JP2009022284A - 顕微鏡的イメージングにより核酸の物理的特性を測定する方法 - Google Patents
顕微鏡的イメージングにより核酸の物理的特性を測定する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009022284A JP2009022284A JP2008197050A JP2008197050A JP2009022284A JP 2009022284 A JP2009022284 A JP 2009022284A JP 2008197050 A JP2008197050 A JP 2008197050A JP 2008197050 A JP2008197050 A JP 2008197050A JP 2009022284 A JP2009022284 A JP 2009022284A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- acid molecule
- molecule
- immobilized
- molecules
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 472
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 370
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 367
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 367
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 title claims description 90
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 165
- 238000013507 mapping Methods 0.000 claims abstract description 150
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 92
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 claims abstract 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 269
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 94
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 89
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 78
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 61
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 58
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 58
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 44
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 41
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 32
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 claims description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 17
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 16
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 9
- -1 polymerase Proteins 0.000 claims description 9
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 claims description 8
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims description 7
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 7
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 claims description 7
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 7
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims description 7
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 6
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims 8
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims 4
- 108091027568 Single-stranded nucleotide Proteins 0.000 claims 3
- 239000002801 charged material Substances 0.000 claims 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims 2
- 239000005357 flat glass Substances 0.000 claims 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 claims 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 claims 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 206
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 abstract description 22
- 230000003094 perturbing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 223
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 146
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 82
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 81
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 78
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 78
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 74
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 64
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 58
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 52
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 49
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 46
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 44
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 43
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 43
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 41
- 230000008569 process Effects 0.000 description 36
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 33
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 31
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 31
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 26
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 26
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 25
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 25
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 25
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 24
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 24
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 23
- GTSMOYLSFUBTMV-UHFFFAOYSA-N ethidium homodimer Chemical compound [H+].[H+].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2C(C)=[N+]1CCCNCCNCCC[N+](C1=CC(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C=C11)=C1C1=CC=CC=C1 GTSMOYLSFUBTMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 23
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 21
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 21
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 description 20
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 description 20
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 20
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 20
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 18
- 230000006870 function Effects 0.000 description 17
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 17
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 17
- GRRMZXFOOGQMFA-UHFFFAOYSA-J YoYo-1 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=C2N(C3=CC=CC=C3O2)C)=CC=[N+]1CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=C1N(C)C2=CC=CC=C2O1 GRRMZXFOOGQMFA-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 16
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 15
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 14
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 14
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 14
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 14
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 13
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 13
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 12
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 12
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 12
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 11
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 11
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 10
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical group [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 10
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 10
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 10
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 10
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 9
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 9
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 8
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 8
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 8
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 8
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 8
- LXAHHHIGZXPRKQ-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-2-methylpyridine Chemical compound CC1=CC=C(F)C=N1 LXAHHHIGZXPRKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 7
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 7
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 7
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 7
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 7
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 7
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 7
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 7
- 210000000415 mammalian chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 6
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 6
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 6
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 6
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 241001354471 Pseudobahia Species 0.000 description 5
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 5
- 238000003705 background correction Methods 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 5
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 description 5
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 238000006303 photolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000015843 photosynthesis, light reaction Effects 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 208000030555 Pygmy Diseases 0.000 description 4
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 4
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 4
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 4
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 4
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 4
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 4
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 4
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 3
- 238000003491 array Methods 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 3
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 3
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 3
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 3
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000008832 photodamage Effects 0.000 description 3
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 3
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- FKXGYESXGMKAKC-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[bis(carboxymethyl)amino]-2-(4,5-dimethoxy-2-nitrophenyl)ethyl]-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound COC1=CC(C(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C([N+]([O-])=O)C=C1OC FKXGYESXGMKAKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005653 Brownian motion process Effects 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 108010066072 DNA modification methylase EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- BVTJGGGYKAMDBN-UHFFFAOYSA-N Dioxetane Chemical compound C1COO1 BVTJGGGYKAMDBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 2
- 108010042546 GCGGCCGC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000935974 Paralichthys dentatus Species 0.000 description 2
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 238000005537 brownian motion Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 2
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 2
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 150000004756 silanes Chemical class 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- 238000007794 visualization technique Methods 0.000 description 2
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 2
- KPZGRMZPZLOPBS-UHFFFAOYSA-N 1,3-dichloro-2,2-bis(chloromethyl)propane Chemical compound ClCC(CCl)(CCl)CCl KPZGRMZPZLOPBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VKWMGUNWDFIWNW-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-1,1-dioxo-1,2-benzothiazol-3-one Chemical compound C1=CC=C2S(=O)(=O)N(Cl)C(=O)C2=C1 VKWMGUNWDFIWNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ILBKBRBXCXDCFB-UHFFFAOYSA-N 4-(1h-indol-2-yl)benzene-1,3-diamine Chemical compound NC1=CC(N)=CC=C1C1=CC2=CC=CC=C2N1 ILBKBRBXCXDCFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023043 Alu Element Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N Azide Chemical compound [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 1
- 108010092265 CCWGG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010028347 Muscle twitching Diseases 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- ZCQWOFVYLHDMMC-UHFFFAOYSA-N Oxazole Chemical compound C1=COC=N1 ZCQWOFVYLHDMMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010034960 Photophobia Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- GYDJEQRTZSCIOI-UHFFFAOYSA-N Tranexamic acid Chemical compound NCC1CCC(C(O)=O)CC1 GYDJEQRTZSCIOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010047571 Visual impairment Diseases 0.000 description 1
- ULHRKLSNHXXJLO-UHFFFAOYSA-L Yo-Pro-1 Chemical compound [I-].[I-].C1=CC=C2C(C=C3N(C4=CC=CC=C4O3)C)=CC=[N+](CCC[N+](C)(C)C)C2=C1 ULHRKLSNHXXJLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N argon Substances [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- ZYVSOIYQKUDENJ-WKSBCEQHSA-N chromomycin A3 Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@@H]1OC(C)=O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](OC(C)=O)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@@H]1C[C@@H](O)[C@@H](OC)[C@@H](C)O1 ZYVSOIYQKUDENJ-WKSBCEQHSA-N 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013075 data extraction Methods 0.000 description 1
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000002019 doping agent Substances 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 108010044076 endodeoxyribonuclease XmaIII Proteins 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000001317 epifluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 239000004312 hexamethylene tetramine Substances 0.000 description 1
- 235000010299 hexamethylene tetramine Nutrition 0.000 description 1
- VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N hexamethylenetetramine Chemical compound C1N(C2)CN3CN1CN2C3 VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013090 high-throughput technology Methods 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 238000003702 image correction Methods 0.000 description 1
- 238000003709 image segmentation Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000012966 insertion method Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000005468 ion implantation Methods 0.000 description 1
- 150000008040 ionic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 208000013469 light sensitivity Diseases 0.000 description 1
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 1
- 238000011326 mechanical measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 description 1
- 230000005499 meniscus Effects 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 1
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 102000044158 nucleic acid binding protein Human genes 0.000 description 1
- 108700020942 nucleic acid binding protein Proteins 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 1
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001853 pulsed-field electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 238000004621 scanning probe microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004574 scanning tunneling microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 239000012453 solvate Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- G01N15/149—
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
- G01N2015/0038—Investigating nanoparticles
-
- G01N2015/1021—
-
- G01N2015/1022—
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
- G01N2015/1493—Particle size
- G01N2015/1495—Deformation of particles
Abstract
【解決手段】変形可能な分子または変形不能な分子に、コンホメーションの変化または位置の変化を起こさせる外部力をかけて、その変化を測定する。適した方法としては、1)混乱させる力(perturbing force)の向きを変えるときに分子が新たな方向に向くようになる速度を測定する、2)外部力の終了後に変形可能な分子が緩和状態にもどる速度を測定する、3)分子が回転する速度を測定する、4)分子が部分的に伸長するとき、その分子の長さを測定する、または5)球形もしくは楕円形の分子の直径を測定することが含まれる。これらの測定は画像情報処理装置または分光学的装置に接続した光学顕微鏡を使って行うことができる。核酸の制限酵素消化物のサイズを決定してその位置をマッピングするのに使用することができる。
【選択図】なし
Description
核酸分子の迅速で効率のよい解析および/または操作を可能にするようなやり方で単一核酸分子を迅速、制御可能、再現可能に伸長させるために、さまざまな方法を利用することができる。こうした技法には、例えばゲルベースの技術(第5.1.1 節)、固相表面ベースの技術(第5.1.2 節)、そしてフローベースの技術(第5.1.3 節)が含まれ、それぞれを以下で別個に説明することにする。
単一核酸分子の伸長のためにゲルベースの技術を利用できる。ここに記載するゲルベースの技術は核酸分子の生物学的機能を維持し、さらに、伸長した単一核酸分子の操作および/または正確な分析を可能にする。このようなゲルベースの技術によって迅速に効率よく分析される核酸分子には、約20kbから哺乳動物の染色体サイズの長さ(すなわち1000kb以上)までの鎖長範囲の核酸分子が含まれる。さらに、このようなゲルベースの技術の使用により、動的な測定法の利用が可能であり、比較的低いレベルの核酸の剪断が生じ、また、伸長した核酸分子を操作する際に広範囲の生化学的活性の利用が可能である。
固相表面ベースの技法は、本節に記述するように、個々の核酸分子の迅速な、制御可能で、かつ再現可能な伸長および固定のために利用することができる。個々の核酸分子を本節に記述するように固相表面上で伸長および固定したならば、第5.3節に記載の解析および/または操作技法の任意のものを容易に実施することができる。
核酸分子を固相表面に結合させた過去の例とは違って、ここに記述する制御された、再現可能な固相表面伸長/固定技法は、表面、特に個々の核酸分子を再現可能な形で伸長し、固定するガラス表面を利用するものである。第5.1.2.2節に詳述するように、ここに記載の表面は陽電荷密度を示す。しかし、例えば第5.3節に記載のゲノム解析技法が実施できるように固相表面電荷を最適化するためには、数種類のパラメーターを考慮に入れなければならない。
個々の核酸分子の光学的伸長および固定のために、種々の簡便な操作により固相の平らな表面を調製することができる。第一に、例えば表面を誘導体化して陽電荷密度を生じさせることができる。この陽電荷密度は、第5.1.2.1節に記載のアッセイを利用して最適化することができる。さらに、簡便な操作を実施して表面陽電荷密度を可逆的に調節し、核酸伸長、固定分析および/または操作工程の各工程においてより正確に表面電荷密度を最適化することができる。このような可逆的な電荷密度の調節を以後「任意固定(facultative fixation)」と呼ぶ。第三に、個々の核酸分子の伸長/固定にさらに影響を及ぼす別の方法が論じられる。これらの方法には、例えば制御された乾燥、陽電荷密度勾配の生成、および伸長された核酸分子の架橋のための方法が含まれる。
核酸分子との相互作用を恐らくは助ける陽電荷密度を作り出す任意の方法を用いて、表面を誘導体化することができる。対象の表面に吸収され、または共有結合し、そして陽電荷密度を表面に導入する任意の化合物を誘導体化剤として利用することができる。このような化合物は、好ましくは、蛍光性であってはならない。例えば、対象の表面に吸収される、または共有結合する、アミノ基を含有する化合物を用いて表面を誘導体化することができる。そのようなアミノ基含有化合物は、例えばガラス等の表面に共有結合することができるアミノ基含有シラン化合物を含み得る。これらのアミノ基含有シラン化合物には、3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)、3-メチルアミノシランが含まれる。酸化に抵抗するという点で3-メチルアミノシランの使用がある場合には有利であるが、APTESは架橋が可能であるという点で有用であり得る。
ここでは固相表面の陽電荷密度の可逆的調節方法を記述する。このような方法は、伸長、固定および解析/操作工程の各工程において固相表面電荷密度を最適化するために設計されている。このような可逆的な電荷密度の調節をもたらし得る方法には、塩濃度、二価カチオン濃度、有効水濃度、および/またはpHの変更が含まれる。
誘導体化の勾配: 全固相表面の均一な、制御可能な誘導体化に加え、再現可能な形で誘導体化の勾配を形成することもまた可能である。このような誘導体化の勾配は、例えば固相表面上に置かれた誘導体化剤の液滴を用いて形成することができる。表面に置かれると、このような液滴はメニスカス(meniscus)を形成し、固相表面にとって利用可能な誘導体化剤が液滴の内部よりも周辺部分でより高濃度となるであろう。これが次に、誘導体化の勾配をもたらし、固相表面の内部におけるよりも外部において液滴が高いレベルの誘導体化を示す。
上に記述したように、広範なサイズの核酸分子を本発明に記述する誘導体化固相表面に付着させることができる。具体的には、このような固相表面を用いて約300塩基対から1000 kb以上の核酸分子を分析することができる。比較的剪断抵抗性である小さい核酸分子は、当業者に周知の標準的核酸精製技法を用いて単離することができる。これらの小さい核酸分子は約150 kb未満であり得る。一般的にはそれらは約20 kb未満である。剪断現象による破壊を受けやすい大きい核酸分子は、例えば第5.1節に記載の核酸分子単離技法を利用して単離することができる。このような剪断感受性核酸分子は一般に150 kbより大きいが、約20 kbより大きい分子を含み得る。
本発明の個々の核酸分子を本節に記述するようなフローベース(flow-based)の技法によって伸長し、操作しおよび/または解析することができる。このような技法は、対象の核酸分子が低濃度でしか使用できない場合に特に有用であり得る。
技法
本発明によれば、対象となる種々の分子パラメーターの推定値を得るための多数の異なる技法を用いて、伸長され、そして恐らく固定された単一核酸分子をイメージングし、サイジングすることができる。この目的のため、本発明の好ましい実施態様において、イメージングされる分子はまず一般的に分子のサイズに比例して分子に吸収される蛍光色素を用いて染色される。次に、以後のプロセシングのために分子のデジタル画像を生成する。特に、画像化された分子のサイズを、適切な光源を用いて分子を照らした時の分子の蛍光強度の測定、デジタル化した分子の輪郭の測定、または一連のデジタル化画像を用いて測定した分子の緩和の力学から決定することができる。本発明の異なる実施態様による核酸分子のイメージングおよびサイジング工程を以下により詳細に述べる。
本発明による第1のプロセシング工程は、対象となる分子を後のイメージングに使用可能とするために染色することである。下記の表は、本発明の好ましい実施態様においてイメージングの目的のために用いられる蛍光色素を纏めて示す。
A) DNA輪郭染色
(PI) 330 および520 620
DAPI 350 460
Hoechst 33258 360 470
キナクリン 455 495
クロモマイシン 430 470
B) ハイブリダイゼーション
部位標識
FITC 490 520
TRITC 554 573
XTRITC 580 600
TR 596 620
AMCA 350 450
CY5C 646 663
本発明によれば、分子を蛍光ビーズおよびアルカリホスファターゼを使用する化学発光標識を使用してイメージングすることができる。一般に、直径がちょうど 0.01 μm である最も小さいビーズを含む単一蛍光ビーズは、蛍光顕微鏡により容易にイメージングされる。蛍光ビーズは、画像処理として単一DNA分子を標識するための信頼できる方法を提供する。なぜならば、個々のビーズは蛍光が強く、形態学的に区別可能であり、スペクトル特性が異なる広範囲の蛍光色素が手に入り、オリゴヌクレオチドに容易に結合するからである。(しかし、実際には、レイリー限界を超えると、ビーズは、画像処理には不適切な輝点として現れる。)ラテックスビーズは、例えば、Molecular Probes, Inc.によって市販されており、カルボキシレート、アビジンまたはストレプトアビジンで被覆されて、6種類のスペクトル(色)および0.01〜2 μm の範囲のサイズで市販されている。カルボキシレートで変性したビーズおよびストレプトアビジンで被覆したビーズは、ビーズをDNA分子に結合させるための多くの代替物を提供する。
サザンブロット法(および他の方法)での非同位体検出に対するオリゴヌクレオチドの化学発光標識は、特にその感度が高いことから、よく用いられる標識法である。その方法は、一般に、アルカリホスファターゼをオリゴヌクレオチドに結合させ(市販の系を使用)、次いで標的DNAにハイブリッドさせることから成る。ハイブリッドの形成後、化学発光基質、通常は、急速に分解して化学発光発生化合物になる1,2−ジオキセタンを添加する。次いで、最大 470 nm で、半減期が 2〜30分である光を、化学環境に応じて照射する。
本発明によれば、分子イメージングの別の方法は、蛍光色素で標識したDNAとオリゴヌクレオチドに結合したビーズとの間のエネルギー移動を使用することである。励起は、DNA−蛍光色素複合体を供与体とし、ビーズを受容体とするように選択することができる。しかし、この場合、ビーズは、供与体の100 Å以内にいる場合にのみ蛍光を発することができ、エネルギー移動の効率は、距離とともに急速に低下する。種々の顕微鏡フィルターを組み合わせた蛍光顕微鏡を使用したエネルギー移動イメージングは、供与体、受容体、および供与体−受容体対(これらは、都合のよいことに、照射経路に入ったり出たりする。)の可視化を可能にする。本発明の好ましい態様によれば、使用に好ましいエネルギー移動供与体は、臭化エチジウムまたはホモ二量体である。なぜならば、これらの蛍光色素はしっかりと結合し、結合すると、蛍光量が急激に増加するからである。なお、この方法の使用による潜在的な問題は、遊離蛍光色素が供与体として作用し得ることであるが、恐らくあまり影響ない。遊離蛍光色素の存在が実際に問題となる場合、イメージングされるフィラメントは2つの部分に別れる可能性があり、蛍光ビーズは、頭−頭構造で結合して、エネルギー移動イメージングに対して受容体−供与体対として作用する可能性がある。
単一核酸分子に関連する物理的パラメーターの定量的測定法は、物理的ゲノム分析の本質的に全ての面で非常に重要である。特に有用なのは、単一DNA分子または制限酵素消化物から得られる断片のサイジング技術である。それは、高分解制限酵素地図の作成に使用できる。パルス電気泳動は、大きいDNA分子を適切に分離することが分かっているが、正確なサイジングは、他の種々の環境では問題が残っており、同様の方法を使用した独立したサイズ測定値はない場合が多い。
静的分子サイジング技術は、測定すべき分子を平面に固定し、それを蛍光染料で染色し、分子の画像を得て、イメージングした分子の、目的とするパラメーターとの関係が知られているパラメーターを測定することを基本とする。本発明によれば、静的測定で使用する場合、サイジングすべき分子はまず、上記第5.1 に記載した方法のいずれかを使用して、伸長し、平面上に固定する。必要であれば、固定分子を消化するために制限酵素を添加することもできる。そのような場合、マグネシウムイオンを中に拡散させて消化を誘発し、その後、制限部位を、伸長したDNA分子の増大ギャップとして可視化することができる。このイメージング法は、分子を直接可視化することができるので、簡単で効果的であり、感度が優れている。本発明の好ましい態様によれば、分子は、第5.4 節で詳述したスポット法を使用して伸長し、固定する。この方法では、溶液の小滴を規則的な格子状で平面誘導表面上に付着させ、乾燥させる。例えば図26A、BおよびCに示されるように、スポットが乾燥した後、分子は、「日輪」の形状で表面上に伸長され、固定された状態を維持している。
本発明の特定の態様によれば、分子のサイジングは、蛍光染色した分子の強度の測定を使用して行うことができる。この測定法は、分子のサイズが、分子が吸収できる蛍光の量に比例するという観察に基づいており、その量は、分子をイメージングすることにより推定できる。特定の態様では、蛍光染料の量、すなわち分子サイズが、絶対蛍光強度の測定を使用して決定される。しかし、この方法では、照射源は、正確な測定値を得るために、非常に安定して、再現性のある光出力を提供しなければならない。実際には、絶対強度測定は、イメージング装置の正確な検定を必要とするが、不正確な場合が多いという事実から、分子のサイズは、基準物質、すなわち画像視野内でサイズが既知である分子の強度と比較した相対的強度を測定して決定するのが好ましい。実際には、基準物質は、単にイメージング分子の一部から成る場合が多い。
本発明の第二の態様によれば、静的核酸分子のサイズを測定する別の方法は、分子をイメージングし、その輪郭の長さを、対応するデジタル化画像の長さを測定することによって推定することである。下記に説明するように、イメージングした分子の長さから、分子のサイズを適切に推定することができる。
1989) 。イメージングされた分子などの物体の中央軸がいったん決定されると、その見かけの長さは、その軸に属する連結画素の数を単に数えるだけで容易に計算できる。理解されるように、輪郭の長さの測定による方法は、ロープの長さの測定に似ており、簡単に実行できるので、自動化も容易であると考えられる。
同様に、断片の一方(例えば、y)が後に切断されてサブ断片uおよびvになる場合、例えば断片uのサイズは、次のように計算される。
一連の切断に対しては、各セグメントの相対的サイズを、全断片の測定値の和に対するセグメントの測定値(x)の比として同様に本発明に従って計算する。
動的緩和を使用する断片サイズの測定は、上記第5.2.2.1.節に述べた静的方法に対して重要な利点を有する。というのは、静的サイジングでは、分子が最適に伸長されることが重要である場合がある。過伸長または準最適に伸長した分子は、絶対的長さに基づく静的測定を使用して正確に測定することができない。なぜならば、この場合の分子の質量に対する関数的関係は、伸びの量に依存するからである。(しかし、先の節に述べたように、相対的サイズの測定は、分子の伸長の量の影響を受けない。)さらに、静的サイジング技術を使用する場合の特定の問題は、固定が不完全であると、不適切に固定された断片は、緩和が早まる傾向にあるということである。これは、すなわち、サイジング測定の正確さに悪影響を及ぼし得る。他方、DNAの表面への強い固定は、典型的には、一般に目に見えるギャップを得るために局部的緩和を必要とする切断部位の確認を妨げる。(しかし、本明細書に記載する任意の固定化法は、この問題を適切に処理する。)
本発明のOCM分子サイジング法は、線状DNA分子がゆるいゲルマトリックス中での電気泳動中に障害物にひっかかると、ほぼ完全に伸びて、数秒間持続し得る準安定なフックを形成するという観察に基づいている。そのようなゆるいマトリックスは、例えば、第5.1.1.節に記載したように、カバーグラス−アガロースゲルの界面に形成され得る。この場合のゲル−カバーグラスの界面は、2、3μm の深さのゆるいマトリックスから成る。これは、DNA分子が捕らえて、上にフックを形成するのに便利な一連の「ペグ(pegs)」を提供するので、OCMサイジング法の使用には理想的である(図9参照)。つなぎ留められた、または一時的に捕らえられたDNA分子の完全な伸長には、比較的弱い電界(例えば、 5〜30ボルト/cm)で十分である。フックのアームを同様にサイジングする場合、分子は、そのほぼ完全な輪郭の長さに伸ばすことができ、それは、次いで、標準的イメージング技術を使用して容易に測定することができる。OCMサイジング法を使用した本発明の好ましい態様によれば、観察される最も長いフックの輪郭の長さは、迅速に集められた一組の画像から決定され、得られた画像をデジタル的に処理することにより、分子の長さが決定される。
本発明の好ましい態様に従って使用される粘弾性測定技術は、コイルのコンホメーションを混乱させて、分子がランダムな状態に戻るのに要する時間を測定することに基づく。測定される緩和時間は、分子量に対する感度がかなり高く、ほぼM1.66として変化する。この測定法では、所定のサイズ分布内で最も大きい分子が測定される緩和を支配し、その結果、サイズ混合物は、典型的には完全には分析できない。
本発明のもう一つの態様に従って、「ベースライン」測定として知られているものを用いて単一分子サイジング(single molecule sizing)を行うことができる。特に、長さの時間に対する明白な依存性を示す典型的なDNA緩和プロット(DNA relaxation plot) によって、いくつか(通常4〜5) の緩和の測定値の平均であるプロットされた点が与えられる。そのようなプロットは、分子の測定された長さが指数関数的に低減すること、そして重要なことにはその分子は球形のランダムコンホメーションまで十分に緩和しないことを示す。それどころか、太くて短い棒状物に似ている準平衡構造が形成される。そのような棒状物の形成は、指数関数的な減少の終わりの合図である。非常に緩慢な緩和プロセス(これは、分子サイズの3乗、すなわちM3に比例し得る)が依然として生じているが、それらは異なる性質のものであり、異なる時間スケール上で進展するものである。
(1) 電場を生じさせ、そして選択された分子を場の方向を変えることによって視界に保持する。フック(hook)が形成された場合、1つのフックアームがその頂点から離れる前にすぐに電場を消滅させ、次いで画像の収集を開始する。正確な画像化には、分子全体に焦点が合うことが必要である。
〈L(t)〉=A exp(-t/τ)+〈L〉
を用いて曲線をフィッティングし、緩和時間τの推定値を得る。
〈L〉(ピクセル)= 0.345 SIZE (kb)−32(1ピクセル=0.27μm)
τ(秒)= 0.017 SIZE1.45 (kb)。
本発明のさらなる態様には、種々の測定技術を用いる分子サイジングが包含される。特定の態様においては、分子サイジングは、例えば種々の方向に加えられた連続した電場を用いる少なくとも1つの外部力の支配下にある分子の再配向(reorientation) 時間を測定することによって行われる。このアプローチは下記の実施例6に記載されており、図4A及び5Jに例証されている。下記のその実施例に記載されたプロセスを用いることによって、パルスフィールド電気泳動中にDNA分子の小塊列(blob train)が加えられた電場により非常に複雑な様式で配向すること、そしてこのプロセス中に電気泳動移動度が配列が完全になるまで、例えば分子が加えられた電場にそって配列されるまで、減速するということが測定された。電場の方向の変化によって、小塊列は同時に幾つかの新たな方向に向きを変える(すなわち小塊が独立に少々動いているように見える。)。結局、小塊列のある部分は加えられた電場によって再配向することにおいて優勢であり、残りの小塊をゲルを通るその作り出された路に沿って引っ張る。完全な小塊列配列に必要な時間はサイズに比例して変化する。すなわち、10mb(1mb=1,000kb)の分子は再配向に1時間を要する一方、同様の電場の強さを用いた場合、10kbの分子はわずか10秒を要するのみである。この現象は図4に例証されている。再配向は、光学顕微鏡検査法及び分光光学的方法と組み合わせた顕微鏡検査法を含む種々の方法で測定される。
frot =8πηL3 /3{(J−Yrot ) }
上記式中、ηは粘性率であり、Yrot =1.57−7(1/J−0.28) 2であり、J=ln(2L/b)であり;L及びbは、それぞれ棒の長軸及び短軸の半分である。分子回転緩和時間に有用な式は、
τr =frot /kT =4πηL3/9{(J−Yrot ) }
によって与えられる。
本節では、本発明に従った分子サイズ測定の精度を増大させるために用いられる統計学的技術の簡単な概略を提供する。この方法は、所望のパラメーターの一群の推定値を得て、公知の統計学的誤差分析基準に従ってパラメーター推定値を操作することに基づくものである。概念的に、上記の方法の中のどれか一つを用いる所望のサイズの分子の各測定値は、測定誤差のない、真の量の推定値と解釈することができる。しかしながら、特定の測定値がそれほど不正確ではないという保証はなく、その場合推定パラメーターは分析に役立たない。このような確率を低減させるためのよく知られた方法は、一群の測定値を取り、平均値(全ての測定値の合計を測定値の数で割ったもの)を用いることである。他方、サンプル分散の測定によってどの程度測定値が正確であるか、すなわちどの程度測定値が仮説の理想値に近いかの評価が与えられる。
ここでは、本発明の単一伸長分子を高分解能ゲノム分析情報の迅速な作成に利用し得る方法を記載する。そのような方法には、下記のように、光学的マッピング及び光学的配列決定技術の両方が含まれる。
本発明の光学的マッピング技術は、高分解能制限地図を迅速に作成するための制限部位の直接的な秩序立った(ordered) マッピングを可能にする。簡単に言うと、そのようなマッピング技術には、単一核酸分子の伸長及び固定、1以上の制限酵素による分子の消化並びに得られる制限断片の視覚化及び測定が包含される。消化される単一核酸分子は固定されているので、得られる制限断片はレジスター中に残っており、それらの順序は直ちに明らかになり、迅速な制限地図は即座に作成される。
本発明の伸長し、固定された単一核酸分子を、その固定された核酸分子上に存在する特異的な、公知のヌクレオチド配列を同定するために計画された方法の一部として利用することができる。そのような方法は、ここでは「光学的配列決定」方法と称する。一つには、これらの方法にはむきだしの核酸分子(例えば、クロマチン状態にはないもの)の分析が包含されるので、光学的配列決定は、in situ ハイブリダイゼーションのようなクロマチンに基づく検出スキームでは可能性のないレベルの分解能を提供することができる。光学的配列決定方法は、一般に、ハイブリダイズした核酸分子の位置を画像化することによって同定することができる手法における、本発明の単一伸長固定核酸分子内に存在する少なくとも一つのヌクレオチド配列への1本鎖核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションを含む。画像化は、例えば、上記の5.2.節で記載したような技術を用いて行うことができる。画像化されたハイブリダイゼーション産物の位置は、例えば、上記の5.2.節で記載したサイジング技術を用いて同定することができる。
本明細書に記載した光学的マッピング技術および光学的配列決定技術は、マッピングを定方向様式で行ってもよいように組み合わせてもよい。このような技術を本明細書中で“定方向光学的マッピング”という。このような技術は、一層の高分解能マッピング分析についてゲノムの特定部分を標的とするために機能する。特に、目的の特定配列を含む単一の核酸分子を、単一の核酸分子の集団中に存在する全単一核酸分子の中から同定することができる。目的の配列を含む特定核酸分子を一旦選びだすと、このような核酸分子を更に分析することができる。
本発明の高処理量の自動化システムおよび方法は、上記の光学マッピングおよび配列決定アプローチに基いており、かつ操作者からのインプットを殆どまたは全く必要としないで、PCR産物、クローンおよびYAC の高速、高分解能のマッピングおよび配列決定を提供することができる。
本発明の好ましい実施態様によれば、分子スポッティングおよび固定のために、自動化された、高速の表面ベースの方法を使用する静的な分子測定用の新規なシステムが開発される。
先の節で説明したように、望ましいDNA固定化属性は、高度の分子延長、生化学的活性の保存および大きな付着速度における再現性を含む。更に、ゲノム分析のための高処理量システムの開発は、固定アプローチが、大きなサンプル付着速度、高い格子状に配列したサンプル密度および配列されたサンプルへの簡素化されたアクセスを提供することを必要とする。これらの固定の性状のいずれかについての不適切な応対処置は、おそらく分析を不当に複雑なものとし、そのコストを増加させる。
図31は格子状に配列したYAC DNA の高処理量の光学的マッピングに使用する本発明のシステムの簡素化されたブロック図である。図31中のシステムは、YAC 分析のためのクローンスポッティングシステムおよび既存の自動化装置と容易にインターフェースで接続することができ、しかも複雑なサンプルの取扱い技術を欠いている研究所において有用な制限マッピングの適用である。
実験データより、溶融アガロース中で懸濁されたYACのサイジングされたDNA分子が、小液滴として表面に格子状に配列された時に伸長され、固定され得ることが示される。図31を参照しつつ、包埋手順を以下のように記載することができる。アガロース中に埋め込まれた少量のDNAを処理された表面110 に落下する。この工程後に、液滴が流れ、DNA分子が表面に粘着し、伸長する。この技術は哺乳類細胞のカリオタイピングに使用するスプレッディング手順と同様である。
本発明の好ましい実施態様では、前処理した表面に固定した分子のイメージングが、エピ−蛍光(epi-fluorescence)のために装備されたツァイス社のAxioplanまたはAxiovert135 顕微鏡 (グリーンの励起波長およびレッドの放射波長のためのフィルターパック、または好ましくはYOYOフィルターパック、490 nmの励起波長、510nmの放射波長)およびPlan-Neofluar 対物レンズ(16倍、100倍: Zeiss 製)を使用して行う。顕微鏡がHamamatsu C 2400 SITフォーカシングカメラおよびイメージングPhotometrics PXL Cooled CCD カメラに結合する。好ましい実施態様では、画像処理装置の空間分解能は12ビット/pel 生画像グレイレベル分解能および16ビット操作分解能で画像当たり1032×1316ピクセルである。
図33は図32に示される本発明の実施態様に従って画像収集プロセスを最適化し、シグナル対ノイズ比を最大にする方法を示す。その方法は、照明源からの迷光および散乱を排除するように、照明源の強度がゼロに下がったときに、カメラが画像を収集し、時間スロットに記録することができるインターバルを制限することに基く。
図34は、本発明の好ましい実施態様による高処理量の画像処理のブロック図である。
本発明の好ましい実施態様によれば、高処理量の光学的マッピングを利用して、クローン地図を作成する。この方法には、以下の工程が含まれる:
前述の第5.3.節で説明した光学的配列決定は、高処理量光学測定と併用する場合、特に重要になると思われるゲノム解析である。また、こうした高処理量の測定を、新規な配列決定技術と組み合わせて利用することができる。例えば、こうした測定を利用して、Sangerジデオキシ配列ラダーのサイズ分布を迅速に解析することができる。具体的には、標準的な技法により切り取られた分子を標識化または染色し、顕微鏡の台に乗せ、上述の回転拡散法を用いてサイズ決定する。
本発明の特定の実施態様によれば、第5.2.2.2.1.節に記載されているように、新しい物理的作用を利用して分子を伸長させ、かつ新しい処理方法を用いてリアルタイムで分子長を測定することによりOCM動的分子サイジングを改良すると、高処理量の方法を提供できる。
G細菌は、Fangman, W.L., Nucl. Acids Res., 5, 653-665 (1978)に記載されているように増殖させ、また、DNAは、無傷ウイルスを1/2 X TBE緩衝液(1X:85mM Trizma Base(ミズーリー州St. LouisのSigma Chemical Co.)、89mMホウ酸、および2.5mM EDTA二ナトリウム)に溶解し、次にエタノールより沈殿させることによって調製したが、パルス電気泳動解析および顕微鏡解析により判断するかぎり、この工程でDNAが切断されることはなかった。
実施例1のサンプルを顕微鏡用スライド上に置いた。サンプルをマウントするために、ピペットマンおよび剪断を減少させるように端部が切り取られたピペットチップを用いて、約3マイクロリットルのDNA‐アガロース混合物を、予め加熱しておいてスライドおよびカバーガラスに注意深く移した。調製されたスライドを、図1および図2に示すように小型パルス電気泳動装置中に配置した。残りの工程はすべて、室温で行った。サンプルを予め数分間電気泳動させ、緩和させた後、データの取得を行った。chrontrol time(カリフォルニア州San diegoのChrontrol Corp.)またはIBM ATコンピュータ内に格納され、Hewlett Packard 6115A高精度電源により電力供給されるAdtron data generating board(アリゾナ州GilbertのAdtron Corp.)のいずれかを用いて、パルス場を発生させた。場の強さは、Fluke digital multimeter(ワシントン州EverettのJ. Fluke Co.)に接続された補助電極を用いて測定した。DAPI蛍光に適したエピ蛍光光学素子およびZeiss 100x Plan Neofluar油浸対物レンズを備えたZeiss Axioplan microscope(西独のCarl Zeiss)を使用して、サンプルの可視化を行った。NDフィルターを使用して励起光を減衰させ、蛍光標識されたDNAに光損傷を与えないようにした。C2400 silicon intensified terget (SIT) camera(ニュージャージー州MiddlesexのHamamatsu Corp.)をIC-1 image processing system(ノースカロライナ州Research Triangle ParkのInovision Corp.)と接続して使用し、顕微鏡からのビデオ画像の取得および処理を行った。5秒または6秒に1個の割合で連続的に画像を取得し、1回の処理で200個におよぶデジタル化画像を格納できた。デジタル化された各時経画像は、30Hzで得られた8個のフレームを統合して得たが、これはコイル運動に起因するストリーキングを回避するのに十分な速さであった。時経取得が終了した後、顕微鏡の焦点をずらし、バックグラウンド画像を取得した。各時経画像の処理は次のように行った。最初に、バックグラウンド画像のコピーを減衰させ、平均バックグラウンド強度が平均時経画像強度の82%になるようにした。この減衰させたバックグウンドを、時経画像から差し引き、次に、得られた画像を線形伸長コントラスト増強アルゴリズムにかけた。処理された画像の写真を、Polaroid Freeze Frame video image recorder(マサチューセッツ州CambrigeのPolaroid Corp.)を用いて得た。
実施例2の分子に対してPOEによる摂動を与えた。所定の比を有する比較的短い一連の正規パルスを用いてPOEを行い、より長い時間を経過させた後、一方の電場の極性を切り換えた。切り換え時間および規格化電場比は、パルス時間および電場角のパルス電気泳動変数と同等である。
実施例1−3のGバクテリオファージDNAの緩和は、POE(3,5-80秒パルス、3ボルト/cm)を600秒間行った後で観測した。
実施例1〜3の手順により既知の分子量の分子をイメージング用に調製し、実施例1〜4の方法により該分子の緩和時間を測定する。イメージングにより緩和時間のデータを収集し、同様な組成のDNA分子の分子量と緩和時間との間の数学的関係を計算するのに使用する。次に未知のサイズの分子のサンプルの緩和時間を測定し、既知のサイズの分子に基づいて決定した数学的関係を使用してその分子のサイズを計算する。
ゲル中での再配向速度を測定することによる1以上の分子の分子量の測定
ポリマーは任意のサイズのものでよいが、特に小さすぎてイメージングできないもの(約0.1μ未満)について、印加電場により誘導される再配向速度を測定
することにより、アガロース、ポリアクリルアミドゲル等のようなマトリックス中でサイズを決定する。再配向測定は自由溶液中でも行えるが、マトリックスは不要なポリマーの対流や移動を防止するので好ましい。さらにマトリックスの存在によりサイズに対する感度を増強することができ、これは一つの理由として配向機序が異なることによる。再配向時間の測定にはPOE が特に有用であり、これはその実験上の融通性と、おそらく15〜20メガ塩基の非常に大きなサイズの解像力によるものである。DNA分子(150塩基対未満とサイズ測定されたもの)のような剛性のポリマーは、溶液中においてロッド状で存在し、回転拡散係数(その長軸の周りで回転させようとしたときにロッドが受ける摩擦) はM3に比例して変化する。顕微鏡観察法を使用すると、イメージングするのに十分大きな分子が可視化され、そのイメージから再配向時間が測定される。分子の任意のサイズについて、特に可視化するのには小さすぎるものについて、視野中の各ロッドの再配向時間を分光分析法で測定することが好ましい。二種類のそのような方法、即ち蛍光二色性及び複屈折によるものを以下に詳述する。
ゲル中での分子の回転時間を測定することによる1以上のDNA分子の分子量の測定
ロッド状あるいは剛性コイル形状の分子を調製し、アガロースゲルではなくアクリルアミドを任意に使用し得る以外は、実施例1〜4と同様に観察する。
ゲル中でのDNA分子の曲線長を測定することによる1以上の分子の分子量の測定
既知の分子量の分子について実施例1〜4の手順を行う。分子を可視化することにより、分子が混乱状態にあるときの分子の曲線長の測定値を収集し、分子量と長さとの間の数学的関係を計算するのに使用する。次に実施例1〜4の手順を使用して同様な組成で未知のサイズの混乱した分子の曲線長を測定し、既知のサイズの分子に基づいて決定した数学的関係を使用してその分子のサイズを計算する。図4及び5は、曲線長測定が可能な混乱状態の分子を示す。
ゲル中でのDNA分子の直径を測定することによる1以上の分子の分子量の測定
分子が完全に緩和状態にあるときに測定を行う以外は、実施例1〜4の手順を既知の分子量の分子について行う。実質的に球形あるいは楕円体形のGバクテリオファージDNA分子の一つまたは複数の直径の測定値を収集し、ゲル中のGバクテリオファージDNA分子の分子量と直径との間の数学的関係を計算するのに使用する。次に未知のサイズの分子の直径を測定し、既知のサイズの分子に基づいて決定した数学的関係を使用してその分子のサイズを計算する。図4(a)及び5(j)は、直径測定が可能な緩和状態の分子を示す。
イメージング用の大型DNA分子の製造
挿入法及びパルス電気泳動を用いてSaccharomyces cerevisiaeからの染色体DNA分子を調製し、単離した。低ゲル化温度アガロースゲル(FMC Corp. Rockland Maine)を調製に使用して比較的低温での溶融を可能とした。UV照射によりDNA分子が破壊され得るので、ゲルから切り出されるエチジウム染色された隣接する端部断面を目安として所望のバンドをゲルから切り出し、301 nmライトボックス装置で写真を取った。その後バンドの重量を測定し、水中の10 mM スペルミンの10倍過剰により室温で3時間平衡化した。スペルミンはDNAを縮合するのに非常に低いイオン強度環境を必要とするが、幸いなことに電気泳動に使用した緩衝液は低いイオン強度を有しているので平衡化の段階の必要性が排除される。平衡化されたサンプルを次に74℃のオーブンで2時間溶融し、溶融後DAPI(1μg/ml) 及び2-メルカプトエタノール(1%)を加えた。3 μlの溶融したアガロース/DNA混合物を予め温めた顕微鏡スライドに慎重に塗布し、混合物がゲル化する前にその上にカバースリップを置いた。そしてスライドを、100X Plan Neofluar対物レンズを装着したZeiss Axioplanエピ蛍光顕微鏡を使用して観察したところ、カバースリップサンドイッチの縁を通して、塩の添加により脱縮合され得る、非常に明るい小さな球状物が観察された。
Schizosaccharomyces pombe 染色体DNA分子の制限地図作成
約17〜19メガ塩基のゲノムサイズを有し、それが3、6 及び8 〜10メガ塩基のサイズの3つの染色体に配分されている真菌であるSchizosaccharomyces pombeのDNAを、実施例10の方法により縮合及び崩壊させないことにより顕微鏡観察のために調製する。3〜5μl のアガロース混合物は約0.1 ngのDNA、0.5%のβ-メルカプトエタノール、1 μg/mlのDAPI、100 μg/mlのウシ血清アルブミン (アセチル化物、Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) 及び10〜20ユニットの適当な制限酵素を含むものとする。この混合物を短時間37℃に維持し、顕微鏡スライド上に慎重に置き、そしてその上にカバースリップを置く。制限酵素による消化の前に、(1) 液体スライド/アガロース/カバースリップのサンドイッチを、カバースリップを動かすことにより任意に少し剪断するか、あるいは(2) 例えば図3に記載したPOE 装置を使用して電場を印加することの2種類の方法のいずれかによりDNAを伸長させる。そしてゲルが硬化したら、10 mM 塩化マグネシウム溶液をサンドイッチ中に拡散させる。マグネシウムイオンがDNA/酵素複合体に到達すると、酵素によりDNAが切断される。
単一のDNA分子に対する核酸プローブのin situ ハイブリダイゼーョン
上記実施例1〜4に記載したようにして顕微鏡観察用に核酸を調製する。核酸分子を含むアガロース媒体は、標識されたプローブ、及びプローブにより標的分子のストランド置換を媒介する組換え酵素、recAも含む。ストランド置換及び対形成はD-ルーピングにより起こる(Radding, C. Ann. Rev. Genet. 16:405-37 (1982)参照)。ATP 及びマグネシウムイオンを付加すると反応が開始される。これらの成分は、実施例11に記載したようにスライド/ゲル/カバースリップのサンドイッチ中に拡散される。反応物を37℃でインキュベートする。異なる標識を有するプローブを使用することにより多数の異なる標的分子が同時に分析される。
光学的マッピングにより構築されたSaccharomyces Cerevisiae染色体の順序付けられた制限地図
光学的マッピング(例えば図6 に示したような)により、制限酵素消化の間に染色された単一の、タンパク質を除去されたDNA分子のイメージが形成され、制限部位の直接の順序付けのマッピングが可能となる。簡単にいうと、流れ場(即ち原則として、あるいはその他の種類の電場) を使用して溶融アガロース中に溶解したDNA分子を伸長し、ゲル化の間に適当な場所にそれらを固定する。
fi=3kT/(2nib)((a2/nib2)-1)+(kT/b)InC
(ここでkはボルツマン定数であり、aはゲル細孔直径であり、niは関連するコイルセグメントの数であり、bはコイルセグメント長であり、Tは温度であり、Cはコイルセグメント構造に関連する定数である) で与えられると計算されている。この結果は、プールの間に発生する張力は孔容量内に含まれるセグメントの数に逆比例することを示している(Eq.1)。従って、伸ばされて伸長した分子は、コンパクトな緩和したものよりもより高い張力下にある。
見かけ長さの測定の物理的な基礎は単純である。すなわち、ゲルに包埋された制限断片のそれぞれが、平均して等しいコイル密度を有していると仮定する。すなわち、各断片は、多少なりとも伸張されるべき同一の変化を有していて、何枚かのマウントで生じる長さの平均が、相対サイズの良好な指標となるというものである。この場合も、相対見かけ長さは、染色体のサイズを乗じることによってkbに換算される。長さならびに相対蛍光強度は、ウェイン・ラスバンド(Wayne Rasband)のNIHイメージ・フォー・マッキントッシュ(NIH Image for Macintosh)(作者(電子メールhuff@mcclb0.med.nyu.edu)に依頼することにより入手可能)の改良版を使用して、16ビットの精度となるよう計算した。略述すると、もともとの未処理イメージを拡大フォーマットで表示させ、DNAを手作業でトレースして、オーバーレイイメージを作成した。長さマップは、このオーバーレイから直接作成した。強度の計算にあたっては、13ビットの生データイメージを平滑化し、オーバーレイイメージを5倍に広げて、すべてのフォアグラウンド画素をカバーした。オーバーレイ上にマークした各画素について、合成バックグラウンド値を、周囲画素の重みづけ平均として計算した。その際の重みは、距離とともに低減するものとしたが、マークされた各画素については、いずれもゼロとした。これらの値は、DNAが不在であったとしたら測定されたであろう値を近似すること意図したものである。特定のDNA断片の強度は、断片の全画素の総和から、対応するバックグラウンド画素の分を差し引いたものとした。断片の面積は、もとのオーバーレイを2倍に拡大したものであった。このプロセスを、オーバーレイイメージを有していた生データの各フレームに関して繰り返した(焦点ぼけしたフレームを除く)。強度の結果は、切断後の5イメージに関して平均し、2断片の相対サイズは、x/(x+y)ならびにy/(x+y)として計算した。断片yが、その後切断されてuおよびvとなった場合には、(y/(x+y))(u/(u+v))をuのサイズとして使用する。得られた数が、その後の分析に際しての1サンプルとなる。次に、制限断片の見かけ長さを換算したところ、4分子という少ない分子数でも良好な精度が得られた。サンプルを平均し、平均についての90%信頼区間を、t分布とn-1 d.f.、ならびにサンプルの標準偏差を使用することによって計算した。この計算は、データが、正規分布しているランダムなサンプルについてのものである場合には、有効であり、この信頼区間に集団の平均が存在する可能性が90%ある。染色体Iについては、報告する信頼区間は、短い断片から下限を、長い断片から上限を選ぶことによって計算した。集団の標準偏差についての90%信頼区間(図10の挿入グラフ)は、サンプルの標準偏差、サンプル数、ならびにカイ二乗分布とn-1 d.f.を使用して計算した。この区間の中央点を使用して、集団の標準偏差を推定した。変異係数(CV)は、推定集団標準偏差を、サンプルの平均で除したものである。プール標準偏差は、分散の平均の平方根である。相対誤差は、我々の値と報告値の差を報告値で除したものである。見かけ長さの相対的測定値は、蛍光強度の測定の場合と同様、制限断片の同じセットに対して検証した。それらの結果(図10B)から、16%(30kbならびに90kbの断片を除く)という同様の平均相対誤差が示される。プール標準偏差は47kbで(図10Bの挿入図)、変異係数の平均は29%であった。
図12には、光学的マッピングで作成した3種の整列させた制限マップを比較して示す(Link, Genetics 127, 681, 1991)。図示したバーは、図10にプロットしたNotI制限断片のサイジング分析の結果と対応する。図13には、NotIで消化した各種の酵母染色体DNA分子の蛍光顕微鏡写真を処理したものをいくつか示す。酵母染色体DNA(酵母株AB972)を、パルス電気泳動(D.C. Schwartz およびC.R. Cantor, Cell 37: 67 (1984))で、1.00%シーケム(Seakem)低融点アガロース(FMC)、1/2xTBE(42.5mMトリズマ塩基、44.5mMホウ酸、1.25mMEDTA二ナトリウム)を使用して分析した。切り出したゲルのバンドを、TE(10mM Tris-Cl、1mM EDTA、pH8.0)中で、繰り返し平衡化した。次に、ゲルに包埋された精製染色体を、0.1mg/mlアセチル化ウシ血清アルブミン、1%β−メルカプトエタノール、0.1%Triton X-100(ベーリンガーマンハイム(Boehringer Manheim)、メンブレーン等級)、および0.2μg/ml 4’,6’−ジアミノ−2フェニルインドールジヒドロクロリド(DAPI)を含有するマグネシウム非含有制限バッファー中で、ゆるやかにかきまぜながら、4°Cにて一晩平衡化した。50〜100μlの範囲の平衡化したサンプルを、72°Cで5分間にわたって溶融し、37°Cに冷却した。約0.3−0.5μlの酵素(2〜14単位/μl)をスライドガラスに塗布した。酵素反応は、製造業者の推奨する温度で行った。β−メルカプトエタノールを加えて光分解を抑制し(M.Yanagidaら、Applications of Fluorescence、D.L. Taylorら編のthe Biomedical Sciences に所収、Alan R. Liss、New York、1986、 pp. 321-345)、この濃度で、消化に悪影響が及ぶことがないかどうかを、電気泳動で調べた。7μlの溶融サンプルを、典型的には、大口径のピペットチップを使用して、18x18mmのカバーガラス上に(ゆっくりと)ピペット滴下し、すばやくスライドガラスに載せた。伸張度を制御するうえで、タイミングをあわせることとゲルを急冷することが重要である。次に、反応チャンバーを鉱油で密封して蒸発を防止し、アガロースを4°Cで30分以上にわたってゲル化させてから、50mM MgCl2を空隙から拡散させた。染色体I(240kb)ならびに染色体III(345kb)については、ゲル化の進行を速めて未熟分子の弛緩を防止する目的で、スライドガラスを冷えたデシケータ(4°C)に入れておいてから流延した。弛緩の進行が遅い大型の染色体については、スライドガラスを室温に保った。スライドガラスを、温度を37°C(CspIは30°C)に制御した顕微鏡のステージに置いた。これらの画像では、固定した分子中に空隙が現れ、その空隙が大きくなっていくことによって、消化の進行がはっきりと示された。こうしたデータ断片から、20秒ごとに得られた時間経過イメージを検討することによってオーダーを判定した。DNA分子のイメージングには、落射蛍光装置(紫外線励起ならびに青色放射用の487901フィルターパック)ならびに100倍あるいは63倍のプラン−ネオフルアー(Plan-Neofluar)対物レンズ(ツァイス(Zeiss))を備え、ハママツ(Hamamatsu)C2400SITカメラと組み合わせたツァイスのアクシオプラン(Axioplan)あるいはアクシオバート(Axiovert)135顕微鏡を使用した。カメラの制御装置を調整する際には、強度範囲の両端でデジタイザーが飽和することのないよう注意した。20秒ごとに32のビデオフレームを8ビットにデジタル化して、マッキントッシュベースのバイオビジョンイメージ処理装置あるいは画素パイプラインデジタイザー(パーセプティクス社(Perceptips Corp.))によって13ビットの精度とした。コンピュータ制御のシャッターを使用して、1イメージあたりの照明を1.5秒に制限して、代表的な実験については、合計で約135〜255秒となるようにした。ニュートラルデンシティーフィルターを使用して、対物レンズで測定される照明強度を100μW以下に保持した。対照実験では、こうした条件で、DNA分子に損傷が生じることはなかった。デジタル化した画像は、ディスクに直接記録し、テープに長期保存用に保管した。観察対象の分子は動く傾向があり、他の分子とのとりちがえが生じることもあるので、「切断配列」あるいは「切断動画」を観察することで、分子同士の相互作用の解析が簡素化される。光学的性質(長さあるいは強度)に基づいたマップと、電気泳動に基づいたマップとは、よく一致している。制限マップの3つめのタイプ(「Com」、図7)は、長さから誘導したデータと強度から誘導したデータとを組み合わせることによって得たものであり、小型の制限断片(<60kb)由来のデータは、長さによってサイズを測定し、一方、強度の測定値からは、マップを完成させるうえで必要な残りの断片サイズを得た。
ここに提示する実施例では、誘導化ガラス面上で伸展させ、固定した個々のDNA分子をイメージングすることによって、光学的マッピング法によるサイズ解像度を大幅に改善する。蛍光強度ならびに見かけ長さの平均をとることによって、800塩基対の長さの制限断片の塊を正確に測定することができた。具体的には、こうした固体表面に基づく光学的マッピング技術を使用して、マウスのピグミー遺伝子座に由来するラムダクローンの整列させた制限マップを作成した。
ポリリシンをコーティングしたガラス表面の調製
ガラス(182mm、Fisher Scientific)を、5M塩酸中で2〜3時間にわたって煮沸することによって清浄化し、高純度の水で濯ぎ、風燥し、その後、濾過済みのポリ−D−リシン(分子量、350,000、シグマ)の溶液(1x10-2〜1x10-8g/水1ml)中で一晩インキュベートした。いずれの溶液にも、蒸気滅菌水を使用した。
DNA分子は、落射蛍光装置ならびに100倍のプラン−ネオフルアー対物レンズを備えたツァイスのアクシオバート35顕微鏡でイメージングした。ハママツC2400SITカメラを使用して、クアドラ(Quadra)900コンピュータ上で作動する標準的な市販のソフトウェアで制御された冷却デジタルCCDカメラ(1032x1316画素)の焦点を合わせた。
分析したクローンは、マウスのピグミー遺伝子座にマッピングされたYACから構築したラムダFIXIIライブラリーに由来する。細胞を生育させ、標準的なプロトコールを使用することによって平板で生育させたファージに感染させ、市販のキット(キアジェン(Qiagen)、ドイツ)を少々改良を加えて使用することによってDNAを調製した。製造業者の指示にしたがって制限消化を行い、通常のパルスフィールドゲル電気泳動によって分析した。ゲルを臭化エチジウムで染色し、ポラロイドフィルムと紫外線トランスイルミネータを使用して記録した。
1μlの希釈クローンDNA(5ng/μl)を、1x制限バッファー(マグネシウムイオン非含有である以外は製造業者の指示通りに調製)、3%β−メルカプトエタノール、および0.2ng/μlのエチジウムホモダイマーに加えた。この溶液3〜4μlを、ドリルで3mmの穴をあけたスライドガラス上にピペットで滴下し、広げた。ポリリシンをコーティングしたカバーガラスを、レンズ用ティッシュペーパー(ロスティシュー(Ross Tissue)、ロスマリン社(Rosmarin Corp.))で拭って乾燥させ、スライドガラスの上に載せ、ワセリンと鉱油との混合物でシールした。カバーガラスとスライドガラスを重ね合わせたまま、顕微鏡のステージに載せ、制限エンドヌクレアーゼ(5〜10単位)の1x制限バッファー(製造業者の指示通りに調製)への希釈液5μlを、ドリル加工した穴を通してサンプルに拡散させ、室温にて15分間インキュベートした。
1μlのラムダDNA(ニューイングランド・バイオラボス(New England Biolabs))(5ng/μl)を、100μlの1xEcoRI制限バッファー(50mM NaCl、100mM Tris-HCl、および0.025%TritonX-100(pH7.5);マグネシウムイオン非含有)、エチジウムホモダイマー(0.2ng /μl)、5%β−メルカプトエタノールに加えた。4μlのサンプルを、清浄にした顕微鏡用スライドガラス(穴なし)上にピペットで滴下し、カバーガラスをかぶせ、各種濃度のポリ−D−リシン溶液(分子量350,000)中で16時間にわたってインキュベートした。各濃度について、カバーグラス上の20−30カ所の別々の位置をイメージングした。それぞれの位置のDNA分子の長さならびに数の平均を計算した。1イメージ視野あたりの利用可能な分子数を、DNA濃度、サンプル容量、イメージ面積から計算した。平均分子数の、溶液中の利用可能な分子数に対する比を計算し、ポリリシン濃度に対してプロットした。
上述の実施例13に記載した方法に若干の修正を加えて使用することによって、光学データからマップを構築した。略述すると、フラット・フィールド補正、バックグラウンド補正、セグメント化、画素値の積分、そして強度比の計算の工程でイメージ処理を行った。各断片の相対強度を計算し、既知の全体サイズを乗ずることによって、サイズ(単位、kb)を求めた。小型断片のサイズが、システム上、過小に算定されてしまうことを防止する目的で、経験にもとづいたカリブレーション関数を適用した。6.5kb未満の断片については、0.665で除した。大きめの断片については、調整を行って、既知の全体サイズを保全した。
ポリリシンをコーティングしたガラス表面へのDNA分子の固定
ポリリシンは、従来から、ガラス表面に細胞を固定するのに使用されてきている(Williams, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 2311-2315, 1977)。ポリリシンをコーティングした雲母の表面を屈折率の測定により詳細に測定したところ(Luckham およびKlein, Chem. Soc., Faraday Trans. I, 80:865-878, 1984)、ポリリシンのコイルは、表面に押しつけることによって、特性を変化させることが可能なことが示された。細胞生物学で、ポリリシンが広範に使用されていることからして、ポリリシンをコーティングしたガラスは制御が簡単で、生化学的にも適合性があるであろうと考えられた。表面誘導化に使用するポリリシンの分子量ならびに濃度は重要であり、多すぎると、分子が強固に固定されて生化学的に不活性になってしまい、少なすぎると、伸張したDNA分子が急速に緩んで、ランダムコイル状コンフォメーションに戻ってしまう。従来のアガロースを使用した光学的マッピングの方法論でも、まさにこうしたことが問題となり、そのうえで成功裏に解決されてきた。
まず、処理されたカバーガラスとスライドガラスの間にサンプルを挟むことにより、分子をポリリシンでコートした表面に固定した。DNAサンプルは、DNA、制限緩衝液からマグネシウムイオンを除いたもの、β-メルカプトエタノールおよび蛍光色素からなるものであった。エチジウムホモダイマー(Glazer et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:3851-3855, 1990)が、ほとんどの制限酵素と適合することが見いだされた。カバーガラスをシールし、スライドガラスの小さな穴を制限酵素とマグネシウムイオンの注入用に用いた。
蛍光顕微鏡の解像度は約0.1ミクロンで、これは約300bpのB-DNAにあたる。理論的には、より小さい分子も検出できるが、空間的な解像度は伴わない。ここに記載されたシステムに利用可能なサイズの範囲は、28kbから800bpにわたり(図17および18参照)、同じ親分子からの制限酵素断片の、相対的な見かけ上の長さおよび相対的な蛍光強度の測定に基づくものである。これは、上記の実施例13において、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)の制限マップを作製するために使った技術と同じものである。
図19に、マウスのPygmy 19座に由来するラムダFIX IIクローンの光学的マッピングにより作製されたEcoRIおよびBamH Iのマップを示す。表1は断片の大きさを示す。図20に、ポリリンカー部位で切断するので、切断していないクローンのPFGE測定によらなくても既知のベクターアームのサイズに基づいて絶対的ななサイズの算出が可能となるような酵素による典型的な開裂パターンを示す。表2に、ポリリンカー部位で切断する酵素(Sal I、Not IまたはSst I)による消化物のPFGE、蛍光強度、および見かけ上の長さの測定により得られた結果を示す。これらの酵素による光学的マッピングを用いて、クローンの全体のサイズを計算することができる。そして、この値をポリリンカーを切断しない酵素を用いた光学的マッピングについてのサイズを計算するために用いることができる。
表面上での光学的マッピングにより作製された酵母人工染色体の順序正しく配列された制限酵素のマップ
この実施例においては、個々のDNA分子から順序正しく配列された制限マップを迅速に作製するための、新規な表面マウント技術について記載する。特に、この技術はポリリシンでコートした誘導化されたガラス表面の利用を含む。この技術がうまく利用できることは、誘導化されたガラス表面にマウントした酵母人工染色体のDNA分子から作製された正確な光学制限マップにより証明される。
YAC、DNAの調製およびPFGE制限マッピング
ゲルインサートは、7H6、3I4、3H5、5L5および6H3という名前の5つのYACクローン(Murray and Szostak, Nature 305:189-93, 1983; Burke et al., Science 236:806-812, 1987) および酵母AB972株から、標準的なプロトコール(Schwartz
and Cantor, Cell 37:67-75, 1984; Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1, 6.10.1-5, John Wiley & Sons, New York, NY, 1994)に従って調製した。パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)をED装置上でおこなった(Schwartz et al., Nature 342:575-576, 1989)。YACのサイズはラムダDNAコンカテマーおよび酵母染色体に対する相対的電気泳動移動度を比較することにより測定した。7H6および3I4のPFGEマップは、異なる制限酵素で切断したYACのDNAにサザンブロット法を行うことにより作製した。ブロットは放射能標識されたヒトAlu反復配列プローブでハイブリッド形成された(Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991, 1984) 。3H5、5L5および6H3の順序正しく配列されたマップは、右および左のクローニングアームに由来するプローブを用いた部分的消化(Smith and Birnstiel, Nucleic Acids Res. 3:2387-2399, 1976)により作製した。
カバーガラスを95℃の過剰3M HCl中で2時間洗浄した後、高純度の精製水で完全に洗浄した。洗浄したカバーガラスを、新しく調製されたpH3.5の0.10M 3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES; Sigma)に65℃で時間を変えて液浸することにより誘導化した。APTESで処理した後、カバーガラスを高純度の精製水で完全に洗浄し、空気乾燥した。DNAをマウントするためのチャンバーを作るために顕微鏡用スライドガラスに直径1cmの穴をあけた後、この穴を二つのカバーガラスで挟んだ。まず、APTESで処理したカバーガラスをシリコン真空グリースで接着した。次いで、20μlの溶融したアガロースゲルにDNAを溶かしたものを、ピペットマンを用いてAPTESで誘導化した表面にゆっくりと拡げた。次いで、チャンバーの上部を処理していないカバーガラスで真空グリースを用いてすばやくシールした。チャンバーを45℃の加熱ブロック上で10-30分インキュベートして、溶融したアガロース中のDNAを誘導化されたガラス表面に移動させた。チャンバーを少し傾けて穏やかな液体の流れを作り、移動の間にDNAが広がるのを助けた。移動の後、チャンバーを4℃で5分間冷却し、ゲルを凝固させた。次いでチャンバーを開いて、3-5ユニットの制限酵素を適当な緩衝液で希釈したものをゲルの表面に加えた。再度チャンバーをシールし、37℃で1-2時間インキュベートした。消化の後、エチジウムホモダイマー(分子プローブ、0.1ng/mlエチジウムホモダイマー、15mM EDTA(pH7.5)および10% 2-メルカプトエタノール)またはオキサゾールイエローホモダイマー(YOYO-1)(分子プローブ、0.1ng/ml YOYO-1、15mM EDTA、pH7.5、および20% 2-メルカプトエタノール)のいずれかを用いてサンプルを染色した。高分子量のDNAの希釈。光学的マッピングのためにDNA分子をマウントする時にはDNAの濃度をコントロールすることが重要である。融点の低いPFGEゲル(Seaplaque、FMC)からバンドとして切り取られたDNA分子は、以下のようにマウントの前に希釈しなければならないことが多い。すなわち、ゲルバンドを0.01mMの四塩化スペルミン(Sigma)のTE緩衝液(10mMトリス、pH7.6;1mM E
DTA)中で2時間インキュベートする。この過程によりゲルに埋め込まれたDNA分子をせん断抵抗性の粒子の中に凝縮させ、希釈の間DNA分子を保護する。次に、72℃で7分間ゲルバンドを溶融し、0.01mMのスペルミンを含む溶融した低融点アガロースをさらに加えて混合する。この段階でボルテックスを行うと少量の外見上の切断がおきる。希釈したサンプルをゲルインサートにして(Schwartz and Cantor, Cell 37:67-75, 1984) 、次いでTE緩衝液を加えて30分間振とうする洗浄を5回繰り返してスペルミンを除去し、それによりDNA粒子の凝縮を解除する。一回目の洗浄は、100mM NaClを補ったTE緩衝液を用いておこなう。ゲルインサートを10mMトリス、0.5mM EDTA、pH7.6中で保存した。
エピ蛍光(epi-fluorescence)用の装置(緑励起および赤発光用のフィルターパック)およびHamamatsu C2400 SITカメラに接続された100X Plan-Neofluar対物レンズ(Zeiss)を装備したZeiss AxioplanまたはAxiovert 135顕微鏡を用いてDNA分子をイメージングした(実施例13)。典型的な100ミクロンの顕微鏡視野には3から5の分析に適した分子が含まれていた。制限酵素による消化の効率は既知の制限マップを用いて分子中のギャップを数えることにより点数化した。この研究に用いた酵素の間では消化効率に差異はなかった。制限マップは実施例13に記載した方法で作成した。
誘導化したガラス表面に大きいDNA分子をマウントするための最適条件
大きいDNA分子は移動の間に切断され易く(Albertsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4256-60, 1990)、表面にマウントするための作業の間にその完全な状態を維持するためには特別な努力が必要である。融解したアガロースは、1メガ塩基よりサイズの大きいDNA分子をマウントするためにとても効率よく使われてきたが(実施例13)、これを用いた場合、分子全体にはっきりした焦点をもたらすのが困難なことがあり、また、アガロースゲルは光を分散させる。アガロースによる固定に関するこれらの問題を除去するために、融解アガロースに溶かした大きいDNA分子をAPTESで誘導化されたガラス表面に固定することにより、融解アガロースの流体の乱れの減衰させる性質を、表面へのマウントの安定性と組み合わせた(Lyubchenko et al., J.of Biomolecular Struct. and Dynamics 10:589-606, 1992; Weetal, Methods Enzymol. 44:19, 1976) 。この組み合わせた技術により、DNA分子と顕微鏡の対物レンズの間のアガロースゲルの量を最小にしたので、高いコントラストを持つイメージングが可能になったと推論された。このアプローチは、アガロースマトリックス中のDNAがAPTESで修飾されたガラス表面と相互作用して、最適に伸長され、安定化された分子を、制限酵素の活性化を促すような環境中に生じさせることができるかどうかをテストすることにより評価した。
れるのに対して、付着が弱すぎると伸長は最大となるが十分な数の分子が表面に固定しない。適当なバランスを達成するために、沈着した分子の測定された分子長さの平均に対して、APTESの量を表面上で滴定した。APTESで修飾したカバーガラス上の染色された分子をイメージングするために蛍光顕微鏡検査を用いた。洗浄したカバーガラスを0.10M APTES溶液中でインキュベーションする時間を0.5から5時間まで変化させ、寄託された希釈されていない出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)(AB972)の染色体I(240kb)を融解アガロースに溶かし、蛍光顕微鏡写真から分子の長さを測定した。表面に付着した分子の数も数えた。目標は表面上に利用可能な数の分子が存在する状態を保ちながら、分子の伸長を最大にすることであった。図21に、APTES濃度に対して分子の伸長の平均および100m2の視野あたりの分子の数をプロットしたグラフを示す。APTES濃度が低いときには、分子の伸長の平均も表面上に検出された分子の数も最小であった。分子の伸長の平均はAPTES濃度とともに増加し、3時間で最大となり、さらにAPTES濃度が増加すると分子の伸長は減少したが、予想通り、表面上の分子の数は増加した。どのくらいの大きさのDNA分子がAPTESで修飾された表面と相互作用をするのかは正確には知られていない。DNAと電荷を持った表面との間の静電的な引力と、マウントの作業中に生じる分子の流動力とが、ある程度までは釣り合っていると推測される。多くのAPTESが被覆されるにつれて表面の電荷密度が増加するのに対して、流動力は一定である。そこで、分子の伸長の最小値は、APTESの表面密度が高いときと低いときに測定される。図21に示されたデータに基づいて、まず、APTES中で3時間インキュベートされたガラス表面を使用することに決定した。このインキュベーション時間によれば、均質に伸長した長さの分布が得られるが、2時間の消化の間に分子が過度に弛緩することが見いだされた。次に、APTESによるインキュベーション時間を5時間に延長した。5時間では、平均の長さはポリマーの輪郭の長さの約55%である。高度の伸長により小さい制限断片の検出が促進されるが、制限酵素の活性が阻害される可能性がある。次の段階は制限酵素の活性をアッセイすることであった(実施例13)。マウントしたDNA分子の消化。以前の光学的マッピングの研究においては、DNA分子は典型的にはそのポリマーの輪郭の長さの約30%まで伸長された。より凝縮した分子はより高い蛍光密度を有するので、この伸長の程度は、画像のコントラストを最大にするために選択された。最近、より低い密度の画像から必要量の情報を集めるためにより長い画像集成時間が用いられるようになった。この実施例では、表面にマウントされた分子は、典型的にはそれらのポリマーの輪郭の長さの50-60%に伸長された。このような分子は、制限酵素により、アガロース中でマウントされたより凝縮した分子と比較して、50%に対して85%と、効果的に切断されることが見いだされた。効率は、与えられた同種の部位における開裂の可能性により測定された(実施例13)。全体的な画像の品質も同様に大きく改善された。
蛍光顕微鏡でイメージングされたような、ラベルされたDNA分子の質量と測定された蛍光強度との定量的な相関関係は、すでに証明した(実施例13)。さらに、顕微鏡的にイメージングされた制限断片長と質量との信頼できる相関関係を確立した(実施例13)。これらの研究は、アガロースゲル中に固定したDNA分子を用いて行なった。この実施例で記載した表面固定条件が異なるため、質量測定のための方法を再評価しなければならなかった。表面固定したS. cerevisiae の染色体DNA分子をNot I で消化し、制限断片の蛍光強度および長さを測定した。これらの測定値を、十分に確立されたS. cerevisiae 染色体のNot I 断片サイズに対してプロットした(実施例13、LinkとOlson, Genetics 127:681, 1991)( 図22および23を参照されたい) 。典型的な分子の蛍光顕微鏡写真を図23に示す。表面固定分子とゲル固定分子のために測定された蛍光強度の間における最も顕著な相違は、再現性の向上である。プールされた標準偏差(SD)は、以前のものが36kbを示した(実施例13)のに対し、17kbであった。また、表面固定分子の蛍光強度データは、我々の以前のゲル固定プロトコルが60kb以下という不十分な値であったのに対し、30kbまで正確であった。表面固定分子の全相対誤差は4%で、標準的な方法で得られた結果と同等であり(Link とOlson, Genetics 127:681, 1991)、変動係数の平均は12%であった。このことは、ルーチンのPFGE分析に匹敵する精度であることを示す。表面固定分子の長さを測定することによる質量測定もまた、ゲル固定分子での以前の結果より良いものであった。長さの測定値より、プールされたSDが47kbに対して32kbであり、変動係数の平均が29%であることが示された。相対誤差は7%であり、蛍光強度データほど正確ではなかった。これらの断片のサイジングの検討より、蛍光強度が長さよりも質量に対する相関が、より正確であり、かつ信頼性が高いことが示された。結局、表面固定分子の画像は、一貫して1焦点平面にあった。正確な蛍光強度測定のためには焦点がしっかり合っていなければならないが、長さの測定ではぼやけた画像に起因する誤りをあまり受けない。明らかに、表面固定分子の消化によって生成された制限断片は、蛍光強度の値よりも、長さの点で多様である。長さの変動に基づく誤差は、均一に伸長されたDNA分子のみを選択することによって減少させることができる。
改良されたDNA結合効率と量子収量とを有する新規な蛍光色素が最近開発された。オキサゾールの黄色のホモダイマー(YOYO−1)対エチジウムのホモダイマーを試験し、YACクローンである3H5、5L5、および6H3を光学的にマッピングした。YOYO−1の画像は、エチジウムホモダイマーによる画像よりも明るく、コントラストがくっきりしていた。また、高い塩の条件により、エチジウムで染色された分子の蛍光放射が低下するのに対し、YOYO−1染色分子では高い塩条件および厳しい固定条件の下においても蛍光性が保持されていた。興味深いことに、2−メルカプトエタノールの存在下においてさえも、二本鎖の破損として示された、DNAに対する重大な光損傷がYOYO−1を含む溶液中で観察された。幸運なことに、表面固定YOYO−1染色DNA分子は、20%(v/v) の2−メルカプトエタノールの存在下において、測定され得る光損傷(二本鎖の破損)を示さなかった。さらに2−メルカプトエタノールを増加させると、YOYO−1の蛍光が消光することが観察された。YOYO−1を用いて達成することができる質的に優れたイメージコントラストにより、制限断片のサイジングの結果が向上した。すなわち、YOYO−1染色制限断片について計算された平均に対するプールされた標準偏差は17kbから11kbへ下がり、平均変動係数は12%から7%へと低下した。
5つのYACを、最適化したAPTES 固定と上記のYOYO−1染色条件とを用いて、制限エンドヌクレアーゼであるMluI、EagI、およびNotIで光学的にマッピングした。全般的に、画像は明瞭でコントラストはくっきりしていた。上記の手順(実施例13)にわずかな変更を加えて地図を作成した。くっきりしたコントラストのイメージングの可能性を利用するような地図作成のために必要な分析は、分子が消化後にイメージングされるために、以前の他のアプローチと比べて単純化された。長いイメージ積算時間を採用し、顕微鏡の視野あたり1つの画像を集めた。以前の手法(実施例13)では、一連の時間経過画像の検討と4〜5枚の連続した(一時的な)画像の解析が必要であった。表面固定分子の切断部位はギャップ(空隙)の出現によって合図され、断片の端はときどき、縮合DNAの明るい領域を表示した。これらの地図を方向付けるために、YACを二重消化によってさらに特徴付けた。得られた地図の一部は、40〜180 kbのサイズの範囲の断片を6個以上含んでいる。光学的地図およびPFGE地図間の全体的な一致は、断片のサイジングおよび順序付けのいずれにおいても非常に良好であった。
DNA分子の光学的な制限マッピングは、大型のDNA分子の制限地図を作成するための従来のゲルおよびハイブリダイゼーションベースの方法に代わる新たなものである。光学的マッピングは以下の点に基づく魅力的な技術である。i)迅速で安全であり、ゲル電気泳動、プローブの調製と放射ラベリング、核酸ハイブリダイゼーションおよびオートラジオグラフィーなどの時間のかかる技術を必要としない。さらに、顕微鏡とカメラを除けば非常に単純な材料を少しだけ必要とする、実施が容易で安価な手法である。ii) この手法では一貫した結果が得られ、正確度は標準的な方法との直接的な比較によって証明されてきた。iii)この手法は、個々のDNA分子を分析するものであるため、小型化と自動化そしてその結果としての状態が処理量の大巾増加、コストの低減が大いに見込める。
Claims (89)
- 核酸分子が依然として酵素反応および/またはハイブリダイゼーション反応を容易に受け入れるように伸長されて平坦な表面上に固定された核酸分子。
- 核酸分子がDNA分子である、請求項1に記載の伸長され固定された核酸分子。
- 核酸分子がRNA分子である、請求項1に記載の伸長され固定された核酸分子。
- 平坦な表面が誘導体化されたガラスである、請求項1に記載の伸長され固定された核酸分子。
- ガラス表面の誘導体化が、低度の緩和を見越しながら伸長状態に核酸分子を維持するのに十分な電荷密度で、核酸分子とガラス表面との静電的相互作用を増加させる荷電物質をコーティングすることにより行われる、請求項4に記載の伸長され固定された核酸分子。
- 荷電物質がポリ−D−リシンまたは3−アミノプロピルトリエトキシシランである、請求項5に記載の伸長され固定された核酸分子。
- ゲル中に固定される、請求項1に記載の伸長され固定された核酸分子。
- ゲルがアガロースまたはポリアクリルアミドである、請求項7に記載の伸長され固定された核酸分子。
- 平坦な表面がその表面に固定された酵素をさらに含む、請求項1に記載の伸長され固定された核酸分子。
- 酵素が制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、リガーゼまたはヘリカーゼである、請求項9に記載の伸長され固定された核酸分子。
- 平坦な表面が固定化酵素の活性にとって必要なキレート化された補助因子をさらに含む、請求項10に記載の伸長され固定された核酸分子。
- キレート化された補助因子が特定の波長の光に暴露されたとき放出され、その暴露位置において固定化酵素が活性化される、請求項11に記載の伸長され固定された核酸分子。
- 平坦な表面上に固定された伸長核酸分子の調製方法であって、核酸分子とその表面との静電的相互作用を増加させる荷電物質でコーティングされた平坦なガラス表面に核酸分子を付着させることを含んでなり、その際の電荷密度が低度の緩和を見越しながら伸長状態に核酸分子を維持するのに十分なものである、上記の方法。
- 荷電物質がポリ−D−リシンまたは3−アミノプロピルトリエトキシシランである、請求項13に記載の方法。
- 平坦な表面上に付着される核酸分子がグリセロールを含有する溶液中に存在する、請求項13または14に記載の方法。
- 平坦な表面上に固定された伸長核酸分子の調製方法であって、平坦な表面上の未重合ゲル組成物内の核酸分子に外部力を加えることによって核酸分子を伸長させ、ゲルの重合時に伸長核酸分子を過度の緩和に先立って適所に固定させて、伸長した比較的静止した状態で維持するが、その伸長核酸分子が依然として酵素反応および/またはハイブリダイゼーション反応を容易に受け入れるものであることを含んでなる、上記の方法。
- ゲルがアガロースまたはポリアクリルアミドである、請求項16に記載の方法。
- 伸長が物理的圧縮により達成される、請求項16に記載の方法。
- 伸長が電気的力により達成される、請求項16に記載の方法。
- 平坦な表面がその表面に固定された酵素をさらに含む、請求項13または16に記載の方法。
- 酵素が制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、リガーゼまたはヘリカーゼである、請求項20に記載の方法。
- 平坦な表面が固定化酵素の活性にとって必要なキレート化された補助因子をさらに含む、請求項21に記載の方法。
- キレート化された補助因子が特定の波長の光に暴露されたとき放出され、その暴露位置において固定化酵素が活性化される、請求項22に記載の方法。
- 請求項1に記載の伸長され固定された核酸分子を、その物理的特性を得るために画像化することを含んでなる、核酸分子の特性決定法。
- 核酸分子がDNA分子である、請求項24に記載の方法。
- 核酸分子がRNA分子である、請求項24に記載の方法。
- 平坦な表面が誘導体化されたガラスである、請求項24に記載の方法。
- ガラス表面の誘導体化が、低度の緩和を見越しながら伸長状態に核酸分子を維持するのに十分な電荷密度で、核酸分子とガラス表面との静電的相互作用を増加させる荷電物質をコーティングすることにより行われる、請求項27に記載の方法。
- ガラスがポリ−D−リシンまたは3−アミノプロピルトリエトキシシランで誘導体化される、請求項28に記載の方法。
- 伸長され固定された核酸分子がゲル中に固定されている、請求項24に記載の方法。
- ゲルがアガロースまたはポリアクリルアミドである、請求項30に記載の方法。
- 平坦な表面がスライドグラスであり、画像化が光学顕微鏡を使って達成される、請求項24に記載の方法。
- 画像がコンピュータ増強される、請求項32に記載の方法。
- 核酸分子の特性決定法であって、
(a) 請求項1に記載の伸長され固定された核酸分子を、核酸分子を修飾する酵素と反応させ、そして
(b) この伸長され固定された核酸分子を画像化してその物理的特性の変化を検出する、ことを含んでなる上記方法。 - 核酸分子がDNA分子である、請求項34に記載の方法。
- 核酸分子がRNA分子である、請求項34に記載の方法。
- 酵素が制限エンドヌクレアーゼである、請求項34に記載の方法。
- 酵素がエキソヌクレアーゼである、請求項34に記載の方法。
- 酵素がポリメラーゼである、請求項34に記載の方法。
- 酵素がリガーゼである、請求項34に記載の方法。
- 酵素がヘリカーゼである、請求項34に記載の方法。
- 平坦な表面がスライドグラスであり、画像化が光学顕微鏡を使って達成される、請求項34に記載の方法。
- 画像がコンピュータ増強される、請求項42に記載の方法。
- 核酸分子の特性決定法であって、
(a) 請求項1に記載の伸長され固定された核酸分子を一本鎖ヌクレオチドとハイブリダイズさせ、そして
(b) その伸長され固定された核酸分子を画像化してハイブリダイゼーション反応産物を検出する、ことを含んでなる上記方法。 - 伸長され固定された核酸分子がDNA分子である、請求項44に記載の方法。
- 伸長され固定された核酸分子がRNA分子である、請求項44に記載の方法。
- 一本鎖ヌクレオチドが標識されている、請求項44に記載の方法。
- 標識が放射性標識、蛍光体、比色用色素または酵素である、請求項47に記載の方法。
- 一本鎖ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドプライマーであり、ポリメラーゼがハイブリダイゼーション反応に添加される、請求項44に記載の方法。
- 平坦な表面がスライドグラスであり、画像化が光学顕微鏡を使って達成される、請求項44に記載の方法。
- 画像がコンピュータ増強される、請求項50に記載の方法。
- 核酸分子の地図作成または配列決定を行うためのキットであって、
(a) 核酸分子が依然として酵素反応および/またはハイブリダイゼーション反応を容易に受け入れるように伸長されて平坦な表面上に固定された核酸分子、および
(b) 核酸を修飾する酵素、を含んでなる上記キット。 - 酵素反応用の試薬をさらに含む、請求項52に記載のキット。
- 酵素が制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、リガーゼまたはヘリカーゼである、請求項52に記載のキット。
- 伸長され固定された核酸分子がDNA分子である、請求項52に記載のキット。
- 伸長され固定された核酸分子がRNA分子である、請求項52に記載のキット。
- 平坦な表面が誘導体化されたガラスである、請求項52に記載のキット。
- ガラス表面の誘導体化が、低度の緩和を見越しながら伸長状態に核酸分子を維持するのに十分な電荷密度で、核酸分子とガラス表面との静電的相互作用を増加させる荷電物質をコーティングすることにより行われる、請求項57に記載のキット。
- 伸長され固定された核酸分子がゲル中に固定されている、請求項52に記載のキット。
- ゲルがアガロースまたはポリアクリルアミドである、請求項59に記載のキット。
- 核酸分子の地図作成または配列決定を行うためのキットであって、
(a) 核酸分子が依然として酵素反応および/またはハイブリダイゼーション反応を容易に受け入れるように伸長されて平坦な表面上に固定された核酸分子、および
(b) ヌクレオチドプローブを含んでなる上記キット。 - ハイブリダイゼーション反応用の試薬をさらに含む、請求項61に記載のキット。
- 伸長され固定された核酸分子がDNA分子である、請求項61に記載のキット。
- 伸長され固定された核酸分子がRNA分子である、請求項61に記載のキット。
- ヌクレオチドプローブが標識されている、請求項61に記載のキット。
- 標識が放射性標識、蛍光体、比色用色素または酵素である、請求項65に記載のキット。
- ヌクレオチドプローブがオリゴヌクレオチドプライマーである、請求項60に記載のキット。
- ポリメラーゼをさらに含む、請求項66に記載のキット。
- 核酸分子が依然として酵素反応および/またはハイブリダイゼーション反応を容易に受け入れるように伸長核酸分子を固定するための誘導体化されたガラス表面であって、低度の緩和を見越しながら伸長状態に核酸分子を維持するのに十分な電荷密度で、核酸分子とガラス表面との静電的相互作用を増加させる荷電物質をコーティングしてある、上記の誘導体化ガラス表面。
- 荷電物質がポリ−D−リシンまたは3−アミノプロピルトリエトキシシランである、請求項69に記載の誘導体化ガラス表面。
- そのガラス表面に固定された酵素をさらに含む、請求項69に記載の誘導体化ガラス表面。
- 酵素が制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、リガーゼまたはヘリカーゼである、請求項71に記載の誘導体化ガラス表面。
- ガラス表面が固定化酵素の活性にとって必要なキレート化された補助因子をさらに含む、請求項71に記載の誘導体化ガラス表面。
- キレート化された補助因子が特定の波長の光に暴露されたとき放出され、その暴露位置において固定化酵素が活性化される、請求項73に記載の誘導体化ガラス表面。
- 請求項69に記載の誘導体化された平坦なガラス表面、およびそのガラス表面に核酸分子を付着させ、伸長させ、固定させるための試薬を含んでなるキット。
- 試薬がグリセロール溶液である、請求項75に記載のキット。
- 酵素反応またはハイブリダイゼーション反応において用いる試薬をさらに含む、請求項75に記載のキット。
- 核酸分子の特性決定を行うためのシステムであって、
(a) 核酸分子が依然として酵素反応および/またはハイブリダイゼーション反応を容易に受け入れるように伸長されて平坦な表面上に固定された核酸分子、および
(b) この伸長され固定された核酸分子の物理的特性を得るためにその核酸分子を画像化する装置、を含んでなる上記のシステム。 - 平坦な表面がその表面に固定された酵素をさらに含む、請求項78に記載のシステム。
- 酵素が制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、リガーゼまたはヘリカーゼである、請求項79に記載のシステム。
- 平坦な表面が固定化酵素の活性にとって必要なキレート化された補助因子をさらに含む、請求項79に記載のシステム。
- キレート化された補助因子が特定の波長の光に暴露されたとき放出され、その暴露位置において固定化酵素が活性化される、請求項81に記載のシステム。
- 平坦な表面がスライドグラスであり、画像化用の装置が光学顕微鏡である、請求項78に記載のシステム。
- ガラス表面が、低度の緩和を見越しながら伸長状態に核酸分子を維持するのに十分な電荷密度で、核酸分子とガラス表面との静電的相互作用を増加させる荷電物質をコーティングすることにより誘導体化されている、請求項83に記載のシステム。
- 光学顕微鏡で得られた画像を増強するための装置をさらに含む、請求項83に記載のシステム。
- 得られた画像を増強する装置がコンピュータである、請求項83に記載のシステム。
- 多くの伸長核酸分子が格子状の模様を形成するように規則正しい配列で平坦な表面に固定されている、請求項78に記載のシステム。
- 伸長され固定された核酸分子を画像化する装置が、画像化すべき固定化核酸分子を位置づけるためにx−y軸を調節する装置を含む、請求項87に記載のシステム。
- 画像化装置がオートフォーカスをさらに含む、請求項88に記載のシステム。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/415,839 US6147198A (en) | 1988-09-15 | 1995-04-03 | Methods and compositions for the manipulation and characterization of individual nucleic acid molecules |
US08/415,710 US5720928A (en) | 1988-09-15 | 1995-04-03 | Image processing and analysis of individual nucleic acid molecules |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP53044496A Division JP4511636B2 (ja) | 1995-04-03 | 1996-04-03 | 顕微鏡的イメージングにより核酸の物理的特性を測定する方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009022284A true JP2009022284A (ja) | 2009-02-05 |
JP4495767B2 JP4495767B2 (ja) | 2010-07-07 |
Family
ID=27023073
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP53044496A Expired - Lifetime JP4511636B2 (ja) | 1995-04-03 | 1996-04-03 | 顕微鏡的イメージングにより核酸の物理的特性を測定する方法 |
JP2008197050A Expired - Lifetime JP4495767B2 (ja) | 1995-04-03 | 2008-07-30 | 顕微鏡的イメージングにより核酸の物理的特性を測定する方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP53044496A Expired - Lifetime JP4511636B2 (ja) | 1995-04-03 | 1996-04-03 | 顕微鏡的イメージングにより核酸の物理的特性を測定する方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP0871640A4 (ja) |
JP (2) | JP4511636B2 (ja) |
AU (1) | AU5532196A (ja) |
WO (1) | WO1996031522A1 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011043077A1 (ja) * | 2009-10-09 | 2011-04-14 | 川崎重工業株式会社 | 未分化多能性幹細胞の識別方法及び装置並びに自動培養方法及び装置 |
US8977031B2 (en) | 2010-06-25 | 2015-03-10 | Kawasaki Jukogyo Kabushiki Kaisha | Method and device for identifying multipotent stem cell colony, and method and device for automatically culturing multipotent stem cells |
JP2016500002A (ja) * | 2012-10-05 | 2016-01-07 | カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー | マイクロ流体イメージングおよび分析のための方法およびシステム |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001508281A (ja) * | 1995-11-14 | 2001-06-26 | ベイラー カレッジ オブ メディシン | 活性表面化学特性に基づく統合核酸ハイブリダイゼーション装置 |
DE19830596B4 (de) * | 1997-07-10 | 2008-08-21 | Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg | Wellenfeldmikroskop, Wellenfeldmikroskopieverfahren, auch zur DNA-Sequenzierung, und Kalibrierverfahren für die Wellenfeldmikroskopie |
CN1323355A (zh) * | 1998-08-13 | 2001-11-21 | 美国吉诺米克斯公司 | 光学鉴定聚合物 |
EP2801624B1 (en) * | 2001-03-16 | 2019-03-06 | Singular Bio, Inc | Arrays and methods of use |
DE60221126T2 (de) | 2001-05-31 | 2008-03-13 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Verbessertes verfahren zum nachweis und zur identifizierung eines eine infektion verursachenden mikroorganismus |
JP4999171B2 (ja) * | 2007-08-06 | 2012-08-15 | 日本電信電話株式会社 | タンパク質機能解析装置 |
WO2009052214A2 (en) | 2007-10-15 | 2009-04-23 | Complete Genomics, Inc. | Sequence analysis using decorated nucleic acids |
US9637776B2 (en) * | 2008-02-19 | 2017-05-02 | Opgen, Inc. | Methods of identifying an organism |
GB0818609D0 (en) | 2008-10-10 | 2008-11-19 | Univ Hull | apparatus and method |
US8597879B2 (en) * | 2009-10-08 | 2013-12-03 | Opgen, Inc. | Methods of characterizing small nucleic acid molecules |
US9671344B2 (en) * | 2010-08-31 | 2017-06-06 | Complete Genomics, Inc. | High-density biochemical array chips with asynchronous tracks for alignment correction by moiré averaging |
US10890528B2 (en) | 2016-10-27 | 2021-01-12 | Sharp Kabushiki Kaisha | Fluorescent testing system, molecular testing method, and fluorescent testing method |
JP6860890B2 (ja) * | 2017-08-01 | 2021-04-21 | シャープ株式会社 | 液体中微粒子分析システムおよび液体中微粒子分析方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4994373A (en) * | 1983-01-27 | 1991-02-19 | Enzo Biochem, Inc. | Method and structures employing chemically-labelled polynucleotide probes |
JPH03505157A (ja) * | 1988-05-03 | 1991-11-14 | オックスフォード・ジーン・テクノロジー・リミテッド | 分析用ポリヌクレオチド配列 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4473452A (en) | 1982-11-18 | 1984-09-25 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Electrophoresis using alternating transverse electric fields |
US4695548A (en) | 1982-11-18 | 1987-09-22 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Gel inserts useful in electrophoresis |
US5118605A (en) | 1984-10-16 | 1992-06-02 | Chiron Corporation | Polynucleotide determination with selectable cleavage sites |
US5079169A (en) | 1990-05-22 | 1992-01-07 | The Regents Of The Stanford Leland Junior University | Method for optically manipulating polymer filaments |
US5314829A (en) * | 1992-12-18 | 1994-05-24 | California Institute Of Technology | Method for imaging informational biological molecules on a semiconductor substrate |
-
1996
- 1996-04-03 AU AU55321/96A patent/AU5532196A/en not_active Abandoned
- 1996-04-03 WO PCT/US1996/004550 patent/WO1996031522A1/en active Application Filing
- 1996-04-03 JP JP53044496A patent/JP4511636B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-03 EP EP96912538A patent/EP0871640A4/en not_active Ceased
- 1996-04-03 EP EP20070023766 patent/EP1914238A3/en not_active Ceased
-
2008
- 2008-07-30 JP JP2008197050A patent/JP4495767B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4994373A (en) * | 1983-01-27 | 1991-02-19 | Enzo Biochem, Inc. | Method and structures employing chemically-labelled polynucleotide probes |
JPH03505157A (ja) * | 1988-05-03 | 1991-11-14 | オックスフォード・ジーン・テクノロジー・リミテッド | 分析用ポリヌクレオチド配列 |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011043077A1 (ja) * | 2009-10-09 | 2011-04-14 | 川崎重工業株式会社 | 未分化多能性幹細胞の識別方法及び装置並びに自動培養方法及び装置 |
JPWO2011043077A1 (ja) * | 2009-10-09 | 2013-03-04 | 川崎重工業株式会社 | 未分化多能性幹細胞の識別方法及び装置並びに自動培養方法及び装置 |
US9008406B2 (en) | 2009-10-09 | 2015-04-14 | Kawasaki Jukogyo Kabushiki Kaisha | Method and apparatus for discriminating undifferentiated pluripotent stem cells, and automated culture method and system |
JP2016028607A (ja) * | 2009-10-09 | 2016-03-03 | 川崎重工業株式会社 | 未分化多能性幹細胞の識別方法及び装置並びに自動培養方法及び装置 |
US8977031B2 (en) | 2010-06-25 | 2015-03-10 | Kawasaki Jukogyo Kabushiki Kaisha | Method and device for identifying multipotent stem cell colony, and method and device for automatically culturing multipotent stem cells |
JP2016500002A (ja) * | 2012-10-05 | 2016-01-07 | カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー | マイクロ流体イメージングおよび分析のための方法およびシステム |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU5532196A (en) | 1996-10-23 |
JP4495767B2 (ja) | 2010-07-07 |
EP0871640A4 (en) | 2002-04-17 |
WO1996031522A1 (en) | 1996-10-10 |
EP1914238A2 (en) | 2008-04-23 |
JP4511636B2 (ja) | 2010-07-28 |
EP1914238A3 (en) | 2008-11-05 |
EP0871640A1 (en) | 1998-10-21 |
JPH11503022A (ja) | 1999-03-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4495767B2 (ja) | 顕微鏡的イメージングにより核酸の物理的特性を測定する方法 | |
JP3650617B2 (ja) | ポリマー分子などの特性を明らかにする方法 | |
US7049074B2 (en) | Methods and compositions for the manipulation and characterization of individual nucleic acid molecules | |
US6294136B1 (en) | Image processing and analysis of individual nucleic acid molecules | |
US6610256B2 (en) | Image processing and analysis of individual nucleic acid molecules | |
Yokota et al. | A new method for straightening DNA molecules for optical restriction mapping | |
Cai et al. | Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces. | |
US20050244863A1 (en) | Molecular arrays and single molecule detection | |
Yamashita et al. | Visualization of DNA microarrays by scanning electrochemical microscopy (SECM) | |
WO2001046474A1 (en) | Detection of nucleic acids | |
Conti et al. | Molecular combing | |
US8084257B2 (en) | Methods for sorting dimorphic daughter cells | |
US20040018526A1 (en) | Method of detecting abasic sites on DNA | |
JP4115366B2 (ja) | 核酸分子の高次構造変化検出方法 | |
Ouyang et al. | Optical mapping of a rice BAC clone using restriction endonuclease and imaging with fluorescent microscopy at single molecule level | |
Lehner | Confocal microscopy on fluorescently labelled single DNA molecules and force-extension measurements on DNA carpets | |
JP2005017233A (ja) | 生化学反応体の検出方法とバイオチップ | |
CA2173156C (en) | A method for characterizing polymer molecules or the like | |
JP2009022274A (ja) | 染色体dna上の位置マッピング方法ならびに核酸混合物の組成分析方法 | |
JP2008307020A (ja) | 染色体の展開・伸長に用いる線維状基体ならびにそれを用いる展開・伸長方法および展開・伸長装置 | |
JP2003294739A (ja) | 生化学反応体の検出方法とバイオチップ |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090121 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090126 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090428 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090526 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090925 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20091119 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100119 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100219 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100316 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100409 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130416 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130416 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140416 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |