って行われる。しかしながら、かかる本発明の態様においては、測定前に分子に摂動を加える必要はない。その代わりに、分子が緩和状態にあり、一般的に球形又は細長い楕円形の形状を有するときに測定する。球体の体積はＲ3（ここでＲは球体の半径である）に比例し、楕円体の体積はａｂ2（ここでａは主軸の半径であり、ｂは短軸の半径である）に比例するので、この技術の分解能は関数的にほぼＭ.53に比例して変化する。この技術によって測定された分子は変形可能である必要はない。この技術は全てのサイズのＤＮＡ分子に用いることができ、そして特に顕微鏡スライド上の大きなＤＮＡ分子及び高密度に充填された分子の両方のサイズ決定に有用である。
本発明に従って、自由溶液（free solution）中での回転拡散を測定することによって分子のサイズを決定することも可能である。棒回転拡散係数は著しくサイズに感受性がある（約長さの３乗）。回転摩擦係数を説明する方程式は下記のとおりである：
ｆrot＝８πηＬ3／３｛（Ｊ−Ｙrot）｝
上記式中、ηは粘性率であり、Ｙrot＝1.57−７（1/J−0.28）2であり、Ｊ＝ln（2L/b）であり；Ｌ及びｂは、それぞれ棒の長軸及び短軸の半分である。分子回転緩和時間に有用な式は、
τr＝ｆrot/kT＝４πηＬ3/９｛（Ｊ−Ｙrot）｝
によって与えられる。
本発明の特定の態様に従って、小さい（100〜3,000bp）、単一の臭化エチジウム染色ＤＮＡ分子の棒回転拡散係数を顕微鏡検査法によって測定したように、蛍光二色性を用いて測定した。蛍光二色性は時間の関数として配向を追跡し、係数測定に対して必要な速度論の情報を提供する。配向分析には上記の方程式を利用する。標準的なバルク測定に関する単一分子アプローチの利点は、データが本質的に複雑でない（deconvoluted）サイズであるということである。
本発明の特定の態様に従って実験装置は、臭化エチジウムフィルターパックを備えた、アルゴンイオンレーザー源によって照らされて488nmの偏光電磁線を供給するZeiss顕微鏡、Hinds光弾性モジュレーター、及びCCDビデオカメラに接続されたマイクロチャンネルプレート検出器からなる。カメラの出力はデータ記憶及び分析用の画像プロセッサーに導かれる。Fluke、高力／高速増殖器は配列に必要な周波数で＋／−1500ボルトを供給する。顕微鏡検査法に用いられる薄いサンプルフィルムはほとんど電力を受け取らないので、この態様における温度調節は比較的簡単である。分子配列はAC又はDC電場の両方を用いて試みられた。AC電場は実験中の正味の移動が零であるという利点を有する。電場強度の増大が要求される場合には、サンプルセルのサイズを小さくして電極を互いに接近させることができる。
回転拡散係数を測定するために、電場を一時的に与えて分子を配向させて遮断し、ブラウン運動によって分子を緩和させる。次に、マイクロチャンネルプレート／CCDビデオカメラによって電場中の各分子の全蛍光減少出力を集めることによって、消極を追跡する。分子が励起電磁線によりタンブルして平面から落ちるとき、その蛍光強度は回転拡散係数によって与えられた特性時間とともに指数関数的に変化する。ビデオカメラは30フレーム／秒のフレーム速度で作動するので、蛍光強度は画像プロセッサーによって1/30秒毎に記録される。全プロセスを数回繰り返し、その結果を平均する。ビデオカメラ検出システムによってもたらされた利点は、個々の分子の全体的調和を明確かつ同時に測定することができ、その結果パラレルデータ収集及び処理を行うことができるということである。300bpのＤＮＡ分子についての緩和時間の計算値は水中で約４マイクロ秒であり、本発明者らの検出システムにとっては速すぎるものである。しかし、回転拡散定数は粘性率とともに一次関数的に増加するので、98％グリセロールを代わりに用いて粘性率を高めることができ、その段階でサンプルを冷蔵してさらに105倍に粘性率を高めることができる。高濃度のグリセロールによってＤＮＡ変性が低温で生ずる場合、スクロースを試すこともできる。いずれのアプローチも粘性率を十分に上昇させて速度をビデオデータ収集用の範囲に導く。
回転係数は通常溶液中で測定されるが、300bp未満のＤＮＡ分子は、アガロースマトリックス内で自由に回転し得る。というのは、それらの測定された回転拡散係数が自由溶液の値に似ているからである。測定中にアガロースに小さいＤＮＡ分子を固定して用いることにより、あらゆる伝達性の力をせき止めることができ、それらが測定値に激しく摂動を加えることが判明した。
5.2.3.測定精度の増大方法
本節では、本発明に従った分子サイズ測定の精度を増大させるために用いられる統計学的技術の簡単な概略を提供する。この方法は、所望のパラメーターの一群の推定値を得て、公知の統計学的誤差分析基準に従ってパラメーター推定値を操作することに基づくものである。概念的に、上記の方法の中のどれか一つを用いる所望のサイズの分子の各測定値は、測定誤差のない、真の量の推定値と解釈することができる。しかしながら、特定の測定値がそれほど不正確ではないという保証はなく、その場合推定パラメーターは分析に役立たない。このような確率を低減させるためのよく知られた方法は、一群の測定値を取り、平均値（全ての測定値の合計を測定値の数で割ったもの）を用いることである。他方、サンプル分散の測定によってどの程度測定値が正確であるか、すなわちどの程度測定値が仮説の理想値に近いかの評価が与えられる。
一群の独立した、通常分散した測定値に対して、その測定の精度は測定値の数の平方根すなわちsqrt（n）（ここで、ｎは測定値の数である）とともに増大するということはよく知られている。したがって、10の独立した測定値の平均を取ることによって、サイズの推定値の精度は約sqrt（10）＝3.16倍上昇する。当業者に知られているように、ある特定の測定値が平均値からはずれる確率を決定する統計学的信頼区間を用いて測定値の精度を評価することができる。よって、例えば、広く分散されたサンプル変動に対する確率密度関数（pdf）によって不正確な測定値（この測定値は捨てることができる）が示され、一方、高度にピークに達したpdfによってそのサンプルビンはばらつきがなくほとんど正確であるということが示される。
本発明の好ましい態様に従って、分子サイズの推定値の精度を増大させるために一群の測定値の平均をとることは、全ての場合において可能な限りいつでも用いられる。加えて、サンプル母集団をさらに特性付けるために、測定値の平均をとった後、平均測定値の90％信頼区間をn-1 d.f.を有するｔ分布及びサンプル標準偏差を用いて計算する（例えばBendatら, Random Data: Analysis and Measurement Procedures, John Wiley, 1986を参照）。この計算は測定データが正規分布からの無作為標本を表すということを仮定するものであり、母集団平均がその信頼区間内に入る可能性は90％であるということを意味するものである。この区間の中間点を用いて母集団の標準偏差が推定される。次に、測定値の変動の係数（CV）は、推定した母集団標準偏差をサンプル平均で割ったものとして得ることができる。プールされた測定の標準偏差を本発明に従って関数方程式sqrt（分散の平均）を用いて計算する。最後に、本発明に従って測定値の相対測定誤差を測定値と報告された値との差をその報告された値で割ったものとして計算する。本発明の方法を用いる典型的な測定において計算されるこれらの及びその他の関連した統計学的測定値は、使用されるサイズ決定方法の精度を増大させ、その結果を他のサイズ決定技術の精度と比較することにおいて非常に重要である。
本発明に従って、伸長し、そして恐らく固定された単一核酸分子を、分子のデジタル画像を作成する多くの技術を用いて画像化することができる。次いで、これらの画像を処理して興味のある分子パラメーターの定量的な測定値を得ることができる。このために、本発明の好ましい態様においては、まず、画像化された分子を、それらのサイズに比例してそれらの分子に吸収される蛍光色素を用いて染色する。その後、染色された分子のサイズは、適当な光源で照らされた分子の蛍光強度を測定することによって決定することができる。
5.3. ゲノム分析／操作
ここでは、本発明の単一伸長分子を高分解能ゲノム分析情報の迅速な作成に利用し得る方法を記載する。そのような方法には、下記のように、光学的マッピング及び光学的配列決定技術の両方が含まれる。
5.3.1.光学的マッピング
本発明の光学的マッピング技術は、高分解能制限地図を迅速に作成するための制限部位の直接的な秩序立った（ordered）マッピングを可能にする。簡単に言うと、そのようなマッピング技術には、単一核酸分子の伸長及び固定、１以上の制限酵素による分子の消化並びに得られる制限断片の視覚化及び測定が包含される。消化される単一核酸分子は固定されているので、得られる制限断片はレジスター中に残っており、それらの順序は直ちに明らかになり、迅速な制限地図は即座に作成される。
ここで記載された光学的マッピング技術は種々の重要な用途を有する。その用途には、本発明が時間を消費し、高価で、難しくかつ間違った傾向にあるということが判明するまで、例えばゲノム物理的地図の効率的な作成が含まれる。実際、ここに記載したアプローチは、例えば、分析的電気泳動、クローンライブラリー、プローブ又はＰＣＲプライマーを必要とせずに、ヒト染色体を含む真核細胞の染色体の秩序立った複雑な高分解能制限地図の作成を可能にする。
さらに、そのような技術は広範な診断用途を有する。例えば、個体由来の核酸に対して一定の疾患対立遺伝子と関連し得る多形性について試験し得る。例えば、そのような多形性は、制限断片長の多形性、転位、挿入、欠失及び／又はVNTR（可変数テイルリピート（variable number tails repeats））を示し得る。
ここで記載した技術を利用することによって、約500bpから1000kbをかなり越える核酸分子を効率的にマッピングすることができる。単一核酸分子を基準にした技術は、下記の5.4.節に記載したような高処理量の用途において簡単に利用することができる。
光学的マッピングのために、単一核酸分子を上記の5.1.節に記載した技術に従って伸長し固定する。アガロース又は固体表面を基材とする伸長／固定方法が利用され得るが、一般的には固体表面技術が好ましい。5.1.節で論じたように、伸長／固定技術は伸長能力、緩和能力及び生体機能の維持の間のバランスをもたらすために最大限に活用される。適切な伸長及び固定によって、単一核酸分子は幾分緩和し、その結果断片は切断中にばらばらに移動する。
したがって、切断部位は画像化された分子中に成長ギャップとして視覚化される。しかしながら、分子はランダムコイルコンホメーション（これは正確な断片測定を不可能にする）まで十分に緩和することから制限されている。ギャップに加えて、切断も、切断部位における断片末端上にＤＮＡの鮮やかな凝縮プール又は「ボール」が出現することによって表示される。これらのボールは切断後間もなく形成され、末端において好都合であるコイル緩和により生じるものである（図13及び15参照）。切断は、成長ギャップ及び切断部位におけるセグメントの拡大している鮮やかなプールの両方の出現によってより確実に記録される。にもかかわらず、ギャップのように見えるものが、実際に、焦点の平面から部分的にはずれている単一分子であり得るという可能性はある。
光学的マッピング制限消化は標準的な反応混合物及び条件（例えば、インキュベーション時間及び温度）を利用することによって行われ得る。しかしながら、その技術は消化される核酸分子の確立された性質に依存するので、伸長／固定プロセスを制限消化の開始前に完了させることは重大である。制限消化の開始を制御することができる数多くの方法、すなわち、消化の開始が所望されるまで制限酵素をその特定の酵素の活性に必要であるどんな補因子（例えばMg2+）からも別々に保持することを含む数多くの方法が存在する。
例えば、アガロースを基材とする伸長／固定技術を用いる場合、核酸は、制限酵素及び適当な緩衝液とともに溶融した（好ましくは低融点の）アガロース中に混合され得るが、補因子はいっしょに混合しない。反応が開始したら補因子を加えることができ、これによって制限酵素が活性化される。また、補因子を制限酵素の不存在下でアガロース中に混合することもできる。消化を開始させるために、酵素を添加して、ゲル中に拡散させることができる。
固体表面を基材とする伸長／固定技術を用いる場合、制限消化反応混合物は、制限酵素又は補因子のいずれかの不存在下で、固体表面と接触させることができる。適当な時間に、欠けている成分（すなわち、制限酵素又は補因子のいずれか）をその表面に添加することができる。また、完全な反応混合物を固体表面上に接触させることもでき、いったん混合物が伸長／固定核酸分子と接触したら消化が開始する。さらに、必要な２価のカチオンをキレート化した形で導入することができる。ここで、そのキレート化は、例えばDM-ニトロフェンのような光に不安定なキレート化である。消化を開始させる場合、キレート化剤を光によって不活性化して消化を開始させる２価のカチオンを放出させる。
所与の核酸分子上に存在する各制限部位が同時に切断されないということは注目すべきであり、このことは、全てのギャップが同時に出現するとは限らないということを意味する。このことから、制限酵素によってなされる酵素的切断の速度は変化しやすいということが予想される。逆にそれどころか、各切断は短時間、例えば５分以内に発生する。
そのような技術によって制限され分析された分子は、上記の5.2.節に記載したものを含む技術によって視覚化され得る。
得られる断片は5.2.節で記載したような技術に従ってサイジングすることができる。そのような技術には、例えば、産物の相対蛍光強度の測定及び断片の相対的な見かけの分子長の測定が含まれる。たった一つを利用するよりはむしろ少数の分子の平均をとるほうが精度が向上し、望ましくない分子又は断片の排除を可能にする。次いで、サイジングされた断片の順序を簡単に記録することによって地図を構築する。
記載したマッピング技術は、単一核酸分子制限地図の効率的な作成において大いに機能する。しかしながら、これらの個々の分子の配向についての知識は、一つのそのような制限地図よりも大きくて秩序だった地図への配列にとって非常に有用である。種々の技術を利用して分子の一つの末端を識別する又は示差的に同定することができ、それによってその配向又は極性をマークすることができる。
例えば、マッピングベクターを産生することができ、ここに記載したマッピング技術とともに使用することができる。そのようなベクターは、分析される分子の一つの末端への「タグ」を導入するのに役立ち得る。そのようなタグには、少しだけ名を挙げると、例えば、希有制限酵素切断部位、タンパク質結合部位（これは例えば標識したタンパク質によってタグ付けすることができる）、又はねじれる傾向にあるＤＮＡの領域（よって、さらなる操作を必要としない視覚的タグとして役立つ）が含まれ得る。さらに、そのようなベクターには、標識ヌクレオチドプローブが、例えば下記の5.3.2.節に記載したような技術によってハイブリダイズし得るヌクレオチド配列が含まれ得る。
サイズ標準は、ここで作製される制限断片の正確な測定をさらに促進し得る。そのような標準は、例えば、上記のようなマッピングベクターに組み込むことができる。マッピングベクターのメチル化のような方法を利用して、サイジング標準を制限中そのままにしておくことを確保することができる。また、サイジング標準は既知レベルの蛍光を生ずる種々のサイズの蛍光ビーズを含んでもよい。
本発明の光学的マッピング技術の好結果の使用を図12に示す。図12は、本発明の光学的マッピングによって作成された、３つのタイプの秩序立った制限地図を例証するものである。これらの地図は刊行物に記載された制限地図と比較される。さらに、図13Ａ〜Ｆは、制限酵素Not Iで消化された種々の酵母染色体ＤＮＡ分子の選択された、対応する処理を行った蛍光顕微鏡写真を示す。これらの画像は固定された分子中における成長ギャップの出現によって連続的な消化を明白に示している。そのようなデータから、断片の順序は、例えば、時間間隔（例えば0.07〜200ｓ）毎に又はその中のあらゆる範囲若しくは値（例えば１〜30ｓ）で得られた低速度撮影の画像の検査によって決定することができる。光学的（長さ又は強度）地図と電気泳動に基づく地図との間の一致が予想される。実際、非常によく一致していることが分かった。第３のタイプの制限地図は、長さ由来のデータと強度由来のデータとを組み合わせたものであり；小さい制限断片は長さによってサイジングすることができるのに対し、強度の測定値は地図を完成させるのに必要な残りの断片サイズを提供することができる。
5.3.2.光学的配列決定
本発明の伸長し、固定された単一核酸分子を、その固定された核酸分子上に存在する特異的な、公知のヌクレオチド配列を同定するために計画された方法の一部として利用することができる。そのような方法は、ここでは「光学的配列決定」方法と称する。一つには、これらの方法にはむきだしの核酸分子（例えば、クロマチン状態にはないもの）の分析が包含されるので、光学的配列決定は、in situハイブリダイゼーションのようなクロマチンに基づく検出スキームでは可能性のないレベルの分解能を提供することができる。光学的配列決定方法は、一般に、ハイブリダイズした核酸分子の位置を画像化することによって同定することができる手法における、本発明の単一伸長固定核酸分子内に存在する少なくとも一つのヌクレオチド配列への１本鎖核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションを含む。画像化は、例えば、上記の5.2.節で記載したような技術を用いて行うことができる。画像化されたハイブリダイゼーション産物の位置は、例えば、上記の5.2.節で記載したサイジング技術を用いて同定することができる。
上記で論じたように、光学的配列決定技術は、伸長し、固定された単一核酸分子の少なくとも一部とそれにハイブリダイズしている核酸分子との間を画像化することができる手法における、特異的ハイブリダイゼーション産物が形成されるような、本発明の伸長し、固定された単一核酸分子への核酸分子のハイブリダイゼーションを含む。そのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズする核酸分子と伸長された単一核酸の少なくとも一部との間の配列の相補性に基づくものであるので、上記の5.2.節で記載した正確なサイジング技術を組み合わせてハイブリダイゼーション産物を画像化して光学的配列決定することによって、その特異的なヌクレオチド配列による核酸領域が迅速に同定される。
ここで記載した光学的配列決定技術は種々の重要な用途を有する。第一に、そのような技術を用いて、例えば、オーバーラップヌクレオチド配列を用いて核酸分子の配列を促進することによって、複雑な物理的地図を作成することができる。
第二に、そのような技術は興味のある特定の遺伝子を迅速に同定し、位置決定することを可能にする。例えば、ある遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部が公知である場合に、光学的配列決定技術によってその遺伝子の特定のゲノムの位置を迅速に決定することができ、さらにそのヌクレオチド配列に相補的な配列を含むｃＤＮＡ分子を迅速に同定することができる。その上、そのような光学的配列決定方法は、例えば遺伝子疾患を引き起こす対立遺伝子のような特定の対立遺伝子を含む核酸分子の迅速な同定などの、多くの診断的用途を有する。例えば、１以上の個体由来の単一の伸長され固定された核酸分子は、興味のある対立遺伝子に特異的である（すなわち、特異的にハイブリダイズする）１本鎖核酸分子プローブとハイブリダイズすることができる。そのような対立遺伝子は、例えば、疾患を引き起こす対立遺伝子であり得る。陽性のハイブリダイゼーションシグナルはその核酸サンプルを採取した個体が興味のある対立遺伝子を含んでいるということを示している。
また、単一の伸長され固定された核酸分子は興味のある対立遺伝子に特異的である（すなわち、特異的にハイブリダイズする）核酸分子を示し得る。そのような場合、核酸サンプルを個体から入手して、伸長され固定された核酸分子にハイブリダイズすることができる。特異的ハイブリダイゼーション産物の存在は、その核酸サンプルを得た個体が興味のある対立遺伝子を有しているということを示す。核酸サンプル：単一分子ハイブリダイゼーション産物を画像化するために、そのサンプル核酸は標準的な方法、例えば少なくとも一つの標識ヌクレオチドの存在下でのＰＣＲ増幅によって標識され得る。また、下記に記載したように、ハイブリダイゼーション産物は標識されている必要はないが、ハイブリダイゼーション産物内での部位特異的制限切断の画像化によって同定することができる。さらに、下記に記載したように、ハイブリダイゼーション産物は、標識化合物のハイブリダイゼーション産物への該産物特異的結合による間接的標識によって同定することができる。
導入された核酸分子が本発明の伸長され固定された単一核酸分子にハイブリダイズする条件は、ただ一つの特異的ハイブリダイゼーション産物が得られるのに十分なほどに厳重でなくてはならない。この文脈で用いられる「特異的」とはヌクレオチド配列特異性をいい、「特異的ハイブリダイゼーション産物」とは伸長された核酸分子の少なくとも一部と、その伸長された核酸分子と相補的な導入された核酸分子の少なくとも一部との間に形成される安定な核酸複合体をいう。これらの二つの核酸分子のハイブリダイズする部分の間の配列相補性は、少なくとも約80％であり、好ましくは少なくとも約90％であり、より好ましくは少なくとも約98〜100％である。
上記の特異的ハイブリダイゼーション産物をうまく得ることができるハイブリダイゼーション条件は、当業者にはよく知られている。第一に、RecA-仲介方法（下記参照）は別として、固定され伸長された核酸分子は、導入された１本鎖核酸分子とのハイブリダイゼーションが可能になるように、当業者によく知られた標準的な変性プロトコールに従って変性しなければならない（１本鎖にする）。
形成された特異的ハイブリダイゼーション産物を、まずかかる産物が形成されたということを確認するために、そして、いくつかの場合においては、伸長され固定された核酸分子におけるかかるハイブリダイゼーション産物が形成された位置を同定するために、画像化しなければならない。ここで記載した光学的配列決定技術において形成された特異的ハイブリダイゼーション産物の画像化には種々の方法を利用し得る。
第一に、本発明の伸長され固定された単一の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を、そのハイブリダイゼーション産物を画像化し得るのに寄与するような手法で標識することができる。当業者によく知られた多くのあらゆる標準的な標識技術を利用し得る。これらには、限定されるものではないが、色素、蛍光、放射線、ビオチン／ステレプトアビジン及び化学発光標識技術が含まれており、蛍光標識が好ましい。伸長され固定された核酸分子を色素的に又は蛍光的に染色する場合、その伸長された分子にハイブリダイズする標識核酸は染色され伸長された分子とは異なる色又は蛍光を発するような様式に標識する。標識核酸は一般的に長さが少なくとも約20ヌクレオチドであり、好ましくは約100から約150ヌクレオチドである。特異的ハイブリダイゼーション産物はハイブリダイゼーション産物内の標識核酸を画像化することによって画像化することができる。
第二に、本発明の伸長され固定された単一の核酸分子にハイブリダイズする核酸の標識を不要にする方法を利用し得る。例えば、光学的配列決定方法は、RecA-補助制限エンドヌクレアーゼ（RARE）技術（Koob, M. ら, 1990, Science 250:271; Ferrin, L.J. ら, 1991, Science 254:1494; Koob, M.ら, 1992, Nucleic Acids Res. 20:5831）として知られた技術とともに用いられ得る。簡単に言うと、RARE技術は、特異的ハイブリダイゼーション産物内で唯一生ずる制限エンドヌクレアーゼ切断の発生を包含する。配列特異的RARE方法に、上記の5.3.1.節で光学的マッピングについて記載したような制限切断部位の形成を可視化する能力を結合することによって、特異的ハイブリダイゼーション産物を、本発明の伸長され固定された単一の核酸分子にハイブリダイズする核酸を予め標識することなく検出することができる。
より具体的には、RARE技術は、EcoRIメチラーゼのようなメチラーゼ酵素が特異的ハイブリダイゼーション産物に作用することを選択的に遮断することによって、ハイブリダイゼーション産物特異的制限を可能にする。メチラーゼは核酸分子を配列特異的手法でメチル化する酵素であり、メチル化された核酸はもはや制限エンドヌクレアーゼ作用を受けない。例えば、EcoRIメチラーゼは、核酸分子をEcoRI認識部位でメチル化して、EcoRIがもはやその部位を切断しないようにする。特異的ハイブリダイゼーションの部位の外側の各制限部位がいったんメチル化すると、制限消化が行われる。唯一得られる切断部位は特異的ハイブリダイゼーションが生じた領域内の部位であり、それによってそのようなハイブリダイゼーションの位置を同定する。
RAREはRecAタンパク質を使用して部位特異的手法でメチラーゼ活性を遮断する。RecAタンパク質は核酸分子を二重らせんＤＮＡ内のその相補的な相同配列と対にする能力を発揮して、３本鎖核酸／RecA複合体を形成させる。そのような複合体はメチラーゼ活性から保護されている。したがって、上記したような特異的ハイブリダイゼーション産物を得るような条件下で、本発明の伸長され固定された単一の核酸分子の少なくとも一部にハイブリダイズする核酸分子をRecAタンパク質（及び必要なRecA補因子試薬）とともに導入することによって、そのような特異的ハイブリダイゼーションの部位に３本鎖複合体が生じる。そのような三重らせん複合体が生成した後、核酸分子をメチル化する。メチル化後、酵素及び導入した核酸分子を除去し、ハイブリダイゼーション部位内の位置を除く全ての位置がメチル化された二重らせんＤＮＡをあとに残す。
三本鎖複合体生成工程およびその後のメチル化工程は、単一の核酸分子の伸長／固定の前または後のいずれかに行うことができる。これらの工程が伸長の前に行われる場合、大きい核酸分子を用いてこの分子の剪断が回避されるように注意しなければならない。このような剪断をうまく回避することができる一つの方法は、アガロースゲルブロックまたは“チョップ”中でこれらの工程を行うことである。“チョップ”は核酸分子を含むアガロースゲルブロックを表し、この場合、ゲルブロックは小片に切断されている。三本鎖形成がゲル組成物中で行われる場合、固まったゲル中へ拡散させるよりも、溶融したアガロース中で成分を一緒にすることが、一般には更に効率的である。
ハイブリダイズしなかった過剰の核酸分子および試薬を除去した後に、核酸分子を5.1節で記載したゲルをベースとする技術または固体表面をベースとする技術に従って伸長し、固定することができる。
上記のように（伸長の前または後のいずれかに）処理された、伸長され、固定された単一の核酸分子を、次にメチル化されたＤＮＡに作用できない（すなわち、開裂できない）制限酵素による制限消化に供する。制限消化および開裂部位の視覚化を、5.3.1節に記載した光学マッピングのために記載された方法に従って行うこができる。形成される唯一の開裂部位は、特異的ハイブリダイゼーションの部位中の開裂部位である。5.2節で上述したようなサイジング技術を、位置を確認するために確かめるために利用してもよい。このようなサイジング技術は、ハイブリダイゼーションの位置ではなく、ハイブリダイゼーションが生じていることをアッセイする場合には不要である。
更に、開裂部位をイメージングする必要および伸長された核酸をハイブリダイゼーションの前に変性する必要の両方を不要なものとする方法を利用することができる。これらの技術は、特に、変性が必要ではないという事実に鑑みて、この節の光学配列決定技術と上記5.3.1節の光学マッピング方法との更に広範囲な結合を可能にする。
このような光学配列決定技術の一実施態様では、改良されたRARE法が利用される。このような改良されたRARE法は、上記のように、三本鎖核酸／RecA複合体の生成を伴う。その後の制限が行われないため、メチル化は複合体形成後には必要ではない。その方法のこのバージョンでは、複合体生成は目的の単一核酸分子の伸長／固定後に行うべきである。伸長され、固定される単一核酸分子にハイブリダイズする核酸分子は、例えば、この節に記載したようにして標識する。RecAが三本鎖複合体形成を促進するために使用されているので、伸長された二重鎖ＤＮＡの先の変性は必要ではない。三本鎖複合体形成後に、標識核酸分子で複合体をイメージングすることにより、特異的ハイブリダイゼーション部位が同定される。
更に、標識された核酸の導入の要請および制限開裂部位をイメージングするための要請という両方を不要なものとする技術を利用してもよい。このような技術は特異的ハイブリダイゼーション生成物の部位のような、特定のヌクレオチド配列を含む部位への標識された成分の結合を伴い、その結果、この部位が実際には間接的に標識される。結合された成分はイメージングされ、それによりハイブリダイゼーションが起こったことを第一に同定し、第二にこのようなハイブリダイゼーションの位置の同定を可能にする。このような技術は、例えば、導入され、伸長された単一核酸分子にハイブリダイズする核酸が不十分である診断の場合においては、特に有益であるかもしれない。更に、これらの技術はハイブリダイゼーションの前のこのような不十分な物質を増幅することを必要とせず、こうして潜在的な増幅によって生成される人工産物（アーティファクト）を避ける。
このような技術の一実施態様では、改良されたRARE手順がその後に続く。特に、三本鎖／RecAタンパク質複合体が上記のように生成されるが、この場合には、利用されるRecAを標識する。制限が起こらないので、再び、メチル化工程は必要ではない。RecAタンパク質は、その活性を保持するとともに、そのイメージングを可能にするような方法で標識されなければならない。このような技術は当業者には公知であり、例えば、ビオチン、ストレプトアビジンなどのエピトープタグの付加が含まれる。伸長された核酸分子を染色する場合、標識されたRecAタンパク質により生じた着色または蛍光が染色された核酸分子のそれとは区別されることが重要である。それ故、制限開裂部位の生成およびイメージング、または標識された核酸分子のイメージングに代えて、結合されたRecAタンパク質を単にイメージングすることにより、特異的ハイブリダイゼーション部位が同定される。
このような技術の別の実施態様では、標識された成分がタンパク質などの標識された化合物であり、これはヌクレオチド配列に特異的な様式で核酸に結合する。標識されたタンパク質を、本発明の伸長され、固定された単一核酸分子と接触させることにより、このような結合タンパク質の存在および位置を同定することができる。
5.3.3定方向光学的マッピング
本明細書に記載した光学的マッピング技術および光学的配列決定技術は、マッピングを定方向様式で行ってもよいように組み合わせてもよい。このような技術を本明細書中で“定方向光学的マッピング”という。このような技術は、一層の高分解能マッピング分析についてゲノムの特定部分を標的とするために機能する。特に、目的の特定配列を含む単一の核酸分子を、単一の核酸分子の集団中に存在する全単一核酸分子の中から同定することができる。目的の配列を含む特定核酸分子を一旦選びだすと、このよう核酸分子を更に分析することができる。
このような定方向光学的配列決定は、多くの重要な応用が可能であり、こうしたなかには特定の遺伝子座、光学マッピングによりイメージングすることができる遺伝的病変について直接イメージングし得る診断用途などが含まれるが、これらに限定されるものではない。更に、特定の遺伝子座のフィンガープリントを個別または集団について迅速に得ることができる。
多くの方法を利用し、単一の核酸分子を選択して更に分析をしてもよい。最初に、目的の特定配列を含むかもしれない核酸分子のそれぞれを、5.2節に記載した技術などをを利用して、伸長させ、固定することができる。一旦伸長させると、更に分析すべき単一核酸分子は、5.3.2節に記載した光学的配列決定技術を使用することにより、同定することができる。最後に、ハイブリダイズするこれらの単一核酸分子を、光学的配列決定を介して、例えば、5.3.1節に記載した光学マッピング技術を介して、高分解能でマッピングすることができる。
また、目的の配列にハイブリダイズする核酸分子を伸長し、本発明の固体表面に固定することができる。一端表面包埋すると、目的の配列を含み得る全ての核酸分子がその表面に固定された核酸分子と接触し、ハイブリダイズする。この表面に固定された核酸分子と相補的な配列を含むこれらの単一核酸分子は、この表面に結合されるようになるであろう。相補的な核酸分子に一旦結合されると、このハイブリダイズする配列を含む単一の核酸分子全体が表面上に固定されるようになるであろう。こうして、更に分析すべき単一核酸分子が同定されるだけでなく、それらは5.3.1節に記載した光学マッピング技術に従う方法で、更に伸長され、固定される。
5.4.高処理量の光学マッピングおよび配列決定システム並びに方法
本発明の高処理量の自動化システムおよび方法は、上記の光学マッピングおよび配列決定アプローチに基いており、かつ操作者からのインプットを殆どまたは全く必要としないで、PCR産物、クローンおよびYACの高速、高分解能のマッピングおよび配列決定を提供することができる。
信頼性のある高速分子サイジングが高処理量の分子分析方法の心臓部である。5.2節に定義したように、サイジングされる分子が定常的であるか否かに依存する二つの主たるサイジングアプローチがある。高処理量の分析方法は、静的方法および動的方法に分類することができる。静的方法は一般に簡単な装置を含み、こうして現在のところ、高処理量の測定に更に適している。一方、動的方法は典型的には更に正確であるが、現在では、より複雑化された装置が必要とされるために、高処理量の測定にはそれ程適してはいない。
本発明によれば、高処理量の分子分析は、静的または動的に混乱させた分子のデジタル化イメージの高速処理を使用して行われる。
5.4.1.静的測定
本発明の好ましい実施態様によれば、分子スポッティングおよび固定のために、自動化された、高速の表面ベースの方法を使用する静的な分子測定用の新規なシステムが開発される。
5.4.1.1. スポッティングおよび固定
先の節で説明したように、望ましいＤＮＡ固定化属性は、高度の分子延長、生化学的活性の保存および大きな付着速度における再現性を含む。更に、ゲノム分析のための高処理量システムの開発は、固定アプローチが、大きなサンプル付着速度、高い格子状に配列したサンプル密度および配列されたサンプルへの簡素化されたアクセスを提供することを必要とする。これらの固定の性状のいずれかについての不適切な応対処置は、おそらく分析を不当に複雑なものとし、そのコストを増加させる。
したがって、本発明の好ましい実施態様では、システムのスポッティングおよび固定装置は、自動化されたエッペンドルフ社のMicro-Manipulator Model 5171、および多数のクローンＤＮＡ分子を誘導体化ガラス表面に付着させることができるとともに、分子の延長および生化学的近接能を維持することができるインジェクターを含む。特に、細いキャピラリーチューブ（約100ミクロン）、または平滑末端化ガラスロッドを使用し、ＤＮＡサンプルを抜き取り、それらをＤＮＡ溶液の小液滴として接触させて表面に移す。溶液の液滴は、5.1節に記載したように、種々のドーパントと混合し、伸長状態の異なる型を生じ得る。
特に、溶液の液滴はコンピュータに接続されたエレクトロニックLudl Mac2000インターフェースボックスによって制御された隔置条件および付着条件で、規則的な配列で表面にスポットする。スポット直径は、例えば、キャピラリーチューブの内径を調整することにより制御し、約40-1000ミクロンの範囲である。更好ましくは、小さいサイズの高密度格子状配列スポットを、最適な処理量のために使用する。図16（Ａ、ＢおよびＣ）に明示したように、より小さいサイズのスポットは、それが乾燥した後にそれぞれのスポットの周辺で比較的多数の分子が延伸されるため、固定技術の効率を高めるものと考えられる。図16Ａ、ＢおよびＣに示された本発明の特別な実施態様では、それぞれのスポットは直径が約100ミクロンであり、スポット間のバラツキは約+/-20ミクロンである。隣接するスポットの中心間の間隔は150ミクロンのオーダーであるが、それより小さいか、または大きい間隔もまた所望により使用し得る。スポットの付着はMicro-Manipulatorおよびミクロステップモーターに接続されたx-yテーブルのコンピュータプログラムセッティングにより制御される。この装置に典型的な付着速度は約２秒未満毎に一つのスポットである。
本発明の別の好ましい実施態様では、非常に多数のクローンを、サンプルスポッティングのためにプログラムされたベックマン社のBiomek 2000ロボットを使用して誘導体化表面に付着させることができる。ロボットの使用はヒトが介入する必要を完全に不要にし、標準的な付着技術と較べて約10倍速い付着速度をもたらす。更に、ロボットで補助された固定アプローチは、その方法の効率を更に改良する非常に密に置かれたＤＮＡサンプル（約35ミクロンのスポット間の隔置で20ミクロン）の信頼できる付着をもたらすことができる。
本発明の更に別の好ましい実施態様では、例えば、Research GeneticsまたはSci-Tech（スイス）により製造されたビジョン制御ピック−アンド−プレースロボットを、平面表面にランダムに分布された物体を選択し、それらを制御された方法で誘導体化表面上にスポットすることにより、スポッティングプロセスを完全に自動化するのに使用することができる。
先に説明したように、ＤＮＡ溶液の小滴は誘導体化表面に容易に付着し得るが、これらの分子（40kb未満）は溶液中では伸長されず、こうして光学的にマッピングすることができない。本発明によれば、三つの異なるアプローチのいずれか一つがスポットされたＤＮＡを広げ、固定するのに使用し得る。本発明の特別な実施態様では、スポットされたＤＮＡ分子は二つのガラス表面の間にカバーグラススで“サンドイッチ”することができ、これらの表面は、一緒に押しつけられる時に、その間に配置されたＤＮＡを延伸する。このアプローチは許容可能なマッピング結果を生じる。しかしながら、それは本質的に連続性であり、その結果、一度に一つのサンプルのみが測定でき、こうして高処理量の処理には有効ではない。
本発明の第二の実施態様では、スポットされたガラス表面を再度水和し、その後にテフロンブロックスタンプをＤＮＡスポットに押しつけ、それらを粘着性の誘導体化表面に広げて固定する。実験結果は、このアプローチが有意な破壊を生じることなく表面包埋されたＤＮＡを伸長するのに有効であることを示す。図29はＤＮＡスポットの拡大図および分子を誘導体化表面に広げるための本発明のこの実施態様によるテフロンブロックの使用を示す。
本発明の第三の好ましい方法では、ＤＮＡ溶液の付着液滴を誘導体化表面で単に乾燥させる。実験は、液滴が乾燥するにつれて、固定されたＤＮＡの殆どが、図26Ａ、ＢおよびＣで明らかに観察できる、特徴的な“サンバースト（sunburst）”パターンでスポット周辺内で充分に伸長され、整列され、一次的に付着されることを示す。スポッティング溶液へのグリセロールの添加は、更に一様に分布される良く伸長されたＤＮＡ分子をもたらす。先に説明したように、実際に、制限エンドヌクレアーゼ緩衝液によるスポットされたＤＮＡサンプルの再水和が、スポットされた分子の生化学的活性を有効に回復させる。本発明の伸長された分子のサンバースト固定パターンは、新規な高処理量の分析方法の基礎を与え、この時点で予想することが不可能である完全に予測されない発見である。
スポッティングおよび固定後に、本発明の好ましい実施態様によれば、表面に固定された分子を、スポットされたカバースリップ当たり約10〜20単位の相当する制限エンドヌクレアーゼを含む１×市販の制限緩衝液20〜40μlを添加すること（製造元の推奨）により、次に消化する。次に、表面を約５〜20分間にわたって保湿チャンバー中でインキュベートする。消化後に、重層した緩衝液をTE（10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、pH7.4）緩衝液のビーカー中で洗浄することにより除去する。過剰のTE緩衝液をアスピレーターにより除去する。次に、表面を、例えば、Molecular Probesにより提供されたYOYO-1（100nM）蛍光色素で染色し、含浸油でシールして乾燥を防止する。顕微鏡用のCargille Immersion Oilをこの目的に使用することができる。次に、表面に固定された分子を光学マッピングのために準備する。
図30はブロック図で、ラムダクローンまたはコスミドクローンの高処理量の光学的マッピングのための本発明の方法を示す。その図は、長方形の誘導体化ガラスプレート100上にクローンをロボットで補助してスポッティングする工程；制限酵素を添加する工程；および消化後にコンピュータ200中のイメージ処理分析工程の順序を示す。
5.4.1.1.1.格子状に配列したYAC DNAの処理
図31は格子状に配列したYAC DNAの高処理量の光学的マッピングに使用する本発明のシステムの簡素化されたブロック図である。図31中のシステムは、YAC分析のためのクローンスポッティングシステムおよび既存の自動化装置と容易にインターフェースで接続することができ、しかも複雑なサンプルの取扱い技術を欠いている研究所において有用な制限マッピングの適用である。
特に、図31はマイタイタプレート100中で調製した染色体ＤＮＡ分子としてYACをスポットする方法を示す。特別な実施態様では、アガロース中で調製した酵母染色体ＤＮＡを使用することができる。その図に示すように、溶融アガロースの一滴をポリリシン、またはAPTESで被覆したガラスなどの被覆表面110上にスポットする。実験結果は、表面に落下させた分子の約30-75％が、メガベースのサイズの分子についてさえも、殆ど分解を示さないことを示す。次に制限酵素を添加し、予め決めた期間、消化を進行させる。最後に、エチジウムホモダイマーなどの高コントラストの蛍光色素を添加し、表面に固定しイメージングした分子のみを分析のために採取する。固定および消化後に蛍光色素を添加し、こうして起こり得る蛍光色素−制限酵素のコンフリクトを回避することに注目されたい。また、イメージングもまた消化後に行う。
別の実施態様では、制限酵素をマイクロタイタプレート中で酵母染色体ＤＮＡ分子に添加することにより、表面包埋されたＤＮＡをマップ作製のために分析することができる。次に、包埋後に生成物を分析する。この場合の分析技術には、最初の末端標識YACが含まれるはずである。本発明の高処理量の方法は、再び、消化後に制限消化産物のイメージングを採用する。
5.4.1.1.2.インタクトなYAC DNAのスポッティング
実験データより、溶融アガロース中で懸濁されたYACのサイジングされたＤＮＡ分子が、小液滴として表面に格子状に配列された時に伸長され、固定され得ることが示される。図31を参照しつつ、包埋手順を以下のように記憶することができる。アガロース中に埋め込まれた少量のＤＮＡを処理された表面110に落下する。この工程後に、液滴が流れ、ＤＮＡ分子が表面に粘着し、伸長する。この技術は哺乳類細胞のカリオタイピングに使用するスプレッディング手順と同様である。
その方法の処理量および精度を高めるために、本発明の特別な実施態様によれば、分解を最小にし、分子伸長分布を最適化することが提案される。理想的には、表面に完全に配置され、完全に生化学的に活性であり、かつ同じ因子によって伸長された全ての分子を有することが望ましいはずである。これは実際には満たされない、仕様書のストリンジェントなセットである。なぜなら、充分なサンプルサイズの簡単なイメージ処理ルーチンが完全なデータよりも少ないデータに適応することができるからである。
特に、好ましい実施態様によれば、ＤＮＡ濃度は、ピペッティング変数（オリフィスサイズ、送達時間等）、ゲル濃度、表面条件（ポリリシンの組成、およびAPTESなどのその他の化合物）、表面および液体の温度等を変えて、系統的に変化させる。被覆されたガラス表面を定義した方向に刻み、分子が付着するための粘着性の溝を提供する。次に、分析のために、蛍光顕微鏡を使用し、固定された分子の数、見かけの分子長さの分布および生化学的活性を測定する。生化学的活性は、表面に結合した既にマッピングされた分子の制限消化活性を測定することにより評価する。重要なことに、この作業は表面上にある分子、アガロースゲル層に閉じ込められた分子を含まない。
高処理量のマッピングのために、表面に落下させたスポットを密に配置させることが重要である。上記のEppendorf Micro-Manipulator/Injector装置がこの目的に適している。その装置のインジェクターユニット（これはMicro-Manipulatorとインターフェースする）は、非常に再現性の良いピペッティング速度、並びにピペット充填時間を提供する。この特別な測定では、大容量の格子状配列を行うことはできないが、マイクロマニュピレーションはミクロンの画分まで再現性がある。
加えて、スポット中の分子密度は、有意な重複および密集状態となることなく、フィールド中でイメージングされる分子の数を最大にするために最適化する必要がある。密集状態はその後の分析において、個々の分子または断片の認識を複雑にするということが認められる。高処理量の処理に最適の包埋条件もまた、因子数に依存し、分子サイズが主要な因子となる。約５〜10個のの500kbの分子を、100倍の対物レンズおよびカメラ／デジタル化システムを使用して同時にイメージングすることができる。制限消化効率が約20％（完全消化について）である場合、正確なマップがは約50〜100個の分子から作製ｓるうことができる。これは、１〜10の完全に消化された点数付けが可能な分子を作り出すために、約５〜20のフィールドが必要であることを意味する。間隔という語は、スポット当たり最大約（0.5mm）2と言い換えることができる。したがって、スポット間の中心間隔が1mmであると仮定して、約400個のスポットを（2cm）2のカバースリップ上に置くことができる。最後の考慮事項は、格子状に配列するプロセス中における乾燥からアガロースのスポットを保護することである。この問題の可能な解決策は、格子状の配列を高湿度の下で行うこと、グリセロールをアガロースに添加することおよび軽質炭化水素の層で覆われた緩衝液中でピペット操作を行うことを含む。
上記の方法を使用して得られた表面包埋分子は鮮明な高コントラストの画像を与える。これらの高コントラスト画像は実際には二元画像をつくるのにほぼ理想的である。なぜなら、それらは通常の影を付ける修正操作以外の処理を殆どまたは全く必要とせず、かつコンピュータが読み取る上で簡単だからである。それ故、このような二元画像は殆どの自動化画像処理ルーチンの出発点である。次に、簡単な自動化イメージングルーチンを種々の個々のＤＮＡを識別するために使用することができる。例えば、光学的マッピング技術を、5.2節に記載したように、蛍光強度および分子輪郭長を測定することによって得られる制限断片をサイジングするために使用することができる。このアプローチを高処理量の測定に使用する場合の問題は、分析に有益な分子の認識である。本発明によれば、この問題の解決策は、包埋されたＤＮＡ分子の二元画像から自動的に“マスク”をつくることである。次いで、これらのマスクは分子断片を認識し、それらをサイジングし、マップをつくる光学的マッピングプログラムを誘導するために使用することができる。
更に、分子にタグをつけ、そしてコンピュータ制御フィルターホイールを用いた蛍光顕微鏡フィルターパックを変えることにより、分子を識別することができる。当然、このような場合、タグはバルク染色された分子のスペクトル特性とは異なるスペクトル特性で設計する。光学的マッピングに適合するその他の分子タギングアプローチもまた使用することができる。
5.4.1.2. 画像処理装置
本発明の好ましい実施態様では、前処理した表面に固定した分子のイメージングが、エピー蛍光（epi-fluorescence）のために装備されたツァイス社のAxioplanまたはAxiovert135顕微鏡（グリーンの励起波長およびレッドの放射波長のためのフィルターパック、または好ましくはYOYOフィルターパック、490nmの励起波長、510nmの放射波長）およびPlan-Neofluar対物レンズ（16倍、100倍: Zeiss製）を使用して行う。顕微鏡がHamamatsu C 2400 SITフォーカシングカメラおよびイメージングPhotometrics PXL Cooled CCDカメラに結合する。好ましい実施態様では、画像処理装置の空間分解能は12ビット／pel生画像グレイレベル分解能および16ビット操作分解能で画像当たり1032×1316ピクセルである。
本発明の好ましい自動化実施態様では、フォーカシングSITカメラの出力を自動焦点調節およびイメージングされるスポットのx-y位置を調節する位置決めのためのフィードバックループに使用する。電子自動焦点ユニットおよび顕微鏡焦点コントロールに接続されたステッピングモーターユニットがLudl El-ectronicsにより提供され、当業界で知られている。このシステムは一つのイメージングされたスポットから別のスポットに自動的に移動することができる自動化顕微鏡として動作する。
本発明の好ましい実施態様では、処理コンピュータは画像データの大容量の連続処理を可能にする128MB RAMおよび32GBハードドライブスペースを備えたSUNワークステーションである。別の実施態様では、デジタル化画像を、Macintoshコンピュータを使用するその後の処理のために格納する。この実施態様では、Signal Analyticから配布された市販のソフトウェアパッケージIp Labの改良バージョン、またはMacintoshコンピュータ用のNIHの市販ソフトウェアの改良バージョンを使用することができる。
図32は好ましくはクールド（cooled）CCDカメラ（Photometrics, AZ）を含む本発明の光学マッピングのためのシステムの別の実施態様のブロック図である。図32の装置は上記の装置よりも高処理量の測定に適しないが、生命分子を区別することが必要である時はいつでも、それは蛍光寿命顕微鏡の使用を必要とする或る用途で使用し得る。
詳しくは、図32中、顕微鏡20がコンピュータ制御x-yテーブルに置くサンプル10をイメージングするのに使用する。顕微鏡の照明は照明源30により与えられ、これは水銀ランプまたは好ましい実施態様では、レーザー源であってもよい。コンピュータ40は操作ゲートパルサー60を制御するコントローラー50に接続される。本発明のこの実施態様では、ゲートパルサー60が照明源30に接続され、サンプル40からの蛍光放射をもたらす照明パルスを誘発する。これらの放射を顕微鏡20によって集め、ゲートパルサー60からのゲートパルスの制御のもとにICCDカメラ70により同調的に読み取る。
5.4.1.3.蛍光寿命イメージング
図33は図32に示される本発明の実施態様に従って画像収集プロセスを最適化し、シグナル対ノイズ比を最大にする方法を示す。その方法は、照明源からの迷光および散乱を排除するように、照明源の強度がゼロに下がったときに、カメラが画像を収集し、時間スロットに記録することができるインターバルを制限することに基く。
図33に示されるように、イメージング蛍光寿命顕微鏡の心臓部はコイル化画像強調電荷結合装置（ICCD）である。この低ノイズ装置は、単一光子カウンティングレベルに近い光条件下でイメージングすることができる。ICCDシグナル対ノイズ比はフレーム平均SITカメラの少なくとも２倍良い。更に、ICCDは5nsまでゲートダウンすることができ、このゲートは殆どの蛍光プローブ寿命よりも短い。このカメラの増強ステージはミクロチャンネルプレートからなり、これは光電子倍増管の束のように機能し、その結果、少数の光子が蛍光体スクリーンに当たり、明るい画像を生じる電子の電子なだれを引き起こす。蛍光体スクリーン画像は光ファイバーカプラーによりインテンシファイヤーに取り付けられたCCDチップにより検知され、チップに生じた画像がカメラ制御装置に移され、デジタル化される。前記のように、強化装置は、それが丁度カメラシャッターのように開閉できるようにゲートされる。しかしながら、この“シャッター”は非常に速く、しかも5×106:1よりも良好なゲーティング比を有する。本発明によれば、ICCDは蛍光寿命顕微鏡を使用する定量的研究に好ましいイメージングシステムである。
そのシステムのシグナル対ノイズ比を最大にするために、ICCDのゲーティング特徴は、励起パルスが終了された後にのみシャッターを開くのに使用され、こうして照明源からの迷光および散乱を実質的に排除する。それ故、画像収集のための放出光子が制御されたタイミングでもっぱら蛍光から発生し、このことが、そのシステムが蛍光寿命に基いて未結合放出および迷蛍光から結合放出を区別できることを可能にしている。
そのシステムを使用する非限定例として、臭化エチジウム−ＤＮＡ複合体について、色素レーザーを525nmに同調させ、ゲート幅を結合種の寿命の約３倍である63nsにセットする。水中の未結合臭化エチジウム蛍光の寿命はわずかに約1.6nsであり、その結果、遊離の蛍光色素の放射が励起プロファイルに近接して起こり、排除が可能となる。浸漬油、ガラススライドおよびサンプル不純物のようなバックグラウンド蛍光のその他の源からの放出もまた、この技術を使用して減少させることができる。
本発明によれば、ゲーティングされたパルスを時間で調節し、蛍光減衰と同調させ得る。特に、ゲーティングパルサーを時間で調節して蛍光色素−ＤＮＡ複合体の蛍光寿命中に高電圧シグナルを生じさせる。高電圧パルスは電子シャッターを開閉する。照明が8ns FWHM期間でパルス化され、その結果、シャッターが閉じられる時にのみ、励起が起こる。このアプローチを使用する排除フィルターにより、光処理量が増加し、望ましくない蛍光源が除去される。特別な実施態様では、レーザー励起反復速度が可変であり（１〜100Hz）、蛍光放出がICCDヘッドの電荷につれて蓄積する。得られた画像は、分子量に比例する強さを有する明るいスポットからなるものを作り上げる。二つのナノ秒レーザー、例えば、Continuum Corporation Nd-YAG pumped TiSaphire同調固相状態レーザーおよびLambda Physik excimer pumped色素レーザーがこれらの方法による使用に適している。
システムの感度およびサイズ分解能は、臭化エチジウムで染色されたλバクテリオファージＤＮＡのEcoRI消化産物を使用して評価し得る。特に、画像が生成され、単一分子に相当するスポット強度が画像処理ルーチンにより表示される。続いて、これらの強度を断片サイズ集団に相当する強度集団を示すヒストグラムを得るために使用する。測定の正確さおよび精度を計算し、ヒストグラム分析に適したビン幅をセットするのに使用することができる。この種の分析は合成シリコンマトリックス中を流れるＤＮＡ分子について行うことができる。
この手法によれば、ＤＮＡ断片に最適焦点を合わせることが好ましい。なぜなら、焦点のずれている断片は、その強度値が、同じサイズの分子に対しても変化する可能性があるからである。分子に焦点が合っていることを確認するために、本明細書中に記載されている表面マウント技法が使用できる。この他の方法として、溶液中またはゲル中のＤＮＡ断片を遠心力を利用してガラス表面上に展開する方法が挙げられる。
本発明によれば、不均一な照明は、注意深い照明調節を併用することよって、および光学的マッピングにおける相対強度測定用に開発された処理ルーチンを使用することによって補正できる。本質的には、このルーチンは、局所的な周囲のピクセルの位置決めを行い、これらの強度値を使用して局所的なバックグラウンド値を計算する。以下で詳細に説明するが、局所的なバックグラウンド値は、不均一な照明を補償し、陰影補正として機能する。
この方法の解像度を改良するために、いろいろな蛍光色素を使用することができる。たとえば、様々な程度の配列特異性を有するもの、また適切であれば、エチジウムホモダイマーおよびエチジウム-アクリジンオレンジヘテロダイマーなどの相補配列バイアスを有する蛍光色素を使用できる。イメージコントラストは、結合していない蛍光色素を除去することによって更に改良できる。例えば、エチジウムモノアジド（Molecular Probes, Inc.）は、光化学的手段で高収率にＤＮＡに共有結合する蛍光色素であり、結合されていない化合物は、マウンティング前に、標識されたＤＮＡから容易に抽出できる。
上記の第5.2.2節に示したように、一連の十分に定義されたＤＮＡ断片を、内部蛍光サイト標準としてサンプルに添加することができる。蛍光強度標準の濃度は、任意のヒストグラム分析で容易に識別できるように調節する。
また、蛍光寿命顕微鏡を使用して、より大きい断片（50-1,000kbまたは1-1,000,000kb）に対し、強度に基づくサイズ決定の改良を行うことができる。純粋なサンプルの制限消化物に対して得られた上記のサイズ決定分析の結果は、光学的なフィンガープリントであり、ゲル電気泳動法から誘導されるフィンガープリント（ハイブリダイゼーション工程を含まない）と類似したものである。この進歩したサイズ決定法を補助的方法に適用し、特定の個体または集団もしくはサブ集団のゲノムＤＮＡおよびＹＡＣから迅速に定序地図を作成することができる。
5.4.2.画像処理
図34は、本発明の好ましい実施態様による高処理量の画像処理のブロック図である。
具体的には、この方法の工程A1は、未処理画像の平坦領域補正である。平坦領域補正を行って、ピクセル値がサンプル平面の各ピクセル位置に存在する色素の量に比例する画像を作成する。この操作は、典型的には、視野の全領域にわたり照明が不均一な場合に必要となる。この補正を行うと、システムの繰り返しサンプリングの際にモアレ効果に類似した目に見えるビートパターンを生成する恐れのある不完全なイメージフィルターの影響を取り除くこともできる。この補正は、放出される蛍光が視野内の照明の量に直線的に依存し、かつカメラのレスポンスが直線的であるという仮定に基づいている。
2つの補助的画像、すなわち、暗い画像（視野からの入力シグナルがない画像）および対象の画像（照明画像）を使用して平坦領域補正を行う。これらの画像はいずれも、ビデオ信号が飽和しない同一条件下で撮影しなければならない。こうした条件下では、両方の画像のグレーレベルヒストグラムが正規分布する。次に、ピクセルごとに照明画像から暗い画像を差し引いて、カメラに到達する光から生成される画像の対応するピクセルにおける照明レベルに比例した差シグナルを発生させる。次に、各ピクセルにおいて得られた差シグナルを、照明画像の対応するピクセルの値により規格化し、ピクセル値がサンプル中の色素の量に比例する画像を発生させる。
本発明による画像処理法の第2工程A2では、所望の分子断片の輪郭にほぼ対応し、従ってこの輪郭を識別するバイナリ画像を発生させる。本発明のシステムでは閾値設定が自動化されており、画像のヒストグラムの作成、およびバックグラウンド（光の存在しない部分）に対応するグレイレベルとフォアグラウンド（分子断片）に対応するグレイレベルとの中点の計算値に等しい二値化のための閾値レベルの設定に基づいて行われる。この工程は当該技術分野で周知であり、これ以上の詳細な説明は行わない。本発明の好ましい実施態様において、バイナリ画像を発生させる工程の前にフィルタ処理を行う。この処理は、本発明の方法の精度に影響を与える恐れのあるスポットノイズまたは他のアーチファクトを除去するようにデザインされている。当該技術分野で周知のように、サイズ5×5または7×7の2-Dメジアンフィルタを使用して、こうしたスポットノイズを除去できることが好ましい。
本発明の方法の工程A3において、画像化された分子は、閾値設定された画像に基づいて分割される。このタイプの形態学的処理については、第5.2節にいくぶん詳細に説明した。NIH画像処理ルーチンを用いた本発明の特定の実施態様において、最初に、所望の断片の近傍を指定することによって、基になる断片を選択する。次に、ピクセル複製を行って4倍に拡大した後、画像領域の選択部分のオーバーレイ画像を提示する。分割工程の前に、バックグラウンド補正を行って、結合していない色素や不完全なエミッションフィルタの影響を取り除いてもよい。この処理工程において、画像の各ピクセルから平均バックグラウンド値を単純に差し引く。
本発明の好ましい実施態様において、画像の分割は自動的に行われるが、これには、例えば、画像化された分子の中心軸の計算および結合情報の定義および保存が含まれる。
本発明の1実施態様において、分割工程A3では、ＤＮＡ断片の識別が行われる。本発明の第2の好ましい実施態様において、断片の識別の後、分子断片を結合させて完全な再構成分子とするコンピュータルーチンの一部として境界抽出およびエッジ結合の工程が含まれる。
図34に示されているように、この高処理量の画像処理の最終工程には、以下でより詳細に説明されるように、画像化された分子のサイズ決定、およびこれに続く光学的マッピングまたは場合により光学的配列決定が含まれる。
5.4.2.1 光学的マッピング
本発明の好ましい実施態様によれば、高処理量の光学的マッピングを利用して、クローン地図を作成する。この方法には、以下の工程が含まれる：
（1）分子を画像化して分析対象のクローンのデジタル画像を得る工程。
（2）相対蛍光強度または輪郭線長の測定値を使用して、個々の分子から地図を作成する工程。この工程には、前述の第5.2節で説明したように、個々の断片の相対的サイズの計算が含まれる。
（3）検出された切片の数に基づいて、測定されたすべての分子のヒストグラムを作成する工程。例えば、図7に示すように、作成されたヒストグラムは、消化後の特定の数の切片を有する分子の数を表す。
（4）特定数の切片に対応するヒストグラムの各柱に対して、工程（2）で作成された地図の統計解析を行って、切片のクラスタリングコンシステンシーに関する情報を得る。コンシステンシーの値は、ヒストグラムの１本の柱に含まれる分子を対象としてプールされた標準偏差を計算することにより決定される。コンシステンシー解析は、単一クラスターの要素間のユークリッド距離を極小化し、かつ他の測定クラスターとの距離を極大化するプログラムに基づいている。本発明の方法のこの工程は、例えば、Systatなどの市販の統計学ルーチンを使用して実施することができる。（従って、例えば、本発明によれば、特定数の切片を有することが判明したすべての分子を調べることにより、切片の空間位置のコンシステンシーが求められる。）
（5）本発明によれば、コンシステンシーが最大（すなわち、プール標準偏差が最小）で、しかも断片の数が最大であるヒストグラムの柱を選んで、更なる解析を行う。具体的には、選択された柱に含まれるすべての個々の断片のサイズを平均して、所望の定序地図の推定図を得る。前述の第5.2.3.節で示したように、サンプル平均をとることにより、測定数の平方根に比例して測定精度が増す。
（6）最後に、地図を並べて（すなわち、最大の断片を左側に置いて）所望の定序地図を作成する。
本発明の好ましい実施態様により提示された光学的マッピング手法は、簡単に実行でき、従って自動化が容易である。更に、多数の測定を並行して行えるので、本発明の方法は、非常に高処理量で、更にまた高精度であるために、すべての種類の実際の用途に対して極めて価値のある解析手段を提供することが期待される。
5.4.2.2 新規な配列決定
前述の第5.3.節で説明した光学的配列決定は、高処理量光学測定と併用する場合、特に重要になると思われるゲノム解析である。また、こうした高処理量の測定を、新規な配列決定技術と組み合わせて利用することができる。例えば、こうした測定を利用して、Sangerジデオキシ配列ラダーのサイズ分布を迅速に解析することができる。具体的には、標準的な技法により切り取られた分子を標識化または染色し、顕微鏡の台に乗せ、上述の回転拡散法を用いてサイズ決定する。
Sanger配列決定技法は、回転拡散係数を測定するための理想的な基質（すなわち、硬い棒状の二重鎖ＤＮＡ分子）を提供する。このサイズ範囲（50-500bp）にある分子に対して、長さに対する回転拡散係数の依存性が実験的に決定されたので、１個の塩基対に相当するサイズ差の解像度が達成できる。例えば、200bp分子対199bp分子では、相対回転拡散係数の比が1.025であり、一方、100bp分子対99bp分子では、この比が1.0360となる。従って、たとえ中程度の長さのポリヌクレオチドを扱う場合でも、依然として解像力は適切なレベルが維持される。更に、測定されたデータは、いくらかの測定誤差があるにもかかわらず、非常に正確であると予想される。なぜなら、測定長は測定時間の1/3乗に比例して変化するからである。
短いロッドのＤＮＡ内に異常に高いモル濃度の発色団が含まれているにもかかわらず、発色体の総数は少なく、従って蛍光が弱い。十分な感度を得るために、例えば、単一光子を検出できるマイクロチャネルプレート検出器が利用できる。更に、マイクロチャネルプレート検出器を高感度SITカメラに接続し、画像処理技術を用いて平均化すると適切なデータが得られる。
また、プライマー長を最適化してサイズ差を最大にする必要がある。具体的には、プライマーは、ラダー中の最小分子を検出するのに十分な発色団を含有できる長さにしなければならないが、ランダムコイルの挙動を呈するほど長くしてはならない。好ましくは、最小分子を検出できる最小のプライマー長を利用すべきである。
こうした新規な光学的配列決定を行うために、一群の離散分子を使用して解析を行う。この解析からサイズ分布ヒストグラムが得られ、更に統計解析を行って所定の配列ラダーの完全なキャラクタリゼーションを行う。システムの処理量を増大するために、画像処理装置は並行して多数の対象物を測定できる。測定される分子が小さいので、何千という分子の強度変化を同時に画像化できる。
新規な光学的配列決定法のデータ処理速度は、原理的には、ゲルベースの方法の何倍も速い。ミリ秒の緩和時間で30サイクル／配列で複数の配置／サイズの継続的測定を高速コンピータを用いて行った場合、配列１個につき４回の反応を仮定すると300塩基対ラダーが120秒間でサイズ決定でき、9,000bp/時の最終速度が得られる。この速度は、ヒトゲノムのマッピングおよび配列決定に関するNational Academy報告に記載されている自動配列決定装置よりも約15倍速い。
5.4.3. 動的測定
本発明の特定の実施態様によれば、第5.2.2.2.1.節に記載されているように、新しい物理的作用を利用して分子を伸長させ、かつ新しい処理方法を用いてリアルタイムで分子長を測定することによりOCM動的分子サイジングを改良すると、高処理量の方法を提供できる。
具体的には、ここに提案された方法によれば、流体-ゲル界面は、摩擦力差を起こすのに最適な状態を提供し、電気泳動分子に作用してほぼその全輪郭線長まで分子を伸長させるとともに、この全輪郭線長を画像化することができる。分子に作用する正味の力は、ゲルマトリックス中のＤＮＡの摩擦係数と流動相の摩擦係数との差によって決まる。周知のように、ＤＮＡ分子がゲル-流体界面を介して電気泳動する場合、流体の摩擦力はゲルマトリックス中に存在するときよりもはるかに小さい。典型的には、これらの力は少なくとも1/10となり、この差はゲルの濃度により変化させることができる。ゲルマトリックス中では分子配座は動的であるが、平均すると比較的小さい。分子がゲルマトリックスから自由溶液中に入ると摩擦力が減少するため、分子を横切って摩擦力に差を生じ、その結果、分子が伸長する。分子をマトリックスから完全に引く抜いた直後に、伸長力が失われ、分子は緩和されて小さい自由溶液配座に戻る。電場を反転させると、自由分子がゲルマトリックス中に戻る。本発明によれば、この過程は、一連のデジタル画像を用いて画像化できる。次に、ゲルマトリックスと流体との境界を横切るように分子が伸長したときの分子の見かけの長さを測定することができる。続いて、所望の精度にもよるが、必要なだけ多く回数で測定値の平均をとることができる。
本発明のもう１つの実施態様において、上述したようにゲル-流体界面を介して分子を電気泳動させ、周期的な間隔で分子の光学長を測定することにより分子緩和を推定し、これから緩和度を定量化すると、高処理量の緩和時間測定が行える。第5.2節で説明したように、時間を関数とした見かけの分子長の変化を単一の指数減衰関数にあてはめると、緩和時間が得られる。
この実施態様において、溶液緩和機構は、コイルセグメントが管内または一連の連結したゲル孔内を移動するという制限がないという点でゲルベースの機構といくらか異なる。むしろ、自由溶液中では、伸長したＤＮＡ分子は、引き伸ばされる扁長楕円体から、より対称性の高い球状配座へ移行することにより緩和される。また、自由溶液中では緩和時間がより短く（一般的には1/10となる）：例えば、500kb分子の緩和時間は4秒である。しかしながら、溶液緩和時間は溶液粘度に反比例するので、小分子に対する測定は、単純にグリセロールまたはセルロースを添加して溶液の粘度を増大させることにより便利な時間スケールで実施することができる。溶液に基づく緩和測定から求められた緩和時間が短いほど、高処理量の手法にとって有利である。なぜなら、緩和時間が短いと、規則的な間隔で画像を自動取得することができ、次に、得られた画像を利用して所望の緩和時間を自動的に決定できるからである。
特定の実施態様において、高処理量の本発明の動的サイズ測定法は、約20-50分子／分の速度で界面を介して分子を電気泳動させることにより実施することができる。輪郭線長は、光学的マッピングおよびコイル緩和測定用に開発されたものと同じ技術およびコンピュータアルゴリズムによって測定および作表することができる。SITカメラから得られるような画像は迅速にデジタル化され、フレーム平均が求められ、30/秒の速度で16ビット分解ファイルとして格納される。特定の実施例において、120ファイルのフレームバッファーが解析用コンピュータで使用できる。このことは約4秒間で120個の512×512ピクセル画像をデジタル化および格納できることを意味する。画像サイズを減少させれば、もっと迅速に画像の格納が行える。この場合、同じハードウェアを使用して480個の128×128ピクセル画像を格納できる。従って、処理アルゴリズムにより、20秒間隔ごとに約10個の画像（4-16個のフレームをまとめて平均することにより）を取得することによって、同時に5-10個の分子のサイズを決定することができる。１ギガバイトのハードディスクは、2,000個程度の完全フレーム画像、すなわち、1,000-2,000個の分子のサイズデータを格納するスペースを提供する。処理アルゴリズムをバッチモードで作動するように設定し、約3-5時間かけて１ギガバイトに相当する画像データを処理して1,000-2,000個のサイズをスプレッドシート上に作表するようにできる。これらの処理時間は不在時操作に基づいているが、オペレータを介在させて便利な手作業による分子の識別およびマーキングを行って解析を進めることもできる。
流体中で得られたＤＮＡの蛍光画像は、ゲル中で得られた画像と比較すると、一般的に、より明るく、より鮮鋭で、蛍光アーチファクトが比較的少ない。従って、これらの画像は無人画像処理に適している。なぜなら、こうした画像は、デジタル画像すなわちバイナリ画像への変換の信頼性が高いからである。このサイズ決定法は、NotIで消化させて複雑さが増した一連の酵母染色体混合物（30-900kbのＤＮＡを含有する）を使用して、試験およびベンチマークテストを行うことができる。統計解析を行って、一回の測定値の精度を計算し、使用した手法の精度を決定することができる。次に、信頼区間を求めて、複雑な混合物を適切に解析するのに必要な分子の最小の数を決定する。この解析は、使用される特定の装置および方法に対して利用しうるサイズ解像度レベルおよびサイズ識別レベルを決定するうえで役立つ。ノイズや系統誤差の発生源をできる限り検出して除去する必要がある。本発明によれば、サイズの下限は5-20kbであり、サイズの上限は増大する。このことは、界面からの既知の距離を相殺し、コイル末端だけをモニターすることにより、顕微鏡の視野よりも大きい輪郭線長を有する分子のサイズが決定されるというもう１つの事実に基づくものである。
実施例
以下の実施例は、本発明をより完全に説明するために提示されたものであって、本発明の範囲を制限するためのものではない。
実施例１． 顕微鏡観察用ＤＮＡの調製
G細菌は、Fangman, W.L., Nucl. Acids Res., 5, 653-665（1978）に記載されているように増殖させ、また、ＤＮＡは、無傷ウイルスを1/2 X TBE緩衝液（1 X：85mM Trizma Base（ミズーリー州St. LouisのSigma Chemical Co.）、89mMホウ酸、および2.5mM EDTA二ナトリウム）に溶解し、次にエタノールより沈殿させることによって調製したが、パルス電気泳動解析および顕微鏡解析により判断するかぎり、この工程でＤＮＡが切断されることはなかった。
ＤＮＡ溶液（1/2 X TBE中、0.1マイクログラム／マイクロリットル）を、1/2 X TBE中の1.0%低ゲル化温度アガロース（メイン州RockportのFMC Corp.製Sea Plague）、0.3マイクログラム／ml DAPI（Sigma Chemical Co.）、1.0% 2-メルカプトエタノールで希釈し（約0.1-0.2ナノグラム／alアガロース）、65℃に保った。ＤＮＡ以外のすべての材料を0.2ミクロンフィルターに通し、蛍光デブリを減少させた。実験条件に起因して融解する可能性のあるＤＮＡをパルス電気泳動解析により調べた結果、問題にならないことが判明した。
実施例２． ゲル中のＤＮＡの画像化
実施例１のサンプルを顕微鏡用スライド上に置いた。サンプルをマウントするために、ピペットマンおよび剪断を減少させるように端部が切り取られたピペットチップを用いて、約3マイクロリットルのＤＮＡ-アガロース混合物を、予め加熱しておいてスライドおよびカバーガラスに注意深く移した。調製されたスライドを、図１および図２に示すように小型パルス電気泳動装置中に配置した。残りの工程はすべて、室温で行った。サンプルを予め数分間電気泳動させ、緩和させた後、データの取得を行った。chrontrol time（カリフォルニア州San diegoのChrontrol Corp.）またはIBM ATコンピュータ内に格納され、Hewlett Packard 6115A高精度電源により電力供給されるAdtron data generating board（アリゾナ州GilbertのAdtron Corp.）のいずれかを用いて、パルス場を発生させた。場の強さは、Fluke digital multimeter（ワシントン州EverettのJ. Fluke Co.）に接続された補助電極を用いて測定した。DAPI蛍光に適したエピ蛍光光学素子およびZeiss 100x Plan Neofluar油浸対物レンズを備えたZeiss Axioplan microscope（西独のCarl Zeiss）を使用して、サンプルの可視化を行った。NDフィルターを使用して励起光を減衰させ、蛍光標識されたＤＮＡに光損傷を与えないようにした。C2400 silicon intensified terget（SIT）camera（ニュージャージー州MiddlesexのHamamatsu Corp.）をIC-1 image processing system（ノースカロライナ州Research Triangle ParkのInovision Corp.）と接続して使用し、顕微鏡からのビデオ画像の取得および処理を行った。5秒または6秒に1個の割合で連続的に画像を取得し、1回の処理で200個におよぶデジタル化画像を格納できた。デジタル化された各時経画像は、30Hzで得られた8個のフレームを統合して得たが、これはコイル運動に起因するストリーキングを回避するのに十分な速さであった。時経取得が終了した後、顕微鏡の焦点をずらし、バックグラウンド画像を取得した。各時経画像の処理は次のように行った。最初に、バックグラウンド画像のコピーを減衰させ、平均バックグラウンド強度が平均時経画像強度の82%になるようにした。この減衰させたバックグウンドを、時経画像から差し引き、次に、得られた画像を線形伸長コントラスト増強アルゴリズムにかけた。処理された画像の写真を、Polaroid Freeze Frame video image recorder（マサチューセッツ州CambrigeのPolaroid Corp.）を用いて得た。
実施例３． ゲル中の摂動分子
実施例２の分子に対してPOEによる摂動を与えた。所定の比を有する比較的短い一連の正規パルスを用いてPOEを行い、より長い時間を経過させた後、一方の電場の極性を切り換えた。切り換え時間および規格化電場比は、パルス時間および電場角のパルス電気泳動変数と同等である。
POE実験を記述するのに使用した条件は次の通りである：すなわち、3,5-80秒パルス、3ボルト／cMである。「3,5-80秒」とは、南北方向の3秒パルスの後で東西方向の5秒パルスを与え、この3,5秒サイクルを80秒間行った後、更に80秒間にわたり5秒パルスの極性を変化させ（西東方向）、関与する分子に対してジグザク階段状経路を規定した。パルス強度は3ボルト／cMであった。この実施例において、エピ蛍光顕微鏡法をPOE法と併用し、電気泳動中のＤＮＡの配座変化および位置変化についての一般的な研究を可能にした。この実験では図２に示された適応顕微鏡室を利用してPOE法を行ったが、通常の電場on-off切り換えを行うことも可能である。様々な角度で電場を印加する場合、POEはいくつかの利点を有するが、その場合、分子をその長軸に沿って回転させなければならないこともある。図１および図２は、適応POR室を図解したものである。
実施例４． ゲル中の分子緩和の観測および測定
実施例１−３のGバクテリオファージＤＮＡの緩和は、POE（3,5-80秒パルス、3ボルト／cm）を600秒間行った後で観測した。
イメージプロセッサーを使用して、例えば、「特徴解析」により、緩和過程の画像化の定量化および自動化を行った。図３（a）に示すように、画像を連続的にデジタル化および格納した後で、特徴解析を行う。次に、イメージプロセッサーは画像中の離散した対象物を識別し、その数をかぞえ、形状に従ってそれらのキャラクタリゼーションを行う。例えば、コンピュータは、歪んだコイルの集団に対して有効楕円体軸（長軸および短軸）を決定し、緩和過程中にコイルが球状配座に近づく時間の関数として、こうした特徴の計算を行う。他のタイプのコンピュータ測定を行ってＤＮＡのキャラクタリゼーションを行うこともできる。
図５に示した画像は12秒間隔で取得したものであるが、この画像は96秒間にわたる数個の分子の緩和を示している。（a）には、電場の印加を打ち切ってから3秒後の数個のコイルが示されている。顕微鏡の解像度の限界による影響を受けるが、印加された電気パルスにより規定される同一の波形階段状経路を介してコイルが緩和するように見える（矢印で示された分子を参照されたい）。（c）には、２つに切断される分子が示されており、（j）において、すべてのコイルが丸形の細長くない配座への緩和を起こした。（j）に示されたバーは、長さ10ミクロンである。
実施例５ 緩和動力学の測定による１以上の分子の分子量測定
実施例１〜３の手順により既知の分子量の分子をイメージング用に調製し、実施例１〜４の方法により該分子の緩和時間を測定する。イメージングにより緩和時間のデータを収集し、同様な組成のＤＮＡ分子の分子量と緩和時間との間の数学的関係を計算するのに使用する。次に未知のサイズの分子のサンプルの緩和時間を測定し、既知のサイズの分子に基づいて決定した数学的関係を使用してその分子のサイズを計算する。
実施例６
ゲル中での再配向速度を測定することによる１以上の分子の分子量の測定
ポリマーは任意のサイズのものでよいが、特に小さすぎてイメージングできないもの（約0.1μ未満）について、印加電場により誘導される再配向速度を測定することにより、アガロース、ポリアクリルアミドゲル等のようなマトリックス中でサイズを決定する。再配向測定は自由溶液中でも行えるが、マトリックスは不要なポリマーの対流や移動を防止するので好ましい。さらにマトリックスの存在によりサイズに対する感度を増強することができ、これは一つの理由として配向機序が異なることによる。再配向時間の測定にはPOEが特に有用であり、これはその実験上の融通性と、おそらく15〜20メガ塩基の非常に大きなサイズの解像力によるものである。ＤＮＡ分子（150塩基対未満とサイズ測定されたもの）のような剛性のポリマーは、溶液中においてロッド状で存在し、回転拡散係数（その長軸の周りで回転させようとしたときにロッドが受ける摩擦）はM3に比例して変化する。顕微鏡観察法を使用すると、イメージングするのに十分大きな分子が可視化され、そのイメージから再配向時間が測定される。分子の任意のサイズについて、特に可視化するのには小さすぎるものについて、視野中の各ロッドの再配向時間を分光分析法で測定することが好ましい。二種類のそのような方法、即ち蛍光二色性及び複屈折によるものを以下に詳述する。
1）立体的に予測可能な形で結合する発色団（エチジウムブロミドはＤＮＡ分子中にインターカレートされる）をポリマー分子に結合する。偏光を照射することにより発色団を励起する。全蛍光強度を測定することにより、一時的に各分子の配向についての情報が得られる。顕微鏡視野中での各分子の蛍光放射は、高感度マイクロチャンネルプレート検出器により測定する。
2）分子の配向の動力学的分析の後、複屈折測定を行う。複屈折法により屈折率の変化を測定し、これは容易に溶液あるいはマトリックス中の巨大分子の配向に関連付けられる。複屈折測定は、ＤＮＡ分子がゲル電気泳動にかけられている間に行う。電場を印加するとＤＮＡは伸長し、電場により整列し、これにより屈折率が変化する。複屈折の変化を経時的に測定することにより、分子が印加電場により配向する間のＤＮＡブロブトレインモーション（DNA blop train motion）の詳細を把握することができる。
より具体的には、複屈折測定は、小さな周波数差（２つの周波数レーザーにより与えられる）により差を付けられたレーザー照射（赤色）の２つの直行偏光面の位相差を測定することにより行う。パルスコントローラー82により発生される印加電場により分子が整列する間に（POEチャンバー中で）、分子の整列により屈折率が変化する。光を検出器76で検出し、レーザー70をソースとする標準と値を比較することにより、位相検出器78で測定される透過した放射中の位相差が得られる（図3（b））。時間（電場印加時間）の関数として得られた位相差のデータをデジタル化し、後の再構成及び分析のためにコンピューター80に記憶させる。
図1及び2に示す装置は、分子の再配向を起こすのに必要な場を印加する。その場において分子のサイズを適切に測定するために、種々の回転様式を取ることができる。例えば、回転電場周波数を掃引してポリマーサンプルとの共鳴周波数を見出すことができる。
実施例７
ゲル中での分子の回転時間を測定することによる１以上のＤＮＡ分子の分子量の測定
ロッド状あるいは剛性コイル形状の分子を調製し、アガロースゲルではなくアクリルアミドを任意に使用し得る以外は、実施例１〜４と同様に観察する。
コイルまたはロッドの回転速度は、上記実施例６において記載した技術のいずれか１つを使用して顕微鏡ベースのシステムにより測定する。分子がその中心の周りを回転する間にサインカーブ状に変化するシグナルが得られる。このサインカーブ状シグナルを使用して、ロッド長の３乗に比例して変化する回転摩擦係数にサインカーブシグナルの周期を適合させることにより、ポリマーサイズあるいは分子量を測定する。言い換えると、サインカーブシグナルから測定される測定角速度（ラジアン／秒）は、自由溶液中のロッド長の３乗に比例して変化する（Boersma, S.（1960）J. Chem. Phys. 32: 1626-1631, 1632-1635）。
計画した一連の実験の条件を定数tとともに以下に示す。
Figure 0004511636
即ち、最初の例においては、5ボルト/cmのパルスを二重、三重あるいはその他の組み合わせで.1ミリ秒間、順次逆方向に印加し、一連の連続的なパルスのそれぞれの最初のものの方向を時計回り方向に10度ずつ開始点から遠ざかるように増加させる。
既知の分子量の分子をゲル中に置き、上記の電場を印加したときのその回転速度を測定する。回転時間のデータを収集し、特定のゲル中におけるGバクテリオファージＤＮＡ分子の分子量と回転時間との間の数学的関係を計算するのに使用する。次に、好ましくは同様の電場を使用して未知のサイズの分子の回転時間を測定し、既知のサイズの分子に基づいて決定した数学的関係を使用してその分子のサイズを計算する。
実施例８
ゲル中でのＤＮＡ分子の曲線長を測定することによる１以上の分子の分子量の測定
既知の分子量の分子について実施例１〜４の手順を行う。分子を可視化することにより、分子が混乱状態にあるときの分子の曲線長の測定値を収集し、分子量と長さとの間の数学的関係を計算するのに使用する。次に実施例１〜４の手順を使用して同様な組成で未知のサイズの混乱した分子の曲線長を測定し、既知のサイズの分子に基づいて決定した数学的関係を使用してその分子のサイズを計算する。図4及び5は、曲線長測定が可能な混乱状態の分子を示す。
実施例９
ゲル中でのＤＮＡ分子の直径を測定することによる１以上の分子の分子量の測定
分子が完全に緩和状態にあるときに測定を行う以外は、実施例１〜４の手順を既知の分子量の分子について行う。実質的に球形あるいは楕円体形のGバクテリオファージＤＮＡ分子の一つまたは複数の直径の測定値を収集し、ゲル中のGバクテリオファージＤＮＡ分子の分子量と直径との間の数学的関係を計算するのに使用する。次に未知のサイズの分子の直径を測定し、既知のサイズの分子に基づいて決定した数学的関係を使用してその分子のサイズを計算する。図4（a）及び5（j）は、直径測定が可能な緩和状態の分子を示す。
実施例10
イメージング用の大型ＤＮＡ分子の製造
挿入法及びパルス電気泳動を用いてSaccharomyces cerevisiaeからの染色体ＤＮＡ分子を調製し、単離した。低ゲル化温度アガロースゲル（FMC Corp. Rockland Maine）を調製に使用して比較的低温での溶融を可能とした。UV照射によりＤＮＡ分子が破壊され得るので、ゲルから切り出されるエチジウム染色された隣接する端部断面を目安として所望のバンドをゲルから切り出し、301nmライトボックス装置で写真を取った。その後バンドの重量を測定し、水中の10mMスペルミンの10倍過剰により室温で３時間平衡化した。スペルミンはＤＮＡを縮合するのに非常に低いイオン強度環境を必要とするが、幸いなことに電気泳動に使用した緩衝液は低いイオン強度を有しているので平衡化の段階の必要性が排除される。平衡化されたサンプルを次に74℃のオーブンで２時間溶融し、溶融後DAPI（1μg/ml）及び2-メルカプトエタノール（1%）を加えた。3μlの溶融したアガロース/ＤＮＡ混合物を予め温めた顕微鏡スライドに慎重に塗布し、混合物がゲル化する前にその上にカバースリップを置いた。そしてスライドを、100X Plan Neofluar対物レンズを装着したZeiss Axioplanエピ蛍光顕微鏡を使用して観察したところ、カバースリップサンドイッチの縁を通して、塩の添加により脱縮合され得る、非常に明るい小さな球状物が観察された。
上記のように、スペルミンは低イオン強度の環境において特に有用である。一方、ＤＮＡ分子を高いイオン性の環境下においた場合、同じ種類の縮合効果がアルコールによって得られる。これらの例はいずれも本発明の範囲を限定するものと解してはならない。
実施例11
Schizosaccharomyces pombe染色体ＤＮＡ分子の制限地図作成
約17〜19メガ塩基のゲノムサイズを有し、それが3、6及び8〜10メガ塩基のサイズの３つの染色体に配分されている真菌であるSchizosaccharomyces pombeのＤＮＡを、実施例10の方法により縮合及び崩壊させないことにより顕微鏡観察のために調製する。3〜5μlのアガロース混合物は約0.1ngのＤＮＡ、0.5%のβ-メルカプトエタノール、1μg/mlのDAPI、100μg/mlのウシ血清アルブミン（アセチル化物、Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD）及び10〜20ユニットの適当な制限酵素を含むものとする。この混合物を短時間37℃に維持し、顕微鏡スライド上に慎重に置き、そしてその上にカバースリップを置く。制限酵素による消化の前に、（1）液体スライド/アガロース/カバースリップのサンドイッチを、カバースリップを動かすことにより任意に少し剪断するか、あるいは（2）例えば図3に記載したPOE装置を使用して電場を印加することの２種類の方法のいずれかによりＤＮＡを伸長させる。そしてゲルが硬化したら、10mM塩化マグネシウム溶液をサンドイッチ中に拡散させる。マグネシウムイオンがＤＮＡ/酵素複合体に到達すると、酵素によりＤＮＡが切断される。
制限切断部位の位置は、顕微鏡装置を使用し切断部位を同定することをＤＮＡストランドの一端から他端まで行うことにより決定する。これらの部位はストランド中のギャップとして現れ、これは酵素消化の前には連続している。そして、（1）各断片の曲線長を測定すること、（2）断片を緩和させその直径を測定すること、（3）電場あるいは流れ場（ゲルを通して溶媒を動かすことにより発生する）を印加することにより各断片のコンホメーションを混乱させ、コンホメーション及び位置の変化の直接目視による検出か、分光分析と組み合わせた顕微鏡観察により緩和動力学を測定することを含む本発明の顕微鏡的方法により各断片のサイズを測定する。もっと大型の分子については直接の目視による観察が好ましく、イメージングするには小さすぎる断片については十分適したその他の方法がある。
得られたサンプルを蛍光顕微鏡を使用して観察すると、3つの異なるサイズの明るい球状体が多数観察され、球の体積についての公式、4/3R3に基づくと、それらの直径はM.33に比例して変化する。ゲルはマグネシウムイオンが存在するときにのみ活性な制限酵素も含む。
実施例12
単一のＤＮＡ分子に対する核酸プローブのin situハイブリダイゼーョン
上記実施例１〜４に記載したようにして顕微鏡観察用に核酸を調製する。核酸分子を含むアガロース媒体は、標識されたプローブ、及びプローブにより標的分子のストランド置換を媒介する組換え酵素、recAも含む。ストランド置換及び対形成はD-ルーピングにより起こる（Radding, C. Ann. Rev. Genet. 16:405-37（1982）参照）。ATP及びマグネシウムイオンを付加すると反応が開始される。これらの成分は、実施例11に記載したようにスライド/ゲル/カバースリップのサンドイッチ中に拡散される。反応物を37℃でインキュベートする。異なる標識を有するプローブを使用することにより多数の異なる標的分子が同時に分析される。
これまで具体的に記載したもの以外の本発明の方法の変形は本発明の範囲内にあるものである。例えば、分子のその他のパラメーターを測定することができ、様々な種類の顕微鏡及び分光分析装置を使用することができる。分子回転を起こすパルスルーチンも変化させることができる。上記した方法を組み合わせることも考えられる。例えば、様々な種類の外部力、媒体及び分光分析方法の組み合わせも本発明の範囲内にあるものである。さらに、測定方法は複数回反復することができ、各試行の測定値を平均してもよい。
実施例13
光学的マッピングにより構築されたSaccharomyces Cerevisiae染色体の順序付けられた制限地図
光学的マッピング（例えば図6に示したような）により、制限酵素消化の間に染色された単一の、タンパク質を除去されたＤＮＡ分子のイメージが形成され、制限部位の直接の順序付けのマッピングが可能となる。簡単にいうと、流れ場（即ち原則として、あるいはその他の種類の電場）を使用して溶融アガロース中に溶解したＤＮＡ分子を伸長し、ゲル化の間に適当な場所にそれらを固定する。
非限定的な例として、酵母染色体ＤＮＡ（酵母株AB972）を、1.00% Seakem低融点アガロース（FMC）、1/2x TBE（42.5mM Trizma塩基、44.5mMホウ酸、1.25mM EDTA二ナトリウム）を使用してパルス電気泳動により分離した（Schwartzら、Cell 37:67（1984））。切断されたゲルのバンドはTE（10mMトリス-Cl, 1mM EDTA, pH8.0）中で繰り返し平衡化した。次にゲルに埋包された精製染色体を、0.1mg/mlアセチル化ウシ血清アルブミン、1%β-メルカプトエタノール、0.1%トライトンX-100（Boehringer Manheim,メンブラン品質）及び0.2μg/ml 4’,6-ジアミノ-2-フェニルインドールジヒドロクロリド（DAPI）を含む、マグネシウムを含まない制限緩衝液中でゆっくりと振盪しながら4℃で一晩平衡化させた。50〜100μlの体積範囲の平衡化されたサンプルを72℃で5分間溶融し、その後37℃に冷却した。約0.3〜0.5μlの酵素（2〜14ユニット/μl）をスライド上に展開した。酵素反応温度は製造者の推奨のものとした。β-メルカプトエタノールを添加して光分解M. Yanagidaら、Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences, D.L. Taylorら、Eds.（Alan R. Liss, New York, 1986）, pp 321-345を防止し、その消化に対する有害な作用についてはいずれもこの濃度で電気泳動を使用して試験した。7μl量の溶融サンプルを、典型的には、大口径ピペットチップを使用してピペットで（ゆっくりと）18 x 18mmカバーグラス上に取り、迅速にスライド上に置いた。ゲルの時間的調節及び急冷は伸長を制御するのに重要なものである。その後反応チャンバーを無機オイルで密閉して蒸発を防ぎ、少なくとも30分間4℃でアガロースをゲル化させ、その後解放した空間から50mM MgCl2を拡散させた。染色体I（240kb）及びIII（345kb）については、キャストする前にスライドを低温のデシケーター（4℃）中に置き、ゲル化を促進し、分子緩和が不完全となるのを防止した。よりゆっくりと緩和するもっと大型の染色体についてはスライドを室温に維持した。37℃（Csp I、30℃を除く）に温度を制御した顕微鏡ステージ上にスライドを置いた。ゲル化（gelatin）工程により、伸長された分子が酵素切断の間にかなり緩和してランダムコイルコンホメーションになることが抑制される。制限酵素を溶融アガロース-ＤＮＡ混合物に添加し、（顕微鏡のスライド上にマウントされた）ゲル化混合物中にマグネシウムイオンを拡散させることにより切断が開始される。開裂部位を、イメージングされた分子中の成長するギャップとして可視化する。エピ蛍光（UV励起及び青色発光用の487901フィルターパック）及び100Xあるいは63X Plan-Neofluar対物レンズ（Zeiss）を装備し、Hammamatsu C2400 SITカメラに接続したZeiss AxioplanあるいはAxivert 135顕微鏡を使用してＤＮＡ分子をイメージングした。強度範囲のいずれかの末端でデジタイザが飽和することを回避するようにカメラ制御を調節するように注意した。MacintoshをベースとするBiovisionイメージプロセッサあるいはPixelパイプラインデジタイザ（Perceptics Corp.）により、20秒毎に32ビデオフレームを8ビットにデジタル化し、再構成して13ビット精度を得た。コンピュータ制御されたシャッターを使用して照射をイメージあたり1.5秒に制限し、典型的な実験について全体で約135〜255秒とした。中程度の濃度のフィルターを使用して対物レンズで測定して100μW未満に照射強度を維持した。対照の実験により、これらの条件下ではＤＮＡ分子が損傷を受けないことが判った。デジタル化されたイメージを直接ディスクに記録し、テープに保存した。得られた断片について2つの方法によりサイズ測定した。即ち、生成物の相対蛍光強度を測定し、また固定ゲル中での相対見かけＤＮＡ分子長を測定することによりサイズ測定した。その後サイズ測定した断片の順序を単純に記録することにより地図を作成した。筆者らからの申し込みにより利用可能な（E-メールhuff@mcclb0.med.nyu.edu）、Wayne RasbandによるMacintosh用のNIH Imageの改定版を使用して、長さ及び相対蛍光強度を16ビット精度で計算した。簡単にいうと、オリジナルの未処理イメージを拡大フォーマットで表示し、ＤＮＡを手作業でトレースしてオーバーレイイメージを作成した。長さの地図はこのオーバーレイから直接作成した。強度の計算については、13ビットの生データイメージを平滑化（smoothed）し、オーバーレイイメージを5倍に拡張して全てのフォアグラウンドピクセルをカバーした。オーバーレイ上にマークされた各ピクセルについて、距離が離れるほど減少する重みにより重み付けした周囲ピクセルの重み付け平均として合成バックグラウンド値を計算したが、全てのマークしたピクセルについてゼロであった。これらの値は、測定されたものでＤＮＡが存在しないものを近似するものである。特定のＤＮＡ断片の強度は断片の全てのピクセルの合計からマッチングバックグラウンドピクセルを引いたものであった。断片の領域はオリジナルのオーバーレイを2倍に拡張したものであった。この過程を、オーバーレイイメージを有する生データの各フレームについて繰り返し、焦点の明確でないものは除外した。強度についての結果は切断の後に5つのイメージについて平均し、2つの断片の相対的サイズはx/（x+y）及びy/（x+y）として計算した。断片yが後にu及びvに切断される場合は、（y/（x+y））（u（u+v））をuのサイズとして使用する。得られる数値が、以降の分析の目的のための単一のサンプルを構成する。1つのみを使用するのではなくいくつかの分子を平均することにより精度が改善され、不要な分子の排除が可能となる。サンプルを平均し、n-1 d.f.でのt-分布及びサンプル標準偏差を使用して、平均についての90%信頼区間を計算した。データが正規分布からのランダムなサンプルを表しているとすれば、この計算は有効なものであり、90%の確率で母平均が信頼区間内にあるということである。染色体Iについては、短い断片から下限を取り、長い断片から上限を取ることにより報告されている信頼区間が見出された。母標準偏差についての90%信頼区間はサンプル標準偏差、サンプル数、及びn-1 d.f.でのカイ自乗分布を使用して計算した。この区間の中心点を使用して母標準偏差を推定した。変動係数（CV）は、推定母標準偏差をサンプル平均で除したものである。プールされた標準偏差は分散の平均の平方根である。相対誤差はここで得られた値と報告された値との間の差異を報告された値で除したでものである。リアルタイムの制限断片順序化を高速の正確なサイズ測定技術と組み合わせたことにより、光学的地図作成は非常に高速なものとなる。光学的マッピングは、分析的電気泳動、クローン化ライブラリー、プローブ、あるいはPCRプライマーを必要とすることがない、真核生物染色体あるいはYACの順序付けられた制限地図を迅速に作成するための新しい強力な技術である。有利な技術的改善により、迅速で高解像度の哺乳動物染色体のマッピング及びYACの順序決定が可能となる。
ゲル固定及び張力下及び切断におけるＤＮＡ緩和の力学: 200μm長（600kb）の単一の大型ＤＮＡ分子は溶液中でランダムコイルであり、緩くまとまった平均直径8μmの球状体として可視化することができる（Robert, T.M. ら、1975, CRC Crit. Rev. Biochem. 3:349）。光学的マッピングは、そのようなＤＮＡ分子を伸ばし、それを所定の位置に固定して急速な緩和を阻害することにより開始され、その後光学的顕微鏡によりイメージングを行う。固定された分子は、イメージングを成功させるためには浅い焦点範囲の平面内になければならない。ゲル中で伸長された分子は伸ばされたバネのような挙動を示し（Schwartz, D.C. & Koval, M., 1989, Nature 338 520-522）、固定された分子は張力下にあり、ランダムコンホメーションへのコイル緩和の間に解放される。しかし、過度の固定は光学的マッピングに望ましくなく、これは制限切断部位が、検出され成長するギャップとしてイメージングされるように緩和しなければならないからである。
アガロースゲル中に埋包されたＤＮＡ分子は、電気泳動の間において、互いに張力下にあるコイルセグメントの一連の連結したプールとして以前にZimmによりモデル化されており（Zimm, B.H., 1991, J. Chem. Phys. 94:2187-2206）、プールの間のシャトルコイルセグメントの自由エネルギー変化と関連する力（fi）は、
fi=3kT/（2nib）（（a2/nib2）-1）+（kT/b）InC
（ここでkはボルツマン定数であり、aはゲル細孔直径であり、niは関連するコイルセグメントの数であり、bはコイルセグメント長であり、Tは温度であり、Cはコイルセグメント構造に関連する定数である）で与えられると計算されている。この結果は、プールの間に発生する張力は孔容量内に含まれるセグメントの数に逆比例することを示している（Eq.1）。従って、伸ばされて伸長した分子は、コンパクトな緩和したものよりもより高い張力下にある。
大きいＤＮＡ分子は、電場を印加することなく、流動力により溶融アガロース中で伸ばすことができ、その後アガロースのゲル化により所定の位置に迅速に固定することができる。酵母染色体ＤＮＡ（酵母株AB972）を1.00% Seakem低融点アガロース（FMC）、1/2x TBE（42.5mM Trizma塩基、44.5mMホウ酸、1.25mM EDTA二ナトリウム）を使用してパルス電気泳動により分離した（D.C. Schwartz及びC.R. Cantor, Cell 37,67（1984））。切断されたゲルのバンドはTE（10mMトリス-Cl, 1mM EDTA, pH8.0）中で繰り返し平衡化した。次にゲルに埋包された精製染色体を、0.1mg/mlアセチル化ウシ血清アルブミン、1%β-メルカプトエタノール、0.1%トライトンX-100（Boehringer Manheim,メンブラン品質）及び0.2μg/ml 4’,6-ジアミノ-2-フェニルインドールジヒドロクロリド（DAPI）を含む、マグネシウムを含まない制限緩衝液中でゆっくりと振盪しながら4℃で一晩平衡化させた。50〜100μlの体積範囲の平衡化されたサンプルを72℃で5分間溶融し、その後37℃に冷却した。約0.3〜0.5μlの酵素（2〜14ユニット/μl）をスライド上に展開した。酵素反応温度は製造者の推奨のものとした。β-メルカプトエタノールを添加して光分解M. Yanagidaら、Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences, D.L. Taylorら、Eds.（Alan R. Liss, New York, 1986）, pp 321-345を防止し、その消化に対する有害な作用についてはいずれもこの濃度で電気泳動を使用して試験した。7μl量の溶融サンプルを、典型的には、大口径ピペットチップを使用してピペットで（ゆっくりと）18 x 18mmカバーグラス上に取り、迅速にスライド上に置いた。ゲルの時間的調節及び急冷は制御された伸長に重要なものである。その後反応チャンバーを無機オイルで密閉して蒸発を防ぎ、少なくとも30分間4℃でアガロースをゲル化させ、その後解放した空間から50mM MgCl2を拡散させた。染色体I（240kb）及びIII（345kb）については、キャストする前にスライドを低温のデシケーター（4℃）中に置き、ゲル化を促進し、分子緩和が不完全となるのを防止した。よりゆっくりと緩和するもっと大型の染色体についてはスライドを室温に維持した。37℃（CspI、30℃を除く）に温度を制御した顕微鏡ステージ上にスライドを置いた。実験上、ゲル化の動力学は温度、及びアニーリング条件を最適化することにより制御した。この分析のためには、ＤＮＡコイルは重要な状態に伸長されなければならず、過度であると分子はイメージングするのが困難になり、過少であると切断部位を明らかにするには張力が不足する。酵母染色体ＤＮＡ（酵母株AB972）を、1.00% Seakem低融点アガロース（FMC）、1/2x TBE（42.5mM Trizma塩基、44.5mMホウ酸、1.25mM EDTA二ナトリウム）を使用してパルス電気泳動により分離した（D.C. Schwartz及びC.R. Cantor, Cell 37,67（1984））。切断されたゲルのバンドはTE（10mMトリス-Cl, 1mM EDTA, pH8.0）中で繰り返し平衡化した。次にゲルに埋包された精製染色体を、0.1mg/mlアセチル化ウシ血清アルブミン、1%β-メルカプトエタノール、0.1%トライトンX-100（Boehringer Manheim,メンブラン品質）及び0.2μg/ml 4’,6-ジアミノ-2-フェニルインドールジヒドロクロリド（DAPI）を含む、マグネシウムを含まない制限緩衝液中でゆっくりと振盪しながら4℃で一晩平衡化させた。50〜100μlの体積範囲の平衡化されたサンプルを72℃で5分間溶融し、その後37℃に冷却した。約0.3〜0.5μlの酵素（2〜14ユニット/μl）をスライド上に展開した。酵素反応温度は製造者の推奨のものとした。β-メルカプトエタノールを添加して光分解M. Yanagidaら、Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences, D.L. Taylorら、Eds.（Alan R. Liss, New York, 1986）, pp 321-345を防止し、その消化に対する有害な作用についてはいずれもこの濃度で電気泳動を使用して試験した。7μl量の溶融サンプルを、典型的には、大口径ピペットチップを使用してピペットで（ゆっくりと）18 x 18mmカバーグラス上に取り、迅速にスライド上に置いた。ゲルの時間的調節及び急冷は伸長を制御するのに重要なものである。その後反応チャンバーを無機オイルで密閉して蒸発を防ぎ、少なくとも30分間4℃でアガロースをゲル化させ、その後解放した空間から50mM MgCl2を拡散させた。染色体I（240kb）及びIII（345kb）については、キャストする前にスライドを低温のデシケーター（4℃）中に置き、ゲル化を促進し、分子緩和が不完全となるのを防止した。よりゆっくりと緩和するもっと大型の染色体についてはスライドを室温に維持した。37℃（CspI、30℃を除く）に温度を制御した顕微鏡ステージ上にスライドを置いた。過度に伸長された分子が示すイメージングピクセルあたりの蛍光色素は少なすぎ、測定される分子強度はバックグラウンドの値に近くなってしまう。さらに固定プロセスは、いくらかのコイルの滑りを可能として切断部位を明らかにするのに十分穏やかなものでなければならない。これらの事項及びその他の事項を考慮して、本発明の固定条件は、分子の曲線の輪郭の長の約20%にわたる分子を生成するように最適化した。
どのようにしてＤＮＡ分子がアガロースゲル化に捕獲されるのかは判っていない。イメージングされ、伸長された分子はその末端におけるコイルの明るく丸いプールを示し、これは鎖緩和の証拠である（図8及び9）。プールのサイズは1〜3μmの範囲にある。セグメントプールは内部的に形成され、その後消失することも観察され、その間コイル張力の局所的ポケットは互いに平衡化する。ＤＮＡ分子が及ぶ一連の連続的なゲルの細孔内でＤＮＡ分子が緩和するに従って、セグメントの密度が増加し、セグメントが周りの細孔スペース中に漏れることさえ観察される。緩和のメカニズムの詳細は複雑なものである（de Gennesら、Scaling Concepts in Polymer Physics, Cornell University Press, 1979）。伸長されたポリマーの配列エントロピーは緩和状態のものよりも低いことから分子は有効な張力を受けるので、ギャップが出現する。単なる説明的なレベルとしては、この過程は、側面に穴を有するきっちりとしたチューブ中に収納された伸長されている厚いゴムバンドの緩和を観察することに例えることができる。切断により分子中に新たな末端が生成することにより、またおそらくは捕獲された断片を局所的なエネルギー最小値から解放するような機械的混乱状態を起こすことにより、切断が緩和を促進する。
高い数値の口径の顕微鏡対物レンズによれば、染色されたＤＮＡ分子の明るく高いコントラストのイメージを形成することができるが、焦点の深さが非常に浅くなる。実験上では、焦点範囲内にあるべき長い分子については、それを約0.2μmの厚さの平面内に置かなければならない。本発明のゲル固定方法によれば、光学的に測定してこの0.2ミクロンの公差内にある分子を再現性をもって可視化することが可能である。この特筆すべき光学的平坦性の程度は、ゲル化の前にガラス表面間で生成される層流の放物線状の流体流パターンにより得られる。さらに、溶解されたアガロース及びＤＮＡ分子は、層流の流れを促進する一方、乱流の発生を防止することによりこの効果を増強する。
最後に、大型ＤＮＡ分子のゲル固定化は、別の系に広く適用するのに十分に便利なものであり、特に生化学的反応を可視化イベントと組み合わせることができる場合に好適である。
単一の分子の制限消化。光学的マッピングによれば、制限酵素切断部位は、断片がよりランダムなコンホメーションに緩和する間に、固定された分子中に現れるギャップとして検出される（図13、15）。異なる制限酵素による酵素的切断の速度は変化するので（Wellsら、Genetics 127,681, 1981）、時間的調製を注意深く行うことが重要である。切断は分子の固定が完了して始めて起こらなければならず、これは反応が不完全だと断片を同期させよう（phase）とする試みが妨害されてしまうからである。この時間的調節の問題は、アガロース/ＤＮＡ溶液に制限酵素を37℃で予め混合し、ゲルを破壊することなくマグネシウムイオンを視野内に拡散させて反応を開始することにより解決される。酵母染色体ＤＮＡ（酵母株AB972）を、1.00% Seakem低融点アガロース（FMC）、1/2x TBE（42.5mM Trizma塩基、44.5mMホウ酸、1.25mM EDTA二ナトリウム）を使用してパルス電気泳動により分離した（D.C. Schwartz及びC.R. Cantor、Cell 37,67（1984））。切断されたゲルのバンドはTE（10mMトリス-Cl, 1mM EDTA, pH8.0）中で繰り返し平衡化した。次にゲルに埋包された精製染色体を、0.1mg/mlアセチル化ウシ血清アルブミン、1%β-メルカプトエタノール、0.1%トライトンX-100（Boehringer Manheim,メンブラン品質）及び0.2μg/ml 4’,6-ジアミノ-2-フェニルインドールジハイドロクロリド（DAPI）を含む、マグネシウムを含まない制限緩衝液中でゆっくりと振盪しながら4℃で一晩平衡化させた。50〜100μlの体積範囲の平衡化されたサンプルを72℃で5分間溶融し、その後37℃に冷却した。約0.3〜0.5μlの酵素（2〜14ユニット/μl）をスライド上に展開した。酵素反応温度は製造者の推奨のものとした。β-メルカプトエタノールを添加して光分解M. Yanagidaら、Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences, D.L. Taylorら、Eds.（Alan R. Liss, New York, 1986）, pp 321-345を防止し、その消化に対する有害な作用についてはいずれもこの濃度で電気泳動を使用して試験した。7μl量の溶融サンプルを、典型的には、大口径ピペットチップを使用してピペットで（ゆっくりと）18 x 18mmカバーグラス上に取り、迅速にスライド上に置いた。ゲルの時間的調節及び急冷は伸長を制御するのに重要なものである。その後反応チャンバーを無機オイルで密閉して蒸発を防ぎ、少なくとも30分間4℃でアガロースをゲル化させ、その後解放した空間から50mM MgCl2を拡散させた。染色体I（240kb）及びIII（345kb）については、キャストする前にスライドを低温のデシケーター（4℃）中に置き、ゲル化を促進して分子緩和が不完全となるのを防止した。よりゆっくりと緩和するもっと大型の染色体についてはスライドを室温に維持した。37℃（Csp I、30℃を除く）に温度を制御した顕微鏡ステージ上にスライドを置いた。ギャップの他に、切断は切断部位において断片の末端のＤＮＡの明るい濃縮されたプールあるいは「球状体」が出現することによっても示される。これらの球状体は切断の少し後に形成され、末端において顕著なコイル緩和により生成するものである（図13、15）。このセグメントのプール化は、ギャップとして現れ得る焦点が合っていないセグメントを実際の切断から区別するのに役立つので、地図作成に有用である。成長するギャップの出現及び切断部位におけるセグメントの拡大する明るいプールの出現の両方により、より高い信頼度で切断をカウントすることができる。
地図構築−断片数決定。主として電気泳動により得られたデータから大規模な制限地図を構築した。顕微鏡ベースの技術を用いて、単一のＤＮＡ分子からなり得るサンプルについて断片のサイズを決定し順序を決定するために一連の新しい方法を開発した。最初の工程は分子内の切断部位の数を決定することである。分子内の切断部位はMg2+の添加後、不規則な回数で現れる傾向がある。全てのあり得る切断部位は同時には現れず、切断は通常、ここで記載する条件下で互いに5分以内に現れる。消化の程度は、断片数及びサイズの両者を含む複数の要因に依存する。Not I消化酵母染色体の選択されたセットについての光学的マッピングにより得られた消化の結果を図7に示す。幸いにも全てのS. cerevisiae染色体について刊行されたNot I制限酵素地図が利用でき（Link, A.J., 1991, Genetics 127, 681-698）、光学的マッピング法の信頼できるベンチマーキングを可能としている。
典型的なマウントされたサンプルは単一の視野内に約３〜５の分子を含み、全体でそれらの約50〜95%はここで記載する基準による1以上の切断の証拠を示す。図7のヒストグラムは、刊行されている結果を越える切断部位の総数はかなり低いことを示している。Not Iにより消化された染色体Vについての切断頻度の結果（図7B）は、完全に切断された分子の数は一箇所で切断された全ての断片の数の約半分であり、完全な消化に対応する値は、マウントされたサンプル中において同一のサイズとされる染色体V及びVIIIＤＮＡ分子の等しい分布が存在するものと推定することにより計算する。これらの染色体についてのNot I制限地図は、染色体Vが3の切断部位を有しているのに対し、VIIIは２つしか有していないことを示している。染色体XIの切断頻度データ（図7C）は前記の染色体の場合とは異なり、全ての切断分子の25%が完全に消化されていることが判る（2つの切断部位）。この見かけ上低い頻度に対する説明としては、この染色体が30kbのサイズのNot I断片を生成し、これはより大きい断片よりも光学的に検出することが難しいということである。切断を横切る張力がおそらく断片のサイズに依存しており、より小さい伸長した断片はより少ない張力を与えることを考慮すると、上記の結果は驚くべきことではない。さらに、切断部位を横切るコイル張力がその同定に必要なので、さらに切断が起こると、最終的に緩和する断片が生成されて全体の分子張力が減少し、さらに切断を観察することが妨げられる。最後に、非常に大きい1メガ塩基のサイズの分子、例えば染色体XIII及びXVIを展開したが、これらのデータ（図7D）は、分子の約半分がマウント内で完全に（1つの切断）切断され、観察可能な切断活性を有していたことを示している。
ヒストグラム分析により測定された切断の最大数は、切断部位の最大数を含むビンであり、その分子はサイズについての強度及び長さの測定により適当に平均できるものである。
コイル緩和の切断検出に対する影響。小さい断片に関する場合を別として、図7の全てのヒストグラムにおいて不完全な消化が見られる。あり得る原因としては、光照射によるアーチファクトから、顕微鏡チャンバーの現行の設計により与えられる相互作用まで挙げるられるが、ここで観察される部分的消化は殆どがギャップあるいははっきりとした球状体を形成できない緩和形態を原因とする所与の切断部位における不完全なコイル緩和に起因するものとすることができる。実際の現場においては種々の異なる緩和形態が観察されるが、そのいくつかを図8に示す。緩和形態は切断検出の促進（8D）及び妨害（8H）の両方に作用し得る。電場あるいは流れ場の印加をそのような部位における緩和を開始させるのに使用でき、その検出を可能とする。並行した電気泳動実験により、同様な実験条件下で本質的に完全な消化が示される。
興味深いことには、染色体Iについてのデータは殆ど完全な消化を示している（95%、図7A参照）。消化における染色体Iのイメージ（図13A）は、図8B、8C及び8Dにおいて解釈されるように、予想される単一の切断が観察された後、切断部位末端のみが緩和し、セグメントの明るいプールが末端に蓄積する（20分子）が、残りの末端は所定の場所に固定されるようである。上記したように、緩和したコイルセグメントの明るいプールがゲル固定ＤＮＡ分子の末端に蓄積する。
考えられるところでは、アガロース中に埋包された染色体Iの末端がある種の分子リベットのように挙動し（図9）、それと介在する分子セグメントとの間に発生した張力に作用し、切断検出にとって理想的な機械的条件を与えるものである。短期的な相互作用が優勢となり、伸長された分子の末端に存在する緩和されたコイルの量はサイズの何らかの閾値を上回る分子質量とともには大きく変化しない可能性が高い。従って、比較的短い分子、例えば染色体Iは、より長いもの、例えば染色体XIII及びXVIよりも大きい割合の緩和されたコイルセグメントをその末端において含むことになる。
相対強度による断片のサイジング。二番目の工程は得られた制限断片のサイズを決定することである。この目的のため、二つの相補的な方法を使用することができ、一つは相対的断片蛍光強度に基づくものであり、第二のものは見かけ相対長測定に基づくものである。しかしいずれの方法も絶対的な値を与えるものではない。但しそれぞれ容易に標準化することができる。幸いなことに、上記したゲル固定法は、強度測定のための天然の基質を生成することができ、これは分子全体を焦点内に置くことができることによる。ゲル固定化により250μmにわたる分子を平坦化することができる。焦点範囲外にある分子のセグメントは強度測定に使用することができず、これはそれらの強度がいかなる単純な様式においても質量に比例しないからである。ここでの関連する観察としては、伸長された分子が実質的に緩和したとき、予測されるようにその質量の殆どは焦点範囲外に移動する。これは、流体中の完全に緩和した700kbＤＮＡ分子の流体力学上の直径が8μmであるのに対し、顕微鏡下で分子をイメージングするのに使用される焦点の深さは約0.2μmであるからである。
顕微鏡におけるＤＮＡ断片の絶対蛍光強度は、多くの可変量、例えばカメラゲインコントロール、ランプ輝度等により決まり、従って測定するのに望ましい量ではない。（同じ親分子からの）2つの断片の相対強度を計算することにより断片の一つを他方に対する内部強度対照とすることができる。既知のあるいは独立して測定された染色体サイズを乗じることにより相対強度をkbに変換する。筆者からの申し込みにより使用可能な（E-メールhuff@mcclb0.med.nyu.edu）、Wayne RasbandによるMacintosh用のNIH Imageの改定版を使用して、長さ及び相対蛍光強度を16ビット精度で計算した。簡単にいうと、オリジナルの未処理イメージを拡大フォーマットで表示し、ＤＮＡを手作業でトレースしてオーバーレイイメージを作成した。長さの地図はこのオーバーレイから直接作成した。強度の計算については、13ビットの生データイメージを平滑化し、オーバーレイイメージを5倍に拡張して全てのフォアグラウンドピクセルをカバーした。オーバーレイ上にマークされた各ピクセルについて、距離が離れるほど減少する重みにより重み付けした周囲ピクセルの重み付け平均として合成バックグラウンド値を計算したが、全てのマークしたピクセルについてゼロであった。これらの値は、測定されたものでＤＮＡが存在しないものを近似するものである。特定のＤＮＡ断片の強度は断片の全てのピクセルの合計からマッチングバックグラウンドピクセルを引いたものであった。断片の領域はオリジナルのオーバーレイを2倍に拡張したものであった。このプロセスを、オーバーレイイメージを有する生データの各フレームについて繰り返し、焦点の明確でないものは除外した。強度についての結果は切断の後の5つのイメージについて平均し、2つの断片の相対的サイズはx/（x+y）及びy/（x+y）として計算した。断片yが後にu及びvに切断される場合は、（y/（x+y））（u（u+v））をuのサイズとして使用する。得られる数値が、以降の分析の目的のための単一のサンプルを構成する。光学的輪郭線最大化法を使用して少数の分子を含むサンプルのサイズを測定することができる（Guo, Nature 359, 783, 1992）。図10Aは、光学的に測定し、電気泳動に基づいた測定から得た刊行物に記載されている値（Link, Genetics, 127, 681, 1991）に対してプロットした、一連の酵母染色体のNot I制限断片についての強度値を示す。斜方向の線に近い点は良好な一致を示すものである。低精度（8ビット）強度データに基づいた染色体V及びVIIIの結果にもかかわらず、そして60kb未満の2つの短い断片にもかかわらず、プールされた標準偏差は36kbであり（図10A、挿入図）、変動係数の平均は16%で、通常のパルス電気泳動サイズ測定に匹敵するものである。刊行物に記載された結果との相関関係は優れたものである。相対誤差の平均は5%であり、刊行物に記載された誤差平均は4%である（Link, Genetics, 127, 681, 1991）。サンプルを平均し、n-1 d.f.でのt-分布及びサンプル標準偏差を使用して、平均についての90%信頼区間を計算した。データが正規分布からのランダムなサンプルを表しているとすれば、この計算は有効なものであり、90%の確率で母平均が信頼区間内にあるということである。染色体Iについては、短い断片から下限を取り、長い断片から上限を取ることにより報告されている信頼区間が見出された。母標準偏差についての90%信頼区間（図10の挿入図）は、サンプル標準偏差、サンプル数、及びn-1 d.f.でのカイ自乗分布を使用して計算した。この区間の中心点を使用して母標準偏差を推定した。変動係数（CV）は、推定母標準偏差をサンプル平均で除したものである。プールされた標準偏差は分散の平均の平方根である。相対誤差は我々の値と報告された値との間の差異を報告された値で除したものである。一つの理由として強度正規化手順のために、非常に小さい断片については精度はより低くなり、30及び55kb測定についてはサイズはあまり一致しない。これらの断片の蛍光強度測定でのサイズ測定によれば、以下に記載するように確定されている値のほぼ２倍である。これらの測定のバックグラウンドを補正するためのアルゴリズム及びデータ収集方法を変更することにより精度は有意に改善される。
相対蛍光強度測定の有効性の一つの試験は、分子緩和条件の使用可能な範囲にわたって断片強度の定常性を監視することである。この要件は、制限断片がサイズにおいて大きく異なる場合に最も重要なものとして試験される。図11は、3種の典型的なサイズについての絶対強度と分子長の測定の結果を示す。これらの結果は、測定された分子長が3〜4倍変化するのにもかかわらず、広いサイズ範囲にわたって強度が比較的一定のままであることを示している。この有利な効果は、部分的には、穏やかな固定条件に起因するものであり、それによりブラウン運動が伸長したコイルをz軸に沿って震えさせることができることによるもので、この運動は消化が進行する間、ライブビデオモニターではっきりと観察される。1秒の間隔にわたってフレームを平均することにより、殆どのＤＮＡはそれが運動する間に、焦点平面を通してゲル細孔内で観察される。
相対見かけ長さによる断片のサイジング
見かけ長さの測定の物理的な基礎は単純である。すなわち、ゲルに包埋された制限断片のそれぞれが、平均して等しいコイル密度を有していると仮定する。すなわち、各断片は、多少なりとも伸張されるべき同一の変化を有していて、何枚かのマウントで生じる長さの平均が、相対サイズの良好な指標となるというものである。この場合も、相対見かけ長さは、染色体のサイズを乗じることによってkbに換算される。長さならびに相対蛍光強度は、ウェイン・ラスバンド（Wayne Rasband）のＮＩＨイメージ・フォー・マッキントッシュ（NIH Image for Macintosh）（作者（電子メールhuff@mcclb0.med.nyu.edu）に依頼することにより入手可能）の改良版を使用して、１６ビットの精度となるよう計算した。略述すると、もともとの未処理イメージを拡大フォーマットで表示させ、ＤＮＡを手作業でトレースして、オーバーレイイメージを作成した。長さマップは、このオーバーレイから直接作成した。強度の計算にあたっては、１３ビットの生データイメージを平滑化し、オーバーレイイメージを５倍に広げて、すべてのフォアグラウンド画素をカバーした。オーバーレイ上にマークした各画素について、合成バックグラウンド値を、周囲画素の重みづけ平均として計算した。その際の重みは、距離とともに低減するものとしたが、マークされた各画素については、いずれもゼロとした。これらの値は、ＤＮＡが不在であったとしたら測定されたであろう値を近似すること意図したものである。特定のＤＮＡ断片の強度は、断片の全画素の総和から、対応するバックグラウンド画素の分を差し引いたものとした。断片の面積は、もとのオーバーレイを２倍に拡大したものであった。このプロセスを、オーバーレイイメージを有していた生データの各フレームに関して繰り返した（焦点ぼけしたフレームを除く）。強度の結果は、切断後の５イメージに関して平均し、２断片の相対サイズは、ｘ／（ｘ＋ｙ）ならびにｙ／（ｘ＋ｙ）として計算した。断片ｙが、その後切断されてｕおよびｖとなった場合には、（ｙ／（ｘ＋ｙ））（ｕ／（ｕ＋ｖ））をｕのサイズとして使用する。得られた数が、その後の分析に際しての１サンプルとなる。次に、制限断片の見かけ長さを換算したところ、４分子という少ない分子数でも良好な精度が得られた。サンプルを平均し、平均についての９０％信頼区間を、ｔ分布とn-1 d.f.、ならびにサンプルの標準偏差を使用することによって計算した。この計算は、データが、正規分布しているランダムなサンプルについてのものである場合には、有効であり、この信頼区間に集団の平均が存在する可能性が９０％ある。染色体Ｉについては、報告する信頼区間は、短い断片から下限を、長い断片から上限を選ぶことによって計算した。集団の標準偏差についての９０％信頼区間（図１０の挿入グラフ）は、サンプルの標準偏差、サンプル数、ならびにカイ二乗分布とn-1 d.f.を使用して計算した。この区間の中央点を使用して、集団の標準偏差を推定した。変異係数（ＣＶ）は、推定集団標準偏差を、サンプルの平均で除したものである。プール標準偏差は、分散の平均の平方根である。相対誤差は、我々の値と報告値の差を報告値で除したものである。見かけ長さの相対的測定値は、蛍光強度の測定の場合と同様、制限断片の同じセットに対して検証した。それらの結果（図１０Ｂ）から、１６％（３０kbならびに９０kbの断片を除く）という同様の平均相対誤差が示される。プール標準偏差は４７kbで（図１０Ｂの挿入図）、変異係数の平均は２９％であった。
見かけ分子長の測定は、強度の測定より簡単であるが、精度は劣り、その結果、さらなる測定を行って、同等の精度を確保する必要が生じる。しかし、わずかに焦点のぼけた断片を使用すると、長さの測定をうまく行うことも可能であり、そのかわり、ぼやけた、焦点ぼけしたイメージでは、強度ベースの測定がうまくいかない。小型の断片の場合、長さによるサイズ測定の方が、強度によるサイズ測定よりうまくいった。３０kbの断片は、長さによる場合には４４kb、強度による場合には７０kbのサイズとして測定され、５５kbの断片は、長さによる場合では４９kb、強度による場合では８８kbのサイズとして測定された。光学的測定の場合にサンプル数が必然的に少なくなることを考えると、２通りのサイズ測定法で結果を相互チェックできることは、マップを成功裏に作成するうえで極めて重要である。
長さならびに強度の測定値にもとづいたマップの構築
図１２には、光学的マッピングで作成した３種の整列させた制限マップを比較して示す（Link, Genetics 127, 681, 1991）。図示したバーは、図１０にプロットしたNotI制限断片のサイジング分析の結果と対応する。図１３には、NotIで消化した各種の酵母染色体ＤＮＡ分子の蛍光顕微鏡写真を処理したものをいくつか示す。酵母染色体ＤＮＡ（酵母株ＡＢ９７２）を、パルス電気泳動（D.C. SchwartzおよびC.R. Cantor, Cell 37: 67（1984））で、１．００％シーケム（Seakem）低融点アガロース（ＦＭＣ）、１／２ｘＴＢＥ（４２．５mMトリズマ塩基、４４．５mMホウ酸、１．２５mMＥＤＴＡ二ナトリウム）を使用して分析した。切り出したゲルのバンドを、ＴＥ（１０mM Tris-Cl、１mM EDTA、pH8.0）中で、繰り返し平衡化した。次に、ゲルに包埋された精製染色体を、０．１mg/mlアセチル化ウシ血清アルブミン、１％β−メルカプトエタノール、０．１％Triton X-100（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Manheim）、メンブレーン等級）、および０．２μg／ml ４’，６’−ジアミノ−２フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）を含有するマグネシウム非含有制限バッファー中で、ゆるやかにかきまぜながら、４℃にて一晩平衡化した。５０〜１００μlの範囲の平衡化したサンプルを、７２℃で５分間にわたって溶融し、３７℃に冷却した。約０．３−０．５μlの酵素（２〜１４単位／μl）をスライドガラスに塗布した。酵素反応は、製造業者の推奨する温度で行った。β−メルカプトエタノールを加えて光分解を抑制し（M.Yanagidaら、Applications of Fluorescence、D.L. Taylorら編のthe Biomedical Sciencesに所収、Alan R. Liss、New York、1986、pp. 321-345）、この濃度で、消化に悪影響が及ぶことがないかどうかを、電気泳動で調べた。７μlの溶融サンプルを、典型的には、大口径のピペットチップを使用して、１８ｘ１８mmのカバーガラス上に（ゆっくりと）ピペット滴下し、すばやくスライドガラスに載せた。伸張度を制御するうえで、タイミングをあわせることとゲルを急冷することが重要である。次に、反応チャンバーを鉱油で密封して蒸発を防止し、アガロースを４℃で３０分以上にわたってゲル化させてから、５０mM MgCl2を空隙から拡散させた。染色体Ｉ（２４０kb）ならびに染色体ＩＩＩ（３４５kb）については、ゲル化の進行を速めて未熟分子の弛緩を防止する目的で、スライドガラスを冷えたデシケータ（４℃）に入れておいてから流延した。弛緩の進行が遅い大型の染色体については、スライドガラスを室温に保った。スライドガラスを、温度を３７℃（CspIは３０℃）に制御した顕微鏡のステージに置いた。これらの画像では、固定した分子中に空隙が現れ、その空隙が大きくなっていくことによって、消化の進行がはっきりと示された。こうしたデータ断片から、２０秒ごとに得られた時間経過イメージを検討することによってオーダーを判定した。ＤＮＡ分子のイメージングには、落射蛍光装置（紫外線励起ならびに青色放射用の４８７９０１フィルターパック）ならびに１００倍あるいは６３倍のプラン−ネオフルアー（Plan-Neofluar）対物レンズ（ツァイス（Zeiss））を備え、ハママツ（Hamamatsu）Ｃ２４００ＳＩＴカメラと組み合わせたツァイスのアクシオプラン（Axioplan）あるいはアクシオバート（Axiovert）１３５顕微鏡を使用した。カメラの制御装置を調整する際には、強度範囲の両端でデジタイザーが飽和することのないよう注意した。２０秒ごとに３２のビデオフレームを８ビットにデジタル化して、マッキントッシュベースのバイオビジョンイメージ処理装置あるいは画素パイプラインデジタイザー（パーセプティクス社（Perceptips Corp.））によって１３ビットの精度とした。コンピュータ制御のシャッターを使用して、１イメージあたりの照明を１．５秒に制限して、代表的な実験については、合計で約１３５〜２５５秒となるようにした。ニュートラルデンシティーフィルターを使用して、対物レンズで測定される照明強度を１００μＷ以下に保持した。対照実験では、こうした条件で、ＤＮＡ分子に損傷が生じることはなかった。デジタル化した画像は、ディスクに直接記録し、テープに長期保存用に保管した。観察対象の分子は動く傾向があり、他の分子とのとりちがえが生じることもあるので、「切断配列」あるいは「切断動画」を観察することで、分子同士の相互作用の解析が簡素化される。光学的性質（長さあるいは強度）に基づいたマップと、電気泳動に基づいたマップとは、よく一致している。制限マップの３つめのタイプ（「Com」、図７）は、長さから誘導したデータと強度から誘導したデータとを組み合わせることによって得たものであり、小型の制限断片（＜６０kb）由来のデータは、長さによってサイズを測定し、一方、強度の測定値からは、マップを完成させるうえで必要な残りの断片サイズを得た。
図１４は、染色体ＩＩＩおよびＸＩをRsrIIで消化し、染色体ＸＩをAscIで消化することによって、光学的マッピングで作成した整列させた制限マップであり、図１５は、代表的消化物についての対応する蛍光顕微鏡写真である。信頼区間を計算するにあたって、プール集団標準偏差として４７kbを使用した相対見かけ長さの結果。染色体、酵素、平均＋／−９０％信頼区間（kb）（サンプル数）。染色体ＩＩＩ、RsrII ２６４＋／−２７（８）、８６＋／−２７（８）。染色体ＸＩ、AscI ４２＋／−５５（２）、１９５＋／−５５（２）、２４２＋／−５５（２）。染色体ＸＩ、RsrII ６７＋／−４５（３）、１２７＋／−４５（３）、２２１＋／−４５（３）、２６０＋／−４５（３）。信頼区間を計算するにあたって、プール集団標準偏差として３６kbを使用した相対蛍光強度の結果。染色体ＩＩＩ、RsrII ２５６＋／−２１（８）。染色体ＸＩ、AscI ８０＋／−４２（２）、１７７＋／−４２（２）、１８１＋／−４２（２）、２３７＋／−４２（２）。染色体ＸＩ、RsrII ８４＋／−３４（３）、１２５＋／−３４（３）、２２６＋／−３４（３）、２４０＋／−３４（３）。これらの結果を独立に検証できるような公表されたマップはない。これらのマップを構築するにあたっては、まず、切断頻度データ（図７に似たもの）から切断部位の最大数を求める。次に、十分に切断された分子からの断片について、長さならびに強度によってサイズを求め、仕分けして平均を求める。長さを測定した断片の仕分けには、相対蛍光強度の測定値を使用する。平均に際して、隣接した断片が、隣接して仕分けされねばならないことは明らかである。消化物中にはっきりしたパターン、たとえば、極めて大型の断片が、極めて小型の断片の断片に隣接しているといったパターンがあると、正確な仕分けがしやすい。部分消化物から得られたデータを使用して、想定部分断片長を計算し、この計算値を観察データと比較することによって、十分に切断された分子から構築されたマップの確認を行った。
このように、本発明では、ＤＮＡ分子のような極めて長い分子を物理的にマッピングする一連の分析アプローチを提供するものであるが、この方法は、単純で、その性質上、極めて迅速な方法である。酵母の染色体のほぼリアルタイムでのマッピング法が実現されたものの、これも、この方法論が有している最終的な能力にはほど遠いものである。クローニング、電気泳動、サザン分析、ＰＣＲといった従来のゲノム分析のツールをほとんど利用しない方法なので、ロボット工学や自動化の進歩にともなって、光学的マッピングのスピードがどのくらい上昇するかは、予測不能である（Chumakov, Nature 359: 380, 1992）。チャンバーの設計、サンプルの操作、画像分析、情報工学の単純な工学上の進歩によってもでも、ゲノム全体を迅速にマッピングしうる処理量の高い方法が得られるはずであり、さらに重要な点として、配列情報の知識を、個々の生物のプロトタイプについてでなく、複数の個体からなる集団へと敷衍していくことが可能となるはずである（Cavalli-Sforza, Am. J. Hum. Genet 46: 649, 1990）。
実施例１４： 制限エンドヌクレアーゼを使用したラムダバクテリオファージクローンの光学的マッピング
ここに提示する実施例では、誘導化ガラス面上で伸展させ、固定した個々のＤＮＡ分子をイメージングすることによって、光学的マッピング法によるサイズ解像度を大幅に改善する。蛍光強度ならびに見かけ長さの平均をとることによって、８００塩基対の長さの制限断片の塊を正確に測定することができた。具体的には、こうした固体表面に基づく光学的マッピング技術を使用して、マウスのピグミー遺伝子座に由来するラムダクローンの整列させた制限マップを作成した。
１４．１ 材料ならびに方法
ポリリシンをコーティングしたガラス表面の調製
ガラス（１８2ｍｍ、Fisher Scientific）を、５Ｍ塩酸中で２〜３時間にわたって煮沸することによって清浄化し、高純度の水で濯ぎ、風燥し、その後、濾過済みのポリ−Ｄ−リシン（分子量、３５０，０００、シグマ）の溶液（１ｘ１０-2〜１ｘ１０-8g／水１ml）中で一晩インキュベートした。いずれの溶液にも、蒸気滅菌水を使用した。
顕微鏡での観察とイメージの回収
ＤＮＡ分子は、落射蛍光装置ならびに１００倍のプラン−ネオフルアー対物レンズを備えたツァイスのアクシオバート３５顕微鏡でイメージングした。ハママツＣ２４００ＳＩＴカメラを使用して、クアドラ（Quadra）９００コンピュータ上で作動する標準的な市販のソフトウェアで制御された冷却デジタルＣＣＤカメラ（１０３２ｘ１３１６画素）の焦点を合わせた。
ＤＮＡの調製とゲル電気泳動
分析したクローンは、マウスのピグミー遺伝子座にマッピングされたＹＡＣから構築したラムダＦＩＸＩＩライブラリーに由来する。細胞を生育させ、標準的なプロトコールを使用することによって平板で生育させたファージに感染させ、市販のキット（キアジェン（Qiagen）、ドイツ）を少々改良を加えて使用することによってＤＮＡを調製した。製造業者の指示にしたがって制限消化を行い、通常のパルスフィールドゲル電気泳動によって分析した。ゲルを臭化エチジウムで染色し、ポラロイドフィルムと紫外線トランスイルミネータを使用して記録した。
ＤＮＡマウンティングならびに制限消化
１μlの希釈クローンＤＮＡ（５ng／μl）を、１ｘ制限バッファー（マグネシウムイオン非含有である以外は製造業者の指示通りに調製）、３％β−メルカプトエタノール、および０．２ng／μlのエチジウムホモダイマーに加えた。この溶液３〜４μlを、ドリルで３mmの穴をあけたスライドガラス上にピペットで滴下し、広げた。ポリリシンをコーティングしたカバーガラスを、レンズ用ティッシュペーパー（ロスティシュー（Ross Tissue）、ロスマリン社（Rosmarin Corp.））で拭って乾燥させ、スライドガラスの上に載せ、ワセリンと鉱油との混合物でシールした。カバーガラスとスライドガラスを重ね合わせたまま、顕微鏡のステージに載せ、制限エンドヌクレアーゼ（５〜１０単位）の１ｘ制限バッファー（製造業者の指示通りに調製）への希釈液５μlを、ドリル加工した穴を通してサンプルに拡散させ、室温にて１５分間インキュベートした。
ポリリシンをコーティングしたガラス表面の分析
１μlのラムダＤＮＡ（ニューイングランド・バイオラボス（New England Biolabs））（５ng／μl）を、１００μlの１ｘEcoRI制限バッファー（５０mM NaCl、１００mM Tris-HCl、および０．０２５％TritonX-100（pH７．５）；マグネシウムイオン非含有）、エチジウムホモダイマー（0.2ng／μl）、５％β−メルカプトエタノールに加えた。４μlのサンプルを、清浄にした顕微鏡用スライドガラス（穴なし）上にピペットで滴下し、カバーガラスをかぶせ、各種濃度のポリ−Ｄ−リシン溶液（分子量３５０，０００）中で１６時間にわたってインキュベートした。各濃度について、カバーグラス上の２０−３０カ所の別々の位置をイメージングした。それぞれの位置のＤＮＡ分子の長さならびに数の平均を計算した。１イメージ視野あたりの利用可能な分子数を、ＤＮＡ濃度、サンプル容量、イメージ面積から計算した。平均分子数の、溶液中の利用可能な分子数に対する比を計算し、ポリリシン濃度に対してプロットした。
マップの構築
上述の実施例１３に記載した方法に若干の修正を加えて使用することによって、光学データからマップを構築した。略述すると、フラット・フィールド補正、バックグラウンド補正、セグメント化、画素値の積分、そして強度比の計算の工程でイメージ処理を行った。各断片の相対強度を計算し、既知の全体サイズを乗ずることによって、サイズ（単位、kb）を求めた。小型断片のサイズが、システム上、過小に算定されてしまうことを防止する目的で、経験にもとづいたカリブレーション関数を適用した。６．５kb未満の断片については、０．６６５で除した。大きめの断片については、調整を行って、既知の全体サイズを保全した。
相対見かけ長さは、画素のレプリケーションによってイメージを４倍に拡大し、マウスを使用して、線分を各断片にそって位置させることによって計算を行った。断片の両端は、断片間の間隙の中央に位置させた。各断片の長さは、直線線分の長さの総和であった。サイズ（単位、kb）は、全断片の総和によって除し、既知の全体サイズで乗じることによって求めた。
イメージ分析過程を、１サンプルから得た数個のイメージ由来の分子の数だけ繰り返した。分析は、適正な数のカット断片の得られた分子について行った。各分子の向きは、クローニングアーム断片のサイズから判断した。その結果、各種の断片の平均における１断片からのデータを包含してしまう危険性が低いかたちで、多くの測定値を平均することが可能となった。
１４．２ 結果
ポリリシンをコーティングしたガラス表面へのＤＮＡ分子の固定
ポリリシンは、従来から、ガラス表面に細胞を固定するのに使用されてきている（Williams, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 2311-2315, 1977）。ポリリシンをコーティングした雲母の表面を屈折率の測定により詳細に測定したところ（LuckhamおよびKlein, Chem. Soc., Faraday Trans. I, 80:865-878, 1984）、ポリリシンのコイルは、表面に押しつけることによって、特性を変化させることが可能なことが示された。細胞生物学で、ポリリシンが広範に使用されていることからして、ポリリシンをコーティングしたガラスは制御が簡単で、生化学的にも適合性があるであろうと考えられた。表面誘導化に使用するポリリシンの分子量ならびに濃度は重要であり、多すぎると、分子が強固に固定されて生化学的に不活性になってしまい、少なすぎると、伸張したＤＮＡ分子が急速に緩んで、ランダムコイル状コンフォメーションに戻ってしまう。従来のアガロースを使用した光学的マッピングの方法論でも、まさにこうしたことが問題となり、そのうえで成功裏に解決されてきた。
ポリリシンの濃度は、ガラス表面に見いだされる平均分子伸張度および平均分子数を、ポリリシン濃度に対してプロットすることによって最適化した。ガラス表面の標識分子のイメージングには、蛍光顕微鏡を用いた。図１６に、種々のポリリシン（分子量３５０，０００）の濃度に対する、ガラス表面のラムダバクテリオファージＤＮＡ分子の数ならびに平均分子長の結果を示す。予測通り、ポリリシン濃度が低いと、平均分子長は短く、ガラス表面で検出される分子数も少なかった。ポリリシン濃度の増加とともに、平均分子伸張度も上昇し、１０-6g／mlでピークを示し、ポリリシン濃度をさらに増加させると、分子伸張度は減少に転じた。予測通り、ガラス表面の分子数も上昇した。
伸張したＤＮＡ分子が、ポリリシンをコーティングした表面とどのように相互作用するのかという正確なメカニズムは、わかっていない。しかし、ＤＮＡも、ポリリシンも、高度に帯電したポリマーであるので、主に静電相互作用が生じているものと推定される。また、分子伸張力は、（マウンティングの方法により）表面に生じる静電力と均衡するので、分子の平均伸張度は、ポリリシンの濃度に応じて変化するものと予想される。分子は、表面を横向きに流れ、また、分子の個々の結合部位の表面との結合は、必ずしも同時に生じているわけではないと考えることができる。ポリリシンの濃度が低い場合には、ガラス表面のポリリシンの密度が低く、伸張した分子を安定したかたちで保持するうえで十分な結合部位が不足している可能性がある。その結果、表面に結合したラムダＤＮＡ分子は、いずれもランダムコイル状になることとなる。ポリリシンの濃度が高い場合には、結合部位が豊富に存在しているので、多少流れの力が強くても打ち消され、狭い領域内で分子が静電結合を形成し、分子の移動ならびにさらなる伸張が抑制されることになる。この場合には、分子の効率的な結合が期待される。中程度の濃度の場合には、流れと静電力がおそらくある程度均衡し、最大の伸張が生じうる。
光学的マッピングでは、特定の条件とした結果、ポリリシン濃度が１０-6〜１０-7g／ｍｌの範囲となり、ポリマーの輪郭の長さが１００〜１４０％伸張した分子が形成された（図１６参照）。ポリマーの輪郭の長さが過度に伸張するのは、ヘリックスの解旋がエチジウムホモダイマーによって（Guoら, Nature 359: 783-784, 1992;Guoら, J. Biomol. Structure & Dynamics 11: 1-10, 1993）、および流体が流れる力によって生じるからであると考えられる。
制限酵素の消化のイメージング
まず、処理されたカバーガラスとスライドガラスの間にサンプルを挟むことにより、分子をポリリシンでコートした表面に固定した。DNAサンプルは、DNA、制限緩衝液からマグネシウムイオンを除いたもの、β-メルカプトエタノールおよび蛍光色素からなるものであった。エチジウムホモダイマー（Glazer et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:3851-3855, 1990）が、ほとんどの制限酵素と適合することが見いだされた。カバーガラスをシールし、スライドガラスの小さな穴を制限酵素とマグネシウムイオンの注入用に用いた。
制限酵素消化物は、初めはSITカメラおよびマッキントッシュコンピューターに入れた512×512画素デジタル化システムを用いてイメージングされた。後に、より高い空間解像度（1032×1316画素）を有する冷却型CCDが得られ、これによりノイズや空間的なゆがみが少なく、優れた直線性を有する画像が得られた。これは小さいDNA分子（20kb以下）のイメージングに好ましい装置である。コントラストが高く、ノイズのない画像を用いれば画像処理方法は単純化され、データ抽出技術は簡素化される。
これまでの光学的マッピングのプロトコールでは、制限酵素の活性のイメージングに時間経過が要求された。表面に固定された分子を用いれば、最終的な結果が簡単にイメージングされる。分子は一度しかイメージングされないので、20-60秒の長い露光時間と高い照度が用いられた。最適の露光時間は、倍率および望まれるグレイレベルの数によって変化する。図17にラムダクローンのDNA分子の典型的な画像を示す。800bpのDNA断片が容易にイメージングされた（図17w）。一般的に、およそ100個の好適な分子を含む、20-80×62ミクロンの顕微鏡の視野をイメージングした。
選択された固定条件によれば、分子の伸長が最大となり、相当な数の表面に結合した分子が得られた。ところが、固定条件は完全ではなく、図16に示したデータからわかるように、すべての分子が最大に伸長するわけではなく、いくつかの分子は交差した。不完全に固定された分子はマップの作製に選ばれなかった。図17にマップの作製に選ばれる典型的な分子を示す。
蛍光強度および見かけ上の長さの測定による質量の定量
蛍光顕微鏡の解像度は約0.1ミクロンで、これは約300bpのB-DNAにあたる。理論的には、より小さい分子も検出できるが、空間的な解像度は伴わない。ここに記載されたシステムに利用可能なサイズの範囲は、28kbから800bpにわたり（図17および18参照）、同じ親分子からの制限酵素断片の、相対的な見かけ上の長さおよび相対的な蛍光強度の測定に基づくものである。これは、上記の実施例13において、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）の制限マップを作製するために使った技術と同じものである。
ゲルにではなく表面にマウントしたDNA分子を使用することにより、サイズの測定の限界を60kbから800bpに下げた。もう一つの特記すべき違いは、強度については36kbに対して3.1kb、長さについては47kbに対して1.9kbという、大きく改善されたプールされた標準偏差である。7kb以下の断片に対するプールされた標準偏差は強度で1.3kb、長さで0.74kbであった。多くの隣接した短い断片を有するサンプルを除けば、表面蛍光強度および長さのデータは800bpの低さで再現性が非常に高いのに対して、以前の結果は60kb以下において良くない結果を与えた。全体の相対的なエラー（長さと強度で同一であった）は大きい断片に対しては5%で、アガロースゲル電気泳動によるサイズの測定におけるエラーと同じ程度である。小さい断片（5kbから800bp）が含まれる場合には、これは10%に上がる。800bpの10%は80bpで、約30の蛍光色素を含むことに注目されたい。ゲルによるサイズの測定のエラーは5から8%であった。
800bpから5.1kbの制限断片は蛍光強度測定により常に小さく測定される結果、隣接する長い断片は実際よりも大きいと評価される。けれども、小さい断片に対するプールされた標準偏差は1.3kbに過ぎない。このことは、測定は正確であること、偏差は何らかの未知の体系的な効果により生じること、および体系的なエラーを正すための補正が必要であるということを示唆している。図20Bは、蛍光強度により定量された質量を、ゲル電気泳動のデータに対して独立してプロットしたグラフである。原点を通る最も適合した線を、小さい断片を補正するための補正曲線として用いた。大きい断片は全体のサイズを維持するように調節された。図20Cに補正後の結果を示す。図20Dには相対的な見かけ上の長さの結果を示す。
消化物は消化が行われた後にイメージングされるので、一つのサンプルから短時間で多くの分子の画像を集めることができる。これにより、ノイズを減らすために結果を平均することが可能になる。最初の測定のノイズが大きくて異なる断片が識別できない場合には、平均により事態が改善されないことは明らかである。ラムダクローンについては、ノイズが２標準偏差に達する場合でも、クローニングアーム（20および9kb）間の11kbのサイズの違いにより、分子の一つの末端を他の種から識別することができる。
ラムダクローンの光学マップ
図19に、マウスのPygmy 19座に由来するラムダFIX IIクローンの光学的マッピングにより作製されたEcoRIおよびBamH Iのマップを示す。表１は断片の大きさを示す。図20に、ポリリンカー部位で切断するので、切断していないクローンのPFGE測定によらなくても既知のベクターアームのサイズに基づいて絶対的ななサイズの算出が可能となるような酵素による典型的な開裂パターンを示す。表２に、ポリリンカー部位で切断する酵素（Sal I、Not IまたはSst I）による消化物のPFGE、蛍光強度、および見かけ上の長さの測定により得られた結果を示す。これらの酵素による光学的マッピングを用いて、クローンの全体のサイズを計算することができる。そして、この値をポリリンカーを切断しない酵素を用いた光学的マッピングについてのサイズを計算するために用いることができる。
上記の実施例13で開発された方法を用いて順序正しく配列された制限酵素マップが作製された。簡単に述べると、それぞれのクローンについて、イメージングされた制限断片の親分子あたりの数から構成される柱状図を作製することによる断片の正確な数、およびその頻度である。一般的に、それぞれのクローンの100分子を分析し、断片の数とマップの内容に基づいて5-10分子をマップの作製のために選択した。通常、これらの分子は、最も数多く制限断片を含む柱状図の柱に含まれていたものである。消化後の分子の画像を研究することにより、断片の順序が判明し、相対的な蛍光強度および相対的な見かけ上の長さの測定により相対的な断片の質量が決められた。断片の長さは断片間のギャップの中間点を起点として測定された。最終的なマップは、同種の分子に由来する制限断片のサイズの平均として報告される。分子は、断片の数が一致し、相応する断片の大きさが上述の測定の精度の範囲内であれば同種であるとみなされた。
少数の分子を分析したため、および消化効率が完全に定量的でなかったため、それぞれの分子について切断部位の数の柱状図分析が必要となった。典型的には、イメージングされた分子の5-30%が完全に消化されていた。効率は断片の数、サイズおよびパターンにより変化した。1.5kb以下の隣接する制限断片は識別不能なことがあった。1kb未満の断片は表面から遊離していて観察されないことがあった。これらの問題点は十分な数の分子をイメージングすることにより除去されると予想される。さらに、完全に消化された分子から作製されたマップを確証するために、部分的に消化されたクローンから得られたデータを用いた。
部分的に切断した分子または完全に切断した分子から得られた不完全な画像を有するデータは役に立つことがあった。すべてではないがいくつかの断片が測定できた場合、または断片が特定の部分的な消化の産物であると疑いなく解釈された場合、既知の断片と、断片を合計したもののすべての組み合わせとの比を計算して、利用可能なすべてのデータと平均した。これらの比は完全に切断され、完全にイメージングされた分子からも計算された。いくつかの完全に切断された分子は、ベクターアーム断片の一つに明らかにその断片に帰属しない強度が混入したため、または、断片が画像の端からはみ出したために、強度の計算に直接使うことができなかった。同様に、いくつかの断片は長さの計算に使うことができなかった。このような場合には、未知の断片と既知の断片との比を用いて、その分子についてのすべての断片のサイズを計算した。
マップは、まず光学的マッピングにより作製しされ、次いで当研究室で得られたゲル電気泳動のデータにより確証され、そして以前に作成されたコンティグマップと比較された。光学的マッピングには内部のサイズの基準、すなわち、切断されていないクローンまたはベクターアームのような明らかに同定可能な断片が必要である。ポリリンカーを切断しない酵素に対しては、切断されていないクローンのサイズを測るためにゲルのデータを用いた。これらのサイズはまた、ポリリンカーを切断する酵素（Not I、Sal IおよびSst I）を用いた光学的マッピングによっても得られた（表２、図20）。全体的に、電気分解に基づくマップと光学マップとの間には、断片のサイズおよび順番に関して優れた一致が見られた。特に10分子からのデータを平均した場合には、光学マップの方がアガロースゲル電気泳動に基づく測定よりも正確に断片のサイズを報告することがしばしば見られた。サイズの測定の精密さのレベルからは、800bp以下の断片については信頼性のある検出はできなかった。
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実施例15
表面上での光学的マッピングにより作製された酵母人工染色体の順序正しく配列された制限酵素のマップ
この実施例においては、個々のDNA分子から順序正しく配列された制限マップを迅速に作製するための、新規な表面マウント技術について記載する。特に、この技術はポリリシンでコートした誘導化されたガラス表面の利用を含む。この技術がうまく利用できることは、誘導化されたガラス表面にマウントした酵母人工染色体のDNA分子から作製された正確な光学制限マップにより証明される。
15.1. 材料と方法
YAC、DNAの調製およびPFGE制限マッピング
ゲルインサートは、7H6、3I4、3H5、5L5および6H3という名前の５つのYACクローン（Murray and Szostak, Nature 305:189-93, 1983; Burke et al., Science 236:806-812, 1987）および酵母AB972株から、標準的なプロトコール（Schwartz and Cantor, Cell 37:67-75, 1984; Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1, 6.10.1-5, John Wiley & Sons, New York, NY, 1994）に従って調製した。パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）をED装置上でおこなった（Schwartz et al., Nature 342:575-576, 1989）。YACのサイズはラムダDNAコンカテマーおよび酵母染色体に対する相対的電気泳動移動度を比較することにより測定した。7H6および3I4のPFGEマップは、異なる制限酵素で切断したYACのDNAにサザンブロット法を行うことにより作製した。ブロットは放射能標識されたヒトAlu反復配列プローブでハイブリッド形成された（Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991, 1984）。3H5、5L5および6H3の順序正しく配列されたマップは、右および左のクローニングアームに由来するプローブを用いた部分的消化（Smith and Birnstiel, Nucleic Acids Res. 3:2387-2399, 1976）により作製した。
表面の調製、DNAのマウントおよび消化
カバーガラスを95℃の過剰3M HCl中で２時間洗浄した後、高純度の精製水で完全に洗浄した。洗浄したカバーガラスを、新しく調製されたpH3.5の0.10M 3-アミノプロピルトリエトキシシラン（APTES; Sigma）に65℃で時間を変えて液浸することにより誘導化した。APTESで処理した後、カバーガラスを高純度の精製水で完全に洗浄し、空気乾燥した。DNAをマウントするためのチャンバーを作るために顕微鏡用スライドガラスに直径1cmの穴をあけた後、この穴を二つのカバーガラスで挟んだ。まず、APTESで処理したカバーガラスをシリコン真空グリースで接着した。次いで、20μlの溶融したアガロースゲルにDNAを溶かしたものを、ピペットマンを用いてAPTESで誘導化した表面にゆっくりと拡げた。次いで、チャンバーの上部を処理していないカバーガラスで真空グリースを用いてすばやくシールした。チャンバーを45℃の加熱ブロック上で10-30分インキュベートして、溶融したアガロース中のDNAを誘導化されたガラス表面に移動させた。チャンバーを少し傾けて穏やかな液体の流れを作り、移動の間にDNAが広がるのを助けた。移動の後、チャンバーを4℃で５分間冷却し、ゲルを凝固させた。次いでチャンバーを開いて、3-5ユニットの制限酵素を適当な緩衝液で希釈したものをゲルの表面に加えた。再度チャンバーをシールし、37℃で1-2時間インキュベートした。消化の後、エチジウムホモダイマー（分子プローブ、0.1ng/mlエチジウムホモダイマー、15mM EDTA（pH7.5）および10% 2-メルカプトエタノール）またはオキサゾールイエローホモダイマー（YOYO-1）（分子プローブ、0.1ng/ml YOYO-1、15mM EDTA、pH7.5、および20% 2-メルカプトエタノール）のいずれかを用いてサンプルを染色した。高分子量のDNAの希釈。光学的マッピングのためにDNA分子をマウントする時にはDNAの濃度をコントロールすることが重要である。融点の低いPFGEゲル（Seaplaque、FMC）からバンドとして切り取られたDNA分子は、以下のようにマウントの前に希釈しなければならないことが多い。すなわち、ゲルバンドを0.01mMの四塩化スペルミン（Sigma）のTE緩衝液（10mMトリス、pH7.6；1mM EDTA）中で２時間インキュベートする。この過程によりゲルに埋め込まれたDNA分子をせん断抵抗性の粒子の中に凝縮させ、希釈の間DNA分子を保護する。次に、72℃で７分間ゲルバンドを溶融し、0.01mMのスペルミンを含む溶融した低融点アガロースをさらに加えて混合する。この段階でボルテックスを行うと少量の外見上の切断がおきる。希釈したサンプルをゲルインサートにして（Schwartz and Cantor, Cell 37:67-75, 1984）、次いでTE緩衝液を加えて30分間振とうする洗浄を５回繰り返してスペルミンを除去し、それによりDNA粒子の凝縮を解除する。一回目の洗浄は、100mM NaClを補ったTE緩衝液を用いておこなう。ゲルインサートを10mMトリス、0.5mM EDTA、pH7.6中で保存した。
顕微鏡検査、画像分析およびマップの作製
エピ蛍光（epi-fluorescence）用の装置（緑励起および赤発光用のフィルターパック）およびHamamatsu C2400 SITカメラに接続された100X Plan-Neofluar対物レンズ（Zeiss）を装備したZeiss AxioplanまたはAxiovert 135顕微鏡を用いてDNA分子をイメージングした（実施例13）。典型的な100ミクロンの顕微鏡視野には３から５の分析に適した分子が含まれていた。制限酵素による消化の効率は既知の制限マップを用いて分子中のギャップを数えることにより点数化した。この研究に用いた酵素の間では消化効率に差異はなかった。制限マップは実施例13に記載した方法で作成した。
15.2 結果
誘導化したガラス表面に大きいDNA分子をマウントするための最適条件
大きいDNA分子は移動の間に切断され易く（Albertsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4256-60, 1990）、表面にマウントするための作業の間にその完全な状態を維持するためには特別な努力が必要である。融解したアガロースは、１メガ塩基よりサイズの大きいDNA分子をマウントするためにとても効率よく使われてきたが（実施例13）、これを用いた場合、分子全体にはっきりした焦点をもたらすのが困難なことがあり、また、アガロースゲルは光を分散させる。アガロースによる固定に関するこれらの問題を除去するために、融解アガロースに溶かした大きいDNA分子をAPTESで誘導化されたガラス表面に固定することにより、融解アガロースの流体の乱れの減衰させる性質を、表面へのマウントの安定性と組み合わせた（Lyubchenko et al., J.of Biomolecular Struct. and Dynamics 10:589-606, 1992; Weetal, Methods Enzymol. 44:19, 1976）。この組み合わせた技術により、DNA分子と顕微鏡の対物レンズの間のアガロースゲルの量を最小にしたので、高いコントラストを持つイメージングが可能になったと推論された。このアプローチは、アガロースマトリックス中のDNAがAPTESで修飾されたガラス表面と相互作用して、最適に伸長され、安定化された分子を、制限酵素の活性化を促すような環境中に生じさせることができるかどうかをテストすることにより評価した。
表面誘導化の条件は、DNA固定の二つの重要な側面、分子の付着および伸長に影響を及ぼす。理想的には、分子は強く付着し、よく伸長しているべきである。実際にはこれらの二つの条件は相反している――付着が強すぎると伸長が妨げられるのに対して、付着が弱すぎると伸長は最大となるが十分な数の分子が表面に固定しない。適当なバランスを達成するために、沈着した分子の測定された分子長さの平均に対して、APTESの量を表面上で滴定した。APTESで修飾したカバーガラス上の染色された分子をイメージングするために蛍光顕微鏡検査を用いた。洗浄したカバーガラスを0.10M APTES溶液中でインキュベーションする時間を0.5から５時間まで変化させ、寄託された希釈されていない出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）（AB972）の染色体I（240kb）を融解アガロースに溶かし、蛍光顕微鏡写真から分子の長さを測定した。表面に付着した分子の数も数えた。目標は表面上に利用可能な数の分子が存在する状態を保ちながら、分子の伸長を最大にすることであった。図21に、APTES濃度に対して分子の伸長の平均および100ｍ2の視野あたりの分子の数をプロットしたグラフを示す。APTES濃度が低いときには、分子の伸長の平均も表面上に検出された分子の数も最小であった。分子の伸長の平均はAPTES濃度とともに増加し、３時間で最大となり、さらにAPTES濃度が増加すると分子の伸長は減少したが、予想通り、表面上の分子の数は増加した。どのくらいの大きさのDNA分子がAPTESで修飾された表面と相互作用をするのかは正確には知られていない。DNAと電荷を持った表面との間の静電的な引力と、マウントの作業中に生じる分子の流動力とが、ある程度までは釣り合っていると推測される。多くのAPTESが被覆されるにつれて表面の電荷密度が増加するのに対して、流動力は一定である。そこで、分子の伸長の最小値は、APTESの表面密度が高いときと低いときに測定される。図21に示されたデータに基づいて、まず、APTES中で３時間インキュベートされたガラス表面を使用することに決定した。このインキュベーション時間によれば、均質に伸長した長さの分布が得られるが、２時間の消化の間に分子が過度に弛緩することが見いだされた。次に、APTESによるインキュベーション時間を５時間に延長した。５時間では、平均の長さはポリマーの輪郭の長さの約55%である。高度の伸長により小さい制限断片の検出が促進されるが、制限酵素の活性が阻害される可能性がある。次の段階は制限酵素の活性をアッセイすることであった（実施例13）。マウントしたDNA分子の消化。以前の光学的マッピングの研究においては、DNA分子は典型的にはそのポリマーの輪郭の長さの約30%まで伸長された。より凝縮した分子はより高い蛍光密度を有するので、この伸長の程度は、画像のコントラストを最大にするために選択された。最近、より低い密度の画像から必要量の情報を集めるためにより長い画像集成時間が用いられるようになった。この実施例では、表面にマウントされた分子は、典型的にはそれらのポリマーの輪郭の長さの50-60%に伸長された。このような分子は、制限酵素により、アガロース中でマウントされたより凝縮した分子と比較して、50%に対して85%と、効果的に切断されることが見いだされた。効率は、与えられた同種の部位における開裂の可能性により測定された（実施例13）。全体的な画像の品質も同様に大きく改善された。
DNA分子の表面へのマウントには欠点がある。すなわち、融解アガロース中のほとんどのDNAが表面に付着するのみでなく、蛍光性の凝集体もまた付着する。このため、観察は一つの光学的な面に限られるので、DNA濃度を低くしなければならなかった。スペルミンの凝縮に基づく、切断が起こらない希釈のプロトコールが開発された（Gosule and Schellmann, J. Mol. Biol. 121:311-326, 1978）。このプロトコールによればアガロース中に埋め込まれたDNAのコイルをうまく崩壊させるので、著しいDNAの切断を伴わずに融解アガロースにボルテックスを行うこともできる。スペルミンとDNAの凝縮/サンプルの希釈という過程はすべてのYACサンプルに使われた。希釈後、ゲルインサートを過剰のTE緩衝液中で洗浄することにより、スペルミンを除去した。
質量測定
蛍光顕微鏡でイメージングされたような、ラベルされたＤＮＡ分子の質量と測定された蛍光強度との定量的な相関関係は、すでに証明した（実施例13）。さらに、顕微鏡的にイメージングされた制限断片長と質量との信頼できる相関関係を確立した（実施例13）。これらの研究は、アガロースゲル中に固定したＤＮＡ分子を用いて行なった。この実施例で記載した表面固定条件が異なるため、質量測定のための方法を再評価しなければならなかった。表面固定したS. cerevisiaeの染色体ＤＮＡ分子をNot Iで消化し、制限断片の蛍光強度および長さを測定した。これらの測定値を、十分に確立されたS. cerevisiae染色体のNot I断片サイズに対してプロットした（実施例13、LinkとOlson, Genetics 127:681, 1991）（図22および23を参照されたい）。典型的な分子の蛍光顕微鏡写真を図23に示す。表面固定分子とゲル固定分子のために測定された蛍光強度の間における最も顕著な相違は、再現性の向上である。プールされた標準偏差（SD）は、以前のものが36kbを示した（実施例１３）のに対し、17kbであった。また、表面固定分子の蛍光強度データは、我々の以前のゲル固定プロトコルが60kb以下という不十分な値であったのに対し、30kbまで正確であった。表面固定分子の全相対誤差は４％で、標準的な方法で得られた結果と同等であり（LinkとOlson, Genetics 127:681, 1991）、変動係数の平均は12％であった。このことは、ルーチンのPFGE分析に匹敵する精度であることを示す。表面固定分子の長さを測定することによる質量測定もまた、ゲル固定分子での以前の結果より良いものであった。長さの測定値より、プールされたSDが47kbに対して32kbであり、変動係数の平均が29％であることが示された。相対誤差は７％であり、蛍光強度データほど正確ではなかった。これらの断片のサイジングの検討より、蛍光強度が長さよりも質量に対する相関が、より正確であり、かつ信頼性が高いことが示された。結局、表面固定分子の画像は、一貫して１焦点平面にあった。正確な蛍光強度測定のためには焦点がしっかり合っていなければならないが、長さの測定ではぼやけた画像に起因する誤りをあまり受けない。明らかに、表面固定分子の消化によって生成された制限断片は、蛍光強度の値よりも、長さの点で多様である。長さの変動に基づく誤差は、均一に伸長されたＤＮＡ分子のみを選択することによって減少させることができる。
ＹＯＹＯ−１による改善された画像
改良されたＤＮＡ結合効率と量子収量とを有する新規な蛍光色素が最近開発された。オキサゾールの黄色のホモダイマー（ＹＯＹＯ−１）対エチジウムのホモダイマーを試験し、ＹＡＣクローンである３Ｈ５、５Ｌ５、および６Ｈ３を光学的にマッピングした。ＹＯＹＯ−１の画像は、エチジウムホモダイマーによる画像よりも明るく、コントラストがくっきりしていた。また、高い塩の条件により、エチジウムで染色された分子の蛍光放射が低下するのに対し、ＹＯＹＯ−１染色分子では高い塩条件および厳しい固定条件の下においても蛍光性が保持されていた。興味深いことに、２−メルカプトエタノールの存在下においてさえも、二本鎖の破損として示された、ＤＮＡに対する重大な光損傷がＹＯＹＯ−１を含む溶液中で観察された。幸運なことに、表面固定ＹＯＹＯ−１染色ＤＮＡ分子は、20％（v/v）の２−メルカプトエタノールの存在下において、測定され得る光損傷（二本鎖の破損）を示さなかった。さらに２−メルカプトエタノールを増加させると、ＹＯＹＯ−１の蛍光が消光することが観察された。ＹＯＹＯ−１を用いて達成することができる質的に優れたイメージコントラストにより、制限断片のサイジングの結果が向上した。すなわち、ＹＯＹＯ−１染色制限断片について計算された平均に対するプールされた標準偏差は17kbから11kbへ下がり、平均変動係数は12％から７％へと低下した。
制限消化および地図作成
５つのＹＡＣを、最適化したAPTES固定と上記のＹＯＹＯ−１染色条件とを用いて、制限エンドヌクレアーゼであるMluI、EagI、およびNotIで光学的にマッピングした。全般的に、画像は明瞭でコントラストはくっきりしていた。上記の手順（実施例１３）にわずかな変更を加えて地図を作成した。くっきりしたコントラストのイメージングの可能性を利用するような地図作成のために必要な分析は、分子が消化後にイメージングされるために、以前の他のアプローチと比べて単純化された。長いイメージ積算時間を採用し、顕微鏡の視野あたり１つの画像を集めた。以前の手法（実施例13）では、一連の時間経過画像の検討と４〜５枚の連続した（一時的な）画像の解析が必要であった。表面固定分子の切断部位はギャップ（空隙）の出現によって合図され、断片の端はときどき、縮合ＤＮＡの明るい領域を表示した。これらの地図を方向付けるために、ＹＡＣを二重消化によってさらに特徴付けた。得られた地図の一部は、40〜180ｋｂのサイズの範囲の断片を６個以上含んでいる。光学的地図およびPFGE地図間の全体的な一致は、断片のサイジングおよび順序付けのいずれにおいても非常に良好であった。
15.3 考察
ＤＮＡ分子の光学的な制限マッピングは、大型のＤＮＡ分子の制限地図を作成するための従来のゲルおよびハイブリダイゼーションベースの方法に代わる新たなものである。光学的マッピングは以下の点に基づく魅力的な技術である。i）迅速で安全であり、ゲル電気泳動、プローブの調製と放射ラベリング、核酸ハイブリダイゼーションおよびオートラジオグラフィーなどの時間のかかる技術を必要としない。さらに、顕微鏡とカメラを除けば非常に単純な材料を少しだけ必要とする、実施が容易で安価な手法である。ii）この手法では一貫した結果が得られ、正確度は標準的な方法との直接的な比較によって証明されてきた。iii）この手法は、個々のＤＮＡ分子を分析するものであるため、小型化と自動化そしてその結果としての状態が処理量の大巾増加、コストの低減が大いに見込める。
本実施例では、ＡＰＴＥＳで誘導体化したガラス表面に付着したＤＮＡ分子を分析する能力に由来する光学的マッピングに対する幾つかの重要な改良を記載する。第一に、表面固定を用いることにより、一焦点面において大型の分子をより容易に見いだすことが可能である。このことは、以前のアプローチとは対照的に、分子が消化された後に画像化されるため、地図作成に必要な分析を単純化する。第二に、表面固定により長時間のイメージングが可能になったことから、ＤＮＡ分子をそれらの高分子の輪郭の長さの60％（以前は30％）まで伸長することが可能になった。分子が長くなればなるほど、制限エンドヌクレアーゼによってより効率的に開裂され、部位の85％が切断される（以前は50％）。かくしてこの手法の基本的な機構は、より力強いもの（vobast）である。価値ある結論は、蛍光強度に基づく長さのデータはより再現性があり、正確であるということである。アガロースゲル固定と比較した表面固定の第三の利点は、小さなＤＮＡ断片がよりたやすく検出されるということである。その理由は、表面固定は緩和してゲルマトリックス中に逆戻りし、視野から消失するという傾向を制止するからである。
今では、30kb（以前は60kb）ほどの小さい分子について信頼性のある測定が可能である。第四の改良は、エチジウムホモダイマーに比べて優れた蛍光色素であるＹＯＹＯ−１から得られた。ＹＯＹＯ−１は、エチジウムホモダイマーとは異なって、コントラストがくっきりした、より鮮明な画像をつくり出し、高い塩によっても妨害されない。改良された画像は、制限断片の平均サイズに対するより低い標準偏差で測定されるように、より信頼性のあるＤＮＡ断片のサイジングを可能にする。
現在、ヒトゲノムの大きな画分はＹＡＣコンティグによってカバーされている（CohenとWeissenbach, Nature 366:698-701,1993）。多くのコンティグの情報の内容は、配列タグ付けされた部位または他のマーカー、各マーカーと関連するＹＡＣおよび幾つかの場合ではＹＡＣのサイズのリストからなる。一般的に、ＹＡＣはほとんど詳細な特徴付けがされておらず、その結果、多くのコンティグによりスパンされた（spanned）物理的な真の距離を評価することは難しい。さらに、物理的なランドマーク（landmark）はより近接して配置されるので、ＹＡＣライブラリーを用いてそれらをより正確に順序づけることは一層難しくなる。なぜなら、近接するマーカーは、しばしば同一のＹＡＣのセットに含まれるか、またはＹＡＣの再配列が矛盾するデータを与えるかもしれないからである。
制限マッピングは、ＤＮＡの内容を真に直線的に、配列に基づいて提示する上で、ＹＡＣの特徴付けのために利用可能な手法のなかでユニークなものである。重複するＹＡＣの制限地図もまた、ＹＡＣの重複、ＤＮＡの再配列、およびキメラ形成（キメリズム）を探索するために有用である。最後に、順序付けられた制限地図（または幾つかの酵素を用いた複数の地図）は複雑なフィンガープリントとして処理することができ、コスミドフィンガープリンティングの使用と同様に、地図作成におけるツールとして使用することができる（Stallingsら、Proc. Natl., Acad. Sci. USA 87:6218-22, 1990）。このようなフィンガープリントは、反復配列を有する消化されたＹＡＣのＤＮＡをハイブリダイズすることによって生成されるフィンガープリントよりもさらに複雑であり、再現性がある。
下等な生物における比較的進んだ配列決定プロジェクトから、順序付けられた制限地図がＤＮＡ配列のより詳細な研究のための序章として必須であるということが例証された。おそらく、手間がかかるという理由のために、PFGEに基づくヒトのＹＡＣの制限地図は、大規模には作成されてこなかった。光学的なマッピングによる劇的な単純化とスピードアップにより、複雑なゲノムの大きなで連続的セグメントをカバーする詳細な制限地図の期待が、達成可能なゴールとなる。光学的なマッピングがＹＡＣクローニングの一部のアーティファクトを直接することを可能にする。２以上の同時クローニングされたＹＡＣを有する酵母の株を光学的マッピングを用いて効率的に分析することができる。不安定なＹＡＣを有する酵母の株（酵母の一画分のみが全長分子を含む）もまた、光学的に効率的にマッピングされ得る。再配列されがちなゲノム領域の分析もまた、複数の酵素を用いた複数のＹＡＣの分析が容易であることから、光学的なマッピングによって促進されるだろう。光学的なマッピングは、Ｐ１、Ｐ１人工染色体（ＰＡＣ）および細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンなどの他の大型の挿入物クローンを分析する上で同様に有用であり、究極的にヒトゲノムの大部分のための正確で詳細な制限地図を作成する上で有用であるように思われる。
本明細書中で引用される文献はすべて、雑誌の記事もしくは要約、対応する米国もしくは外国の特許文献、発行された米国もしくは外国特許、または他のいかなる資料をも含めて、すべてのデータ、表、図面、および引用文献中の文章が参考として本明細書中に取り込まれるものとする。
公知の工程、従来法の工程、公知の方法もしくは従来の方法を参照することは、いかなる側面においても、本発明の詳細な説明もしくは実施態様が開示され、適切な技術において教示もしくは示唆がなされているということを容認するものではない。
特定の実施態様についての先の記載は、他の人が、当業界の技術の範囲の知識を適用することによって（本明細書中で引用した文献の内容を含めて）、過度の実験をすることなく、このような特別の実施態様を容易に改良することおよび／またはこれらに種々の応用を適合させることができるという、本発明の一般的性質を十分に明らかにした。それゆえ、このような適合および改良は、開示された発明と意味および範囲において、ここで示された教示とガイドラインに基づき、均等である。本明細書における用語および言い回しは、記載のためになされたものであり、何等限定されるものではなく、本明細書で示された教示およびガイドラインに照らして、当業者によって解釈されるべきであるということを理解すべきである。
参考文献
本発明明細書中で引用された文献は、参考文献として本明細書中に全部が取込まれているものとする。
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Claims (2)

  1. 核酸分子のマッピング方法であって、
    （ｉ）（ａ）核酸分子を含有する溶液の液滴を平坦な固相表面上に置くこと、および
    （ｂ）該溶液の液滴を乾燥させること、
    によって該平坦な固相表面上に伸長し固定された核酸分子を用意する工程であって、
    該平坦な固相表面が正電荷物質をコーティングしてあり、該正電荷物質の密度が十分であるために、該核酸分子が、伸長された核酸分子が切断された場合に、０．５μｍ〜５．０μｍのギャップを生じるように緩和しながら、伸長され、該平坦な固相表面上にその長さに沿って固定され、その結果該核酸分子は分析することが可能であり、酵素反応を容易に受け入れることが可能である、上記工程；
    （ｉｉ）該平坦な固相表面上に伸長し固定された核酸分子と制限エンドヌクレアーゼとを反応させる工程；ならびに
    （ｉｉｉ）光学顕微鏡を使用して該平坦な固相表面上に伸長し固定された核酸分子を画像化し、該核酸分子の物理的特性の変化を検出する工程を含む、上記方法。
  2. 核酸分子の配列決定方法であって、
    （ｉ）（ａ）核酸分子を含有する溶液の液滴を平坦な固相表面上に置くこと、および
    （ｂ）該溶液の液滴を乾燥させること、
    によって平坦な固相表面上に伸長し固定された核酸分子を用意する工程であって、
    該平坦な固相表面が正電荷物質をコーティングしてあり、該正電荷物質の密度が十分であるために、該核酸分子が、伸長された核酸分子が切断された場合に、０．５μｍ〜５．０μｍのギャップを生じるように緩和しながら、伸長され、該平坦な固相表面上にその長さに沿って固定され、その結果該核酸分子は分析することが可能であり、ハイブリダイゼーション反応を容易に受け入れることが可能である、上記工程；
    （ｉｉ）該平坦な固相表面上に伸長し固定された核酸分子と光学的に標識された一本鎖ヌクレオチドを反応させる工程；ならびに
    （ｉｉｉ）光学顕微鏡を使用して該平坦な固相表面上に伸長し固定された核酸分子を画像化し、ハイブリダイゼーション反応産物を検出する工程を含む、上記方法。
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